KR20200055808A - 항원-특이적 t 세포 식별, 농축, 및/또는 증식을 위한 시약 및 방법 - Google Patents

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Abstract

비처리 T 세포를 포함한, 그리고 희귀 전구체 세포를 포함한 항원-특이적 T 세포는 배양액에서 농축되고 증식된다. 농축 및 증식은 입양성 전이(adoptive transfer)에 의해 더욱 효과적인 면역요법을 위한 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라, 후보 펩티드 항원의 라이브러리로 T 세포 반응성을 측정함에 의해 개인화 면역요법을 위한 플랫폼을 제공한다.

Description

항원-특이적 T 세포 식별, 농축, 및/또는 증식을 위한 시약 및 방법 {REAGENTS AND METHODS FOR IDENTIFYING, ENRICHING, AND/OR EXPANDING ANTIGEN-SPECIFIC T CELLS}
본 출원의 주제는 면역요법에 관한 것이고, 2014년 3월 13일 출원된 PCT/US2014/25889 (이들의 내용은 참고로 편입됨)에 개시된 주제에 관련된다.
항원-특이적 T 세포의 증식은, 겨우 백만분의 1일 수 있는, 항원-특이적 비처리 전구체의 희귀성에 의해 복잡해진다. 입양성 요법에 대하여 요구된 다수의 종양-특이적 T 세포 (예를 들어)를 생성하기 위해, 림프구는 수주에 걸쳐 항원으로 종래 자극되고, 종종 그 다음 T 세포 선택되고 노동 집약적 공정에서 하위-클로닝된다.
양쪽 치료적 및 진단적 목적을 위하여, 비처리 전구체 유래의 항원-특이적 T 세포의 다수로, 그리고 고빈도로 빠르게 생성할 수 있는, 또는 후보 펩티드 항원에 대한 T 세포 반응을 빠르게 식별할 수 있는 기술이 필요하다.
발명의 요약
다양한 측면에서, 본 발명은, 비처리 T 세포 유래의 것을 포함하는, 및 전구체 세포 유래의 것을 포함하는, 배양액에서 항원-특이적 T 세포의 급속 농축 및 증식을 제공한다. 본 발명은 이로써 (예를 들면, 입양성 전이(adoptive transfer)에 의해) 더 효과적인 면역요법을 위한 플랫폼을 제공한다. 본 발명은 추가로 환자 림프구 유래의 항원-특이적 T 세포 반응을 빠르게 식별하기 위한 플랫폼, 및 후보 펩티드 항원의 라이브러리에 대해 T 세포 반응성 측정에 의해 개인화 면역요법을 위한 플랫폼을 제공한다.
본 발명은, 면역 세포, 예컨대 항원-특이적 T 림프구에 대한 자극 신호, 예컨대 CTL을 포착 및 전달하는, 나노-스케일 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 다양한 구현예에서 사용한다. aAPC 상에서 존재하는 신호는, 다수의 조직적합성 복합체 (MHC) (클래스 I 또는 클래스 II)의 맥락에서 존재한 항원성 펩티드인, 신호 1; 및 T 세포 반응을 조절하는 하나 이상의 공자극 리간드인, 신호 2를 포함할 수 있다. 신호 2는 일부 구현예에서 CD28에 결합하고 이를 통해 활성화하는 리간드이다. 다양한 구현예에서, 입자 물질은 상자성이고 바람직하게는 생체적합성, 예컨대 덱스트란-코팅된 산화철 입자이다. 상자성 입자는 자기장의 적용에 의해 자성 포착 또는 "농축", 뿐만 아니라 자기장의 적용에 의해 또한 향상되는, 농축된 세포 분획 내서 항원-특이적 림프구의 활성화 및 후속의 증식을 허용한다.
일부 측면에서, 본 발명은 항원-특이적 T-세포 집단의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 유래의 T-세포를 포함한 샘플 제공을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 환자는 항원-특이적 T-세포의 입양성 전이를 필요로 한다. 상기 샘플은 PBMC 샘플, 또는 백혈구분반술에 의해 수득된 샘플일 수 있다. 상기 샘플은 해당 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및/또는 비처리 T 세포에 대해 농축될 수 있다. T 세포를 함유한 샘플은 해당 질환 (예를 들면, 종양-유형)에 대해 공통인 항원을 제시하는, 및/또는 개인화된 근거로 선택된 하나 이상의 항원을 제시하는 상자성 aAPC의 집단 내에서 접촉된다. 특정 구현예에서, 각 aAPC 비드는 단일 항원을 제시하고, 상이한 항원을 각각 나타내는 aAPC 비드의 칵테일은 농축/증식을 위해 사용된다. 상자성 특성은 가까이에 자석을 배치시킴으로써 항원-특이적 T-세포를 위한 샘플을 포착 또는 "농축"시키기 위해, 이로써 비-관련 세포 유래의 aAPC-관련 세포를 분리시키기 위해 사용된다. 회수된 T-세포는 aAPC를 갖는 배양액에 의해 시험관내 증식될 수 있고, 항원-특이적 세포의 증식은 자기장의 존재에 의해 추가로 향상된다. 농축 및 증식 공정은 항원-특이적 세포의 최적 증식 (및 추가로 순도)를 위하여 1회 이상 반복될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 항원-특이적 T 세포의 약 1000-10,000 배 증식 (또는 초과)를 제공하고, 약 108 초과 항원-특이적 T 세포는, 예를 들어, 1-3 주의 기간에서 생성된다. 수득한 세포는 질환을 치료하기 위해 환자에 투여될 수 있다. 항원-특이적 빈도가 전이 이후 최적 증식을 위하여 독립적으로 중요한 파라미터인 것은, 부적절한, 공-전이된 세포 유래의 성장 신호에 대한 경쟁이 해당 항-종양 T 세포의 항상성 증식을 유의미하게 약화시킬 수 있기 때문이다.
추가의 다른 측면에서, 본 발명은 개인화된 근거로 T 세포 항원의 선택 방법을 제공한다. 예를 들어, 후보 항원성 펩티드를 각각 나타내는 aAPC의 어레이 또는 라이브러리는 대상체 또는 환자 유래의 T 세포로 스크리닝되고, 각 aAPC-펩티드에 대한 T 세포의 반응은 측정 또는 정량화된다. T 세포 반응은, 예를 들어, 사이토카인 발현 또는 T 세포 활성화의 다른 대리 마커의 발현에 의해 정량화될 수 있다. 예시적 검정 플랫폼은 면역화학, 예컨대 ELISA, 또는 예를 들면, RT-PCR에 의한 발현된 유전자의 증폭을 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포 활성화는 T 세포 활성화, 예컨대 칼슘 신호전달을 나타내는 세포내 신호전달 이벤트 측정으로 정량화된다. 상기 검정은 당해 기술에서 공지된 임의의 다양한 비색 검정을 사용할 수 있다.
가장 강력한 반응을 보여주는 펩티드 항원은, 항원-특이적 T 세포의 농축 및 증식을 통해 달성될 수 있는, 입양성 면역요법을 일부 구현예에서 포함하는, 면역요법을 위하여 선택된다. 일부 구현예에서, 및 특히 암 면역요법에 대하여, 환자의 종양은 유전자 상으로 분석되고, 종양 항원은 환자의 독특한 종양 돌연변이 서명으로부터 예상된다. 이들 예상된 항원 ("신생항원")은 aAPC 플랫폼을 이용하여 환자의 T 세포에 대해 합성 및 스크리닝된다. 반응성 항원이 식별/확정되면, aAPC는 본원에서 기재된 프로토콜 농축 및 증식을 위하여 제조될 수 있거나, 또는 일부 구현예에서 aAPC는 환자에 직접적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자 또는 대상체의 T 세포는, 각각 상이한 후보 펩티드 항원을 나타내는, 상자성 aAPC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 상기 스크린은 대상체 또는 환자의 T 세포 레퍼토리에 관한 풍부한 정보를 제공할 수 있고, 그 결과는 진단적 또는 예후적 목적에 유용하다. 예를 들어, 돌연변이된 단백질, 과발현된 단백질, 및/또는 다른 종양-관련 항원에 대한 T 세포 항-종양 반응의 수 및 동일성은 위험을 계층화하기 위한, 면역요법의 효능을 모니터링하기 위한, 또는 면역요법 치료의 결과를 예측하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 추가로, 상기 T 세포 반응의 수 또는 세기는 질환 진행의 위험에 반비례할 수 있거나 또는 화학요법에 내성 또는 비-반응성을 예측할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체의 또는 환자의 T 세포는 후보 펩티드 항원을 각각 제시하는 나노-APC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝되고, T 세포 반응의 존재, 또는 이들 T 세포 반응의 수 또는 세기는, 예를 들어, 자가면역 질환의 식별, 또는 환자가 하위-임상 종양을 갖는지를 식별에 의해 환자의 건강에 관한 정보를 제공한다. 상기 구현예에서, 공정은 잠재적 질환 상태를 식별할 뿐만 아니라, 질환 생물학의 초기 이해를 제공한다.
본 발명은 이로써, 암, 자가면역 질환, 및 생체외 항원-특이적 면역 세포의 검출, 농축, 활성화, 및/또는 증식이 치료적으로 또는 진단적으로 바람직한 다른 질환을 포함하여, 수많은 T 세포-관련된 질환 또는 증상에서 진단적 및 치료적 진전을 제공한다.
본 발명의 추가 측면 및 구현예는 하기 상세한 설명에 기반하여 숙련가에 명백할 것이다.
도 1A-B는 항원-특이적 T 세포의 농축 및 증식을 위한 구현예의 도식을 나타낸다. 나노스케일 인공 항원 제시 세포 (나노-aAPC)의 구현예 (도 1A)는 50-100 nm 철-덱스트란 나노입자에 MHC-Ig 이량체 (신호 1) 및 공자극 항-CD28 항체 (신호 2)의 커플링에 의해 합성된다. 자성 농축의 도식 (도 1B). 나노-aAPC에 결합된 항원-특이적 CD8+ T 세포는 "농축" 단계에서 자성 칼럼으로 유지되고, 반면에 비-동족 세포는 덜 결합될 것 같다. 농축된 T 세포는 그 다음 나노-aAPC에 의해 활성화되고 "증식" 단계에서 증식한다.
도 2A-2C. 항원-특이적 T 세포의 나노-aAPC-매개된 농축. (도 2A) 나노-aAPC는 천-배 더 많은 다클론성, Thy1.2+ B6 비장세포의 풀 유래의 동족, Thy1.1+ pmel 세포의 항원-특이적 농축을 매개한다. 나노-aAPC의 양 증가와 함께 (도 2A)에서와 같이 수행된 pmel 농축 이후 회수된 항원-특이적 세포 빈도 및 퍼센트 세포의 요약 (도 2B). 나노-aAPC (최상부)에 의한 내인성 Db-gp100 비장세포의 농축 (도 2C). 비-동족 Kb-Trp2 세포의 빈도는 농축 (최하부)이후 증가하지 않는다.
도 3A-3G. 농축 이후 항원-특이적 T 세포의 증식. 증식에 관한 농축의 효과를 평가하기 위해 사용된 세포 분획의 도식 (도 3A). 입자-결합된 항원-특이적 T 세포는 자성 칼럼 (양성 분획)에서 포착되고, 반면에 미결합된 세포는 통과한다 (음성 분획). 음성 분획은 농축 (양성+음성)의 효과를 제거하기 위해 양성 분획에 역으로 부가될 수 있다. 항원-특이적 세포의 증가된 빈도 (도 3B)는 Kb-Trp2 나노-aAPC를 이용한 농축의 결과로서 배양의 7일 이후 생성하였다. 음성 (좌측), 양성 (중간) 및 양성+음성 (우측) 분획은 7일 동안 배양되었고, 그 다음 동족 Kb-Trp2 (최상부) 및 대조 Kb-SIINF (최하부) 이량체로 염색되었다. 세포가 농축된 경우 (도 3C) 10-15 배가 Kb-Trp2 세포의 빈도 (*, t-시험에 의해 p<0.001)에서 증가한다. 동족 나노-aAPC로 농축 이후 Db-gp100, Kb-SIINF, 및 Ld-A5 나노-aAPC 증식 7 일의 대표적인 FACS 작도 (도 3D). 지시된 나노-aAPC로 농축 및 활성화 이후 퍼센트 항원-특이적 세포 (좌측) 및 총 항원 특이적 세포 (우측)의 요약 (도 3E). (도 3F) 3개 항원 (Db-gp100, Kb-SIINF, Kb-Trp2)은 동시에 농축 및 증식하였다. 동일한 T 세포 배양액 유래의 각 항원에 대한 항원-특이성의 대표적인 FACS 작도. 개별적으로 또는 함께 농축 및 증식된 경우 3개 지시된 항원에 대하여 생성된 항원-특이성 (좌측) 및 총 항원-특이적 세포 (우측)의 비교 (도 3G).
도 4A-4D: 농축된 및 증식된 T 세포의 입양성 전이가 종양 거부를 매개한다. 입양성 전이 이후 증식에 관한 림프구고갈 및 감소된 방관자 경쟁의 효과 (도 4A). B6 마우스는 106 또는 107 부적절 B6 세포의 존재하에 105 pmel T 세포의 입양성 전이에 앞서 1일 500 cGy 감마 방사선으로 림프구감손되었거나 또는 미처리되었다. 소수의 방관자 세포의 양쪽 림프구고갈 및 투여는 비장 및 림프절로부터 회수된 pmel T 세포의 빈도 (2-방식 ANOVA으로 p<0.01)를 증가시켰다. Thy1.1+ pmel 세포의 총 수 (도 4B)는 (도 4A)에서 회수하였다. 입양성 전이에 앞서 7 일 동안 배양된 Kb-Trp2 및 Db-gp100 농축된+증식된 림프구 (도 4C)는 흑색종 성장 (2-방식 ANOVA로 p<0.01, 8 마우스/그룹)을 저해하였다. 마우스는 8 일 먼저 피하 흑색종으로 주사되었고 1 일 먼저 500 cGy 감마 조사로 조사되었다. 비-동족 농축된 및 증식된 림프구 (SIINF)는 (미처리와 비교된) 종양 성장을 저해하지 않았고, 반면에 동족 농축된 및 증식된 (Trp2+gp100)는 저해하였다. (도 4C)로부터 동물의 생존 (도 4D). 2/8 마우스는 Kb-Trp2 및 Db-gp100 처리된 그룹에서 종양의 완벽한 거부를 보여주었고, 이는 비-동족 및 비처리된 그룹에 비교된 유의미하게 더 긴 생존 (Mantel-Cox으로 p<0.01)을 가졌다
도 5A-5B: 인간 항-종양 반응의 증식. CD8+ PBMCs는 건강한 공여자로부터 단리되었고 1 주 동안 농축 및 증식 프로토콜을 이용하여 증식되었다. CD8 단리 (일 0, 좌측) 직후 및 농축 및 증식의 1 주 (일 7, 우측) 후 A2-NY-ESO1 (최상부) 및 A2-MART1 (최하부) 특이적 세포의 대표적인 염색 및 빈도 (도 5A). 지시된 나노-aAPC로 농축/증식 이후 퍼센트 항원-특이적 세포 빈도 (최상부) 및 총 항원 특이적 세포 (최하부)의 요약 (도 5B). 상이한 공여자를 이용한 3개 실험으로부터 유도된 결과.
도 6A-6C: 신생-에피토프 증식. B16 및 CT26 무토메(mutome)에 대한 후보 펩티드 발생 공정의 도식 (도 6A). 17-mer 서열 주위의 단일-염기쌍 치환 (SBS)은 MHCNet 예측 알고리즘에 의한 MHC 결합에 대하여 평가된다. 세포의 대표적인 결합 (도 6B)은 동족 (최상부) 및 비-동족 (최하부) MHC에 대한 신생-에피토프에 대하여 7일 동안 나노-aAPC E+E로 증식시켰다. E+E 이후 1 주에서 수득된 도 (6C) 총 신생-에피토프 특이적 세포.
도 7A-7C: 마이크로-aAPC는 항원-특이적 농축에 대하여 유효하지 않다. 결합된 비드의 형광성 표지화를 특징으로 하는, 동족 pMEL (적색) 또는 비-동족 2C (청색) CD8+ T 세포에 대한 마이크로- (최상부) 및 나노- (최하부) aAPC의 결합 (도 7A). 비드 (회색) 배경은 대조로서 보여지지 않는다. (도 7B) 마이크로-aAPC는 동족 세포를 농축시키지 않는다. Thy1.1+ pmel 세포는 다클론성, Thy1.2+ B6 비장세포를 이용하여 1:1000 비율로 항온처리되었고, 농축은 Db-GP100 극미립자를 이용하여 시도되었다. Thy1.1+ 세포의 빈도는 농축 이후 유의미하게 증가시키지 않았다. 마이크로-aAPC의 양 증가와 함께 (도 7C에서와 같이 수행된, 회수된 세포의 항원-특이적 세포 빈도 및 퍼센트 (도 7C)
입양성 면역요법은, 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해 환자에 전이된 수득한 세포로의, 생체외 면역 세포의 활성화 및 증식을 포함한다. 희귀한 전구체 세포 유래의 것을 포함하여, 활성화된 및 항원-특이적 CTL의 충분한 수 및 빈도가 상대적으로 단시간에서 생성될 수 있으면, 예를 들어, 입양성 전이를 통해, 항원-특이적 세포독성 (CD8+) 림프구 (CTL) 반응의 유도는 매력적인 요법이 될 수 있다. 상기 접근법은 일부 구현예에서 질환의 재발을 예방하는 장기 기억까지 생성할 수 있다. 암 면역요법, 및 CTL를 포함한 면역요법에 더하여, 본 발명은, CD4+ T 세포 및 조절 T 세포를 포함하여, 다른 면역 세포와 함께 사용을 찾아내고, 따라서, 다른 것 중에서, 감염성 질환 및 자가-면역 질환용 면역요법에 광범위하게 적용가능하다.
하나의 측면에서, 본 발명은, 면역 효과기 세포, 예컨대 항원-특이적 T 림프구, 예컨대 CTL에 자극 신호를 포착 및 전달하는, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 aAPC는 입양성 면역요법을 위한 강력한 도구를 제공한다. T 세포 활성화를 지지하는 aAPC 상에서 제시한 신호는 다수의 조직적합성 복합체 (MHC), 클래스 I 또는 클래스 II의 맥락에서 제시하는, 및 항원-특이적 T-세포 수용체 (TCR)를 결합하는 항원성 펩티드인, 신호 1; 및 T 세포 반응을 조절하는 하나 이상의 공자극 리간드인, 신호 2를 포함한다. 상기 시스템의 일부 구현예에서, 신호 1은 단량체성, 이량체성 또는 다량체성 MHC 작제물에 의해 부여된다. 이량체성 작제물은 면역글로불린 중쇄 서열의 가변 영역 또는 CH1 영역에 융합으로 일부 구현예에서 창출된다. MHC 복합체는 하나 이상의 항원성 펩티드로 부하되고, 신호 2는 B7.1 (T 세포 수용체 CD28에 대한 천연 리간드) 또는 CD28에 대한 활성화 항체이다. 양쪽 리간드는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 창출하기 위해 마이크로스케일 (4.5 μm) 또는 나노스케일 비드의 표면에 직접적으로 화학적으로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 입자 물질은 상자성이고, 자기장의 적용으로 자성 포착 또는 "농축", 뿐만 아니라 농축된 세포 분획 내에 항원-특이적 림프구의 후속의 증식을 허용하고, 또한 자기장의 적용으로 향상된다. 다른 구현예에서, 상자성 특성은, 시험관내 수분 내지 수시간 내에 검출될 수 있는, 심지어 비처리 세포 유래의, 급속 T 세포 반응 (예를 들면, 활성화)을 지지한다.
일부 측면에서, 본 발명은 입양성 전이를 위한 항원-특이적 T-세포 집단의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 유래의 T-세포를 포함한 샘플 제공을 포함하고, 여기에서 환자는 항원-특이적 T-세포의 입양성 전이가 필요하다. T 세포, 또는 T 세포를 함유한 샘플은 본원에서 상세히 기재된 바와 같이 상자성 aAPC의 집단과 접촉되고, 각각의 이들은 MHC (클래스 I 또는 II)의 맥락에서 해당 펩티드 항원을 제시하고, 이로써 (드물게 나타나는 비처리 항원-특이적 세포를 포함한) 샘플에서 항원-특이적 T-세포를 결합한다. aAPC는 해당 질환 (예를 들면, 종양-유형)에 공통인 항원을 제시할 수 있거나, 또는 개인화된 근거로 선택된 하나 이상의 항원을 제시할 수 있다. 상자성 특성은, 예를 들어, 비-관련 세포 유래의 aAPC-관련 세포를 분리시키기 위해 자석을 이용함으로써, 항원-특이적 T-세포용 샘플을 포착 또는 "농축"시키기 위해 사용될 수 있다. 회수된 T-세포, 예를 들어, 상자성 aAPC 입자와 관련되어 남아있는 것은, aAPC의 존재하에 시험관내 증식될 수 있고, 항원-특이적 세포의 증식은 자기장의 존재에 의해 추가로 향상된다. 이론에 의한 구속됨 없이, 항원-특이적 T 세포에 결합된 상자성 aAPC가 자기장의 존재하에 T 세포 수용체 클러스터링을 용이하게 할 것이라고 여겨진다. 증식 단계는 일부 구현예에서 약 3 일 내지 약 2 주, 또는 약 5 일 내지 약 10 일 (예를 들면, 약 1 주) 계속할 수 있다. 농축 및 증식 공정은 그 다음 항원-특이적 세포의 최적 증식 (및 추가 순도)를 위하여 1회 이상 반복될 수 있다. 농축 및 증식의 후속의 순회를 위하여, 추가의 aAPC는 샘플내 더 큰 항원-특이적 T 세포 집단의 증식을 지지하기 위해 T 세포에 부가될 수 있다. 특정 구현예에서, 증식의 최종 순회 (예를 들면, 순회 2, 3, 4, 또는 5)는 생체내 발생하고, 여기에서 생체적합성 나노 APC가 증식된 T 세포 집단에 부가되고, 그 다음 환자에 주입된다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 항원-특이적 T 세포의 약 1000-10,000 배 증식 (또는 초과)를 제공하고, 약 108 초과 항원-특이적 T 세포는, 예를 들어, 약 1 개월 미만, 또는 약 3 주 미만, 또는 약 2 주 미만의 기간에서, 또는 약 1 주에서 생성된다. 수득한 세포는 질환을 치료하기 위해 환자에 투여될 수 있다. aAPC는 일부 구현예에서 수득한 항원-특이적 T 세포 제제와 함께 환자에 투여될 수 있다.
추가의 다른 측면에서, 본 발명은 개인화된 근거로 T 세포 항원의 선택 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 후보 항원성 펩티드를 각각 나타내는 aAPC의 어레이 또는 라이브러리는 대상체 또는 환자 유래의 (및 일부 구현예에서 자기장의 존재하에) T 세포로 스크리닝되고, 각 aAPC-펩티드에 대한 T 세포의 반응은 측정 또는 정량화된다. T 세포 반응은, 예를 들어, 사이토카인 발현 또는 T 세포 활성화의 다른 대리 마커의 발현 정량화로 (예를 들면, 예컨대 RT-PCR에 의한 발현된 유전자의 면역화학 또는 증폭으로) 일부 구현예에서 분자적으로 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 정량화 단계는 배양액에서 약 15 시간 내지 48 시간 사이에 수행된다. 다른 구현예에서, T 세포 반응은 세포내 신호전달 (예를 들면, Ca2+ 신호전달, 또는 T 세포 활성화 동안 초기에 발생하는 다른 신호전달)의 검출에 의해 측정되고, 따라서 나노-aAPC를 갖는 배양액의 약 15 분 내지 약 5 시간 이내 (예를 들면, 약 15 분 내지 약 2 시간 이내) 정량화될 수 있다. 가장 강력한 반응을 보이는 펩티드는, 일부 구현예에서 본원에서 기재된 입양성 면역요법 접근법을 포함하여, 면역요법으로 선택된다. 일부 구현예에서, 및 특히 암 면역요법을 위하여, 환자의 종양은 (예를 들면, 차세대 서열분석을 이용하여) 유전자 상으로 분석되고, 종양 항원은 환자의 독특한 종양 돌연변이 서명으로부터 예측된다. 이들 예측된 항원 ("신생항원")은 본원에서 기재된 aAPC 플랫폼을 이용하여 환자의 T 세포에 대해 합성 및 스크리닝된다. 반응성 항원이 식별/확정되면, aAPC는 본원에서 기재된 프로토콜 농축 및 증식을 위하여 제조될 수 있거나, 또는 aAPC는 일부 구현예에서 환자에 직접적으로 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 대상체 또는 환자의 T 세포는 (본원에서 기재된 바와 같이) 상자성 나노-aAPC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝되고, 여기에서 각 상자성 나노-aAPC는 펩티드 항원을 제시한다. 각각에 대한 T 세포 반응은 본원에서 기재된 바와 같이 측정 또는 정량화되고, 환자의 T 세포 레퍼토리에 관한 유용한 정보, 및 따라서 대상체 또는 환자의 상태를 제공한다.
예를 들어, 돌연변이된 단백질, 과발현된 단백질, 및/또는 다른 종양-관련 항원에 대한 T 세포 항-종양 반응의 수 및 동일성은 위험을 계층화하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있고, 일부 구현예에서 약물 내성 또는 약물 민감성에 대하여 반응 프로파일을 분류하기 위해, 또는 면역요법 (예를 들면, 관문 저해제 요법 또는 입양성 T 세포 전이 요법)에 대한 후보로서 반응 프로파일을 계층화하기 위해 컴퓨터-시행된 분류기 알고리즘을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 T 세포 반응의 수 또는 세기는 고위험의 질환 진행에 반비례할 수 있고/있거나, 면역요법에 환자의 유사 반응에 직접적으로 관련할 수 있고, 관문 저해제 요법, 입양성 T 세포 전이, 또는 암에 대한 다른 면역요법 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
추가의 다른 측면 및 구현예에서, 환자의 T 세포는, 후보 펩티드 항원을 각각 제시하는, 상자성 나노-APC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 어레이 또는 라이브러리는 종양-관련 항원을 제시할 수 있거나, 또는 다양한 감염성 질환에 관한 T 세포 항원을 제시할 수 있다. 환자의 T 세포로 어레이 또는 라이브러리를 항온처리시킴으로써, 및 T 세포 수용체 클러스터링을 촉진시키기 위한 자기장의 존재하에, T 세포 반응의 존재, 및/또는 이들 T 세포 반응의 수 또는 세기는 빠르게 측정될 수 있다. 상기 정보는, 예를 들어, 하위-임상 종양, 자가면역 또는 면역 질환, 또는 감염성 질환의 진단에 유용하고, 잠재적 병원성 또는 치료적 T 세포, T 세포 항원을 포함하는, 질환 생물학의 초기 이해, 및 약물 또는 면역요법 표적을 나타내는, 해당 T 세포 수용체의 이해를 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면의 다양한 대안적 구현예가 아래 상세히 기재된다.
본 발명은 생체외 항원-특이적 면역 세포의 검출, 농축 및/또는 증식이 치료적으로 또는 진단적으로 바람직한 암 및 다른 질환에 대한 면역요법을 제공한다. 본 발명은, 세포독성 T 림프구 (CTL), 헬퍼 T 세포, 및 조절 T 세포를 포함한, 항원-특이적 T 세포의 검출, 농축 및/또는 증식에 일반적으로 적용한다.
일부 구현예에서, 환자는 암 환자이다. 환자에 입양성 전이를 위한 생체외 항원-특이적 CTL의 농축 및 증식은 강력한 항-종양 면역 반응을 제공한다. 상기 방법에 따라 치료 또는 평가될 수 있는 암은 좋지 못한 면역 반응을 역사적으로 시인되지 않은 또는 높은 재발율을 갖는 암을 포함한다. 예시적 암은 암종, 육종, 및 림프종을 포함하여 고형 종양의 다양한 유형을 포함한다. 다양한 구현예에서 암은 하기이다: 흑색종 (전이성 흑색종 포함), 결장암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 도관암, 간암, 췌장암, 신장암, 자궁내막암, 고환암, 위암, 형성이상 경구 점막, 용종증, 두경부 암, 침습성 경구암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐암, 중피종, 과도기적 및 편평상피 세포 비뇨기 암종, 뇌암, 신경교세포종, 및 신경아교종. 일부 구현예에서, 암은 하기이다: 혈액 악성종양, 예컨대 만성 골수성 백혈병, 소아기 급성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병, 악성 피부 T-세포, 균상식 육종, 비-MF 피부 T-세포 림프종, 림프종양 구진증, T-세포 풍부 피부 림프양 과다형성, 및 원판성 홍반성 낭창.
다양한 구현예에서, 암은 I 기, II 기, III 기, 또는 IV 기이다. 일부 구현예에서, 암은 전이성 및/또는 재발성이다. 일부 구현예에서, 암은 전임상이고, 본원에서 기재된 스크리닝 시스템에서 검출된다 (예를 들면, 결장암, 췌장암, 또는 초기에 검출하기 어려운 다른 암).
일부 구현예에서, 환자는 감염성 질환을 갖는다. 감염성 질환은 환자에 입양성 전이를 위한 생체외 항원-특이적 면역 세포 (예컨대 CD8+ 또는 CD4+ T 세포)의 농축 및 증식이 생산적인 면역 반응을 향상 또는 제공할 수 있는 것일 수 있다. 치료될 수 있는 감염성 질환은 박테리아, 바이러스, 프리온, 진균, 기생충, 연충, 등에 의해 야기된 것을 포함한다. 상기 질환은 AIDS, 간염, CMV 감염, 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD)를 포함한다. CMV는, 예를 들어, 장기 이식 환자에서 발견되는 가장 흔한 바이러스 병원체이고 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받은 환자에서 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. 이는, 혈청양성 환자에서 잠재적 바이러스의 재활성화 또는 혈청음성 개인에서 기회 감염을 허용하는, 이들 환자의 면역저하된 상태 때문이다. 이들 치료에 유용한 대안은 이식 절차의 개시 이전 환자로부터 또는 적절한 공여자 유래의 유도된 바이러스-특이적 CTL의 생성을 포함한 예방적 면역치료적 레지멘이다. PTLD는 이식 환자의 유의미한 분획에서 발생하고 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV) 감염에서 비롯된다. EBV 감염은 미국내 성인 집단의 대략 90%에서 존재한다고 여겨진다. 활성 바이러스 복제 및 감염은 면역계에 의해 억제되지만, CMV의 사례에서와 같이, 이식 요법에 의해 면역저하된 개인은, 바이러스 재활성화를 허용하는, 통제 T 세포 집단을 상실한다. 이는 이식 프로토콜에 심각한 장애를 나타낸다. EBV는 다양한 혈액 및 비-혈액 암에서 종양 촉진에 또한 관여될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 자가면역 질환을 갖고, 여기에서 환자에 입양성 전이를 위한 생체외 조절 T 세포 (예를 들면, CD4+, CD25+, Foxp3+)의 농축 및 증식은 유해한 면역 반응을 둔화시킬 수 있다. 치료될 수 있는 자가면역 질환은 하기를 포함한다: 전신 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 크론 질환, 궤양성 대장염, 건선, 중증 근무력증, 굿파스처 증후군, 그레이브스 질환, 심상성 천포장, 애디슨 질환, 포진성 피부염, 셀리악병, 및 하시모토 갑상선염. 일부 구현예에서, 환자는 자가면역 질환 또는 면역 증상을 갖는 것 (예컨대 이전의 문장에서 기재된 것)으로 의심되고, 본원에서 기재된 바와 같이 상자성 나노-aAPC의 라이브러리에 대한 T 세포 반응의 평가는 면역 증상의 식별 또는 확정에 유용하다.
따라서, 다양한 구현예에서 본 발명은 항원-특이적 T 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구 (CTL), 헬퍼 T 세포, 또는 조절 T 세포의 농축 및 증식을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 항원-특이적 CTL의 농축 및 증식을 포함한다. 전구체 T 세포는 환자로부터 또는 적합한 HLA-매칭된 공여자로부터 수득될 수 있다. 전구체 T 세포는, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 및 종양을 포함하여, 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 환자 유래의 PBMC 샘플이다. 일부 구현예에서, PBMC 샘플은 해당 T 세포 집단, 예컨대 CD8+, CD4+ 또는 조절 T 세포를 단리시키기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 전구체 T 세포는 숙련가에 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 피콜 분리를 이용하여 대상체 유래의 수집된 혈액의 단위체로부터 수득된다. 예를 들어, 개체의 혈액 순환으로부터 전구체 T 세포는 분리반출법 또는 백혈구분반술에 의해 수득될 수 있다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T 세포 및 전구체 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵의 백색 혈액 세포, 적색 혈액 세포, 및 혈소판을 함유한다. 백혈구분반술은 백색 혈액 세포가 혈액의 샘플로부터 분리되는 실험실 절차이다.
분리반출법에 의해 수집된 세포는 후속의 가공 단계를 위하여 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 적절한 버퍼 또는 배지에서 세포를 배치시키기 위해 세정될 수 있다. 세정 단계는 당해 기술의 숙련가에 공지된 방법, 예컨대 제조자의 지침에 따른 반-자동화 "통과액" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서) 이용에 의해 달성될 수 있다. 세정 이후, 세포는 다양한 생체적합성 버퍼, 예컨대, 예를 들어, 무 Ca, 무 Mg PBS에서 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 배양 배지에서 재-현탁될 수 있다.
원한다면, 전구체 T 세포는 적혈구의 용해 및 단핵구의 고갈, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리될 수 있다.
원한다면, T 세포의 하위집단은 존재할 수 있는 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포, 예컨대 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 다른 농축 기술은 음성 자성 면역부착 또는 유세포측정, 예를 들면, 음성으로 선택된 세포에 존재한 세포 표면 마커에 유도된 단클론성 항체의 칵테일 이용을 통해 세포 세포 분급 및/또는 선택을 포함한다.
특정 구현예에서, 백혈구는 백혈구분반술에 의해 수집되고, 그 뒤에 공지된 공정, 예컨대 상업적으로 이용가능한 자성 농축 칼럼을 이용한 CD8+ T 세포에 대해 농축된다. CD8-농축된 세포는 그 다음 aAPC 시약을 갖는 자성 농축을 이용하여 항원-특이적 T 세포에 대해 농축된다. 다양한 구현예에서, 적어도 약 105, 또는 적어도 약 106, 또는 적어도 약 107 CD8-농축된 세포는 항원-특이적 T 세포 농축을 위하여 단리된다.
다양한 구현예에서, 면역 세포 (예를 들면, CD8+ T 세포)를 포함한 샘플은 자성 특성을 갖는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉된다. 상자성 물질은 자기장에 작은, 양성 민감성을 갖는다. 이들 물질은 자기장에 의해 유인되고 그 물질은 외부 장이 제거된 경우 자성 특성을 보유하지 않는다. 예시적 상자성 물질은, 비제한적으로, 마그네슘, 몰리브데늄, 리튬, 탄탈럼, 및 산화철을 포함한다. 자성 농축에 적합한 상자성 비드는 상업적으로 이용가능하다 (DYNABEADSTM, MACS MICROBEADSTM, Miltenyi Biotec). 일부 구현예에서, aAPC 입자는 철 덱스트란 비드 (예를 들면, 덱스트란-코팅된 철-산화물 비드)이다.
특정 구현예에서, aAPC는 적어도 2개 리간드, 항원 제시 복합체 (펩티드-MHC), 및 림프구 활성화 리간드를 함유한다.
항원 제시 복합체는, T 세포 또는 T 세포 전구체에 제시를 위한 항원을 잠복시킨, 항원 결합 천구를 포함한다. 항원 제시 복합체는, 예를 들어, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자일 수 있고, 이량체성 또는 다량체성 MHC를 제공하기 위해 연결될 또는 묶여질 수 있다. 일부 구현예에서, MHC는 단량체성이지만, 나노-입자 상에서 그의 밀접한 관련은 결합능 및 활성화에 충분하다. 일부 구현예에서, MHC는 이량체성이다. 이량체성 MHC 클래스 I 작제물은, 그 다음 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 (및 관련된 경쇄와) 관련되는, 면역글로불린 중쇄 서열에 융합에 의해 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 1 복합체는 비-고전적 MHC-유사 분자 예컨대 CD1 패밀리 (예를 들면, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, 및 CD1e)의 구성원이다. MHC 다량체는 펩티드 또는 화학 링커를 통한 직접적인 묶음에 의해 창출될 수 있거나, 또는 비오틴 모이어티를 통한 스트렙타비딘과 회합을 통해 다량체성일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 제시 복합체는, 면역글로불린 골격에 의해 제공된 안정성 및 분비 효율에 기반하여, 극도로 안정하고 생산하기 쉬운, 면역글로불린 서열과 융합을 포함한 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자 복합체이다.
면역글로불린 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자 복합체는 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 6,268,411 (이는 본 명세서에 참조로서 전체적으로 편입되어 있음). 이들 MHC 클래스 I 분자 복합체는 면역글로불린 중쇄의 말단에서 형태적으로 무손상 방식으로 형성될 수 있다. 항원성 펩티드가 결합되는 MHC 클래스 I 분자 복합체는 항원-특이적 림프구 수용체 (예를 들면, T 세포 수용체)에 안정되게 결합할 수 있다. 다양한 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 서열은 충분한 길이는 아니지만, Ig 힌지 영역, 및 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인의 하나 이상을 포함한다. Ig 서열은 가변 영역을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있지만, 가변 영역 서열이 존재하는 경우, 가변 영역은 전체 또는 부분일 수 있다. 복합체는 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함할 수 있다.
예시적 MHC 클래스 I 분자 복합체는 적어도 2개 융합 단백질을 포함한다. 제1 융합 단백질은 제1 MHC 클래스 I α 쇄 및 제1 면역글로불린 중쇄 (또는 힌지 영역을 포함한 이의 일부)를 포함하고, 제2 융합 단백질은 제2 MHC 클래스 I α 쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄 (또는 힌지 영역을 포함한 이의 일부)를 포함한다. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 회합하여 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성하고, 이는 2개 MHC 클래스 I 펩티드-결합 천구를 포함한다. 면역글로불린 중쇄는 IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2β, IgG2α, IgG4, IgE, 또는 IgA의 중쇄일 수 있다. 일부 구현예에서, IgG 중쇄는 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 다가 MHC 클래스 I 분자 복합체가 요구되면, IgM 또는 IgA 중쇄는 5가 또는 4가 분자, 각각을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
예시적 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E를 포함하고, 이들은 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 제시 복합체는 HLA-A2 리간드이다.
예시적 MHC 클래스 II 분자 복합체는, 그 전체가 이로써 참고로 편입되는, 미국 특허 6,458,354, 미국 특허 6,015,884, 미국 특허 6,140,113, 및 미국 특허 6,448,071에 기재된다. MHC 클래스 II 분자 복합체는 적어도 4개 융합 단백질을 포함한다. 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 (또는 힌지 영역을 포함한 이의 일부) 및 (ii) MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 (또는 이의 일부) 및 (ii) MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제1 및 2개의 제2 융합 단백질은 회합하여 MHC 클래스 II 분자 복합체를 형성한다. 각 제1 융합 단백질의 MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인 및 각 제2 융합 단백질의 MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인은 MHC 클래스 II 펩티드 결합 천구를 형성한다.
면역글로불린 중쇄는 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2β, IgG2α, IgG4, IgE, 또는 IgA의 중쇄일 수 있다. 일부 구현예에서, IgG1 중쇄는 2개 항원 결합 천구를 포함한 2가 분자 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 임의로, 중쇄의 가변 영역은 포함될 수 있다. IgM 또는 IgA 중쇄는 5가 또는 4가 분자 복합체, 각각을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
MHC 클래스 II 분자 복합체의 융합 단백질은 면역글로불린 쇄와 MHC 클래스 II 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에서 삽입된 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열의 길이는, 항원 결합 및 수용체 가교의 정도를 조정하기 위해 요구된 가요성에 따라, 다양할 수 있다.
면역글로불린 서열은 일부 구현예에서 인간화된 단클론성 항체 서열이다.
신호 2는 일반적으로 T 세포 영향 분자, 즉, 전구체 T 세포 또는 항원-특이적 T 세포 상에서 생물학적 효과를 갖는 분자이다. 상기 생물학적 효과는, 예를 들어, CTL, 헬퍼 T 세포 (예를 들면, Th1, Th2), 또는 조절 T 세포로 전구체 T 세포의 분화; 및/또는 T 세포의 증식을 포함한다. 따라서, T 세포 영향 분자는 T 세포 공자극 분자, 접착 분자, T 세포 성장 인자, 및 조절 T 세포 유발제 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, aAPC는 적어도 하나의 상기 리간드를 포함하고; 임의로, aAPC는 적어도 2개, 3개, 또는 4개의 상기 리간드를 포함한다.
특정 구현예에서, 신호 2는 T 세포 공자극 분자이다. T 세포 공자극 분자는 항원-특이적 T 세포의 활성화에 기여한다. 상기 분자는, 비제한적으로, CD28 (항체 포함), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BB, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT에 특이적으로 결합하는 분자, HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 분자 (신호 2)는 항체 (예를 들면, 단클론성 항체) 또는 이의 일부, 예컨대 F(ab')2, Fab, scFv, 또는 단쇄 항체, 또는 다른 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화된 단클론성 항체 또는 항원-결합 활성을 갖는 이의 일부이거나, 또는 완전히 인간 항체 또는 항원-결합 활성을 갖는 이의 일부이다.
나노-aAPC에 유용한 접착 분자는 T 세포 또는 T 세포 전구체에 나노-aAPC의 접착을 매개하기 위해 사용될 수 있다. 유용한 접착 분자는, 예를 들어, ICAM-1 및 LFA-3을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 1은 펩티드-HLA-A2 복합체에 의해 제공되고, 신호 2는 B7.1-Ig 또는 항-CD28에 의해 제공된다. 예시적 항-CD28 단클론성 항체는 9.3 mAb (Tan et al., J. Exp. Med. 1993 177:165)이고, 특정 구현예에서 인간화될 수 있고/있거나 완전히 무손상 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서 비드에 접합될 수 있다.
일부 구현예는, T 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 미치는, T 세포 성장 인자를 사용한다. T 세포 성장 인자의 예는 사이토카인 (예를 들면, 인터류킨, 인터페론) 및 초항원을 포함한다. 원한다면, 사이토카인은 융합 단백질을 포함한 분자 복합체에 존재할 수 있거나, 또는 aAPC에 의해 캡슐화될 수 있다. 특히 유용한 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 감마 인터페론, 및 CXCL10을 포함한다. 임의로, 사이토카인은 증식 단계 동안 배지 성분에 의해 단독으로 제공된다.
나노입자는 임의의 물질로 제조될 수 있고, 물질은 원하는 자성 특성에 대하여 적절하게 선택될 수 있고, 예를 들어, 금속 예컨대 철, 니켈, 코발트, 또는 희토금속의 합금을 포함할 수 있다. 상자성 물질은 또한 마그네슘, 몰리브데늄, 리튬, 탄탈럼, 및 산화철을 포함한다. 물질 (세포 포함)의 농축에 적합한 상자성 비드는 상업적으로 이용가능하고, 철 덱스트란 비드, 예컨대 덱스트란-코팅된 산화철 비드를 포함한다. 자성 특성이 요구되지 않는 본 발명의 측면에서, 나노입자는 또한 비금속 또는 유기 (예를 들면, 폴리머성) 물질 예컨대 셀룰로오스, 세라믹, 유리, 나일론, 폴리스티렌, 고무, 플라스틱, 또는 라텍스로 제조될 수 있다. 나노입자의 제조를 위한 예시적 물질에서, 이들 구현예와 함께 이용될 수 있는, 폴리(락트산-코-글라이콜산) (PLGA) 및 그의 코폴리머가 있다. 이용될 수 있는 폴리머 및 코-폴리머를 포함한 다른 물질은 PCT/US2014/25889 (이는 본 명세서에 참조로서 전체적으로 편입되어 있음)에 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 자성 입자는 생체적합성이다. 이는 aAPC가 농축된 및 증식된 세포와 회합에서 환자에 전달될 구현예에서 특히 중요하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 자성 입자는 생체적합성 철 덱스트란 상자성 비드이다.
다양한 구현예에서, 입자는 약 10 내지 약 500 nm 이내, 또는 약 20 내지 약 200 nm 이내의 크기 (예를 들면, 평균 직경)를 갖는다. 특히 aAPC가 환자에 전달될 구현예에서, 마이크로스케일 aAPC는 림프에 의해 담지되기에 너무 크고, 피하로 주사된 경우 주사 부위에 남아 있다. 정맥내로 주사된 경우, 이들은 모세관 층에 머무른다. 사실상, 마이크로스케일 비드의 좋지 못한 추적은 aAPC가 최적 면역요법을 위하여 상대해야 하는 연구를 배제하였다. 나노-aAPC의 추적 및 생체분포는 마이크로스케일 aAPC 보다 더욱 효율적일 것 같다. 예를 들어, aAPC가 가장 유효해야 하는 2개의 잠재적 부위는, 비처리 및 기억 T 세포가 거주하는 림프절, 및 종양 자체이다. 약 50 내지 약 200 nm 직경의 나노입자는 림프에 의해 채택될 수 있고 림프절로 수송될 수 있고, 따라서 T 세포의 더 큰 풀에 접근한다. 이로써 참고로 편입된, PCT/US2014/25889에 기재된 바와 같이, 나노-aAPC의 피하 주사는 대조군 또는 정맥내로 주사된 비드 보다 덜한 종양 성장을 유발하였다.
일부 구현예에서, 환자에 T 세포의 주입 직전에, 나노-크기의 aAPC를 이용한 항원-특이적 T 세포의 재-농축은, 예를 들어, 마이크로-크기의 aAPC가 세포와 함께 환자에 주입되면 효과일 수 있는, 정맥 및 동맥의 봉쇄를 피할 것이다.
세포-나노입자 인터페이스에서 수용체-리간드 상호작용은 양호하게 이해되지 않는다. 그러나, 나노입자 결합 및 세포성 활성화는, T 세포 활성화 동안 특히 중요한, 막 공간적 조직화에 민감성이고, 자기장은 활성화를 향상시키기 위해 클러스터-결합된 나노입자를 조작하는데 사용될 수 있다. 참고 WO/2014/150132. 예를 들어, T 세포 활성화는 지속적으로 향상된 나노스케일 TCR 클러스터링의 상태를 유도하고 나노입자는 더 큰 입자가 없는 방식으로 상기 클러스터링에 민감성이다. 참고 WO/2014/150132.
더욱이, TCR 클러스터와 나노입자 상호작용은 수용체 촉발을 향상시키기 위해 개척될 수 있다. T 세포 활성화는, T 세포-APC 접촉 부위의 주변에서 초기에 형성하고 내부로 이주하는, "신호전달 클러스터" 수백 나노미터로, 신호전달 단백질의 응집에 의해 매개된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 외부 자기장은 항원-특이적 T 세포 (희귀 비처리 세포 포함)를 농축시키기 위해 그리고 TCR에 결합된 자성 나노-aAPC의 응집을 유도하기 위해 사용될 수 있어, 비처리 T 세포의 TCR 클러스터의 응집 및 향상된 활성화를 유발한다. 자기장은 상자성 입자에 강한 힘을 적절하게 발휘할 수 있지만, 다르게는 생물학적으로 불활성이어서, 입자 행동을 제어하기 위해 이들을 강력한 도구로 만든다. 상자성 나노-aAPC에 결합된 T 세포는 외부로 인가된 자기장의 존재하에 활성화된다. 나노-aAPC는 자체 자화되고, 양쪽 장 공급원에 및 장내 근처 나노입자에 유인되어, 비드 및 따라서 TCR 응집을 유도하여 aAPC-매개된 활성화를 늘린다. 참고 WO/2014/150132.
나노-aAPC는 더 많은 TCR에 결합하고 비처리 T 세포에 비교하여 미리 활성화된 더 큰 활성화를 유도한다. 또한, 외부 자기장의 인가는 비처리 세포 상에서 나노-aAPC 응집을 유도하고, 양쪽 시험관내 및 생체내 후속 입양성 전이에서 T 세포 증식을 향상시킨다. 중요하게는, 흑색종 입양성 면역요법 모델에서, 자기장에서 나노-aAPC에 의해 활성화된 T 세포는 종양 거부를 매개한다. 따라서, 인가된 자기장의 사용은, 다르게는 자극에 저조하게 반응성인, 비처리 T 세포 집단의 활성화를 허용한다. 비처리 T 세포가, 강한, 장기간 T 세포 반응을 발생하기 위해 더 높은 증식성 수용력 및 더 큰 능력으로, 암 면역요법에 대하여 더욱 분화된 하위유형보다 더 효과적이도록 보여짐에 따라 이는 면역요법의 중요한 특징이다. 따라서, 나노-aAPC는, 세포성 요법 예를 들어, 감염성 질환, 암, 또는 자가면역 질환을 갖는 환자를 개선하는, 비처리 전구체 유래의 증식된 항원-특이적 T 세포의 수율 및 활성을 증가시키기 위해, 또는 면역억제된 환자에 예방적 보호를 제공하기 위해 T 세포의 자기장 향상된 활성화에 사용될 수 있다.
분자는, 공유 결합을 포함하여, 흡착에 의해 또는 직접적인 화학 결합에 의해 나노입자에 직접적으로 부착될 수 있다. 참고, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996. 분자 자체는, 친핵성 기, 이탈 기, 또는 친전자성 기를 포함하여, 다양한 화학 작용성으로 직접적으로 활성화될 수 있다. 활성화 작용기는 알킬 및 아실 할라이드, 아민, 설프하이드릴, 알데하이드, 불포화된 결합, 하이드라자이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 케톤, 및 화학 결합에 대하여 활성화하기 위해 공지된 다른 기를 포함한다. 대안적으로, 분자는 작은 분자-커플링 시약의 사용을 통해 나노입자에 결합될 수 있다. 커플링 시약의 비-제한 예는 카보디이미드, 말레이미드, n-하이드록시석신이미드 에스테르, 비스클로로에틸아민, 이중작용성 알데하이드 예컨대 글루타르알데하이드, 아니하이드라이드 등등을 포함한다. 다른 구현예에서, 분자는, 당해 분야에 양호하게 공지되어 있는 바와 같이, 친화도 결합 예컨대 비오틴-스트렙타비딘 연결 또는 커플링을 통해 나노입자에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 나노입자에 결합될 수 있고, 바이오티닐화된 분자는 당해 기술에 공지되어 있는 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
나노입자에 대한 공유 결합이 고려되면, 지지체는 전형적으로 링커를 통해 적합한 반응물에 대한 공유 결합에 이용가능한 하나 이상의 화학 모이어티 또는 작용기를 함유하는 폴리머로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 폴리머는, 적절한 링커를 통해 공유적으로 분자를 커플링화하기 위해 이용가능한 기, 예컨대 라이신의 ε-아미노 기를 가질 수 있다. 본 개시내용은 또한 이들 작용기를 제공하기 위해 나노입자상에 제2 코팅물의 배치를 고려한다.
활성화 화학은 나노입자의 표면에 분자의 특이적, 안정한 부착을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 단백질을 작용기에 부착시키기 위해 사용될 수 있는 수많은 방법이 있다. 예를 들어, 공통의 교차-링커 글루타르알데하이드는 2-단계 공정에서 아민화된 나노입자 표면에 단백질 아민 기를 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 수득한 연결은 가수분해적으로 안정하다. 다른 방법은 단백질상에서 아민과 반응하는 n-하이드로석신이미도 (NHS) 에스테르를 함유한 교차-링커, 아민-, 설프하이드릴-, 또는 히스티딘-함유 단백질과 반응하는 활성 할로겐을 함유한 교차-링커, 아민 또는 설프하이드릴 기와 반응하는 에폭사이드를 함유한 교차-링커, 말레이미드 기와 설프하이드릴 기 사이의 콘주게이션의 이용, 및 현수 당 모이어티의 퍼아이오데이트 산화 그 다음 환원성 아미노화에 의해 단백질 알데하이드 기의 형성을 포함한다.
동일한 나노입자에서 특정한 리간드의 비는 항원 또는 공자극 리간드 제시에서 나노입자의 유효성을 증가시키기 위해 다양할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 다양한 비, 예컨대 약 30:1, 약 25:1, 약 20:1, 약 15:1, 약 10:1, 약 5:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 0.5:1, 약 0.3:1; 약 0.2:1, 약 0.1:1, 또는 약 0.03:1로 HLA-A2-Ig 및 항-CD28과 커플링될 수 있다. 지지체에 커플링된 단백질의 총 양은, 예를 들어, 입자의 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml, 또는 약 50 mg/ml일 수 있다. 효과기 기능 예컨대 사이토카인 방출 및 성장이 T 세포 활성화 및 분화보다 신호 1 대 신호 2에 대한 상이한 요건을 가질 수 있기 때문에, 이들 기능은 분리하여 측정될 수 있다.
나노입자의 입체배치는 불규칙한 형상부터 구형까지 및/또는 불균일 또는 불규칙한 표면부터 부드러운 표면까지 다양할 수 있다. 비-구형 aAPC는 WO 2013/086500(이는 본 명세서에 참조로서 전체적으로 편입되어 있음)에 기재된다.
aAPC는 T 세포에 항원을 제시하고 따라서, 비처리 T 세포 유래의 것을 포함하여, 양쪽 항원-특이적 T 세포를 농축시키기 위해 및 증식시키기 위해 사용될 수 있다. 펩티드 항원은 원하는 요법, 예를 들어, 암, 암의 유형, 감염성 질환, 등에 기반하여 선택될 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 암 환자를 치료하기 위해 수행되고, 환자에 특이적인 신생항원은 식별되고, aAPC 부하를 위하여 합성된다. 일부 구현예에서, 3 내지 10개의 신생항원은 종양의 유전적 분석 (예를 들면, 핵산 서열분석), 그 다음 예측의 생물정보학을 통해 식별된다. 본원에서 보이는 바와 같이, 몇 개의 항원은 방법에서 기능성의 손실 없이 (별도의 aAPC상에서) 함께 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 천연, 비-돌연변이된, 암 항원이고, 이들 다수는 공지되어 있다. 개인화된 근거로 항원 식별을 위한 상기 공정은 아래 더 상세히 기재된다.
다양한 항원은 항원 제시 복합체에 결합될 수 있다. 항원의 성질은 사용되는 항원 제시 복합체의 유형에 좌우된다. 예를 들어, 펩티드 항원은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 펩티드 결합 천구에 결합될 수 있다. 비-고전적 MHC-유사 분자는 비-펩티드 항원 예컨대 인지질, 복합체 탄수화물, 등등 (예를 들면, 박테리아 막 성분 예컨대 마이콜 산 및 리포아라비노만난)을 제시하기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 펩티드는 항원 제시 복합체에 결합될 수 있다. 항원성 펩티드는 종양-관련 항원, 자가항원, 동종항원, 및 감염성 제제의 항원을 포함한다.
"종양-관련 항원"은 정상 성인 조직이 아닌 많은 종양에서 발현된 유도된, 공유된 종양 항원 (종양태아 항원)인 종양에 의해 배타적으로 발현된 독특한 종양 항원, 및 종양이 발생한 정상 조직에 의해 또한 발현된 조직-특이적 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은, 예를 들어, 배아 항원, 비정상 번역 후 변형을 갖는 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 또는 종양 억제제의 생성물, 융합 단백질, 또는 종양바이러스 단백질일 수 있다.
다양한 종양-관련 항원은 당해 기술에 공지되어 있고, 많은 이들은 상업적으로 이용가능하다. 종양태아 및 배아 항원은 하기를 포함한다: 암종배아 항원 및 알파-태아단백 (보통 배아 발생에서 단지 크게 발현되지만 간 및 결장, 각각의 종양에 의해 빈번하게 크게 발현됨), MAGE-1 및 MAGE-3 (흑색종, 유방암, 및 신경아교종에 발현됨), 태반 알칼리성 포스파타제 시알릴-루이스 X (선암종에서 발현됨), CA-125 및 CA-19 (위장, 간, 및 부인과 종양에서 발현됨), 태그-72 (대장 종양에서 발현됨), 상피성 당단백질 2 (많은 암종에서 발현됨), 췌장 종양태아 항원, 5T4 (위암종에서 발현됨), 알파태아단백 수용체 (다중 종양 유형, 특히 유선 종양에서 발현됨), 및 M2A (세균 세포 신조직형성에서 발현됨).
종양-관련 분화 항원은 티로시나제 (흑색종에서 발현됨) 및 특정한 표면 면역글로불린 (림프종에서 발현됨)을 포함한다.
돌연변이된 종양유전자 또는 종양-억제제 유전자 생성물은 Ras 및 p53을 포함하고, 이 둘 모두는 많은 종양 유형, Her-2/neu (유방 및 부인과 암에서 발현됨), EGF-R, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 망막모세포종 유전자 생성물, myc (폐암과 관련됨), ras, p53, 유방 종양과 관련된 비돌연변이체, MAGE-1, 및 MAGE-3 (흑색종, 폐, 및 다른 암과 관련됨)에서 발현된다. 융합 단백질은 크롬산 골수 백혈병에서 발현되는 BCR-ABL을 포함한다. 종양바이러스 단백질은 자궁경부 암종에서 발견되는 HPV 유형 16, E6, 및 E7을 포함한다.
조직-특이적 항원은 하기를 포함한다: 멜라노트랜스페린 및 MUC1 (췌장암 및 유방암에서 발현됨); CD10 (공통의 급성 림프아구성 백혈병 항원, 또는 CALLA로서 이전에 공지됨) 또는 표면 면역글로불린 (B 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); IL-2 수용체, T 세포 수용체, CD45R, CD4+/CD8+의 α 쇄 (T 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); 전립선특이적 항원 및 전립선 산-포스파타제 (전립선 암종에서 발현됨); GP 100, MelanA/Mart-1, 티로시나제, gp75/갈색, BAGE, 및 S-100 (흑색종에서 발현됨); 사이토케라틴 (다양한 암종에서 발현됨); 및 CD19, CD20, 및 CD37 (림프종에서 발현됨).
종양-관련 항원은 또한 하기를 포함한다: 변경된 당지질 및 당단백질 항원, 예컨대 뉴라민산-함유 글리코스핑고지질 (예를 들면, 흑색종 및 일부 뇌 종양에서 발현된, GM2 및 GD2); 암종에서 비정상적으로 발현될 수 있는, 혈액 그룹 항원, 특히 T 및 시알릴화된 Tn 항원; 및 뮤신, 예컨대 CA-125 및 CA-19-9 (난소 암종 상에서 발현됨) 또는 과소당화된 MUC-1 (유방 및 췌장 암종 상에서 발현됨).
"감염성 제제의 항원"은 원생동물, 박테리아, 진균 (양쪽 단세포 및 다중세포), 바이러스, 프리온, 세포내 기생충, 연충, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 다른 감염성 제제의 성분을 포함한다.
박테리아 항원은 그램-양성 구균, 그램 양성 바실러스, 그램-음성 박테리아, 혐기성 박테리아의 항원, 예컨대 패밀리 악티노마이세타세애, 바실라세애, 바르토넬라세애, 보데텔라에, 캅토파가세애, 코리네박테리아세애, 엔테로박테리아세애, 레지오넬라세애, 마이크로코카세애, 마이코박테리아세애, 노카르디아세애, 파스튜렐라세애, 슈도모나다세애, 스피로차에타세애, 비브리오나세애의 유기체 및 속 아시네토박터, 브루셀라, 캄필로박터, 에리시펠로트릭스, 어윙젤라, 프란시셀라, 가드네넬라, 헬리코박터, 레비네아, 리스테리아, 스트렙토바실러스 및 트로페리마의 유기체를 포함한다.
원생동물 감염성 제제의 항원은 말라리아 플라스모디아, 라이쉬마니아 종, 트라이파노소마 종 및 주혈흡충 종의 항원을 포함한다.
진균 항원은 아스페르길루스, 블라스토마이세스, 칸디다, 콕시디오이데스, 크립토코쿠스, 히스토플라즈마, 파라콕시시오이데스, 스포로트릭스의 항원, 목 뮤코랄레스의 유기체, 코로마이코시스 및 균종을 유도하는 유기체 및 속 트리코파이톤, 마이크로스포럼, 에피더모파이톤, 및 말라쎄지아의 유기체를 포함한다.
바이러스 펩티드 항원은, 비제한적으로, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 유두종 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 폭스바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 및 CMV의 것을 포함한다. 특히 유용한 바이러스 펩티드 항원은 하기를 포함한다: HIV 단백질 예컨대 HIV gag 단백질 (비제한적으로, 막 고착 (MA) 단백질, 코어 캡시드 (CA) 단백질 및 뉴클레오캡시드 (NC) 단백질 포함), HIV 폴리머라제, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 (M) 단백질 및 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드 (NP) 단백질, B형 간염 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 코어 단백질 (HBcAg), E형 간염 단백질 (HBeAg), B형 간염 DNA 폴리머라제, C형 간염 항원, 등등.
항원성 펩티드를 포함한 항원은, 미국 특허 6,268,411(이는 본 명세서에 참조로서 전체적으로 편입되어 있음)에 기재된 바와 같이, 능동적으로 또는 수동적으로 항원 제시 복합체의 항원 결합 천구에 결합될 수 있다. 임의로, 항원성 펩티드는 펩티드 결합 천구에 공유 결합될 수 있다.
원한다면, 펩티드 연결기는 펩티드 결합 천구에 항원성 펩티드를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 클래스 I MHC 분자의 측정 분석은 β2M의 아미노 말단이 MHC 펩티드 결합 천구에서 상주하는 항원성 펩티드의 카복실 말단으로부터 매우 근접, 대략 20.5 옹스트롬 떨어져 있음을 나타낸다. 따라서, 상대적으로 짧은 링커 서열, 대략 13 아미노산 길이를 이용하여, β2M의 아미노 말단에 펩티드를 묶을 수 있다. 서열이 적절하면, 그 펩티드는 MHC 결합 홈에 결합할 것이다 (참고 미국 특허 6,268,411).
aAPC에 결합되는 항원-특이적 T 세포는 자성 농축, 또는 다른 세포 분급 또는 포착 기술을 이용하여 결합되지 않는 세포로부터 분리될 수 있다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 다른 공정은 (예를 들면, 본원에서 기재된 항원-제시 복합체 또는 다른 리간드의 고정화를 포함한) 유세포측정 및 다른 크로마토그래피 수단을 포함한다. 하나의 구현예에서 항원-특이적 T 세포는 원하는 항원-특이적 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 비드, 예를 들어, 항원-제시 복합체/항-CD28-접합된 상자성 비드 (예컨대 DYNABEADS®)로 항온처리에 의해 단리된다 (또는 농축된다).
일부 구현예에서, T 세포의 집단은, 예를 들면, 비처리 T 세포에 대하여 농축된 집단을 이탈하는, CD44에 대한 항체를 이용하여, 이전에 활성 T 세포에서 실질적으로 감손될 수 있다. 상기 집단에 대한 결합 나노-aAPC는 비처리 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않을 것이지만, 그의 정제를 허용할 것이다.
추가의 다른 구현예에서, NK 세포, NKT 세포, 또는 B 세포 (또는 다른 면역 효과기 세포)를 표적하는 리간드는, 임의로 아래에서 기재된 바와 같이 배양액에서 증식하면서, 상자성 나노입자로 편입될 수 있고, 이들 세포 집단에 대하여 자석으로 농축시키기 위해 사용될 수 있다. 추가의 면역 효과기 세포 리간드는 PCT/US2014/25889(이는 본 명세서에 참조로서 전체적으로 편입되어 있음)에 기재된다.
이론에 의한 구속됨 없이, 원치않는 세포의 제거는 사이토카인 및 성장 신호에 대한 경쟁을 감소시킬 수 있고, 억제성 세포를 제거할 수 있거나, 또는 단순히 해당 세포의 증식을 위한 더 많은 물리적 공간을 제공할 수 있다.
농축된 T 세포는 그 다음 자기장을 생성하기 위한 자석에 근접하여 배양액에서 증식되어, 이는 aAPC 결합된 세포의 T 세포 수용체 클러스터링을 향상시킨다. 배양액은 나노-aAPC를 이용한 가변량의 시간 (예를 들면, 약 0.5, 2, 6, 12, 36, 48, 또는 72 시간 뿐만 아니라 계속되는 자극) 동안 자극될 수 있다. 고 농축된 항원-특이적 T 세포 배양액에서 자극 시간의 효과는 평가될 수 있다. 항원-특이적 T 세포는 당해 기술에서 공지되어 있는 바와 같이 배양액에서 반대로 배치될 수 있고 세포 성장, 증식 속도, 다양한 효과기 기능에 대하여 분석될 수 있다. 상기 조건은 원하는 항원-특이적 T 세포 반응에 따라 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양액에서 약 2 일 내지 약 3 주, 또는 일부 구현예에서, 약 5 일 내지 약 2 주, 또는 약 5 일 내지 약 10 일 증식된다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양액에서 약 1 주 동안 증식되고, 그 후 제2 농축 및 증식 단계는 임의로 수행된다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 또는 5 농축 및 증식 순회는 수행된다.
농축 및 증식의 하나 이상의 순회 이후, 샘플의 항원-특이적 T 세포 성분은 세포의 적어도 약 1%, 또는 일부 구현예에서, 샘플에서 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%일 것이다. 추가로, 이들 T 세포 일반적으로 활성 상태를 표시한다. 환자로부터 단리된 최초 샘플로부터, 다양한 구현예에서 항원-특이적 T 세포는 다양한 구현예에서 약 100-배 내지 약 10,000 배, 예컨대 적어도 약 1000-배, 적어도 약 2000-배, 적어도 약 3,000 배, 적어도 약 4,000-배, 또는 적어도 약 5,000-배 증식된다. 농축 및 증식의 하나 이상의 순회 이후, 적어도 약 106, 또는 적어도 약 107, 또는 적어도 약 108, 또는 적어도 약 109 항원-특이적 T 세포가 수득된다.
T 세포 전구체의 증식, 활성화 및 분화에 관한 나노-aAPC의 효과는 당해 분야의 숙련가에 공지된 다수의 방식으로 분석될 수 있다. 기능의 신속한 측정은 T 세포의 각 유형에 특이적인 검출 마커에 의해 배양액에서 CTL, 헬퍼 T 세포, 또는 조절 T 세포의 증가를 측정함으로써, 증식 검정을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 마커는 당해 기술에 공지되어 있다. CTL은 사이토카인 생산에 대하여 또는 크로뮴 방출 검정을 이용한 세포용해 활성 검정에 대하여 검정함으로써 검출될 수 있다.
적절한 효과기 기능을 갖는 항원-특이적 T 세포의 생성에 더하여, 항원-특이적 T 세포 효능에 대한 또 다른 파라미터는 T 세포가 병리학의 부위에 상대하게 하는 귀소 수용체의 발현이다 (Sallusto et al., Nature 401, 708-12, 1999; Lanzavecchia & Sallusto, Science 290, 92-97, 2000).
예를 들어, 효과기 CTL 효능은 귀소 수용체, CD62L+, CD45RO+, 및 CCR7-의 하기 표현형에 연결되었다. 따라서, 나노-aAPC-유도된 및/또는 증식된 CTL 집단은 이들 귀소 수용체의 발현을 특징으로 할 수 있다. 귀소 수용체 발현은 초기 자극 조건에 연결된 복합체 특성이다. 짐작컨대, 이는 양쪽 공자극 복합체 뿐만 아니라 사이토카인 환경에 의해 제어된다. 연루된 하나의 중요한 사이토카인은 IL-12 이다 (Salio et al., 2001). 이하에서 논의된 바와 같이, 나노-aAPC는 생물학적 결과 파라미터를 최적화하기 위해 개별적으로 분리된 성분 (예를 들면, T 세포 효과기 분자 및 항원 제시 복합체)을 다양화하도록 잠재력을 제공한다. 임의로, 사이토카인 예컨대 IL-12는 항원- 특이적 T 세포 집단에서 귀소 수용체 프로파일에 영향을 미치기 위해 초기 유도 배양액에 포함될 수 있다.
임의로, 항원-특이적 T 세포를 포함한 세포 집단은 제1 세포 집단에서 항원-특이적 T 세포의 수에 비하여 항원-특이적 T 세포의 증가된 수를 포함한 제2 세포 집단을 형성하기 위해 충분한 일정 기간 동안 동일한 나노-aAPC 또는 제2 나노-aAPC로 계속해서 항온처리될 수 있다. 전형적으로, 상기 항온처리은 3-21 일, 바람직하게는 7-10 일 동안 수행된다.
적합한 항온처리 조건 (배양 배지, 온도, 등)은 T 세포 또는 T 세포 전구체를 배양하기 위해 사용된 것, 뿐만 아니라 DC 또는 인공 항원 제시 세포를 이용한 항원-특이적 T 세포의 형성 유도를 위한 당해 기술에서 공지된 것을 포함한다. 참고, 예를 들면, Latouche & Sadelain, Nature Biotechnol.18, 405-09, April 2000; Levine et al., J. Immunol.159, 5921-30, 1997; Maus et al., Nature Biotechnol. 20, 143-48, 2002년 2월. 또한 하기 특정 실시예 참고.
증식성 신호의 규모를 평가하기 위해, 항원-특이적 T 세포 집단은 CFSE로 표지될 수 있고 세포 분할의 속도 및 수에 대하여 분석될 수 있다. T 세포는 항원이 결합된 나노-aAPC를 이용한 자극의 1-2 순회 이후 CFSE로 표지될 수 있다. 그 지점에서, 항원-특이적 T 세포는 총 세포 집단의 2-10%를 나타낸다. 항원-특이적 T 세포는 항원-특이적 염색을 이용하여 검출될 수 있어서 이로써 항원-특이적 T 세포의 분할의 속도 및 수는 그 다음 CFSE 손실될 수 있다. 자극 이후 다양한 시간 (예를 들어, 12, 24, 36, 48, 및 72 시간)에서, 세포는 양쪽 항원 제시 복합체 염색 및 CFSE에 대하여 분석될 수 있다. 항원이 결합되지 않은 나노-aAPC를 이용한 자극은 증식의 기준선 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 임의로, 증식은 당해 기술에서 공지되어 있는 바와 같이 3H-티미딘의 편입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다.
나노-aAPC를 이용하여 수득된 항원-특이적 T 세포는, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 진피내 투여, 림프내 투여, 및 종양내 투여를 포함하여, 임의의 적절한 경로로 환자에 투여될 수 있다. 환자는 양쪽 인간 및 수의과 환자를 포함한다.
항원-특이적 조절 T 세포는 면역억제성 효과를 달성하기 위해, 예를 들어, 이식 환자에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하기 위해, 또는 자가면역 질환, 예컨대 상기 열거된 것, 또는 알러지를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 조절 T 세포의 용도는, 그 전체가 참고로 이로써 편입된, 예를 들어, US 2003/0049696, US 2002/0090724, US 2002/0090357, US 2002/0034500, 및 US 2003/0064067에 개시된다.
이들 방법에 따라 제조된 항원-특이적 T 세포는 약 5-10 x 106 CTL/kg 체중 (~7 x108 CTL/치료)에서 최대 약 3.3 x 109CTL/kg 체중 (~6 x 109 CTL/치료) 범위의 용량으로 환자에 투여될 수 있다 (Walter et al., New England Journal of Medicine 333, 1038-44, 1995; Yee et al., J Exp Med 192, 1637-44, 2000). 다른 구현예에서, 환자는 정맥내로 투여된 용량 당 약 103, 약 5 x 103, 약 104, 약 5 x 104, 약 105, 약 5 x 105, 약 106, 약 5 x 106, 약 107, 약 5 x 107, 약 108, 약 5 x 108, 약 109, 약 5 x 109, 또는 약 1010 세포를 받을 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, 환자는, 예를 들면, 200 μl 볼러스에서 약 8 x 106 또는 약 12 x 106 세포의 결절내 주사를 받을 수 있다. 세포로 투여된 나노-APC의 용량은 용량 당 약 103, 약 5 x 103, 약 104, 약 5 x 104, 약 105, 약 5 x 105, 약 106, 약 5 x 106, 약 107, 약 5 x 107, 약 108, 약 5 x 108, 약 109, 약 5 x 109, 또는 약 1010 나노-aAPC를 포함한다.
예시적 구현예에서, 농축 및 증식 공정은 환자로부터 유도된 동일한 샘플 상에서 반복적으로 수행된다. T 세포의 집단은 배양액에서 일 0, 그 다음 적합한 기간 (예를 들면, 약 3-20 일)에 농축 및 활성화된다. 그 뒤에, 나노-aAPC는 해당 항원에 대하여 재차 농축 및 증식시키기 위해 사용될 수 있고, 추가로 집단 순도를 증가시키고 추가 T 세포 증식을 위하여 추가의 자극을 제공한다. 나노-aAPC 및 농축된 T 세포의 혼합물은 그 뒤에 재차 적절한 기간동안 시험관내 배양될 수 있거나, 또는 생체내 추가 증식 및 치료 효과를 위하여 환자에 재-주입될 수 있다. 농축 및 증식은 원하는 증식이 달성될 때까지 임의의 횟수로 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 상이한 항원에 대해 나노-aAPC, 각각의 칵테일은 동시에 다중 항원에 대해 항원 T 세포를 농축 및 증식시키기 위해 한 번에 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 각각 상이한 MHC-펩티드를 보유한, 수많은 상이한 나노-aAPC는 각각의 해당 항원에 대해 T 세포를 동시에 농축시키기 위해 조합 및 사용될 것이다. 수득한 T 세포 풀은 각각의 이들 항원에 대해 농축 및 활성화될 것이고, 다중 항원에 대한 반응은 따라서 동시에 배양될 수 있다. 이들 항원은 단일 치료 중재; 예를 들어, 단일 종양상에 존재한 다중 항원에 관련될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는, 입양성 전이에 의한 항원-특이적 T 세포 수용에 앞서, 또는 환자의 종양의 유전적 분석을 통해 시험관내 식별된 신생항원을 보유한 aAPC의 직접적인 투여에 앞서, 하나 이상의 관문 저해제를 갖는 면역요법을 받는다. 다양한 구현예에서, 관문 저해제(들)는 CTLA-4 또는 PD-1/PD-L1 중 하나 이상을 표적하고, 이는 상기 표적에 대한 항체, 예컨대 단클론성 항체, 또는 그의 일부, 또는 그의 인간화된 또는 완전히 인간 버전을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관문 저해제 요법은 이필리무맙 또는 케이트루다 (펨브롤리주맙)를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 입양성 면역요법의 약 1 내지 5 순회 (예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5 순회)를 받는다. 일부 구현예에서, 입양성 면역요법의 각 투여는 관문 저해제 요법의 순회와 동시, 또는 그 이후 (예를 들면, 약 1 일 내지 약 1 주 이후) 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 입양성 면역요법은 관문 저해제 요법 이후 약 1 일, 약 2 일, 또는 약 3 일 제공된다.
추가의 다른 구현예에서, 환자에 나노-aAPC의 입양성 전이 또는 직접적인 주입은, 비드 상의 리간드로서, CTLA-4 또는 PD-1/PD-L1 중 하나 이상을 표적하는 리간드를 포함한다. 상기 구현예에서, 방법은 가용성 관문 저해제 요법 투여의 특정 부작용을 피할 수 있다.
개인화된 요법을 위한 방법
일부 측면에서, 본 발명은 개인화된 암 면역요법을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자가 반응할 항원을 식별하기 위해 aAPC, 그 다음 환자에 적절한 펩티드-부하된 aAPC의 투여, 또는 그 다음 생체외 항원 특이적 T 세포의 농축 및 증식을 이용하여 달성된다.
게놈-전체 서열분석은 암 생물학의 현대 이해를 극적으로 변경시켰다. 암의 서열분석은 많은 인간 암의 발생에 관여된 분자 공정에 관하여 중요한 데이터를 수득하였다. 돌연변이 유발은 3개의 주요 세포성 공정 (1) 세포 운명, (2) 세포 생존 및 (3) 게놈 유지를 조정하는 경로에 관여된 중요 유전자에서 식별되었다. Vogelstein et al., Science 339, 1546-58 (2013).
게놈-전체 서열분석은 또한 암 면역요법에 대한 현대 접근법을 변혁시키기 위한 잠재력을 갖는다. 서열분석 데이터는 암 면역요법에 대하여 양쪽 공유된 뿐만 아니라 개인화된 표적에 대한 정보를 제공할 수 있다. 원칙적으로, 돌연변이체 단백질은 면역계에 생소하고 잠정적 종양-특이적 항원이다. 사실상, 서열분석 노력은 수 천의 잠재적으로 관련된 면역 표적이 없다면 다수 정의되었다. 제한된 연구는 이들 신생-에피토프에 대한 T 세포 반응이 암 환자에서 발견될 수 있거나 또는 암 백신에 의해 유도될 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나, 특정한 암에 대한 상기 반응의 빈도 및 상기 반응이 환자 사이에서 공유되는 정도는 잘 알려지지 않는다. 종양-특이적 면역 반응의 현대 제한된 이해에 대한 주요 이유 중 하나는 잠재 면역학적으로 관련된 표적 유효화를 위한 현행 접근법이 다루기 힘들고 시간이 걸린다는 것이다.
따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 암에서 신생-항원에 대한 T 세포 반응의 검출에 대한 고-처리량 플랫폼-기반된 접근법을 제공한다. 상기 접근법은 암 항원에 대해 심지어 낮은-빈도 T 세포 반응의 검출에 대하여 본원에서 기재된 aAPC 플랫폼을 이용한다. 상기 반응의 빈도 및 사람 간의 가변성 이해는 암 백신 및 개인화된 암 면역요법의 설계에 대한 함의를 가질 것이다.
중심 내성이 자기-단백질에 대한 T 세포 반응을 폐지하여도, 종양발생 돌연변이는 T 세포 반응이 형성할 수 있는 것에 대해 신생-에피토프를 유도한다. 전체의 엑솜 서열분석으로부터 유도된 돌연변이 카탈로그는 상기 신생-에피토프 식별을 위한 개시점을 제공한다. HLA 결합 예측 알고리즘 (Srivastava, PLoS One 4, e6094 (2009)을 이용하여, 각 암이 7-10 이상 신생-에피토프를 가질 수 있음이 예측되었다. 유사한 접근법은 수백 종양 신생-에피토프를 추정하였다. 상기 알고리즘은, 그러나, T 세포 반응 예상에서 낮은 정확도를 가질 수 있고, 예측된 HLA-결합 에피토프의 단지 10%가 HLA의 맥락에서 결합할 것으로 예상된다 (Lundegaard C, 면역학 130, 309-18 (2010)). 따라서, 예상된 에피토프는 상기 잠재적 신생-에피토프에 대해 T 세포 반응의 존재에 대하여 입증되어야 한다.
특정 구현예에서, 나노-aAPC 시스템은 다양한 암에서, 또는 특정한 환자의 암에서 T 세포 반응을 유도하는 신생-에피토프에 대하여 스크리닝하기 위해 사용된다. 암은, 예를 들어, 전체의 엑솜-서열분석에 의해 유전자 상으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 24 진전된 선암종의 패널 중에서, 종양 당 약 50 돌연변이의 평균이 식별되었다. 분석된 대략 20,000 유전자 중에서, 1327은 적어도 하나의 돌연변이를 가졌고, 148은 2 이상의 돌연변이를 가졌다. 974 미스센스 돌연변이는 결실 및 삽입의 작은 추가수와 함께 식별되었다.
후보 펩티드의 목록은 돌연변이된 단백질에서 중첩한 9 아미노산 윈도우로부터 생성될 수 있다. 각 단백질로부터 돌연변이된 아미노산, 및 2 비-돌연변이된 "대조군"을 함유하는 모든 9-AA 윈도우는 선택될 것이다. 이들 후보 펩티드는, NetMHC 및 안정화된 매트릭스 방법 (SMM)을 포함하여, 공통의 MHC 결합 예측 알고리즘을 이용한 MHC 결합에 대하여 컴퓨터를 이용하여 평가될 것이다. 나노-aAPC 및 MHC 결합 알고리즘은 주로 HLA-A2 대립유전자에 대하여 개발되었다. 공통 예측의 민감성 컷-오프는 펩티드 (~500) 및 비-돌연변이된 대조군 펩티드 (~50)를 함유한 다루기 쉬운 수의 돌연변이가 식별될 때까지 조정될 수 있다.
펩티드 라이브러리는 그 다음 합성된다. aAPC를 보유한 MHC (예를 들면, A2)는 다중 웰 플레이트에서 침착되고 펩티드로 수동적으로 부하된다. CD8 T 세포는 양쪽 A2 양성 건강한 공여자 및 A2 양성 췌장암 환자 (또는 본원에서 기재된 다른 암 또는 질환)의 PBMC로부터 단리될 수 있다. 그 뒤에, 단리된 T 세포는 농축 단계용 플레이트에서 부하된 aAPC로 항온처리된다. 항온처리 이후, 플레이트는 자기장에 배치되고 aAPC에 결합되지 않은 부적절 T 세포를 함유한 상청액은 제거된다. aAPC에 결합된 잔여 T 세포는 배양될 것이고 7 내지 21 일 동안 증식하게 될 것이다. 항원 특이적 증식은 aAPC를 이용한 재-자극 및 세포내 IFNγ 형광 염색에 의해 평가된다.
일부 구현예에서, 환자의 T 세포는 나노APC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝되고, 결과는 진단적 또는 예후적 목적으로 사용된다. 예를 들어, 돌연변이된 단백질, 과발현된 단백질, 및/또는 다른 종양-관련 항원에 대해 T 세포 항-종양 반응의 수 및 동일성은 위험을 계층화하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 T 세포 반응의 수는 질환 진행의 위험 또는 화학요법에 대한 내성 또는 비-반응성의 위험에 반비례할 수 있다. 다른 구현예에서, 환자의 T 세포는 나노-APC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝되고, T 세포 반응의 존재, 또는 이들 T 세포 반응의 수 또는 세기는 환자가 하위-임상 종양을 갖는다는 것을 식별하고/하거나, 종양 생물학의 초기 이해를 제공한다.
일부 구현예에서, 환자 또는 대상체의 T 세포는, 상이한 후보 펩티드 항원을 각각 나타내는, 상자성 aAPC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 상기 스크린은 대상체 또는 환자의 T 세포 레퍼토리에 관하여 풍부한 정보를 제공할 수 있고, 결과는 진단적 또는 예후적 목적에 유용하다. 예를 들어, 돌연변이된 단백질, 과발현된 단백질, 및/또는 다른 종양-관련 항원에 대한 T 세포 항-종양 반응의 수 및 동일성은 위험을 계층화하기 위한, 면역요법의 효능을 모니터링, 또는 면역요법 치료의 결과를 예측하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 추가로, 상기 T 세포 반응의 수 또는 세기는 질환 진행의 위험에 반비례할 수 있거나 또는 화학요법에 대해 내성 또는 비-반응성을 예측할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체의 또는 환자의 T 세포는, 후보 펩티드 항원을 각각 나타내는, 나노-APC의 어레이 또는 라이브러리에 대해 스크리닝되고, T 세포 반응의 존재, 또는 이들 T 세포 반응의 수 또는 세기는, 예를 들어, 자가면역 질환을 식별함으로써, 또는 환자가 하위-임상 종양을 갖는 것을 식별함으로써 환자의 건강에 관하여 정보를 제공한다. 상기 구현예에서, 공정은 잠재적 질환 상태를 식별할 뿐만 아니라, 질환 생물학의 초기 이해를 제공한다.
시약/키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 나노-aAPC는 농축 및 증식 공정 수행을 위한 성분과 함께 키트에서 제공될 수 있다. 나노-aAPC에 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함하여 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 임의로, 하나 이상의 상이한 항원은 나노-aAPC에 결합될 수 있거나 또는 분리하여 공급될 수 있다. 키트는, 대안적으로 또는 또한, T 세포용 하나 이상의 다중벽 플레이트 또는 배양액 플레이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 aAPCS를 포함한 밀봉된 용기, 자석, 및 임의로 자성 농축 수행용 시험관 및/또는 용액 또는 버퍼를 포함한다.
키트는 약제학적으로 허용가능한 버퍼, 예컨대 포스페이트-완충된 염수, 링거액, 또는 덱스트로오스 용액을 포함한 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 최종 사용자에 유용한 다른 물질을 또한 함유할 수 있다.
키트는 항원-특이적 T 세포 활성화 또는 증식의 정도 및 효능 평가용 시약, 예컨대 특이적 마커 단백질, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자 복합체, TCR 분자 복합체, 항클로노타입형 항체, 등등에 대한 항체를 또한 함유할 수 있다.
키트는, 다양한 프로토콜에서 키트내 나노aAPC를 이용하여, 항원-특이적 T 세포 유도 방법용, 항원-특이적 T 세포 증식 방법용 서면 설명서를 함유한 포장 삽입물을 또한 포함할 수 있다. 포장 삽입물은 비승인된 초안 포장 삽입물일 수 있거나 또는 음식 및 약물 투여 (FDA) 또는 다른 조절 바디에 의해 승인된 포장 삽입물일 수 있다.
실시예
실시예 1
입양성 T 세포 요법은 암의 내구성 퇴행을 매개할 수 있다. 비처리 T 세포 유래의 기능적 종양-특이적 T 세포의 다수를 빠르게 생성하기 위해, 자성 칼럼에서 희귀 종양-특이적 T 세포를 농축시킬 수 있으면서 동시에 이들을 활성화시킬 수 있는, 상자성, 나노스케일 인공 항원 제시 세포를 이용한 농축 + 증식 전략을 개발하였다. 농축 + 증식은 마우스 및 인간 종양-특이적 T 세포의 1000-배 초과 증식을 유발하였고, 농축 + 증식에 의해 생성된 종양-특이적 CTL로 처리된 마우스는 유의미하게 더 적은 종양 성장을 가졌다. 농축 + 증식을 통해 비용 유효한, 재생가능한 방식으로 종양-특이적 T 세포의 다수의 생성 간소화는 자가조직 종양 면역요법 프로토콜에 강력한 부가일 수 있다.
종양-특이적 T 세포의 입양성 전이는 암1의 내구성 퇴행을 매개할 수 있다. 기존의 항-종양 반응이 소수의 암 환자2로부터 배양될 수 있는 반면, 다양한 종양 항원에 특이적인 T 세포는 종양 항원3으로 비처리 전구체 세포의 자극에 의해 생성될 수 있다. 상기 배양 공정은, 각 개별 환자4를 위하여 생성되어야 하는 복합체 생물제제인, 자가조직 항원 제시 세포 및 공급장치 세포에 의존하여, 입양성 면역요법의 비용 및 복합성을 유의미하게 증가시킨다.
종양-특이적 T 세포의 증식은 종양-특이적 비처리 전구체의 희귀성, 겨우 백만5-7분의 1 만큼 추가로 복잡해진다. 유효한 요법8-10에 요구된 종양-특이적 T 세포의 다수를 생성하기 위해, 림프구는 많은 주에 걸쳐 항원으로 반복적으로 자극되고, 종종 그 다음 T 세포 선택 및 하위-클로닝11된다. 상기 노동-집약적 공정은 최종 세포 생성물에서 종양-특이적 T 세포의 총 수 및 항원-특이적 빈도 (또는 "순도") 양쪽을 증가시킨다. 항원-특이적 빈도가 전이 이후 최적 증식을 위하여 독립적으로 중요한 파라미터인 것은, 부적절한, 공-전이된 세포로부터 성장 신호에 대한 경쟁이 해당12-14 항-종양 T 세포의 항상성 증식을 유의미하게 약화시키기 때문이다.
따라서, 세포성 APC 또는 공급장치 세포의 부가된 비용 및 복합성 없이, 비처리 전구체 유래의 종양-특이적 T 세포의 다수, 그리고 고빈도로 빠르게 생성시킬 수 있는 기술이 필요하다. 본 발명은 따라서 나노스케일 인공 항원 제시 세포 (나노-aAPC)를 이용하여 T 세포 농축 및 증식 전략을 제공한다. 본원에서 예시된 나노-aAPC는, 내인성 APC에 의해 전달된 2개의 활성화 신호로 작용화된, 직경 50-100 nm인, 상자성 철-덱스트란 나노입자이다: 신호 1, TCR에 결합하는 MHC의 맥락에서 나타낸 동족 항원성 펩티드; 및 신호 2, T 세포 반응을 조절하고 유효한 활성화를 촉진시키는 수많은 공자극 수용체 중 하나 (도 1, 최상부). 상자성 나노-aAPC는 따라서 자성 농축 칼럼에서 동족 T 세포 배양, 및 항원-특이적 T 세포 증식 유도 양쪽을 가능하게 한다 (도 1, 최하부).
나노-aAPC를 이용한 농축은 나노-aAPC로 비처리, 다클론성 마우스 CD8+ T 림프구의 항온처리, 자성 칼럼을 통한 세포-입자 혼합물의 통과, 용출 및 그 다음 자석-결합된 분획의 배양에 의해 수행된다 (도 1). 농축의 효능을 평가하기 위해, Db-gp100 흑색종 항원에 특이적인 Thy1.1+ pmel TCR 형질전환 T 세포의 공지된 수는 B6 마우스 유래의 Thy1.2+ CD8 T 세포와 1:1000 비율로 혼합되었다. pmel gp100-특이적 aAPC를 이용한 농축 이후, 항원-특이적 pmel T 세포의 빈도는 용량-의존 방식에서 농축 이전 0.07%에서 농축 이후 1.17%까지 10-배 초과 증가시켰다 (도 2A). T 세포로 항온처리된 나노-aAPC의 양 최적화는 농축 효율을 증가시켰고 부가된 pmel T 세포의 95% 까지 회수를 유발하였다 (도 2B).
내인성 B6 CD8+ 비장세포 유래의 야생형 Db-gp100 세포의 농축은 가용성 MHC 오량체를 이용한 염색으로 평가되었다. Db-gp100 특이적 빈도는 농축에 앞서 검출가능한 수준 미만이었지만, 이후 0.30%까지 증가되었다. Db-gp100 입자로 항온처리된 비-특이적 Kb-Trp2 세포의 빈도는 증가하지 않았다 (도 2C).
농축 이후, 농축된 세포 및 나노-aAPC의 자석-결합된 분획 (양성 분획)은 용출되었고 시험관내 배양되었다. 후속의 증식에 관한 농축의 효과를 연구하기 위해, 풍부 절차는 음성 분획 (나노-aAPC에 결합되지 않은 CD8+ T 세포)의 수집, 및 양성 분획에 역으로 이의 부가에 의해 대조군 샘플에서 "무효화하였다" (도 3A).
농축은 증식 이후 항원-특이적 빈도 및 총 T 세포 수를 유의미하게 향상시켰다. Kb-Trp2 나노-aAPC를 이용한 농축 7 일 후, 양성 분획 유래의 증식된 세포의 17.6%는 음성+양성, 농축되지 않은 그룹 유래의 세포의 1.46%에 비교하여, Kb-Trp2 특이적이었다 (도 3B). 농축 절차는 음성+양성 분획에서 총 세포에서 더 많은 수에도 불구하고 총 항원-특이적 세포에서 2-3 배수 증가를 유발하였다. 총 T 세포 증식에서 증가가 림프친화성 사이토카인에 대한 감소된 경쟁에 의해 매개될 수 있음을 가설한다.
농축 + 증식 접근법은, 흑색종 항원 gp100 (Db-gp100), Kb-제한된 난백알부민 항원 SIIN (Kb-SIIN), 및 결장 암종 항원 Ld-AH1/A5 (Ld-A5)를 포함하여, 다양한 종양 및 모델 T 세포 항원에 광범위하게 적용가능하였다 (도 3D, 3E). 항원-특이적 세포의 절대 수 및 빈도는 항원-의존적이었다. Kb-SIIN 반응은 1 주 후 20% 항원-특이적 세포를 유발하였고, 반면에 Db-gp100 특이성은 총 T 세포의 대략 5% 및 Ld-A5 대략 7.5%이었다.
T 세포 증식은 해당 항원에 대한 공지된 전구체 빈도로부터 추정되었다 (표 1). 외래 항원에 대한 CD8 반응을 위한 전구체 빈도는 10s-100s/107,7 범위이고 자기-항원 예컨대 Trp2에 대한 상기 범위의 하부 말단에서인 것으로 예상된다. Db-gp100에 대한 전구체 빈도는 Kb-SIINF에 대하여 107,5 중 10에서 및 107 중 40-350에서 측정되었다. 1 주 후, 150,000 Trp2-특이적 세포는 107 다클론성 CD8 T 세포로부터 생성되었고; 따라서, Trp2-특이적 증식이 100 내지 1000 배임을 추정한다. 비교하자면, 대략 35,000 Db-gp100 및 150,000 Kb-SIINF 특이적 T 세포는 107 T 세포로부터 생성되었고, 각 항원에 대하여 최대 5,000 배 증식을 나타낸다. 이는 생체내18 바이러스 감염 이후 관측된 강력한 증식에 비교할만하다.
이들 추정을 유효화하기 위해, 증식 마커 염료 CFSE로 비처리 T 세포 집단을 표지하였고, 이는 T 세포 분할의 모든 순회로 절반 희석된다. E+E 4 일 후, Kb-Trp2 사량체 결합 T 세포는 검출가능한 한계 미만으로 그의 CFSE를 희석하였다. 나노-aAPC의 중간 정도의 용량으로 자극된 형질전환 pmel T 세포는 비교로 사용되었고; 이들 세포는 CFSE 형광의 다중 피크를 보여주었고, 분할의 2-7 순회 사이를 지시한다. 이는 농축된+증식된 Trp2-특이적 T 세포가 단지 4 일 후 256-배 초과 증식과 일치된, 분할의 7 순회 초과를 완료하였음을 측정하게 하였다. 증식된 T 세포는 강력한 활성화 및 증식과 일치된, CD62L 낮은 CD44 높은 효과기 기억 표현형을 보여주었다.
E+E에 의한 T 세포 증식은 Trp2 펩티드로 펄스된 성숙한, 골수 유도된 수지상 세포를 이용하여 증식와 비교되었다. 천만 비처리 림프구의 자극은, 0.5-2.85% 사이의 항원-특이적 빈도로, E+E로 달성된 수 및 빈도에서 대략 10-배 낮은, 2 ± 0.5 × 104 Trp2-특이적 T 세포를 유발하였다. 이는 인간에서 APC 및 인공 APC에 의한 증식와 일치되고, 여기에서 자극의 1 주 후 항원-특이적 반응은 빈번하게 검출불가능19이다.
다중 종양 항원에 대한 T 세포 반응의 동시 생성은 단일 비처리 T 세포 집단으로부터 생성된 항-종양 T 세포의 수를 증가시킬 것이고, 단일 항원20-22의 하향-조절 때문에 종양 면역 탈출의 가능성을 감소시킬 것이다. 따라서 동시에 다중 항-종양 집단 발생을 위한 단일-단계 E+E 프로토콜을 개발하였다.
비처리 림프구는, 각각 표준 단일-항원 용량에서, Db-gp100, Kb-SIINF, 및 Kb-Trp2 MHC 이량체를 보유한 나노-aAPC로 항온처리되었다. "삼중" E+E 1 주 후, 항원-특이적 T 세포는 해당 각 항원에 대해 오량체 염색으로 검출되었다 (도 3F). 각 집단의 빈도가 단 하나의 항원으로 자극된 대조군 샘플에서 발견된 것보다 더 낮은 경우 (도 3G), 총 항원-특이적 세포는 개별적으로 또는 동시에 단리되는지와 무관하게 동일하였다 (2-방식 ANOVA에 의한 p>0.4) (도 3G). 따라서, 삼중 E+E 프로토콜은 임의의 단일-항원 대조군으로서 각 종양 특이적 T 세포 집단에 효율적이었다.
입양성 전이되는 종양-특이적 T 세포는 성장 신호12-14에 대하여 공-전이된, 비-종양 특이적 방관자 세포와 경쟁한다. 그러나, 상기 효과는, 농축 + 증식 동안 발생함에 따라, 시험관내 미리 활성화된 T 세포의 항원-특이적 증식에 대하여 입증되지 않았다.
따라서 E+E (10% 및 1%, 각각) 있거나 없이 달성된 항원 특이적 빈도에 가까운 비율로 종양-특이적 pmel T 세포와 다클론성, 야생형 B6 세포를 조합하였다. 각 그룹에서, 투여된 pmel T 세포의 총 수는 동일하였고 (105); 단지 방관자 T 세포의 양은 상이하였다 (106 또는 107). pmel T 세포의 최대 수 및 최고 빈도는 더 적은 (106) 방관자 세포를 수용한 마우스에서 관측되었다 (도 4A-B). 대략 5.5 ± 1.5 × 105 pmel T 세포는 이들 동물의 비장 및 림프절로부터 회수되었다 (도 4B). 대략 1.4 ± 0.7 × 105 pmel T 세포는 107 방관자 세포를 받은 동물로부터 회수되었다 (터키 후-시험으로 2-방식 ANOVA에 의한 p<0.05). 따라서, 공-전이된 세포로부터 경쟁의 제거는 전이 이후 생착 및 증식을 향상시켰다.
또한, 종양-특이적 T 세포는 성장 신호24 에 대하여 숙주 세포와 경쟁하고, 이는 입양성 전이25,26에 앞서 숙주 방사선- 및 화학-기반된 림프구고갈의 사용을 동기화하였다. 따라서, 106 또는 107 방관자 세포를 받은 동물은 전이 24 시간에 앞서 500 cGy 감마 방사선으로 조사되었거나 또는 미치료되어, 4개의 실험적 그룹을 생성하였다. 조사되지 않았던 동물은 106 또는 107 방관자 그룹에서 회수된 0.3 × 105 pmel T 세포 미만으로 좋지 못한 생착을 보여주었다 (도 4A-B). 따라서, 양쪽 전이된 방관자 림프구 및/또는 숙주 림프구의 제거는 숙주에서 입양성 전이되는 종양-특이적 T 세포의 수율을 유의미하게 증가시켰다.
종양-특이적 림프구가 확립된 흑색종의 나노-aAPC 매개된 거부를 갖는 농축 + 증식에 의해 생성되는지 여부를 다음으로 측정하였다. 공격성, 저조하게 면역원성 흑색종 모델인, B16-F10 세포는 B6 숙주 마우스에 피하로 이식되었고 종양이 촉지가능할 때까지 8 일 동안 성장하였다. 병렬적으로, CD8 림프구는 비처리 B6 공여자 마우스로부터 단리되었고 Db-GP100 및 Kb-Trp2 항원에 대해 농축+증식되었고, 그 다음 림프구고갈 1 일 후 숙주에 전이되었다.
종양-특이적 E+E 공여자 림프구를 받은 동물은 미처리된 마우스, 또는 부적절 Kb-SIINF 항원에 대해 생성된 동등 수의 림프구를 받은 마우스보다 유의미하게 더 덜한 종양 성장을 가졌다 (도 4C). 종양 주사 18 일 후, 미처리된 마우스에 대한 평균 종양 면적은 처리된 Kb-SIINF 처리된 마우스에 대하여 144 ± 11 mm2 및 Db-gp100/Kb-Trp2 처리된 마우스에 대하여 22 ± 9 mm2 에 비교하여 130 ± 12 mm2이었다 (터키(Tukey) 후-시험을 갖는 ANOVA에 의한 p<0.05).
미처리된 및 Kb-SIINF 처리된 그룹에서 모든 마우스는 과도한 종양 부하 때문에 일 22에서 희생되었다. 그에 비해, Db-gp100/Kb-Trp2 그룹에서 마우스는 일 24까지 희생되지 않았고, 2/8 마우스는 이식 2 개월 이후 검출가능한 종양을 갖지 않았다 (Mantel-Cox에 의한 p<0.01). 중앙 생존은 미처리된 (20 일) 또는 비-동족 처리된 (20 일) 그룹보다 E+E 처리된 그룹 (28 일)에서 유의미하게 더 컷다. 따라서, 단지 1 주 동안 비처리 세포 유래의 배양된 E+E 림프구는 지연될 수 있었고 일부 경우에서 확립된 B16 흑색종을 완전히 거부할 수 있었다.
HLA-A2로 작용화된 나노-aAPC에 의한 농축 + 증식은 비처리 림프구 유래의 인간 항-종양 반응 증식에서 또한 유효하다. 인간 CD8+ 림프구는 건강한 공여자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리되었고, E+E는 NY-ESO1 또는 MART1 종양 항원을 보유한 나노-aAPC로 수행되었다. 1 주 후, 44,000 ± 21,000 NY-ESO1 특이적 세포는 생성되었고, 대략 1000-배 전구체 증식을 나타내었다 (표 1, 도 5). MART1 반응에 대하여, 83,000 ± 37,000은 1 주 지나서 생성되었고; 이는 대략 100-배 증식을 나타내고, 심지어 건강한 공여자 27에서 발견된 MART1 반응의 높은 전구체 빈도를 반영한다 (표 1, 도 5). 따라서 농축 + 증식은 비제한적으로 뮤린 T 세포이지만, 또한 비처리, 낮은 빈도, 항-종양 인간 CTL의 증식을 위한 강력한 접근법이다.
암에 대한 입양성 면역요법의 널리-확산된 적용은 종양-특이적 세포의 비용-유효한 및 편리한 공급원의 이용가능성에 의해 제한된다. 본원에서, 1 주에 1000-배 초과 증식로, 비처리 세포 유래의 고빈도로 다수의 종양-특이적 림프구를 빠르게 증식하기 위한 유선형의 기술을 개발하였다. 농축에 의해 부적절 방관자 세포의 제거가 양쪽 시험관내 배양 동안 및 생체내 입양성 전이 이후 종양-특이적 T 세포에 유의미한 생존 및 증식 이점을 부여한다는 것을 추가로 입증한다.
항원-특이적 T 세포가 T 세포 증식 28-30 이후 MHC 사량체를 이용하여 농축될 수 있는 반면, 현대 플랫폼은 농축 및 증식을 단일 시약으로 수행되도록 함으로써 상기 공정을 단순화한다. 더욱이, 공자극의 부재하에 다량체성 MHC에 의한 TCR의 가교결합은 사량체 개입 이후 항원-특이적 세포의 최대 2분의 1의 결실과 함께 T 세포 세포자멸사 또는 무력증 31-33을 유도할 수 있다. 따라서, 양쪽 T 세포 농축 및 증식을 위한 단일 플랫폼의 사용은 현존하는 프로토콜상에서 단순화 및 개선시킨다.
종양-특이적 T 세포는 이제 항-암 TCR 또는 키메라성 항원 수용체 (CAR)1를 발현시키기 위해 림프구의 유전공학에 의해 생성될 수 있고 이용가능성 증가에 대한 유망한 접근법이지만; 그러나, 내인성 내성 기전에 의해 조절되지 않는 외래 수용체는 시험34에서 관측된 유의미한 독성으로 교차-반응성 및 독성의 가능성을 이론적으로 증가시킨다. 자가조직 흑색종-침투 림프구는 임상 시험에서 매우 유효함을 증명하지만, 모든 흑색종 환자로부터 또는 대부분의 다른 암2에 대하여 배양될 수 없다.
내인성, 비처리 세포 유래의 반응 발생을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 따라서 양쪽 이용가능성 및 안전성3을 증가시킬 수 있다. 현존하는 프로토콜은 비처리 세포35,36 유래의 유도된 반응을 갖는 촉진성 결과를 입증하였지만, 그러나 수주 내지 수개월에 걸쳐 반복된 자극 및 클로닝에 좌우되어 주입 당 투여된 108 내지 1010 종양-반응성 T 세포36-38를 생성시켜, 고비용 및 복합성을 유발한다. E+E는 더 짧은 기간에서 강력한 증식을 생성하기 위해 현존하는 시도에 비교된, 양쪽 총 수 및 순도에 관하여, 유망한 신규 접근법이다. 예를 들어, 배양액에서 1 주 후 수지상 세포-기반된 접근법으로 NY-ESO1의 증식은 검출불가능하거나 보고되지 않아, 더욱더 현저한 1000-배 증식로 4-27% 사이의 항원 특이적 순도를 달성한다. 그에 반해서, 몇 개의 그룹은 높은 전구체 빈도 MART1 반응의 유효한 증식을 보고하였다. 예를 들어, Wolfl et al39에 의해 기재된 신규 DC-기반된 ACE-CD8 플랫폼은 인간 CD8 세포의 증식용 요건을 정의 및 최적화 일조에 매우 유용하고 인상적인 10 일 증식을 보여주는 양호하게-특성화된 시스템이고, 배양 조건의 추가 최적화가 시험관내 최적 MART1 증식을 지지하도록 요구되는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 임상적으로 필요할 수 있는 T 세포의 양을 발생시키기 위해, DC-기반된 ACE-CD8 플랫폼은 환자 유래의 잠재적으로 다중 혈장사혈을 여전히 요구하여 비-항원-특이적 기술의 증식 또는 사용을 위한 DC의 매주 배양을 발생할 것이다. 나노-aAPC 기반 E+E는 상기 구속의 대상이 아니다.
대략 1-10 / 백만의 종양-특이적 T 세포 전구체 빈도, 단일 백혈구분반술로부터 수확된 대략 0.5×1010 CD8 T 세포, 및 E+E로 관측된 1000-5000 배 증식을 가정하면, 108 초과 항원 특이적 T 세포는 1 주에 생성될 수 있다. 동시 증식 다중 항원은 상기 수를 추가로 증가시킬 것이고, 주입을 위하여 충분한 세포를 수득한다. 따라서, 세포성 APC를 배양하기 위한 필요성 제거 및 높은-빈도 종양-특이적 T 세포의 다수 생성 간소화로, 농축 + 증식은 자가조직 종양 면역요법 프로토콜에 강력한 부가가 될 수 있다.
방법
마우스 및 시약. Pmel TCR/Thy1a Rag-/- 형질전환 마우스는 동형접합체로서 유지되었다. C57BL/6j 및 Balb/C 마우스는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)로부터 구매되었다. 모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 기관 감사 위원회에 따라 유지되었다. 형광성으로 표지된 단클론성 항체는 BioLegend (San Diego, CA)로부터 구매되었다.
MHC-Ig 이량체 및 나노-aAPC의 제조. 가용성 MHC-Ig 이량체, Kb-Ig, Db-Ig, 및 A2-Ig는 제조되었고 기재된 바와 같이 펩티드로 부하되었다.19 나노-aAPC는 기재된 바와 같이 MACS Microbeads (Miltenyi Biotec)에 MHC-Ig 이량체 및 항-CD28 항체 (37.51; BioLegend)의 직접적인 콘주게이션에 의해 제조되었다.15
림프구 단리. 마우스 림프구는 RBC의 저삼투압 용해 이후 균질화된 마우스 비장 및 림프절로부터 수득되었다. 세포독성 림프구는 제조 프로토콜을 따른 Miltenyi Biotec (Cologne, Germany)으로부터 CD8 무-접촉 단리 키트 및 자성 농축 칼럼을 이용하여 단리되었다. 해당하는 경우, 세포는 37℃에서 15 분 동안 카복시플루오레신 석신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지되었고, 그 다음 광범위하게 세정되었다. 인간 연구를 위하여, 존스 홉킨스 대학의 윤리 위원회는 상기 연구를 승인하였고 모든 건강한 지원자는 서면 고지에 의한 동의를 제공하였다. HLA-A2+ 공여자의 PBMC는 밀도 구배 원심법 (Lymphocyte Separation Medium Ficoll-Paque, GE Healthcare)으로 수득되었다. 그 뒤에, CD8+ T 세포는 제조 프로토콜을 따른 Miltenyi Biotec (Cologne, Germany)으로부터 CD8 무-접촉 단리 키트 및 자성 농축 칼럼을 이용하여 단리되었다. 정제된 CD8+ T 세포는 4 ℃에서 1시간 동안 나노-aAPC로 염색되었고 MS-칼럼 (Miltenyi Biotec)을 이용하여 자석으로 농축되었다.
농축 및 증식. 10 백만 CD8-농축된 림프구는 4℃에서 1 시간 동안 10 μl의 나노-aAPC로 항온처리되었다. 세포-입자 혼합물은 그 뒤에 자성 농축 칼럼을 통해 통과되었고, 음성 분획은 수집되었고 양성 분획은 용출되었다. 단리된 분획은 혼합되었고 1 주 동안 5% CO2 및 37 ℃를 제공하는 가습된 항온처리기 내 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (Falcon)에서 10% 인간 자가조직 혈청 및 3% T 세포 성장 인자 (TCGF)로 보충된 완벽한 RPMI-1640 배지에서 7 일 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 배양되었다. 배지 및 TCGF는 1 주 1회 보충되었다. CTL의 특이성은 FACS 분석을 이용한 사량체 및 MHC-Ig 염색에 의해 일 0 및 7에서 모니터링되었다.
방관자 생체내 실험. pmel 및 야생형 B6 CD8+ T 림프구의 혼합물은 지시된 비율로 혼합되었다. 세포 혼합물은 입양성 전이에 앞서 20 μl의 Db-gp100 나노-aAPC로 1 주 동안 배양되었다. 일시적 림프구감소증은 지시된 그룹에서 MSD Nordion Gammacell 이중 Cs137 공급원 (Johns Hopkins Molecular Imaging Center)으로 입양성 전이 1 일 전 입술밑 조사 (500 cGy)로 숙주 마우스에서 유도되었다. 마우스는 30,000 단위체 복강내 IL-2로 입양성 전이의 일 또는 다음날 양쪽에서 처리되었다. 입양성 전이 7 및 20-일 후, 3 마우스 / 그룹은 희생되었고 림프구는 말초 혈액, 비장, 및 서혜, 자궁경부, 및 겨드랑이 림프절로부터 단리되었고 그 다음 항-Thy1.1 항체로 염색되었다.
종양 거부 실험. 종양 거부 실험은 상기에서와 같이 수행되었고, 예외로 3x105 B16 흑색종 세포가 입양성 T 세포 전이 10 일에 앞서 피하로 주사되었다. 일시적 림프구감소증은 상기에서 기재된 바와 같이 입양성 전이 1 일 전에 유도되었다. 각 공여자 유래의, 10,000,000 비처리 림프구가, 생성된 대략 2x105 종양-특이적 T 세포를 나타내는, 각 종양 숙주 (최대 3 숙주 / 공여자)에 대하여 항원-특이적 세포를 생성하기 위해 사용되었고 배양 1 주 후 전이되었다. 마우스는 30,000 단위체 복강내 IL-2로 입양성 전이의 일 및 다음날 양쪽에서 처리되었다. 종양 성장은 디지털 캘리퍼스를 사용하여 2 일 간격으로 모니터링되었다. 종양이 150 mm2를 달성하면 마우스는 희생되었다.
항원-특이적 T 세포 증식. 추정된 T 세포 전구체 빈도 / 10,000,000 림프구. (참조로) 10,000,000 림프구로부터 생성된 항원-특이적 세포.
항원 전구체 빈도
(천만 세포 당)		 Ag-특이적 세포 배 증식
Kb-Trp2 10-1007 130,000 ±80,000 1,300-13,000x
Db-gp100 10-1005 35,000±10,000 350-3,500x
Kb-SIINF 20-3507 150,000±75,000 450-7,500x
A2-NY-ESO1 3627 44,000±21,000 1200x
A2-MART1 100027 83,000±37,000 83x
실시예 2
신생-항원의 증식
지금까지 기재된 종양 항원은 종양에서 과-발현되고, 다중 환자 유래의 종양 사이에서 공유된 또는 종양에 존재하는 단백질로부터 유도된 이전에 공지된 "공유된 항원"이다. 게놈-전체 서열분석의 출현으로, 대부분의 암이 환자의 MHC에 결합할 수 있는 클로날, 비-동의성 단일 염기쌍 치환을 함유하고, 이로써 면역요법에 대한 새로운 길을 열어준다는 것을 보여주었다.29 후속의 분석은 상기 아이디어를 강화하였다.38-45 이들 "신생-항원"은 종양 표적으로서 공유된 항원에 대한 이론적 이점, 예컨대 종양 조직에 대한 더 큰 특이성 및 잠재적으로 더 높은-친화도 TCR-MHC 상호작용을 갖는다. 그러나, 돌연변이의 패턴은 각 암에서 독특하고, 방법은 급속 개인화된 식별 및 이들 신생-항원의 표적화를 위하여 개발되어야 한다.
농축 + 증식을 이용하여 신생-항원에 대한 T 세포 반응을 생성하기 위해, 마우스 흑색종 계통 B16 및 결장 암종 계통 CT26에 대하여 기재된 공개된 "무토메"를 이용하였다.46,47 간단히, 게놈성 및 전사체성 데이터 세트는 발현된 단일 염기쌍 치환을 식별하기 위해 조합되었다 (도 6A). 각 SBS의 8 또는 9개의 측접하는 아미노산 업스트림 및 다운스트림은 인실리코 추출되었다. 이들 ~17-아미노산 서열은 그 다음 인공 신경 네트워크48를 이용하여 인간 HLA 뿐만 아니라 마우스 MHC 대립유전자에 대한 펩티드의 결합을 예측하는 알고리즘인, NetMHC에 의해 가공되었다. 상기 알고리즘은 CT26 및 B16에 대하여 아미노산 신생-에피토프 8 내지 10 아미노산 길이를 예측하였다 (표 2). 광범위 예측된 친화도를 나타내는 7 후보 펩티드, CT26로부터 2 및 B16으로부터 5는 합성되었고 신생-에피토프 특이적 나노-aAPC를 생성하기 위해 사용되었다. 이들 신생-에피토프를 보유한 나노-aAPC를 이용한 E+E는 그 다음 수행되었고 일 7에서 MHC 다량체로 평가되었다.
일 7 배양액으로부터 항원-특이적 집단은 시험된 2개 CT26-유도된 후보 펩티드 (FPS 및 SAF)의 양쪽에 대하여 식별되었다. 도 6B는 Ld-FPS 및 Ld-SAF 활성화된 샘플의 대표적인 일 7 동족 MHC 염색을 보여준다. B16 무토메로부터 유도된 펩티드는 반응성 (Db-YTG) 및 비-반응성 (Kb-LAY) 염색 패턴을 보여주었고 (도 6B); 탐구된 전체 2/5 펩티드 (Db-YTG 및 Kb-VDW)는 강한 반응을 보여주었고, 2/5는 중간 정도의 반응 (Db-IAM 및 Db-RTF)을 보여주었고, 1/5은 비-반응성 (Kb-LAY)이었다. NetMHC (표 2)에 의해 예측된 바와 같이 MHC에 대한 펩티드 친화도는 E+E 반응을 정확하게 예측하지 못했고; 강한 반응군 YTG 및 VDW는 991 및 9066 nM 각각에서 낮은 예측된 친화도를 가졌고, 반면에 비-반응군 LAY 및 애매한 반응군 IAM은 69 및 5 nM 각각에서 높은 예측된 친화도를 가졌다. 전반적으로, 일 7에서 생성된 세포의 총 수는 15,000 - 40,000 (도 6C) 범위의 공유된 항원 Db-GP100 및 Ld-A5로 관측된 것에 근접하였지만, 공유된 항원 Kb-TRP2 및 Kb-SIIN 미만이었다.
후보 신생-에피토프
P에피토프용 최상 단백질 (황색=10mer) 돌연변이체
펩티드
(10mers 포함) 		예측된
친화도
(nM) 		대립유전자
Actn4 VTFQAFIDV 210 H-2-Kb
Atp11a QSLGFTYL 19 H-2-Kb
Cpsf3l RTFANNPGPM 2043 H-2-Db
Dag1 TTTTKKARV 2024 H-2-Kb
Ddb1 VLMINGEEV 153 H-2-Db
Ddx23 QTAMFTATM 112 H-2-Kb
Dpf2 LALPNNYCDV 318 H-2-Db
Eef2 ESFAFTADL 277 H-2-Kb
Fat1 IAMQNTTQL 5 H-2-Db
Fzd7 VAHVAAFL 87 H-2-Kb
Kif18b VDWENVSPEL 9066 H-2-Kb
Mthfd11 TILNCFHDV 1761 H-2-Kb
Orc2 VVPSFSAEI 39 H-2-Kb
Pbk AAVILRDAL 121 H-2-Db
Plod2 VWQIFENPV 111 H-2-Kb
S100a132510039O18 TVVCTFFTF 379 H-2-Kb
Sema3b VSAAQAERL 1487 H-2-Kb
Tm9sf3 AIYHHASRAI 191 H-2-Kb
Tnpo3 LAYLMKGL 69 H-2-Kb
Tubb3 YTGEAMDEM 991 H-2-Db
Wdr82 TNGSFIRLL 87 H-2-Kb
NetMHC에 의해 예측된 바와 같이 MHC 친화도를 포함하여, B16 종양으로부터 유도된 신생-에피토프를 함유한 후보 펩티드 서열의 목록.
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실시예 2를 제외한 전체 출원을 위한 참조
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Claims (38)

  1. 대상체 유래의 비처리 T-세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플을 상자성이고 이들의 표면상에서 하나 이상의 펩티드 항원을 제시하는 MHC-펩티드 항원-제시 복합체 및 CD28에 대한 림프구 공자극 리간드를 포함하는 입자의 집단과 접촉시키는 단계로서, 상기 입자가 10 nm 내지 500 nm 직경인, 단계;
    상기 상자성 입자에 근접하여 자기장을 배치하여, 이에 의해 항원-특이적 비처리 T 세포를 동시에 농축 및 활성화시키고, T 세포 수용체 클러스터링을 촉진시키는 단계;
    상기 상자성 입자와 관련된 세포를 상자성 입자와 관련되지 않은 세포로부터 분리시키는 단계;
    상기 상자성 입자와 관련된 상기 세포를 회수하는 단계; 및
    상기 회수 및 농축된 세포를 배양액(culture)에서 1 내지 3 주 동안 증식시켜서 상기 펩티드 항원(들)에 특이적인 T 세포를 포함하는 T-세포 집단을 제조하는 단계로서, 상기 T-세포 집단은 상기 펩티드 항원(들)에 특이적인 적어도 106 T 세포를 갖고, 상기 T-세포 집단에서 적어도 10%의 세포가 상기 펩티드 항원(들)에 특이적인 것인 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 펩티드 항원에 대한 T-세포 집단을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원-특이적 T 세포가 CD8+ 세포독성 T 림프구인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 T-세포가 암 환자 또는 공여자 유래의 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 결장암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 도관암, 간암, 췌장암, 신장암, 자궁내막암, 고환암, 위암, 형성이상 경구 점막, 용종증, 두경부암, 침습성 경구암, 비소세포 폐암종, 소세포 폐암, 중피종, 과도기적 및 편평상피 세포 비뇨기 암종, 뇌암, 신경교세포종, 또는 신경아교종인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 암이 흑색종인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 암이 혈액 악성종양인 방법.
  7. 제1항에 있어서, T 세포를 포함하는 상기 샘플이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플인 방법.
  8. 제1항에 있어서, T 세포를 포함하는 상기 샘플이 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 또는 종양 유래의 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, T 세포를 포함하는 상기 샘플이 백혈구분반술(leukapheresis)에 의해 단리된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 CD8+ 세포에 대해 농축되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 106 CD8-농축된 세포가 접촉, 배치, 및 회수의 단계에 사용되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 상자성 입자가 철 덱스트란 비드를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 MHC-펩티드 항원-제시 복합체가 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 복합체인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 MHC-펩티드 항원-제시 복합체가 단량체성 또는 이량체성인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 MHC-펩티드 항원-제시 복합체가 이량체성이고, 상기 MHC-펩티드 항원-제시 복합체가 디설파이드 결합에 의해 회합된 면역글로불린 중쇄 서열과의 MHC의 융합을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 서열이 IgG 서열인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 MHC가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-E를 포함하는 MHC 클래스 I 복합체인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 MHC가 HLA-A2인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 MHC-펩티드 항원-제시 복합체의 면역글로불린 서열이 인간화된 단클론성 항체 서열인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 공자극 리간드가 단클론성 항체, F(ab')2, Fab, scFv, 및 단쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 단편이 인간화된 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 공자극 리간드가 인간화된 단클론성 항체 9.3 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 상자성 입자가 20 nm 내지 200 nm 이내의 크기를 갖는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항원 제시 복합체 및 상기 공자극 리간드가 상기 상자성 입자의 상기 표면에 공유 결합되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 3개 내지 10개의 상이한 항원이 상자성 입자의 상기 집단에서 상기 항원 제시 복합체에 의해 제시되는 것인 방법.
  26. 제3항에 있어서, 상기 항원-제시 복합체가 종양 관련 항원을 제시하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 회수하는 단계는 항원-특이적, 비처리 T 세포에 대해 농축하는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 세포가 자기장의 존재하에 배양액에서 증식되는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 적어도 15% 항원-특이적 T 세포, 또는 적어도 20% 항원-특이적 T 세포, 또는 적어도 25% 항원-특이적 T 세포를 유발하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 적어도 107, 또는 적어도 108 항원 특이적 T 세포가 수득되는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 회수된 T-세포가 표현형 특성화 단계를 거친 것인 방법.
  32. 제3항에 있어서, 상기 항원-제시 복합체가 환자의 종양의 유전적 분석으로부터 예측된 신생항원을 제시하고, 상기 신생항원이 패신져(passenger) 돌연변이, 드라이버(driver) 돌연변이, 종양유전자 형성 돌연변이, 및 종양 억제인자 파괴 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이에 의해 형성되는 것인 방법.
  33. 제3항에 있어서, 상기 항원-제시 복합체가 환자의 종양의 유전적 분석으로부터 예측된 항원을 제시하는 것인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 항원-특이적 T-세포가 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 것인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 항원-특이적 T-세포로부터 mRNA를 단리시키는 단계, 및 상기 mRNA로부터 유도된 cDNA, 또는 상기 mRNA 상에서, 서열 측정 반응( sequence determination reaction)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 상자성 입자가 검출가능하게 표지되는 것이고, T-세포 활성화 마커의 발현에 대하여 상기 항원-특이적 T-세포를 검정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 항원 제시 복합체 및 상기 공자극 리간드가 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 결합 쌍을 통해 상기 상자성 입자의 상기 표면에 결합되는 것인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 표현형 특성화가 CD62L, CD45RA, PD-1, CTLA-4, Tim-3, Lag-3, 및 ICS로부터 선택되는 마커에 대해 검정하는 것을 포함하는 것인 방법.
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