KR20200060666A - 플라그 표적화 펩타이드 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 플라그 표적화 나노전달체는 플루로닉 고분자, 상기 플루로닉 고분자에 도입된 키토산, 링커를 통하여 상기 키토산에 결합된 플라그 표적화 펩타이드를 포함한다.

Description

플라그 표적화 펩타이드 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체{Plaque targeting nano-carrier comprising pluronic polymer with plaque targeting peptide and chitosan}
본 발명은 플라그 표적화 펩타이드 및 키토산이 도입된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체 및 이를 이용한 혈중 플라그 검출용 영상화제 및 혈전질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
죽상동맥경화증은 지질 대사의 불균형을 통해 혈관벽에 지질과 대식세포가 축적되어 만성 염증을 일으킴에 기인한다. 죽상동맥경화증은 갑작스런 죽음을 초래할 수 있는 심혈관 질환을 일으킬 위험이 높은 것으로 알려져 있다. 또한 동맥경화성 플라그의 형성은 중형 이상의 전신 혈관에서 발생할 수 있기 때문에, 관상 동맥 증후군, 고혈압 및 뇌졸중과 같은 여러 가지 심각한 혈관 질환을 유발할 가능성이 있다. 특히 혈관의 막힘이나 플라그 파열로 인한 급사와 같은 의학적 사건이 발생할 때까지는 혈관 내에서 플라그의 진행이 아무런 징후도 보이지 않는다는 것은 상당히 위험한 점이다.
그러나 요즘, 죽상동맥경화증에 대한 확립된 검출 및 치료 전략에는 한계가 있다. 예를 들어, 죽상동맥경화증을 진단하는 가장 일반적인 방법은 혈관 조영 기술과 혈관 내 초음파 이미징 방법이며, 동맥경화성 플라그의 형성으로 혈류 장애를 관찰한다. 이러한 침습적인 방법이 사용되는 경우, 혈관에 상처를 만들어 원치 않는 플라그 형성을 유발할 수 있으며, 작은 크기의 플라그를 검출하는 것이 곤란하다.
죽상동맥경화증의 치료법은 고혈압과 콜레스테롤 양을 줄이고 죽종 파열로 인한 내강의 폐쇄를 예방한다는 점에서 예방법에 국한되어 있다. 이러한 죽상동맥경화증의 증상이 없는 진행과 죽상동맥경화증의 현재 임상 전략의 한계를 고려할 때 죽상동맥경화증의 효과적인 관리를 위한 죽상동맥경화증 검사 및 치료법 개발이 필요한 실정이다.
죽상동맥경화증을 진단하고 치료하려는 많은 시도들 중에서, 나노전달체 시스템은 죽상동맥경화증의 영상화 및 치료를 위한 효율적인 전달 수단으로 각광을 받아왔다. 죽상동맥경화증은 대식세포의 급속한 축적과 증식으로 인해 신생 혈관 형성과 느슨한 조직 구조와 같은 종양과 유사한 특성을 보임을 고려하면, 나노전달체 시스템은 죽상동맥경화증을 표적으로 하고 의학적으로 기관의 느슨한 조직 구조에 대한 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과와 시스템의 나노 스케일에 의한 긴 순환과 같은 고유한 특성으로 인해 죽상동맥경화 병변으로 약물을 전달할 수 있다. 특히 고분자 기반의 나노전달체 시스템은 산화철 나노 입자, 양자점, 금 나노 물질 및 실리카 나노 입자와 같은 무기 나노전달체 시스템보다 적절한 기능을 도입하기 쉽기 때문에 유용 할 수 있다 (즉, pH 민감성, 특정 리간드의 진단 및 치료를 위한 생체 적합성을 갖는 고분자 기반의 나노전달체 시스템에 적용될 수 있다.)
죽상동맥경화증의 진행을 치료하고 억제하기 위해 많은 연구 그룹이 죽상 동맥 경화 병변에서 혈관 신생의 막힘, 누적된 대식세포에서의 지질 유출 및 병변에서의 염증 반응의 억제와 같은 여러 치료법을 제안해왔다.
첫째, 죽상동맥경화증 병변의 혈관 신생 폐색은 병변의 지질 및 대 식세포의 축적을 방해하여 플라그의 진행을 억제하는 유용한 방법이 될 수 있다. 그러나 죽상 동맥 경화가 지질 축적으로 인한 만성 염증 반응임을 고려할 때, 혈관 신생의 방해는 염증 반응이 지속되는 한 일시적인 치료일 수 있다.
둘째, 죽상동맥경화 플라그에 축적된 대식세포로부터의 지질 유출의 경우, 죽상경화 병변은 콜레스테롤 유출의 조절을 통해 지질 대사를 조절함으로써 감소 될 수 있다. 그러나 지질 유출을 위한 약물에는 간 지방 형성, 고지혈증 및 울혈 성 심부전과 같은 부작용이 있기 때문에 한계가 있다.
따라서, 죽상동맥경화증을 보다 효과적이고 직접적으로 치료할 수 있는 방법의 개발에 대한 요구가 꾸준히 있었다.
I. F. Charo and R. Taub, "Anti-inflammatory therapeutics for the treatment of atherosclerosis," Nat. Rev. Drug Discov., vol. 10, no. 5, pp. 365-376, May 2011.
본 발명의 일 과제는 혈중, 구체적으로는 혈관 내 축적되어 있는 플라그에 전달될 수 있는 플라그 표적화 나노전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 나노전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 과제는 상기 나노전달체를 포함하는 혈중 플라그 검출용 영상화제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 과제는 상기 나노전달체를 포함하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 플루로닉 고분자, 상기 플루로닉 고분자에 도입된 키토산, 링커를 통하여 상기 키토산에 결합된 플라그 표적화 펩타이드를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플라그 표적화 펩타이드는 αγβ3 인테그린 또는 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 αγβ3 인테그린 표적화 펩타이드는 환형 RGD 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드는 서열번호 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플루로닉 고분자 및 키토산은 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자와 아크릴화된 키토산 사이의 광중합 반응을 통해 결합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노전달체의 크기는 체온에서 50 nm 내지 100 nm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플루로닉 고분자의 분자량은 8000 Da 내지 15,000 Da일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산의 분자량은 5 kDa 내지 15 kDa일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산의 탈아세트화도는 80% 내지 95%일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 (a) 플루노닉 고분자에 아크릴화된 키토산을 도입하여 나노전달체 원형을 제조하는 단계; (b) 상기 나노전달체 원형의 키토산에 포함된 아민기를 말레이미드기(MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N-하이드록시숙신아미드(NHS)와 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체 중간체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 나노전달체 중간체에 링커를 이용하여 혈중 플라그를 표적화하는 플라그 표적화 펩타이드를 결합시키는 단계;를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체의 제조방법를 제공한다.
본 발명의 또다른 일 양태는 상기 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈중 플라그 검출용 영상화제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 영상화제의 나노전달체 내에 MRI 조영제, PET 조영제 및 형광 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 봉입하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태는 상기 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플라그 표적화 나노전달체는 내부에 항염증제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항염증제는 인터루킨-10, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-11, 인터루킨-13, TGF-베타, 아토르바스타틴(Atorvastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 로바스타틴(Lovastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 로수바스타틴 칼슘(Rosuvastatin Calcium), 심바스타틴(Simvastatin) 및 ETC-1002 (벰페도익산(Bempedoic acid))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈전 질환은 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 혈전증,　동맥경화성　플라그, 급성 심근경색증, 만성 불안정 협심증, 일과성 허혈증,　말초혈관질환, 폐색전증 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 플라그 표적화 나노전달체는 환형 RGD 펩타이드를 리간드로 사용하여 나노전달체 내에 담지되어 있는 약물을 혈중, 예를 들어 혈관 내에 축적된 플라그로 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명의 특정 서열을 가지는 펩타이드와 키토산의 상승 효과는 표적화 효능을 증진시킬 수 있으며, 나노전달체의 약물 서방출 효과에 의하여 약물을 보다 장기간 동안 높은 농도로 유지할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산 및 산화철 나노입자가 도입된 나노전달체, 환형 RGD 펩타이드, 키토산 및 산화철 나노입자가 도입된 나노전달체, 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드, 키토산 및 산화철 나노입자가 도입된 나노전달체의 모식도를 나타낸다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 종래의 죽상동맥경화증의 진단을 위한 나노입자가 혈관 내 플라그 표적화 능력을 이용하고 있으나, 이들 입자들이 약물을 담지할 수 없다는 문제점을 해결하기 위하여, 플루로닉 고분자, 키토산 및 플라그 표적화 펩타이드를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체가 플라그 표적화 능력을 가지면서도 약물을 담지하여 서방출하여 약물 전달에 유효함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 플루로닉 고분자, 상기 플루로닉 고분자에 도입된 키토산, 링커를 통하여 상기 키토산에 결합된 플라그 표적화 펩타이드를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체를 제공한다.
본 명세서에서, "나노전달체"는 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자와 아크릴화된 키토산과의 수용액 상 혼합물에서 광중합을 수행하여 플루로닉 고분자 기반 나노전달체에 키토산을 도입하여 표면을 개질하고, 상기 키토산에 혈중 플라그에 특이적으로 전달 가능한 플라그 표적화 펩타이드를 링커를 통해 부착시킴으로써, 정맥주사 등에 의해서 표적 플라그 병변 부위에 전달할 수 있는 약물 전달시스템으로의 나노전달체이다.
상기 나노전달체의 크기는 50 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 50 nm 내지 70 nm일 수 있다. 나노전달체의 크기가 50 nm 미만인 경우에는 정맥주사 시 모세혈관 벽을 통해 유출되어 선택적으로 약물을 전달하기 어려운 문제점이 있고, 100 nm 초과인 경우에는 대식세포에 의해 나노전달체가 제거가 될 수 있는 문제점이 있다.
본 명세서에서, "플루로닉 고분자"는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 양친매성 고분자로서, 화학적으로 가교된 안정한 구조, 시험관내 및 체내 안정성, 단백질 담지의 용이성과 효율성 및 세포 비독성뿐만 아니라, 온도 감응성과 같은 여러 이점을 갖는다. 특히 이러한 온도 감응성은 간단한 온도 변화를 통해 나노전달체의 골격 형태를 변화시켜 치료제, 조영제와 같은 약물 기타 입자들을 포집 및 서방출할 수 있는 특성을 제공할 수 있다. 플루로닉 고분자 기반 나노전달체 시스템은 우수한 생체 적합성과 긴 순환 특성을 가지고 있다.
상기 플루로닉 고분자의 분자량은 8,000 Da 내지 15,000 Da, 예를 들어, 8,500 Da 내지 13,000 Da일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 특정 플루로닉의 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조적 특성에 따라 적합한 분자량의 범위를 선택할 수 있다.
본 명세서에서, "키토산"은 양전하를 띄는 양이온성 리간드로서, 나노전달체의 활성 수송을 용이하게 하는 기능을 갖는다.
상기 키토산의 분자량은 1 kDa 내지 50 kDa, 예를 들어, 5 kDa 내지 10 kDa일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 범위는 나노전달체의 양이온성을 위해 선택된 범위로서, 해당 범위의 키토산은 분자량에 따라 도입 가능하며, 양이온성의 차이에 따라 선택될 수 있다.
상기 키토산의 탈아세트화도는 80 내지 95%일 수 있다. 키토산의 탈아세트화도가 높을수록 플루로닉 고분자와의 결합 수율이 높아지는 이점이 있다. 키토산의 탈아세트화도가 80% 미만의 경우에는 지나친 소수성에 의해 키토산이 중성 수용액에 녹지 못하고 산성 수용액에만 녹게 되어, 플루로닉 고분자와의 효율적인 반응이 어려우며, 특히 줄어든 키토산 고분자 내 아민기 수에 의해 플루로닉과의 결합 수율 및 표적화 리간드 접합 정도가 떨어질 수 있다. 키토산의 탈아세트화도가 95% 초과인 경우에는 플로로닉 고분자와의 결합 효율이 낮아질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 나노전달체에서, 상기 플루로닉 고분자와 키토산은 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자와 아크릴화된 키토산 사이의 광중합 반응을 통해 결합된 형태일 수 있다.
본 발명에 사용되는 "플라그 표적화 펩타이드"는 αγβ3 인테그린 표적화 펩타이드 또는 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드일 수 있다.
죽상동맥경화증의 형성 과정을 고려하면, 초기 죽상동맥경화증 병변에서 혈관 신생은 병변의 저산소 상태 때문에 발생하고, 결과적으로, 국소 지방 침착, 대식세포 축적 및 병변 내 침윤은 혈관 신생에 의해 형성된 신생 혈관을 통해 유도되고 죽상동맥경화증의 진행을 촉진시킨다.
콜라겐으로 구성된 섬유질 캡을 갖는 플라그는 평활근 세포로부터 여러 종류의 콜라겐을 합성함으로써 형성되며, 제4형 콜라겐의 축적 정도는 죽상동맥경화증의 진행에 따라 증가한다. 죽상동맥경화증의 초기 단계에서 이 제4형 콜라겐이 병변의 평활근 세포 주위에서 관찰된다. 그러나 진행된 죽상동맥경화증 병변에서는 제4형 콜라겐이 특히 섬유질 뚜껑에 축적되어 있다. αγβ3 인테그린 은 신생 혈관 및 활성화된 대식세포에서 동시에 발현된다. 이를 고려하면 cRGD 펩타이드가 나노전달체가 효율적으로 표적 세포를 표적화 할 수 있을 것으로 판단된다. 이에 따라, αγβ3 인테그린 및 제4형 콜라겐은 혈관 내 플라그를 표적화하는 경우 그 목표로서의 역할을 할 수 있다.
상기 αγβ3 인테그린 표적화 펩타이드는 환형 RGD 펩타이드(cRGD)일 수 있으며, RGD 펩타이드 및 그의 유도체를 포함한다. 이러한 환형 RGD 펩타이드는 염증성 질환에서 혈관 내피세포 표면에서 발현하는 인테그린을 표적할 수 있는 펩타이드이다. 상기 환형 RGD 펩타이드는 환형 RGD(사이클로(Arg-Gly-Asp)), 환형 RGDfV(사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)), 환형 RGDfK (사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)), 환형 RGDfC(사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)), 환형 RGDfE(사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu)), 환형 RGDyK(사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)), 환형 RGDyE(사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Glu)), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드는 제4형 콜라켄 표적화 서열인 "KLWVLPK(서열번호 1)"를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, KLWVLPKGGGC(서열번호 2)로 표시되는 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다.
나아가, 상기 플라그 표적화 펩타이드는, 예를 들어, VCAM-1 표적화 펩타이드(VHPKQHR, CVHSPNKKC 및 CNNSKSHTC), IL-4 리셉터 펩타이드(CRKRLDRNC), 스타빌린 표적화 펩타이드(CRTLTVRKC), 대식세포 리셉터인 Lyp-1 표적화 펩타이드(CGNKRTRGC), Apo A-I 표적화 펩타이드(CGVLESFKASFLSALEEWTKKLQ, DWLKAFYDKVAEKLKEAF, DWLKAFYDKVAEKLKEAFPDWLKAFYDKVAEKLKEAF 및 FAEKFKEAVKDYFAKFWD), Apo E 표적화 펩타이드(LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR), 단핵구의 CCR2 표적화 펩타이드(YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK), CCR5 표적화 펩타이드(ASTTTNYT), 혈소판의 인테그린 GPIIb-IIIa(RGD), 제1형 콜라겐 표적화 펩타이드(GKWH(CTTKFPHHYC)) 및 피브린 표적화 펩타이드(CREKA, RWQPCPAESWT-Cha-CWDP) 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
cRGD 펩타이드가 표적으로 하는 αγβ3 인테그린 이 생체 내 초기 단계 플라그에서의 높은 축적뿐만 아니라 시험관 내 대식세포에 의한 나노전달체의 증진을 위해 Col IV-tg-펩타이드보다 더 강력하다. 따라서, cRGD 펩타이드 결합 나노전달체는 Col IV-tg-펩타이드 결합 나노전달체와 비교하여 초기 단계의 죽상동맥경화성 플라그를 능동적으로 표적화하는 데보다 우수할 수 있다.
본 발명에 사용되는 "링커"는 모체인 나노전달체와 플라그 표적화 리간드인 환형 RGD 펩티드를 결합시켜주는 역할을 하는 것으로, 말레이미드기 (MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N-하이드록시숙신아미드(NHS)의 MAL과의 콘쥬게이션을 위해 RVG와 같이 각 펩타이드는 말단에 시스테인 간기가 추가된 펩타이드 모델을 사용하였다.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체의 제조방법을 제공한다:
(a) 플루노닉 고분자에 아크릴화된 키토산을 도입하여 나노전달체 원형을 제조하는 단계;
(b) 상기 나노전달체 원형의 키토산에 포함된 아민기를 말레이미드기(MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N-하이드록시숙신아미드(NHS)와 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체 중간체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 나노전달체 중간체에 링커를 이용하여 혈중 플라그를 표적화하는 플라그 표적화 펩타이드를 결합시키는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 플루노닉 고분자 및 키토산을 이용하여, 키토산이 부분적으로 도입된 나노전달체의 원형을 제조하는 단계로서, 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자 및 아크릴화된 수용성 키토산을 광중합시켜 플루로닉 고분자에 키토산을 도입함으로써 나노전달체의 표면을 개질하는 단계이다. 구체적으로, 수용액 상에서 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자와 아크릴화된 키토산을 혼합한 후, 광 개시제를 첨가하고 자외선 광을 10 분 내지 20 분 동안 조사하여 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체 원형을 수득할 수 있다. 상기 자외선 광은 1.0 mW/cm2 내지 1.5 mW/cm2의 크기로 조사될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 수득된 나노전달체의 키토산과 링커, 예를 들어, MAL-PEG-NHS를 반응시켜 본 발명의 나노전달체 상의 1차 아미노기와 이종 2 관능성 PEG와 NHS기 사이의 특이적 반응에 의해 MAL-PEG가 결합된 나노전달체를 얻는 단계이다.
이때, 상기 링커의 첨가 비율은 상기 단계 (a)에서 수득된 나노전달체의 아민기에 대하여 1:1.5 내지 2.5의 몰 비율로 첨가될 수 있다. 링커, 예를 들어, MAL-PEG-NHS에 따른 첨가 비율은 표적화 펩타이드의 결합과 연관이 있고, 나노전달체의 아민기 1 몰에 대하여 1.5 몰 미만으로 첨가되는 경우에는 표적 펩타이드가 적게 결합되어 나노전달체로서의 효율이 떨어질 수 있고, 2.5 몰 초과로 첨가되는 경우에는 나노전달체에 남아있는 아민기의 수가 적어지므로 키토산의 양전하성 효과가 떨어질 수 있다.
한편, 본 발명에서는 중간 링커로서 작용하는 NHS-PEG-MAL의 MAL과의 콘쥬게이션을 위해 표적화 펩타이드는 말단에 시스테인 간기가 추가된 펩타이드 모델을 사용할 수 있다.
상기 단계 (c)는 상기 단계 (b)에서 수득한 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에 플라그에 특이적으로 전달 가능한 서열을 가지는 플라그 표적화 펩타이드, 예를 들어, 환형 RGD 펩타이드를 결합시키는 단계이다.
상기 단계 (c)에 있어서, 말레이미드기는, 예를 들어 플라그 표적화 서열을 가지는 펩타이드로서 환형 RGD 펩타이드를 사용하는 경우, 티올기 사이에서 특이적 반응에 의해 플라그 표적화 서열을 가지는 펩타이드가 키토산 상에 결합될 수 있다. 이때, 본 발명의 상기 단계 (b)에서 수득된 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에는 시스테인과 같은 -SH 서열이 포함된 다양한 특정 펩타이드 또한 결합할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈중 플라그 검출용 영상화제를 제공한다.
본 발명의 나노전달체는 혈중 플라그를 표적화하여 이동하는 특성을 가지므로, 나노전달체 내에 MRI 조영제, PET 조영제, 형광 조영제 및 이들의 조합 등을 봉입함으로써, 혈중 플라그 검출용 영상화제로 유용하게 사용될 수 있다.
이때, 상기 MRI 조영제는 상자성 물질, 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로써, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 상기 PET 조영제는 방사성 동위원소 18F, 124I, 64Cu, 99mTc 및 11In으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 킬레이트 DOTA 및 DTPA 착화합물 형태로서 나노전달체에 봉입될 수 있다. 상기 형광 조영제는 Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG 및 이들의 조합 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 나노전달체에 봉입할 수 있다.
상기 나노전달체의 내부에 상기 조영제, 예를 들어, 금속 나노입자, 보다 구체적으로, 산화철 나노입자를 사용하는 경우에는, 상기 조영제 입자가 나노전달체의 약물 서방출에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 조영제 입자의 농도를 조절함으로써 나노전달체의 내부에 담지된 약물의 서방출 속도를 조절할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태는 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 나노전달체는 약물 봉입 효율 및 약물 서방출 효과가 우수하므로, 나노전달체의 기본 골격 내의 공간에 약물 등 입자를 봉입하여 혈중 플라그가 존재하는 병변 부위에 효과적으로 전달할 수 있다.
상기 혈전 질환은 혈관 내 축적되는 플라그에 의해 야기되는 것으로, 예를 들어, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 혈전증,　동맥경화성　플라그, 급성 심근경색증, 만성 불안정 협심증, 일과성 허혈증,　말초혈관질환, 폐색전증 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 혈중 플라그에 의해 야기되는 질환이라면 족하고, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혈전 질환 치료를 위해 나노전달체에 담지될 수 있는 약물은 항염증제일 수 있는데, 이는 죽상동맥경화증의 경우 염증이 동맥경화성 플라그를 유도하고 발생시키는 주된 요인이기 때문이다. 항염증제를 이용한 나노운반체 시스템의 적용은 괴사성 코어의 감소와 콜라겐 캡의 증가에 의한 동맥경화성 플라그의 파열 위험을 감소시킬 수 있으며, 이러한 효과는 죽상동맥경화성 동물 모델에서 항염증 단백질이 지속적으로 발현되는 경우, 대조군보다는 죽상동맥경화증 병변의 진행이 유의하게 억제된 결과로부터 확인할 수 있다. 상기 항염증제는 사이토카인, 아토르바스타틴(Atorvastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 로바스타틴(Lovastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 로수바스타틴 칼슘(Rosuvastatin Calcium), 심바스타틴(Simvastatin) 및 ETC-1002 (벰페도익산(Bempedoic acid))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 항염증 효과가 있는 것이면 족하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 사이토카인은 대식세포의 활성화를 억제하는 단백질로서, 예를 들어, 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TGF-베타를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 제조예, 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.
실시예
시료의 준비
(1) 플루로닉 F-127(PEO 100 PPO 65 PEO 100, 분자량 12.6 kDa)(이하, PF 127) 및 플루로닉 F-68(PEO 82 PPO 31 PEO 82, 분자량 6.8 kDa) (이하, PF 68)을 BASF(대한민국 서울)로부터 제공받았다.
(2) 수용성 키토산(분자량 5 kDa 이하, 탈아세틸화도 85%)을 키토라이프(대한민국 서울)에서 구입하였다.
(3) 환형 RGD(cRGD) 펩타이드(Cyclo-(RGDfC), 분자량 578.7 Da, 순도 98%)를 ChinaPeptides(중국 상하이)로부터 구입하였다.
(4) 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드(Col IV-tg-펩타이드, 서열: KLWVLPKGGGC, 순도 95%)를 애니젠(한국 광주)에서 구입하였다.
(5) 헤테로 기능성 폴리에틸렌 글리콜(α-maleimide-ω-N-hydroxy-succinimde ester polyethylene glycol, Mal-PEG-NHS, 분자량 1 kDa)을 Creative PEGWorks(미국 노스캐롤라이나)에서 구입하였다.
(6) 카복시 기로 코팅된 산화철 나노입자(IONP, 평균 크기 10 nm 이하)를 Ocean NanoTech(미국 애리조나)에서 구입하였다.
(7) Cy5.5의 단일반응성 하이드록시숙신이미드 에스터(NHS-Cy5.5)를 Amersham Bioscience(미국 뉴저지)로부터 구입하였다.
(8) 에스케리키아 콜리 055:B5(Escherichia coli 055:B5)로부터의 리포폴리사카라이드(LPS)를 Sigma-Aldrich(미국 미주리)로부터 구입하였다.
(9) 4-(2-하이드록시에톡시)페닐-(2-하이드록시-2-프로필)케톤(Irgacure 2959)을 Ciba Specialty Chemicals(스위스 바젤)로부터 구입하였다.
모든 화학 물질은 분석 등급이었으며, 추가 정제 없이 사용되었다.
실시예 1. 리간드가 결합된 나노전달체의 제조
1.1. 키토산이 도입된 나노전달체 원형의 제조
키토산을 함유하는 플루로닉계 나노전달체(NC)에 표적화 리간드, 환형 RGD(cRGD) 또는 Col IV-tg- 펩타이드를 결합(conjugate)하였다.
먼저, 수성 환경에서 디아크릴레이트 플루로닉 F127(DA-PF 127)을 메타크릴화된 키토산(GMA-키토산)으로 광가교결합시켜 미셀 상태로 만들어, 키토산을 포함하는 플루로닉 기반 나노전달체를 합성하였다. 간략하게, 광중합 개시제(Irgacure 2959) 0.057 중량%를 함유한 GMP-키토산 용액(2.8 mg/ml) 1.846 ml에 10 중량% DA-PF 127 용액 0.154 ml를 첨가하였다. 그 후, 혼합된 용액에 자외선 광램프(VL-4LC, 8W, Viber Lourmat, 프랑스)를 1.3 mW/cm2에서 15 분 동안 조사하여 나노전달체 원형을 합성 하였다.
제조된 나노전달체 원형을 탈이온수(DIW)를 사용하여 1 일 동안 투석하고, 동결건조시켰다. 나노전달체 내 키토산의 함량은 닌하이드린(Ninhydrin) 분석에 의해 나노전달체 총중량을 기초로 12.5 ± 0.9 중량%임을 확인하였다.
1.2. 리간드가 결합된 나노전달체의 제조
이하, 상기 나노전달체 원형(NC)을 이용하여, 이작용성 가교제인 Mal-PEG-NHS를 이용하여 리간드 펩타이드의 티올 기와 나노전달체 상의 키토산 아민 기와의 화학적 결합에 의해 리간드-결합 나노전달체(cRGD-NC 또는 Col IV-tg-NC)를 제조하였다.
인산염 완충액(1ml, pH 8)에 용해된 나노캐리어(NC) 10 mg을 상온(25 ℃)에서 3 시간 동안 진탕기를 이용하여 Mal-PEG-NHS(3.15mg/315 μl PBS, pH 8)와 반응시켜 말레이미드 기를 나노캐리어 상에 도입하였다.
이어서, cRGD 펩타이드(3.65 mg) 또는 Col IV-tg-펩타이드(7.68mg)를 말레이미드 기 관능기화된 나노전달체와 24 시간 동안 반응시켜 펩타이드 내의 티올 기와 나노전달체의 말레이미드 기 간의 특이 반응을 유도하여, 각 표적화 리간드를 나노전달체에 도입하였다.
상기 표적화 리간드가 결합된 나노전달체를 24 시간 동안 투석하여 정제하여 미 반응 펩티드를 제거하고 샘플을 추가 실험을 위해 동결 건조시켰다.
쿠마시블루 분석을 사용하여 나노전달체 상에 결합된 표적화 리간드(cRGD 펩타이드 또는 Col IV-tg-펩타이드)의 양을 측정하였다. 그 결과, cRGD-NC 및 Col IV-tg-NC 1 mg은 각각 0.30 ± 0.03 μmol cRGD 펩타이드 또는 0.30 ± 0.02 μmol Col IV-tg- 펩타이드를 함유하였으며, 나노전달체 상에 결합된 리간드에 관계없이 동량의 리간드와 결합하였음을 확인하였다.
1.3. 형광 염료가 결합된 나노전달체의 제조
광학 모니터링을 위하여, NHS-Cy5.5와 나노전달체의 아민 기를 반응시켜, 근적외선(NIR) 형광 염료인 Cy5.5를 나노전달체에 결합시켰다.
간략히, 나노전달체 10 mg을 인산완충액(10mM, pH 8) 2 ml에 용해시키고, NHS-Cy5.5 16.7 μg을 용액에 첨가하였다. 그 후, 혼합된 용액을 회전 진탕기를 이용하여 실온의 암 조건에서 8 시간 동안 배양하고, 생성물을 48 시간 동안 투석하여 정제함으로써 미반응 염료를 제거하고 동결 건조시켰다.
다중플레이트 판독기(Molecular Devices, Spectra-MaxM2e, Trenton, 미국 뉴저지)를 사용하여 680 nm 여기에서 700 nm에서의 형광 방출로 계산했을 때, 나노전달체에 결합된 Cy5.5의 양은 0.157 중량% 이하였다.
실험예 1. 나노전달체의 물리적 특성 확인
나노전달체의 안정성 및 물리적 특성을 평가하기 위하여, 동적 광산란 시스템(ELS-8000, Otsuka Electronics, 일본 도쿄)을 이용하여 크기 및 표면 전하를 측정하였다.
IONP가 있는 cRGD 펩타이드가 결합된 나노전달체(IONP-cRGD-NC) 및 IONP가 있는 Col IV-tg-펩타이드가 결합된 나노전달체(IONP-Col IV-tg-NC)의 크기를 37 ℃에서 측정하여 평가하였다. 간략히, IONP-cRGD-NC 또는 IONP-Col IV-tg-NC 1 ㎎을 10% 소태아혈청(FBS)이 함유된 세포 배양 배지 1 ml에 용해시킨 후, 시료를 37 ℃ 및 100 rpm에서 배양하고, 시료의 크기를 3 주 동안 미리 결정된 시점에서 측정하였다.
실험 결과, IONP 담지 전후의 다양한 나노전달체의 수력학적(hydrodynamic) 크기와 표면 전하를 37 ℃에서 측정하였다(도 2). 나노전달체(NC), cRGD-NC, Col-IV-tg-NC, IONP-NC, IONP-cRGD-NC 및 IONP-Col IV-tg-NC의 크기는 각각 75 ± 8 nm, 79 ± 9 nm, 74 ± 20 nm, 66 ± 9 nm, 80 ± 5 nm 및 78 ± 22 nm로 확인하였다(도 2의 A). 리간드 결합 및/또는 IONP 담지 후에도 빈 나노전달체와 유사한 크기인 것으로 관찰되었으며, 이는 리간드의 결합 및/또는 IONP의 담지가 나노전달체의 크기에 영향을 주지 않음을 의미한다.
표면 전하와 관련하여, 나노전달체 자체(NC)는 표면에 키토산이 존재하기 때문에 22 ± 1 mV의 양전하를 보였다. 리간드가 결합된 나노전달체 또한 유사한 양전하 표면 전하(~ 20 mV)를 나타냄을 확인하였다. IONP 담지 후에 모든 나노전달체의 표면 전하에는 현저한 변화가 없었다(도 2의 B). 이러한 결과를 통해 표적화 리간드와 IONP가 나노전달체에 결합하는 것이 그들의 물리화학적 성질에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 나아가, 이하의 실험예에서 모든 나노전달체의 물리화학적 성질이 비슷하므로, 죽상동맥경화성 플라그를 표적화하는 그들의 능력이 표적화 리간드의 특성에 의하여 결정되는 것이라고 타당할 것이라는 추정을 가능하게 하였다.
한편, IONP-cRGD-NC 및 IONP-Col IV-tg-NC의 콜로이드 안정성을 생리학적 조건에서의 시료의 크기를 관찰함으로써 확인하였다.
실험 결과, IONP-cRGD-NC와 IONP-Col IV-tg-NC는 혈청 함유 배지에서 3 주까지 응집되기 때문에 눈에 띄는 크기의 증가 없이 잘 분산되었다(도 3). 생체 조건에서 IONP 담지된 나노전달체의 이러한 우수한 안정성은 생체 내 적용 및 정맥 내 주입에 중요하고 유익할 것임을 확인하였다.
실험예 2. 나노전달체의 세포 독성 및 세포 흡수 확인
2.1. 세포 독성의 확인
동물 실험 전 IONP가 담지된 나노전달체의 세포 독성 및 세포 흡수를 평가하기 위하여, RAW 264.7 뮤린(murine) 대식세포를 사용하였다.
세포 독성 시험을 위하여, 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 10% FBS(가열-불활성화됨) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에 37 ℃, 5% 이하의 CO2 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 다양한 농도(50 ~ 1000 μg/ml)의 나노전달체가 들어있는 배양 배지에서 배양하였다. 배지를 WST-8이 함유된 신선한 배지로 교체하고 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, 미국 캘리포니아)를 사용하여 생성 된 포르마잔(formazan)의 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
실험 결과, 모든 나노전달체는 1000 μg/ml의 농도까지 유의한 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 4).
2.2. 세포 흡수의 확인
유동 세포 계측법 분석에 의하여 다양한 나노전달체의 시험관 내 세포 흡수를 정량적으로 측정하였다. 세포를 웰당 2 Х 105 세포의 밀도로 12-웰 조직 배양 플레이트 상에 접종하였다. 12 시간 동안 세포를 성장시킨 후, 배지를 100μg/ml의 농도로 Cy5.5가 부착된 IONP-담지 나노전달체를 함유하는 새로운 배지로 대체하였다. 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 나노전달체의 세포 흡수를 허용하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 분리하고, 원심분리(1500 rpm, 4 ℃에서 5 분)로 수집하였다. 수집된 세포를 각 시료에 대해 30,000 개의 이벤트를 수집함으로써 유동세포계측기(FACS Calibur, BD Biosciences, 미국 캘리포니아)에 의해 즉시 분석하였다. 나노전달체 처리가 없는 세포를 대조군으로 사용하였다.
또한 나노전달체의 세포질 섭취를 활성화된 대식세포에서 정량화하였다. 대식세포를 LPS 처리(100 ng/ml)에 의해 12 시간 동안 활성화시킨 후, 상기와 같이 FACS를 사용하여 나노전달체 흡수를 정량화 하였다.
실험 결과, 리간드가 결합된 나노전달체(cRGD-NC 및 Col IV-tg-NC) 모두 비활성화된 대식세포에서 비표적화된 나노전달체보다 높은 세포 섭취를 나타냈다 (도 5). 그러나, cRGD-NC 및 Col IV-tg-NC는 비활성화 RAW 264.7 세포에 의해 유사한 섭취를 나타냈다. 대조적으로, LPS 활성화 후, 나노전달체의 세포 흡수에 큰 차이가 있음을 확인하였다. 활성화된 대식세포에서의 NC, Col IV-tg-NC 및 cRGD-NC의 흡수는 비활성화 된 대식세포와 비교하여 각각 1.8, 2.1 및 3.6 배 증가하였다(도 5의 B). LPS 처리는 대식세포를 활성화시키고 대사 및 식균 활성을 증가시켜 나노전달체 및 Col IV-tg-NC의 세포 흡수를 증가시키는 것으로 이해할 수 있었다. 활성화 전 Col IV-tg-NC와 cRGD-NC는 세포 내에서 유사한 섭취를 보였으나, 활성화 후 cRGD-NC는 Col IV-tg-NC보다 유의하게 높은 섭취를 보였다. cRGD-NC의 섭취가 크게 증가한 것은 활성화된 세포에서 αγβ3 인테그린 수용체의 발현이 증가했기 때문일 것으로 유추하였다.
LPS 활성화 후 RAW 264.7 대식세포에서 αγβ3 발현 양상을 조사한 결과, LPS 활성화 후 대식세포에서의 αγβ3 발현이 거의 4 배 더 높은 것으로 나타났다. 따라서, LPS 활성화에 의한 수용체의 상향조절된 발현은 수용체 매개 엔도시토시스를 통한 cRGD-NC의 더 많은 결합 및 흡수를 초래하였음을 확인하였다.
실험예 3. 죽상동맥경화 병변을 동반한 동물 모델에서 플라그 표적화 성능 확인
3.1. 죽상동맥경화 병변을 동반한 동물 모델
마우스 대동맥에서 동맥경화성 플라그(atherosclerotic plaque)의 형성을 유도하기 위하여, C57BL/6 계통의 암컷 ApoE 녹아웃 마우스(apoE-/-)를 6 주령까지 정상 식이를 진행하였다. 그 후, ApoE 녹아웃 마우스를 죽상동맥경화 병변의 초기 단계를 유도하기 위하여, 1.25% 콜레스테롤을 함유한 서양식이요법(WD, D12336-Paigent의 죽상동맥경화성 설치류 식단에 부합하는 정제식이요법, 중앙실험동물, 대한민국)을 8 내지 12 주간 처리하였다.
3.2. 동물 모델에서 죽상동맥경화증 병변에서의 플라그 형성의 확인
상기 실험예 3.1.에서 수득한 마우스를 희생시키고 대동맥을 수집하였다. 수집한 대동맥을 4% 포르말린 용액에 24 시간 동안 고정시켰다. 고정된 대동맥을 최적 절단 온도(OCT) 화합물(CellPath, 영국 포이스)에 삽입하고 -25 ℃에서 동결시켰다. 그 후, 냉동된 대동맥을 10 μm 이하의 두께로 절개하였다. 절편된 대동맥 시료를 헤마톡실린-이오신(H&E) 염색법 및 오일레드 O(ORO) 염색법으로 염색하고, 염색된 표본을 광학현미경(TE2000-U, Nikon Co., 일본 도쿄)으로 관찰하여 대동맥의 동맥경화성 플라그 형성을 규명하였다.
실험 결과, H&E 염색법 및 ORO 염색법을 통해 AoE 녹아웃 마우스에서 죽상동맥경화성 플라그의 형성을 확인하였다(도 6). 대동맥 내 플라그의 형성은 죽상동맥경화증 병변에서 많은 양의 콜레스테롤과 지질의 축적을 유도해 혈관 구조를 변형시키는데, 염색된 이미지는 변성된 혈관 구조 및 더 높은 지질 축적을 나타내는 부위(진한 적색으로 염색된 영역)를 나타내었고, 이를 통해 대동맥에서 죽상동맥경화성 플라그의 형성을 확인하였다.
그 후, 제조된 나노전달체의 플라그 표적화 능력을 비교하기 위한 적절한 시점을 선택하기 위하여, ORO 염색법에 의해 서양식이요법 처리 기간의 증가와 함께 죽상동맥경화성 플라그의 발생을 모니터하였다.
마우스 모델에서 플라그의 진행은 6 단계로 나뉘는데, 1 단계에서 3 단계는 일반적으로 초기 단계라고 하며, 서양식이요법으로 10 주간 섭취한 ApoE 녹아웃 마우스에서 수집한 대동맥의 H&E 및 ORO 염색 이미지는 2 단계 병변에 해당하는, 지질이 많은 거품 세포의 지방 줄무늬를 나타냈다(도 7의 A). 더욱이, 섬유질의 캡이 12 주간 서양식이요법이 진행된 ApoE 녹아웃 마우스의 플라그에서 관찰되었으며, 10 주 마우스에서는 유의한 섬유질 캡이 없었던 것과는 대조적이었다. 10 주간의 서양식이요법 처리 후, 대동맥 단면을 차지하는 플라그(~ 0.02 mm2)의 면적은 13% 미만으로, 유사한 마우스 모델을 사용하여 이전에 보고된 죽상동맥경화증 모델(18% 이상의 대동맥 횡단면의 플라그 부위를 보여둠)보다 훨씬 적었다(도 7). 본 실험예에서 관찰 결과, 10 주간 서양식이요법 처리 후의 플라그의 크기는 죽상동맥경화증의 초기 단계로 간주하기에 충분히 작았다.
3.3. 동물 모델에서의 플라크 표적화 성능 확인
죽상동맥경화증 병변에서 IONP-담지된 나노전달체의 표적화 특성을 조사하기 위하여, 상기 실험예 3.1.에서 수득한 마우스(10주간 서양식이요법 처리)에 Cy5.5 염료가 결합된 IONP-담지 나노전달체(PBS(pH 7.4) 100 μl 당 나노전달체 1mg) 또는 유리 염료 자체(주입된 나노전달체에서의 염료와 동량)를 마우스의 꼬리정맥에 주입하였다. 주입 24 시간 후, 마우스를 희생시키고 완전한 대동맥을 조심스럽게 수집하였다. 수집된 대동맥으로부터의 근적외선 형광을 Cy5.5 필터를 갖는 IVIS 영상 시스템(IVIS Lumina K; PerkinElmer INC., 미국)을 사용하여 측정하였다.
실험 결과, 유리 Cy5.5 주입 마우스의 대동맥에서의 형광 신호는 매우 낮았으며, 유리 염료 자체가 플라그에 대해 친화성을 갖지 않음을 확인하였다. 반면, 실시예에 따라 제조된 나노전달체는 유리 염료 자체보다 대동맥에서 더 높은 신호를 보였다. 이는 죽상동맥경화성 플라그가 종양의 혈관 투과성과 유사한 높은 혈관 투과성을 지니고 나노입자 기반 전달체가 병변 부위에 축적될 수 있음을 나타낸다. 다양한 나노 담체 중 IONP-cRGD-NC 및 IONP-Col IV-tg-NC는 모두 비표적화 나노전달체와 비교하여 대동맥에서 더 높은 형광 강도를 나타내어 플라그에서의 나노전달체 축적에 대한 리간드의 명확한 영향을 확인할 수 있었다(도 8).
상기 실험예 1에서 살펴본 바와 같이, IONP가 담지된 나노전달체의 크기와 표면 전하가 유사한 것을 고려하면, 죽상동맥경화증 병변에서의 나노전달체 축적 거동은 주로 표적화 리간드의 접합에 의한 것으로 추정할 수 있었다. 그러나 대상 나노전달체 중에서 IONP-cRGD-NC는 IONP-Col IV-tg-NC보다 플라그에서 유의하게 높은 축적을 보였다. 이와 관련하여, cRGD 펩타이드는 Col IV-tg-펩타이드보다 본 동물 모델(초기 죽상동맥경화증 모델)에서 플라그를 보다 효과적으로 표적화할 수 있는 것으로 확인하였다.
3.4. 죽상동맥경화증 병변의 생체외 MR 영상의 관찰
죽상동맥경화증 병변에서 IONP가 담지된 나노전달체의 MR 영상은 3T 임상 MRI 장치(Magnetom Skyra, Siemens AG, 독일)를 사용하여 수득하였다. 상기 실험예 3.3.에서와 같이, 나노전달체 주입 후 24 시간 후 희생시킨 마우스로부터 수집한 대동맥을 24 시간 동안 4% 포르말린 용액에 고정시켰다. 고정된 대동맥을 7% 젤라틴 젤 블록에 끼우고 다음과 같은 설정으로 KNEE 코일을 사용하여 T2- 가중 MRI를 시행하였다: 에코 시간(TE) 220 ms, 반복 시간(TR) 1950 ms, 플립 각도 180°, 에코트레인 길이(ET) 16, 섹션 두께 3mm, 256 Х 256 매트릭스, 및 NEX(여기 횟수) 1.
실험 결과, IONP-담지된 나노전달체는 대조군과 비교하여 대동맥에서 향상된 조영 신호를 나타냈다(도 10의 A). 상세하게, IONP-cRGD-NC는 MR 영상에서 IONP-NC와 비교하여 약 4 배 높은 조영 증강을 보였다(도 10의 B). 대조적으로, IONP-Col IV-tg-NC는 IONP-cRGD-NC보다 낮은 콘트라스트 향상을 보였으나, IONP-NC보다 거의 2 배 높은 콘트라스트 향상을 나타냈다. 이 결과는 자기공명 조영제인 IONP가 나노전달체에 의해 죽상동맥경화성 플라그로 효율적으로 전달될 수 있음을 나타낸다. 또한 MR 조영 증강 결과는 근적외선 형광 결과와 잘 일치하므로, IONP가 나노전달체와 함께 병변에 전달되었다고 결론을 내릴 수 있었다.
3.5. 죽상동맥경화증 병변의 프러시안 블루 염색
분리된 대동맥을 OCT 화합물에 삽입하고 -25 ℃에서 동결시켰다. 연속절편된 조직을 10 μm 두께로 준비하고, 프러시안 블루(Prussian blue) 염색액(20% 염산 및 10% 포타슘 시아나이드 용액의 혼합물, 1:1 부피비)으로 40 분 동안 염색한 후, 5 분 동안 핵고속적색용액(nuclear fast red solution)으로 대조염색하고, DIW로 세척하였다. 염색된 조직 절편의 이미지를 광학현미경으로 획득하였다.
실험 결과, 죽상동맥경화증 병변에서 IONP의 존재를 프러시안 블루 염색에 의하여 재차 확인하였으며(도 10), 이는 MR 영상 및 형광 신호와 일치하였다.
MR 영상 및 형광 신호와 일치하도록, IONP-cRGD-NC군은 다른 군보다 플라그에서 훨씬 더 강한 프러시안 블루 염색 결과를 나타냈다. 유사하게, IONP-Col IV-tg-NC군은 IONP-cRGD-NC군에 비해 염색이 적었지만, IONP-NC군에 비해 더 강한 염색 결과를 나타냈다. 또한, 프러시안 블루 염색이 적용된 영역의 ORO 염색 결과를 통해 IONP가 나노전달체에 의해 혈관 내에 형성된 플라그에 전달되었음을 확인하였다. 이 결과는 표적화 리간드의 플라그 표적화 능력에 따라, IONP 담지된 나노전달체가 죽상동맥경화성 플라그의 내피 영역에 축적되었음을 나타낸다.
또한 비표적화된 IONP-NC와 비교하여 표적화된 나노전달체(IONP-cRGD-NC 및 IONP-Col IV-tg-NC)의 선택성을 조사하기 위하여, 여러 기관에서의 정맥 주사 24 시간 후의 누적된 상대 변화가 분석되었다(도 11). 표적화 리간드의 관능기화는 동맥에서의 나노전달체 축적을 증가시키고, 간 또는 폐에서의 이들의 섭취를 감소시켰음을 확인하였다. cRGD 관능기화 된 나노전달체(IONP-cRGD-NC)는 IONP-Col IV-tg-NCdp 비해 동맥에서 상대적으로 높은 축적을 나타냈다. 그러나, cRGD 표적화는 비장에서 나노전달체 축적을 증가시키는 반면, 신장에서 IONP-Col IV-tg-NC의 유의한 증가가 관찰되었다. 비장에서 IONP-cRGD-NC의 높은 축적 거동은 RGD 펩타이드가 비장에서 적색 펄프의 세포와 강한 친화성을 갖는다고 설명할 수 있다. 유사하게, IONP-Col IV-tg-NC는 신장에서 매우 높은 축적 거동을 나타냈다. 이는 제4형 콜라겐이 신장의 사구체 기저막의 주성분이기 때문일 것이라고 추정되었다.
이러한 결과로부터, cRGD 펩타이드는, 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드에 비해, 죽상동맥경화증의 비교적 초기 단계에서 나노전달체 시스템을 위한 보다 유용한 표적화 리간드로 간주될 수 있을 것으로 판단되었다.
실시예 2. 입자가 담지된 나노전달체의 제조
나노전달체 시스템에 산화철 나노입자, IL-10 등의 입자를 도입하기 위하여, 나노전달체의 온도 민감성으로 인한 부피 변화를 이용해, IONP 및/또는 IL-10을 담지한 나노전달체(IL10-NC)를 제조하였다.
2.1. 산화철 나노입자가 담지된 나노전달체의 제조
MRI 검출능을 구현하기 위해, 산화철 나노입자(IONP)를 나노전달체에 담지하였다. 간략히, 동결건조된 나노전달체에 IONP 용액(5mg Fe/ml)를 첨가하고 시료(IONP:나노전달체의 질량비는 1:20이고, 즉, IONP를 나노전달체에 5 중량%로 첨가함), 4 ℃에서 12 시간 동안 항온 배양하여 나노전달체로의 IONP 담지를 유도하였다.
스핀 여과(spin-filtration)를 통해 빈(unloaded) IONP를 분리함으로써 나노전달체 내에서 IONP의 담지 효율이 95% 초과인 것을 분석하였다.
2.2. IL-10이 담지된 나노전달체의 제조
IL-10를 나노전달체에 담지하기 위하여, 건조 상태의 상기 실시예 2.1.에서 수득된 IONP가 담지된 나노전달체 1 mg에 DIW 중의 IL-10 5 μg을 첨가하고, 혼합 용액을 4 ℃에서 밤새 배양하여 IL-10을 담지한 나노전달체(IL10-NC)를 제조하였다.
IL-10 및 IONP의 담지 효율은 나노전달체 시스템에서 상당히 높았다(90% 초과). 빈 IONP 및 IL-10을 공지된 방법인 스핀 여과에 의해 분리 및 분석하였다.
상기 제조된 IL10-NC를 동결건조하고, 장기 보관을 위해 -20 ℃에서 보존하였다.
실험예 4. 나노전달체의 물리적 특성 확인
나노전달체의 안정성 및 물리적 특성을 평가하기 위하여, 동적 광산란 시스템을 이용하여 나노전달체의 크기 및 표면 전하를 측정하였다.
상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 빈 나노전달체, (IONP가 있거나 없는) IL-10 담지된 나노전달체의 크기 및 표면전하를 관찰하였다.
실험 결과, 체온인 37 ℃에서, 빈 나노전달체(Bare NC), IONP가 있는 빈 나노전달체(Bare NC (w/ IONP)), IONP가 없는 나노전달체(IL10-NC (w/o IONP)) 및 IONP가 있는 나노전달체(IL10-NC (w/IONP))는 각각 79 ± 9 nm, 74 ± 14 nm, 80 ± 5 nm 및 81 ± 16 nm의 크기를 나타내었다(도 12의 A). IL-10 단백질과 IONP가 있는 나노전달체 시스템은 37 ℃에서 비슷한 크기(약 80 nm)를 보였으므로, IL-10 단백질 및/또는 IONP의 나노전달체 시스템으로의 물리적 삽입은 나노전달체 시스템의 크기의 변화시키지 않음을 확인하였다. 또한 나노전달체의 표면 전하의 경우, 나노전달체 시스템에서 키토산의 존재로 인하여 모든 나노전달체가 비슷한 양전하 표면 전하(약 20 mV)을 보였다(도 2의 B). 나노전달체 시스템 사이에 중요한 표면 전하 변화가 없다는 것을 고려할 때, 나노전달체로의 IL-10 단백질 및/또는 IONP의 물리적 봉입은 나노전달체의 물리화학적 특성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
실험예 5. 나노전달체 시스템으로부터의 IL-10의 방출 거동 확인
IL10-NC(w/o IONP)와 IL10-NC(w/IONP) 사이의 죽상동맥경화성 병변 치료를 위한 적절한 나노전달체 시스템을 선택하기 위하여, 나노전달체 시스템으로부터의 IL-10의 생체외 방출 거동을 확인하였다.
이를 위하여, 1 mg의 IL10-NC, 및, 예컨대, IL10-NC 중의 IL-10과 동량의 유리 IL-10를 0.1 ml의 PBS 완충액에 용해시키고, 용해된 용액을 투석주머니(분자량 컷오프 100 kDa)에 넣었다. 투석주머니를 50 ml 시험관에 넣고, 방출 완충액(PBS(pH 7.4), 0.01 중량% 소혈청알부민(BSA) 및 20 mM 나트륨 아자이드) 10 ml를 시험관에 첨가하였다. 시료를 진탕배양기(100 rpm, 37 ℃)에서 배양하였다. 그 후, 소정의 시점에서, 방출 완충액 1ml를 수집하고, 방출완충액 전체를 신선한 방출완충액과 교체하였다. ELISA 키트(R&D systems, 미국 미니애폴리스) 및 다중-웰 플레이트 판독기를 사용하여 각 시점에서 IL-10의 양을 450 nm에서 분석하였다. 모든 실험은 3 회 수행되었다.
실험 결과, IL-10 단백질 자체의 경우, 단백질은 실험 3 일 이내에 빠른 방출을 보였다. 그러나 IONP가 없는 IL10-NC(IL10-NC (w/o IONP)) 및 IONP가 있는 IL10-NC(IL10-NC (w/ IONP))의 경우, IL-10은 7 일까지 지속 방출 작용을 보였다(도 13). 특히, IL10-NC (w/ IONP)의 경우, IL-10의 방출 거동은 다른 시료보다 3 주 동안 가장 느렸다. IL-10의 등전점은 8.3인 것을 고려하면, IL10-NC (w/ IONP)로부터의 지속적인 IL-10 방출은 카복시 기로 코팅된 IONP의 음성 표면 전하로 인한 IL-10과 IONP 사이의 정전기적 상호 작용에 의해 유발될 수 있음을 유추할 수 있었다.
나노전달체 시스템으로부터 IL-10의 방출은 죽상동맥경화성 플라그에 보다 효과적인 치료 효과를 제공할 수 있을 것으로 판단되었다. 이를 토대로, 죽상동맥경화증에 대한 나노전달체 시스템의 치료 효과를 연구하기 위해, IONP를 포함한 IL10-NC(IL10-NC (w/ IONP))을 선택하였다. 이하, IL10-NC (w/ IONP)는 (비수식된) "나노전달체"(또는 "IL10-NC")로 표시하였다.
실험예 6. 죽상동맥경화 병변을 동반한 동물 모델에서 IL-10의 치료 효과의 확인
6.1. 죽상동맥경화 병변을 동반한 동물 모델에의 시료 주입
상기 실험예 3.1.에서 수득한 동물 모델에, IL10-NC에서 처리된 IL-10과 동량인, IL10-NC 1 mg 및 IL-10 5 ㎍을 PBS 0.1 ml에 용해시키고, 용해된 시료들을 3 주 동안 1 주일에 한 번씩 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하여, 체내에서 높은 IL-10 농도를 유지하였다.
6.2. 나노전달체의 독성 확인
IL10-NC의 치료 효과를 확인하기 전, 동물 모델에서 IL-10 처리의 중의 효과를 조사하기 위하여, 체중 및 혈중 콜레스테롤 농도의 변화를 모니터링하였다.
이를 위하여, 시료 주입 후, 마우스의 체중을 측정하고, 심장 천공을 이용해 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 수집한 혈액을 3000 rpm, 4 ℃에서 5 분간 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 그 후, 혈청 내 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백질(HDL), 저밀도 지단백질(LDL) 및 트리글리세리드의 농도를 GC *?*Labs(대한민국 용인)의 혈액 검사 서비스를 통해 분석하였다.
실험 결과, ApoE 녹아웃 마우스의 체중은 시료 주입 전후의 유의한 변화가 없었고(도 14의 A), IL10-NC 처리군과 IL-10 처리군의 혈청 콜레스테롤 농도는 대조군과 유사하였다(도 14의 B).
IL10-NC와 IL-10의 정맥 주사 후 마우스의 체중 변화가 없다는 것을 장기적인 관점에서 볼 때, IL-10 농도가 마우스에게 유의한 독성이 없음을 시사하며, 본 실험예에서의 IL-10 농도가 독성이 없는 적절한 농도로 간주될 수 있음을 확인하였다. 또한, IL10-NC 처리군과 IL-10 처리군 사이의 혈청 콜레스테롤 농도는 ANOVA 분석을 이용한 대조군과 비교하여 유의미한 차이가 없으므로, 면역 억제 단백질인 IL-10이 지질 대사에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
6.3. 마우스에서의 IL-10 농도의 측정
처리된 마우스에 잔존하는 IL-10을 측정하기 위하여, 꼬리 정맥을 통해 시료를 주사한 후 1 일 및 7 일 후에 복강-안와 채혈법을 통해 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 원심분리(3000 rpm, 4 ℃, 5 분)를 사용하여 수집된 혈액으로부터 혈청을 분리하였다. ELISA 키트(R&D systems)와 450-nm에서 다중-웰 플레이트 판독기를 이용하여 수득된 혈청 중의 IL-10의 농도를 분석하였다.
실험 결과, IL10-NC 처리군은 정맥주사 후 1 일 및 7 일차에 IL-10 처리군 및 PBS 처리군에 비하여 혈청 내 IL-10 단백질의 농도가 높음을 확인하였다. 정맥주사 후 1 일 및 7 일차에, IL-10 처리군 및 PBS 처리군은 혈청에서 유사한 IL-10 농도를 보였다. 대조적으로, 정맥주사 후 7 일차에서, IL10-NC 처리군은 다른 시료 군에 비해 IL-10 농도가 높았지만 정맥주사 후 1 일차 농도보다는 낮았다(도 15).
이러한 결과는 ApoE 녹아웃 마우스의 혈청에서 IL10-NC가 유리 IL-10의 치료보다 IL-10 단백질의 보유를 연장시킬 수 있음을 시사하였다.
6.4. IL-10 전달에 의한 나노전달체의 죽상동맥경화증 병변 치료 효과 확인
죽상동맥경화증 병변에 대한 IL-10 단백질 전달에 의한 나노전달체 시스템의 치료 효과를 조사하기 위해, 마지막 주사 후 일주일 후, IL-10 또는 IL10-NC로 처리된 모든 마우스를 희생시키고 대동맥을 수집하였다. 수집한 대동맥을 4% 포르말린 용액에 24 시간 동안 고정시켰다.　
고정된 대동맥을 OCT 화합물에 삽입하고 -25 ℃에서 동결시켰다. 그 후, 냉동된 대동맥을 10 μm 이하의 두께로 절개하였다. 절개된 대동맥 시료를 오일레드 O 염색법으로 염색하여, 대동맥의 플라그 면적을 조사하였다. 그 후, 염색된 표본을 대동맥의 죽상동맥경화 병변의 특성을 규명하기 위하여, 광학 현미경(TE2000-U, Nikon Co., 일본 도쿄)으로 관찰하였다.
또한 절편에 남아있는 IL-10 단백질은 면역 형광 염색 후 형광 현미경으로 분석하였다. 요약하면, IL-10 단백질(항-IL 10 항체(ab9969), abcam, 영국)에 대한 1차 항체 용액 10 μg/ml를 절개된 대동맥에 처리하고, 처리된 시료 슬라이드를 4 ℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 2 회 세척하고, 100 배 희석된 2차 항체 용액(염소 항-토끼 IgG H&L(Texas Red®), ab6719, abcam, 영국)을 시료에 처리하고, 처리된 시료를 실온의 암실에서 1 시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여, 시료를 PBS로 2 회 세척하였다. 마지막으로, 시료를 DAPI를 포함하는 실장 용액을 사용하여 커버 글래스로 덮고 시료로부터의 형광 신호를 현미경으로 관찰하였다.
나노전달체에 의해 전달된 IL-10 단백질은 면역형광 이미지를 이용하여 죽상동맥경화성 플라그에서 특정되었다.
실험 결과, IL-10 처리군 및 PBS 처리군의 경우에는 IL-10 단백질의 유의한 신호가 확인되지 않았다. 혈관 내에서 큰 크기의 죽상동맥경화성 플라그가 엘라스틴으로 구성된 혈관 구조로부터 자가형광 및 DAPI 염색을 통해 관찰되었다. 대조적으로, IL10-NC 처리군의 경우, 죽상동맥경화성 동맥 경화 플라그 영역으로부터의 강한 적색 형광 신호를 확인하였다. 또한, 다른 군에서와 달리, DAPI 형광 및 혈관 구조로부터의 자가형광에 의해, 매우 작은 크기의 플라그가 관찰되었다. 흥미롭게도 PBS 처리군과 IL-10 처리군은 서로 다른 형광 영상을 나타냈다. 즉, PBS 처리군은 죽상동맥경화성 동맥 경화 플라그 주변의 얇은 엘라스틴 형광 신호 및 많은 양의 세포 축적을 보였으나, IL-10 처리군은 플라그에서 두꺼운 엘라스틴 형광 신호를 보였으며 PBS 처리군에 비해 적은 세포 농도를 나타냈다. 이를 통해, IL-10 단백질이 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)을 증가시키고 괴사성 코어를 유도 할 수 있는 세포 축적을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 IL10-NC 처리군의 경우, 시료 주사 7 일 후까지 죽상동맥경화증 병변에 IL-10 단백질이 남아 있었다(도 16). IL10-NC가 장기화된 IL-10의 분비 특성을 보여준 것을 고려하면, IL-10 단백질이 장기간 질병 부위에서 지속하는 것은 보다 효과적인 치료로 이어질 수 있음을 예상할 수 있었다.
지질 침착이 있는 죽상동맥경화성 플라그를 관찰하기 위하여, 대동맥 단면의 오일레드 O 염색 결과를 확인하였다. 실험 결과, IL-10 처리군과 PBS 처리군은 죽상동맥경화성 동맥경화성 플라그가 관 내의 50%를 점유하고 있음을 확인하였다. 대조적으로, IL10-NC 처리군은 죽상동맥경화성 플라그에 의해 루멘의 약 20%가 차단된 것으로 나타났다(도 17의 A 및 B). 또한, 혈관 구조에서 죽상동맥경화성 플라그의 크기를 분석한 결과, IL10-NC 처리군은 죽상동맥경화증의 초기 단계에서 비슷한 크기인 0.025 mm2 이하의 플라그 크기를 나타내었으나, IL-10 처리군 및 PBS 처리군은 유사한 동맥경화성 플라그 크기를 보였고, 그 크기는 IL10-NC 처리군에 비해 0.08 내지 0.12 mm2로 더 컸다. 그 결과, 실험군 중 IL10-NC 처리군만이 죽상동맥경화성 플라그의 진행을 억제함으로써 효과적인 치료 효과를 보임을 확인하였다.
실시예 3 내지 10. 다양한 플루로닉 고분자의 적용
상기 실시예 1.1에 기재된 방법 중에서 디아크릴레이트 플루로닉 F127(DA-PF 127)를 사용하는 것과 표적화 리간드의 함량을 하기 표 1과 같이 변경하는 것을 제외하고는, 실시예 1.1 및 1.2.에 기재된 방법과 동일한 방법으로 표적화 리간드가 결합된 나노전달체를 제조하였다.
실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 실시예 9 실시예 10
플루로닉 고분자 PF 68 PF 68 PF 68 PF 68 PF 127 PF 127 PF 127 PF 127
표적화 리간드 - cRGD cRGD cRGD - cRGD cRGD cRGD
반응시 첨가된 리간드함량 (mg/ 1mg 나노입자) - 0.122 0.243 0.365 - 0.122 0.243 0.365
치환된 리간드의 함량 (중량%) 0 5 10 17 0 5 10 17
실험예 7. 나노전달체의 물리적 특성 확인
나노전달체의 안정성 및 물리적 특성을 평가하기 위하여, 동적 광산란 시스템을 이용하여 나노전달체의 크기 및 표면 전하를 측정하였다.
상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 상기 실시예 3 내지 10에서 수득된 나노전달체의 크기 및 표면전하를 관찰하였다.
실험 결과, 플루로닉 고분자로서 PF 68을 사용한 실시예 3 내지 6에 있어서, 표적화 리간드의 함량과 무관하게, 각 측정 온도(5 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃(체온))에서 나노전달체 간의 크기 변화 및 37 ℃에서 측정된 표면 전하 사이에는 비슷한 값을 나타내었다(도 18). 또한 플루로닉 고분자로서 PF 127을 사용한 실시예 7 내지 10에 있어서, 유사한 결과를 나타내었다(도 19).
실시예 3 내지 6과 실시예 7 내지 10의 각 군에서 나노전달체들이 동일한 측정 온도 하에서는 서로 비슷한 크기를 보였으므로, 표적화 펩티드인 cRGD의 삽입 및 그 함량이 나노전달체 시스템의 크기의 변화시키지 않음을 확인하였으며, 표면 전하의 경우, 나노전달체 시스템에서 모든 나노전달체가 비슷한 양전하 표면 전하(약 20 mV)을 보여 유의한 표면 전하 차이가 없는 것을 통해, 나노전달체로의 표적화 펩티드의 삽입 및 함량은 나노전달체의 물리화학적 특성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
다만, 체온인 37 ℃를 기준으로, 온도가 하락할수록 나노전달체의 크기가 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 두 군에서 유사하게 확인되었다. 이를 통하여, 각 나노전달체의 온도민감성을 확인함과 동시에, 온도에 따라 나노전달체의 내부에 약물 등의 입자를 담지시키거나 방출시키는 양 및 속도를 조절할 수 있는 가능성을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Plaque targeting nano-carrier comprising pluronic polymer with plaque targeting peptide and chitosan <130> P-180376 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting peptide <400> 1 Lys Leu Trp Val Leu Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting peptide <400> 2 Lys Leu Trp Val Leu Pro Lys Gly Gly Gly Cys 1 5 10

Claims (16)

  1. 플루로닉 고분자, 상기 플루로닉 고분자에 도입된 키토산, 링커를 통하여 상기 키토산에 결합된 플라그 표적화 펩타이드를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플라그 표적화 펩타이드는 αγβ3 인테그린 또는 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 αγβ3 인테그린 표적화 펩타이드는 환형 RGD 펩타이드인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제4형 콜라겐 표적화 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 플루로닉 고분자 및 키토산은 양극단이 아크릴화된 플루로닉 고분자와 아크릴화된 키토산 사이의 광중합 반응을 통해 결합되는 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노전달체의 크기는 체온에서 50 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 플루로닉 고분자의 분자량은 8,000 Da 내지 15,000 Da인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 키토산의 분자량은 5 kDa 내지 15 kDa인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 키토산의 탈아세트화도는 80% 내지 95%인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  10. (a) 플루노닉 고분자에 아크릴화된 키토산을 도입하여 나노전달체 원형을 제조하는 단계;
    (b) 상기 나노전달체 원형의 키토산에 포함된 아민기를 말레이미드기 (MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N-하이드록시숙신아미드(NHS)와 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체 중간체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 나노전달체 중간체에 링커를 이용하여 혈중 플라그를 표적화하는 플라그 표적화 펩타이드를 결합시키는 단계;
    를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈중 플라그 검출용 영상화제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 영상화제의 나노전달체 내에 MRI 조영제, PET 조영제 및 형광 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 봉입하여 사용하는 것을 특징으로 하는 혈중 플라그 진단용 영상화제.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 플라그 표적화 나노전달체를 포함하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 플라그 표적화 나노전달체는 내부에 항염증제를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 항염증제는 인터루킨-10, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-11, 인터루킨-13, TGF-베타, 아토르바스타틴(Atorvastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 로바스타틴(Lovastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 로수바스타틴 칼슘(Rosuvastatin Calcium), 심바스타틴(Simvastatin) 및 ETC-1002 (벰페도익산(Bempedoic acid))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 혈전 질환은 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 혈전증,　동맥경화성　플라그, 급성 심근경색증, 만성 불안정 협심증, 일과성 허혈증,　말초혈관질환, 폐색전증 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈전 질환 치료용 약학적 조성물.
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