KR102364521B1 - 알부민 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 하이드로겔 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티올기를 가진 알부민과 말단 말레이미드를 가지고 4개의 팔을 가진 PEG 간의 티오에테르 결합의 빠른 반응을 이용하여 체내 주입 시 부반응 없이 겔화가 진행되는 하이드로겔 및 그의 제조방법에 관한 발명이다. 또한, 더욱 상세하게는 하이드로겔에 단백질 약물을 봉입시 약물의 하이드로겔 내 고착화 및 그로 인한 약물 방출 억제 현상을 해결하고 생체 적합성 기제를 이용하여 체내 부작용을 최소화한 하이드로겔에 관한 것이다.

Description

알부민 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 하이드로겔 및 그의 제조방법 {HYDROGEL CONTAINING ALBUMIN AND POLY ETHYLENE GLYCOL, AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 말레이미드-티올(maleimide-thiol) 작용기 간의 빠른 결합반응을 이용하여 생성되는 하이드로겔 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단백질 약물 봉입시 발생 가능한 약물의 하이드로겔 내 고착화 및 그로 인한 방출 억제를 줄이고 생체 적합성 기제를 이용하여 체내 부작용을 최소화한 하이드로겔에 관한 것이다.

하이드로겔을 이용한 약물 전달은 다양한 응용을 통해 발전되고 있는데, 목적한 약물을 겔화 과정 중에 또는 겔화된 하이드로겔을 건조한 후 추가적인 팽윤과정을 통해 봉입할 수 있다는 데서 활용 가치가 높은 약물 전달체 기술이다. 일반적으로 하이드로겔은 고분자 물질 간의 망상구조를 기반으로 한 삼차원 구조 물질로서 내부에 다량의 물을 포함할 수 있는 흡습성과 친수성 및 생체적합성 성질을 이용하여 체내 데포(depot) 등 약물 전달체나 연골 등의 대체제로 이용된다. 또한 렌즈나 패치, 마스크 팩 등 다양한 의료용, 미용 제품에 응용되는데 인체에 접촉 또는 이식되는 특성상 기제로 사용되는 고분자 물질은 기본적으로 생체친화성과 생분해성을 갖는 안정성을 필요로 한다. 셀룰로오스, 히알루론산, 키토산, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐 등의 천연고분자와, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올) 등의 합성고분자를 이용하고 있으며, 이들 고분자를 의료기기로 전환하기 위해서 다이하이드라자이드, 카보다이이미드, 부탄디올 디글리시딜에테르(butanediol diglycidylether) 등의 다양한 가교 결합제를 사용하고 있다.

하이드로겔의 형성을 위한 친수성 고분자 간의 가교 결합(crosslinking)은 크게 물리적 가교결합(physical crosslinking)과 화학적 가교결합(chemical crosslinking)으로 나뉘는데 구체적으로는 물리적 가교결합은 고분자 용액의 동결 및 해빙(freezing and thawing)의 반복, 결정화(crystallization), 방사선 조사(radiation), 수소결합(hydrogen bonding interaction), 전하 상호작용(charge interaction), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction), 입체복합체(stereocomplexation) 등에 의한 방법이고, 화학적 가교결합(chemical crosslinking)은 가교제를 이용한 고분자 사슬 간의 공유결합을 기반으로 하는 방법이다.

한편 치료 목적의 약학적 단백질의 약물로의 응용은 점차 증가하는 추세에 있다. 1982년 재조합 인슐린을 시작으로 30여 년간 130개 이상의 단백질 의약품이 미 FDA의 승인을 받았고 현재도 많은 연구들이 진행 중에 있다. 이러한 단백질 의약품은 대표적으로 항암제를 비롯하여 항염증 약물, 백신, 진단에 활용되는 경우가 많은데, 작은 분자량의 화학 약물보다는 표적 선택성이 높다는 데 장점이 있다. 하지만 체내 효소에 의해 쉽게 분해되는 탓에 투여 경로가 비교적 제한되는 것과 분리 및 정제과정에서 발생할 수 있는 약물의 변성 가능성 등 의약품으로 다루기에 까다로운 점이 많다는 것은 극복해야 할 한계로 지적되는 실정이다. 이러한 한계를 극복하기 위한 방법으로 주사제를 통한 약물 투여가 아닌 폐 흡입이나 경구, 비강내 투여 등 높은 생체이용률을 나타내는 대안에 대한 연구, poly(ethylene glycol)(PEG)나 폴리시알산(polysialic acid) 등의 고분자를 이용하여 단백질 고유의 항원성을 줄인 후 체내 지속 시간을 연장하는 방법, 및 리포좀, 고분자 기반의 마이크로/나노입자, 하이드로겔 등을 이용한 주사 가능한 시스템의 제어 방출을 이용하는 방법 등이 제시되고 있다. 하지만 구조적 변성이 발생한 경우 약물 활성이 감소되거나 심지어 부작용을 초래할 수 있다는 점에서 단순한 주사제를 이용한 투여가 아닌 약물 전달체를 이용한 약물 송달의 경우 전달체와의 상호 반응도 고려해야만 한다.

이러한 측면에서 고려했을 때, 구조적 변성 혹은 약물 전달체와의 상호 작용으로 인한 약물 효력 감소를 최소화할 목적으로 하이드로겔을 이용한 단백질 약물의 전달은 좋은 대안으로 여겨진다. 하이드로겔 특유의 친수성 성질과 외부 힘에 의한 유동성이 작고 안정성이 높은 구조적 성질은 단백질 약물 봉입 과정에서 발생할 수 있는 문제점들을 최소화할 수 있기 때문이다. 따라서 다른 약물 송달 시스템에 비해 하이드로겔을 이용한 단백질 약물 전달의 경우 장점이 부각되고 있다.

하지만 단백질 약물 표면의 다양한 작용기는 특히 화학적 가교결합을 기반으로 한 겔화 반응 도중에 하이드로겔을 구성하는 마크로머(macromer)와 반응하여, 약물과 하이드로겔 간에 원치 않는 반응이 일어날 수 있다. 이 경우 약물 방출에 문제가 발생할 수 있는데, 이러한 문제의 대안으로 작용기의 수식 및 차단이 시도되기도 한다.

한편 주사 가능한 하이드로겔(Injectable Hydrogel)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 온도나 pH 감응성 고분자를 이용하여 체내 주입 시 체온 조건에 의해 겔화가 진행되는 하이드로겔이 이에 해당한다. 하이드로겔은 장에서 효소 또는 p H 등으로부터 약물의 변성을 방지할 수 있고, 또한 여러 인체 내의 자극에 의해 약물을 방출하는 특징적 성질을 부여할 수 있다.

한국 공개특허 제2013-0133692호 한국 공개특허 제2011-0056630호

이에, 본 발명은 생체적합성, 생분해성을 기반으로 안정성을 확보하면서 복잡한 화학적 수식 없이 주사 가능하고 제조 조건이 용이한 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 하이드로겔의 마크로머 간의 화학적 반응 시 봉입되는 단백질 약물과 부반응을 일으키지 않아, 단백질 약물이 하이드로겔 내부에 갇히지 않고, 방출할 때에도 외부의 영향을 받지 않으며 예측 가능한 수준에서 약물 방출 양상을 나타내는 시스템을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 하이드로겔은 티올 (-SH, 설프히드릴) 잔기를 가진 알부민과 말단 말레이미드(maleimide) 잔기를 가지고 4개의 팔을 가진 4중합된 PEG를 포함하며, 알부민의 티올(-SH) 잔기와 고분자 물질인 PEG의 말단에 수식된 말레이미드(maleimide) 잔기 간의 빠르고 선택적인 반응인 티올에테르(thioether) 결합을 이용하여 제조된다.

본 명세서에서, "마크로머(macromer)"는 하이드로겔을 구성하는 단위로서 하이드로겔에 포함된 알부민의 티올기와 PEG의 말레이미드 기 사이에 티올에테르 반응이 진행되어 생성된 중합체를 의미한다.

이론적으로, 생리적 조건에서 말레이미드-티올(maleimide-thiol) 간의 반응은 말레이미드-아민(maleimide-amine) 반응에 비해 약 1,000배 가량 빠르고, 단백질 약물의 경우 일반적으로 시스테인(cysteine) 잔기가 리신(lysine) 잔기보다는 그 수가 훨씬 적은 것으로 알려져 있다. 따라서 최적화된 반응 조건에서 가교결합을 형성할 때, 하이드로겔에 봉입된 단백질의 아민기와 하이드로겔을 구성하는 마크로머 간의 반응 보다는 마크로머(macromer) 간의 말레이미드-티올(maleimide-thiol) 반응이 더 신속하고 선택적으로 진행되어 하이드로겔이 형성되며, 부반응은 최소화된다. 또한, 단백질 약물의 시스테인 잔기는 주로 분자 내 이황화결합(intramolecular disulfide bond)을 형성하거나 추가적인 산화(oxidation) 과정을 거쳐야만 노출이 되기 때문에, 약물의 티올 잔기와 마크로머의 말레이미드 잔기 간의 부반응이 일어날 가능성이 거의 없다. 또한 잘 알려진 화학적 가교결합의 하나인 NHS 잔기와 아민기의 아미드 결합을 비롯한 대부분의 화학반응에 비해 반응속도가 빠르고 말레이미드 잔기 자체의 안정성이 NHS 잔기 등의 기타 화학결합기에 비해 뛰어나다는 것도 말레이미드-티올 반응 기반의 하이드로겔이 갖는 장점이다.

본 발명의 PEG는 생분해성 고분자로서, 4개의 팔을 갖는 4중합된 고분자이며 그 말단은 말레이미드기로 수식되어 있다. 4개의 팔을 갖지 않은 PEG, 예컨대 2개의 팔을 가진 PEG를 사용하는 경우에는 하이드로겔을 형성하는데 걸리는 겔화 시간이 지나치게 오래 걸려 체내 주입용 약물 전달체로 사용하기에는 적절하지가 않다. 또한, 하이드로겔의 강도도 체내 주입용 약물 전달체로 사용하기에는 적절하지가 않다. 반면, 본 발명의 4개의 팔을 가진 PEG는 알부민의 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드 기가 4개가 존재하여 가장 효율적으로 말레이미드-티올기 반응을 진행할 수 있으며, 이를 통해 약물 전달체로서 적합한 강도 및 구조를 가진 하이드로겔을 빠른 시간 내에 형성할 수 있는 장점이 있다.

또한, 체내에 투여되었을 때 겔화 반응의 최적화를 위해, 상기 PEG는 10,000 내지 20,000의 분자량을 갖는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 20,000의 분자량을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 4개의 팔을 가진 PEG는 일 실시형태에서 하기 화학식 1과 같은 구조를 가질 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식에서, a, b, c 및 d는 195~265의 정수를 가지며,

상기 X는 (CH₂)₃-NHCO-CH₂CH₂ 이다.

본 발명의 4개의 팔을 가진 PEG에서, 4개의 팔은 구조적으로 대칭 또는 비대칭일 수 있다.

본 발명의 티올기를 가진 알부민과 말레이미드 기를 가진 PEG의 혼합 비율은 바람직하게는 분자량 기준으로 1:1 내지 1:2일 수 있다. 알부민의 당량을 증량하였을 때 (알부민 : PEG = 2 : 1) 겔화 시간이 큰 영향을 받아서, 본 발명에서 목적으로 하는 주사 가능한 하이드로겔에 적용하기에는 지나치게 빠른 겔화 시간을 나타내어 이용하기에는 문제점이 있다. 한편 PEG를 증량하는 경우 (알부민 : PEG = 1 : 2) 1:1 농도비의 경우와 비교하여 겔화 시간에 큰 변동이 나타나지 않는다. 일 실시형태에서, 비용적 측면에서의 효율성을 위해 두 물질의 당량비는 1 : 1 일 수 있다.

또한, 티올기를 가진 알부민과 말단 말레이미드 기를 가진 PEG의 최종 농도는 300 μM 내지 600 μM인 것이 바람직하다. 상기 최종 농도는 겔화된 하이드로겔 내의 알부민 및 PEG의 농도를 의미한다. 즉, 반응에 참여한 알부민 및 PEG의 최종 하이드로겔 부피에 대한 농도입니다. 농도가 300 μM 미만인 경우에는 하이드로겔을 형성하는데 걸리는 겔화 시간이 너무 길며, 600 μM 초과인 경우에는 겔화가 과도하게 빠르게 진행되어 실용성이 떨어져 특히 주사 제형으로 적합하지가 않다.

알부민의 티올기는 티올화제와 알부민을 반응시켜서 형성될 수 있으며, 티올화제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP), 2-이미노티올란(2-iminothiolane), N-숙신이미딜- S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA) 또는 숙신이미딜 아세틸티오프로피오네이트(succinimidyl acetylthiopropionate, SATP)등일 수 있다. 상기 티올화제는 추가적인 탈보호화(deprotection) 과정이 필요하지 않는다는 점에서 2-iminothiolane이 보다 바람직하다.

본 발명의 하이드로겔은 체내에 주입되어 겔을 형성하며, 주사 제형으로 체내에 주입될 수 있다. 즉, 본 발명의 하이드로겔은 빠른 반응 속도를 이용하여 용액(solution) 상태 또는 졸(sol) 상태로 체내 주사가 가능하고, 이 후 체내에서 겔(gel)이 형성되도록 하는데, 상기 용액은 기본적으로 PBS(phosphate buffered solution)를 사용하고 혹은 주사 가능한 주사액을 포함하는 용액을 사용하여 분산액의 형태로 만들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 알부민과 PEG의 티오에테르 결합을 통한 하이드로겔 형성을 위한 겔화 시간은 30초 내지 90초 이내인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로 60초 이내이다. 겔화 시간이 30초 미만이면 겔이 형성되어 주사로서의 사용이 불가능해지며, 겔화 시간이 60초를 초과하면 체내에서 겔이 형성되기 어렵거나 봉입된 생리 활성 물질을 잘 전달하기 어려운 문제가 있다.

본 발명은 하이드로겔에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질을 더 포함할 수 있다. 하이드로겔에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질로서는 특별한 제한이 없으며, 이의 비제한적인 예로는 트레일(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)과 같은 항암제, 인슐린, 엑센딘-4, 인체성장호르몬(hGH), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 조혈성장인자(Granulocyte Colony stimulating factor, G-CSF), GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor) 등과 같은 단백질 약물과 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등의 약물과 전술한 성분 이외에 당해 기술분야에 알려진 통상적인 첨가제, 예컨대 부형제, 안정화제, pH 조정제, 항산화제, 보존제, 결합제 또는 붕해제 등이 있다.

본 발명의 하이드로겔은 바람직하게는 단백질 약물을 봉입할 수 있으며, 이 경우 단백질 약물이 하이드로겔을 구성하는 마크로머와 부반응을 일으키지 않으며, 단백질 약물을 목적하는 장소에 효과적으로 전달하는 우수한 효과를 나타낸다.

하이드로겔에 봉입될 수 있는 단백질 약물로서 "트레일(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)"은 종양괴사인자 (Tumor Necrosis Factor, 이하 TNF)의 일종으로 세포의 자가소멸(apoptosis)에 관여하는 세포막 단백질을 의미한다.

또한, 상기 트레일은 천연형 또는 유전자 변형으로 얻어지는 재조합 트레일일 수 있으며, 트레일의 삼량체 형성을 유도하는 지퍼(zipper) 아미노산 배열 및/또는 분리 정제를 용이하게 하는 말단기가 포함된 트레일일 수 있다. 상기 트레일 단백질은 281개의 아미노산 서열을 갖는 인간 트레일이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 트레일 단백질은 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 서열을 갖는 인간 트레일이다.

또한, 상기 트레일 단백질은 N-말단에 이소루신 지퍼를 부착한 것을 사용할 수 있다. N-말단에 이소루신 지퍼를 가진 트레일 단백질을 수용체가 효과적으로 인지할 수 있는 삼량체 형태의 트레일 단백질을 형성하는 것이 용이하므로, 천연형 트레일에 비하여 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 주사 제형의 하이드로겔은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 기타 보조제 및 담체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔은 주사를 통해 체내로 들어가기 때문에 이의 제조에 사용되는 고분자 등은 생체적합성과 생체분해성을 지니고 있어야 한다. 즉, 상기 고분자는 생체세포에 안전하여야 하며 트레일 단백질 또는 단백질 약물의 방출 종료시에는 스스로 분해되어 소실될 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질 약물이 봉입된 하이드로겔의 제조방법은 다음을 포함한다:

(a) 알부민과 티올화제를 반응시켜서 알부민에 티올기를 도입하는 단계;

(b) 말단 말레이미드기를 가지고 4개의 팔을 가진 PEG에 단백질 약물을 혼합하는 단계; 및

(c) 상기 알부민 및 단백질 약물이 포함된 PEG를 혼합하는 단계.

상기 (a) 단계는 알부민의 표면에 존재하는 아민기를 티올기로 바꾸는 단계로서, 가교 역할을 하는 PEG와 좀 더 신속하고 선택적인 반응을 유도하기 위해 알부민 표면의 작용기를 변경하는 단계이다. 또한, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin) (HSA)일 수 있다.

상기 티올화제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP), 2-이미노티올란(2-iminothiolane), N-숙신이미딜- S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA) 또는 숙신이미딜 아세틸티오프로피오네이트(succinimidyl acetylthiopropionate, SATP)등일 수 있다. 상기 티올화제는 추가적인 탈보호화(deprotection) 과정이 필요하지 않는다는 점에서 2-iminothiolane이 보다 바람직하다.

또한, 일 실시형태에서 상기 제조방법은 상기 (a) 단계는 티올기를 가진 알부민을 농축 및 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 농축 및 정량하는 단계는 상기 (a) 단계의 티올기를 가진 알부민을 확인하고 불순물을 제거한 후 농축 및 정량하는 단계로서, 상기 티올기를 가진 알부민을 고농도로 농축하여 정량하고 이 과정에서 반응하지 않은 트라우츠 시약(traut’s reagent)과 같은 티올화제를 제거하여 반응 순도를 높이는 단계이다.

일 실시형태에서, 상기 단계의 농축은 MWCO(Molecular Weight Cutoffs)가 30k인 amicon을 이용하여 2,200rpm에서 15분 동안 원심분리를 통해 이루어지며, 이 과정에서 잔여 트라우츠 시약이 여과되어 제거된다. 상기 원심분리는 동일한 조건으로 총 5회 진행되는데, 이에 제한되는 것은 아니며, 당해 기술분야의 통상의 방법을 사용할 수 있다.

상기 농축된 티올기를 가진 알부민은 HPLC를 통해 정량 및 반응 상태를 확인하는데 zorbox column을 이용한 역상 크로마토그래피에서 티올화(thiolation)에 따른 피크의 이동 및 피크 면적을 이용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 농축 및 정량하는 단계는 단백질의 변성을 최소화하기 위해 신속하고 상온 범위에서 진행되도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 말레이미드-티올기의 반응은 바람직하게는 pH 6.5~7.5 조건에서 안정하게 진행이 된다. pH가 상기 범위를 벗어나는 경우 말레이미드 고리가 깨어져서 겔화 반응이 적절하게 진행되지 않을 수 있으며, 본 발명은 하이드로겔 형성 반응이 체내에 주입한 후에 겔화가 주로 진행이 되므로 반응의 최적 pH 조건을 만족한다. 또한 겔화 반응이 빠른 시간 내에 이루어지므로 본 발명은 온도 조건에 크게 영향을 받지 않으며, 예컨대 온도가 체온 조건인 경우에도 하이드로겔을 형성하는데 크게 문제가 되지 않는다.

본 발명은 알부민의 티올기와 PEG의 말레이미드 잔기 간의 티오에테르 가교결합을 기반으로 하여, 단백질 약물과 부반응을 일으키지 않는 생분해성 하이드로겔을 제공할 수 있다.

본 발명의 약물 전달체는 빠른 반응 속도를 기반으로 하이드로겔의 손상 없이 생체 내로 주입이 가능하고 이후 주사 부위에서 하이드로겔이 형성되어 데포(depot)로서 역할이 가능하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생성 및 분해 과정에서 주사 부위의 독성 및 부작용이 최소화된 생적합성 하이드로겔이며, 봉입된 단백질 약물과 의도치 않은 결합으로 인한 약물 송달의 저해를 최소화할 수 있다. 즉, 봉입된 단백질 약물은 알부민 및 PEG 간의 가교결합에 참여하지 않고, 독립된 약물로 존재하게 되어 하이드로겔이 형성된 후에 방출에 영향을 받지 않는다.

도 1a는 일 실시형태에서 티올기를 가진 알부민과 말레이미드 기를 가진 PEG 간의 티오에테르 결합 반응을 나타낸 것이다.
도 1b는 티올기를 가진 알부민(실시예 1)과 아민기를 가진 알부민(비교예 1)의 경우, 각각 말레이미드 기를 가진 PEG 및 트레일(TRAIL)과 반응하여 하이드로겔을 형성하는데 걸리는 시간을 나타낸 것이다.
도 1c는 실시예 1 및 비교예 1에 의해 형성된 하이드로겔을 나타낸 사진이다. 실시예 1은 1 분 이내에 겔화가 진행되는 반면에 비교예 1로 설정된 NHS-NH₂ 기반의 하이드로겔은 흘러내리는 것을 확인할 수 있다.
도 2a는 알부민 또는 PEG의 최종 농도에 따른 겔화 시간을 알부민 및 2-iminothiolane의 당량비에 따라 나타낸 그래프이다.
도 2b는 알부민 또는 PEG의 최종 농도가 고농도(600μM 초과)인 경우에 형성된 하이드로겔의 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법으로 제조된 하이드로겔에서 봉입된 약물이 하이드로겔과 부반응 혹은 내부 갇힘 없이 지속적으로 방출되는 것을 확인한 도면이다. 구체적으로, 도 3a는 형광을 이용한 약물 방출을 확인한 도면이고, 도 3b는 균질화된 하이드로겔을 HPLC에서 확인한 도면이며, 도 3c는 균질화된 하이드로겔을 CD에서 확인한 도면으로, NHS-NH₂ 반응을 통해 겔화된 하이드로겔을 대조군으로 비교하였다.
도 4는 봉입된 트레일의 췌장암 세포주(Mia paca-2)에서의 항암 활성을 나타낸 것이다. 각 하이드로겔의 배양액을 원심분리 한 후 얻어진 상등액을 통해 이루어진 아폽토시스를 시각화한 결과이다.
도 5는 본 발명 하이드로겔의 체내 주입 후 겔화 양상과 이 후 체내에서 분해되는 과정에 대한 사진을 나타낸 것이다. 도 5a는 겔화 양상을 체내 주입 후 3 시간 후에 확인하였고, 분해 양상을 총 21일에 걸쳐 확인한 것을 사진으로 나타낸 것이다. 도 5b는 3주에 걸쳐 체내에 형성된 하이드로겔의 생분해성에 대해 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 3주 동안 50% 이상의 하이드로겔이 정상적으로 분해되어 소실되는 것으로 확인되었다. 도 5c는 H&E 및 TUNEL 염색을 통한 주사 부위에서의 독성 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 하이드로겔의 췌장암에 대한 항암 활성을 나타낸 것으로서, 도 6a는 생쥐의 종양의 크기를 나타낸 것이며, 도 6b는 해부된 생쥐 종양의 외관상 형태 및 크기 비교를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 트레일을 내부 봉입한 주사 제형의 하이드로겔 제조

40 mg 의 인간 혈청 알부민(HAS)을 2 ㎖의 PBS 에 용해하고, 각각 알부민 당량 대비 6, 9, 12, 18, 및 24 당량의 2-iminothiolane을 알부민 수용액에 혼합한 후 교반기를 이용하여 90 분간 교반하였다. 생성된 티올기를 가진 알부민 수용액을 amicon (MWCO; 30k)을 이용하여 원심분리기에서 2,200 rpm에서 15분간 총 5회에 걸쳐 원심분리하여 농축하였다. 농축 후 정량 및 확인은 HPLC를 통해 진행되었으며 최종 농도는 100 mg/ml로 하였다.

이 후 N-말단에 지퍼가 없는 트레일 3 mg을 최대 3 mg/ml로 농축하여 준비하고 여기에 말레이미드기를 가진 PEG 12 mg 을 혼합하여 PEG 수용액을 제조하였다. 상기 PEG는 NOF America사의 SUNBRIGHT^® PTE-200MA를 사용하였다.

앞서 100 mg/ml로 농축된 티올기를 가진 알부민과 트레일이 포함된 PEG 수용액을 혼합한 후, 4~5회 교반 후 방치하면 1분 이내에 하이드로겔을 얻을 수 있었다. 상기 실시예 1에 대한 간략한 모식도를 도 1a에, 12당량의 2-iminothiolane을 사용하여 제조된 하이드로겔 및 NHS-NH₂을 사용한 하이드로겔의 사진을 도 1c에 나타내었다(도 1a 및 1c 참고).

또한, 알부민과 반응한 2-iminothiolane의 당량별로, 티올기를 가진 알부민 또는 말레이미드기를 가진 PEG의 최종 농도에 따른 겔화 시간을 도 2a에 나타내었다(도 2a 참고). 한편, 도 2b에 첨부된 사진은 고농도 (최종 농도가 600 μM를 초과)인 경우 형성된 하이드로겔의 사진이다(도 2b 참고). 티올기의 치환이 18 당량 이상을 가진 알부민을 이용하여 하이드로겔을 형성한 경우에도 상기 도 2b와 유사한 양상을 나타내었다. 즉, 티올기를 가진 알부민 또는 말레이미드기를 가진 PEG가 600 μM를 초과하는 고농도이거나, 티올기가 알부민 당량 대비 18 당량 이상 진행된 알부민을 사용하는 경우, 교반 도중에 겔화가 진행되는 등 겔화가 과도하게 빠르게 진행이 되어 실용성이 떨어지므로 적합한 조건은 아닌 것으로 밝혀졌다. 또한, 티올기를 가진 알부민 또는 말레이미드기를 가진 PEG가 300 μM 이하의 저농도이거나, 티올기가 알부민 당량 대비 9 당량 미만으로 치환된 알부민의 경우에는 반응 속도가 현저히 떨어져(5분 이상) 역시나 하이드로겔 형성을 위한 조건으로는 적합하지 않았다.

실시예 2: 하이드로겔과 단백질 약물의 부반응 및 트레일의 방출 양상

상기 실시예 1과 동일한 방법(12 당량의 2-iminothiolane 사용)으로 실시하되, 상기 N-말단에 지퍼가 없는 트레일 3 mg에 1.5 당량의 형광물질 rhodamine (0.036 mg)를 넣고 실온에서 5 시간 차광하여 반응시켰다. Rhodamine은 색깔을 나타내므로, 하이드로겔과의 부반응 없이 지속적으로 트레일이 방출되는지 여부를 알아보기 위해 형광물질인 rhodamine을 부착하여 사용하였다.

이 후 반응하지 않은 rhodamine은 Desalting column을 이용하여 제거하고 트레일-FITC를 최종 3 mg/㎖ 의 농도로 농축하였다.

한편, 별도의 치환기 변환 과정을 거치지 않은 알부민 즉, 아민기(-NH₂)를 가진 알부민과 말단이 NHS로 치환된 PEG를 사용하여 NHS-NH₂ 치환기 간의 반응을 이용한 것을 제외하고는 상시 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하여 하이드로겔을 제조하였다(비교예 1).

본 발명의 하이드로겔에 봉입된 생체 활성 물질의 방출 양상과 하이드로겔 및 생체 활성 물질 간의 부반응 발생 여부를 확인하기 위해, 공초점 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss, Meta LSM510, Germany)을 이용해서 관찰하였으며, 이를 도 3a에 나타내었다(도 3a 참고).

즉, 형광 물질을 부착한 약물 (TRAIL)을 봉입한 각각의 하이드로겔을 PBS 배양 후 하이드로겔 일부를 공초점(confocal) 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 경우 봉입된 약물이 하이드로겔 기재와 부반응이 없이 방출되어 매우 옅은 형광 시그널을 나타내는 반면, NHS-NH₂ 기반의 비교예 1의 하이드로겔은 봉입 약물이 하이드로겔 기재와 반응하여 방출되지 못해 현미경을 통한 관찰에서 강한 형광 신호를 나타내었다.

또한, 균질화된 하이드로겔의 상등액을 취해 동일 농도의 트레일 및 알부민 수용액(대조군)과 비교하여 HPLC(Gilson, 321 pump, USA) 및 CD(Applied Photophysics, Chirascan plus, UK)를 이용하여 관찰하였다. 정량은 역상 크로마토그래피와 BCA assay를 교차하여 확정하였으며, 그 결과를 도 3b 및 도 3c에 나타내었다(도 3b, 3c 참고).

그 결과, 도 3a, b, 및 c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이드로겔은 봉입된 트레일과 별도의 부반응 없이 방출되는 것이 확인되었고, 방출된 약물인 트레일 또한 고유의 성질을 보존하고 있는 것으로 나타났다.

실시예 3: 본 발명 하이드로겔의 세포주에서의 항암활성 확인

본 발명의 약물 전달체인 하이드로겔의 항암 활성을 알아보기 위해 췌장암 세포인 Mia paca-2 세포를 사용하여 세포 독성 실험을 진행하였다.

구체적으로, 12 웰 플레이트 각 웰에 커버 글라스를 깔고 그 위에 각각 1x10⁵ 개씩의 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하여 세포의 안정화를 유도하였다. 이 후 각각의 세포에 최종 10배 희석한 상기 실시예 2에서 제조된(12 당량의 2-iminothiolane 사용) 본 발명의 하이드로겔과 상기 비교예 1의 하이드로겔 배양액을 각각 약물 처리하였다.

그 다음, 각각의 웰에 고정화 과정을 거쳐 세포를 고정한 후 TUNEL reaction mixture를 첨가하고 최종적으로 DAPI solution을 이용하여 세포핵을 염색하여 세포의 성상 및 자멸사 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이드로겔의 incubation 상등액의 경우 췌장암 세포에서 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 자멸사로 인해 나타나는 선명한 형광 신호를 통해 겔화 과정에서 봉입 트레일의 췌장암 세포주에 대한 아폽토시스 활성이 잘 유지되었음을 확인하였다(도 4 참고).

상기와 같은 결과는 본 발명의 하이드로겔이 그에 봉입된 약물인 트레일과 부반응을 일으키지 않고 방출되어 약효를 나타냈으며, 약물 활성에 영향을 미치지 않고 정상적으로 우수한 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 4: 하이드로겔의 체내 주입 후 겔화 및 시간에 따른 생분해성 확인

발명의 방법으로 제조된 하이드로겔의 체내 주입 후 겔화 여부를 확인하기 위해, 가교가 없는 알부민 용액(대조군)과 상기 비교예 1의 NHS-NH₂ 기반의 하이드로겔, 및 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된(12 당량의 2-iminothiolane 사용) 하이드로겔을 겔화 되기 전 졸(sol) 상태에서 각각 6주령 수컷 BALB/c nu/nu 생쥐의 우측 옆구리에 주사하였다.

그 결과 도 5a에 나타난 대로, 본 발명의 하이드로겔의 경우 졸 상태의 주입 후 체내에서 정상적으로 겔화가 진행된 것을 확인할 수 있다. 반면에 NHS-NH₂ 기반의 하이드로겔은 가교가 없는 알부민 용액과 유사한 형태로 겔을 형성하지 못하고 퍼진 채로 존재하는 것이 확인되었다(도 5a 참고).

한편, 3주에 걸쳐 체내 주입된 하이드로겔의 생분해성에 대해 관찰한 결과를 도 5b에 나타냈는데, 3주 동안 50% 이상의 하이드로겔이 정상적으로 분해되어 소실되는 것으로 확인되었다(도 5b 참고). 생적합성 고분자 물질이 시간이 흐름에 따라 체내 분해됨에 따라서 활용 가능성이 충분하다.

또한, 도 5c에 나타난 바와 같이, H&E 및 TUNEL 염색을 통한 주사 부위에서의 독성 관찰 결과, 정상 피부 세포 조직과 비교하여 심각한 독성 및 구조적 변성이 일어나지는 않는 것으로 확인되었다(도 5c 참고). 상기 실험은 6 주령 수컷 BALB/c nu/nu 생쥐 우측 옆구리에 주사한 각각의 하이드로겔 주사 부위의 피부 조직을 3주 후 얻어내어 포르말린 및 파라핀 처리를 통해 고정하였다. 이 후 고정된 조직을 횡단면 방향으로 얇게 슬라이스한 후 H&E 염색 및 TUNEL 염색을 진행하였고, 염색된 검체를 현미경을 통해 관찰하였다.

실시예 5: 하이드로겔의 항암 치료 효과 확인

본 발명 하이드로겔의 항암 효과를 6 주령 수컷 BALB/c nu/nu 생쥐를 사용하여 확인 및 평가하였다.

구체적으로, 생쥐의 적응 환경은 온도 (22±3℃), 습도 (55±5%), 빛 (밝고 어두운 상태가 12시간씩 반복) 상태의 일정한 조건에서 최소 1주일 이상 유지하였다. 투약 4주 전, 마리당 10⁶ 개의 Mia paca-2 세포를 우측 옆구리에 피하 주사하여 췌장암 종양을 유발하고 각 그룹당 5 마리의 생쥐를 임의로 나눴다. 주사된 종양 세포가 안정화되면, 하이드로겔을 투약하지 않는 대조군 (Group 1), 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 하이드로겔을 투약하는 군 (Group 2), 상기 비교예 1과 동일한 방법으로 제조된 NHS-NH₂ 반응을 기반으로 제조된 하이드로겔을 투약하는 비교군 (Group 3)으로 나눠 4 주간에 걸쳐 투약을 진행하였다. 하이드로겔의 투약의 경우 겔화가 완성되기 전 졸(sol)의 상태로 체내에 주사하여 체내 겔화를 유도하였다. 그 결과, 상기 Group 1 내지 2에 대한 항암 활성 효과는 해부 후 종양 조직의 비교 관찰 및 종양의 크기 비교를 통해 확인하였고, 그 결과를 도 6a, b에 나타내었다.

도 6a, b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이드로겔을 투약한 Group 2의 경우, 종양의 외관상 형태가 나머지 그룹들에 비하여 확연히 작은 결과를 나타내었으며(도 6a 참고), 종양의 크기 면에서도 나머지 그룹들에 비하여 확연히 작은 크기를 나타내어 종양의 치료에 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 하이드로겔은 우수한 약물 봉입 및 방출 가능성을 가지고 있다(도 6 b 참고).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

1. 티올기를 가진 알부민; 및
   말단 말레이미드기를 가지고 4개의 팔을 가진 폴리에틸렌글리콜 (Poly(ethylene glycol), PEG)을 포함하며, 상기 티올기와 말레이미드기 간의 가교에 의해 형성되는 약물 전달용 하이드로겔로서,
   상기 티올기는 알부민 표면의 NH₂ 잔기에 티올화제를 반응시켜 형성되는 것이고,
   상기 알부민 및 티올화제의 당량비는 9 내지 18 당량인, 하이드로겔.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 알부민은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin) (HSA)인 하이드로겔.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 PEG는 10,000 내지 20,000의 분자량을 갖는 하이드로겔.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 티올기를 가진 알부민 및 PEG는 분자량 기준으로 1 : 1 내지 1 : 2의 비율인 하이드로겔.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 티올기를 가진 알부민 및 PEG의 최종 농도가 300 μM 내지 600 μM인 하이드로겔.
   
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8. 제1항에 있어서,
   상기 티올화제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP), 2-이미노티올란(2-iminothiolane), N-숙신이미딜- S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA) 또는 숙신이미딜 아세틸티오프로피오네이트(succinimidyl acetylthiopropionate, SATP)인 하이드로겔.
   
9. 제1항에 있어서,
   내부에 봉입된 단백질 약물을 더 포함하는 하이드로겔.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 약물은 항암제, 인슐린, 엑센딘-4, 인체성장호르몬(hGH), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 조혈성장인자(Granulocyte Colony stimulating factor, G-CSF) 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 하이드로겔.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항암제는 트레일(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)인 하이드로겔.
    
12. 제1항에 있어서,
    상기 4개의 팔을 가진 PEG는 하기 화학식 1로 표현되는 것인 하이드로겔:
    [화학식 1]
    

    

    
    상기 화학식에서, a, b, c 및 d는 195~265의 정수이며,
    상기 X는 (CH₂)₃-NHCO-CH₂CH₂ 이다.
    
13. 제1항 내지 제5항 및 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔을 포함하는 주사 제형.
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