KR20200071414A

KR20200071414A - 왕사마귀로부터 유래된 테노데라신-1 펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR20200071414A
Application number: KR1020180159130A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 김인우; 김미애; 서민철; 김선영; 김성현; 이준하
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-06-19
Also published as: KR102146937B1

Abstract

본 발명은 왕사마귀로부터 유래된 테노데라신-1 펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 테노데라신-1 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 등에 대한 항균 또는 항진균 효과가 우수하며, NO 분비를 억제하고 IL-6, IL-1β, iNOS, COX-2 등의 발현을 억제하는 효능이 있어, 각종 염증질환의 치료제로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

왕사마귀로부터 유래된 테노데라신-1 펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물 {Tenoderasin-1 peptide isolated from Tenodera sinensis or antimicrobial, antimycotic and antiinflammatory composition comprising it}

본 발명은 왕사마귀로부터 유래된 테노데라신-1 펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

곤충들은 살아가는 환경에 적응하고 생존하기 위해서 그들만의 특별한 생리조절 기전 및 물질들을 확보하는 방향으로 진화해 왔는데, 최근 곤충의 생리활성 물질들을 이용한 새로운 약물후보물질 개발 연구가 활발히 진행되고 있다[Insect Biochem. Mol. Biol. 41, 747-769]. 이러한 곤충 후보군 중의 하나인 왕사마귀(Tenodera sinensis)는 몸길이 70∼95mm로 사마귀보다 약간 큰 곤충인데, 현재 왕사마귀를 이용한 약리학적 기전 또는 약학 조성물의 적용방법은 거의 알려진 바가 없다.

한편, 생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다. 실제로, 병원성 미생물이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 병원성 미생물 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다. 항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 이러한 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 발생되는데, 이로 인해 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다. 병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다. 아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주되며, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 병원성 미생물들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있기에, 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

염증(inflammation)은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 원인은 기계적 상해작용, 온도, 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이며 이 중 세균에 의한 것이 가장 많다. 이러한 주요 원인 외에도, 여러 부수적 요인과 개체의 소인이나 면역 등에 의하여 그 발생은 복잡하다. 또한 염증반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응 중의 하나라고 할 수 있다. 대식세포는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 활성화된 대식세포는 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE2(prostaglandin E2), NO (nitric oxide), ROS (reactive oxygen species) 등과 같은 다양한 염증성 매개체를 분비한다. 한편, 이러한 염증성 매개체의 과발현은 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관질환, 암 등을 유도한다(Lawrence, T. et al., 2012).

이에 본 발명자들은 왕사마귀로부터 유래된 펩타이드를 이용하여 다양한 생리활성을 연구하던 중, 신규 펩타이드 테노데라신-1이 항균, 항진균 또는 항염증 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제10-0320948호 (발명의 명칭 : 상표초로부터 분리·정제한 혈전 용해성 세린프로테아제 및 그의 제조방법, 출원인 : 대한민국) 한국공개특허 제10-2008-0019837호 (발명의 명칭 : 염증 억제 및 면역조절 활성을 함유하는 사마귀 추출물 및 이를 포함하는 조성물, 출원인 : 대한민국)

Lawrence, T. et al., Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation., Nat. Rev. Immunol., 2002, 2, 787-795.

본 발명의 목적은 왕사마귀로부터 유래된 테노데라신-1 펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 왕사마귀(Tenodera sinensis)로부터 유래된, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균, 항진균 또는 항염증성 펩타이드에 관한 것이다.

서열번호 1: YFPEKGKSGFIIWRYVLRR-NH₂

상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상에 대하여 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항진균 활성을 나타낼 수 있다.

상기 항균, 항진균 효과로 인해 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공할 수도 있다.

이에 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균, 항진균 항염증용 조성물을 제공하며, 이를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 왕사마귀로부터 분리한 항균, 항진균 또는 항염증성 펩타이드의 유전자에서 합성된 서열번호 1로 표현되는 펩타이드에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 서열번호 1과 동일한 서열을 갖는 왕사마귀로부터 직접 분리한 항균, 항진균 또는 항염증 펩타이드에 관한 것일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1과 동일한 서열을 갖는 왕사마귀로부터 직접 분리한 항염증성 펩타이드에 관한 것일 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 카르복실 말단이 -NH₂ 형태 또는 -OH 형태일 수도 있다.

본 발명에서는 상기 왕사마귀(Tenodera sinensis) 유래 펩타이드 유전자를 확인하기 위해 먼저 왕사마귀를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 왕사마귀 내 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인하며, 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산(펩타이드)의 서열을 바탕으로 기존의 밝혀진 항염증성 펩타이드의 성질을 이용하여 항염증성 활성을 나타내는 펩타이드로 추정되는 유니진을 선별할 수 있다.

상기 펩타이드의 아미노산 서열은 YFPEKGKSGFIIWRYVLRR-NH₂로 19개 아미노산으로 구성되며 이를 테노데라신-1(Tenoderasin-1)으로 명명한다.

본 발명은 상기 펩타이드를 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 각종 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 항염증용 조성물, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 테노데라신-1 펩타이드를 함유하는 약학 조성물은 또한 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 펩타이드 또는 이를 함유하는 조성물은 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 테노데라신-1 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물에서 본 발명의 테노데라신-1 펩타이드 또는 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약학 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규 펩타이드를 함유하는 약학 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명에 대한 선행기술로서 한국등록특허 제10-0320948호와 한국공개특허 제10-2008-0019837호 등에 사마귀 유래의 추출물이나 알집 등의 약리학적 용도가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같은 왕사마귀 유래의 펩타이드 조성물이 이와 유사한 기능을 한다는 것에 대해서는 전혀 개시된 바 없고, 또한, 왕사마귀 관련된 펩타이드 기술에 있어서 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 항균, 항진균 또는 항알레르기성 효능이 있다는 연구도 아직까지 수행된 바 없다.

도 1은 테노데라신-1 펩타이드의 Escherichia coli 및 Staphylococcus aureus에 대한 항균활성, Candida albicans에 대한 항진균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 마우스의 대식세포인 Raw264.7 세포에 대한 테노데라신-1 펩타이드의 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 테노데라신-1 펩타이드의 NO (nitric oxide) 분비 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 테노데라신-1 펩타이드의 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 테노데라신-1 펩타이드의 IL-6, IL-1β의 단백질 발현 억제활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 테노데라신-1 펩타이드의 iNOS, COX-2의 mRNA 발현 억제 활성을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1. 왕사마귀 유래 펩타이드 유전자 선발>

왕사마귀의 면역화는 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans를 각각 TSB (Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 진탕배양기에서 18시간 동안 1차 배양 후, 동일한 조건하에서 다시 2시간 30분 동안 2차 배양한 다음, 세포수가 5 × 10⁵ 콜로니 형성 단위(CFU: colony forming unit)가 되도록 취하여 미세주사기를 이용하여 체강에 주사하고 면역화를 유도하기 위해 25℃에서 18시간 동안 사육하였다.

생리활성 물질의 발현을 극대화하기 위해 정상의 왕사마귀와 면역화 시킨 왕사마귀의 total RNA를 이용하여 RNA-seq을 진행하였다. 우선 정상의 왕사마귀와 면역화시킨 왕사마귀를 준비한 후 조직을 최대한 신선하게 유지하기 위해서 이를 액체 질소로 급속 냉동시키고 막자사발에 갈아서 시료를 준비한 후 시료 100 mg과 TRIZOL 1 ml과 혼합하고 5분간 상온에서 반응시킨다. 이 후 200 ㎕ chloroform을 첨가하여 섞어준 후 3분간 상온에서 반응시킨다. 다음으로 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리 한 뒤 상층액을 취해 500 ㎕ isopropanol을 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 4℃에서 12,000×g로 10분간 원심분리하였다. 침전된 total RNA는 1 ml의 75％(v/v) 에탄올 수용액으로 세척하고 4℃에서 7,500×g로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 에탄올을 제거하고 건조시킨 다음 이를 멸균수에 녹여 RNA를 준비하였다. 준비된 total RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer 기기를 이용하여 RNA의 순도와 quality를 확인하였다.

이렇게 얻은 RNA를 이용하여 Illumina HiSeq™ 2000 기기로 RNA-seq 분석법을 이용하여 왕사마귀 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인하였으며 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 기존의 생리활성 펩타이드 성질을 참고하여 유니진 전체를 filtration 하였으며 그 결과 새로운 생리활성 펩타이드로 추정되는 유전자를 선발하였다. 선별된 아미노산 서열은 YFPEKGKSGFIIWRYVLRR-NH₂으로 19개 아미노산으로 구성되었으며 테노데라신-1(Tenoderasin-1)으로 명명하였다(표 1).

펩타이드	아미노산 서열
Tenoderasin-1	YFPEKGKSGFIIWRYVLRR-NH₂

<실시예 2. 테노데라신-1 합성 및 분리 정제>

상기 실시예 1에서 확인된 왕사마귀로부터 유래한 테노데라신-1 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다.

먼저, 테노데라신-1 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)을 사용하여 펩타이드를 제조하였다.

상기 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-아미노 그룹(amino group)의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.

Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 DCC (N-hydroxybenzo-triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide)법에 의하였다.

각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다.

여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC (reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μm, 19.0 mm x 30mm , Waters)을 이용하여 정제하였다.

합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110℃ 에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다.

그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실시예 3. 테노데라신-1의 항균 및 항진균 활성 검정>

테노데라신-1에 대한 항균 활성 검정은 RDA (radial diffusion assay) 실험 방법을 이용하여 확인하였다. RDA법은 Citrate phosphate buffer(9 mM sodium phosphate, 1 mM sodium citrate, pH7.4)와 1%(w/v) type Ⅰ(low electroendosmosis) agarose, 0.03% TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에 배양된 세균 (4 × 10⁶colony forming units)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 붓고, underlay gel이 굳으면 지름 3mm의 구멍을 내어 펩타이드를 농도별로 5 ㎕씩 구멍에 loading 한다. 펩타이드가 균일하게 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, overlay agar(6% TSB, 1% agarose) 10 ㎖을 붓고 37℃에서 다시 배양하여 clear zone을 확인하고 직경을 측정하였다. 균주 사용은 그람 음성균 Escherichia coli, 그람 양성균 Staphylococcus aureus, 진균은 Candida albicans를 대표로 사용하였다.

이에 대한 결과는 도 1에 나타내었는데, 도 1의 unit 단위는 항균환의 지름 1 mm를 10 unit으로 환산하여 나타낸 값을 가리킨다.

도 1을 참고하면, 본 발명의 펩타이드인 테노데라신-1은 실험한 모든 세균 또는 진균에 대해 농도의존적인 항균/항진균 효과가 있었으며 특히 그람 음성균과 그람 양성균에서 효과가 탁월한 것으로 나타난다.

<실시예 4. 테노데라신-1의 세포 생존률 확인>

마우스의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 MTS assay 법으로 세포독성을 확인하였다. 이를 위해 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 항생제(100 units/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin)와 10％ fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 Raw264.7 세포를 배양하고 실험에 사용하였다.

MTS assay를 위해서는 96-well 배양용기에 2 × 10⁴cells/well 세포를 200 ㎕ 씩 분주한 후 테노데라신-1을 농도 의존적으로 24시간 동안 처리하였다. 이후 MTS 시약 10 ㎕ CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent (Promega, USA)를 첨가하고 3 ~ 4 시간 반응시켜 색의 변화를 확인하였고 이를 multi detecter (Beckman DTX8800, USA)를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.

이에 대한 결과는 도 2에 나타내었는데, 도 2를 참고하면 테노데라신-1은 측정된 최대 농도인 200 ㎍/㎖까지 Raw264.7 세포에 대한 독성이 없는 것으로 확인된다.

<실시예 5. 테노데라신-1의 항염증 활성 검정>

실시예 5-1. NO (nitric oxide) 분비량 확인

테노데라신-1의 항염증 활성을 측정하기 위해 Raw264.7 세포에서 NO의 분비량을 확인하였다. Raw264.7 세포는 염증 유발 시 NO를 생산하고 이를 세포 외로 분비하는 것으로 알려져 있다.

NO의 분비량 확인을 위해 Raw 264.7 세포를 6-well에 각 1 × 10⁶cells/㎖ 세포수를 준비한 후 펩타이드를 농도별로 1시간 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 1 ㎍ 처리하고 24시간 배양 하였다. 배양된 세포의 상등액 100 ㎕를 실험에 사용하였으며 NO detection kit (intron, Korea)를 이용하여 LPS에 의해 분비되는 NO의 양이 펩타이드에 의해 얼마나 감소되는지를 multi detecter (Beckman DTX8800, USA)를 이용하여 550nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.

이에 대한 결과는 도 3에 나타내었는데, 도 3을 참고하면, 테노데라신-1 50㎍/㎖ 농도 이상 처리할 경우 농도의존적으로 NO의 분비량이 감소하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 5-2. IL-6, IL-1β의 mRNA 발현 확인

세포에서 염증이 유발되면 염증유발인자인 사이토카인(cytokine)의 발현량이 증가된다. 이에 사이토카인 중에 대표적인 물질인 IL-6, IL-1β의 발현량을 qRT-PCR (Quantitative RT-PCR) 방법을 이용하여 조사하였다.

Raw264.7 세포를 6-well에 각 1 × 10⁶cells/㎖ 세포수로 준비한 후 펩타이드를 농도별로 1시간 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 1 ㎍ 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 세포를 수거하였다. 수거한 세포에 1 ㎖의 TRIZOL 용액을 혼합하고 5분간 상온에서 반응시켰다. 200 ㎕ chloroform을 첨가하여 섞어준 후 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리 한 뒤 상층액을 취해 500 ㎕ isopropanol을 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 4℃에서 12,000×g로 10분간 원심분리하였다. 침전된 RNA는 1 ml 75％ ethanol로 세척하고 4℃에서 7,500×g로 5분간 원심분리였다. 원심분리 후 에탄올을 제거하고 건조시킨 다음 이를 멸균수에 녹여 RNA를 준비하였다. 그 후 1 ㎍의 total RNA를 이용하여 cDNA synthesis Kit로 cDNA를 준비하고 qRT-PCR 실험을 진행하였으며 사용된 primer는 다음의 표 2와 같다.

Name	Sequence
IL-6	Forward 5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’
IL-6	Reverse 5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’
IL-1β	Forward 5’-CCTTCCAGGATGAGGACATGA-3’
IL-1β	Reverse 5’-TGAGTCACAGAGGATGGGCTC-3’
GAPDH	Forward 5’-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3’
GAPDH	Reverse 5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’

mRNA 발현 확인 결과는 도 4에 나타내었는데, 도 4를 참고하면 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현량이 테노데라신-1의 처리로 인해 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 테노데라신-1이 염증 질환에 탁월한 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드임을 제시한다.

실시예 5-3. 사이토카인 IL-6, IL-1β의 단백질 발현 확인

다음으로는 IL-6, IL-1β의 단백질 발현량을 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 실험 방법을 이용하여 조사하였다.

Raw264.7 세포를 6-well에 각 1 × 10⁶cells/㎖ 세포수로 준비한 후 펩타이드를 농도별로 1시간 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 1 ㎍ 처리하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 수거하여 IL-6, IL-1β의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 multi detecter (Beckman DTX8800)로 흡광도를 측정하고 정량하였다.

이에 대한 결과는 도 5에 나타내었는데, 도 5를 참고하면, 테노데라신-1 처리로 인해 IL-6, IL-1β 펩타이드의 발현량이 줄어들었음을 확인할 수 있다.

실시예 5-4. iNOS와 COX-2의 mRNA 발현량 확인

다음으로는 염증매개인자인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현량을 하기의 표 3의 프라이머를 이용하여 실시예 5-2 방법으로 확인하였다.

Name	Sequence
i-NOS	Forward 5’-CAGCACAGGAAATGTTTCAGC-3’
i-NOS	Reverse 5’-TAGCCAGCGTACCGGATGA-3’
COX-2	Forward 5’-CAGACAACATAAACTGCGCCTT-3’
COX-2	Reverse 5’-GATACACCTCTCCACCAATGACC-3’
GAPDH	Forward 5’-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3’
GAPDH	Reverse 5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’

이에 대한 결과는 도 6에 나타내었는데 염증매개인자인 COX-2 와 iNOS의 mRNA 발현이 테노데라신-1에 대해 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Tenoderasin-1 peptide isolated from Tenodera sinensis or antimicrobial, antimycotic and antiinflammatory composition comprising it <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Tenodera sinensis <400> 1 Tyr Phe Pro Glu Lys Gly Lys Ser Gly Phe Ile Ile Trp Arg Tyr Val 1 5 10 15 Leu Arg Arg

Claims

왕사마귀(Tenodera sinensis)로부터 분리한 항균, 항진균 또는 항염증성 펩타이드의 유전자에서 합성된 하기 서열번호 1로 표현되는 펩타이드.
서열번호 1: YFPEKGKSGFIIWRYVLRR-NH₂
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상에 대하여 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 NO 분비를 억제하거나 IL-6, IL-1β, iNOS 또는 COX-2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균, 항진균 또는 항염증용 조성물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항생제.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 방부제.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 보존제.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품 보존제.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.