KR20200060801A

KR20200060801A - 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200060801A
Application number: KR1020180145825A
Authority: KR
Inventors: 김한우; 박애경; 이준혁; 신승철; 김현
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2020-06-02
Also published as: KR102132276B1

Abstract

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 유전자 및 이에 의하여 코딩되는 돌연변이 디하이드린 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.

Description

북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질 및 이의 용도{Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof}

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 유전자 및 이에 의하여 코딩되는 돌연변이 디하이드린 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

식물은 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스에 항상 노출되는데, 특히 토양의 수분 부족, 높은 염분 농도, 냉해, 중금속, 열충격 및 오존과 같은 비생물적 스트레스(abiotic stress)는 육상식물의 생장과 발달을 저해하며 품질을 감소시키는 주요 요인이 된다고 알려져 있다. 지금까지 이러한 비생물적 스트레스에 대한 기능연구가 이뤄져 왔지만, 냉해(저온) 스트레스를 비롯한 비생물학적 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스 관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태이다. 이에, 식물의 저항성을 증가시키고 작물의 수확량을 증진시키기 위한 연구가 중요한 과제가 되고 있다.

한편, 식물은 비생물적 스트레스에 직면했을 때 특이적이고 독특한 스트레스 반응을 활성화시킨다. 예를 들어, 저온 환경에서 수분이 충분하지 않을 때 식물은 LEA(Late embryogenesis Abundant) 단백질을 만드는 유전자를 활성화시켜 자신을 방어한다. 상기 LEA 유전자는 비생물적 스트레스에 의해 유의하게 유도되며, 과발현시 형질전환 식물의 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. LEA 단백질들의 공통적인 특징은 높은 글리신(glycine) 함량 및 높은 친수성에 따라 본질적으로 내재적 비정형(intrinsically disordered) 단백질 구조를 갖는 것이며, 서열 유사성에 따라 LEAⅠ, LEAⅡ 및 LEAⅢ의 세 가지 그룹으로 분류된다. 또한, 디하이드린 단백질 DHN(dehydrins)은 다양한 식물, 조류 및 시아노박테리아에 존재하는 9~200kDa의 친수성, 열안정성 단백질로, 글리신 잔기가 매우 풍부하고 시스테인(cysteine)과 트립토판(tryptophan)은 결핍되어 있거나 또는 극소량 존재한다. 디하이드린 단백질의 구조적 특징은 K-, S- 및 Y- 세그먼트로 명명된 고도로 보존된 서열 모티프의 존재이다. 상기 고도로 보존된 도메인 외에도 디하이드린 단백질은 Y-, S- 및 K- 세그먼트 사이에 위치한 φ- 세그먼트를 가지며, φ- 세그먼트의 서열 및 길이는 다른 세그먼트들과 비교하여 매우 불규칙하다는 특징이 있다.

식물 중에서도, 극지 식물은 혹독한 환경 조건에도 적응할 수 있게 해주는 독특한 생리학적 메커니즘을 가지고 있다. 북극점나도나물(Cerastium arcticum , Arctic mouse-ear chickweed 또는 Arctic mouse-ear)은 북극 지방의 툰드라에서 번성하는 식물이다. 북극점나도나물 유래 스트레스 반응성 디하이드린 유전자(dehydrin gene)인 CaDHN(Arctic Cerastium arcticum Lange)은 SK₅ 타입(type)에 속하는 디하이드린 유전자로, 대부분의 디하이드린 단백질에 시스테인 잔기가 없는 것과 달리 특이하게도 시스테인 잔기를 단일 잔기로 포함한다.

Graether SP, Boddington KF. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family. Front Plant Sci. 2014;5. Cuevas-Velazquez CL, Rendon-Luna DF, Covarrubias AA. Dissecting the cryoprotection mechanisms for dehydrins. Front Plant Sci. 2014;5. Kovacs D, Kalmar E, Torok Z, Tompa P. Chaperone activity of ERD10 and ERD14, two disordered stress-related plant proteins. Plant Physiol. 2008;147(1):381-90.

본 발명자들은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 재조합 CaDHN이 단량체(monomer) 및 이량체(dimer)의 두 가지 형태로 공존함을 확인하고, 상기 이합체화(dimerization)에 주목하여 저온 스트레스 등의 비생물적 스트레스에 대한 내성에 관여하는 메커니즘을 규명하고자 노력하였다. 그 결과, CaDHN의 이합체화(dimerization)는 시스테인 분자 간의 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)의 결과임을 확인하고, CaDHN의 단일 시스테인 잔기가 CaDHN의 이합체화를 조절하며 비생물적 스트레스에 대한 내성 강화의 타겟이 될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물, 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 CaDHN의 보존된 부위를 모식화한 것으로, CaDHN의 독특한 단일 시스테인 잔기를 Cys143으로 표시하였다. K: K- 세그먼트(segment), S: S- 세그먼트, Φ: Φ- 세그먼트이다.
도 2는 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다. WT: 야생형 CaDHN, M: 돌연변이 C143A 단백질, β-ME: 10mM β-mercaptoethanol 처리, BC: TEV 단백질 분해효소(protease)에 의한 N-말단 태그의 절단 전, AC: N-말단 태그 절단 후.
도 3은 정제된 CaDHN의 이황화결합을 통한 이합체화(dimerization) 여부를 확인하기 위한 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A 단백질의 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 A는 야생형 CaDHN 및 C143A을 다양한 농도의 DTT 및 CuSO₄로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 B는 야생형 CaDHN을 DTT(0-20mM)로 처리한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 GFP(green fluorescent protein) 단백질 리폴딩(refolding)에 대한 CaDHN의 샤페론(chaperone) 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 산-변성된 GFP는 야생형 CaDHN(주황색) 또는 돌연변이 C143A(파란색)를 포함하는 재생 버퍼에서 리폴딩되었다. 10mM DTT로 처리된 야생형 CaDHN(녹색) 역시 샤페론 활성 분석에 사용되었다. GFP 단백질의 자발적인 리폴딩(검정색)을 대조군으로 사용하였다.
도 5는 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)(도 5의 A) 및 SDS-PAGE(도 5의 B)를 수행하여 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A의 금속결합능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 산화 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 7 및 도 8은 저온 및 고온 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 9는 형질전환 효모 세포의 금속 이온 항상성 실험 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

디하이드린(dehydrin, DHN)이란 저온 또는 가뭄 스트레스 조건 하의 식물에서 발현하는 단백질 군으로, 친수성을 띄며, 내열 활성을 갖는다.

본 발명의 돌연변이 디하이드린 펩타이드는 한국 다산 북극 기지(Dasan Korean Arctic Research Station)로부터 수득한 북극점나도나물(세라스티움 아크티큠; Cerastium arcticum L.; Caryophyllaceae)로부터 유래한 디하이드린 펩타이드에 돌연변이를 유발시킨 것으로, 야생형 디하이드린 펩타이드 CaDHN의 143번째 아미노산인 시스테인(cysteine)이 알라닌(alanine)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 야생형 디하이드린 펩타이드는 돌연변이를 유발시키지 않은 상기 북극점나도나물 유래 펩타이드로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 돌연변이 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 야생형 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 사용한 야생형 디하이드린 펩타이드, 돌연변이 디하이드린 펩타이드의 아미노산 서열 및 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

	서열	서열번호
돌연변이 디하이드린 펩타이드 ( C143A , M)	MSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH A HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGY	1
돌연변이 디하이드린유전자	ATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC GCC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAA	2
야생형 디하이드린 펩타이드 ( CaDHN , WT)	MSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH C HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGY	3
야생형 디하이드린 유전자	ATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC TGC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAA	4

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열인 것을 의미한다. 한편, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(gap)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서, 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지(bacteriophage) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들어, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 및 p426GPD 등), 파아지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들어, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

상기 재조합 벡터에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서, 용어 "작동적으로 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵 세포를 숙주로 하는 경우, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 가진다.

상기 숙주 세포는 동물세포, 식물세포, 진균, 세균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 재조합 벡터로 효모를 형질전환시켜 비생물적 스트레스 내성이 증진됨을 확인하였다.

폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, 칼슘 클로라이드(CaCl₂) 방법 또는 전기천공법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나, 당화(glycosylation) 문제로 인해 온전한(intact) Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않고, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아 (starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 디하이드린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 효모의 경우, H₂O₂ 및 저온 스트레스 존재 하에서 야생형 CaDHN이 발현된 효모에 비해 비생물적 스트레스에 대한 증진된 내성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공한다. 상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아 (starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스일 수 있다. 상기 도입은 상기 디하이드린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 전달할 수 있는 방법이면 그 방법을 제한하지 않으며, 그 예는 상기한 바와 같다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 고온 스트레스 내성은 분자 샤페론(chaperone) 활성에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 야생형 CaDHN은 단백질 접힘(folding) 과정에 관한 샤페론 활성을 나타내고, 상기 샤페론 활성에는 야생형 CaDHN의 독특한 단일 시스테인 잔기에 의한 분자간 이황화결합을 통한 이합체화가 결정적인 역할을 수행함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 “단백질 항상성(proteostasis)”이란 정상 단백질의 부족을 초래하거나, 비정상적 단백질을 축적시킴으로써 독성을 증가시키는 단백질의 오폴딩(misfolding) 등을 억제하여 외적 및 내적 환경의 변화에도 불구하고 생리적 상태를 일정하게 유지하는 조절능을 의미한다.

상기 조성물은 오폴딩된 단백질(misfolded proteins)의 축적 또는 단백질 항상성 장애와 관계된 질병에 사용할 수 있는 등 전반적인 단백질 품질제어(protein quality control) 조절에 활용할 수 있다. 용어 “단백질 품질제어(Protein Quality Control)”란 생물체가 외부 스트레스로 인해서 변성된 단백질을 제거하거나 원상태로 돌리는 메커니즘을 의미한다. 상기 단백질 항상성은 분자 샤페론(chaperone) 활성에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 산-변성된 GFP를 사용한 실험 결과, 야생형 CaDHN은 열 변성에 대한 보호 효과를 가질 뿐만 아니라 변성된 단백질의 리폴딩을 가능하게 함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 CaDHN에 존재하는 독특한 단일 시스테인 잔기가 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 극지방의 극한 환경에 적응하기 위한 방어 시스템을 구축하고, 이를 통해 비생물적 스트레스에 대한 내성을 강화시킴을 확인한 것에 가장 큰 특징이 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 모든 실험은 최소 3회 독립적으로 수행하였으며, 결과는 평균 및 표준편차로 나타내었다. 스포팅(spotting) 분석은 동일한 조건하에서 독립적으로 최소 2회 실시하였다.

실시예 1. CaDHN 유전자의 클로닝 및 분석

한국 다산 북극 기지(Dasan Korean Arctic Research Station)의 스발바르 제도의 Brogger-Halvoya(N75 55″, E11 54″)로부터 C. arcticum L.(Caryophyllaceae)를 수득하였다. 총 RNA는 RNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 C. arcticum의 잎으로부터 분리하였다. cDNA 프로브는 RT-PCR(reverse transcription- PCR) 프리믹스 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 합성하였다. CaDHN 코딩부위는 PCR로 cDNA로부터 증폭하였고, PCR 산물은 정제 후 pET-30a(+)(Novagen, USA) 벡터 EcoRI 및 XhoI 제한효소 부위에 삽입하였다. TEV 단백질 분해효소 인식 서열(TEV protease recognition sequence)은 CaDHN 유전자 앞에 삽입하였다. 본 발명에서 사용한 모든 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다(F: 정방향, R: 역방향).

프라이머	서열	제한효소 부위	서열번호
pET30a/WT(F)	CTGATATCGGATCC GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAAC	EcoRI	5
pET30a/WT(R)	TGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTT	XhoI	6
pGPD426/WT(F)	CCCCCGGGCTGCAG GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAAC	EcoRI	7
pGPD426/WT(R)	AACTAATTACATGA CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTT	XhoI	8
C143A(F)	CCTACCGGTGACCACGCCCACCAGGAGCAG	-	9
C143A(R)	CTGCTCCTGGTGGGCGTGGTCACCGGTAGG	-	10

한편, cDNA에 대하여 시퀀싱 반응을 통한 염기서열 확인 결과, 다른 디하이드린 단백질들과 달리, 북극점나도나물(세라스티움 아크티큠; Cerastium arcticum L.; Caryophyllaceae)로부터 유래 디하이드린 단백질을 코딩하는 유전자인 CaDHN은 특이하게 단일 시스테인 잔기(Cys143)를 가지는 것을 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 시스테인 잔기는 두번째와 세번째 K-세그먼트 사이의 φ-세그먼트에 위치하고, 구체적으로는 143번째 잔기임을 확인하였다.

실시예 2. CaDHN 단백질의 발현 및 정제

CaDHN 단백질의 발현 및 정제를 위하여, 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 세포 펠릿을 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl 및 10 mM imidazole에 부유시키고 초음파 처리(sonication)하여 파쇄하였다. 세포 잔해물 제거를 위해 상기 파쇄액을 원심분리 후, 상등액을 회수하여 Ni-NTA 친화 레진(Qiagen, Hilden, Germany)을 포함하는 컬럼에 중력을 이용하여 로딩시켰으며, 상기 컬럼은 리소자임이 없는 용해 버퍼로 선균질화(preequilibrate) 시켰다. 그 다음 컬럼을 세척 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 30 mM imidazole)로 세척하고, Ni-NTA 레진에 결합된 CaDHN 단백질을 용출 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 300 mM imidazole)를 이용하여 용출시켰다. 그 다음, TEV 단백질 분해효소를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 여과 버퍼(dialysis buffer)를 사용하여 용출된 CaDHN 단백질을 여과하였다. 절단되지 않은 CaDHN 및 N-말단 펩타이드 태그(tag)를 제거하기 위하여 니켈 어피니티 레진 크로마토그래피(Nickel-charged affinity chromatograpy)를 다시 한 번 수행하였다. CaDHN 단백질의 분자량은 29,509 Da(약 29.5 kDa)로 예측되었다.

한편, PCR을 이용하여 CaDHN의 단일 시스테인(Cys143)에 위치 선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발시켜 시스테인이 알라닌(alanine)으로 치환된 C143A의 돌연변이 유전자를 얻었다. 그 후, 전술한 것과 동일한 방법으로 재조합 플라스미드를 제조하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. E. coli BL21(DE3) 세포에 발현된 돌연변이 단백질에 대하여, 전술한 야생형(wild-type, WT) 단백질에서와 같이 단백질 정제를 수행하였다.

실시예 3. SDS-PAGE

3-1. 야생형 CaDHN(WT) 및 돌연변이 C143A(M)의 이량체 형성 여부 확인

실시예 2에서 정제한 야생형 CaDHN(WT)에 대하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 구체적으로, 단백질 정제 후 TEV 단백질 분해효소를 사용하여 재조합 CaDHN의 N-말단 태그를 제거하고, 야생형 CaDHN(WT) native gel 전기영동을 수행하였다. 전기영동은 10% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤, 전기영동 버퍼(25mM Tris base, 19mM 글리신)를 사용하여 수행하였고, 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이(WT lane), SDS-PAGE 결과 두 종류의 단백질 밴드를 확인할 수 있었는데(-β-ME), 위쪽 밴드는 80kDa 정도로 환원제인 β-ME(β-mercaptoethanol) 처리 후 사라졌고, 반면 40kDa에 해당하는 아래쪽 밴드는 β-ME 처리 전후로 이동하지 않음을 확인하였다(+β-ME). 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 CaDHN의 시스테인 잔기가 용액 내의 단백질들 사이에서 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)를 형성했을 것으로 추측하였다.

상기 추측을 구체적으로 확인하기 위해, 실시예 2에서 정제한 시스테인 대신에 알라닌 잔기가 도입된 돌연변이(mutant) C143A(M)에 대하여 SDS-PAGE를 수행하고, 마찬가지로 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이(M lane), 돌연변이 C143A는 비환원성 SDS-PAGE 젤에서 단일 단백질 밴드만이 나타났고, 80kDa의 단백질 밴드는 발견되지 않음을 확인하였다(-β-ME). 상기 결과를 통해, 아생형 CaDHN은 단 하나의 시스테인 잔기만을 가짐에 따라 단량체(monomer), 두 단량체사이에서 이황화결합을 갖는 이량체(dimer)의 두가지 형태로 공존함을 확인하였다.

3-2. 야생형 CaDHN (WT) 및 C143A(M)의 이량체 형성에 대한 금속 이온의 영향 확인

Citrus 디하이드린 단백질의 경우 히스티딘(histidine) 잔기와 금속 이온의 상호작용이 보고되어 있고(Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56(420):2695-703), Opuntia streptacantha Lem 유래 OpsDHN1(SK₃ 타입) 디하이드린 단백질의 경우 이합체화가 보고되어 있다. 이 중 OpsDHN1의 경우, 첫번째와 두번째 K-세그먼트 사이에 있는 비보존된 세그먼트에 위치한 히스티딘-풍부 모티프(histidine-rich motif)가 이량체 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Hernandez-Sanchez IE et al, Front Plant Sci. 2014, 5:520; Rahman LN et al, Biochim Biophys Acta. 2013, 1828(3):967-80). 이에, 야생형 CaDHN(WT) 및 C143A(M)의 이합체 형성에 대하여 금속 이온이 미치는 영향을 조사하기 위해 실시예 3-1과 동일한 방법으로 SDS-PAGE를 수행하였으며, 분자간 이황화결합의 존재를 확인하기 위해, 두 단백질 모두에 서로 다른 농도의 DTT(dithiothreitol) 및 구리 이온(CuSO₄)을 첨가하였다(DTT는 시스테인 잔기 사이의 이황화결합 형성을 방지하는 환원제로, 산화 구리 이온은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화결합을 형성시키는 용도로 사용하였다). 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 CaDHN(WT)과 C143A(M)는 서로 다른 크기의 단백질 밴드로 나타남을 확인하였다. 구체적으로, WT의 경우 DTT 농도가 증가함에 따라 위쪽 밴드가 농도의존적으로 감소하였고, 8mM 이상에서는 단백질 대부분이 아래쪽 밴드로 이동하였음을 확인하였다(도 3의 B). 반면, 구리 이온의 농도가 증가하는 경우 아래쪽 밴드 일부가 위쪽 밴드로 이동하였고, 이를 통해 구리 이온은 야생형 CaDHN의 이황화결합 형성을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 3의 A, 좌측 패널).

반면, 시스테인 잔기가 없는 C143A의 경우, 구리 이온의 존재에도 불구하고 아래쪽 밴드는 이동하지 않았으며, 이를 통해 CaDHN은 이황화결합에 따라 이량체를 형성하는 것이지, 히스티딘과 같은 아미노산 잔기를 통해 단백질 분자 간에 구리 이온에 의해 매개되는 이량체 형성을 하는 것이 아님을 확인하였다(도 3의 A, 우측 패널). 또한, C143A는 DTT에 의한 밴드 이동도 전혀 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 야생형 CaDHN는 독특한 단일 시스테인 잔기가 매개하는 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)에 의한 이량체 형태로 존재함을 확인하였다.

실시예 4. CaDHN의 샤페론 활성 분석

CaDHN의 이합체화(dimerization)가 CaDHN의 샤페론 활성(chaperone activity)에 미치는 영향을 조사하기 위해, 산-변성(acid-denatured)된 GFP를 모델 기질로 사용하여 야생형 CaDHN(WT)과 C143A의 샤페론 활성을 측정하였다. 구체적으로, 약 100μM의 GFP(green fluorescent protein)를 120mM HCl에서 60분 동안 변성시켰다. 재생 버퍼(20mM Tris-Hcl, pH 8.0, 200mM NaCl)로의 100배 희석에 의해 자발적 리폴딩(refolding)이 개시되었다. 그 후, 3μM의 야생형 CaDHN(WT) 또는 C143A 단백질을 재생 버퍼 내 변성된 GFP에 첨가하여 GFP 리폴딩이 시작되었다. GFP 리폴딩은 20분 동안 모니터링하였다(400nm excitation, 510nm emissioin). 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 재생 버퍼(renaturing buffer) 내 야생형 CaDHN(WT) 존재시 산-변성된 GFP의 리폴딩(refolding)이 40% 정도 증가됨을 확인하였다. 반면, C143A 존재시 산-변성된 GFP의 리폴딩 활성에는 아무런 변화가 없었고, 나아가 CaDHN(WT) 및 DTT를 동시에 포함하는 재생 버퍼를 처리한 경우에도 CaDHN의 리폴딩 활성에는 아무런 변화가 없음을 확인하였다. 한편, CuSO₄를 포함하는 재생 버퍼의 경우 GFP의 감소된 형광 때문에 CaDHN의 샤페론 활성 측정이 불가능하였다. 상기 결과를 통해, 야생형 CaDHN의 이량체(dimer) 형태만이 변성된 단백질을 리폴딩하는 샤페론 활성을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 야생형 CaDHN이 열 변성에 대한 보호 효과를 가질 뿐만 아니라 변성된 단백질의 리폴딩을 가능하게 함을 확인하였다. 즉, 야생형 CaDHN은 단백질 접힘(folding) 과정에 관한 진정한 샤페론 활성을 나타내고, CaDHN의 샤페론 활성에는 분자간 이황화결합을 통한 이합체화가 결정적인 역할을 수행함을 확인하였다.

실시예 5. CaDHN의 금속 이온 결합능 분석

일부 디하이드린 단백질은 금속 촉매 반응에 의해 야기되는 세포 독성 하이드록실 라디칼(cytotoxic hydroxyl radical)에 대한 소거 활성을 갖는 금속 이온 결합능을 나타낸다고 알려져 있다(Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56(420):2695-703). 이에, CaDHN(WT) 및 돌연변이 C143A의 금속 결합능 및 이에 따른 ROS 소거 활성을 조사하기 위해, 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)를 수행하였다. 컬럼에 100mM의 각 금속 이온(Fe³ ⁺, Co² ⁺, Ni² ⁺, Cu²⁺, Zn² ⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺ 및 Mn² ⁺)을 충전시킨 후 약 200μg의 CaDHN(WT) 또는 돌연변이 C143A를 평형 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 8.0 및 200mM NaCl; equilibration buffer, EQ)로 평형시킨 컬럼에 로딩하여 금속 결합 활성(metal-binding activity, MBA)을 분석하였다. 평형 버퍼로 컬럼을 충분히 세척하여 결합되지 않은 단백질들을 제거한 후, 결합된 단백질을 100mM EDTA로 용출시켰다. 용출된 단백질을 수집하고, SDS-PAGE를 수행한 뒤 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 A에 나타낸 바와 같이, CaDHN 및 C143A 모두 Fe³ ⁺, Co² ⁺, Ni² ⁺, Cu² ⁺및 Zn²⁺ 이온에 완전히 결합되었지만, Mg² ⁺, Ca² ⁺ 및 Mn² ⁺에는 결합하지 않음을 확인하였다. 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, Cu² ⁺ 이온을 제외한 7개 금속 이온 모두에서 밴드의 크기 변화가 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, CaDHN은 Cu² ⁺에 대한 결합 활성을 가지고 있지만, 이와 같은 Cu² ⁺에 대한 결합능은 CaDHN의 이합체화와 관련이 없음을 확인하였다.

실시예 6. CaDHN 유전자 발현 형질전환 효모의 제작

PCR을 이용하여 증폭한 CaDHN 유전자를 GPD1(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 글리세알데하이드-3-인산 탈수소효소) 프로모터(Euroscarf, Germany) 및 CYC(cytochrome-c-oxidase) 종결자(terminator)가 포함되어 있는 p426GPD 벡터에 연결시켜 효모 발현 벡터를 제작하였다. 클로닝된 플라스미드는 E.coli DH5α를 이용하여 플라스미드 DNA를 증폭한 다음, CYC 종결자(terminator) 프라이머를 이용하여 시퀀싱하였다. 결과 플라스미드를 p426GPD::CaDHN_WT로 명명하였다.

그 다음, p426GPD::CaDHN_WT 및 PCR-의존적 선택적 돌연변이 키트(PCR-dependent Site-Directed Mutagenesis kit; New England Biolabs)를 이용하여 CaDHN_C143A의 돌연변이를 유도하고, 상기 C143A 돌연변이 유전자를 벡터 내에 삽입함으로써 효모 발현 벡터 p426GPD::CaDHN_C143A를 제작하였다. 각각의 플라스미드 DNA를 플라스미드 분리 키트 (Nucleogen, Siheung, Korea)를 이용하여 분리하고, 상기 플라스미드를 S. cerevisiae BY4741 균주(Euroscarf)에 형질전환시켰다. 한편, 본 발명에 사용된 균주의 정보를 하기 표 3에 나타내었다.

Strain	Genotype	Source	Genbank accession number
E. coli BL21	fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [ dcm ] ΔhsdS λ DE3 = λ sBamHIo ΔEcoRI -B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1 ) i21 Δnin5	NEB	CP001509.3
S. cerevisiae BY4741	MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0	Euroscarf	JRIS00000000

구체적으로, S. cerevisiae BY4741 세포들을 28℃에서 하룻밤 동안 YPD 브로스(1 % yeast extract, 2 % peptone 및 2 % dextrose)에서 배양 후, 신선한 YPD 브로스에 접종하고, 600nm (A₆₀₀)에서의 배양물의 광밀도가 약 1.0(1 × 10⁷ cells mL^-1)에 도달할 때까지, 교반(180 rpm)과 함께, 4시간 동안 28 ℃에서 인큐베이션 시켰다. 그 뒤, 상기 세포를 PEG/LiCl 방법에 따라 타겟 플라스미드인 p426GPD::CaDHN_WT 및 p426GPD::CaDHN_C143A 플라스미드로 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 아미노산이 없으며, 황산암모늄을 포함하는 0.67% 효모 니트로겐 베이스(Yeast Nitrogen Base), 우라실이 없는 0.192% 효모 합성 드롭아웃 배지 보충물(yeast synthetic dropout medium supplement; Sigma, St. Louis, USA), 2% 글루코스 및 2% 아가를 포함하는 효모 합성 드롭아웃 아가 배지(yeast synthetic dropout agar medium)에 위치시켰다. 샘플을 28℃에서 3일간 인큐베이션 하였다. 양성 콜로니는 우라실이 없는 배지에서 성장하였고, 이어지는 실험에 사용하였다.

실시예 7. 산화 및 저온 스트레스 내성 실험

돌연변이 CaDHN 단백질 즉, C143A의 발현이 산화 및 저온 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 향상시키는지 여부를 확인하기 위하여, 중간-로그기(A₆₀₀=2.5) 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10^-9배 단계희석하였다. 그 후, 과산화수소를 포함하는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 40℃(Heat shock)에서 6일간 인큐베이션, 15℃(Chilling)에서 10일간 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 형질전환 효모 세포가 장시간 및 단시간 동안 과산화수소(H₂O₂)에 노출된 경우, 두 가지 형질전환 효모 세포(WT, C143A) 모두 빈 벡터만 있는 세포(EV)보다 내성이 있었고, 특히 C143A의 경우 WT에 비해 산화 스트레스에 대한 내성이 현저히 향상됨을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 고온 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT)가 C143A보다 높고, 저온 스트레스에 대한 내성은 C143A가 CaDHN(WT)보다 높음을 확인하였다.

한편, 다양한 냉각 조건 하에서의 저온 스트레스 내성을 실험하기 위하여 중간-로그기(A₆₀₀=2.5) 형질전환 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10^-9배 단계희석한 후, 과산화수소를 포함하는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 다음과 같은 조건으로 처리하였다: ⅰ) 15℃(Chilling)에서 11일간 인큐베이션, ⅱ) 15℃(Chilling)에서 10일간 인큐베이션, ⅲ) 4℃에서 7일간 인큐베이션 후 28℃에서 3일간 인큐베이션. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 다양한 냉각 조건 하에서 실험한 결과, 모든 처리조건에서 C143A의 저온 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT)보다 현저히 향상됨을 확인하였다.

실시예 8. 금속 이온 항상성 실험

중간-로그기(A₆₀₀=2.5)까지 YPD 브로스에서 성장한 형질전환 효모 세포를 1시간 동안 교반(180 rpm)과 함께, 20 및 25mM 과산화수소(H₂O₂), 100mM 염화 아연(ZnCl₂), 20mM 황산 구리(CuSO₄), 80mM 염화 코발트(CoCl₂), 80mM 황산 니켈(CoSO₄), 80mM 염화 철(FeCl₂), 80mM 염화 망간(manganese chloride), 250mM 염화 칼슘(CaCl₂) 및 250 mM 염화 마그네슘(MgCl₂)에 노출시켰다. 그 뒤 신선한 YPD 브로스로 10^-4배 단계희석하였다. 그 다음, 희석된 용액 5㎕를 YPD 아가(2% 아가+YPD) 플레이트에 로딩시킨 뒤, 28℃에서 3일간 인큐베이션한 후, 촬영하였다. 한편, 저온 스트레스를 모니터하기 위하여, 동일한 중간-로그기(A₆₀₀=2.5) 형질전환 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10^-9배 단계희석하고, 과산화수소를 포함하지 않는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 40℃에서 6일간 인큐베이션, 15℃에서 10일간 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, Co² ⁺, Ni² ⁺, Fe³ ⁺ 및 Zn² ⁺ 이온을 포함한 다양한 금속 이온에 의해 유도된 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT) 발현 세포가 EV 세포의 금속 이온 내성에 비해 우수하였다. 반면, Mg² ⁺, Ca² ⁺및 Mn² ⁺을 처리한 경우는 CaDHN(WT) 발현 세포와 EV 세포의 금속 이온 내성이 유사하게 나타나 이러한 결과는 상기 실시예 5의 in vitro 실험 결과와 일치함을 확인하였다. 특이하게도 Cu² ⁺ 스트레스 하에서는 C143A 세포가 CaDHN(WT) 세포보다 스트레스 내성을 나타내었다. 상기 결과를 통해, CaDHN에 의한 금속 이온 항상성은 Cu² ⁺를 제외하고는 CaDHN의 이합체화와 무관함을 다시 한 번 확인하였다.

본 발명은 내재적 비정형 단백질로 알려진 디하이드린 단백질의 일종인 CaDHN에 돌연변이를 유도하고, 상기 돌연변이 CaDHN(C143A)가 효모 내에서 발현되는 경우 효모의 비생물적 스트레스에 대한 내성이 현저하게 향상됨을 확인한 것에 가장 큰 의미가 있다.

구체적으로, 본 발명자들은 CaDHN은 분자간 이황화결합에 의한 이합체화(dimerization)에 중요한 역할을 하는 독특한 단일 시스테인 잔기를 가지고 있으며, CaDHN의 이합체화는 다른 디하이드린 단백질과 달리 금속 이온과는 무관함을 최초로 규명하였다. 나아가, 본 발명자들은 이와 같은 CaDHN의 단일 시스테인 잔기에 주목하여, 시스테인을 다른 아미노산(알라닌)으로 치환한 돌연변이를 유도하고, SDS-PAGE, 산화 및 저온 스트레스 내성, 금속 이온 항상성 등의 실험을 수행함으로써, CaDHN의 구조적 변화를 통해 생물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 동시에, 야생형 CaDHN의 경우 CaDHN 단백질의 독특한 단일 시스테인 잔기가 매개하는 이황화결합에 의해 CaDHN이 이량체로 존재하며, 돌연변이 C143A에 비해 고온 스트레스 내성 및 단백질 항상성이 우수함을 규명하였다.

따라서, 본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof <130> KOPRI1-2 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 1 Met Ser Asn Leu His Pro Thr Gly Gly Glu Thr Glu Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Asp Arg Gly Leu Phe Gly Phe Gly Lys Lys Thr Glu Thr Pro Val Ala 20 25 30 Thr Pro Thr Glu Pro Pro His Lys Pro Thr Leu Thr Glu Lys Leu His 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Ala His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys Ala His Lys Gly Tyr 260 265 270 <210> 2 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence encoding mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 2 atgtcgaact tacacccaac cggaggcgaa accgagacca ctaatactga tagaggcctg 60 tttggcttcg gtaagaagac ggaaaccccc gtcgccaccc cgactgagcc accacacaag 120 cctactctca cggagaagct tcaccgctcg ggcagtagta gctctagctc gtcagatgag 180 gaggtaatag aaaatggtgc gaagattagg aagccgagga ggaagggaat agcagggaaa 240 atcaaggaca agcttccggg tggtcacaag gatgaatacg agactgcgac tcctattgct 300 gcgggtgagt actatcacca ggagccgaac aagcacgctt cagacagggg agtagcggag 360 aagatcaagg aaaagttacc aggcggtcac aaggatgaat acgggacagc gcctaccggt 420 gaccacgccc accaggagca gaacaagcac gcttctgaga tgggtgcggc ggagaaaatc 480 aaggacaagt tgccaggcgg acagaaggat gaatacggga ctgcgcctac tggcgaccac 540 taccaccggg accagaacaa gcatactgcg gcaggaaaca cgcattaccc cgagggaaac 600 aaggggtttg ttggcaatgt taaggataaa ttgccgggaa atcagacaga cgtgaaccat 660 caccagcagc agcaacagca cccggctgtt catgtttcac aacaggcggt ccaggagccg 720 catcatgaga agaaagggct cttagacaac attaaggaca agatgcccgg cggccacaag 780 gatgatgctg ataaagctca caagggttac taa 813 <210> 3 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dehydrin CaDHN from Cerastium arcticum <400> 3 Met Ser Asn Leu His Pro Thr Gly Gly Glu Thr Glu Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Asp Arg Gly Leu Phe Gly Phe Gly Lys Lys Thr Glu Thr Pro Val Ala 20 25 30 Thr Pro Thr Glu Pro Pro His Lys Pro Thr Leu Thr Glu Lys Leu His 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Cys His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys Ala His Lys Gly Tyr 260 265 270 <210> 4 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence encoding dehydrin CaDHN from Cerastium arcticum <400> 4 atgtcgaact tacacccaac cggaggcgaa accgagacca ctaatactga tagaggcctg 60 tttggcttcg gtaagaagac ggaaaccccc gtcgccaccc cgactgagcc accacacaag 120 cctactctca cggagaagct tcaccgctcg ggcagtagta gctctagctc gtcagatgag 180 gaggtaatag aaaatggtgc gaagattagg aagccgagga ggaagggaat agcagggaaa 240 atcaaggaca agcttccggg tggtcacaag gatgaatacg agactgcgac tcctattgct 300 gcgggtgagt actatcacca ggagccgaac aagcacgctt cagacagggg agtagcggag 360 aagatcaagg aaaagttacc aggcggtcac aaggatgaat acgggacagc gcctaccggt 420 gaccactgcc accaggagca gaacaagcac gcttctgaga tgggtgcggc ggagaaaatc 480 aaggacaagt tgccaggcgg acagaaggat gaatacggga ctgcgcctac tggcgaccac 540 taccaccggg accagaacaa gcatactgcg gcaggaaaca cgcattaccc cgagggaaac 600 aaggggtttg ttggcaatgt taaggataaa ttgccgggaa atcagacaga cgtgaaccat 660 caccagcagc agcaacagca cccggctgtt catgtttcac aacaggcggt ccaggagccg 720 catcatgaga agaaagggct cttagacaac attaaggaca agatgcccgg cggccacaag 780 gatgatgctg ataaagctca caagggttac taa 813 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a/WT(F) <400> 5 ctgatatcgg atccgaattc atgtcgaact tacacccaac 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a/WT(R) <400> 6 tggtggtggt ggtgctcgag ttagtaaccc ttgtgagctt 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGPD426/WT(F) <400> 7 cccccgggct gcaggaattc atgtcgaact tacacccaac 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGPD426/WT(R) <400> 8 aactaattac atgactcgag ttagtaaccc ttgtgagctt 40 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C143A(F) <400> 9 cctaccggtg accacgccca ccaggagcag 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C143A(R) <400> 10 ctgctcctgg tgggcgtggt caccggtagg 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포, 식물세포, 진균, 세균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
제6항에 있어서, 상기 진균은 효모인 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
제1항의 디하이드린 펩타이드 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아(starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스인 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법.
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물.
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 고온 스트레스 내성 또는 단백질 항상성은 분자 샤페론 활성에 의한 것임을 특징으로 하는, 조성물.