KR20200072471A - 약학적 제제의 전달 조성물 및 방법 - Google Patents

약학적 제제의 전달 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20200072471A
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와이. 조셉 모
쑤동 위엔
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날 파마슈티칼 그룹 리미티드
와이. 조셉 모
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Abstract

항암제 또는 다른 활성제를 대상체에게 전달하기 위해 나노 입자 및 미세 구가 제공된다. 나노 입자 및 마이크로 구체는 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 또는 이의 유사체를 포함하는 코팅 또는 쉘에 의해 둘러싸인 코어로부터 형성된다. 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 하나 이상의 알부민 (또는 이의 유사체) 모이어티, 하나 이상의 소마토스타틴 모이어티 (예를 들어, SST-14, SST-28), 및 알부민을 알부민으로, 소마토스타틴에서 소마토스타틴으로 및/또는 알부민을 소마토스타틴 부분으로 연결하는 하나 이상의 스페이서를 포함한다.

Description

약학적 제제의 전달 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017 년 8 월 25 일자로 출원 된 미국 가출원 제 62/550,535 호의 이익을 주장하며, 그 내용은 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 입자 형태로 캡슐화 된 약학적 활성 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 약학적 활성 성분은 알부민 도메인 및 소마토스타틴 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함하는 생체 적합성 중합체 쉘에 캡슐화된다.
대부분의 항암제의 치료 효능은 종양 부위로의 적절한 국소 전달을 달성하는 것으로 추정된다. 많은 암 화학 요법제는 시험 관내에서 매우 효과적이지만 생체 내에서는 효과적이지 않은 것으로 나타났다. 이러한 차이는 부분적으로 치료 수준에서 약물을 종양 부위에 전달하는 데 어려움이 있고 효과적인 치료를 제공하기 위해 높은 비율의 종양 세포 제거가 필요하기 때문인 것으로 여겨진다 (Jain, 1994, Scientific American 271 (1) : 58-65; Tannock, 1998, Lancet. 351 Suppl 2 : SII9-16). 치료 분자, 사이토 카인, 항체 및 바이러스 벡터는 종종 혈관벽을 가로 지르는 어려움으로 인해 종양에 영향을 미치는 능력이 제한적이다 (Yuan, 1998, Seminars in Radiation Oncology 8 (3) : 164-175). 부적절한 특이 적 전달은 현재의 암 화학 요법제에서 자주 관찰되는 낮은 치료 지수로 이어질 수 있다.
소마토스타틴 ("SST")은 다양한 내분비 조직 및 비 내분비 조직에 의해 분비되는 폴리펩티드 호르몬이며 신체 전체에 널리 분포되어있다. 소마토스타틴은 뇌하수체, 췌장 및 위장관 호르몬 분비 방출뿐만 아니라 사이토 카인 생성, 장 운동 성과 흡수, 혈관 수축 및 세포 증식을 억제합니다. 최근 연구에 따르면 SST는 내분비 계의 특정 암 치료, 종양 성장 억제, 내분비 종양의 증식 억제 및 유방암, 결장 직장암, 간암, 폐암, 내분비 암, 신경 내분비 암, 췌장암 및 전립선 암. 또한, 1997 년 Wangberg, The Oncologist 2 : 50-58에 의해보고 된 바와 같이, SST는 SST 및 SST의 치료 적 유사체가 우선적으로 결합 할 SST 수용체를 발현하는 신경 내분비 종양을 포함하는 특정 종양에 선택적으로 결합할 것이다.
소마토스타틴 분자는 2 가지 생물학적 활성 형태를 갖는다 : 소마토스타틴 -14 (SST-14), 사이 클릭 테트라 데카 펩티드 및 소마토스타틴 -28 (SST-28), S- 말단의 N- 말단 연장 형태. SST-14는 위치 3과 14에서 시스테인 사이의 이황화 결합을 함유하는 길이가 14 개의 잔기를 갖는시 클릭 펩티드이다. 두 가지 형태의 소마토스타틴은 유사한 활성을 갖지만, 각각의 효능 및 조직 학적 특성은 다양하다. 예를 들어, SST-14는 글루카곤 및 가스트린의보다 현저한 억제를 나타내고, SST­28은 성장 호르몬 및 인슐린 작용의보다 현저한 억제를 나타낸다. 두 가지 형태의 소마토스타틴은 표적 세포상의 SST 수용체 및 세포 내 경로를 통해 각각의 생물학적 기능을 발휘한다. 소마토스타틴 수용체의 5 가지 아형 (SSTR 1-5)이 SSTR2에 대한 2 개의 스 플라이 싱 된 변이체 : SSTR2A 및 SSTR2B, 상이한 카복실 말단을 갖는 것으로 인식되었다.
특정 과분비 내분비 장애의 치료에서 소마토스타틴의 유익한 효과 및 종양에 대한 이의 항 증식 효과는 잘 알려져있다. 그러나 생체 내 소마토스타틴의 반감기는 효소 분해와 세포 내 이입으로 인해 2-3 분 밖에되지 않아 소마토스타틴의 임상 적 유용성을 제한합니다. 지난 10 년 동안 수많은 안정한 소마토스타틴 유사체가 개발되었습니다. 예를 들어, 옥 트레오 티드 및 란 레오 티드는 성장 호르몬 (GH)-분비 선종 및 카르시 노이드의 치료에 사용된다.
미국 특허 제 5,439,686 호에는 생체 적합성 중합체, 예를 들어 알부민과 같은 단백질을 포함하는 외부 쉘을 갖는 입자 내에 제형 화 된 파클리탁셀 (Taxol174;)과 같은 실질적으로 수 불용성 인 성분이 기재되어 있으며, 입자는 생체 적합성 액체에 현탁된다.
2016 년 2 월 26 일에 국제 출원일 인 공동 소유 국제 특허 출원 PCT/US2016/019950 및 공동 소유 미국 특허 출원 Ser. 2016 년 8 월 26 일자로 출원 된 미국 특허 제 15/249,346 호는 알부민 잔기 및 소마토스타틴 잔기를 함유하는 안정한 재조합 융합 단백질을 기술하고, 이들 잔기는 스페이서를 통해 연결된다. 융합 단백질은 소마토스타틴에 반응하는 종양을 치료 또는 하향 조절하기 위해 안정한 소마토스타틴 유사체를 제공하는 이점을 갖는다. 그러나, 이러한 발달에도 불구하고, 소마토스타틴 활성의 이점을 다른 유형의 항암제를 비롯한 다른 치료 또는 진단 모이어티와 조합 한 조성물에 대한 당 업계의 요구가 여전히 남아있다.
따라서, 본 발명은 약학적 활성 성분, 또는 진단 성분, 및 중합체 쉘을 포함하는 입자를 제공하며, 여기서 중합체 쉘은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 특정 구체 예에서, 중합체 쉘은 실질적으로 약학적 활성제를 함유한다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 중합체 쉘은 약 5 중량 % 내지 약 100 중량 %의 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 ( "SST 융합 단백질")을 포함하거나, 대안 적으로 중합체 쉘은 약 65 중량 % 내지 약 소마토스타틴-알부민 단백질 95 중량 %. 특정 측면에서, 입자에서 SST 융합 단백질 및 약학적 활성 성분 또는 진단 성분의 중량비는 약 20 : 1 내지 1:20이다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 입자는 항암제 인 약학적 활성 성분을 추가로 포함한다. 예를 들어, 항암제는 질소 머스타드, 니트로 소 우레아, 에틸렌 이민, 알칸 설포 네이트, 테트라 진, 백금 화합물, 피리 미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항 대사제, 엽산 유사체, 안트라 사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 토포 이소 머라 제 억제제, 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 약제 및 이들의 조합. 항암제가 예를 들어, 탁 산인 경우, 탁 산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 캄 프토 테신, 카바지 탁셀, 탁신, 세 팔로 만 닌 및 이들의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은
SST;
L; 및
작동 가능하게 연결된 ALB를 포함하고,
여기서
L은 어떤 순서로든 SST와 ALB를 연결합니다.
SST는 소마토스타틴, 이의 유사체 또는 유도체이며;
L은 스페이서 또는 링커이고; 및
ALB는 알부민, 그 유사체 또는 변이체이다.
특정 실시 양태에서, 융합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다 :
SST- (L) x1-ALB (I);
ALB- (L) x1-SST (II);
[SST- (L) x1] y1-ALB (III);
ALB-[(L) x1-SST] y1 (IV);
[SST- (L) x1] y1-ALB-[(L) x2-SST] y2 (V);
[SST- (L) x1] y1-ALB-[(L) x2-SST] y2- (L) x3-ALB (VI);
[SST- (L) x1] y1-ALB-[(L) x2-SST] y2- (L) x3-ALB-[(L) x4-SST] y3 (VII);
ALB- (L) x1- [SST- (L) x2] y1-ALB (VIII);
ALB- (L) x1- [SST- (L) x2] y1-ALB-[(L) x3-SST] y2- (L) x1-ALB (IX); 과
ALB- (L) x1- [SST- (L) x2] y1-ALB-[(L) x3-SST] y2- (L) x1-ALB-[(L) x4-SST] y3 (X);
여기서, x1, x2, x3, x4, y1, y2 또는 y3은 독립적으로 0 또는 1-10으로부터 선택된 정수이다.
본 발명의 입자는 SST가 천연 유래 또는 합성 제조 된 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 양태에서, 융합 단백질의 SST는 각각 서열 식별 번호 : 17 또는 18로 표시되는 SST-14 또는 SST-28을 인코딩하는 서열의 하나 이상의 탠덤 반복 또는 적어도 하나를 갖는 서열을 포함한다 이들 서열 중 하나와 85 % 상동성. 예를 들어, 융합 단백질의 SST는 SST-14 또는 SST-28이다.
또한, 융합 단백질은 링커 L을 포함하는데, 이는가요 성 또는 알파 나선 구조화 된 폴리펩티드 링커 또는 스페이서이다. 특정 실시 양태에서, L은 2 내지 100 개의 아미노산을 갖는 펩티드이다. 추가의 구체 예에서, L은 하나 이상의 GGGGS, A (EAAAK) 4A, (AP) n 도메인, (G) 8 또는 (G) 5, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 펩티드이고, n은 10-34에서 선택된 정수이다.
융합 단백질은 또한 포유류 혈청 알부민 (ALB)을 포함한다. 특정 실시 양태에서, ALB는 예를 들어 서열 25에 따른 ALB를 포함하는 포유 동물 혈청 알부민, 또는 85 % 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질 서열이다.
? 본 발명의 특정 실시 양태에서, x1, x2, x3, x4는 각각 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수이고, 및/또는 y1, y2, y3은 각각 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수이다.
추가의 구체 예에서, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 이황화 결합에 의해 실질적으로 가교 결합되며, 예를 들어 이황화 결합은 초음파 처리에 의해 형성된다.
본 발명의 입자는 중합체 쉘의 최대 단면 치수가 약 1 미크론 내지 0.01 미크론이되도록 선택적으로 제조된다. 대안 적으로, 본 발명의 입자는 중합체 쉘의 최대 단면 치수가 0.4 미크론 내지 0.01 미크론이되도록 선택적으로 제조된다.
특정 실시 양태에서, 약학적 활성 제제를 함유하는 중합체 쉘은 생체 적합성 수성 액체 또는 생체 적합성 분산제에 현탁된다.
특히, 생체 적합성 분산제는 콩기름, 코코넛 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 면실유, 지방족, 지환 족 또는 4 내지 30 개의 탄소 원자를 갖는 방향족 탄화수소, 2 내지 30 개의 탄소 원자를 갖는 지방족 또는 방향족 알코올, 탄소수 2 내지 30의 지방족 또는 방향족 에스테르, 알킬, 아릴, 또는 탄소수 2 내지 30의 사이 클릭 에테르, 탄소수 1 내지 30의 알킬 또는 아릴 할라이드로부터 선택되고, 이는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 치환기, 3 내지 30 개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 폴리 알킬 렌 글리콜, 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 갖는다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 입자는 진단 성분을 추가로 포함한다. 진단 제는 선택적으로 초음파 조영제, 방사선 조영제, 자기 공명 이미지 조영제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 또한 실질적으로 수 불용성 약제를 이를 필요로하는 대상에게 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은이를 필요로하는 대상에게 유효량의 본 발명의 입자를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 약학적 활성 성분을 포함하는 입자의 제조 방법을 제공한다 :
소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성 제제를 함유하는 수성 매질을 이황화 결합에 의해 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 가교 결합을 촉진시켜 그 안에 약학적 활성 제제를 함유하는 중합체 쉘을 생성시키기에 충분한 시간 동안 전단 조건을 가하는 단계. 약학적 활성제는 선택적으로 분산제에 분산된다. 전단 조건은 예를 들어, 약 10 내지 100,000 psi 범위의 정적 혼합, 고압 균질화, 미세 유동 조건 하에서 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성 제제를 함유하는 수성 매질을 균질화함으로써 제공된다.
약학적 활성 성분은 선택적으로 수용성 또는 수 불용성 항암제이고, 이는 질소 머스타드, 니트로 소 우레아, 에틸렌 이민, 알칸 설포 네이트, 테트라 진, 백금 화합물, 피리 미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항 대사제, 엽산 유사체, 안트라 사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 토포 이소 머라 제 억제제, 호르몬 제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 항암제는 예를 들어 파클리탁셀 또는 도세탁셀이다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명의 입자를 제조 할 때, 전단 조건은 예를 들어 약 2 초 내지 5 초의 시간 동안 약 50 내지 200 watt/cm2 범위의 음향 전력을 포함하는 고강도 초음파에 의해 제공된다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 입자는 종양 소마토스타틴 수용체를 통해 종양 세포에 선택적으로 결합한다.
본 발명을보다 완전하게 이해하기 위해, 다음 용어들이 아래에 정의된다.
본 발명은 약물 전달을위한 작은 크기의 입자, 즉 "마이크로 스피어" 및/또는 "나노 입자"를 광범위하게 제공한다. 마이크로 스피어 및 나노 입자는 포함 된 입자의 평균 단면 직경에 기초하여 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미크론"은 1 천분의 1 밀리미터 (1 μm) 또는 1000 nm의 측정 단위를 의미한다.
본 발명에 따른 "마이크로 스피어"는 약 1㎛ 내지 약 1000㎛ 범위의 평균 단면 직경을 갖는 본 발명의 입자이며,이는 하나 이상의 활성제를 포함하는 코어를 전체적으로 또는 부분적으로 덮는 중합체 쉘을 포함한다.
본 발명에 따른 "나노 입자"는 본 명세서에서 약 0.001 ㎛ 내지 약 1 ㎛ 범위의 평균 단면 직경을 갖는 입자로서 광범위하게 정의된다.
마이크로 스피어는 나노 입자보다 크며, 입자 당 더 많은 활성제를 전달한다는 일반적인 이점 및 활성제의 연장 또는 제어 된 방출을 제공 할 수있는 가능성을 갖고, 예를 들어 피하 또는 근육 내 주사로 조직으로 주사함으로써 쉽게 투여 될 수있다. 그러나, 미소 구체는 정맥 내 투여, 예를 들어 주사 후 덩어리를 응집 또는 형성하는 경향, 및 더 큰 미소 구체의 경우 모세 혈관을 통한 순환에 어려움이있는 특정 단점이있다. 나노 입자, 특히 0.4 μm보다 작은 나노 입자는 미세 구에 비해, 특히 정맥 주사에 대해 이점이 있고, 예를 들어, 나노 입자는 응집 될 가능성이 적고, 망상 내피 계 (resticuloendothelial system, RES)를 피할 가능성이 높고, 피노 사이토 시스를 통해 세포로 들어갈 수 있으며, 고형 종양에서 향상된 투과성 및 보유 (EPR) 효과에 기초하여 종양 조직에서 표적화 및 축적하는 이점을 갖는다. EPR 효과는 중합체 쉘의 SST 융합 단백질 성분의 SST 수용체를 나타내는 종양에 대한 선택적 결합 및 표적화에 추가된다.
또한, "a", "an"및 "the"와 같은 단수 형태는 편의를 위해 본 출원 전반에 걸쳐 사용되며, 그러나, 문맥 또는 명백한 진술이 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태는 복수를 포함하도록 의도된다.
모든 수치 범위는 수치 범위 내의 각각의 모든 수치를 포함하는 것으로 이해되어야하고, 각각의 모든 수치를 개별적으로 인용하는 것으로 해석되어야한다. 동일한 구성 요소 또는 속성으로 향하는 모든 범위의 끝점은 포괄적이며 독립적으로 결합 할 수 있습니다.
본원에 사용 된 용어 "약"은보고 된 수치의 10 % 이내, 바람직하게는보고 된 수치의 5 % 이내를 의미한다.
"본질적으로 구성되는"이라는 문구는 조성물 또는 방법이 추가 성분 및/또는 단계를 포함 할 수 있지만, 추가 성분 및/또는 단계 인 경우에만
청구 된 조성물 또는 방법의 기본 및 신규 특성을 실질적으로 변경하지 않으며, 즉 추가 성분 (들) 및/또는 단계 (들)는 청구 된 조성물 또는 방법에 목적 재료를 제공하지 않을 것이다.
"본질적으로 구성되는"이라는 구절은 조성물 또는 방법이 추가 성분 및/또는 단계를 포함 할 수 있지만, 추가 성분 및/또는 단계가 청구 된 조성물 또는 방법의 기본 및 신규 특성을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만 의미하는데, 즉, 추가 성분 (들) 및/또는 단계 (들)는 청구 된 조성물 또는 방법에 목적 물질을 제공하지 않을 것이다.
본원에 사용 된 용어 "생체 적합성"은 생물학적 시스템이 도입되는 임의의 불리한 방식으로 눈에 띄게 변경되거나 영향을 미치지 않는 물질을 기술한다.
본원에 사용 된 바와 같이, 본 발명의 입자 및 하나 이상의 다른 활성제와의 "공-투여된"또는 "공-투여"라는 용어는 본 발명의 입자와 함께 다른 활성제를 함께 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 광범위하게, 본 발명의 입자는 하나 이상의 활성제를 전달하며, 이러한 활성제 또는 제제는 본 발명의 입자에 포함되지 않은 하나 이상의 다른 활성제를 또한 투여받는 대상에게 투여 될 때 조정 및/또는 상승 효과를 제공할 수 있다.
본원에 사용 된 용어 "대상체"는 본 발명의 입자가 투여되는 임의의 동물을 의미하며, 바람직하게는 동물은 포유 동물이다. 동물 대상은 인간 대상 또는 비인간 대상을 포함할 수 있다. 비 제한적으로, 비인간 또는 동물 대상은 예를 들어 가축 또는 야생 동물의 관리 또는 치료 과정에서 본 발명의 입자가 투여 될 수있는 임의의 동물이다. 비인간 대상은 바람직하게는 길 들여진 포유 동물을 포함한다. 예를 들어, Canis 속의 개 (개, 늑대, 코요테 및 자칼), Felis 속 (예 : 고양이), Camelus (낙타) 속, 에쿠스 (Equus) 속의 구성원 (예 : 말, 엉덩이 및 얼룩말), 하위 가족 Caprinae (양 및 염소)의 구성원 및/또는 Bovinae 하위 가족 (가축 가축, 들소, 아프리카 버팔로, 물소, 야크 및 4 뿔 및 나선형 뿔 영양과 같은 유제). 인간이 아닌 대상은 또한 예를 들어 닭, 오리, 칠면조, 거위, 타조 등과 같은 양식 된 닭과 같은 길 들여진 조류 및/또는 애완용 조류, 예컨대 핀치 및/또는 Psittaciformes 순서의 구성원, 예를 들어 앵무새 및 잉꼬를 포함하는 것으로 고려된다.
본 발명이하기에 상세히 기술되기 전에, 본 발명은 본원에 기술 된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않으며, 이는 다양 할 수 있음을 이해해야한다. 또한, 본 명세서에서 사용 된 용어는 특정 실시 예를 설명하기위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 첨부 된 청구 범위에 의해서만 제한 될 수 있음을 이해해야한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용 된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 1은 시험 관내 소마토스타틴 (SST)-인간 혈청 알부민 (HSA) 파클리탁셀 입자 및 아브 락산 입자로부터의 파클리탁셀의 방출 프로파일을 도시한다. 시간 단위의 시간은 X 축을 따르며 퍼센트 방출은 Y 축을 따릅니다. 다이아몬드 (◆)로 표시된 곡선은 SST-HSA 입자에서 파클리탁셀의 방출을 나타냅니다. 정사각형 (■)으로 표시된 곡선은 Abraxane의 방출을 나타낸다.
본 발명은 하나 이상의 활성제를 함유하는 입자, 및 활성제를 둘러싸고 캡슐화하는 중합체 쉘을 제공한다. 선택적으로, 활성제의 일부는 매체에 노출되거나 중합체 쉘 외부에있다. 중합체 성 쉘은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 일 구현예에서, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 이황화 결합에 의해 실질적으로 가교된다. 입자는 또한 선택적으로 생리 학적으로 허용되는 완충 용액과 같은 약학적으로 적합한 담체에 현탁된다.
활성제
본 발명의 입자는 하나 이상의 약학적 활성 성분을 포함하며, 여기에서 또한 제한없이 활성제, 치료제 또는 활성 약학적 성분 (들) (API)으로 지칭 될 수있다. 활성제는 인간을 포함한 동물 대상과 같은 대상에서 원하는 생물학적 효과를 생성 할 수있는 생리 학적 또는 약학적 활성 물질 일 수있다. "활성제"라는 용어는 또한 진단 제, 또는 영양가의 활성제를 포함하도록 의도된다. 특정 에이전트의 선택은 원하는 애플리케이션에 따라 다릅니다. 용어 "활성제"는 또한 생체 내에서 활성 형태, 예를 들어 프로 드러그 또는 다른 전구체로 전환되는 활성제에 대한 전구체를 포함하도록 의도된다. 활성제는 펩티드, 단백질, 핵산 및 소분자를 포함하는 무기 또는 유기 화합물일 수 있다. 활성제는 다양한 형태 일 수 있으며, 변경되지 않은 분자, 분자 복합체, 약학적으로 허용되는 염과 같은 형태, 히드로 클로라이드, 히드로 브로마이드, 설페이트, 라우 레이트, 팔미 테이트, 포스페이트, 아질산염, 질산염, 붕산염, 아세테이트, 말레 에이트, 타르트 레이트, 올레 에이트, 살리 실 레이트 등과 같은 형태일 수 있다. 산성 치료제로서, 금속, 아민 또는 유기 양이온의 염, 예를 들어 4 차 암모늄이 사용될 수 있다. 염기, 에스테르 및 아미드와 같은 약물의 유도체가 또한 활성제로서 사용될 수있다. 수 불용성 인 활성제는 이의 수용성 유도체 형태 또는 이의 염기 유도체로서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 또는 이의 전달에 의해, 효소에 의해, 체 pH에 의해 가수 분해되거나, 또는 다른 대사 과정에 의해 원래의 치료 학적 활성 형태로 전환된다.
활성제는 화학 요법제와 같은 항암제 일 수 있다. 활성제는 또한 면역 억제 제, 사이토 카인, 세포 독성 제, 핵산 분해성 화합물, 방사성 동위 원소, 수용체, 항염증제, 진통제, 항생제, 항 바이러스제, 항진균제, 항 기생충 제 및/또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 입자에 포함시키기위한 및/또는 본 발명의 입자와의 공-투여를위한 약학적 활성 항암제의 예는 본원에 참고로 포함 된 미국 특허 8,173,115에 열거되어 있고, 질소 머스타드, 니트로 소 우레아, 에틸렌 이민, 알칸 설포 네이트, 테트라 진, 백금 화합물, 피리 미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항 대사 체, 엽산 유사체, 안트라 사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 토포 이소 머라 제 억제제 및 호르몬 제를 광범위하게 포함한다.
특정한 예시적인 화학요법약물은 예를들어 악티노마이신-d, 알케란, Ara-C(아라비노실시토신), 아나스트로졸, 아스파라기나제, 비크누(bicnu), 비칼루타미드, 블레오마이신, 부술판, 카페시타빈, 카보플라틴, 카보플라티늄, 카무스틴, CCNU, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, CPT-11(이리노테칸), 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시토신아라비노사이드, 사이토산, 다카바진(DTIC)독소루비신, 에피루비신, 에틸렌이민, 에토포시드, 플록시리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 포테무스틴, 젬시타빈, 허셉틴, 헥사메틸아민, 하이드록시우레아, 아이다루비신, 이포스파마이드, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토푸린아미드, 미토트렉틴, 파미드로네이트(pamidronate), 펜토스타틴, 플라카마이신, 프로카바진, 리툭시맙, 스트렙토조신, 이마티닙(STI-571, Gleevec®, Glivec®), 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포시드, 테트라진, 티오구닌, 티오테파, 토무덱스, 토포테인, 트리오스테인, 트리오스테인, 트리오스빈틴, 비노렐빈, VP-16및젤로다를 포함한다.
본 발명의 입자에 포함되거나 본 발명의 입자와 공-투여 되는 유용한 항암제를 포함하고, 또한 알킬화제 예를들어, 티오테파 및 시클로포스파미드와같은; 알킬술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메메르도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파르아미드 및 트리메틸올로멜아민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민히드로클로라이드, 멜팔란, 노베비에힌, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실머스타드와 같은 질소 머스타드; 칸누틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 항생제, 예컨대아클라시노신, 악티노마이신, 오트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조오-5-옥소-1-노르루마이신, 독소루비신, 에톡시비신, 마르첼로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포피로마이신, 푸로마이신, 퀴라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베마넥스, 지노스타틴 및 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과같은항대사물질; 엽산유사체, 예컨대데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌과같은퓨린유사체; 피리미딘유사체, 예컨대안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록시리딘 및 5-FU; 안드로겐, 예컨대칼루스테론, 드로모스타놀론프로피오네이트, 에피티오스타놀, 르네피티오스테인 및 테스토락톤; 아미노글루테이미드, 미토타인 및 트리로스탄과같은항부신; 엽산보충제, 예컨대프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 디포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄아세테이트; 에토글루시드; 갈륨질산염; 하이드록시우레아; 렌티나; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 나이트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSKTM; 라자옥산; 시조프란; 스피로마니움; 테누아손산; 트리아지쿠온; 2, 2', 2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피보브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; thiotEPa; 탁소이드, 예를들어 파클리탁셀(Taxol174; , 브리스톨-마이어스스퀴브종양학, 뉴저지주프린스턴), 독세탁셀(Taxotere174; , Rhone-PoulencRorer, Antony, France) 및 카바지탁셀(Jevtana®, Sanofi-Aventis); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(vp-16); 이포스파미드; 미토마이신 c; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 배꼽; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; cpt-11; 토포이소머라제 억제제 RFS2000; 디플루오로메틸오르니틴(dmfo); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 예를들어 타목시펜, 라록시펜, 아로마타제 억제4(5)-이미다졸, 4하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, 오나프리스톤 및 토레미펜(fareston)을 비롯한 항에스트로겐과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제 하는 항호르몬제; 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프로라이드 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는염, 산 또는 유도체가 포함된다.
사이토 카인은 또한 치료제 (들)로서 본 발명의 입자에 포함되거나, 예를 들어 다른 치료제를 공동 처리 또는 증강시키기 위해 본 발명의 입자와 함께 투여 될 수있다. 이러한 사이토 카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다.
폴리 뉴클레오티드는 치료제(들)로서 본 발명의 입자에 캡슐화 될 수 있다. 폴리 뉴클레오티드는 작은 또는 짧은 간섭 RNA ("siRNA"), 마이크로 RNA, RNA, DNA, 안티센스 또는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
전통적인 폴리펩티드 호르몬은 예를들어 성장호르몬, 예컨대 인간성장호르몬, N-메티오닐인간성장호르몬 및 소성장호르몬; 부갑상선호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프롤락신; 여포자극호르몬(FSH), 갑상선자극호르몬(TSH) 및 황체형성호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간장성장인자; 섬유아세포성장인자; 프로락틴; 태반락토겐; 종양괴사인자-α 및 β; 뮬러리안-억제 물질; 마우스성선자극호르몬관련펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관내피성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판성장인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환성장인자(TGF); 인슐린유사성장인자 -I 및 -II(IGF-1 및 IGF-II); 프로스타글란딘(PG); 프로스타글란딘E1(PGE1, 알프로스타딜) 및 프로스타글란딘E2(PGE2, 디노프로스톤); 에리트로포이에틴(EPO); 골유도인자; 인터페론, 예컨대인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니자극인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 과립구-CSF(GCSF); 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자를 포함한다. IGF-1의 반감기는 매우 짧습니다 : 약 10-20 분. 아미노산 유사체 IGF-1 LR3 (긴) 또는 IGF-1 DES (절단)를 만들기 위해 IGF-1을 변형시킬 수있다. IGF-1 DES는 IGF-1보다 10 배 더 강력합니다. 사이토 카인 중에는 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFNα, IFNβ 및 IFNγ 인터페론, 및 이의 공지 된 재조합 변이체가 포함된다. 특히, 재조합 IFN 알파 2b (Intron174; A)는 본 발명에 따른 입자에 포함되거나 특정 조건에 대해 본 발명의 입자와 함께 투여되는 것으로 고려된다. 본원에 사용 된 용어 "사이토 카인"은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양 물 및 생물학적 활성 등가물 인 천연 서열 사이토 카인으로부터의 단백질을 포함한다.
예를 들어, 인터페론은 옥트레오타이드 와 같은 소마토스타틴 유사체의 이점을 증대시키기 위해 위장관 췌장 신경 내분비 종양 (GEP-NETS)과 같은 특정 암의 치료의 일부로서 투여된다. SST- 알부민 융합 단백질 쉘 내에 캡슐화 된 사이토카인, 예를 들어 인터페론을 포함하는 본 발명에 따른 입자는 치료제의 표적화를 향상시키는 추가적인 이점을 제공하는 것으로 고려된다.
바람직하게는, 항암제는 난용성 탁산을 포함한다 (본 명세서에 사용 된 용어 "탁산"은 탁산 유사체 및 프로 드러그, 예를 들어 카바지 탁셀 (Jevtana174;), 파클리탁셀 (Taxol174;) 및 도세탁셀 (Taxotere ™)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 입자에 포함되고/되거나 본 발명의 입자와 함께 투여되는 다른 항암제는 다음을 포함한다.
엘로티닙히드로클로라이드 에버롤리무스, 플루오로우라실, 젬시타빈 히드로클로라이드, 이리노테칸 히드로클로라이드 리포좀, 미토마이신 c, 파클리탁셀 알부민-안정화 된 나노입자 제제, 및/또는 수니티닙 말레이트 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 췌장암 치료용으로 승인 된 약물.
란레오티드 아세테이트, 시스플라틴 및/또는 에토포시드와 같은 위장관 췌장 신경 내분비 종양, 및 상기의 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 치료용으로 승인 된 약물.
카보잔티닙-s-말레이트, 독소루비신 히드로클로라이드, 렌바티닙 메실레이트, 소라페닙 토실레이트 및/또는 반데타닙 및 상기의 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 갑상선암 치료용으로 승인 된 약물.
카버골린 및/또는 브로모크립틴, 및 상기 임의의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 같은 뇌하수체 암 치료제로 승인 된 약물.
본 발명의 입자에 포함될 것으로 예상되고/되거나 본 발명의 입자와 함께 투여되는 마취제는 메톡시플루오란, 이소 플루오란, 엔플루오란, 할로테인, 벤조카인, 단트롤렌, 바르비투레이트 등, 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 작용제를 포함한다.
본 발명의 입자에 포함되는 것으로 고려되고 /되거나 본 발명의 입자와 함께 투여되는 다른 약제에는, 예를 들어 비 스테로이드성 소염제, 예를 들어, 이부프로펜, 피록시캄, 아세틸살리실산, 콜린, 나트륨 및 마그네슘 살리실레이트, 셀레콕시브, 디클로페낙 나트륨/에폴아민, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜칼슘, 플루비프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 메클로페나메이트 나트륨, 메케카믹산 나프록센, 나프록센 나트륨, 옥사프로진, 로페콕시브, 살살레이트, 술린닥, 톨메틴나트륨 및/또는 발데콕시브, 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본 발명의 입자에 포함되는 것으로 고려되고/되거나 그와 함께 투여되는 추가의 약제에는 단순히 예를 들어 H2 차단 제산제, 시메티딘, 파모티딘, 라니티딘과 같은; 실질적으로 수 불용성인 스테로이드 덱사메타손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니손, 코르티손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 디플로라손, 베타메타손 및/또는 테스토스테론가 포함된다.
또한, 본 발명의 입자에 포함되는 것으로 고려되고 및/또는 이와 함께 공-투여되는 것은 실질적으로 수 불용성 면역 억제제, 예를 들어, 시클로스포린, 아자티오프린, FK506, 프레드니손, 미코페놀산, 레푸노미드, 테르플루노마이드, 타크롤리무스, 시클로스포린, 에버롤리무스 및/또는 시롤리무스, 리바록사반 등이다.
또한, 본 발명의 입자에 포함시키고/거나 그것과 병용 투여되는 것은 항생제, 항 바이러스제, 항진균제, 혈액응고 방지제, 항 혈전제 및/또는 항 기생충제와 같은 항 미생물제이다.
항생제 (항균) 제는 예를 들어 살균 또는 정균 효과를 나타내는 임의의 분자를 포함한다. 용어 내에는 예를 들어, 고전 항생제가 포함된다. 예를 들어, 암포테리신 B 클로람페니콜, 에리스로 마이신, 린코 마이신, 푸지산, 스트렙토마이신, 뜸플록시신 기타 아미노 글리코시드 항생제, 테트라사이클린, 폴리믹신, 포스포마이신, 반코마이신, 리스토세틴, 바시트라신, 그라마키딘, 페니실린 및 페팔릴린; 항 대사 물질, 예를 들어 설폰아미드 및 트리메토프림; 및 소분자 독소, 방사성 화합물 및 뉴클레오시드 유사체와 같은 다른 살균제 또는 정균제가 포함된다.
항 바이러스제는 예를 들어, 이독수리딘, 아시클로버, 간치코비르, 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 자나미비르, 네비라핀, 델라비딘, 에파비렌츠, 지도부딘, 디다노신, 잘시타빈, 스타부딘, 라미부딘, 아바카비르, 엠트리시타빈, 암프레나비르, 포암레나비르, 인디나비르, 리토나비르, 사퀴나비르, 넬피나비르, 테노포비르 및/또는 아데포비르를 포함한다.
항진균제는 예를 들어 전신 항진균제, 예를 들어, 암포테리신 B, 보리코나졸, 포사코나졸 및/또는 플루코나졸과 같은 국소 항진균제, 예를 들어, 아모로핀, 부테나핀, 부토코나졸, 카르볼푸신, 시클로피록스, 클리오퀴놀, 클로트리마졸, 에코나졸, 플루코나졸, 그리세오풀빈, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 나프티핀, 니스타틴, 옥시코나졸, 술코나졸, 테르비나핀, 테르코나졸, 티오코나졸 및/또는 톨나프테이트를 포함한다.
항 기생충제는 예를 들어 알벤다졸, 암포테리신 B, 에플로르니틴, 푸마길린, 멜라소롤, 메트로니다졸, 밀테포신, 니클로사미드, 니타졸사니드, 티니다졸, 프라지콴텔, 리팜핀을 포함한다.
본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려되는 진단 제의 예는 초음파 조영제, 방사선 조영제(예: 요오도-옥탄, 할로카본, 레노그라핀 등), 자기 조영제 (예: 플루오로카본, 지용성 상자성 화합물, 양자점 등), 뿐만 아니라 실질적으로 수 불용성인 성질을 수용하기 위해 물리적 및/또는 화학적 변형 없이 쉽게 전달될 수 없는 다른 진단제를 포함한다.
본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려되는 영양가의 제제의 예는 아미노산, 당, 단백질, 탄수화물, 지용성 비타민 (예: 비타민 A, D, E, K 등), 지방, 기능성식품, 예컨대 커큐민 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 입자에 포함 된 제제는 수 불용성 또는 실질적으로 수 불용성 일 수 있다.
본 발명의 입자는 바람직하게는 실질적으로 수 불용성 활성제의 생체 내 전달에 사용된다. 본원에 사용 된 용어 "생체 내 전달"은 경구, 정맥 내, 피하, 복강 내, 경 막내, 근육 내, 흡입, 국소, 경피, 좌제 (직장), 페서리 (질) 등과 같은 투여 경로에 의한 약학적 활성 제제의 전달을 지칭한다.
포함된 제제는 고체 또는 액체 일 수 있으며, 중합체 쉘 내에 실질적으로 또는 완전히 함유될 수 있다.
따라서, 활성 물질의 입자는 약 1 미크론 내지 약 0.001 미크론 이하의 단면 직경을 갖는 쉘 내에 함유 될 수있는 나노 입자이다. 단면 직경이 0.5 미크론 미만인 나노 입자가 더 바람직하고, 0.2 미크론 미만의 단면 직경은 현재 정맥 내 투여 경로에 의해 나노 입자를 투여하기에 가장 바람직한 단면 직경이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 나노 입자는 나노 입자의 제조 방법 및 이들이 사용될 목적에 따라 약 0.05 미크론 내지 약 0.3 미크론의 크기 범위인 것이 바람직하다.
다른 구체 예에서, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 예를 들어 단백질의 자연 구조에서 발생하는 아미노산 시스테인을 통한 이황화 결합의 형성을 통해 선택적으로 가교된다. 예를 들어, 초음파 처리 공정은 용해되거나 현탁 된 약학적 활성 제제를 함유하는 분산제를 설프 하이 드릴 또는 이황화기를 함유하는 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 수용액으로 분산시켜 가교 된 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 쉘이 비 수성 매질의 미세 액적 주위에 형성되도록 사용된다. 초음파 처리 공정은 액체에서 공동 현상을 일으켜 엄청난 국소 가열을 야기하고 설 프히 드릴 잔기를 산화시켜 (및/또는 기존의 이황화 결합을 방해하여) 새로운 가교 이황화 결합을 형성함으로써 중합체를 가교시키는 과산화물 이온을 형성한다.
소마토스타틴-알부민 융합 단백질-약물 제제의 예시적인 범위는 0.01 : 1 내지 약 100 : 1의 단백질 대 약물 비 (w/w)이다. 보다 바람직하게는, 비는 0.02 : 1 내지 약 40 : 1의 범위이다. 융합 단백질 대 약제의 비는 상이한 단백질 및 약제 조합에 대해 최적화되어야하지만, 일반적으로 융합 단백질 대 약제의 비는 약 18 : 1 이하이다(예를 들어, 약 15 : 1, 약 10 : 1, 약 5 : 1 또는 약 3 : 1). 보다 바람직하게는, 비는 약 0.2 : 1 내지 약 12 : 1이다. 가장 바람직하게는, 비는 약 1 : 1 내지 약 9 : 1이다. 바람직하게는, 제형은 본질적으로 Cremophor®가없고, 더욱 바람직하게는 Cremophor EL® (BASF)이 없다. Cremophor®는 피마자유와 에틸렌 옥사이드의 폴리에테르인 비이온성 유화제이다.
추가의 구체 예는 높은 전단력 조건 하에서 제조 된 수 중유 에멀젼으로부터 용매 증발 기술에 의해 본 발명의 입자를 형성하는 방법을 제공한다(예를 들어, 초음파 처리, 고압 균질화 등). 이 방법은 임의의 통상적 인 계면 활성제를 사용하지 않고 그리고 입자의 매트릭스를 형성하기 위해 임의의 중합체 성 코어 재료를 사용하지 않고 수행 될 수 있다. 대신에, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질이 안정화제로서 사용된다.
본 발명은 또한 선택적으로 0.22 미크론 필터를 통해 멸균 여과 될 수있는, 단면 직경이 0.2 미크론 미만인 비정상적으로 작은 입자, 즉 나노 입자의 재현 가능한 형성 방법을 제공한다. 이는 예를 들어 수용성 용매 (예를 들어, 에탄올)를 유기상에 첨가하고 유기상의 유형, 상 분획 및 약물상의 약물 농도를 신중하게 선택함으로써 달성된다. 0.22 미크론 필터에 의해 여과 될 수있는 크기의 나노 입자를 형성하는 능력은 유리하다. 왜냐하면 상당한 양의 임의의 단백질 (예를 들어, 알부민)을 함유하는 제제는 단백질의 열 응고로 인해 오토 클레이 빙과 같은 통상적 인 방법에 의해 멸균 될 수 없기 때문이다.
본 발명은 또한 약학적 활성제 분자의 일부가 소마토스타틴-알부민 융합 단백질에 결합되어 있고, 따라서 대상체에게 투여시 즉시 생체 이용 가능한 약물 전달 시스템을 제공한다. 약학적 활성 제제의 다른 부분은 융합 단백질에 의해 코팅 된 입자 내에 함유된다. 약학적 활성 제제를 함유하는 입자는 임의의 중합체 매트릭스에 의한 희석없이 순수한 활성 성분으로서 존재한다.
본 발명에 따르면, 물 또는 식염수로 쉽게 재구성 될 수있는 분말 형태의 서브 마이크론 평균 단면 직경의 나노 입자가 또한 제공된다. 동결 건조에 의해 물을 제거한 후 분말을 수득한다. 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 본 발명의 나노 입자의 구조적 성분, 및 동결 방지제 및 재구성 보조제로서 작용한다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 0.22 미크론 필터를 통해 여과 가능한 입자의 제조,이어서 건조 또는 동결 건조는 정맥 주사에 유용한 멸균 고체 제제를 생성한다.
본 발명에 따라 생성 된 입자는 결정질, 비정질 또는 이들의 혼합물 일 수있는 것으로 인식되지만, 약물은 제형에 비정질 형태로 존재하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이로 인해 용해 및 흡수가 쉬워지고 생체 이용률이 향상됩니다.
본 발명의 특정 구체 예의 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 인간 혈청 알부민 및/또는 소마토스타틴의 유도체를 포함하는 알부민의 변이체를 포함한다. 본 발명의 다른 구체 예의 스페이서는 한 말단의 소마토스타틴 및 다른 말단의 알부민에 공유 연결된 펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 구체 예에서 스페이서는 2 내지 100 개의 아미노산을 갖는 펩티드 서열을 포함한다.
SST 융합 단백질
본 발명의 입자에 사용되는 소마토스타틴-알부민 융합 단백질, 이를 제조하기위한 벡터 및 숙주 세포 및 단백질의 정제 방법은 국제 출원일 2016 년 2 월 26 일 국제 특허 출원 PCT/US2016/019950 및 2016 년 8 월 26 일 출원 된 미국 특허 출원 제 15/249,346 호에 상세히 기술되어 있다.
소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 이의 유사체는 알부민 (또는 이의 유사체) 모이어티, 소마토스타틴 모이어티 (예를 들어, SST-14, SST-28), 및 두 모이어티를 분리하는 스페이서를 포함하도록 제조된다. 인간 혈청 알부민 및/또는 소마토스타틴의 유도체를 포함하는 알부민의 변형이 또한 융합 단백질의 일부로서 고려된다. 융합 단백질 내의 스페이서는 크기가 약 2 내지 약 100 개의 아미노산 잔기 범위의 펩티드 서열을 포함한다.
일 구현 예에서, 사용 된 융합 단백질은 다음을 포함한다:
SST;
L; 및
ALB,
여기서
SST는 소마토스타틴 또는 이의 유사체 또는 유도체이며;
L은 스페이서 또는 링커이고;
ALB는 알부민 또는 그 유사체 또는 변이체이다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 하기 화학식 I-X 중에서 선택된다.
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1- [SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX); 및
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
여기서
융합 단백질에 적어도 하나의 L이 존재하는 경우, 각각의 x1, x2, x3, x4, y1, y2 또는 y3은 독립적으로 0 또는 1-10으로부터 선택된 정수이다.
또 다른 구체 예에서, 사용 된 알부민-소마토스타틴 융합 단백질은 다음을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다:
SST;
L; 및
ALB,
SST는 소마토스타틴 또는 이의 유사체 또는 유도체이며;
L은 스페이서 또는 링커이고;
ALB는 알부민 또는 그 유사체 또는 변이체이다.
특정 구체 예에서, 뉴클레오티드 서열은 다음 중에서 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하도록 선택된다 :
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1- [SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX); 및
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
여기서
알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 L이 존재하는 경우, 각각의 x1, x2, x3, x4, y1, y2 또는 y3은 독립적으로 0 또는 1-10으로부터 선택된 정수이다.
알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다른 구체 예에서, 스페이서 서열은 서열 번호 31 또는 -GGGGS-로 표시되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열로 구성된다.
다음을 포함하는 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 또한 고려된다 :
(a) 인간 소마토스타틴 펩티드를 인코딩하는 서열의 하나 이상의 인접 반복 물을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 영역;
(b) 인간 혈청 알부민을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제 2 영역;
(c) 2 내지 100 개의 잔기 길이의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 스페이서 영역;
여기서, 스페이서 영역은 제 1 영역과 제 2 영역 사이, 또는 제 1 영역과 다른 제 1 영역 사이에 존재하고;
여기서, 인간 소마토스타틴 펩티드를 인코딩하는 서열의 하나 이상의 인접 반복 물은 각각 서열 번호 17 및 18로 표시되는 SST-14 또는 SST-28, 또는 이들 두 서열 중 적어도 하나와 85 % 이상의 상동성을 갖는 서열을 인코딩하거나; 또는
여기서, 스페이서 서열은 서열 번호 31 또는 GGGGS 또는 서열 번호 30 A (EAAAK) 4A로 표시되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열로 이루어지고; 또는
상기 영역 (a)는 각각 서열 식별 번호 : 23 및 24로 나타낸 바와 같이 SST-14 또는 SST-28의 하나 이상의 인접 반복부 또는 이들 두 서열 중 적어도 하나와 85 % 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성된다.
알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 또 다른 구체 예에서, 제 1 영역 (a)는 서열 번호 17 또는 18, SST-14, SST-28 또는 이의 단편에 대해 적어도 85 % 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다.
알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 추가의 구체 예에서, 제 2 영역 (b)는 서열 번호 19에 대해 적어도 85 % 서열 상동성을 갖는 폴리 펩타이드, 알부민 또는 이의 단편을 인코딩한다.
또한, 본 발명에 의해 사용 된 융합 단백질은 다음을 포함하는 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 포함하는 것으로 고려된다 :
(a) 소마토스타틴 펩티드 (인간 소마토스타틴 펩티드 일 수 있음)의 폴리펩티드 서열을 포함하는 제 1 영역;
(b) 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민 일 수 있음)의 폴리펩티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제 2 영역;
(c) 2 내지 100 개의 잔기 길이의 폴리펩티드를 포함하는 스페이서 영역.
스페이서 영역 (c)은 영역 (a)와 영역 (b) 사이 또는 영역 (a)와 영역 (a) 사이에 존재할 수있다. 또한, 영역 (a)는 각각 서열 번호 17 또는 18로 표시되는 SST-14 또는 SST-28을 인코딩하는 서열의 하나 이상의 탠덤 반복, 또는 이들 서열 중 하나와 85 % 상동성을 갖는 서열을 포함 할 수 있다 .
적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 제조하는 일반적인 방법은 예를 들어 본원에 참고로 포함 된 미국 특허 제 9,296,809 호에 기재되어있다. 본 발명에 의해 사용되는 알부민-소마토스타틴 융합 단백질의 재조합 발현은 융합 단백질을 인코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로한다. 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드가 수득되면, 알부민-소마토스타틴 융합 단백질의 생산을위한 벡터는 당 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성 될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 알부민-소마토스타틴을 함유하는 폴리 뉴클레오티드를 발현시켜 융합 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어있다. 당 업계에 널리 공지 된 방법을 사용하여 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 갖는 발현 벡터를 구축 할 수있다. 이들 방법은 예를 들어 시험 관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제조된다.
제조 된 발현 벡터는 통상적 인 기술에 의해 숙주 세포로 형질 감염되고,이어서 형질 감염된 세포는 통상적 인 기술에 의해 배양되어 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 생성한다. 따라서, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 인코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 사용된다.
알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용 될 수있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 생성되고 후속 적으로 정제 될 수있는 비히클을 나타내지 만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질 전환되거나 형질 감염 될 때 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 현장에서 발현 할 수있는 세포를 나타낸다. 호스트 시스템은 예를 들어 미국 특허 제 8,969,538 호에 개시되어있다. 여기에는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 알부민-소마토스타틴 융합 단백질 코딩 서열을 함유하는 코스 미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환 된 박테리아 (예를 들어, E. coli, B. subtilis)와 같은 미생물; 알부민-소마토스타틴 융합 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 전환 된 효모 (예를 들어, 사카로 마이 세스, 피 키아); 알부민-소마토스타틴 융합 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 배큘로 바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리 플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 알부민-소마토스타틴 융합 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질 전환 된 식물 세포 시스템; 또는 포유 동물 세포의 게놈(예 : 메탈 로티 오네 인 프로모터) 또는 포유 동물 바이러스(예 : 아데노 바이러스 후기 프로모터; 백시 니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래 된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작 제물을 보유하는 포유 동물 세포 시스템(예 : COS, CHO, BHK, HEK293 세포, 3T3 세포, 쥐과 Sp2/0 세포)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일시적으로 형질 감염된 포유 동물 세포 이외에, 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 발현하는 안정한 풀 또는 안정한 세포주의 형태로 안정적으로 형질 감염된 세포가 또한 포함된다.
본 발명의 특정 구체 예에서, 본 발명의 입자는 표 1의 폴리펩티드 서열을 갖는 단리 및 정제 된 알부민-소마토스타틴 융합 단백질 (예를 들어, 알부민-소마토스타틴 융합 단백질의 폴리펩티드 서열 또는 이러한 단백질을 발현하는 플라스미드 작 제물)을 포함한다.
표 1
폴리 펩타이드 서열의 비제한적 목록
SEQ ID NO: 설명
SEQ ID NO: 1 SST14-A(EAAAK)4A-HSA-A(EAAAK)4A-SST14
SEQ ID NO: 2 HSA-A(EAAAK)4A-SST14
SEQ ID NO: 3 His6-GGGGS-HSA-GGGGS-SST14-HSA
SEQ ID NO: 4 His6-GGGGS-HSA-GGGGS-(SST14-GGGGS)2-HSA
SEQ ID NO: 5 HSA-GGGGS-(SST14-GGGGS)2- HSA
SEQ ID NO: 6 Linker GGGGGGGG
SEQ ID NO: 7 SST14-(GGGGS)3-HSA
SEQ ID NO: 8 SST14-A(EAAAK)4A-HSA
SEQ ID NO: 9 His6-GGGGS-HSA-GGGGS-SST14
SEQ ID NO: 10 SST14-GGGGS-HSA-GGGGS-His6
SEQ ID NO: 11 HSA-GGGGS-SST14
SEQ ID NO: 12 SST14-GGGGS-HSA
SEQ ID NO: 13 (SST14-GGGGS)2- HSA
SEQ ID NO: 14 (SST14-GGGGS)4- HSA
SEQ ID NO: 15 HSA-(GGGGS)3-SST14
SEQ ID NO: 16 HSA-(GGGGS)6-SST14
SEQ ID NO: 17 SST-14
SEQ ID NO: 18 SST-28
SEQ ID NO: 19 HSA
SEQ ID NO: 20 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (Signal Peptide)
SEQ ID NO: 21 Linker APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO: 22 Linker APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO: 30 A(EAAAK)4A peptide
SEQ ID NO: 31 GGGGS peptide
SEQ ID NO: 32 Linker GGGGSLVPRGSGGGGS
SEQ ID NO: 33 Linker GSGSGS
SEQ ID NO: 34 Linker GGGGSLVPRGSGGGG
SEQ ID NO: 35 Linker GGGGSLVPRGSGGGGS
SEQ ID NO: 36 Linker GGSGGHMGSGG
SEQ ID NO: 37 Linker GGSGGSGGSGG
SEQ ID NO: 38 Linker GGSGGHMGSGG
SEQ ID NO: 39 Linker GGSGG
SEQ ID NO: 40 Linker GGGGSLVPRGSGGGGS
SEQ ID NO: 41 Linker GGSGGGGG
SEQ ID NO: 42 Linker GSGSGSGS
SEQ ID NO: 43 Linker GGGSEGGGSEGGGSEGGG
SEQ ID NO: 44 Linker AAGAATAA
SEQ ID NO: 45 Linker GGGGG
SEQ ID NO: 46 Linker GGSSG
SEQ ID NO: 47 Linker GSGGGTGGGSG
SEQ ID NO: 48 Linker GSGSGSGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS
융합 단백질, 예를 들어 서열 번호 1-5, 7-10 및 13-16의 경우, 이들은 22 잔기 신호 펩티드 (서열 번호 20)를 갖는 프로-단백질로 인코딩됨에 유의해야한다.
소마토스타틴-알부민 융합 단백질
본 발명은 소마토스타틴 모이어티가 내인성 인간 SST-14 또는 SST-28의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85 % 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 구성체를 포함하는 입자를 포함한다 (서열 번호 23 및 24).
본 발명은 또한 인간 혈청 알부민 모이어티가 내인성 인간 혈청 알부민의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85 % 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 작 제물을 포함하는 입자를 포함한다 (서열 번호 : 25). 폴리 펩타이드 작 제물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 또한 선택적으로 서열 번호 25에 대해 90 % 또는 95 % 이상의 서열 상동성을 가질 수있다. 본 발명은 인간 혈청 알부민 잔기가 내인성 인간 혈청 알부민 단백질의 단편 인, 예를 들어 서열 번호 25의 서브 서열로 구성된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 구성체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민 단편은 선택적으로 3 개의 인간 혈청 알부민 구형 도메인 중 하나 이상을 포함하며, 이들 각각은 2 개의 서브 도메인, 명명 된 서브 도메인 IA, IB, IIA, IIB, IIIA 및 IIIB를 함유한다(Dockal, 1999, The Journal Of Biological Chemistry, 274(41): 29303-29310).
본 발명은 또한 소마토스타틴 부분이 내인성 SST-14 또는 SST-28의 폴리펩티드 서열 (각각 서열 번호 17 및 18)과 85 % 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드 구조물을 포함하는 입자를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 혈청 알부민 모이어티가 성숙한 인간 혈청 알부민의 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 85 % 서열 상동성, 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 작 제물을 포함하는 입자를 포함한다 (서열 번호 : 19).
본 발명은 또한 신호 펩티드, 정제 태그 (His-6), 제 1 링커, 인간 혈청 알부민 모이어티, 제 2 링커 및 소마토스타틴 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 입자를 포함한다. 한 구체 예에서, 융합 단백질은 서열 번호 : 9로 표시되는 폴리펩티드 또는 이의 서열 상동성을 85 % 갖는 서열이다.
본 발명은 또한 소마토스타틴 모이어티, 제 1 링커, 인간 혈청 알부민 모이어티, 제 2 링커, 소마토스타틴 모이어티 및 정제 태그 (His-6)를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 입자를 포함한다. 한 구체 예에서, 융합 단백질은 폴리펩티드가 서열 번호 10으로 표시되거나, 서열 상동성이 85 %, 90 % 또는 95 % 인 서열이다.
융합 단백질은 펩티드 스페이서에 의해 분리 된 N- 말단 인간 혈청 알부민 모이어티 및 C- 말단 소마토스타틴 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호 11)에 의해 인코딩된다. 대안 적으로, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11과 85 %, 90 % 또는 95 % 서열 상동성을 갖는 알부민-소마토스타틴 융합 작 제물을 대안 적으로 인코딩한다.
뉴클레오티드 서열 (서열 번호 12)은 대안 적으로 N- 말단 소마토스타틴 부분 및 펩티드 스페이서에 의해 분리 된 C- 말단 인간 혈청 알부민 부분을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 대안 적으로, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12와 85 %, 90 % 또는 95 % 서열 상동성을 갖는 알부민-소마토스타틴 융합 작 제물을 인코딩한다.
융합 단백질은 대안 적으로, 소마토스타틴 부분이 탠덤으로 배열 된 SST-14 또는 SST-28 서열의 2 개 이상의 카피를 포함하는 폴리 펩타이드, 즉, 각각 "(SST-14) 2"또는 "(SST-14) 3"또는 "(SST-28) 2"또는 "(SST-28) 3",를 포함한다. 선택적으로, 링커 서열은 2 개 이상의 탠덤 소마토스타틴 부분 사이에 포함되고 /되거나 신호 펩티드 서열은 융합 단백질의 N- 말단에 포함된다.
융합 단백질은 대안 적으로, 소마토스타틴 모이어티가 SST14의 하나 이상의 카피가 각각 알부민에 의해 양쪽에 연결되는 방식으로 배열 된 SST-14 서열의 2 개 이상의 카피를 포함하는 폴리 펩타이드를 포함한다. 선택적으로, 링커 서열은 2 개 이상의 탠덤 소마토스타틴 부분 사이 및 소마토스타틴과 알부민 사이에 포함되고 /되거나 신호 펩티드 서열은 융합 단백질의 N- 말단에 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드 구조물은 신호 펩티드, 스페이서에 의해 분리 된 2 개의 SST-14 잔기, 제 2 스페이서 및 대표되는 HSA 잔기를 포함 할 수있다. 선택적으로, 작 제물은 N- 말단 신호 펩티드를 생략한다.
융합 단백질은 대안 적으로, 소마토스타틴 부분이 탠덤으로 배열 된 SST-28 서열의 2 개 또는 3 개의 사본, 즉 각각 "(SST-28) 2"또는 "(SST-28) 3"을 포함하는 폴리 펩타이드 작 제물을 포함한다. 선택적으로, 링커 서열은 2 개 이상의 탠덤 소마토스타틴 부분 사이에 포함된다.
융합 단백질은 대안 적으로, 전술 한 단락에 기재된 임의의 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 알부민-소마토스타틴 융합 단백질은 내인성 SST-14 또는 SST-28 펩티드보다 생체 내 반감기가 더 길다.
융합 단백질은 대안 적으로 이전 단락에 기재된 임의의 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서, 알부민-소마토스타틴 융합 단백질은 내인성 SST-14 또는 SST-28과 비교하여 소마토스타틴 수용체에 대해 대략 동일하거나 더 큰 결합 친화도를 갖는다.
융합 단백질은 대안 적으로 SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 및 SEQ ID NO : 2로 표시되는 N- 말단 알부민 모이어티, SEQ ID NO : 7 및 SEQ ID NO : 8로 표시되는 내부 SST 모이어티 및 C- 말단 알부민 모이어티를 포함하는 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, N- 말단은 신호 펩티드를 추가로 포함 할 수있다.
선택적으로, 하나 이상의 알부민 및 SST 도메인은 각각 서열 번호 1로 나타낸 바와 같이 독립적으로 선택된 링커 서열에 의해 분리 될 수있다. 일부 실시 양태에서, SST 모이어티는 2 개 이상의 탠덤 SST 반복 부 사이에 개재 간격 서열을 갖거나 갖지 않는 한 쌍 또는 복수의 탠덤 SST 서열, 예를 들어 (SST-14)2 또는 (SST-28)3을 포함 할 수있다. 선택적으로, 융합 단백질의 정제를 보조하기 위해 하나 이상의 정제 태그 서열이 2 개의 부분 사이의 서열에 또는 N 또는 C- 말단에 포함될 수 있다. 대안적인 구체 예는 서열 번호 4로 표시되는 바와 같이 스페이서에 의해 분리 된 한 쌍의 SST-14 부분을 포함한다. 추가의 구체 예는 서열 번호 5로 표시되는 폴리펩티드 서열에 의해 나타낸 바와 같이 정제 태그 (예를 들어, His6)를 생략 할 수있다.
소마토스타틴
본 발명의 융합 단백질과 함께 사용하기위한 소마토스타틴 도메인은 임의의 적합한 소마토스타틴 도메인, 이의 유사체 또는 유도체 일 수있다. 인간 소마토스타틴, 임의의 다른 단리 또는 천연 유래 소마토스타틴 일 수있다. SST 부분은 옥 트레오 타이드, 란 레오 타이드, 파시 레오 타이드, 세 글리 타이드, 바 프레 오타 이드, SST 수용체 1 길항제 (예를 들어, L797-591), SST 수용체 2 길항제 (예 : L779-976), BIM 23014 (옥 트레오 티드), CH-275 (CAS 번호 174688-78-9), SST 수용체 3 길항제 (예 : L796-778), SST 수용체 4 길항제 (예 : L803087) 및/또는 SST 수용체 5 길항제 (예 : Pasireotide, L817818)와 같은 유사체 일 수 있다.
융합 단백질은 또한 대안 적으로 소마토스타틴 부분이 소마토스타틴 유사체를 포함하는 폴리 펩타이드 작 제물을 포함 할 수있다. 바람직하게는, 이러한 유사체는 재조합 숙주 세포에서 융합 단백질의 일부로서 발현에 적합하다. 본원에 개시된 임의의 예에 포함 된 SST-14 또는 SST-28 서열 대신 적합한 소마토스타틴 유사체 서열이 사용될 수있는 것으로 이해된다.
융합 단백질은 대안 적으로 소마토스타틴 모이어티가 소마토스타틴 폴리펩티드 서열, 예: SST-14 또는 SST-28; 서열 번호 : 17 및 18의 2 개 이상의 탠덤 반복을 포함하는 폴리펩티드 컨스트럭트를 포함 할 수 있다. 반복 된 소마토스타틴 폴리펩티드 서열 각각은 SST-14 또는 SST-28과 85 % 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열 일 수있다. 이들 반복 된 변이체 서열은 독립적으로 선택되며, 즉 일부 실시 양태에서 반복은 동일하지만, 다른 실시 양태에서는 이들이 고유하다.
알부민
본 발명에 사용하기위한 알부민은 임의의 알부민, 이의 유사체 또는 변이체 일 수있다. 알부민은 인간 혈청 알부민, 소 또는 말 혈청 알부민, 조류 알부민, 예를 들어 닭고기 알부민 및/또는 임의의 다른 단리되거나 자연적으로 발생하는 알부민 또는 이의 단편 일 수있다.
융합 단백질은 대안 적으로 인간 혈청 알부민 잔기가 자연 형태보다 추가로 또는 더 적은 시스테인 잔기의 존재로 인해 대안적인 배열 또는 이황화 결합의 수를 갖는 폴리펩티드 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 또한 포함 할 수있다 (예를 들어, 서열 번호 : 25).
알부민은 또한 다른 알부민 변종, 예를 들어, 프로 알부민 : 크라이스트 처치 타입 (Gainesville, Y- 혈청 3433), 타케 푸 타입, 릴 타입 (풀리 바우어, 도키 시마, 타이페이); 알부민 변이체 : Nagasaki-3, Yanomama-2, Tagliacozzo, Parklands, Naskapi type (Mersin), Nagasaki-2, Maku, Mexico-2, B, Mi/Fg; 체인 종료 (Ge/Ct) 등을 포함한다.
스페이서 또는 링커
전술 한 바와 같이, 스페이서 또는 링커가 본 발명에 사용될 수있다. 스페이서 또는 링커는 소마토스타틴 또는 알부민과 독립적 일 수있다.
융합 단백질은 대안 적으로 링커로서 대안 적으로 지칭되는 펩티드 스페이서가 길이가 약 2 내지 약 100 개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 폴리펩티드 구조물을 추가로 포함한다. 융합 단백질은 대안 적으로 펩티드 스페이서 길이가 약 2 내지 약 50 개 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 2 내지 약 30 개, 또는 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 20 개의 아미노산 잔기 인 폴리펩티드 구조물을 포함한다.
융합 단백질은 대안 적으로 펩티드 스페이서 (또는 링커라고도 함)가 폴리펩티드 서열 "GGGGS"(서열 번호 31)를 갖는 폴리펩티드 구조물을 포함한다. Gly, Ser 또는 Thr가 풍부한 폴리펩티드는 다음과 같은 특별한 장점을 제공한다: (i) 인접 도메인이 다른 도메인에 대해 자유롭게 이동하도록 폴리펩티드 골격의 회전 자유도; (ii) 향상된 용해도; (iii) 단백질 분해에 대한 내성. 또한, 많은 천연 링커는 알파-나선 구조를 나타냈다. 알파-나선 구조는 Gly rich 링커보다 더 단단하고 안정적이다. 서열 A (EAAAK) 4A (서열 번호 : 30)를 갖는 경험적 강성 링커는 기능성 도메인을 분리하는데 사용될 수있다. 단백질 도메인을 함께 연결시키는 역할 외에도, 인공 링커는 융합 단백질의 생산에 생물학적 활성 개선, 단백질 발현 증가 및 바람직한 약동학 적 프로파일 달성과 같은 다른 이점을 제공 할 수있다.
표 2
본 발명의 융합 단백질 구축물에 사용될 수있는 비 제한적 링커 서열 목록.
GGGGSLVPRGSGGGGS (SEQ ID NO: 32)
GSGSGS (SEQ ID NO: 33)
GGGGS LVPRG SGGGG (thrombin proteolytic site is underlined) (SEQ ID NO: 34)
GGGGS LVPRG SGGGGS (thrombin proteolytic site is underlined) (SEQ ID NO: 35)
GGSGGHMGSGG (SEQ ID NO: 36)
GGSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 37)
GGSGGHMGSGG (SEQ ID NO: 38)
GGSGG (SEQ ID NO: 39)
GGGGS LVPRGS GGGGS (thrombin proteolytic site is underlined) (SEQ ID NO: 40)
GGSGGGGG (SEQ ID NO: 41)
GSGSGSGS (SEQ ID NO: 42)
GGGSEGGGSEGGGSEGGG (SEQ ID NO: 43)
AAGAATAA (SEQ ID NO: 44)
GGGGG (SEQ ID NO: 45)
GGSSG (SEQ ID NO: 46)
GSGGGTGGGSG (SEQ ID NO: 47)
GT
GSGSGSGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 48)
GGS
GGGGGGGG (SEQ ID NO: 6)
A(EAAAK)4A (SEQ ID NO: 20)
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 21)
APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 22)
소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 제조
본 발명에 따라 사용되는 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 벡터를 숙주 내로 도입하는 것을 인코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 융합 단백질을 발현시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 융합 단백질은 효모와 같은 숙주에서의 발현에 의해 수득된다. 예를 들어, 피 키아 파스 토리스 GS115가 적합한 발현 숙주로서 사용될 수 있고, 재조합 발현을 구축하는데 사용 된 벡터는 pPIC9K이다. 또한, CHO 또는 HEK293과 같은 포유 동물 계통이 바람직한 발현 숙주로서 사용될 수있다.
이전 단락 중 임의의 단락에 기재된 소마토스타틴 알부민 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 알부민 소마토스타틴 융합 단백질을 발현 할 수있는 플라스미드 작 제물도 제공된다. 예를 들어, 적합한 플라스미드 작 제물은 본원에 개시된 임의의 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 서열 번호 26으로 표시되는 pcDNA3.1 벡터를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 당 업계에 공지 된 다른 적합한 단백질 발현 벡터는 발현 숙주에 기초하여 선택 될 수 있다(예를 들어, 포유 동물 프로모터 시스템을 갖는 발현 벡터는 인간 세포주에서의 발현에 적합 할 것이지만, 이들 유기체 중 어느 하나에서의 발현이 요구된다면 효모 또는 박테리아 발현 플라스미드가 선택 될 것이다).
상기 단락 중 임의의 단락에 기재된 바와 같이, 소마토스타틴 알부민 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 작 제물로 형질 전환 된 박테리아 또는 효모 세포를 포함하는 박테리아 또는 효모 단백질 발현 시스템이 또한 제공된다. 적합한 박테리아 균주는 예를 들어 대장균을 포함한다. 적합한 효모 균주는 예를 들어 피 키아 파스 토리스를 포함한다. 예시적인 플라스미드 작 제물은 서열 번호 27로 표시되는 pPIC9K (Invitrogen)를 포함하며, 본원에 기재된 임의의 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 벡터의 다중 클로닝 부위에 통합하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기 단락 중 임의의 단락에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 서열을 갖는 단리 및 정제 된 융합 소마토스타틴 융합 단백질이 또한 제공된다.
표 3
본 발명의 특정 구체 예에서 뉴클레오티드 서열의 목록
SEQ ID NO: 뉴클레오티드 서열은 다음을 인코딩합니다 : 설명
SEQ ID NO: 23 SST14 Somatostatin-14 (SST-14)
SEQ ID NO: 24 SST28 Somatostatin-28 (SST-28)
SEQ ID NO: 25 Human Serum Albumin mature form Human Serum Albumin (HSA)
SEQ ID NO: 26 pcDNA3.1(+) Vector pcDNA3.1(+) Vector mammalian expression vector
SEQ ID NO: 27 pPIC9K Vector yeast expression vector
SEQ ID NO: 28 GGGGS GGGGS Linker
SEQ ID NO: 29 A(EAAAK)4A alpha-helical linker
SST가 소마토스타틴 유사 체인 경우, 당 업계에 공지 된 대안적인 방법을 사용하여 접합체를 제조 할 수있다. 이러한 대안적인 방법은 선택적으로 화학적 합성, 펩티드의 화학적 변형, 단백질 합성 동안의 비 천연 아미노산 혼입 등에 의한 것이다.
다양한 링커 서열을 갖는 11 개의 SST14- 알부민 융합 단백질 구조물이 설계되었다. 이들 작 제물 중 8 개를 플라스미드 내에서 융합 유전자로 만들고 100mL 규모로 HEK 293 일시적 발현에 의해 생성 하였다. 단백질을 배양 배지로부터 수집하고, 알부민-기반 친화도 정제를 통해 정제하고, 저장 완충액으로 투석 하였다. 이들 융합 단백질은 SSTR2 수용체에 대한 이들의 결합 친화도 및 SSTR2- 과발현 CHO-K1 세포주에서 cAMP 생성을 억제하는 세포-기반 활성에 대해 평가되었다. 이들 연구의 결과는 링커의 길이 및 유형이 SSTR2 수용체 결합 친화도, 시험 관내 세포-기반 기능적 활성 및 융합 단백질 생산 수율에 유의하게 영향을 미쳤다는 것을 나타내었다.
SST- 알부민 융합 단백질은 상응하는 비 융합 SST 분자와 비교하여 시험 관내 및/또는 생체 내 용액 또는 제약 조성물에서 더 긴 혈청 반감기 및/또는보다 안정화 된 활성을 가질 수있다. 래트 혈장에서, 예를 들어, 40 분의 인큐베이션까지 90 % 초과의 SST 융합 단백질이 검출되었고, SST 융합 단백질의 70 % 초과가 180 분 이상까지 유지되었다. 동일한 조건 하에서, 40 분 배양 후 약 50 % 미만의 유리 SST가 남아 있었고, 120 분 이후에는 유리 SST가 검출되지 않았다. 래트에서의 혈장 SST 융합 단백질 농도의 측정은 SST 융합 단백질의 농도가 SST 단독의 혈장 농도에 의해 나타나는 수 분의 T1/2와 대조적으로 ~ 6 시간의 T1/2와 함께 천천히 감소 함을 보여 주었다. 따라서, SST 융합 단백질의 농도가 혈장에서 제로 농도에 도달하는 데 약 72 시간이 소요될 것이다.
또한, SST- 알부민 융합 단백질은 상응하는 비 융합 된 유리 SST 분자와 비교하여 시험 관내 및/또는 생체 내 용액 또는 제약 조성물에서 유의하게 더 긴 혈청 반감기 및/또는 개선 된 약동학 적 프로파일을 나타냈다. 유리 SST 및 SST 융합 단백질의 안정성을 시험 관내 래트 혈장에서 비교 하였다. 37 ℃에서 새로 제조 된 래트 혈장에서 배양 될 때, 유리 SST 및 SST 융합 단백질은 각각 33 분 및 5.5 시간의 분해 반감기를 나타냈다.
유리 SST에 비해 SST 융합 단백질의 개선 된 안정성을 입증하기 위해 생체 내 약동학 적 프로파일이 또한 생성되었다. SST 융합 단백질로 정맥 내로 투여 된 래트는 2 상 약동학 적 프로파일을 나타내었고, 여기서 α- 상 T1/2는 1.01 시간이고 β- 상 T1/2는 6.14 시간이었다. 계산 된 반감기는 래트에서 유리 SST의보고 된 혈장 T1/2보다 상당히 길다(< 1 분; Yogesh C. Patel and Thomas Wheatley. In Vivo and in Vitro Plasma Disappearance and Metabolism of Somatostatin-28 and Somatostatin-14 in the Rat. Endocrinology. Vol. 112, No. 1 (1992), pages 220-225.).
본 발명 입자의 제조 및 이용
따라서, 본 발명의 입자는 캡슐화 된 활성제가 효과적인 것으로 알려진 임의의 상태를 진단 또는 치료하기 위해 고려된다. 암을 치료하기 위해, 본 발명은 임의의 이전 단락에 기재된 바와 같이 본 발명의 입자를 투여함으로써 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함하는 것으로 고려된다. 여기서 상기 암은 예를 들어 유방암, 결장 직장암, 간암, 폐암, 내분비 암, 신경 내분비 암, 췌장암 및 전립선 암으로부터 선택된다.
예를 들어, 입자는하기 기재된 방법에 의해 제조 될 수있다.
알부민 융합 단백질의 입자는 유기 용매의 첨가 및 승온에서의 안정화 또는 확산에 의한 균질화, 유화 또는 화학적 가교를 포함 하나 이에 제한되지 않는 몇몇 상이한 제조 방법에 의해 생성 될 수있다. 알부민 융합 단백질의 입자는 또한 생분해 성 중합체, 비 분해성 중합체, 지질, 오일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 담체의 일부로서 다른 물질을 포함 할 수있다. 생분해 성 중합체는 바이오 폴리에스터(폴리(락트산-글리콜산)/PLGA, 폴리락트산/PLA, 폴리글리콜산/ PGA, 폴리카프로락톤/PCL, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리-L-락티드/MPEG-L-PLA, 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리-DL-락티드/MPEG-DL-PLA, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리 (ε-카프로락톤)/MPEG-PEG-PCL, 폴리에틸렌글리콜-b-폴리{N'-[N-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스파르타마이드}/PEG-PAsp(DET), 폴리히드록시부티레이트), 다당류 및 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 알부민 융합 단백질로 형성된 입자는 일반적으로 나노 입자 또는 마이크로 스피어이다. 즉, 나노 입자의 경우 직경이 약 0.001㎛ 내지 약 1㎛이고, 미소 구체의 경우 직경이 1㎛ (1 미크론) 내지 약 1000㎛ 인 단면 직경을 갖는다. 일 구체 예에서,이 크기 범위는 이들 나노 입자 및 미세 구의 생체 분포 또는 약동학 적 특성에 중요하다. 직경 100-200 nm 미만의 작은 입자는 일반적으로 망상 내피 시스템 (RES)에 의해 흡수되어 간 및 비장뿐만 아니라 고형 종양에 축적됩니다. 직경이 5-100 μm 인 더 큰 입자는 일반적으로 모세관 층을 목표로한다. 특정 조직, 예: 환자의 팔의 삼각근, 허벅지의 넓적한 측근, 엉덩이의 심근, 및 엉덩이의 뒷근육,에 주사 할 때,이 5-100 μm 직경의 입자는 장기간 방출된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 미세 구는 소분자 및 거대 분자 둘 다를 포함하는 치료제 또는 진단 제를 운반 할 수 있다.
광범위하게, 본 발명의 미소 구체는 다음에 의해 제조된다:
1. 고압 균질화 방법을 사용한 SST-HSA 단백질 결합 된 파클리탁셀 입자의 제조.
SST-HSA 용액은 SST-HSA 단백질 스톡 용액을 탈 이온수 (DI)에 첨가하여 제조된다. 10 mg 파클리탁셀을 클로로포름에 용해시키고 SST-HSA 용액에 첨가하면서 균질화하여 10 : 1 (w/w)에서 SST-HSA 단백질 대 파클리탁셀의 비율로 에멀젼을 형성한다. 이어서, 에멀젼 용액을 회전식 증발기로 옮겨 유기 용매를 제거한 후 동결 건조 공정을 수행한다. 이어서, SST-HSA/파클리탁셀 분말을 0.9 % 식염수로 재구성하고 여과에 의해 추가로 분별한다. 분획은 입자 크기를 측정하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 상기 제제는 Malvern Zeta Sizer에 의해 측정 된 바와 같이 Z- 평균 직경에서 86 nm(범위 43-122 nm), 164 nm (범위 79-190 nm) 및 235 nm (범위 106-295 nm)의 입자 크기를 갖는 3 개의 분획을 생성 하였다.
2. 고압 균질화 방법을 이용한 SST-HSA/HSA 단백질 결합 된 파클리탁셀 나노 입자의 제조
SST-HSA/HSA 용액의 혼합물은 물에 SST-HSA : HSA = 1 : 9-1:19의 비율로 SST-HSA 단백질 원액 및 HSA를 첨가함으로써 제조된다. 파클리탁셀을 먼저 클로로포름에 용해시키고, 균질화하면서 SST-HSA 및 HSA 대 파클리탁셀의 10 : 1 (w/w) 비로 에멀젼을 형성하도록 균질화하면서 SST-HSA/HSA 용액에 첨가한다. 이어서, 에멀젼 용액을 회전식 증발기로 옮겨 유기 용매를 제거한 후 동결 건조 공정을 수행한다. 이어서 SST-HSA/HSA/파클리탁셀 분말을 0.9 % 식염수로 재구성하여 입자 크기를 측정한다. 예를 들어, 상기 제제는 Malvern Zeta Sizer에 의해 측정 된 206 nm (범위 78-220 nm) (SST-HAS : HSA = 1:9) 및 177 nm (범위 68-164 nm) (SST-HSA : HSA = 1:19)에서 Z- 평균 입자 크기를 갖는 3 개의 분획을 생성 하였다.
3. 고압 균질화 방법을 이용한 SST-HSA 단백질 결합 도세탁셀 나노 입자의 제조
SST-HSA 용액은 SST-HSA 단백질 저장 용액을 탈 이온수에 첨가하여 제조된다. 도세탁셀은 클로로포름에 용해된다. 도세탁셀 용액을 SST-HSA 용액에 첨가하면서 균질화하여 에멀젼을 형성한다. 이어서 균질화 된 에멀젼을 회전 증발기로 옮겨 유기 용매를 제거한다. 이어서, 최종 분산액을 0.8 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하고 동결 건조시켰다. 재구성 된 나노 입자 크기는 0.9 % 식염수 용액에서 측정된다. 분획은 입자 크기를 측정하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 나노 입자 크기를 갖는 3 개의 분획이 Malvern Zeta Sizer에 의해 측정 된 Z- 평균 직경에서 113 nm 또는 0.113 μm (범위 68-295 nm) 인 3 개의 분획을 제조 하였다.
소마토스타틴 수용체를 보유하는 암 및/또는 소마토스타틴 유사체가 효과적인 치료를 제공하는 것으로 간주되는 암, 예를 들어, 위장관의 내분비 종양, 성장 호르몬 (GH)-분비 뇌하수체 종양, 전이성 내분비 종양, 예컨대 췌장 종양 및 카르시노이드,를 치료하기 위해 본 발명의 입자를 투여하는 것도 고려된다. 하나 이상의 알부민-소마토스타틴 융합 단백질을 포함하는 중합체 쉘은 활성 소마토스타틴 수용체를 발현하는 종양 세포에 선택적으로 결합하고 표적화하여 입자의 선택성을 증폭시킬 것이다. 이러한 종양 세포는 종종 소마토스타틴 및 이의 유사체에 의해 억제된다. 소마토스타틴 수용체를 나타내고 SST 요법에 반응하는 것으로 알려진 암은 일반적으로 신경 내분비 종양을 포함한다. 예를 들어, 이들은 암종, 섬 세포 암종, 글루카곤 종, 위염 종, 인슐린 종, VIP 종 및 수질 갑상선 암종과 같은 종양을 포함한다. 이 특성에 대한 대사 적 기초는 신생 신경 내분비 세포가 아민을 세포 내로 혼입시키고 아민을 탈 카르 복실 화시키는 능력을 통하는 것이다(Kvols, et al, 1992, The Yale Journal of Biology And Medicine 65, 505-518).
본 발명은 또한 임의의 상기 단락 중 어느 한 단락에 기재된 바와 같은 단리 및 정제 된 알부민-소마토스타틴 융합 단백질과 같은 본 발명의 융합 단백질을 함유하는 조성물을 투여함으로써 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함한다. 조성물은 또한 적합한 담체를 포함 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 입자 융합 단백질 형태의 소마토스타틴 유사체뿐만 아니라 투여 된 나노 입자의 페이로드 인 임의의 항암제로 소마토스타틴 반응성 종양을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 입자를 포함하는 조성물을 투여하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수있다. 예를 들어, 본 발명의 입자를 포함하는 조성물은 주사(예를 들어, 피하 주사, 근육 내 주사, 정맥 내 주사, 또는 척수 내 주사 또는 장기 또는 잠재적 또는 실제 체강으로의 직접 주입)를 통해 투여 될 수 있다.
본 발명의 입자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에, 대상체는 대상체가 투여 될 입자 유형 (예를 들어, 암)에 적합한 임상 적 상태 또는 진단 적 필요가 있는지 여부를 결정하기 위해 평가 될 수있다. 당업자는 대상이 그러한 조성물을 받아야하는지의 여부를 용이하게 결정할 수있다. 예를 들어, 대상 (예를 들어, 인간)은 표준 진단 기술을 사용하여 암을 갖는 것으로 식별 될 수있다.
본 발명의 입자가 적절한 치료 방식 인 임상 상태를 갖는 것으로 대상을 확인한 후, 대상은 적절한 입자를 포함하는 조성물을 투여받을 수 있다.
본 발명은 입자의 일부가 아닌 추가의 항암제를 전달하여 이러한 암에 대한 증강 또는 상승적 치료를 제공함으로써 소마토스타틴 반응성 내분비 암 또는 다른 유형의 암을 치료하는 것을 추가로 포함한다.
약학적 활성 성분을 함유하는 본 발명의 입자를 포함하는 유효량의 조성물은 대상체에서 임상 적으로 효과적인 결과를 허용하는 임의의 양일 수 있으며, 결과는 약학적 활성 성분에 적합한 것이다. 약학적 활성 성분이 항암제 인 경우, 유효량은 당업자에 의해 임상 적으로 암의 진행률을 감소 시키거나, 무 진행 생존율을 증가 시키거나, 또는 대상체에게 유의미한 독성을 생성하지 않으면 서 진행까지의 중간 시간을 증가시키는 양으로 임상 적으로 결정된다. 전형적으로, 파클리탁셀을 함유하고 전달하는 유효량의 입자는 대상체의 약 50 mg/m2 내지 약 150 mg/m2 (예를 들어, 약 80 mg/m2) 일 수있다. 특정 대상이 특정 양에 반응하지 않으면, 입자의 양은 예를 들어 2 배 또는 3 배 증가 될 수있다. 이 더 높은 농도를받은 후, 대상체는 치료 및 독성 증상에 대한 반응성 및 이에 따른 조정에 대해 모니터링 될 수있다. 투여 량은 치료에 대한 대상체의 반응에 따라 일정하게 유지되거나 슬라이딩 스케일 또는 가변 용량으로 조정될 수있다. 다양한 요인이 특정 응용 분야에 사용되는 실제 유효량에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 투여 빈도, 치료 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및 암의 중증도는 실제 투여되는 유효량의 증가 또는 감소를 요구할 수있다.
본 발명의 입자의 투여 빈도는 임상 효과를 생성 또는 유지하는 임의의 빈도 일 수있다. 항암제의 경우, 빈도는 바람직하게는 포유 동물에 유의 한 독성을 생성하지 않으면 서 암의 진행 속도를 감소 시키거나, 무 진행 생존율을 증가 시키거나, 진행까지의 중간 시간을 증가시키는 것이다. 예를 들어, 투여 빈도는 한 달에 약 1 회 내지 약 3 회, 또는 한 달에 약 2 회 내지 약 6 회, 또는 약 2 개월에 1 회 내지 2 개월마다 약 3 회일 수있다. 투여 빈도는 일정하게 유지되거나 치료 기간 동안 가변적 일 수있다. 파클리탁셀을 함유하는 입자를 포함하는 조성물로 처리하는 과정은 휴지 기간을 포함 할 수있다. 예를 들어, 파클리탁셀을 함유하는 입자의 조성물은 2 주 기간에 이어 2 주 휴식 기간에 걸쳐 투여 될 수 있으며, 이러한 요법은 여러 번 반복 될 수있다. 유효량과 마찬가지로, 다양한 요인이 특정 적용에 사용되는 실제 투여 빈도에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 유효량, 치료 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및 암의 중증도는 투여 빈도의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
본원에 제공된 본 발명의 입자를 포함하는 조성물을 투여하기위한 유효 기간은 임상 반응을 생성하는 임의의 기간 일 수있다. 입자가 항암제를 함유하는 경우, 지속 시간은 암의 진행률을 감소 시키거나, 무 진행 생존율을 증가 시키거나, 또는 대상체에게 상당한 독성을 생성하지 않으면 서 진행까지의 중간 시간을 증가시키는 기간이다. 따라서 유효 기간은 며칠에서 몇 주, 몇 달 또는 몇 년까지 다양합니다. 일반적으로, 암 치료의 유효 기간은 몇 주에서 몇 개월까지 지속될 수있다. 어떤 경우에는 개별 주제가 살아있는 한 유효 지속 시간이 될 수 있습니다. 여러 요인이 특정 치료에 사용 된 실제 유효 기간에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 유효 기간은 투여 빈도, 유효량, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및 암의 중증도에 따라 달라질 수있다.
본 발명의 입자를 함유하는 조성물은 임의의 적절한 형태 일 수있다. 예를 들어, 본원에 제공된 조성물은 주 사용 현탁액을 제조하기 위해 희석제를 갖거나 갖지 않는 용액 또는 분말의 형태 일 수있다. 조성물은 또한 제약 상 허용되는 비히클을 포함 하나 이에 제한되지 않는 추가 성분을 포함 할 수있다. 제약 상 허용되는 비히클은 예를 들어 식염수, 물, 락트산, 만니톨 또는 이들의 조합 일 수있다.
본원에 제공된 조성물을 대상체에게 투여 한 후, 임상 상태, 예를 들어 암이 효과적으로 치료되었는지 여부를 결정하기 위해 대상체를 모니터링 할 수있다. 예를 들어, 암의 진행률이 감소 또는 중지되었는지 여부를 결정하기 위해 치료 후 대상체를 평가할 수있다. 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 당 업계에 공지 된 방법을 사용하여 진행 및 생존율을 평가할 수있다.
일부 경우에, 항암제를 함유하는 본 발명의 입자를 포함하는 조성물은, 대상 집단에 대한 8 주 무 진행 생존율이 항암제를 함유하는 입자를 포함하는 조성물을 수용하지 않는 유사한 대상 집단에서 관찰 된 것보다 65 % 이상(예 : 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % 이상)인, 조건 하에서 암을 갖는 대상체에게 투여 될 수있다. 일부 경우에, 항암제를 함유하는 입자를 포함하는 조성물은 대상체 집단에 대한 평균 진행 시간이 150 일 이상(예 : 155, 160, 163, 165 또는 170 일 이상)인 조건 하에서 암을 갖는 대상체에게 투여 될 수있다.
진단 제를 함유하는 본 발명의 입자를 포함하는 유효량의 조성물은 조성물을 대상체에게 투여하고, 진단제가 질환, 장애 또는 상태 진단이 가능하고 상관 여부를 판단함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
생분해성 폴리머, PEG, 인지질 및 지질
소마토스타틴-알부민 융합 단백질과 조합하여, 실질적으로 수 불용성 약학적 활성 제제를 둘러싸는 중합체 쉘의 형성을 위해 다수의 생체 적합성 중합체가 사용될 수있다. 본질적으로 이의 구조 내의 임의의 중합체, 천연 또는 합성, 설프 하이 드릴 기 또는 이황화 결합은 약학적 활성제 입자에 대한 이황화 가교 쉘의 제조에 이용 될 수있다. 설프 하이 드릴 기 또는 디설파이드 연결은 중합체 구조 내에 이미 존재할 수 있거나 적절한 화학적 변형에 의해 도입 될 수있다. 예를 들어, 단백질, 올리고 펩티드, 다 핵산, 다당류 (예를 들어, 전분, 셀룰로오스, 덱스 트란, 알기 네이트, 키토산, 펙틴, 히알루 론산 등) 등과 같은 천연 중합체가 이러한 변형의 후보이다.
적합한 생체 적합성 중합체의 예로서, 이러한 단백질이 아미노산 서열 (즉, 설 프히 드릴 또는 이황화 기) 내에 충분한 시스테인 잔기를 가져서 가교 결합 (예를 들어, 이황화 결합 형성을 통해)을 갖는 한, 천연 유래 또는 합성 단백질이 사용될 수있다. 초음파 처리 또는 초음파 조사 중 산화의 결과)가 발생할 수 있습니다. 적합한 단백질의 예는 알부민 (35 개의 시스테인 잔기를 함유 함), 인슐린 (6 개의 시스테인을 함유 함), 헤모글로빈 (α2β2 단위당 6 개의 시스테인 잔기를 함유 함), 리소자임 (8 개의 시스테인 잔기를 함유 함), 면역 글로불린, α-2- 마크로 글로불린, 피브로넥틴, 비트로 넥틴, 피브리노겐 등을 포함한다. 에스테르 조사, 아미드, 에테르 등과 같은 다른 결합이 또한 초음파 조사 단계 동안 (필수 작용기가 출발 물질 상에 존재하는 한) 형성 될 수 있다.
알부민 융합 단백질과 함께 미소 구체 및/또는 나노 입자에 혼입 될 수있는 생분해 성 중합체는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 바이오 폴리 에스터 (폴리 (락트산-글리콜 산)/PLGA, 폴리 락트산/PLA, 폴리 글리콜 산/PGA, 폴리 카프로 락톤/PCL, 메 톡시 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리 -L- 락 티드/MPEG-L-PLA, 메 톡시 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리 -DL- 락 티드/MPEG-DL-PLA, 메 톡시 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리 (?- 카프로 락톤)/MPEG-PEG-PCL, 폴리에틸렌 글리콜 -b- 폴리 {N '-[N- (2- 아미노 에틸) -2- 아미노 에틸] 아스 파라 미드}/PEG-PAsp (DET), 폴리 하이드 록시 부티레이트), 다당류 및 단백질.
중합체는 또한 일부 PEG 유도체, 예컨대 단관 능성 선형 PEG, 이관 능성 PEG, 다-암 PEG, 분 지형 PEG, 이관 능성 PEG, 포크 형 PEG를 포함한다.
인지질 및 지질은 또한 미소 구체 및 나노 입자에 사용될 수있다.
지질은 천연 공급원으로부터의 정제 된 인지질 (예 : 수소화 된 대두 포스파티딜콜린/HSPC, 수소화 된 달걀 포스파티딜콜린/HEPC, 달걀 스 핑고 마이 엘린), 정제 된 합성 인지질 (1,2- 디카 노일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DDPC, 1,2- 딜라 우로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DLPC, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DMPC, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DPPC, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DSPC, 1,2- 딜리 놀 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DLoPC, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DOPC, 1,2- 디에 루 코일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/DEPC, 1- 미리 스토 일 -2- 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/MPPC, 1- 미리 스토 일 -2- 스테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/MSPC, 1- 팔미 토일 -2- 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/PMPC, 1- 팔미 토일 -2- 스테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 /PSPC, 1- 미리 스토 일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/MOPC, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 /POPC, 1- 스테아로 일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 /SOPC, 1- 미리 스토 일 -2- 리소 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/M-LysoPC, 1- 팔미 토일 -2- 리소 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 /P- 리소 PC, 1- 스테아로 일 -2- 리소 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린/S- 리소 PC, 1- 올레 오일 -2- 리소 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 /O-LysoPC, 비수 소화 에그 포스파티딜 글리세롤, 나트륨 염 /EPG-Na, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 나트륨 염/DMPG-Na, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 암모늄염 /DMPG-NH4, 1,2- 다이 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 나트륨 염/DPPG-Na, 1,2- 다이 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 암모늄염 /DPPG-NH4, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 나트륨 염 /DSPG-Na, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 암모늄염/DSPG-NH4, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 나트륨 염 /DOPG-Na, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 글리세롤, 나트륨 염/POPG-Na, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스페이트 산, 나트륨 염 /DMPA-Na, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스페이트 산, 나트륨 염/DPPA-Na, 1,2- 디스 테아 일 -sn- 글리세로 -3- 포스페이트 산, 나트륨 염/DSPA-Na, 비수 소화 에그 포스파티딜 에탄올 아민/EPE, 1,2- 딜라 우로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민 /DLPE, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민 /DMPE, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민/DPPE, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민/DSPE, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민/DOPE, 1,2- 딜리 놀 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민/DLoPE, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민 /POPE, 1,2- 디루 코일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민/DEPE, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 -L- 세린, 나트륨 염 /DMPS-Na, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 -L- 세린, 나트륨 염/ DPPS-Na, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 -L- 세린, 나트륨 염 /DSPS-Na, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 -L- 세린, 나트륨 염 /DOPS-Na, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -sn-3- 포스 포 -L- 세린, 나트륨 염/POPS-Na,), 페 길화 된 지질(N- (카르 보닐-메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000) -1,2- 디스 페리 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염/DSPE-PEG 2000과 같은, N- (카르 보닐-메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 5000) -1,2- 디스 페리 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염/DSPE-PEG 5000, N- (카르 보닐-메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000) -1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염/DPPE-PEG 2000, N- (카르 보닐-메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000) -1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염/DMPE-PEG 2000, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DSG-PEG 5000, 1,2- 디스 테아로 일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DSG-PEG 2000, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜/DPG-PEG 2000, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DOG-PEG 2000, 1,2- 디 미리 스토 일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DMG-PEG 2000, N- (카르 보닐-메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000) -1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염 /DPPE-PEG 5000, N- [카르 보닐 -2 ', 3'- 비스 (메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000)]-1,2- 디스 페리 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염 /DSPE-2arm PEG 2000, N- [카르 보닐 -2 ', 3'- 비스 (메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 5000)]-1,2- 디스 페리 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 나트륨 염 /DSPE-2arm PEG 5000, 1,2- 디 미리 스토 닐 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DMG-PEG 5000, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DPG-PEG 5000, 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세롤, 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 /DOG-PEG 5000), 기능성 인지질(N- (3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 미리 스토 일/DMPE-MAL, N- (3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 팔미 토일/DPPE-MAL, N- (3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디스 테아로 일/DSPE-MAL, N- (3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 /POPE-MAL, N- (숙신 이미 딜 옥시-글 루타 릴) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디올 레오 일 /DOPE-NHS, N- 글 루타 릴 -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 미리 스토 일/DMPE-Glu, N- 글 루타 릴 -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 팔미 토일/DPPE-Glu, N- 글 루타 릴 -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디스 테아로 일/DSPE-Glu, N- 글 루타 릴 -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디올 레오 일/DOPE-Glu, N- 글 루타 릴 -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일/POPE-Glu, N- (아미노 프로필 폴리에틸렌 글리콜) 카바 밀-디스 레오 일 포스파티딜-에탄올 아민 /DSPE-PEG-NH2, N-[(3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) 아미노 프로필 폴리에틸렌 글리콜-카바 밀] 디스 테아로 포스파티딜-에탄올 아민/DSPE-PEG-MAL, 3- (N- 숙신 이미 딜 옥시글 루틸) 아미노 프로필, 폴리에틸렌 글리콜-카바 밀 디스 테아로 일 포스파티딜-에탄올 아민/DSPE-PEG-NHS, N- (3- 옥소 프로 폭시 폴리에틸렌 글리콜) 카바 밀-디스 레오 일-에탄올 아민 /DSPE-PEG-ALD, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민 -N- (7- 니트로 -2-1,3- 벤즈 옥사 디아 졸 -4- 일) [트리 에틸 아민 염]/NBD-DPPE, 1,2- 디 팔미 토일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민 -N- (5- 디메틸 아미노 -1- 나프탈렌 술 포닐) [트리 에틸 아민 염]/단실 -DPPE, N- [3- (2- 피리딘 일 디티 오) -1- 옥소 프로필] -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 팔미 토일/DPPE-PDP, N- (숙신 이미 딜 옥시-글 루타 릴) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디스 테아 일 /DSPE-NHS, N- (3- 말레이 미드 -1- 옥소 프로필) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디올 레오 일/DOPE-MAL, N- (숙신 이미 딜 옥시-글 루타 릴) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 미리 스토 일/DMPE-NHS, N- (숙신 이미 딜 옥시-글 루타 릴) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 디 팔미 토일/DPPE-NHS, N- (숙신 이미 딜 옥시-글 루타 릴) -L-α- 포스파티딜 에탄올 아민, 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일/POPE-NHS,), 신규 지질 및 양이온 성 지질 (예 : 1,2- 디올 레오 일옥시 -3- 트리메틸 암모늄 프로판 클로라이드 /DOTAP, 1,2- 디올 레일 옥시 -3- 트리메틸 암모늄 프로판 클로라이드/DOTMA, 1,2- 디올 레오 일옥시 -3- 디메틸 아미노 프로판/DODAP, 1,2- 디올 레일 옥시 -3- 디메틸 아미노 프로판/DODMA),폴리 글리신-인지질 (예 : DSPE- 폴리 글리세린-사이클로 헥실-카복실산, DSPE- 폴리 글리세린 -2- 메틸 글 루터-카복실산), SS 절단 및 pH 반응성 지질 유사 물질 (예 : COATSOME® SS-14/3AP-01, COATSOME® SS-33/3AP-05, COATSOME® SS-33/4PE-15, COATSOME® SS-20/3AP-04), 다른 부형제 (예 : PUREBRIGHT® MB 시리즈 NOFABLE 시리즈 SUNBRIGHT® DKH-02HB, DKH-03HB 및 DKH-04HB (MACROGOL PEG200, 300 및 400) SUNBRIGHT® OE 시리즈 (바이오 호환 PEG 앵커))를 포함한다.
기타 구성 요소
본 발명에 따른 중합체 쉘은 선택적으로 알부민-소마토스타틴 기반 융합 단백질 이외에 다른 성분을 포함한다. 예를 들어, 중합체 쉘은 가변 량의 통상적 인 또는 변이 알부민 또는 이의 단편을 포함하고, 바람직하게는 임의의 유형의 인간 혈청 알부민을 포함 할 수있다.
선택적으로, 공지 된 옵 소닌 인 α-2- 마크로 글로불린과 같은 단백질은 대 식세포-유사 세포에 의한 약학적 활성 제제의 쉘 봉입 입자의 흡수를 향상시키기 위해 또는 간 및 비장으로의 껍질에 둘러싸인 입자의 흡수를 향상시키기 위해 쉘 조성물에 포함된다.
유사하게, 시스테인 잔기 (설프 하이 드릴 또는 디설파이드 기)를 함유하는 합성 폴리펩티드는 또한 약학적 활성제 상에 쉘을 형성하기에 적합한 후보이다. 또한, 폴리 알킬 렌 글리콜 (예를 들어, 직쇄 또는 분지 쇄), 폴리 비닐 알코올, 폴리 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트, 폴리 아크릴산, 폴리 에틸 옥사 졸린, 폴리 아크릴 아미드, 폴리 비닐 피 롤리 디논 등은 화학적 변형 (설프 하이 드릴 및/또는 이황화 결합을 도입하기 위해) 및 셸 형성 (가교 결합의 원인)에 대한 좋은 후보이다. 따라서, 예를 들어 시스테인 잔기 및/또는 디설파이드기를 함유하는 합성 폴리 아미노산, 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 비닐 알코올; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 하이드 록시 에틸 메타 크릴 레이트; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 아크릴산; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 에틸 옥사 졸린; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 아크릴 아미드; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 비닐 피 롤리 디논; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 알킬 렌 글리콜; 유리 설프 하이 드릴 기 및/또는 디설파이드기를 함유하도록 개질 된 폴리 락 타이드, 폴리 글리콜 라이드, 폴리 카프로 락톤 또는 이들의 공중 합체; 뿐만 아니라 이들 중 임의의 둘 이상의 혼합물과 같은 물질이 본 발명의 실시에 사용되도록 고려된다.
약학적 조성물의 목적하는 부위로의 표적화를 용이하게하는 다른 기능성 단백질, 예컨대 항체 또는 효소는 선택적으로 중합체 쉘의 형성에 사용된다.
본 발명의 입자를 운반 또는 현탁시키기위한 생체 적합성 수성 액체는 예를 들어 물, 식염수, 적절한 완충제를 함유하는 용액, 아미노산, 당, 단백질, 탄수화물, 비타민 또는 지방과 같은 영양제를 함유하는 용액, 및 처럼.
약학적 조성물의 제조방법
다른 실시 양태에서, 본 발명은 약학적 활성 제제 및 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 함유하는 혼합물에 이황화 결합에 의한 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 가교를 촉진시키는 조건을 적용하는 것을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 방법은 예를 들어 다음을 포함하는 혼합물을 처리하는 단계를 포함한다:
상기 약학적 활성제가 분산 된 유기상 및 생체 적합성 중합체를 함유하는 수성 매질;
상기 혼합물은 고압 균질화 기에서 균질화하기 위해 계면 활성제를 함유하거나, 또는 선택적으로 실질적으로 계면 활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로하는 방법.
선택적으로, 유기 및/또는 수성상은 이후 높은 전단 조건을 거친 후에 혼합물로부터 제거된다.
선택적으로, 유기 및/또는 수성상은 이후 높은 전단 조건을 거친 후에 혼합물로부터 제거된다. 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려되는 분산제는 약학적 활성제를 현탁 또는 용해시킬 수 있지만, 쉘을 생성하기 위해 사용 된 중합체 또는 약학적 활성제 자체와 화학적으로 반응하지 않는 임의의 비 수성 액체를 포함한다. 예를 들어 식물성 기름 (예 : 콩기름), 미네랄 오일, 옥수수 오일, 평지 씨 오일, 코코넛 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 면실유 등), 지방족, 지환 족, 또는 탄소수 4 내지 30의 방향족 탄화수소 (예를 들어, n- 도데 칸, n- 데칸, n- 헥산, 시클로 헥산, 톨루엔, 벤젠 등); 탄소수 2 내지 30의 지방족 또는 방향족 알코올 (예 : 옥탄 올 등), 탄소수 1 내지 30의 지방족 또는 방향족 에스테르 (예를 들어, 에틸 카 프릴 레이트 (옥타 노 에이트) 등), 탄소수 2 내지 30의 알킬, 아릴 또는시 클릭 에테르 (예를 들어, 디 에틸 에테르, 테트라 하이드로 푸란 등), 1-30 개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴 할라이드 (및 선택적으로 하나 이상의 할로겐 치환기, 예를 들어 CH3Cl, CH2Cl2, CH2Cl-CH2Cl 등), 탄소수 3 내지 30의 케톤 (예 : 아세톤, 메틸 에틸 케톤 등), 폴리 알킬 렌 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등), 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함한다.
분산제/유기 매질의 특히 바람직한 조합은 약 200 ℃ 이하의 비점을 가지며, 보다 높은 분자량(휘발성이 적음)의 분산제와 함께 디클로로 메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 벤젠 등(즉, 약학적 활성제에 대한 고도의 용해도를 가지며 사용 된 다른 분산제에 가용성 인 용매)과 같은 휘발성 액체를 포함한다. 다른 분산제에 첨가 될 때, 이들 휘발성 첨가제는 약학적 활성제의 분산제 내로의 용해성을 유도하는 것을 돕는다. 이 단계는 일반적으로 시간이 많이 걸리므로 바람직합니다. 용해 후, 휘발성 성분은 증발에 의해 (선택적으로 진공 하에서) 제거 될 수있다.
중합체 성 쉘 내에 실질적으로 함유되거나 또는 이와 관련되어 본원에 기재된 바와 같이 제조 된 약학적 활성 제제의 입자는 순수하게, 또는 선택적으로 생체 적합성 매체에서 현탁액으로 전달된다. 이 매질은 물, 완충 수성 매질, 식염수, 완충 식염수, 선택적으로 완충 된 아미노산 용액, 선택적으로 완충 된 단백질 용액, 선택적으로 완충 된 당 용액, 선택적으로 완충 된 탄수화물 용액, 선택적으로 완충 된 비타민 용액, 선택적으로 완충 된 합성 중합체 용액, 지질-함유 에멀젼 등으로부터 선택 될 수있다.
본 발명의 다른 구체 예에 따르면, 생체 내 전달을위한 약학적 활성 제제의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성 제제를 함유하는 배지를 이황화 결합에 의해 생체 적합성 물질의 가교를 촉진시키기에 충분한 시간 동안 고강도 초음파 조건에 노출시키는 단계를 포함한다. 약학적 활성제는 중합체 쉘 내에 실질적으로 완전히 함유 될 수 있다. 상기 쉘의 최대 단면 치수는 약 10 미크론 이하, 바람직하게는 약 0.2 미크론 이하일 수있다.
본 발명의 다른 구체 예에 따르면, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질은 고압 균질화 기에서 고전 단 조건에 노출 된 결과 가교 될 수있다. 용해 또는 현탁 된 약학적 활성 제제를 함유하는 분산제를 융합 단백질의 수용액에 분산시키기 위해 고전 단이 사용되어, 가교 된 중합체의 쉘이 비 수성 매질의 미세한 액적 주위에 형성된다. 고전 단 조건은 액체에서 캐비테이션을 생성합니다. 공동화는 국소 가열을 야기하고, 예를 들어, 설 프히 드릴 잔기를 산화 (및/또는 기존의 이황화 결합을 방해)하여 융합 된 단백질을 가교시킬 수있는 초 산화물 이온의 형성을 초래하여 새로운 가교 이황화 결합을 형성한다.
따라서, 본 발명에 따르면, 약학적 활성제는 적합한 용매(예를 들어, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 테트라 하이드로 푸란, 디 옥산, 아세토 니트릴, 아세톤, 디메틸 설폭 사이드, 디메틸 포름 아미드, 메틸 피 롤리 디논 등 및 이들 중 임의의 둘 이상의 혼합물)에 용해된다. 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려되는 추가의 용매는 콩기름, 코코넛 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 면화 씨 오일, 참기름, 오렌지 오일, 리모넨 오일, C1-C20 알코올, C2-C20 에스테르, C3-C20 케톤, 폴리에틸렌 글리콜, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 할로겐화 탄화수소 및 이들의 조합을 포함한다.
중합체 (예 : 폴리 락트산)는 용매에 용해되지 않을 수있다. 본 발명의 조성물의 제조에 사용되는 오일상은 용매에 용해 된 약학적 활성제만을 함유 할 수있다. 다음에, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질이 (수성 상으로) 첨가되어 안정한 나노 방울의 형성을위한 안정 화제로서 작용한다. 융합 단백질은 약 0.05 내지 25 % (w/v) 범위,보다 바람직하게는 약 0.5 % 내지 5 % (w/v) 범위의 농도로 첨가 될 수있다. 계면 활성제 (예 : 소듐 라 우릴 설페이트, 레시틴, 트윈 80, 플루로 닉 F-68 등)가 혼합물에 첨가 될 수있다.
다음으로, 고압 및 높은 전단력 하에서 균질화에 의해 에멀젼이 형성된다. 이러한 균질화는 고압 균질화기를 사용하여 고압에서 균질화 노즐을 통해 수성 및 오일 상을 강제함으로써 편리하게 수행된다. 고압 균질 기는 전형적으로 약 3,000 내지 30,000 psi 범위의 압력에서 작동된다. 바람직하게는, 이러한 공정은 약 6,000 내지 25,000 psi의 압력에서 수행된다. 생성 된 에멀젼은 비 수성 용매의 매우 작은 나노 방울 (용해 된 약학적 활성제를 함유 함) 및 단백질 안정 화제의 매우 작은 나노 방울을 함유한다. 허용되는 균질화 방법은 고압 균질화, 고전 단 혼합기, 초음파 처리, 고전 단 임펠러 등과 같은 고전 단 및 캐비테이션을 부여하는 공정을 포함한다.
마지막으로, 용매를 감압하에 증발시켜 약학적 활성 물질의 단백질 코팅 된 입자 및 융합 단백질로 구성된 콜로이드 시스템을 수득한다. 허용되는 증발 방법은 회전식 증발기, 낙하 필름 증발기, 분무 건조기, 동결 건조기 등의 사용을 포함한다.
생성 된 분말을 임의의 편리한 시간에 식염수, 완충 식염수, 물, 완충 된 수성 매질, 아미노산 용액, 비타민 용액, 탄수화물 용액 등 및 이들 중 임의의 둘 이상의 조합과 같은 적합한 수성 매질에 재 분산시켜 포유 동물에게 투여 될 수있는 현탁액을 수득 할 수있다. 이 분말을 얻기 위해 고려되는 방법은 동결 건조, 분무 건조 등을 포함한다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 비정상적으로 작은 서브 마이크론 입자 (나노 입자), 즉 직경이 0.2 마이크론 미만인 입자를 형성하는 방법이 제공된다. 이러한 입자는 액체 현탁액 형태로 사용하기 전에 멸균 여과 될 수있다. 오토 클레이 빙과 같은 통상적 인 수단에 의해 고농도의 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민)을 함유하는 분산액을 멸균하는 것이 불가능하기 때문에 본 발명의 제형 공정 (즉, 약물 입자)의 최종 생성물을 멸균 여과하는 능력은 매우 중요하다.
멸균 여과 가능한 입자 (즉, 입자 <0.2 미크론)를 수득하기 위해, 약학적 활성제는 초기에 실질적으로 수불 혼 화성 유기 용매(예를 들어, 클로로포름과 같은 물에 약 5 % 미만의 용해도를 갖는 용매)에 고농도로 용해되어, 약학적 활성 제제를 함유하는 오 일상을 형성한다. 적합한 용매가 상기에 제시되어있다. 중합체 (예 : 폴리 락트산)는 용매에 용해되지 않을 수있다. 본 발명의 방법에 사용되는 오일상은 용매에 용해 된 약학적 활성제만을 함유 할 수있다.
다음으로, 수혼 화성 유기 용매(예를 들어, 에탄올과 같은 물에 약 10 % 초과의 용해도를 갖는 용매)를 총 유기상의 약 1 % -99 % v/v 범위 보다 바람직하게는 약 5 % -25 % v/v 범위의 최종 농도로 유상에 첨가한다. 수혼 화성 유기 용매는 에틸 아세테이트, 에탄올, 테트라 하이드로 푸란, 디 옥산, 아세토 니트릴, 아세톤, 디메틸 설폭 사이드, 디메틸 포름 아미드, 메틸 피 롤리 디논 등과 같은 용매로부터 선택 될 수있다. 대안 적으로, 수불 혼 화성 용매와 수혼 화성 용매의 혼합물을 먼저 제조 한 후, 혼합물에 약학적 활성제를 용해시킨다.
다음으로, 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 수성 매질에 용해시킨다. 이 성분은 안정한 나노 방울의 형성을위한 안정 화제로서 작용한다. 임의로, 충분한 양의 제 1 유기 용매 (예를 들어 클로로포름)를 수성 상에 용해시켜 포화 농도에 가깝게한다. 별도의 측정 된 양의 유기상(약리 활성제, 제 1 유기 용매 및 제 2 유기 용매를 함유 함)을 포화 수 성상에 첨가하여, 유기상의 상 분율이 약 0.5 % -15 % v/v,보다 바람직하게는 1 % 내지 8 % v/v가 되도록 한다.
다음으로, 낮은 전단력에서 균질화에 의해 마이크로 및 나노 방울로 구성된 혼합물이 형성된다. 이것은 예를 들어 약 1,000 내지 약 30,000 rpm의 범위에서 작동되는 종래의 실험실 균질기를 사용하여 당업자에 의해 쉽게 식별 될 수있는 다양한 방식으로 달성 될 수있다. 이어서 고압 하에서 (즉, 약 1,000 내지 40,000psi의 범위에서) 균질화가 이어진다. 생성 된 혼합물은 단백질 수용액 (예를 들어, 인간 혈청 알부민), 수 불용성 약학적 활성제, 제 1 용매 및 제 2 용매를 포함한다. 마지막으로, 용매를 진공 하에서 빠르게 증발시켜 초소형 나노 입자 (즉, 약 0.01 미크론 내지 0.2 미크론 범위의 입자) 형태의 콜로이드 분산 시스템(약학적 활성제 및 단백질)을 생성하고, 따라서 멸균 여과 될 수있다. 입자의 바람직한 크기 범위는 제형 및 작동 파라미터에 따라 약 0.05 내지 1.17 미크론이다.
본 발명에 따라 제조 된 콜로이드 시스템은 예를 들어 적합한 온도-시간 프로파일에서 동결 건조에 의해 물을 제거함으로써 분말 형태로 추가로 전환 될 수있다. 융합 단백질 자체는 동결 보호제로서 작용하고, 분말은 만니톨, 슈 크로스, 글리신 등과 같은 통상적 인 동결 보호제를 사용할 필요없이 물, 식염수 또는 완충제를 첨가함으로써 쉽게 재구성된다. 필요하지는 않지만, 원하는 경우 통상적 인 동결 보호 제가 본 발명의 제형에 첨가 될 수 있음이 물론 이해된다.
본 발명의 다른 구체 예에 따르면, 중합체 쉘 내에 함유 된 약학적 활성제는 고강도 초음파를 사용하여 합성된다. 2 개의 비선형 음향 공정이 안정한 중합체 쉘 (즉, 음향 유화 및 공동화)의 형성에 관여한다. 먼저, 음향 유화는 약학적 활성 제제를 단백질 수용액으로 분산시킨다. 이어서, 형성된 분산 물은 이황화 결합의 형성에 의해 화학적으로 가교되고 안정화된다. 이황화 결합은 음향 캐비테이션을 통해 생성되는 슈퍼 옥사이드에 의해 산화 된 시스테인 잔기 (소마토스타틴-알부민 융합 단백질에서)로부터 형성된다.
생성 된 현탁액을 선택적으로 Centricon 필터 (100 kDa 컷오프)를 통해 여과하고 여과 된 구조물 또는 미세 기포를 정상 식염수 또는 적절한 완충액에 재현 탁시킨다. 이들 구조물의 평균 직경은 대략 2 미크론 일 수있다. 입자 계수기로 결정된 입자 크기 분포는 상당히 좁은 것으로 볼 수있다 (평균 직경이 약 3 미크론 인 가우스 분포가 전형적으로 관찰 될 수 있음). 이 기술에 의해 수득 된 입자의 크기 범위는 0.1 미크론 내지 20 미크론 일 수있다. 이 크기는 작은 혈관 막힘 및 후속 조직 (산소 부족으로 인한 허혈) 손상의 위험없이 정맥 내 또는 동맥 내 주사가 달성 될 수 있기 때문에 의료 응용에 적합하다. 비교를 위해, 정상적인 적혈구의 직경은 약 8 미크론입니다.
약학적 활성제 입자에 대한 쉘의 형성은 수성 상과 비 수성 상 사이의 계면에서 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 전개 및 재배 향을 수반 할 수있고, 단백질 내의 친수성 영역은 수 성상에 노출되는 반면, 단백질 내의 소수성 영역은 비 수성쪽으로 배향된다. 중합체의 전개를 수행하거나 이의 형태를 변화시키기 위해서는 단백질에 에너지가 공급되어야한다. 두 상 (즉, 수성 및 비 수성) 사이의 계면 자유 에너지 (계면 장력)는 그 계면에서의 단백질 형태의 변화에 기여한다. 열 에너지는 또한 단백질 형태의 전개 및/또는 변화에 필요한 에너지 풀에 기여한다.
열 에너지 입력은 초음파 처리 공정에서 사용되는 음향 전력, 초음파 처리 시간, 초음파 처리되는 재료의 성질, 초음파 처리되는 재료의 부피 등과 같은 변수의 함수일 수있다. 초음파 처리 공정의 음향 출력은 광범위하게 변할 수 있으며, 일반적으로 약 1 내지 최대 1000 watts/cm2의 범위 내이며; 약 50 내지 200 watts/cm2 범위의 음향 출력이 현재 바람직한 범위 인 것을 특징으로한다. 유사하게, 초음파 처리 시간은 광범위하게 변할 수 있으며, 전형적으로 약 2 초 내지 약 5 분의 범위 내이다. 바람직하게는, 초음파 처리 시간은 약 15 내지 최대 60 초의 범위에있을 것이다. 당업자는 가해진 음향 출력이 높을수록 초음파 처리 시간이 덜 필요하며, 그 반대도 가능하다는 것을 인식한다.
계면 자유 에너지는 두 상/액체 사이의 극성 차이에 정비례한다. 따라서, 주어진 작동 온도에서, 두 액체 사이의 계면에서 최소 자유 에너지는 원하는 중합체 쉘을 형성하는데 필수적이다. 따라서, 동종의 분산제가 극성, 예를 들어 알칸 산의 에틸 에스테르의 점진적인 변화와 함께 취해지는 경우, 더 높은 동족체는 점점 비극성이다. 즉, 이들 분산제와 물 사이의 계면 장력은 에스테르 내의 탄소 원자의 수가 증가함에 따라 증가한다. 따라서, 에틸 아세테이트는 수불 혼 화성(즉, 2 개의 탄소 산의 에스테르)이지만, 실온 (~ 20 ℃)에서,이 분산제만으로는 중합체 성 쉘-코팅 된 입자의 상당한 수율을 제공하지 않을 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 에틸 옥타 노 에이트 (8 개의 탄소 산의 에스테르)와 같은 고급 에스테르는 중합체 쉘-코팅 된 입자를 높은 수율로 제공한다. 실제로, 에틸 헵 타노 에이트 (7 개의 탄소 산의 에스테르)는 적당한 수율을 제공하는 반면, 저급 에스테르 (3, 4, 5 또는 6 개의 탄소 산의 에스테르)는 수율이 불량하다. 따라서, 주어진 온도에서, 고 수율의 중합체 쉘-코팅 된 입자의 형성에 필요한 최소 수계 분산제 계면 장력의 조건을 설정할 수있다.
온도는 중합체 쉘-코팅 된 입자의 수율에 영향을주기 위해 조작 될 수있는 다른 변수이다. 일반적으로 액체의 표면 장력은 온도가 상승함에 따라 감소합니다. 온도에 따른 표면 장력의 변화 속도는 종종 액체마다 다릅니다. 따라서, 예를 들어, 두 액체 사이의 계면 장력 (Δγ)은 온도 T1에서 Δγ1이고 온도 T2에서 Δγ2 일 수있다. T1에서의 Δγ1이 중합체 쉘을 형성하는데 요구되는 최소값에 근접하고, Δγ2 (온도 T2에서)가 Δγ1보다 크면, T1에서 T2 로의 온도 변화는 중합체 쉘의 수율을 증가시킬 것이다. 이것은 에틸 헵 타노 에이트의 경우 일 수 있는데, 이는 20 ° C에서 적당한 수율을 제공하지만 10 ° C에서는 높은 수율을 제공합니다.
온도는 또한 사용되는 액체의 증기압에 영향을 미친다. 온도가 낮을수록 총 증기압이 낮아집니다. 총 증기압이 낮을수록 캐비테이션 버블의 붕괴가 더 효율적입니다. 초음파 처리 기포의보다 효율적인 붕괴는 증가 된 과산화물 (HO2-) 형성과 관련이있다. 과산화물 형성 속도가 증가하면 저온에서 중합체 쉘의 수율이 증가합니다. 그러나, 상반되는 고려로서, 과산화물 이온에 의한 설프 하이 드릴 기의 산화 (즉, 이황화 결합을 형성하기위한) 반응 속도는 온도가 증가함에 따라 증가한다. 따라서, 초음파 처리 조건이 적용되는 주어진 액체에 대해, 높은 수율의 중합체 쉘이 수득되는 최적의 작동 온도 범위는 상당히 좁다.
따라서, 두 가지 효과의 조합, 즉 온도에 따른 표면 장력의 변화 및 온도(융합 단백질의 전개 및/또는 형태 변화에 직접적으로 영향을 미침)에 따른 반응 수율의 변화(이황화 결합의 형성을 통한 융합 단백질의 가교 반응)는 중합체 쉘-코팅 된 입자의 전체 전환 또는 수율을 지시한다. 본 발명의 중합체 쉘의 제조에 적합한 온도는 약 0 ℃ 내지 80 ℃의 범위에있을 수 있다.
전술 한 초음파 처리는 다양한 크기를 갖는 약학적 활성제를 함유하는 중합체 쉘-코팅 된 입자를 생성하도록 조작 될 수있다. 현재 바람직한 입자 반경은 약 0.1 내지 약 5 미크론의 범위에 속한다. 이 범위의 좁은 크기 분포는 정맥 내 약물 전달에 매우 적합합니다. 이어서, 중합체 쉘-코팅 된 입자를 적합한 수단으로 투여하기 전에 (상기 기재된 바와 같은) 수성 생체 적합성 액체에 현탁시킨다.
또한, 중합체 쉘은 임의로 적합한 작용제에 의해 변형 될 수 있으며, 작용제는 선택적 공유 결합을 통해 중합체 쉘과 관련된다. 이러한 결합에 대해 고려되는 공유 결합은 에스테르, 에테르, 우레탄, 디 에스테르, 아미드, 2 차 또는 3 차 아민, 포스페이트 에스테르, 설페이트 에스테르 등을 포함한다. 중합체 쉘의 이러한 선택적인 변형에 고려되는 적합한 작용제는 합성 중합체 (폴리 알킬 렌 글리콜 (예를 들어, 직쇄 또는 분지 쇄 폴리에틸렌 글리콜), 폴리 비닐 알콜, 폴리 하이드 록시 에틸 메타 크릴 레이트, 폴리 아크릴산, 폴리 에틸 옥사 졸린, 폴리 아크릴 아미드, 폴리 비닐 피 롤리 디논 등), 인지질 (예 : 포스파티딜 콜린 (PC), 포스파티딜 에탄올 아민 (PE), 포스파티딜 이노시톨 (PI), 스 핑고 미엘린 등), 단백질 (예 : 효소, 항체 등), 다당류 (예 : 전분, 셀룰로오스, 덱스 트란, 알기 네이트, 키토산, 펙틴, 히알루 론산 등), 화학적 개질제 (예컨대 피리 독살 5'- 포스페이트, 피리 독살 유도체, 디 알데히드, 디 아스피린 에스테르 등), 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함한다.
중합체 쉘 내에 봉입 된 용해 된 약학적 활성 제제의 일반적인 주제에 대한 변형이 가능하다. 생체 적합성 분산제 중의 약학적 활성 제제의 미립자의 현탁액은 (용해 된 약학적 활성제를 함유하는 생체 적합성 분산제 대신에) 분산제-현탁 된 약학적 활성제 입자를 함유하는 중합체 쉘을 제조하는데 사용될 수있다. 즉, 중합체 쉘은 분산제 중에 약학적 활성 제제의 포화 용액을 함유 할 수있다. 다른 변형은 약학적 활성제를 휘발성 유기 용매 (예를 들어 벤젠)에 초기에 용해시키고, 중합체 쉘을 형성하고, 예를 들어 회전 증발기에서 진공하에 휘발성 용매를 증발 시키거나, 전체 현탁액을 동결 건조시켜 생성 된 약학적 활성제의 고체 코어를 함유하는 중합체 쉘이다. 이는 폴리머 코팅으로 둘러싸인 약학적 활성 약제의 고체 코어를 갖는 구조를 초래한다. 이 후자의 방법은 고용량의 약학적 활성 제제를 비교적 적은 부피로 전달하는데 특히 유리하다. 일부 경우에, 코어 주위에 쉘을 형성하는 중합체는 그 자체가 치료제 또는 진단 제, 예를 들어 인슐린의 경우에 전술 한 초음파 처리 공정에서 형성된 중합체 쉘의 일부로서 전달 될 수 있다.
중합체 쉘에서 변형이 또한 가능하다. 예를 들어, 술 프히 드릴기를 함유하는 소량의 PEG가 융합 단백질에 포함될 수있다. 초음파 처리시, PEG는 융합 단백질 내로 가교되어 중합체 쉘의 성분을 형성한다. 대안 적으로, PEG는 (쉘이 제조되는 매체의 일부로서 포함되지 않고) 쉘의 제조 후에 중합체 쉘에 연결될 수있다. PEG는 비 접착 성 특성으로 알려져 있으며 생체 내에서 순환 시간을 증가시키기 위해 단백질 및 효소에 부착되어있다[Abuchowski et al., J. Biol. Chem. Vol. 252:3578 (1977)]. 또한 리포좀에서 지질 이중층을 형성하는 인지질에 부착되어 그들의 생체 내 흡수 및 수명 연장을 감소시킨다[Klibanov et al., FEBS Letters Vol. 268:235 (1990)]. 따라서, 가교 된 단백질 껍질의 벽으로의 PEG의 혼입은 혈액 순환 시간을 변화시킨다. 이 특성은 약학적 활성 제제 및 연장 된 약학적 활성 제제 방출 시간의 더 높은 혈액 수준을 유지하기 위해 이용 될 수있다.
PEG- 이미 다졸, 숙신 이미 딜 숙시 네이트, 니트로 페닐 카보네이트, 트레 실 레이트 등을 포함하는 친 전자 성 PEG 유도체; 및 PEG- 아민, 아미노산 에스테르, 히드라 지드, 티올 등을 포함하는 친 핵성 PEG 유도체는 또한 중합체 쉘의 변형에 유용하다. PEG- 변형 된 중합체 쉘은 이의 변성되지 않은 대응 물보다 더 오랜 기간 동안 순환에서 지속될 것이다. PEG에 의한 중합체 쉘의 변형은 쉘의 형성 전에 또는 이의 형성 후에 수행 될 수있다. 현재 바람직한 기술은 중합체 쉘의 형성 후에 중합체 쉘을 변형시키는 것이다. 덱스 트란, 알기 네이트, 히드 록시 에틸 전분 등을 포함하는 다른 중합체가 중합체 쉘의 변형에 사용될 수있다.
당업자는 본 발명의 범위 및 사상 내에서 여러 변형이 가능하다는 것을 인식 할 것이다. 중합체 쉘 내의 분산제는 다양 할 수 있고, 매우 다양한 약학적 활성 제제가 이용 될 수 있으며, 다른 천연 및 합성 중합체뿐만 아니라 광범위한 단백질이 중합체 쉘의 벽 형성에 사용될 수있다. 응용도 상당히 광범위합니다.
본 발명의 또 다른 실시 예에 따르면, 상기 기재된 투여 방식은 도세탁셀이 생체 적합성 액체에 현탁 된 신규 한 도세탁셀 함유 조성물에 의해 촉진되고, 생성 된 현탁액은 단면 크기가 10 미크론 이하, 바람직하게는 0.2 미크론 인 도세탁셀 입자를 함유한다. 약 10 미크론 미만의 원하는 입자 크기는 다양한 방식으로, 예를 들어 분쇄, 분무 건조, 침전, 초음파 처리 등에 의해 달성 될 수있다.
도세탁셀의 입자는 바람직하게는 10 미크론 미만,보다 바람직하게는 5 미크론 미만, 가장 바람직하게는 1 미크론 미만의 크기를 가지며, 이는 장기 및 조직의 미세 순환에서 막힐 위험없이 현탁액 형태로 정맥 내 전달을 허용한다.
전달 된 약물의 나노 입자 특성으로 인해, 대부분의 비장, 간 및 폐와 같은 망상 내피 시스템을 갖는 기관에 의해 순환으로부터 제거된다. 이는 입자 형태의 약학적 활성 제제가 신체 내의 이러한 부위를 표적으로 할 수있게한다.
이 구체 예에서 사용하기 위해 고려되는 생체 적합성 액체는 상기 기술 된 것과 동일하다. 또한, 약물 입자의 담체로는 인트라 리피드(비경 구 영양제로서 사용되는 시판되는 지방 에멀젼의 상표명; N.C. 클레이튼 소재의 Kabi Vitrum, Inc.로부터 입수 가능함), 뉴트라 리피드 ™(비경 구 영양제로 사용되는 시판되는 지방 에멀젼의 상표명; 캘리포니아 어바인 소재 McGaw로부터 입수 가능함), 리포 신 III(비경 구 영양제 (20 % 대두유, 1.2 % 계란 포스페이트 및 2.5 % 글리세린 함유)로 사용되는 시판되는 지방 에멀젼의 상표명; 미국 일리노이 주 시카고 북부 애보트 연구소 (Abbott Laboratories)로부터 입수 가능함) 등과 같은 비경 구 영양제가 사용될 수 있다. 대안 적으로, 생체 적합성 액체가 대두 오일과 같은 약물-가용화 물질 (예를 들어, 인트라 리피드 (Intralipid) ™의 경우와 같은)을 함유하는 경우, 약물은 전달을 돕기 위해 담체 액체 내에서 부분적으로 또는 완전히 가용화 될 수있다. 이러한 경우의 예는 담체로서 인트라 리피드 (intralipid) ™에서 도세탁셀의 전달이다. 본 구체 예에서 사용하기에 현재 바람직한 생체 적합성 액체는 상기 기술 된 것과 같은 비경 구 영양제이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 약학적 활성 제제 및 중합체 쉘을 함유하는 제약 조성물을 투여함으로써 인간 대상체를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체 예에 따르면, 도세탁셀이 비경 구 영양제에 용해 된 도세탁셀의 생체 내 전달 용 조성물이 제공된다.
실시예
본 발명의 선택된 구체 예는하기 실험 및 비교 예를 참조하여 더욱 상세하게 설명 될 것이다. 이들 실시 예는 단지 예시를위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1 : 포유류 시스템에서 퓨전 단백질의 발현
실시예 1-1. 재조합 유전자 합성
표 5에 열거 된 융합 단백질에 상응하는 8 개의 작 제물이 제조되었다. 먼저, 각각의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 합성하고이어서 pcDNA3.1 벡터에 삽입 하였다.
실시예 1-2. 플라스미드 생성
Maxi-prep 또는 Mega-prep을 사용하여 ~ 20mg의 각 DNA를 생성했습니다.
실시예 1-3. 형질 감염 및 단백질 생산
(A) 서스펜션 셀 방법
FreeStyle ™ 293-F 세포를 플라스크에 0.55-0.6 x 106 세포/mL로 접종 하였다. 약 24 시간 후, 세포를 진탕 플라스크에 1.1-1.2 x 106 세포/mL로 시딩 하였다. DNA는 프리 스타일 배지에서 500 ug DNA/80 mL로 제조되었다. 폴리 에틸 레니 민 (PEI)을 프리 스타일 배지에서 80 mL 당 1.8 mL PEI로 제조 하였다. DNA를 FreeStyle 배지에서 혼합하고, 유효량의 PEI를 DNA 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 약 15 분 동안 인큐베이션하여 DNA-PEI 복합체를 형성시켰다. 배양 된 DNA-PEI 복합체 80 mL를 세포 배양에 첨가한다. 약 3 시간 후, TC 이스트 올 레이트 공급 물 (BD)을 첨가하여 최종 농도 4g/l의 배양 물을 갖도록한다. 약 7-8 일 후, 배지는 원심 분리에 의해 수확된다.
(B) 접착 세포 방법
형질 감염 약 24 시간 전에, HEK293 세포를 플라스크에 50-90 % 합류성으로 시딩하고, 완전한 배지를 첨가 하였다. 약 24 시간 후, 세포를 세척 한 후 기저 배지를 첨가 하였다.
무 혈청 배지에 DNA를 첨가하여 DNA 및 PEI 용액을 제조한다. PEI 용액을 DNA 용액에 첨가하고 15 분 동안 인큐베이션하여 실온에서 DNA-PEI 복합체를 형성 하였다.
DNA-PEI 복합체를 세포에 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 약 4-6 시간 동안 인큐베이션 하였다. 배지를 제거하고 글루타민 및 혈청이 첨가 된 새로운 배지를 첨가 한 후, 37 ℃에서 4 일 동안 배양 하였다.
상청액을 수집하기 위해 원심 분리하여 약 4 일 후에 배지를 수확 하였다. 침전물을 L- 글루타민이 첨가 된 새로운 배지로 보충하여 3 일 동안 배양하여 수확 과정을 반복 하였다.
실시예 1-4 : 단백질 농도, Ni-NTA 정제 및 완충제 교환
수집 된 배지는 정제 방법 (연속 크로마토 그래피 또는 수동 배치 정제)에 따라 TFF 시스템 (밀리 포어)에 의해 특정 부피로 농축되었다.
농축 된 단백질을 결합 완충액에서 약 4 ℃에서 새로운 Ni-NTA 수지와 배양하고 크로마토 그래피 또는 배치 시스템을 사용하여 세척 완충액으로 세척 하였다. 단백질을 용리 완충액으로 용리시키고 분획을 수집하고 농축하여 정제 된 단백질을 회수 하였다. 크기 배제 크로마토 그래피 정제를 사용하여 단백질을 추가로 정제 할 수있다.
최종 용출액의 완충액은 투석에 의해 원하는 완충액으로 교환 될 수있다.
실시예 2 : SST- 알부민 퓨전 단백질의 수
SST-HSA 융합 단백질은 모두 고 수율로 가용성 형태로 발현되었다. 링커의 길이 또는 성질은 융합 단백질의 단백질 수율 및 용해도에 영향을 줄 수있다. 결과는 융합 단백질 구조물이 길고 복잡 해짐에 따라 생산 수율이 약간 감소 함을 나타냈다. 그러나, 모든 구조물은 스케일 업 생산에 대한 수율을 나타냈다.
표 4
SST14-HSA 융합 단백질 발현 수율
Sequence ID 디자인 총 아미노산 MW (kDa) 제조 수율 (g/L)
SEQ ID NO: 1 SST14-A(EAAAK)4A-HSA-A(EAAAK)4A-SST14 657 73.8364 0.26
SEQ ID NO: 2 HSA A(EAAAK)4A-SST14 621 70.1543 0.27
SEQ ID NO: 7 SST14-(GGGGS)3-HSA 614 69.112 0.33
SEQ ID NO: 8 SST14-A(EAAAK)4A-HSA 621 70.1543 0.25
SEQ ID NO: 9 H6-GGGGS-HSA-GGGGS-SST14 613 69.4874 0.30
SEQ ID NO: 10 SST14-GGGGS-HSA-GGGGS-His6 613 69.4874 0.41
SEQ ID NO: 15 HSA-(GGGGS)3-SST14 614 69.112 0.28
SEQ ID NO: 16 HSA-(GGGGS)6-SST14 629 70.1119 0.29
실시예 3 : 수성 매체에서 도세탁셀 입자의 제조
도세탁셀의 결정은 10 미크론 미만의 크기를 갖는 고체 도세탁셀 입자가 얻어 질 때까지 볼 밀에서 분쇄된다. 입자의 크기는 입자를 등장 성 식염수에 현탁시키고 입자 계수기를 이용하여 계수함으로써 결정된다. 입자의 100 %가 5 마이크론 미만의 크기를 가질 때까지 분쇄를 계속 하였다. 정맥 내 전달을위한 바람직한 입자 크기는 5 마이크론 미만, 가장 바람직하게는 1 마이크론 미만이다.
대안 적으로, 도세탁셀의 입자는 모든 입자가 직경이 10 미크론 미만이 될 때까지 물에서 도세탁셀 현탁액을 초음파 처리함으로써 수득된다.
직경이 10 미크론 미만인 도세탁셀 입자는 또한 탁한 현탁액이 얻어 질 때까지 물을 첨가함으로써 에탄올 중 도세탁셀 용액으로부터 도세탁셀을 침전시킴으로써 얻을 수있다. 선택적으로, 도세탁셀 용액은 탁한 현탁액이 얻어 질 때까지 물을 첨가하는 동안 초음파 처리 될 수있다. 이어서, 생성 된 현탁액을 여과하고 건조시켜 원하는 크기 범위의 순수한 도세탁셀 입자를 수득한다.
도세탁셀의 미립자는 에탄올과 같은 휘발성 용매에 도세탁셀 용액을 분무 건조함으로써 제조된다. 용액을 도세탁셀을 함유하는 에탄올의 액 적을 형성하는 초음파 노즐을 통과시킨다. 분무 건조기에서 에탄올이 증발함에 따라, 미세한 도세탁셀 입자가 수득된다. 에탄올에서 도세탁셀의 농도를 변경하고 노즐을 통한 액체의 유량과 초음파 처리 능력을 조정하여 입자 크기를 변화시킨다. 적합한 초음파 처리기는 모델 CV33 프로브 헤드가있는 Vibracell VCX 750, Sonics and Materials Inc., Conn.를 포함합니다.
실시예 4 : 단백질 쉘 함유 오일의 제조
5 % 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 용액 3ml를 초음파 프로브에 부착 된 원통형 용기에 담는다. 적합한 초음파 처리기에는 모델 CV33 프로브 헤드가있는 Vibracell VCX 750, 코네티컷 주 뉴타운 소재의 Sonics and Materials Inc.가있다. 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 용액은 6.5ml의 대두유 (소야 오일)로 오버레이된다. 초음파 처리기 프로브의 끝 부분이 두 용액 사이의 경계면에 도달하고 어셈블리가 20 ° C의 냉각 조에서 유지됩니다. 시스템이 평형을 유지하고 초음파기가 30 초 동안 켜집니다. 격렬한 혼합이 일어나고 백색 유백색 현탁액이 얻어진다. 현탁액을 정상 식염수로 1 : 5로 희석시켰다. 유분 함유 단백질 껍질의 크기 분포 및 농도를 결정하기 위해 입자 계수기가 사용된다.
실시예 6 : 중합체 쉘 형성에 영향을 미치는 파라미터
단백질 농도, 온도, 초음파 처리 시간, 약학적 활성 제제의 농도 및 음향 강도와 같은 여러 변수를 테스트하여 중합체 쉘의 형성을 최적화합니다. 이들 파라미터는 톨루엔을 함유하는 가교 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 쉘에 대해 결정된다.
1 %, 2.5 %, 5 % 및 10 %의 단백질 농도를 갖는 용액으로 제조 된 중합체 껍질을 입자 계수기로 계수하여 생성 된 중합체 껍질의 크기 및 수의 변화를 결정한다. 중합체 쉘의 크기는 단백질 농도에 따라 다르지만, 형성된 "밀키 현탁액"밀리 리터당 중합체 쉘의 수는 단백질 농도가 5 %까지 증가함에 따라 증가한다. 중합체 쉘의 수의 유의 한 변화는 그 농도 이상으로 발생하지 않았다.
초기 용기 온도는 중합체 쉘의 최적 제조에 중요하다. 일반적으로 초기 용기 온도는 0 ° C ~ 45 ° C로 유지됩니다. 중합체 쉘의 형성에 사용되는 오일의 수성 오일 계면 장력은 온도의 함수에 따라 변하는 중요한 파라미터이다. 약학적 활성제의 농도는 단백질 껍질의 수율에 크게 영향을 미치지 않습니다. 약학적 활성 제제가 용해 된 상태로 포함되거나 분산 매질에 현탁되는 경우는 비교적 중요하지 않다.
초음파 처리 시간은 ml 당 생산되는 고분자 껍질의 수를 결정하는 중요한 요소입니다. 3 분 초과의 초음파 처리 시간은 중합체 쉘의 전체 개수가 감소하여 과도한 초음파 처리로 인해 중합체 쉘이 파괴 될 수 있음을 나타냅니다. 3 분 미만의 초음파 처리 시간은 적절한 수의 중합체 쉘을 생성한다. 초음파 처리기의 음향 전력 등급과 관련하여, 최대 수의 중합체 쉘은 최대 전력 설정에서, 예를 들어 약 200 watts/cm2의 음향 전력으로 생성된다.
실시예 7 : 오일 캐리어에 도세탁셀을 함유하는 중합체 쉘의 제조
도세탁셀을 USP 등급 대두유에 2 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 초음파 프로브에 부착 될 수있는 원통형 용기에 5 % 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 용액 3ml를 취한다. 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 용액은 6.5 ml의 대두유/도세탁셀 용액으로 오버레이된다. 초음파 처리기 프로브의 끝 부분이 두 용액 사이의 경계면에 도달하고 어셈블리가 평형 상태로 유지되고 초음파 처리기가 30 초 동안 켜집니다. 격렬한 혼합이 일어나고 오일/도세탁셀 용액을 둘러싸는 단백질-벽 중합체 쉘을 함유하는 안정한 백색 유백색 현탁액이 수득된다.
가교 된 단백질 쉘 내로 약물의 더 많은 로딩을 얻기 위해, 오일 및 약물 (의약이 상당히 높은 용해도를 갖는)을위한 상호 용매가 오일과 혼합 될 수있다. 이 용매가 비교적 무독성 인 경우 (예를 들어, 에틸 아세테이트), 원래의 담체와 함께 주사 될 수있다. 다른 경우에는, 중합체 쉘의 제조 후 진공 하에서 액체를 증발시켜 제거 할 수있다.
실시예 8 : 폴리머 쉘의 안정성
알려진 농도에서 중합체 쉘의 현탁액은 3 가지 상이한 온도 (즉, 4 ℃, 25 ℃ 및 38 ℃)에서의 안정성에 대해 분석된다. 안정성은 시간에 따른 입자 수의 변화에 의해 측정됩니다. 콩기름 (SBO)을 함유하는 가교 된 단백질 (소마토스타틴-알부민 융합 단백질) 껍질을 상기 기재된 바와 같이 제조하고 (실시 예 2 참조), 식염수에서 20 %의 최종 오일 농도로 희석하고 상기 온도에서 저장한다. 입자 수 (엘존)는 시간의 함수로서 각 샘플에 대해 얻어진다.
계수 된 입자 (즉, 중합체 쉘)의 농도는 실험 기간 동안 상당히 일정하게 유지된다. 이 범위는 거의 4 주에 걸쳐 다양한 온도 조건에서 우수한 폴리머 쉘 안정성을 나타냅니다.
실시예 9 : 생체 내 생체 분포-형광 단을 함유하는 가교 된 단백질 쉘
정맥 주사 후 가교 된 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 껍질의 운명을 결정하기 위해, 형광 염료 (루벤, a/k/a (5,6,11,12- 테트라 페닐 테트라 스테인, 알드리치에서 입수))를 톨루엔에 용해시키고, 톨루엔/루 브렌을 함유하는 가교 된 단백질 껍질을 초음파 처리에 의해 상기 기재된 바와 같이 제조한다. 생성 된 유백색 현탁액을 정상 식염수로 5 회 희석 하였다. 이어서, 2 ml의 희석 된 현탁액을 10 분에 걸쳐 래트의 꼬리 정맥에 주사 하였다. 주사 후 1 시간 및 주사 후 24 시간에 한 마리의 동물을 희생시켰다.
냉동 폐, 간, 신장, 비장 및 골수 섹션은 형광 염료를 함유하는 중합체 쉘의 존재에 대해 형광 하에서 검사된다. 1 시간에, 대부분의 중합체 쉘은 손상되지 않고 폐 및 간에서 약 1 미크론 직경의 밝은 형광 입자로서 발견된다. 24 시간에 간, 폐, 비장 및 골수에서 고분자 껍질이 발견됩니다. 조직의 일반적인 염색도 관찰되는데, 이는 중합체 쉘이 소화되고 염료가 내부에서 유리함을 나타냅니다. 이 결과는 기대치와 일치하며, 도세탁셀과 같은 포획 된 약제의 지연 또는 제어 방출을위한 본 발명의 조성물의 잠재적 인 용도를 입증한다.
실시예 10 : 대두유 (SBO)를 함유하는 중합체 쉘의 독성
대두유 (SBO)를 함유하는 중합체 쉘은 실시 예 2에 기술 된 바와 같이 제조된다. 생성 된 현탁액을 정상 식염수로 희석하여 하나는 20 % SBO를 함유하고 다른 하나는 30 % SBO를 함유하는 두 가지 용액을 생성한다.
시판되는 총 비경 구 영양제 (TPN) 작용제 인 Intralipid ™는 20 % SBO를 함유합니다. 마우스에서 Intralipid ™에 대한 LD50은 1cc/min으로 주사했을 때 120ml/kg, 또는 30g 마우스에 대해 약 4ml입니다.
두 그룹의 마우스 (각 그룹에서 3 마리의 마우스; 약 30g의 각 마우스)는 다음과 같이 SBO를 함유하는 본 발명의 조성물로 처리된다. 각각의 마우스에는 4 ml의 SBO- 함유 중합체 쉘의 현탁액을 주사 하였다. 한 그룹의 각 구성원은 20 % SBO를 포함하는 현탁액을 받고 다른 그룹의 각 구성원은 30 % SBO를 포함하는 현탁액을받습니다.
본 발명에 따른 중합체 쉘 내에 함유 된 오일은 시판되는 SBO 제제 (Intralipid ™)와 비교하여 이의 LD50 용량에서 독성이 없다. 이러한 효과는 중합체 쉘 내에서 오일의 1 시간 이상의 방출 (즉, 생체 이용률이 제어 된 속도)과 같은 느린 것으로 인한 것일 수있다. 이러한 서방 형은 상업적으로 이용 가능한 에멀젼으로 달성되는 고 유량과는 달리 치명적인 용량의 오일의 획득을 방지한다.
실시예 11 : 중합체 쉘로부터 방출 된 대두유의 생체 내 생체 이용률
랫트의 혈류에 중합체 성 쉘의 현탁액을 주입 한 후 중합체 성 쉘로 둘러싸인 물질의 서방 형 또는 서방 형을 결정하기위한 시험이 수행된다. 콩기름 (SBO)을 함유하는 가교 된 단백질 (소마토스타틴-알부민 융합 단백질) 벽으로 둘러싸인 중합체 쉘을 상기 한 바와 같이 초음파 처리하여 제조한다. 오일 함유 중합체 쉘의 생성 된 현탁액을 식염수로 20 % 오일을 함유하는 최종 현탁액으로 희석시킨다. 이 현탁액 5 ml를 10 분에 걸쳐 래트의 캐뉼 러화 된 외부 경정맥에 주사 하였다. 주사 후 여러 시점에 이들 랫트로부터 혈액을 수집하고, 일상 분석에 의해 결정된 혈액 중 트리글리세리드 (대두유는 주로 트리글리세리드)의 수준이다.
5 밀리리터의 시판되는 지방 유제 (Intralipid ™, 20 % 대두유, 1.2 % 난황 인지질 및 2.25 % 글리세린을 함유하는 수성 비경 구 영양제)가 대조군으로 사용됩니다. 대조군은 에멀젼을 안정화시키기 위해 에그 포스페이트를 유화제로 사용한다. 두 경우에서 트리글리세리드의 혈청 수준의 비교는 시간의 함수로서 오일의 생체 이용률을 직접 비교할 것이다. 20 % 오일을 함유하는 중합체 쉘의 현탁액에 추가하여, 최종 농도 30 % 오일의 식염수 중 5ml의 오일 함유 중합체 쉘 샘플을 주입한다. 세 그룹 각각에 두 마리의 쥐가 사용되었다.
Intralipid ™ 대조군의 경우 주사 후 매우 높은 트리글리세리드 수치가 나타납니다. 트리글리세리드 수치는 주입 전 수치로 내려 오는 데 약 24 시간이 걸린 것으로 보입니다. 따라서 오일은 주사 후 대사에 즉시 이용 가능한 것으로 보인다.
Intralipid ™ (20 %)와 동일한 양의 총 오일을 함유하는 오일 함유 폴리머 쉘의 현탁액은 혈청에서 검출 가능한 트리글리세리드의 극도로 다른 이용 가능성을 보여줍니다. 이 수치는 혈중 트리글리세리드가 정상에 가까운 수준으로 느리거나 지속적으로 방출되는 것을 나타냅니다. 30 % 오일을 갖는 오일-함유 중합체 쉘을 수용하는 그룹은 더 높은 수준의 트리글리세리드 (더 높은 투여 량과 함께)를 나타낸다. 다시 한번,이 그룹에서 트리글리세리드의 혈중 농도가 Intralipid ™ 투여군과 비교하여 천문학적으로 상승하지 않습니다. 이는 다시, 본 발명의 조성물로부터의 오일의 느리고 지속 가능한 이용 가능성을 나타내며, 이는 중합체 쉘 내에 함유 된 물질의 위험하게 높은 혈액 수준의 물질을 피하고 장기간에 걸쳐 허용 가능한 수준으로 이용 가능한 이점을 갖는다. 분명히, 본 발명의 중합체 쉘 내에 전달되는 약물은 이러한 동일한 장점을 달성 할 것이다.
이러한 대두유-함유 중합체 성 쉘 시스템은 아미노산, 필수 전해질, 비타민 및 당의 수용액에 현탁되어 총 비경 구 영양제 (TPN)를 형성 할 수있다. 이러한 TPN은 전해질 존재 하에서 에멀젼의 불안정성으로 인해 현재 이용 가능한 지방 에멀젼 (예를 들어, Intralipid ™)으로부터 제형 화 될 수 없다.
실시예 12 : 약학적 활성 제제의 고체 코어를 함유하는 가교 된 단백질-벽 중합체 쉘의 제조
중합체 쉘 내에 도세탁셀과 같은 난 용성 약물을 전달하는 다른 방법은 고체 약물 코어 주위에 중합체 물질의 쉘을 제조하는 것이다. 이러한 '단백질 코팅 된'약물 입자는 다음과 같이 얻을 수있다. 도세탁셀을 비교적 높은 농도로 용해시키기 위해 유기 용매를 사용하여 실시 예 4에 기재된 절차를 반복한다.
일반적으로 사용되는 용매는 벤젠, 톨루엔, 헥산, 에틸 에테르 등과 같은 유기물이다.
용해 된 도세탁셀을 함유하는 중합체 성 쉘의 유백색 현탁액 5 mL를 정상 식염수에서 10 ml로 희석시켰다. 이 현탁액을 실온에서 회전 증발기에 넣고 휘발성 유기물을 진공에 의해 제거한다. 회전식 증발기에서 약 2 시간 후에, 이들 중합체 쉘을 현미경으로 조사하여 불투명 코어를 나타내어 실질적으로 모든 유기 용매의 제거 및 단백질 쉘 내의 고체 도세탁셀의 존재를 나타낸다.
대안 적으로, 유기 용매-함유 용해 된 약물의 코어를 갖는 중합체 쉘은 동결 건조되어 사용시 식염수 (또는 다른 적합한 액체)에 재현 탁 될 수있는 건조 부서지기 쉬운 분말을 얻는다. 실온에서 고체상에 있지 않을 수있는 다른 약물의 경우, 액체 코어 중합체 성 쉘이 수득된다. 이 방법은 희석되지 않은 약물을 함유하는 가교 된 단백질-벽 쉘의 제조를 가능하게한다. 입자 크기 분석에 따르면 이러한 폴리머 껍질은 오일을 포함하는 것보다 작습니다. 중합체 쉘의 형성에 사용하기 위해 현재 바람직한 단백질은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질이지만, 공지 된 옵 소닌 인 α-2- 마크로 글로불린과 같은 다른 단백질은 대 식세포-유사 세포에 의한 중합체 쉘의 흡수를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 대안 적으로, PEG- 설프 하이 드릴 (하기 설명 됨)은 중합체 쉘의 형성 동안 첨가되어 생체 내 순환 시간이 증가 된 중합체 쉘을 생성 할 수있다.
실시예 13 : 중합체 쉘의 생체 내 순환 및 방출 동역학
도세탁셀을 함유하는 고체 코어 중합체 쉘은 상기 기재된 바와 같이 제조되고 (예를 들어, 실시 예 4 참조), 생리 식염수에 현탁된다. 현탁액 중 도세탁셀의 농도는 다음과 같이 HPLC에 의해 측정된다. 먼저, 중합체 쉘 내의 도세탁셀은 0.1M 머 캅토 에탄올의 첨가 (단백질 이황화물 가교 결합 및 중합체 쉘의 가교 분해 결과)에 의해 유리되고,이어서 유리 된 도세탁셀은 현탁액에서 아세토 니트릴로 추출된다. 생성 된 혼합물을 원심 분리하고 상청액을 동결 건조시켰다. 동결 건조물을 메탄올에 용해시키고 HPLC에 주입하여 현탁액 중의 도세탁셀의 농도를 측정 하였다.
쥐에게 경정 카테터를 통해이 현탁액 2 ml를 주사 하였다. 동물은 2 시간에 희생되고,간에 존재하는 도세탁셀의 양은 HPLC에 의해 결정된다. 이를 위해서는 간을 균질화 한 다음, 아세토 니트릴로 추출하고 원심 분리 후 상청액을 동결 건조해야합니다. 동결 건조물을 메탄올에 용해시키고 HPLC에 주입 하였다.
실시예 14 : SST-HSA 파클리탁셀 나노 입자의 조성물, 제조 및 약물 방출
실시 예 14-1 : 고압 균질화 방법을 사용한 SST-HSA 단백질 결합 된 파클리탁셀 나노 입자의 제조
4 ml의 2.5 mg/ml SST-HSA 단백질 및 360 μl의 25 % HSA를 5.64 ml의 탈 이온수에 첨가함으로써 10 ml의 1 % (w/v) SST- 융합 단백질 및 HSA 용액을 제조하였고, 이어서 용액을 52 ㎕의 클로로포름으로 미리 포화시켰다. 파클리탁셀 10 mg을 183 ㎕의 클로로포름 및 17 ㎕의 에탄올의 혼합물에 용해시켰다. 파클리탁셀 용액을 10 ml SST- 융합 단백질 및 균질화와 함께 HSA 용액에 첨가 하였다. 혼합물을 추가로 몇 분 동안 균질화하여 조 에멀젼을 형성 하였다. 미정 제 에멀젼을 고압 균질화기로 옮겼다. 유화액을 몇 분 동안 유제를 재순환시키면서 고압에서 수행 하였다. 회전 증발기를 사용하여 휘발성 유기 용매를 제거한 후, 동결 건조에 의해 나머지 용매를 제거하여 균질화 된 에멀젼을 농축시켜 나노 입자를 수득 하였다. 최종 나노 입자를 4 ℃에서 저장 하였다. 재구성 된 나노 입자의 크기는 Malvern Zeta Sizer를 사용하여 측정하였고, 생성 된 입자의 Z- 평균 입자 크기는 0.17 내지 0.2 미크론 (170 내지 200 nm)이었다. 여과 또는 다른 방법에 의해 나노 입자를 추가로 분별하여 직경이 약 0.1 미크론 (100 nm) 미만, 0.1 내지 0.2 미크론 (100-200 nm) 및 0.2 미크론 (200 nm) 초과 인 3 개의 분획의 나노 입자를 수집 하였다. 적합한 균질기에는 인라인 메가 트론 균질 기 MT-V 3-65 F/FF/FF, 스위스 키네마 티카 AG가 포함된다.
다른 배치의 나노 입자를 7.64 ml의 탈 이온수 중 2 ml의 2.5 mg/ml SST-HSA 단백질 및 360 ml의 25 % HSA로 제조 하였다. 이 나노 입자 배치의 크기 분포는 상기 나노 입자와 유사 하였다.
실시예 14-2 : 시험 관내 SST 단백질 결합 된 파클리탁셀 나노 입자의 방출
시험 관내 방출 연구는 USP 장치 II를 사용하는 SST-HSA 파클리탁셀 나노 입자로 수행되었다. Abraxane 샘플도 참조로 사용되었습니다. 샘플을 8 시간에 걸쳐 주기적으로 취하고 파클리탁셀 농도를 HPLC로 측정 하였다. SST-HSA 파클리탁셀 나노 입자 및 아브 락산 나노 입자의 방출 프로파일이도 1에 도시되어있다:
결과는 SST- 융합 단백질이 파클리탁셀의 방출 프로파일을 변경시키지 않았 음을 나타냈다.
실시예 15 : 파클리탁셀-공액 복합체의 세포 독성
파클리탁셀 -SST 융합 단백질의 세포 독성 (서열 번호 1). 공액 복합체는 인간 재조합 sst2a를 발현하는 CHO 세포에서 시험되었다. 대사 활성 세포의 지표 인 ATP 존재의 정량에 기초하여, 배양에서 생존 세포의 수를 결정하는 CellTiter-Glo174; 발광 세포 생존 능력 분석 (Promega)을 사용하여 세포 생존력을 측정 하였다. 분석은 제조업체의 매뉴얼 (2009 년 6 월 개정 된 제품 G7570, G7571, G7572 및 G7573에 대한 Promega Technical Bulletin, Part # TB288)에 따라 수행되었습니다.
20 ㎍/ml 농도의 디지토 닌을 양성 대조군으로 사용하였고, DMSO- 처리 된 및 작용제 (Octreotide)-처리 된 웰을 비히클 대조군으로 사용 하였다. 시험 화합물을 웰에 분배 한 후, 인큐베이션 완충액 내의 세포를 웰에 첨가하고 20 분 동안 인큐베이션 하였다. 배양 종료시, CellTiter-Glo를 각 웰에 첨가하여 발광을 측정 하였다. 모든 시험 웰은 0.4 % DMSO를 함유 하였다. 0.14 nM, 0.42 nM, 1.4 nM, 4.2 nM, 14 nM, 42 nM 및 110 nM의 다양한 파클리탁셀 농도에서 유의 한 세포 독성이 관찰되지 않았다 (표 5).
결과는 SST- 융합 단백질이 약물 전달 단백질로서 사용되기에 안전하다는 것을 나타내었다.
표 5
파클리탁셀-공액 화합물의 세포 독성
화합물 농도. 단위 세포독성
% 		표준 편차
시험 1 디지토닌
(양성 대조군)		 20 mg/ml 100.0 NA
DMSO
(비히클)		 0.4 % 0.0 NA
옥토로 타이드 (작용제) 10 nM -4.0 3.2
파클리탁셀 -SST 융합 단백질 공액 복합체 0.14 nM 3.0 9.1
0.42 nM 12.0 6.8
1.4 nM 1.0 3.3
4.2 nM -5.0 14.1
14.0 nM -1.0 2.7
42.0 nM 0.0 9.1
시험 2 디지토닌
(양성 대조군)		 20 mg/ml 100.0 NA
DMSO
(비히클)		 0.4 % 0.0 NA
옥토로 타이드 (작용제) 10 nM 8.0 1.9
파클리탁셀 -SST 융합 단백질 공액 복합체 110 nM 11.0 4
실시예 16: 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1) 접합 복합체에 의한 SST2A 수용체에 대한 SST 결합의 억제
다양한 농도의 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 0.03 μM 및 0.1 μM의 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1)을 SST 및 sst2 수용체 결합 억제 분석에서 시험 하였다. 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 접합 된 복합체는 6.55 nM의 IC50 값으로 SST 및 SST2 수용체 결합을 억제 할 수 있었다.
표 6
파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1) 접합 복합체에 의한 SST2A 수용체에 대한 SST 결합의 억제
화합물 IC50 Ki nH
파클리탁셀 -SST 융합 단백질 공액 복합체 6.55 nM 3.48 nM 2. 61
SST 14 5.43 pM 2.88 pM 0.79
실시예 17 : CHO-K1 세포에서 SST2A 수용체에 대한 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1) 접합 된 복합체 결합
sst2a 수용체를 발현하는 CHO-K1 세포를 아데 닐릴 시클 라제 분석에 사용하여 sst2a 수용체에 대한 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 접합 복합체의 결합을 정량적으로 결정 하였다. 다양한 농도의 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1)을 1 nM-0.3 μM에서 시험 하였다. 파클리탁셀 SST- 융합 단백질 접합 복합체는 EC50 값이 8.29 nM 인 SST2a 수용체 발현 CHO-K1 세포에 결합 할 수 있었다 (표 7).
표 7
파클리탁셀 SST- 융합 단백질 (서열 번호 1)은 CHO-K1 세포에서 SST2A 수용체에 대한 복합 결합
화합물 EC50
파클리탁셀 -SST 융합 단백질 공액 복합체 8.29 nM
옥트레오티드 0.039 nM

Claims (45)

  1. 약학적 활성 성분 또는 진단 성분, 및 중합체 쉘을 포함하는 입자로서, 중합체 쉘은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 포함하고, 중합체 쉘은 약학적 활성 성분 또는 진단 성분을 캡슐화하는 것인, 입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중합체 쉘이 약 5 중량 % 내지 약 100 중량 %의 소마토스타틴-알부민 융합 단백질을 포함하는 것인, 입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    중합체 쉘이 약 65 중량 % 내지 약 95 중량 %의 소마토스타틴-알부민 단백질을 포함하는 것인, 입자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    약학적 활성 성분이 항암제, 영양제 또는 기능 식품인, 입자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    항암제가 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민, 알칸설포네이트, 테트라진, 백금 화합물, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항 대사제, 엽산 유사체, 안트라사이클린, 탁산, 빈카알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 호르몬 제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 입자.
  6. 제 4 항에 있어서,
    탁산이 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀, 캄프토테신 및 이의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 입자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    소마토스타틴-알부민 융합 단백질이:
    SST;
    L; 및
    작동 가능하게 연결된 ALB를 포함하되,
    여기서
    L은 어떤 순서로든 SST와 ALB를 연결하고;
    SST는 소마토스타틴, 이의 유사체 또는 유도체이며;
    L은 스페이서 또는 링커이고; 및
    ALB는 알부민, 이의 유사체 또는 변형체이고,
    여기서 L은 어떤 순서로든 SST와 ALB를 연결하는 것인, 입자.
  8. 제 7 항에 있어서,
    융합 단백질이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 입자:
    SST-(L)x1-ALB (I);
    ALB-(L)x1-SST (II);
    [SST-(L)x1]y1-ALB (III);
    ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
    [SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
    [SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
    [SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
    ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
    ALB-(L)x1- [SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX); and
    ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
    여기서, x1, x2, x3, x4, y1, y2 또는 y3은 독립적으로 0 또는 1-10으로부터 선택된 정수이다.
  9. 제 7 항에 있어서,
    SST가 천연 유래 또는 합성 제조 된 것인, 입자.
  10. 제 7 항에 있어서,
    SST가 각각 서열 식별 번호 17 또는 18로 표시되는 SST-14 또는 SST-28을 인코딩하는 서열 또는 이 서열들 중 하나와 적어도 85 % 상동성을 갖는 서열의 하나 이상의 탠덤 반복을 포함하는 것인, 입자.
  11. 제 7 항에 있어서,
    SST가 SST-14 또는 SST-28 인 입자.
  12. 제 7 항에 있어서,
    L이 가요성 또는 알파 나선형 구조의 폴리펩티드 링커 또는 스페이서인 입자.
  13. 제 7 항에 있어서,
    L이 2 내지 100 개의 아미노산을 갖는 펩티드인 입자.
  14. 제 13 항에 있어서,
    L이 하나 이상의 GGGGS, A(EAAAK)4A, (AP)n 도메인(여기서, n은 10-34에서 선택된 정수), (G)8 또는 (G)5, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 펩티드인, 입자.
  15. 제 7 항에 있어서,
    ALB가 포유 동물 혈청 알부민인 입자.
  16. 제 15 항에 있어서,
    포유 동물 혈청 알부민이 서열 번호 25이거나, 이 서열의 적어도 85 % 서열 상동성을 갖는 단백질 서열인, 입자.
  17. 제 8 항에 있어서,
    x1, x2, x3, x4가 각각 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수인 입자.
  18. 제 8 항에 있어서,
    y1, y2, y3이 각각 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수인 입자.
  19. 제 1 항에 있어서,
    소마토스타틴-알부민 융합 단백질이 이황화 결합에 의해 실질적으로 가교 결합 된 것인, 입자.
  20. 제 19 항에 있어서,
    이황화 결합이 초음파 처리에 의해 형성되는 것인, 입자.
  21. 제 1 항에 있어서,
    중합체 쉘이 실질적으로 약학적 활성제를 함유하는 것인, 입자.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 중합체 쉘의 최대 단면 치수가 약 0.001 미크론 내지 약 1000 미크론인 입자.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 중합체 쉘의 최대 단면 치수가 약 0.01 미크론 내지 약 1.0 미크론인 입자.
  24. 제 21 항에 있어서,
    약학적 활성제를 함유하는 상기 중합체 쉘이 생체 적합성 수성 액체에 현탁 된 것인, 입자.
  25. 제 1 항에 있어서,
    약학적 활성제는 생체 적합성 분산제에 현탁 된 것인, 입자.
  26. 제 25 항에있어서,
    생체 적합성 분산제가 대두유, 코코넛유, 올리브유, 홍화유, 면화씨 유, 탄소수 4 내지 30의 지방족, 지환 족 또는 방향족 탄화수소, 탄소수 2 내지 30의 지방족 또는 방향족 알코올, 탄소수 2 내지 30의 지방족 또는 방향족 에스테르, 탄소수 2 내지 30의 알킬, 아릴 또는 시클릭 에테르, 탄소수 1 내지 30의 알킬 또는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 치환기를 갖는 아릴 할라이드, 3-30 개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 폴리 알킬 렌 글리콜, 또는 이들의 임의의 둘 이상의 조합으로부터 선택되는 것인, 입자.
  27. 제 1 항에있어서,
    진단 성분이 초음파 조영제, 방사선 조영제, 자기 공명 화상 조영제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 입자.
  28. 제 4 항에있어서,
    영양제는 아미노산, 당, 단백질, 탄수화물, 지용성 비타민, 지방, 오일 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 입자.
  29. 제 28 항에있어서,
    지용성 비타민이 비타민 A, D, EK 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 입자.
  30. 제 4 항에있어서,
    기능 식품이 커큐민인 입자.
  31. 실질적으로 수 불용성 인 약제를 대상체에게 전달하는 방법이되, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 제 1 항의 입자를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  32. 다음을 포함하는 약학적 활성 성분을 포함하는 입자의 제조 방법 :
    소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성 제제를 함유하는 수성 매질을 이황화 결합에 의해 소마토스타틴-알부민 융합 단백질의 가교 결합을 촉진시켜 그 안에 약리학 적 활성 제제를 함유하는 중합체 쉘을 생성시키기에 충분한 시간 동안 전단 조건을 가하는 단계.
  33. 제 32 항에있어서,
    약학적 활성제는 질소 머스타드, 니트로소루아, 에틸렌 이민, 알칸 설포 네이트, 테트라 진, 백금 화합물, 피리 미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항 대사제, 엽산 유사체, 안트라 사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 토포 이소 머라 제 억제제, 호르몬 제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항암제.
  34. 제 33 항에있어서,
    항암제가 파클리탁셀, 카바지탁셀 또는 도세탁셀인, 방법.
  35. 제 32 항에있어서,
    전단 조건은 약 2 초 내지 5 분의 시간 동안 약 50 내지 최대 200 watts/cm2의 음향 파워를 갖는 고강도 초음파 하에서 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성제를 함유하는 수성 매질을 초음파 처리함으로써 제공되는 것인 방법.
  36. 제 32 항에있어서,
    전단 조건은 소마토스타틴-알부민 융합 단백질 및 약학적 활성제를 함유하는 수성 매질을 정적 혼합, 고압 균질화, 미세 유동화 조건 하에서 약 10 내지 최대 100,000 psi의 범위에서 균질화함으로써 제공되는 것인, 방법.
  37. 제 32 항에있어서,
    약리 활성제는 분산제에 분산되어 있는 것인, 방법.
  38. 제 1 항에있어서,
    소마토스타틴-알부민 융합 단백질이 중합체 쉘의 부피당 약 0.05 중량 % 내지 약 25 중량 %로 포함되는 것인, 입자.
  39. 제 1 항에있어서,
    소마토스타틴-알부민 융합 단백질이 중합체 쉘의 부피당 약 0.5 중량 % 내지 약 5 중량 %로 포함하는 입자.
  40. 제 1 항에있어서,
    입자 중 SST 융합 단백질 및 약학적 활성 성분 또는 진단 성분의 중량비가 약 20:1 내지 1:20 인 것인, 입자.
  41. 제 1 항에있어서,
    입자는 종양 소마토스타틴 수용체를 통해 종양 세포에 선택적으로 결합하는 것인, 입자.
  42. 제 41 항에있어서,
    종양 세포가 카르시노이드(carcinoids), 섬 세포 암종(islet-cell carcinoma), 글루카곤 종(glucagonomas), 위염 종(gastrinomas), 인슐린 종(insulinomas), VIP 종(VIPomas) 또는 골수 갑상선 암종에 존재하는 것인, 입자.
  43. 제 1 항의 입자, 및 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  44. 유효량의 제 1 항의 입자를 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 진단 방법.
  45. 유효량의 제 43 항의 약학적 조성물을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 진단 방법.
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