CN114796530B - 软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：将II型胶原靶向肽与羧甲基壳聚糖偶联，制备II型胶原靶向肽‑羧甲基壳聚糖偶联物；将所述II型胶原靶向肽‑羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾反应，制备所述软骨靶向纳米颗粒。本发明通过采用II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖和高锰酸钾制备得到软骨靶向纳米颗粒，具有纳米级尺寸和软骨靶向肽的引导特点，可以主动穿透关节软骨致密的胶原网络，故产生明显的T1增强效果，可以实现骨关节炎软骨损伤的有效早期诊断，其还具有良好的软骨保护和促进骨间充质干细胞的软骨形成的作用，在体外细胞水平和体内动物模型验证中对骨关节炎表现出有效治疗效果。

Description

软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨退变是早期骨关节炎的重要病理特征，软骨损伤的早期诊断和干预是预防骨关节进一步受损的手段。目前，检测软骨损伤的成像技术包括传统的磁共振成像序列，新兴开展的磁共振序列(如T2mapping、T1rho成像、弥散加权成像、糖胺聚糖化学交换饱和转移显像、23Na MR)以及磁共振关节造影技术。磁共振关节造影技术是指向关节腔内注射稀释的磁共振成像(MRI)造影剂溶液，由于健康组织和病理组织的含水量不同，MRI造影剂可以通过影响水分子的纵向弛豫时间(T1)或横向弛豫时间(T2)来增强图像的对比度的一种技术。
造影剂根据作用效果不同可分为T1造影剂也称为阳性造影剂，以及T2造影剂也称为阴性造影剂。其中T1造影剂主要是通过缩短T1从而增强信号，使病变部分变亮，近年来已经开发了钆(Gd)类造影剂、锰(Mn)类造影剂、富勒烯类造影剂等众多种类的T1造影剂。
目前，临床上使用钆类造影剂的过程中存在着Gd残留、毒性和非特异性生物分布的问题，例如Gd-DTPA体积较大，无法穿透关节软骨中的胶原纤维形成的致密网络结构，且对软骨缺乏亲和力，不足以检测损伤软骨。
有研究提供了一种关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂，结构为HA-DTPA-Gd，该造影剂对软骨具有较好的亲和力，从而提高造影效果。然而该造影剂为钆类造影剂，仍具有一定的毒性，其主要用于检测较大的软骨缺损(全层软骨损伤模型)，尚缺乏具有对骨关节炎较小的软骨损伤检测作用的造影剂。此外，钆类造影剂达到软骨损伤部位后，并不具有修复受损软骨的能力。
Mn相较于Gd而言，具有良好的生物安全性，但目前可用的Mn类造影剂存在循环时间短、r1值低等缺点，造影效果不佳。与小分子Mn类造影剂相比，大分子Mn聚合物可以在较低剂量下获得相对较好的造影剂增强效果，但是由于其尺寸较大，不能有效穿透软骨的纳米级胶原网络，进而限制了其在软骨成像中的应用。
发明内容
基于此，本发明提供一种软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。该制备方法制备的软骨靶向纳米颗粒能够有效穿透软骨的纳米级胶原网络，造影效果和生物安全性佳，且具有修复软骨损伤的作用。
具体技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种软骨靶向纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将II型胶原靶向肽与羧甲基壳聚糖偶联，制备II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物；
将所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾反应，制备所述软骨靶向纳米颗粒。
在其中一实施例中，所述II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾的质量比为1:(49～51):(7～8)。
在其中一实施例中，所述II型胶原靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在其中一实施例中，所述制备方法包括如下步骤：
将所述II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖和偶联试剂混合，于0℃～5℃避光反应7h～9h，透析，冻干，制备所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物；
将所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾混合，于0℃～5℃反应1h～3h，透析，冻干，制备所述软骨靶向纳米颗粒。
在其中一实施例中，所述偶联试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合。
在其中一实施例中，透析步骤包括如下条件：透析截留分子量为10000d～100000d，温度为3℃～5℃，透析时间为24h～48h。
本发明的第二方面，提供一种软骨靶向纳米颗粒，通过上述的制备方法制备得到。
在其中一实施例中，所述软骨靶向纳米颗粒的粒径为2nm～5nm。
本发明的第三方面，提供上述的软骨靶向纳米颗粒在软骨造影中的应用。
本发明的第四方面，提供上述的软骨靶向纳米颗粒在制备具有治疗骨关节炎功效的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的软骨靶向纳米颗粒的制备方法，通过采用II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾制备软骨靶向纳米颗粒，将亲水聚合物羧甲基壳聚糖与MnOx通过原位氧化还原反应结合，增强Mn离子的亲水性，有效减少了水分子的纵向弛豫时间，提高纵向弛豫率，从而达到优化T1增强的成像效果，并且制备得到的软骨靶向纳米颗粒具有纳米级尺寸和软骨靶向肽的引导特点，可以主动穿透关节软骨致密的胶原网络，故产生明显的T1增强效果，可以实现骨关节炎软骨损伤的有效早期诊断。此外，该软骨靶向纳米颗粒还具有良好的软骨保护和促进骨间充质干细胞的软骨形成的作用，在体外细胞水平和体内动物模型验证中对骨关节炎表现出有效治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1为实施例1中WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的制备路线示意图；
图2为实施例2中WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的透射电镜图；
图3为实施例2中WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的X射线光电子能谱；
图4为实施例3中WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的体外T1加权磁共振成像结果(A：不同Mn浓度的纳米颗粒溶液的T1加权MRI图像；B：不同Mn浓度的纳米颗粒溶液的1/T1线性回归图)；
图5为实施例4中注射WY-CMC-MnOx NPs前后矢状位OA大鼠膝关节T1加权MRI图像；
图6为实施例5中系列浓度的WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒溶液的细胞毒性研究结果(A：大鼠骨髓间充质干细胞；B：小鼠成纤维细胞；C：小鼠胚胎成骨细胞前体细胞；D：人脐静脉内皮细胞)；
图7为实施例6中WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒对间充质干细胞软骨分化基因转录影响的结果(A：SOX9；B：ACAN；C：COL2)；
图8为实施例7各处理组中间充质干细胞软骨分化蛋白表达情况(A：阿利新蓝染色结果；B：COL2免疫组化染色结果)；
图9为实施例8各处理组中OA大鼠的骨关节炎治疗和软骨修复结果(A：各处理组中OA大鼠膝关节石蜡切片、番红O/固绿染色结果图；B：各处理组中股骨侧和胫骨侧的OARSI评分)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明提供一种软骨靶向纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将II型胶原靶向肽与羧甲基壳聚糖偶联，再与高锰酸钾反应，制备软骨靶向纳米颗粒。
本发明提供的软骨靶向纳米颗粒的制备方法，通过采用II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾制备软骨靶向纳米颗粒，将亲水聚合物羧甲基壳聚糖与MnOx通过原位氧化还原反应结合，增强Mn离子的亲水性，有效减少了水分子的纵向弛豫时间，提高纵向弛豫率，从而达到优化T1增强的成像效果，并且制备得到的软骨靶向纳米颗粒具有纳米级尺寸和靶向肽的引导特点，可以主动穿透关节软骨致密的胶原网络，故产生明显的T1增强效果，可以实现骨关节炎软骨损伤的有效早期诊断。
在其中一示例中，II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾的质量比为1:(49～51):(7～8)。
在其中一示例中，II型胶原靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ IDNo.1：WYRGRL。
在其中一示例中，软骨靶向纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖和偶联试剂混合，于0℃～5℃避光反应7h～9h，透析，冻干，制备II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物；
将II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾混合，于0℃～5℃反应1h～3h，透析，冻干，制备软骨靶向纳米颗粒。
在其中一示例中，采用标准固相法合成方法制备II型胶原靶向肽，并在肽段的c端添加一个富含羧基的连接体(EEE)。
可以理解地，富含羧基的连接体EEE为三个谷氨酸序列，该氨基酸富含羧基(HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH)。
在其中一示例中，偶联试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
可以理解地，本发明中可采用EDC/NHS法将含有-COOH基团的II型胶原靶向肽偶联到羧甲基壳聚糖的-NH2基团上，制备II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物。
在其中一示例中，透析步骤包括如下条件：透析截留分子量为10000d～100000d，温度为3℃～5℃，透析时间为24h～48h。进一步地，透析时间包括但不限于：24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h。
在其中一示例中，透析截留分子量为50000d～100000d。进一步地，透析截留分子包括但不限于：50000d、60000d、70000d、80000d、90000d、100000d。
在其中一示例中，透析步骤采用超纯水。
在本发明中，对冻干步骤不作特别要求，将产物完全冻干即可。在其中一示例中，透析步骤包括如下步骤：将经透析处理的产物于-85℃～-75℃预冻23h～25h，再于-1Pa～1Pa、-56℃～-54℃条件下冻干24h～48h。
本发明提供一种软骨靶向纳米颗粒，软骨靶向纳米颗粒的原料成分包括II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾。
可以理解地，本发明提供的II型胶原靶向肽可以采用本领域技术人员常规的固相合成方法制备，在此不过多赘述。
本发明还提供一种软骨靶向纳米颗粒，通过上述制备方法制备得到。
在其中一示例中，软骨靶向纳米颗粒的粒径为2nm～5nm。进一步地，软骨靶向纳米颗粒的粒径包括但不限于：2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm。
在本发明中，软骨靶向纳米颗粒具有软骨靶向肽的引导特点，对软骨亲和力高，并且由于其具有超小的尺寸，可以主动穿透关节软骨致密的胶原网络，而早期关节软骨损伤区域胶原网络受损，使得软骨靶向纳米颗粒更容易穿透，从而更好地发挥T1增强效果，因此，该软骨靶向纳米颗粒尤其适用于骨关节炎软骨损伤的有效早期诊断。
本发明还提供上述的软骨靶向纳米颗粒在软骨造影中的应用。
本发明提供的软骨靶向纳米颗粒中，Mn基纳米颗粒本身具有减少水分子的纵向弛豫时间(T1)，从而达到T1增强的作用，将亲水聚合物羧甲基壳聚糖与MnOx通过原位氧化还原反应结合，增强了Mn离子的亲水性，从而进一步减少了水分子的T1，提高纵向弛豫率，达到优化T1增强的成像效果，且该软骨靶向纳米颗粒对软骨亲和力高，能够更好地应用于软骨造影中。
本发明还提供上述的软骨靶向纳米颗粒在制备具有治疗骨关节炎功效的药物中的应用。
本发明提供的软骨靶向纳米颗粒具有良好的软骨保护和促进骨间充质干细胞的软骨形成的作用，减少软骨基质降解，在体外细胞水平和体内动物模型验证中对骨关节炎表现出有效治疗效果。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。如无特殊说明，以下实验中所使用的试剂均来自于市售，操作方法均为现有的常规操作方法。
1.实验材料
(1)实验细胞
BMSCs细胞：购自赛业(广州)生物科技有限公司；
L929细胞：购自ATCC细胞库；
MC3T3-E1细胞：购自中科院细胞库；
HUVECs细胞：购自上海中乔新舟生物科技有限公司；
(2)实验动物
实验所用大鼠由南方医科大学实验动物中心提供。
2.实验仪器
3.0T MR扫描仪：Ingenia,Philip Healthcare,Best,Netherlands；
7.0T动物磁共振成像扫描仪：PharmaScan70/16US，Bruker BioSpin MRI GmbH，Germany。
实施例1
本实施例提供一种软骨靶向纳米颗粒，其制备方法如下：
(1)制备WY-CMC偶联物
采用标准固相法合成II型胶原靶向肽(序列为WYRGRL，称为靶向肽WY)，并在靶向肽WY的c端添加了一个富含羧基的连接体(EEE)；
将靶向肽WY与CMC按质量比1:50混合，加入偶联试剂EDC·HCl(2mg)和NHS(4mg)得到悬浮液，将悬浮液于5mL超纯去离子水中溶解混匀后，置于冰上避光搅拌反应8h，靶向肽WY中的羧基被EDC活化，然后NHS将靶向肽WY与CMC中的氨基偶联；
反应结束后，透析产物(透析截留分子量为100000d，温度为4℃，透析时间为24h)，冻干(产物于-80℃冰箱预冻24h，再移至冻干机于0Pa、-55℃条件下冻干24h)，得到WY-CMC偶联物。
(2)制备WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒
取步骤(1)得到的WY-CMC偶联物50mg溶于无菌去离子水中，加入KMnO4，其中靶向肽WY、CMC、KMnO4的质量比为1:50:7.5，所得混合物置于冰上(0℃)搅拌反应2h，溶液由紫色变为深棕色，透析产物(透析截留分子量为100000d，温度为4℃，透析时间为24h)，冻干(产物于-80℃冰箱预冻24h，再移至冻干机于0Pa、-55℃条件下冻干24h)，得到WY-CMC-MnOxNPs纳米颗粒，即软骨靶向纳米颗粒。
实施例2理化表征
(1)采用透射电子显微镜观察WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的粒子形态(见图2)，结果表明成功合成了形状均匀、分布良好的WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒，粒径约为2nm，其晶格间距为
Figure BDA0003552514460000091
符合MnO2(XRD标准卡片PDF#44-0992)的特征。
(2)采用X射线光电子能谱对WY-CMC-MnOx NPs进行分析(见图3)，结果显示WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒Mn2p对应Mn2+(MnO)、Mn3+(Mn2O3)和Mn4+(MnO2)，说明纳米颗粒中的Mn为多价态，以Mn4+为主。
实施例3 WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的T1加权磁共振成像研究
(1)用ddH2O稀释WY-CMC-MnOx纳米颗粒，得到不同Mn浓度(3mM、1.5mM、0.8mM、0.4mM和0.2mM)的纳米颗粒溶液，分别置于2mL离心管内，各管按浓度梯度放置在塑料试管架上。
(2)使用3.0T MR扫描仪及16通道头线圈进行T1 mapping序列扫描。从T1 mapping图像中提取平均T1松弛时间，计算上述纳米颗粒溶液的1/T1。T1mapping序列扫描参数如下：反转时间＝54-4465ms，回波时间(TE)＝1.7ms，重复时间(TR)＝5ms，矩阵维度＝168×160×3层，激励次数＝4，回波链长度＝16。r1弛豫率是通过线性拟合1/T1与纳米颗粒溶液中Mn浓度的关系来计算的，将WY-CMC-MnOx纳米颗粒溶液中Mn浓度和相应的1/T1作散点图。
结果表明，软骨靶向纳米颗粒增强了T1-MRI成像信号，且增强程度随Mn浓度的增加而增加(见图4A)，线性回归方程为Y＝1.725*X+0.4869(R2＝0.9963)，其T1弛豫率为1.72mM-1·s-1(见图4B)。
实施例4 OA大鼠膝关节注射WY-CMC-MnOx的MRI成像研究
(1)按标准方法建立内侧半月板失稳大鼠OA模型。术后6周，于OA大鼠膝关节腔注射WY-CMC-MnOx纳米颗粒溶液(100μL，2.5mg/kg)。
(2)在纳米颗粒溶液注射前和注射后24小时分别进行磁共振扫描，磁共振扫描使用7.0T动物磁共振成像扫描仪，配备86毫米内径的容积线圈和鼠头表面接收线圈。采集矢状面脂肪饱和T1加权图像，参数如下：TR＝867.5ms，TE＝6.5ms，视场＝22×32mm，层厚＝0.7mm，矩阵尺寸＝184×266×16层，像素带宽＝1050，采集时间＝3min，59s。
结果显示(见图5)，在注射纳米颗粒溶液前，T1非增强MRI图像中很难观察到关节软骨，相比之下，注射纳米颗粒后24小时，受损软骨部位的信号强度明显增强(如图5中的箭头处所示)。
实施例5 WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒的细胞毒性研究
分别将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与系列浓度(500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL和0μg/mL)的WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒溶液共培养24h，使用标准CCK-8方法评估细胞活性。
结果显示(见图6)，WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒对细胞没有明显的细胞毒性，生物安全性较好。
实施例6 WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒对间充质干细胞软骨分化基因转录的促进作用研究
(1)将WY-CMC-MnOx纳米颗粒与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，使用软骨诱导液诱导7天；其中采用赛业(Cyagen)公司软骨诱导培养基，细胞培养为500uL体系，软骨球诱导为2mL体系，均为37℃、5％CO2常规培养。
(2)采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测软骨分化基因SOX9、Aggrecan(ACAN)和COL2的转录水平。
结果显示(见图7)，将WY-CMC-MnOx纳米颗粒与大鼠骨髓间充质干细胞共培养后，间充质干细胞中的软骨分化基因SOX9、Aggrecan(ACAN)和COL2的转录水平均上调。
实施例7 WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒对间充质干细胞软骨分化蛋白表达的促进作用
(1)Control组：使用软骨诱导液将大鼠骨髓间充质干细胞诱导培养14天(不添加纳米颗粒)；
实验组：将WY-CMC-MnOx纳米颗粒与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，使用软骨诱导液诱导14天。
采用阿利新蓝染色法观察间充质干细胞中糖胺聚糖形成情况。
结果显示(见图8A)，与Control组相比，将WY-CMC-MnOx纳米颗粒与大鼠骨髓间充质干细胞共培养的实验组中阿利新蓝染色更深，说明糖胺聚糖合成更多。
(2)Control组：使用软骨诱导液将大鼠骨髓间充质干细胞培养21天诱导形成软骨细胞球(不添加纳米颗粒)；
实验组：将WY-CMC-MnOx纳米颗粒与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，使用软骨诱导液诱导21天形成软骨细胞球。
制作石蜡切片，进行COL2免疫组化染色，采用正置显微镜观察切片染色情况。
结果显示(见图8B)，与Control组相比，将与WY-CMC-MnOx纳米颗粒共培养的大鼠骨髓间充质干细胞COL2染色更深，软骨分化蛋白表达更高。
实施例8 WY-CMC-MnOx NPs纳米颗粒对OA大鼠的治疗和软骨修复作用研究
(1)按标准方法建立内侧半月板失稳大鼠OA模型。
实验组：术后6周，于OA大鼠膝关节内注射WY-CMC-MnOx纳米颗粒溶液(100μL，2.5mg/kg)；
PBS对照组：术后6周，于OA大鼠膝关节内注射生理盐水(100μL)；
Sham组：仅切开皮肤、关节囊后缝合伤口，不造成半月板失稳，术后不予处理(即正常对照组)。
(2)各组均每两周注射1次，共3次。治疗6周后处死大鼠，取膝关节样品固定、脱钙，制作石蜡切片。
(3)进行番红O-固绿染色、骨关节炎评分(OARSI评分)。
番红O-固绿染色结果显示(见图9A)，PBS对照组的大鼠关节软骨破坏明显(如图9A箭头处所示)，而实验组采用WY-CMC-MnOx纳米颗粒治疗后，大鼠膝关节软骨磨损明显减轻。
OARSI评分结果显示(见图9B)，实验组采用WY-CMC-MnOx纳米颗粒治疗后OARSI评分较PBS对照组明显下降，说明软骨靶向纳米颗粒减轻了OA关节软骨损伤。
综上研究结果显示，本发明提供的软骨靶向纳米颗粒具有超小的尺寸和软骨靶向肽的引导的特点，可以主动穿透关节软骨致密的胶原网络，而早期关节软骨损伤区域胶原网络受损，纳米颗粒则更容易穿透，从而产生明显的T1增强效果，细胞毒性试验表明其具有较好的生物安全性，并且在进一步的体外细胞水平和体内动物模型验证中对骨关节炎表现出有效治疗效果，具有良好的软骨保护和促进骨间充质干细胞的软骨形成的作用，减少软骨基质降解。本发明提供的软骨靶向纳米颗粒可适用于早期骨关节炎软骨病变的诊断与治疗。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南方医科大学珠江医院
<120> 软骨靶向纳米颗粒及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Tyr Arg Gly Arg Leu
1 5

Claims (10)

1.一种软骨靶向纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将II型胶原靶向肽与羧甲基壳聚糖偶联，制备II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物；
将所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾反应，制备所述软骨靶向纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖以及高锰酸钾的质量比为1:(49～51):(7～8)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述II型胶原靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述II型胶原靶向肽、羧甲基壳聚糖和偶联试剂混合，于0℃～5℃避光反应7h～9h，透析，冻干，制备所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物；
将所述II型胶原靶向肽-羧甲基壳聚糖偶联物与高锰酸钾混合，于0℃～5℃反应1h～3h，透析，冻干，制备所述软骨靶向纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述偶联试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，透析步骤包括如下条件：透析截留分子量为10000d～100000d，温度为3℃～5℃，透析时间为24h～48h。
7.一种软骨靶向纳米颗粒，其特征在于，通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的软骨靶向纳米颗粒，其特征在于，所述软骨靶向纳米颗粒的粒径为2nm～5nm。
9.权利要求7～8任一项所述的软骨靶向纳米颗粒在制备软骨造影剂中的应用。
10.权利要求7～8任一项所述的软骨靶向纳米颗粒在制备具有治疗骨关节炎功效的药物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200060666A (ko) * 2018-11-22 2020-06-01 광주과학기술원 플라그 표적화 펩타이드 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200060666A (ko) * 2018-11-22 2020-06-01 광주과학기술원 플라그 표적화 펩타이드 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 플라그 표적화 나노전달체
CN114146191A (zh) * 2021-12-03 2022-03-08 南京创复捷医疗科技有限公司 一种基于ii型胶原靶向肽的有机无机杂化金纳米颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cartilage-targeting peptide-modified dual-drug delivery nanoplatform with NIR laser response for osteoarthritis therapy;Song Xue等;《Bioactive Materials》;第6卷;2372–2389 *
Manganese dioxide nanoparticles protect cartilage from inflammationinduced oxidative stress;Shreedevi Kumar等;《Biomaterials》;第224卷;119467 *

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