KR20200055156A - 세균 감염들의 치료용 합성 펩타이드들 - Google Patents
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Abstract
세균 감염 및 관련된 염증의 치료를 위한 펩타이드들 및 방법들이 기재되어 있다. 유효 투여량들 및 치료 프로토콜들이 기재되어 있다.
Description
세균 감염들을 치료하기 위한 펩타이드들 및 방법들이 본원에 기재되어 있다.
본 출원 전체에서, 다양한 공보들이 괄호들 안에 아라비아 숫자들로 참조되어 있다. 이들 공보들에 대한 완전한 인용들은 본 명세서의 선행 기술 단락에서 찾을 수 있다.
패혈증을 포함하여, 그람-음성 또는 그람-양성 세균들, 또는 이들의 혼합물에 의해 유발된 중증의 세균 감염들은, 강력한 항미생물제들의 이용가능성 및 지지적 치료에서의 진보들에도 불구하고, 전세계적인 이환율(morbidity) 및 사망률의 주요 원인이다[1].
스트렙토코쿠스-피오게네스(Streptococcus pyogenes)[에스. 피오게네스(S. pyogenes)] 및 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)[에스. 아루레우스(S. aureus)]와 같은, 그람-양성 세균들에 의해 유발된 국재화된 감염들은 패혈증 및 치명적인 패혈성/독성 쇼크로 진행할 수 있는, 열 및 저혈압을 포함하는, 전신 독성의 징후들에 의해 흔히 복잡해진다. 이러한 유형들의 세균들은 과도한 세포 면역 반응을 촉발시킬 수 있는, 스타필로코쿠스 장독소들 SEA-SEE, 독성 쇼크 증후군 독소 1(TSST-1) 및 스트렙토코쿠스성 발열성 외독소들 SPEA 및 SPEC를 포함하는, 외독소 단백질들, 또는 초항원들(SAgs)을 분비할 수 있다[2-7].
예를 들어, 괴사성 연조직 감염(Necrotizing Soft Tissue Infection: NSTI)은 천근막(superficial fascia) 및 피하 지방 둘 다가 관련되며 감염된 부위에서의 통증 및 다수 기관 손상을 포함하는 전신 독성에 의해 특징화되는 급성의, 신속하게 진행하는 심각한 피부 감염이다. 당해 감염은 자발적으로 또는 외상 후 발생할 수 있다. 이러한 유형의 감염들은 항생제들에 대해 불량하게 반응하기 때문에, 괴사 조직을 제거하는 공격적인 외과적 개입이 의무적이다. 치료에도 불구하고, 사망률은 현재 대략 10 내지 20%이다. 일반적인 세균 병인학이 존재하지는 않지만, 에스. 아우레우스(S. aureus)을 포함하는 세균 종들, 클로스트리디아(Clostridia) 종들, 장내세균 및 비-클로스트리디움 혐기성 균들이 때때로 혼합된 또는 다중-병원성 감염으로서 가장 흔히 확인된 것들이다. 현재, 이러한 지침에 대해 이용가능한 승인된 약물 제품들이 존재하지 않으므로, 효과적인 치료요법들에 대한 의학적 요구를 유의적으로 충족시키지 못하고 있다.
그 결과, 심각한 감염들의 효과를 완화시킬 수 있고 사망률을 감소시킬 수 있는 부가적인 치료요법들을 개발하기 위한 노력들이 집중되어 왔다. 세균 독성 인자들을 중화시키고/시키거나 숙주 방어를 향상시킬 수 있는 제제들의 이용가능성은, 특히 항생제 치료요법과 함께, 이들 감염들의 치료요법을 증진시킬 수 있다.
염증-유도된 림프구 세포자멸사(apoptosis) 또는 세균 독소들에 의한 피롭토시스(pyroptosis)는 실험적 감염 모델들 및 내독소- 및 초항원-유도된 독성 쇼크 모델들에서 면역억제 및 치사율의 주요 원인인 것으로 밝혀져 왔다. 최근의 증거는, CD40 및/또는 CD 80/86을 포함하는 공-자극 시그날들의 차단이 실험적 복강내 패혈증에서 사망률을 감소시킬 수 있음을 나타낸다[8].
본원에 기재된 펩타이드 p2TA는 사람 말초 혈액 단핵 세포들에서 염증성 사이토킨들의 초항원-매개된 유도를 차단하고 마우스들에서 초항원-매개된 치사율을 차단하는 것으로 이미 보고되었다[9, 10].
본원에 기재된 주제에 대한 배경으로서 관련된 것으로 고려된 참조문헌들을 하기 나열한다:
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Dellinger, R. P., et al. (2008) Crit Care Med, 36(1):296-327.
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본원의 상기 참조문헌들의 인식은, 이들이 본원에 기재된 주제의 특허성과 어떠한 방식으로도 관련되어 있음을 의미하는 것으로 추론되어서는 안된다.
감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료가 요구되는 사람 피검자(subject)에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한, p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르가 본원에 제공되며, 여기서, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다. 추가로 또는 달리는, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.1 mg 내지 약 0.75 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다. 추가로 또는 달리는, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.25 mg 내지 약 0.5 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 유도체는 또한 D-Ala-p2TA로 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
본 기재내용의 제2의 국면에서, 후술되는 요구되는 사람 피검자에서, 적어도 하나의 그람-양성 세균, 그람-음성 세균, 다균성 감염 및 세균 독소들에 의해 유도된, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로부터 발생되거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 당해 손상을 억제하며 완화시키는 것들 중의 적어도 하나를 위한 방법에서 사용하기 위한, p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르가 제공되며, 여기서, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다. 추가로 또는 달리는, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당약 0.1 mg 내지 약 0.75 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다. 추가로 또는 달리는, 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.25 mg 내지 약 0.5 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다.
기재된 주제의 상기 제2의 국면의 상기 다른 구현예들에서, 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 상기 적어도 하나는 적어도 하나의 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염, 세균 독소들 및 다른 독성 세균들 성분들에 의해 유도될 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서 상기 그람-음성 세균은 프로테오박테리아(proteobactgeria), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 엔테로-박테리아세아에(Entero-bacteriaceae), 슈도모나스(Pseudomonas), 모락셀라(Moraxella), 헬리코박터(Helicobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 아세트산 세균들, 레지오넬라(Legionella), 알파-프로테오박테리아(alpha-proteobacteria), 볼바키아(Wolbachia), 그람-음성 코키(Gram-negative cocci), 나이세리아(Neisseria) 종들, 나이세리아 고노로에아에( neisseria gonorrhoeae), 나이세리아, 메닌기티디스(meningitidis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 그람-음성 바실리, 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 세라티아 마르케스켄스(Serratia marcescens), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 프란키셀라 툴라레미아(Francisella tularemia), 비브리오(Vibrio), 불니피쿠스(vulnificus), 콜레라에(cholerae), 플루비알리스(fluvialis), 파라헤몰리티쿠스(parahemolyticus), 알기놀리티쿠스(alginolyticus), 포토박터 담셀라(Photobacter damsela), 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum), 포르피로모나스(Porphyromonas)/프레보텔라 아종 프레보텔라 인테르메디아(prevotella sp. Prevotella Intermedia), 프레보텔라 부카에(Prevotella Buccae), 프레보텔라 아종(Prevotella sp.), 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 NDM-1 세균 균주들 중의 어느 하나일 수 있으며, 상기 그람-양성 세균들은 그룹 A 스트렙토코쿠스(streptococcus), 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 뉴모니아(S. pneumonia), 그룹 B 스트렙(strep), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 그룹 D 스트렙토코쿠스(streptococcus), 그룹 G 스트렙토코쿠스(streptococcus), 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans), 스트렙토코쿠스 밀레리(Streptococcus milleri), 프로피오니박테리움 아종(Propionibacterium sp.), 엔테로코쿠스 파에키움(Enterococcus faecium), 펩토스트렙토코쿠스 아종(Peptostreptococcus sp.), 스트렙토코쿠스 미크로아에로필릭(Streptococcus Microaerophilic), 락토바실루스 아종(Lactobacillus sp.), 스타필로코쿠스 에피데르미스(Staphylococcus Epidermis) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중의 어느 하나일 수 있으며, 상기 다균성 감염은 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 또는 이들의 조합에 의해 유발될 수 있으며, 상기 독성 세균 성분들은 외독소들, 내독소들, 초항원 독소들, 병원체 관련된 분자 패턴들(PAMPs), 손상 관련된 분자 패턴 분자들(DAMPs), 지질다당류들, 펩티도글리칸들(peptidoglycans) 또는 이의 독성 성분들, 선천적인 면역계의 세포들에 의해 인식된 병원체들의 그룹과 관련된 분자들 및 톨-유사 수용체들(Toll-like receptors: TLRs)에 의해 인식된 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들 중의 어느 하나일 수 있다.
본원에 기재된 주제의 상기 및 모든 다른 구현예들 및 국면들에서, 상기 손상은 전신계 손상 또는 감염 부위에서의 손상일 수 있으며, 괴사 연조직 감염(NSTI), 다균성 복강내 감염 및 화상들 중의 어느 하나로 나타날 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 상기 손상은 다-기관 기능부전, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 관절염 및 패혈성 쇼크 중의 적어도 하나를 초래할 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 투여는 경구 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 수막내 또는 피하 주사, 직장내 투여, 비강내 투여, 안구 투여 및 국소 투여 중의 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 펩타이드는 상기 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 발병 후 임의의 적합한 시간에, 예를 들면, 상기 감염 또는 이와 관련된 급성 감염의 상기 발병 후 즉시, 또는 약 30분 내지 약 72시간의 범위 내에, 또는 약 30분 내지 약 7일의 범위 내에 투여될 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 방법들은 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제 및/또는 보호 치료의 지원 표준을 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제는 최적 이하 투여량(suboptimal dose) 또는 치료학적 투여량일 수 있는, 적합한 투여량으로 투여된, 항세균제들, 항바이러스제들, 항진균제들, 항생제들, 세균정지제들 및 살세균제들, 스테로이드들 및 항미생물 제제들 중의 어느 하나일 수 있다. 보호 치료의 상기 지원 표준은 환기(ventilation), 수술, 상처 치유, 고압 산소, IVIG(정맥내 면역글로불린들), 코르티코-스테로이드들, 혈장분리반출술, 음성압 상처 치료요법[백 드레싱들(vac dressings)] 및 활성화된 단백질 C 중 적어도 어느 하나이다. 상기 펩타이드 및 상기 추가의 치료학적 유효 제제는 동시 투여될 수 있다. 달리는 및 추가로, 상기 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 치료학적 유효 제제는 상이한 시점들에서, 상이한 투여 간격들로, 상이한 기간 동안, 및/또는 상이한 순서로 투여될 수 있다. 상기 펩타이드 및 상기 추가의 치료학적 유효 제제의 투여 사이의 상기 간격은 0 내지 72 시간일 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 모든 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 펩타이드는 약제학적 조성물 속에 포함될 수 있으며, 당해 조성물은 적어도 하나의 생리학적으로 허용되는 첨가제들, 담체들, 희석제들 및 부형제들을 포함한다.
기재된 주제의 상기 국면들 및 구현예들에서, 상기 펩타이드는 단일 투여로 투여될 수 있다.
제3의 국면에서, 본 기재내용은 감염 및 이와 관련된 급성 감염 중의 적어도 하나의 치료가 요구되는 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료 방법에 사용하기 위한, p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 제공하고, 여기서, 상기 방법은 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 상기 펩타이드를 단일 투여함을 포함한다. 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
제4 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 사람 피검자에서 적어도 하나의 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들에 의해 유발된 감염 또는 이와 관련된 급성 염증으로부터 발생하거나 이와 관련된 손상 또는 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 이를 억제시키며 완화시키는 적어도 하나의 방법에서 사용하기 위한, p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능적 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 제공하며, 당해 방법은 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 상기 펩타이드 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 기능성 단편, 염 또는 에스테르를 단일 투여함을 포함한다. 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 제3 및 제4 국면들의 모든 구현예들 및 기재된 주제의 다른 국면들 및 구현예들에서, 상기 치료학적 유효량은 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중, 예를 들면 약 0.1 mg 내지 약 0.75 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중, 예를 들면, 약 0.25 mg 내지 약 0.5 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중일 수 있다.
기재된 주제의 다른 국면들 및 구현예들은 설명이 진행됨에 따라 명백해질 것이다.
기재된 주제를 이해하고 이를 실제로 수행할 수 있는 방법을 실현하기 위하여, 구현예들을 첨부한 도면들을 참조하여, 단지 비-제한적인 실시예를 제공하기 위해 기술할 것이며, 여기서:
도 1은, D-Ala-p2TA 치료가, 살아있는 에스. 아우레우스 감염에 의해(도 1a) 또는 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들에 대한 노출에 의해(도 1b) 생성된 패혈성 관절염으로부터 마우스들을 보호할 수 있음을 입증하는 그래프들을 포함한다. 약어들: SA는 패혈성 관절염을 나타내고 MSA는 마우스 혈청 알부민을 나타낸다.
도 2는, D-Ala-p2TA 치료가 감염 후 1시간 및 5시간의 지연된 시점들에서 확립된 에스. 피오게네스 감염으로부터 마우스를 보호할 수 있음을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯(Kaplan-Meier survival plot)이다.
도 3은, D-Ala-p2TA를 감염 후 1시간의 지연된 시점에 투여하는 경우, 마우스들의 에스. 피오게네스 연조직 감염, 투여량 반응의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 4는 감염 후 36시간 째에 D-Ala-p2TA 및 항생제들의 상승 효과를 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 5는 에스. 피오게네스 감염 후 24시간 째에 감염의 국소 부위에서 D-Ala-p2TA의 효과를 입증하는 사진이다.
도 6은, 에스. 피오게네스 감염 후 제공된 5시간 째에, D-Ala-p2TA(5mg/kg에서)의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는 BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 7은 에스. 피오게네스 감염 후 제공된 D-Ala-p2TA(2.5 mg/kg)의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는 BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 8a는 투여량들 사이의 상이한 간격(12 시간 및 24 시간)에서 D-Ala-p2TA의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 8b는 48 시간 및 72 시간 이하의 투여량들 사이의 상이한, 보다 큰 간격에서 D-Ala-p2TA의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 9는 에스. 피오게네스로 감염된 마우스들의 생존시 D-Ala-p2TA의 투여량 분획화의 효과를 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 10은 에스. 피오게네스로 감염되고 D-Ala-p2TA로 치료한 마우스들에서 사이토킨 수준들을 입증하는 그래프들을 포함한다.
도 10a는 감염 후 12시간 째에 혈장 Th1 사이토킨들에서의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다.
도 10a-1은 IFN-γ에 있어서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10a-2는 IL-17A에서의 효과를 입증하는 그래프이며; 도 10a-3은 TNF-α에서의 효과를 입증하는 그래프이며 도 10a-4는 IL-1β에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 10b는 감염 후 12시간 째에, 혈장 염증성 사이토킨들에서의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 도 10b-1은 IL-8의 마우스 오쏠로그(ortholog)인, KC에서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10b-2는 IL-6에서의 효과를 입증하는 그래프이며; 도 10b-3은 RANTES에서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10b-4는 MCP-1에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 10c는 감염 후 24 시간 째에 혈장 Th2 사이토킨, IL-10에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 11은 에스. 피오게네스로 감염된 마우스들에서 혈청 사이토킨 수준들의 그래프적 묘사이다.
도 11a는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들를 감염 후 12시간(도 11a-1), 24시간(도 11a-2), 48시간(도 11a-3) 및 72시간(도 11a-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 혈청 수준을 나타내는 그래프들이다.
도 11b는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들을 감염 후 12시간(도 11b), 24시간(도 11b-2), 48시간(도 11b-3) 및 72시간(도 11b-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 IL-1β의 혈청 수준을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 11c는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들을 감염 후 12 시간(도 11c-1), 24시간(도 11c-2), 48시간(도 11c-3) 및 72시간(도 11c-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 IL-6의 혈청 수준을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 11d는 에스. 피오게네스로 감염되고 D-ala-p2TA로 치료된 마우스들에서 혈청 사이토킨 수준 평균들을 나타내는 그래프들을 포함한다. 도 11d-1은 감염 후 48시간 째에 사이토킨들의 수준을 입증하는 그래프이고; 도 11d-2는 감염 후 72시간 째에 사이토킨들의 수준을 입증하는 그래프이다.
도 12는 감염 후 24시간(도 a, 도 c) 및 48시간(도 b, 도 d) 째에 에스. 피오게네스로 감염되고 D-Ala-p2TA로 치료된 마우스들의 근육(도 12a 및 도 12b) 및 비장(도 12c 및 도 12d)내 세균 수들을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 13a는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 근육에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하(bacterial burden)을 나타내는 그래프이다.
도 13b는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 간에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하를 나타내는 그래프이다.
도 13c는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 비장에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하를 나타내는 그래프이다.
도 14는 에스. 피오게네스 감염 후 48시간(도 14a 및 도 14b) 및 72 시간(도 14c; 도 14d)째에 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경 사진들이다. 도 14a 및 도 14c는 에스. 피오게네스 감염 후 펩타이드 D-ala-p2TA로 치료된 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경사진들이고 도 14b 및 도 14d는 에스. 피오게네스 감염 후 치료되지 않은 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경사진들이다.
도 15는 SPE A, B 및 C에 대한 혈청 항체 역가들의 그래프적 묘사이다. 스트렙토코커스 발열성 외독소들 A, B, 및 C에 대한 항체 역가들을 에스. 피오게네스로 근육내 감염시킨 후 5일(A-C, n=5) 및 14일(D-F, n=20)째에 측정하였다. 감염되고, 치료되지 않은 마우스들 중의 어느 것도 5일 이상 생존하지 않았다. 도 15a는 감염 후 5일째에 SPEA에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15b는 감염 후 5일째에 SPEB에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이며; 도 15c는 감염 후 5일째에 SPEC에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15d는 감염 후 14일째에 SPEA에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이며; 도 15e는 감염 후 14일째에 SPEB에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15f는 감염 후 14일째에 SPEC에 대한 항체 역가들을 입증하는 그래프이다.
도 16은 혼합된 림프구 반응을 그래프로 나타낸다. 3명의 상이한 개인들로부터의 수지 세포들(DCs)을, 3명의 추가의 공여자들로부터의 동종이계 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)과 증가하는 투여량들의 D-Ala-p2TA와 함께 3일 동안 배양하였다.
도 17은 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로 감염시킨 후 조합된 D-Ala-p2TA 치료 및 항생제들의 효과를 입증하는 생존 그래프이며, 여기서 치료제는 감염 후 24시간 째에 투여된다.
도 18은 에스. 뉴모니아에로 감염된 마우스에게 감염 후 24시간 째에 투여된 D-Ala-p2TA(항생제들과 병용)의 단일 투여량의 효능을 입증하는 생존 그래프이다: 투여량 반응.
도 19는 항생제 및 D-Ala-p2TA(D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 감염시 개시하고 항생제들은 감염 후 4시간 째에 제공하였다)의 병용된 치료에 의한 세균 복막염들(대장균에 의한 치사 감염에 의해 유도됨)로부터 마우스를 보호함을 입증하는 그래프이다.
도 20은 대장균로 감염된 마우스의 생존에 있어서 D-Ala-p2TA(단일의 완전한 투여량과 비교)의 투여량 분획화의 효과를 입증하는 그래프이며, 여기서 D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 감염 시기에 개시하였다. 항생제들은 감염 후 4시간 째에 제공되었다.
도 21은 CLP 후 사망률 감소에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 투여량의 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다. D-Ala-p2TA는 항생제들과 함께 수술 후 2시간 째에 제공되었다.
도 22는 CLP 후 12 또는 24 시간 째에 투여되는 경우, D-Ala-p2TA 및 항생제들의 상승 효과를 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 23은 CLP 모델에서 D-Ala-p2TA의 단일 투여량 대 다중 투여량들의 사망률을 감소시키는데 있어서의 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 24는 CLP 모델, 투여량 반응에서 D-Ala-p2TA의 사망률을 감소시키는데 있어서 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 25는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈장(혈액 - 좌측 패널들 A-C) 및 복강액(우측 패널들 D-F)에서 사이토킨 수준들에 있어 D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들없이 투여됨)의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 도 25a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 TNF-α 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 TNF-α 수준들을 입증하는 그래프이며; 도 25c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 RANTES 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25d는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 RNATES 수준들을 입증하는 그래프이며; 도 25e는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 KC(IL-8) 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25f는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 KC(IL-8) 수준들을 입증하는 그래프이다.
도 26은 CLP 동물들의 조직들 및 기관들로부터, CFU에 의해 측정된, D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)가 세균의 제거를 촉진함을 임증하는 그래프들을 포함한다. 도 26a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중에서 측정한 밀리리터당 CFU를 입증하는 그래프이고; 도 26b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액에서 측정한, 밀리리터 측정 당 CFU(X104)를 입증하는 그래프이며; 도 26c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장 속에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이고; 도 26d는 CLP 후 12 및 24시간 째에 간에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이며; 도 26e는 CLP 후 12 및 24시간 째에 신장에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이다.
도 27은 CLP 후 12 및 24시간 째에 MPO 활성에 의해 측정된, CLP 후 주요 기관들내로의 감소된 다형체 핵 세포들(PMN) 침윤을 입증하는 그래프들을 포함한다. D-Ala-p2TA는 CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여되었다. 도 27a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장내 MPO 활성을 입증하는 그래프이고; 도 27b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 간내 MPO 활성을 입증하는 그래프이며; 도 27c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 신장 내 MPO 활성을 입증하는 그래프이다.
도 28은 CLP 후 24시간 째에 직접적인 계수로 측정된, 간으로의 PMN 침윤에 있어서 1회 투여량의 D-Ala-p2TA (CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)의 효과를 입증하는 그래프이다. 간 단면들 속에 존재하는 다수의 호중구들(에스테라제 양성 염색된 세포들)을 x400배에서 현미경적으로 무작위 스크리닝(5 내지 7개 장(field)들/시료)하였다.
도 29는 CLP 후 CD28 발현에 있어서 D-Ala-p2TA의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 유동 세포분석에 의해 평가된 CD28의 표면 발현은 D-Ala-p2TA 펩타이드에 의한 치료와 함께 및 이러한 치료없이 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장(도 29a) 및 혈액(도 29c) CD3+ T 림프구들의 유의적인 감소를 나타내었다. 비장(도 29b) 및 혈액(도 29d) Gr1+ 림프구 세포들은 CLP 후 증가된 발현을 나타내었으며, D-Ala-p2TA 펩타이드 치료에 의한 효과는 관찰되지 않았다. *P<0.05, sham에 대해; 평균 ± SEM; n=5 내지 8마리의 마우스들/그룹.
도 30은 CLP에 이어 D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)를 사용한 치료 후 24시간 째에 신장 및 비장에서 감소된 세포자멸사 수준들을 입증하는 그래프이다. *P<0.05, sham에 대해; #, P<0.05, C57BL/6 CLP에 대해. *P<0.05, sham에 대해; # P<0.05, D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 CLP 그룹에 대해. 평균±SEM; n=4 내지 6마리의 마우스들/그룹.
도 31은 CLP 후 24시간 째에 비장내에서 감소된 세포자멸사를 (TUNEL 염색에 의해) 입증하는 현미경사진이다. D-Ala-p2TA는 CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여되었다. 도 31a는 sham에서 염색을 입증하는 현미경사진이고; 도 31b는 치료되지 않은 CLP에 있어서 염색을 입증하는 현미경사진이고; 도 31C는 CLP 후 치료된 D-Ala-p2TA에서 염색을 입증하는 현미경 사진이다.
도 32는 조직 단면들에서 대표적인 면역조직화학 TUNEL 염색 현미경사진들을 포함한다. D-Ala-p2TA 치료는 TUNEL 염색에 의해 CLP후 24시간 째에 비장 및 신장 조직 세포자멸사를 감소시켰다. sham 동물들은 비장(도 32a) 및 신장(도 32b)에서 TUNEL의 염색을 나타내지 않거나 약간 나타냈다. CLP 마우스들은 sham-수술된 마우스와 비교하여 강력한 TUNEL 염색(도 32c, 비장; 도 32d, 신장)을 나타내었고, D-Ala-p2TA-치료된 CLP 마우스들은 유의하게 더 적은 TUNEL 염색(도 32e, 비장; 도 32f, 신장)을 나타내었다. 원래의 배율들, X100.
도 33은 본원에 사용된 세균 감염의 각종 모델들에서 D-Ala-p2TA의 효능의 요약을 나타내는 막대 그래프이다.
도 34는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 정맥내 투여 후 조직 농도들-시간 곡선들을 입증하는 그래프들을 포함하며, 여기서 발린 잔기는 수컷 Balb/c 마우스들에 대해 [발린-14C] (5 mg/kg)로 대체된다. 펩타이드 D-Ala-p2TA의 수준들은 림프절들(도 34a) 및 혈장(도 34b)에서 이의 전신계 투여 후 처음 1시간에 걸쳐 나타난다.
도 35는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 정맥내 투여 후 조직 대 혈장 비(평균±SD)를 나타내는 그래프들을 포함하며, 여기서, 발린 잔기는 수컷 Balb/c 마우스들에 대해 [발린-14C] (5 mg/kg)으로 대체된다. 도 35a: 전신 투여 후 처음 2시간에 걸친 림프절들 대 혈장 비. 도 35b: 전신계 투여 후 처음 2시간에 걸친 비장 대 혈장 비.
도 36은 펩타이드 D-Ala-p2TA의 분포를 입증하는 그래프들을 포함하며, 여기서 발린 잔기는 마우스들 내로 주사 후 2분(도 36a), 10분(도 36b) 및 20분(도 36c)째에 마우스들의 각종 조직들 내에서 [발린-14C] (5 mg/kg)로 대체되어 있다.
도 37은 위약과 비교한 것으로서 0.5mg/kg 또는 0.25mg/kg의 D-Ala-p2TA 펩타이드를 사용한 1회 투여에 의해 치료된 괴사 연조직 감염(NSTI)을 지닌 환자들의 집중 치료실(Intensive Care Units: ICU)에서 머무는 평균 기간(±SD)을 설명한다. 다른 비교로서, 모든 활성 치료 그룹들을 함께 혼주(pooling)하여 위약과 함께 비교하였다. ICU에서의 경과일 수를 약물 투여 시간으로부터 출발하여 24시간 시계를 기준으로 계산하였다.
도 38a는 위약과 비교한 것으로서 치료 그룹들(0.5 및 0.25mg/kg) 각각에서 수행된 괴사조직제거들(±SD)의 전체 평균 수를 설명한다.
도 38b는 감염으로부터 회복하기 위해(각각의 치료 그룹들에서) 단지 1회의괴사조직제거가 요구된 환자들의 비 뿐만 아니라 회복하기 위해 4회 이상의 괴사조직제거가 요구된 환자들의 비도 설명한다.
도 39는 시간(1일 내지 14일 사이)에 걸친 치료 그룹들 각각에서 기관 기능장애(≥ 3의 SOFA 점수를 갖는 것으로 정의)를 갖는 환자들의 비를 설명한다.
도 1은, D-Ala-p2TA 치료가, 살아있는 에스. 아우레우스 감염에 의해(도 1a) 또는 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들에 대한 노출에 의해(도 1b) 생성된 패혈성 관절염으로부터 마우스들을 보호할 수 있음을 입증하는 그래프들을 포함한다. 약어들: SA는 패혈성 관절염을 나타내고 MSA는 마우스 혈청 알부민을 나타낸다.
도 2는, D-Ala-p2TA 치료가 감염 후 1시간 및 5시간의 지연된 시점들에서 확립된 에스. 피오게네스 감염으로부터 마우스를 보호할 수 있음을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯(Kaplan-Meier survival plot)이다.
도 3은, D-Ala-p2TA를 감염 후 1시간의 지연된 시점에 투여하는 경우, 마우스들의 에스. 피오게네스 연조직 감염, 투여량 반응의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 4는 감염 후 36시간 째에 D-Ala-p2TA 및 항생제들의 상승 효과를 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 5는 에스. 피오게네스 감염 후 24시간 째에 감염의 국소 부위에서 D-Ala-p2TA의 효과를 입증하는 사진이다.
도 6은, 에스. 피오게네스 감염 후 제공된 5시간 째에, D-Ala-p2TA(5mg/kg에서)의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는 BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 7은 에스. 피오게네스 감염 후 제공된 D-Ala-p2TA(2.5 mg/kg)의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는 BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 8a는 투여량들 사이의 상이한 간격(12 시간 및 24 시간)에서 D-Ala-p2TA의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 8b는 48 시간 및 72 시간 이하의 투여량들 사이의 상이한, 보다 큰 간격에서 D-Ala-p2TA의 1회 투여량 대 2회 투여량들의 효능을 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 9는 에스. 피오게네스로 감염된 마우스들의 생존시 D-Ala-p2TA의 투여량 분획화의 효과를 입증하는, BALB/c 마우스들의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 10은 에스. 피오게네스로 감염되고 D-Ala-p2TA로 치료한 마우스들에서 사이토킨 수준들을 입증하는 그래프들을 포함한다.
도 10a는 감염 후 12시간 째에 혈장 Th1 사이토킨들에서의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다.
도 10a-1은 IFN-γ에 있어서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10a-2는 IL-17A에서의 효과를 입증하는 그래프이며; 도 10a-3은 TNF-α에서의 효과를 입증하는 그래프이며 도 10a-4는 IL-1β에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 10b는 감염 후 12시간 째에, 혈장 염증성 사이토킨들에서의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 도 10b-1은 IL-8의 마우스 오쏠로그(ortholog)인, KC에서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10b-2는 IL-6에서의 효과를 입증하는 그래프이며; 도 10b-3은 RANTES에서의 효과를 입증하는 그래프이고; 도 10b-4는 MCP-1에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 10c는 감염 후 24 시간 째에 혈장 Th2 사이토킨, IL-10에서의 효과를 입증하는 그래프이다.
도 11은 에스. 피오게네스로 감염된 마우스들에서 혈청 사이토킨 수준들의 그래프적 묘사이다.
도 11a는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들를 감염 후 12시간(도 11a-1), 24시간(도 11a-2), 48시간(도 11a-3) 및 72시간(도 11a-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 혈청 수준을 나타내는 그래프들이다.
도 11b는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들을 감염 후 12시간(도 11b), 24시간(도 11b-2), 48시간(도 11b-3) 및 72시간(도 11b-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 IL-1β의 혈청 수준을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 11c는 임의의 추가의 치료의 부재하에서 또는 마우스들을 감염 후 12 시간(도 11c-1), 24시간(도 11c-2), 48시간(도 11c-3) 및 72시간(도 11c-4) 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 경우 에스. 피오게네스로 근육내 감염된 마우스들에서 IL-6의 혈청 수준을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 11d는 에스. 피오게네스로 감염되고 D-ala-p2TA로 치료된 마우스들에서 혈청 사이토킨 수준 평균들을 나타내는 그래프들을 포함한다. 도 11d-1은 감염 후 48시간 째에 사이토킨들의 수준을 입증하는 그래프이고; 도 11d-2는 감염 후 72시간 째에 사이토킨들의 수준을 입증하는 그래프이다.
도 12는 감염 후 24시간(도 a, 도 c) 및 48시간(도 b, 도 d) 째에 에스. 피오게네스로 감염되고 D-Ala-p2TA로 치료된 마우스들의 근육(도 12a 및 도 12b) 및 비장(도 12c 및 도 12d)내 세균 수들을 나타내는 그래프들을 포함한다.
도 13a는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 근육에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하(bacterial burden)을 나타내는 그래프이다.
도 13b는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 간에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하를 나타내는 그래프이다.
도 13c는 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 대 치료되지 않은 마우스들의 비장에서 72시간 째에 에스. 피오게네스의 세균 부하를 나타내는 그래프이다.
도 14는 에스. 피오게네스 감염 후 48시간(도 14a 및 도 14b) 및 72 시간(도 14c; 도 14d)째에 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경 사진들이다. 도 14a 및 도 14c는 에스. 피오게네스 감염 후 펩타이드 D-ala-p2TA로 치료된 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경사진들이고 도 14b 및 도 14d는 에스. 피오게네스 감염 후 치료되지 않은 마우스 염색된 근육 단면들의 현미경사진들이다.
도 15는 SPE A, B 및 C에 대한 혈청 항체 역가들의 그래프적 묘사이다. 스트렙토코커스 발열성 외독소들 A, B, 및 C에 대한 항체 역가들을 에스. 피오게네스로 근육내 감염시킨 후 5일(A-C, n=5) 및 14일(D-F, n=20)째에 측정하였다. 감염되고, 치료되지 않은 마우스들 중의 어느 것도 5일 이상 생존하지 않았다. 도 15a는 감염 후 5일째에 SPEA에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15b는 감염 후 5일째에 SPEB에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이며; 도 15c는 감염 후 5일째에 SPEC에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15d는 감염 후 14일째에 SPEA에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이며; 도 15e는 감염 후 14일째에 SPEB에 대한 혈청 항체 역가들을 입증하는 그래프이고; 도 15f는 감염 후 14일째에 SPEC에 대한 항체 역가들을 입증하는 그래프이다.
도 16은 혼합된 림프구 반응을 그래프로 나타낸다. 3명의 상이한 개인들로부터의 수지 세포들(DCs)을, 3명의 추가의 공여자들로부터의 동종이계 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)과 증가하는 투여량들의 D-Ala-p2TA와 함께 3일 동안 배양하였다.
도 17은 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로 감염시킨 후 조합된 D-Ala-p2TA 치료 및 항생제들의 효과를 입증하는 생존 그래프이며, 여기서 치료제는 감염 후 24시간 째에 투여된다.
도 18은 에스. 뉴모니아에로 감염된 마우스에게 감염 후 24시간 째에 투여된 D-Ala-p2TA(항생제들과 병용)의 단일 투여량의 효능을 입증하는 생존 그래프이다: 투여량 반응.
도 19는 항생제 및 D-Ala-p2TA(D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 감염시 개시하고 항생제들은 감염 후 4시간 째에 제공하였다)의 병용된 치료에 의한 세균 복막염들(대장균에 의한 치사 감염에 의해 유도됨)로부터 마우스를 보호함을 입증하는 그래프이다.
도 20은 대장균로 감염된 마우스의 생존에 있어서 D-Ala-p2TA(단일의 완전한 투여량과 비교)의 투여량 분획화의 효과를 입증하는 그래프이며, 여기서 D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 감염 시기에 개시하였다. 항생제들은 감염 후 4시간 째에 제공되었다.
도 21은 CLP 후 사망률 감소에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 투여량의 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다. D-Ala-p2TA는 항생제들과 함께 수술 후 2시간 째에 제공되었다.
도 22는 CLP 후 12 또는 24 시간 째에 투여되는 경우, D-Ala-p2TA 및 항생제들의 상승 효과를 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 23은 CLP 모델에서 D-Ala-p2TA의 단일 투여량 대 다중 투여량들의 사망률을 감소시키는데 있어서의 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 24는 CLP 모델, 투여량 반응에서 D-Ala-p2TA의 사망률을 감소시키는데 있어서 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 25는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈장(혈액 - 좌측 패널들 A-C) 및 복강액(우측 패널들 D-F)에서 사이토킨 수준들에 있어 D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들없이 투여됨)의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 도 25a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 TNF-α 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 TNF-α 수준들을 입증하는 그래프이며; 도 25c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 RANTES 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25d는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 RNATES 수준들을 입증하는 그래프이며; 도 25e는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중 KC(IL-8) 수준들을 입증하는 그래프이고; 도 25f는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액 중 KC(IL-8) 수준들을 입증하는 그래프이다.
도 26은 CLP 동물들의 조직들 및 기관들로부터, CFU에 의해 측정된, D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)가 세균의 제거를 촉진함을 임증하는 그래프들을 포함한다. 도 26a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 혈액 중에서 측정한 밀리리터당 CFU를 입증하는 그래프이고; 도 26b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 복강액에서 측정한, 밀리리터 측정 당 CFU(X104)를 입증하는 그래프이며; 도 26c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장 속에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이고; 도 26d는 CLP 후 12 및 24시간 째에 간에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이며; 도 26e는 CLP 후 12 및 24시간 째에 신장에서 측정한, 조직 그람 당 CFU를 입증하는 그래프이다.
도 27은 CLP 후 12 및 24시간 째에 MPO 활성에 의해 측정된, CLP 후 주요 기관들내로의 감소된 다형체 핵 세포들(PMN) 침윤을 입증하는 그래프들을 포함한다. D-Ala-p2TA는 CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여되었다. 도 27a는 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장내 MPO 활성을 입증하는 그래프이고; 도 27b는 CLP 후 12 및 24시간 째에 간내 MPO 활성을 입증하는 그래프이며; 도 27c는 CLP 후 12 및 24시간 째에 신장 내 MPO 활성을 입증하는 그래프이다.
도 28은 CLP 후 24시간 째에 직접적인 계수로 측정된, 간으로의 PMN 침윤에 있어서 1회 투여량의 D-Ala-p2TA (CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)의 효과를 입증하는 그래프이다. 간 단면들 속에 존재하는 다수의 호중구들(에스테라제 양성 염색된 세포들)을 x400배에서 현미경적으로 무작위 스크리닝(5 내지 7개 장(field)들/시료)하였다.
도 29는 CLP 후 CD28 발현에 있어서 D-Ala-p2TA의 효과를 입증하는 그래프들을 포함한다. 유동 세포분석에 의해 평가된 CD28의 표면 발현은 D-Ala-p2TA 펩타이드에 의한 치료와 함께 및 이러한 치료없이 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장(도 29a) 및 혈액(도 29c) CD3+ T 림프구들의 유의적인 감소를 나타내었다. 비장(도 29b) 및 혈액(도 29d) Gr1+ 림프구 세포들은 CLP 후 증가된 발현을 나타내었으며, D-Ala-p2TA 펩타이드 치료에 의한 효과는 관찰되지 않았다. *P<0.05, sham에 대해; 평균 ± SEM; n=5 내지 8마리의 마우스들/그룹.
도 30은 CLP에 이어 D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여됨)를 사용한 치료 후 24시간 째에 신장 및 비장에서 감소된 세포자멸사 수준들을 입증하는 그래프이다. *P<0.05, sham에 대해; #, P<0.05, C57BL/6 CLP에 대해. *P<0.05, sham에 대해; # P<0.05, D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 CLP 그룹에 대해. 평균±SEM; n=4 내지 6마리의 마우스들/그룹.
도 31은 CLP 후 24시간 째에 비장내에서 감소된 세포자멸사를 (TUNEL 염색에 의해) 입증하는 현미경사진이다. D-Ala-p2TA는 CLP 후 2시간 째에 항생제들 없이 투여되었다. 도 31a는 sham에서 염색을 입증하는 현미경사진이고; 도 31b는 치료되지 않은 CLP에 있어서 염색을 입증하는 현미경사진이고; 도 31C는 CLP 후 치료된 D-Ala-p2TA에서 염색을 입증하는 현미경 사진이다.
도 32는 조직 단면들에서 대표적인 면역조직화학 TUNEL 염색 현미경사진들을 포함한다. D-Ala-p2TA 치료는 TUNEL 염색에 의해 CLP후 24시간 째에 비장 및 신장 조직 세포자멸사를 감소시켰다. sham 동물들은 비장(도 32a) 및 신장(도 32b)에서 TUNEL의 염색을 나타내지 않거나 약간 나타냈다. CLP 마우스들은 sham-수술된 마우스와 비교하여 강력한 TUNEL 염색(도 32c, 비장; 도 32d, 신장)을 나타내었고, D-Ala-p2TA-치료된 CLP 마우스들은 유의하게 더 적은 TUNEL 염색(도 32e, 비장; 도 32f, 신장)을 나타내었다. 원래의 배율들, X100.
도 33은 본원에 사용된 세균 감염의 각종 모델들에서 D-Ala-p2TA의 효능의 요약을 나타내는 막대 그래프이다.
도 34는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 정맥내 투여 후 조직 농도들-시간 곡선들을 입증하는 그래프들을 포함하며, 여기서 발린 잔기는 수컷 Balb/c 마우스들에 대해 [발린-14C] (5 mg/kg)로 대체된다. 펩타이드 D-Ala-p2TA의 수준들은 림프절들(도 34a) 및 혈장(도 34b)에서 이의 전신계 투여 후 처음 1시간에 걸쳐 나타난다.
도 35는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 정맥내 투여 후 조직 대 혈장 비(평균±SD)를 나타내는 그래프들을 포함하며, 여기서, 발린 잔기는 수컷 Balb/c 마우스들에 대해 [발린-14C] (5 mg/kg)으로 대체된다. 도 35a: 전신 투여 후 처음 2시간에 걸친 림프절들 대 혈장 비. 도 35b: 전신계 투여 후 처음 2시간에 걸친 비장 대 혈장 비.
도 36은 펩타이드 D-Ala-p2TA의 분포를 입증하는 그래프들을 포함하며, 여기서 발린 잔기는 마우스들 내로 주사 후 2분(도 36a), 10분(도 36b) 및 20분(도 36c)째에 마우스들의 각종 조직들 내에서 [발린-14C] (5 mg/kg)로 대체되어 있다.
도 37은 위약과 비교한 것으로서 0.5mg/kg 또는 0.25mg/kg의 D-Ala-p2TA 펩타이드를 사용한 1회 투여에 의해 치료된 괴사 연조직 감염(NSTI)을 지닌 환자들의 집중 치료실(Intensive Care Units: ICU)에서 머무는 평균 기간(±SD)을 설명한다. 다른 비교로서, 모든 활성 치료 그룹들을 함께 혼주(pooling)하여 위약과 함께 비교하였다. ICU에서의 경과일 수를 약물 투여 시간으로부터 출발하여 24시간 시계를 기준으로 계산하였다.
도 38a는 위약과 비교한 것으로서 치료 그룹들(0.5 및 0.25mg/kg) 각각에서 수행된 괴사조직제거들(±SD)의 전체 평균 수를 설명한다.
도 38b는 감염으로부터 회복하기 위해(각각의 치료 그룹들에서) 단지 1회의괴사조직제거가 요구된 환자들의 비 뿐만 아니라 회복하기 위해 4회 이상의 괴사조직제거가 요구된 환자들의 비도 설명한다.
도 39는 시간(1일 내지 14일 사이)에 걸친 치료 그룹들 각각에서 기관 기능장애(≥ 3의 SOFA 점수를 갖는 것으로 정의)를 갖는 환자들의 비를 설명한다.
본원에 사용된 용어 "감염"은 적어도 하나의 그람-양성 세균, 그람-음성 세균 또는 그람-양성 세균들과 그람-음성 세균들의 혼합물일 수 있는, 세균 병원체들 뿐만 아니라 이의 독성 성분들에 의한 숙주 유기체의 콜로니화(colonization)를 의미하기 위해 사용되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "다균성 감염"은 몇몇 종들의 세균들로 이루어진/이들에 의해 유발된 감염을 의미하기 위해 사용되어야 한다. 상기 세균 감염은 그람-양성 세균들의 혼합물, 그람-음성 세균들의 혼합물 또는 그람-양성 세균들과 그람-음성 세균들 둘 다의 혼합물에 의해 유발될 수 있다. 다균성 감염은 또한 호기성 세균들, 혐기성 세균들 또는 이들 둘 다의 혼합물에 의해 유발될 수 있다.
일부 구현예들에서, 감염 또는 급성 염증 상태는 그람-음성 세균들에 의해 유발된다. 감염들은 세균들에 의해서만이 아니라 독성 세균 성분들에 의해서도 유발될 수 있다. 그람-음성 세균들은 대장균(E. coli), 및 다른 헬리코박터(Helicobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 레지오넬라(Legionella) 및 알파-프로테오박테리아들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 특별한 의학적 관련성이 있는 그람-음성 세균들은 나이세리아 고노호에아에(Neisseria gonorrhoeae)(이는 이성간 전파된 질병을 유발한다) 및 나이세리아 메닌기티디스(이는 수막염을 유발한다)와 같은 나이세리아 종들과 같은 콕시(cocci), 및 또한 호흡 증후군들을 유발하는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그람-음성은 주로 호흡 문제들을 유발하는 종들[헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)], 뇨 문제들[대장균, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 세라티아 마르케스켄스(Serratia marcescens)], 및 위장 문제들[헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi)]을 포함한다. 병원성 감염들과 관련된 그람-음성 세균들은 균혈증, 2차 수막염, 및 병원 설비들의 집중 치료실들내 인공호흡기 관련 폐렴들을 유발하는 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii)를 포함한다. 다른 세균들은 치사 호흡기 감염을 유발할 수 있는 프란키셀라 툴라레미아(Francisella tularemia), 불니피쿠스(vulnificus), 콜레라에(cholerae), 플루비알리스(fluvialis), 파라헤몰리티쿠스(parahemolyticus), 알기노리티쿠스(alginolyticus) 및 담셀(damsel), 포토박터 담셀라(Photobacter damsela), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 또는 고도의 항생제 내성 NDM-1 세균 균주들 중의 어느 것을 포함하는 비브리오 종들을 포함한다. 당해 그룹은 또한 포르피로모나스(Porphyromonas)/프레보텔라 아종 클로스트리디움 히스톨리티쿰(prevotella sp. Clostridium histolyticum), 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella Intermedia), 프레보텔라 부카에(Prevotella Buccae), 프레보텔라 아종 및 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 감염 또는 급성 염증 상태는 프로테오박테리아, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도모나스(Pseudomonas), 모락셀라(Moraxella), 헬리코박터(Helicobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 스테노스포포모나스(Stenotrophomonas), 아세트산 세균들, 레지오넬라(Legionella), 알파-프로테오박테리아, 볼바키아(Wolbachia), 그람-음성 콕시, 나이세리아 종들, 나이세리아 고노로에아에(neisseria gonorrhoeae), 나이세리아, 메닌기티디스, 모락셀라 카타랄리스, 그람-음성 바실리(bacilli), 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 세라티아 마르케스켄스(Serratia marcescens), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 프란키셀라 툴라레미아(Francisella tularemia), 비브리오(Vibrio), 불니피쿠스(vulnificus), 콜레라에(cholerae), 플루비알리스(fluvialis), 파라헤몰리티쿠스(parahemolyticus), 알기놀리티쿠스(alginolyticus), 포토박터 담셀라(Photobacter damsela), 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum), 포르피로모나스(Porphyromonas)/프레보텔라 아종 프레보텔라 인테르메디이(prevotella sp. Prevotella Intermedia), 프레보텔라 부카에(Prevotella Buccae), 프레보텔라 아종, 박테로이데스 우니포르미스 및 NDM-1 세균 균주들로 이루어진 그룹 중에서 선택된 그람-음성 세균들에 의해 유발된다.
세균 병원체들은 또한 그람-양성 세균들, 예를 들면, 그룹 A 스트렙토코쿠스[예를 들면, 에스. 피오게네스(S. pyogenes)], 에스. 뉴모니아(S. pneumonia), 그룹 B 스트렙토코쿠스(streptococcus), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)(그룹 D 스트렙), 그룹 G 스트렙, 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans), 스트렙토코쿠스 밀레리 프로피오니박테리움 아종 엔테로코쿠스 파에키움(Streptococcus milleri Propionibacterium sp. Enterococcus faecium), 펩토스트렙토코쿠스 아종 스트렙토코쿠스 미크로아에로필릭(Peptostreptococcus sp. Streptococcus Microaerophilic), 락토바실러스 아종 스타필로코쿠스 에피데르미스(Lactobacillus sp. Staphylococcus Epidermis) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함한다.
세균 감염들은 또한 단일 세균 종들보다는 수개의 종들의 세균 병원체들을 포함할 수 있다. 이들 감염들은 또한 복합체, 복잡하고, 혼합된, 이중의, 2차, 상승적, 동시 발생하는, 다균성, 동시-감염들(이의 일부 예들은 본원의 복강내 감염의 모델에서 나타낸다)로서 공지되어 있다.
독성 세균 성분들은 외독소들 및 내독소들과 같은 세균 독소들을 포함한다. 일반적으로 그람-양성 세균들과 관련된 세균 외독소들의 예들은 몇가지만 예를 들면, 스타필로코쿠스성 장독소 B(SEB), 스타필로코쿠스 장독소 A(SEA), 독성 쇼크 증후군 독소 1(TSST-1)와 같은 단백질들이다. 다른 독성 성분들은 병원체 관련 분자 패턴들(PAMPs), 즉 특히 톨-유사 수용체들(TLRs)에 의한 선천적 면역계의 세포들에 의해 인식되는 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들에 속한다. PAMP들의 예들은 그람-음성 세균들과 관련된 내독소들, 예를 들면, LPSs(지다당류들) 또는 이의 독성 성분, 예를 들면, 지질 A이다. 다른 독성 성분들은 비감염성 염증 반응에서 면역 반응을 개시하고 영속시킬 수 있는 분자들인, 손상 관련 분자 패턴 분자들(DAMPs)일 수 있다. DAMPS의 예들은 그람-양성 세균들과 관련된 펩티도글리칸들, 열 쇼크 단백질들 및 이들의 단편들, 하이알루로난 단편들, 퓨린 대사산물들 등이다.
일부 구현예들에서, 독성 세균 성분들은 외독소들, 내독소들, 초항원 독소들, 병원체 관련 분자 패턴들(PAMPs), 손상 관련된 분자 패턴 분자들(DAMPs), 펩티도글리칸들, 지다당류들 또는 이의 독성 성분들, 톨-유사 수용체들(TLRs)에 의해 인식된 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들 및 선천적 면역계의 세포들에 의해 인식되는 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
감염 상태들은 본원에 나타낸 바와 같은, 패혈성 관절염을 유발하는 에스. 아우레우스 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세균성 관절염(또는 패혈성 관절염)은 사람들 중에서 신속히 전파되며 고도로 파괴적인 관절병이다. 패혈성 관절염의 임상 증상들은 붉은, 팽윤된, 열이있는, 고통스러운 및 기능장애 관절들을 포함한다[15, 16]. 패혈성 관절염은, 세균들이 혈류를 통해 관절로 확산되는 경우 진행되며, 이는 또한, 관절이 손상으로부터 또는 수술 동안 미생물에 의해 직접 감염되는 경우 발생할 수 있다. 이러한 유형의 감염에 대한 가장 일반적인 부위들은 무릎 및 엉덩이이다. 이러한 감염의 관련된 실험 모델은 마우스들에서 에스. 아우레우스 무릎 관절 감염이다.
다른 감염 상태들은 괴사성 연조직 감염(NSTI)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. NSTI는 피부, 피부 구조물들 및 연조직과 관련하여 가장 심각한 유형들의 감염들을 나타내는 각종의 명백한 임상 진단들을 포함하는 설명적 용어이다. 그룹 A 스트렙토코쿠스 감염 또는 비 그룹 A 감염에 기인한 괴사성 근막염, 세균성 상승적 괴저, 클로스트리디움 가스 괴저, 포르니어 괴저(Fournier's gangrene), 및용혈성 스트렙토코쿠스 괴저는 심각한 국소 조직 괴저, 전신 독혈증 및 균혈증을 포함하는 임상 특징들을 공유하는 명백한 임상 실체들의 비-제한적 예들이며 다수 기관 기능부전으로 인해, 높은 사망률 비율을 갖는다. 비-제한적 예는 본원에 나타낸, 에스. 피오게네스 감염이다. 이러한 감염의 관련된 실험적 모델은 마우스들에서 에스. 피오게네스 대퇴 감염이다.
수술, 당뇨병들, 비만, 정맥내 약물 사용, 말초 혈관병 및 면역억제는 NSTI에 대한 위험 인자들로서 흔히 인용되지만, 많은 비율의 경우들이 이들의 감염에 대해 소인적 원인을 가지지 않는다. 주요 임상 특징은 피하 근막 조직들 및 흔히 또한 심근막 층들, 지방, 신경들, 동맥들 및 정맥들내에 국한된 괴사의 존재이고 이것이 항상 물리적 검사 또는 영상 연구들에 의해 명백하지 않을 수 있지만, 이는 즉각적인 외과적 검사 및 괴사조직제거를 필요로 하는 환자를 확인한다.
이론에 얽메임이 없이, NSTI의 발병은 세균 독소들 및 염증성 사이토킨들의 과도한 국소 방출과 관련된 것으로 고려된다. 과도한 국소 염증 반응은 전신 순환내로 확산하여 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)을 유발하며, 이는 난치성 쇼크 및 다중-기관 기능부전을 초래할 수 있다.
감염 상태들은 또한 호흡성(폐) 감염(예를 들면, 에스. 뉴모니아에 의한) 및 복강내(또는 심각한 복부내) 감염들(예를 들면, 맹장 결찰 및 천자(CLP) 모델 및 대장균 복막염 모델 둘 다에서 다음 실시예들에 나타낸 바와 같음)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이와 관련된 급성 염증"은 본 기재내용에 따른 세균 병원체들 및/또는 이의 성분들에 의한 감염과 같은 유해한 자극들에 대한 기관의 복잡한 급성 생물학적 반응의 일부를 의미한다.
본 발명에 포함되는 추가의 조건들은 선천적 면역 반응의 활성화와 관련되어 있으며, 죽은 세포들에 의해 방출된 세포내 단백질들의 수용체-매개된 검출을 통해 세포 수준에서 인식되는 외상 또는 외상성 손상(초기에는 감염과 관련되지 않음) 및이의 관련된 조직 손상이다. 이들 성분들은 비감염성 염증 반응시 면역 반응을 개시하고 영구화시킬 수 있는 손상 관련된 분자 패턴 분자들(DAMPs)로 명명된다. 이들은 염증 반응의 개시 및 영구화를 구동하는 병원체-관련 분자 패턴 분자들(PAMPs)과 유사한 "시그날 0"으로 제공된다. DAMPs의 예들은 세포 외부로 방출되거나 조직 손상 후 세포의 표면 위에 노출되는 경우, 환원으로부터 산화 환경으로 이동하여 이들의 기능적 변성을 초래하는 정의된 세포내 기능을 갖는 핵 또는 세포질성 단백질들을 포함한다.
특별한 구현예에서, 세균-유도된 조건은 전신 염증 상태(또한 SIRS로 언급됨) 및 공지되거나 예측된 감염의 존재로 특징화되는 심각한 상태인 패혈증이다. 신체는 혈액, 뇨, 폐들, 피부, 또는 다른 조직들내 세균들의 존재에 대해 면역계에 의해서 이러한 염증 반응을 발달시킬 수 있다. 패혈증은 혈액 중독 또는 패혈증(septicemia)로서 일반적으로 공지되어 있다. 심각한 패혈증은 전신성 염증 반응과, 감염과, 적어도 하나의 기관 기능장애의 존재이다. 패혈증(septicemia) 또한 때때로 균혈증으로 언급됨)은 혈류 속에 병원성 유기체들이 존재함을 나타내며, 패혈증으로 진행된다.
감염 상태들은 또한 그룹 A 스트렙토콕시(group A streptococci)와 같은 육식성 세균들에 의해 유발되거나 이를 포함하는 상태들, 및 패혈성 관절염(관절 염증 및 파괴)를 초래하는 에스. 아우레우스(S. aureus)에 의한 예를 들어, 불능(구토, 오심) 또는 괴저뿐만 아니라 많은 다른 것들도 포함한 합병증을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "단일 투여"는 특정 시점에서, 1회로 제공된 하나의 투여량으로서 제공되는 약물의 투여를 말한다.
용어 "치료학적 활성제"는 항세균제들, 항바이러스제들, 항진균제들, 항생제들, 정균제 및 살세균제들, 스테로이드들 및 항미생물제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "항생물 제제"는 천연, 반-합성 또는 합성 제품일 수 있는, 항생제, 항세균제, 정균제, 살세균제, 항미생물제들을 포함하는 세균 감염들에 대해 효과적인 임의의 치료제도 의미하는 것으로 사용되어야 한다. 예시적인 및 비-제한적인 항생제들은 목시플록사신 또는 세프트리악손이다.
본원에 기재된 주제의 한가지 구현예는 본원에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 펩타이드 p2TA 또는 이의 기능성 유도체의 투여가, 단독 치료요법으로서 또는 적어도 하나의 추가의 치료제 및/또는 보호 치료 기준과 함께 제공되는 경우, 이를 필요로 하는 사람 피검자에서 감염 및/또는 이와 관련된 급성 염증의 치료시 효과적이었다는 발견에 기초한다.
본원에 p2TA로 지정된 펩타이드는 서열 번호: 1로 나타낸 것으로서, 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진다. 상기 펩타이드의 기능성 유도체들은 또한 본 기재내용에 포함된다.
비-제한적 예로서, 당해 펩타이드의 유도체는 펩타이드 p2TA이며, 이는 D-알라닌 잔기들을 지닌 말단 둘다에 인접한 아미노산 서열 SPMLVAYD를 포함한다. 수득되는 유도체는 본원에서 또한 "D-Ala-p2TA"로 언급된 서열 번호: 2로 나타낸 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드이다.
이론에 얽메이려는 의도없이, 양쪽 말단에서 D-알라닌 잔기들의 첨가는 펩타이드의 프로테아제 내성을 증진시킨다. p2TA의 다른 유도체들은 후술되는 바와 같이, 본 발명의 영역내에 고려된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 p2TA는 서열 번호: 1의 펩타이드, 및 이의 유도체, 예를 들면, 서열 번호: 2로 나타낸 유도체 D-Ala-p2TA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료가 요구되는 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료용 방법에서 사용하기 위한, p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르가 현재 기재되어 있으며, 여기서 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 펩타이드의 양으로 투여된다.
용어 "펩타이드"는 또한 이의 단편들, 유도체들 및 기능성 유도체들을 의미하는 것으로 사용되어야 한다. 따라서, 예를 들면, 유도체들, 예를 들어, D-Ala-p2TA 펩타이드는 "펩타이드"로서 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어들 "단편들", "유도체들" 및 "기능성 유도체들"은 본원에 기술된 바와 같이, 세균 및 다른 감염들, 및 이와 관련된 염증들에 치료학적으로 영향을 미치는 이들의 능력을 방해하지 않는 펩타이드에 대한 임의의 삽입들, 결실들, 치환들 및 변형들을 가한, 서열 번호: 1 또는 2 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드들을 의미한다. 유도체는 서열 번호: 1에 대해 최소의 상동성, 예를 들면, 95%, 90%, 80%, 70%, 60% 등을 유지하여야 한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "삽입들"은 본 발명의 펩타이드들에 대해 적어도 하나의 아미노산 잔기들 및 20개 아미노산 잔기들, 예를 들면 20 내지 1개의 아미노산 잔기들, 보다 구체적으로 1 내지 10개의 아미노산 잔기들, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기들의 임의의 첨가를 의미한다.
본원에 기재된 펩타이드들은 이들의 N-말단을 통해 라우릴-시스테인(LC) 잔기에 및/또는 이들의 C-말단을 통해 시스테인(C) 잔기에 커플링될 수 있다.
펩타이드들은 모두 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나 중성일 수 있다. 또한, 이들은 이량체, 다량체 또는 제한된 구조의 형태일 수 있으며, 이는 내부 브릿지들, 짧은 범위의 폐환 반응들, 연장 또는 다른 화학적 변형들에 의해 획득될 수 있다.
또한, 펩타이드들은 다양한 동일하거나 상이한 아미노산 잔기들을 사용하여 이의 N- 및/또는 C-말단에서 연장시킬 수 있다. 이러한 연장에 대한 예로서, 펩타이드는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에서 천연적으로 존재하거나 합성의 아미노산 잔기들일 수 있는 동일하거나 상이한 소수성 아미노산 잔기들로 연장될 수 있다. 구체적인 합성 아미노산 잔기는 D-알라닌이다. 이러한 연장을 위한 추가의 예는 둘 다 이의 N- 및/또는 C-말단에서 시스테인 잔기로 연장된 펩타이드들에 의해 제공될 수 있다. 본질적으로, 이러한 연장은 이황화물 결합의 형성으로부터 생성되는 Cys-Cys 폐환으로 인하여 제한된 구조를 이끌 수 있다. 또 다른 예는 N-말단 라이실-팔미토일 테일의 혼입일 수 있으며, 당해 라이신은 링커로서 제공되고 팔미트산은 소수성 앵커(hydrophobic anchor)로서 제공된다. 또한, 상기 펩타이드들은 천연적으로 발생하거나 합성의 아미노산 잔기들일 수 있는 방향족 아미노산 잔기들에 의해 연장될 수 있는데, 예를 들어, 구체적인 방향족 아미노산 잔기는 트립토판일 수 있다. 상기 펩타이드들은 이의 N- 및/또는 C-말단에서 천연적으로 존재하지 않거나 합성인 아미노산들인 각종의 동일하거나 상이한 유기 잔기들로 연장될 수 있다. 이러한 연장의 예로서, 펩타이드는 이의 N- 및/또는 C- 말단에서 N-아세틸 그룹을 사용하여 연장시킬 수 있다. 본 발명에 의해 사용되고 본원에 기재된 모든 단일 펩타이드 서열의 경우, 본 발명은 상응하는 역전 서열(retro-inverse sequence)을 포함하며, 여기서 상기 펩타이드 쇄의 방향은 역전되고, 여기서 모든 아미노산들은 D-시리즈에 속한다. 서열 번호: 1에 의해 나타낸 바와 같거나, 양쪽 말단에서 D-Ala 잔기들(또한 D-Ala-p2TA로 명명된 서열 번호: 2)와 인접한 아미노산 서열 또는 다른 유도체들의 일부 또는 모두를 포함하는 염기성 에피토프 서열인 더 긴 펩타이드들이 또한 기재된 요지의 영역내에 포함된다.
일부 구현예들에서, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료가 필요한 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료 방법에 사용하기 위한, 또한 D-Ala-p2TA로 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은, 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드가 본원에 기재되어 있으며, 여기서 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자 kg 체중의 양으로 투여된다.
본원에 정의된 목적들을 위한 펩타이드의 치료학적 유효량(또는 양들)은 의학적 상태를 치유하거나 적어도 정지시키거나 적어도 완화시키기 위하여 당해 분야에 공지된 이러한 고려사항들에 의해 결정된다. 본 기재내용에 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 의 펩타이드 양으로 투여된다.
본 발명에 따른 펩타이드는 0.025 mg 내지 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중, 예를 들면 0.05 내지 1.0, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.4 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.6 내지 1.0, 0.7 내지 1.0, 0.8 내지 1.0, 0.9 내지 1.0, 0.05 내지 0.7, 0.1 내지 0.7, 0.2 내지 0.7, 0.3 내지 0.7, 0.4 내지 0.7, 0.5 내지 0.7, 0.6 내지 0.7, 0.05 내지 0.4, 0.05 내지 0.3, 0.05 내지 0.2의 양으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 치료학적 유효량은 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975 또는 1.0 mg 펩타이드/kg 체중 중의 어느 하나일 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 본 기재내용에 따른 펩타이드는 상기 사람 피검자에게 약 0.1 mg 내지 약 0.75 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중이 양으로 투여된다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 본 기재내용에 따른 펩타이드는 사람 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.25 mg 내지 약 0.5 mg 펩타이드의 양으로 투여된다.
투여될 펩타이드의 양은 구체적인 펩타이드의 분자량 및 다른 특징들을 고려하여 약 5 내지 25%로 변할 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나는 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염, 세균 독소들 및 다른 독성 세균 성분들에 의해 유발된다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 그람-음성 세균들은 프로테오박테리아, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라, 시겔라(Shigella), 엔테로-박테리아세아에, 슈도모나스, 모락셀라, 헬리코박터, 브델로비브리오, 스테노트로포모나스, 아세트산 세균들, 레지오넬라, 알파-프로테오박테리아, 볼바키아, 그람-음성 콕시, 나이세리아 종들, 나이세리아 고노로에아에, 나이세리아, 메닌기티디스, 모락셀라 카타랄리스, 그람-음성 바실리(Gram-negative bacilli), 헤모필루스 인프루엔자에, 클렙시엘라 뉴모니아에, 레지오넬라 뉴모필라, 슈도모나스 아에루기노사, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 세라티아 마르케스켄스(Serratia marcescens), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 프란키셀라 툴라레미아(Francisella tularemia), 비브리오(Vibrio), 불니피쿠스(vulnificus), 콜레라에(cholerae), 플루비알리스(fluvialis), 파라헤몰리티쿠스(parahemolyticus), 알기놀리티쿠스(alginolyticus), 포토박터 담셀라(Photobacter damsela), 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum), 포르피로모나스(Porphyromonas)/프레보텔라 아종 프레보텔라 인테르메디아(prevotella sp. Prevotella Intermedia), 프레보텔라 부카에(Prevotella Buccae), 프레보텔라 아종(Prevotella sp.), 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis) 및 NDM-1 세균 균주들로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 여기서 상기 그람-양성 세균들은 그룹 A 스트렙토코쿠스, 에스. 피오게네스, 에스. 뉴모니아, 그룹 B 스트렙, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 그룹 D 스트렙토코쿠스, 그룹 G 스트렙토코쿠스, 스트렙토코쿠스 비리단스, 스트렙토코쿠스 밀레리, 프로피오니박테리움 아종, 엔테로코쿠스 파에키움, 펩토스트렙토코쿠스 아종, 스트렙토코쿠스 미크로아에로필릭, 락토바실루스 아종, 스타필로코쿠스 에피데르미스 및 스타필로코쿠스 아우레우스 중의 어느 것일 수 있으며, 상기 다균성 감염은 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 또는 이들의 조합에 의해 유발되며, 상기 독성 세균 성분들은 외독소들, 내독소들, 초항원 독소들, 병원체 관련된 분자 패턴들(PAMPs), 손상 관련된 분자 패턴 분자들(DAMPs), 지질다당류들 또는 이의 독성 성분들, 선천적인 면역계의 세포들에 의해 인식된 병원체들의 그룹들과 관련된 분자 및 톨-유사 수용체들(Toll-like receptors: TLRs)에 의해 인식된 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들 중의 어느 것일 수 있다.
이의 또 다른 국면들에서, 본 기재내용은 이를 필요로 하는 피검자에서 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들 중의 적어도 하나에 의해 유발된, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로부터 발생하거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 당해 손상을 억제시키며 완화시키는 것 중의 적어도 하나를 위한 방법에서 사용하기 위한, 또한 p2TA로 나타낸, 서열 번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능적 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 제공하며, 여기서 상기 펩타이드는 상기 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg의 펩타이드의 양으로 투여된다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 이를 필요로 하는 사람 피검자에서 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들 중의 적어도 하나에 의해 유발된, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로부터 유래되거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 정지시키며 완화시키는 것 중의 적어도 하나를 위한 방법에서 사용하기 위한 펩타이드는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 손상은 전신 손상 또는 감염 부위에서의 손상이다. 기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 손상은 괴사 연조직 감염(NSTI)에 의해, 다균성 복부내 감염에 의해, 또는 화상들에 의해 나타나며, 여기서 상기 손상은 다중-기관 부전, 패혈증, 심각한 패혈증, 패혈성 관절염 및 패혈성 쇼크 중의 적어도 하나를 초래할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "필요로 하는 사람 피검자"는 본원에 정의된 바와 같이 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로 고생하는 사람을 의미하는데 사용되어야 한다.
본원에 정의된 바와 같은 용어 "치료하다" 또는 이의 형태들은 환자의 질병또는 상태가 악화되는 것을 방지하거나 이를 완화시키거나 치유하는 것을 의미한다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 투여는 다음 경로들 중의 어느 것에 의해 수행될 수 있다: 경구 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 수막내 또는 피하 주사; 직장내 투여; 비강내 투여, 안구 투여 또는 국소 투여. 정맥내 투여는 구체적으로 약 10 내지 약 30분의 기간에 걸친 연속 투여일 수 있다. 정맥내 투여는 달리는 푸쉬 투여(push administration)일 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 본 기재내용에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 상기 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 발병 후 적합한 시간에 투여될 수 있다. 달리는 또는 추가로, 본 기재내용에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 상기 감염 또는 이와 관련된 급성 염증의 발병후 즉시 투여될 수 있다. 여전히 달리는 또는 추가로, 본 기재내용에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 상기 감염 또는 이와 관련된 급성 염증의 발병 후 약 30분 내지 약 72시간내에 투여될 수 있다. 여전히 달리는 또는 추가로, 본 기재내용에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 상기 감염 또는 이와 관련된 급성 염증의 발병 후 약 30분 내지 약 7일 내에 투여될 수 있다.
용어 "발병"은 상기 사람 피검자의 감염 시기 또는 이의 임상적 징후 또는 이와 관련되거나 상기 감염으로부터 생성된 급성 염증의 징후의 개시 시점과, 참여한 의료진의 숙련된 구성원에 의해 감염 및 염증 중의 어느 것을 진단하는 시기 사이의 임의의 시점, 및 이들 사이 또는 이후의 임의의 시점을 말하며, 여기서 본 기재내용에 따른 치료가 상기 피검자에게 전문적으로 지정된다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기한 다른 치료학적 활성제는 항세균제, 항바이러스제, 항진균제, 항생제, 정균제 및 살세균제, 스테로이드 및 항미생물제 중의 어느 하나일 수 있으며, 이들은 최적 이하 투여량 또는 치료학적 투여량으로 투여될 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 보호 치료 기준은 적어도 하나의 환기, 수술, 상처 보호, 고압 산소, IVIG(정맥내 면역글로불린들), 코르티코스테로이드들, 혈장분리반출술, 음성압 상처 치료요법[백 드레싱들(vac dressings)] 및 활성화된 단백질 C를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 펩타이드 및 상기 추가의 다른 치료학적으로 효과적인 제제는 동시 투여된다. 달리는 또는 추가로, 상기 펩타이드 및 상기 추가의 다른 치료학적으로 효과적인 제제는 상이한 시점들에서, 투여들 사이의 상이한 간격들에서, 상기한 기간 동안, 또는 상이한 순서로 투여된다. 상기 펩타이드의 투여와 상기 추가의 다른 치료학적으로 효과적인 제제의 투여 사이의 간격은 0 내지 72 시간일 수 있다.
예를 들면, 치료는 펩타이드와 추가의 제제 둘다의 투여로 개시될 수 있으며, 추가의 제제의 투여는 펩타이드의 투여 전 또는 후에 중지될 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 본원에 기재된 주제의 펩타이드는 약제학적 조성물 속에 포함되며, 당해 조성물은 적어도 하나의 생리학적으로 혼화성인 첨가제들, 담체들, 희석제들 및 부형제들을 포함한다.
본원에 기재된 주제의 약제학적 조성물들은 일반적으로 완충제, 이의 삼투압을 조절하는 제제, 및 임의로, 당해 분야에 공지된 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체들, 부형제들 및/또는 첨가제들을 포함한다. 보충적인 활성 성분들을 또한 조성물들내로 혼입시킬 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물들, 및 야채 오일들을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키며 표면활성제들을 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 담체, 첨가제, 부형제 및/또는 희석제는 펩타이드의 활성을 방해하지 않는다.
본원에 정의된 바와 같은 용어 "염들"은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 당해 분야에 잘 공지된 방법들에 의해 제조되는, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄, 및 프로트아민 아연 염들을 포함하여 약제 산업에서 일반적으로 사용된 비-독성 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 및 암모늄 염들을 말한다. 당해 용어는 또한 본원에 사용된 활성 화합물들을 적합한 유기 또는 무기 산과 반응시켜 일반적으로 제조되는 무-독성 산 부가 염들을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 용어 "에스테르"는 약제학적으로 허용되는 에스테르, 예를 들면, 에스테르 결합의 가수분해 시, 카복실산 또는 알코올의 생물학적 유효성 및 특성들을 유지하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않는 것이 아닌 에스테르들을 말한다. 일반적으로, 에스테르 형성은 통상의 합성 기술들을 통해 달성할 수 있다.
구체적인 구현예들에서, 상기 약제학적 조성물은 지연되거나 조절된 방출 형태, 또는 조합된 지연/조절된 방출 및 속방성 형태들일 수 있다.
기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 펩타이드는 약제학적 단위 용량형으로 포함될 수 있으며, 당해 용량형은 임의로 적어도 하나의 생리학적으로 허용되는 첨가제들, 담체들, 펩타이드 안정화제들, 희석제들 및 부형제들을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 용량형은 임의로 프로테아제 억제제들을 추가로 포함할 수 있다.
펩타이드 p2TA, 및 또한 이의 유도체들은 예를 들면, D-Ala-p2TA에 제한되지 않으며, 건강한 자원자들에서 수행된 제1상 연구에서 밝혀진 바와 같이, 마우스들 및 돼지들과 같은 실험 동물들, 및 또한 사람들의 혈장내에서 매우 짧은 반감기를 가진 것으로 밝혀졌다. 모든 이들 종들에서 문서화된 반감기는 1 내지 2.6분의 범위내이었다. 이러한 짧은 반감기에도 불구하고, 당해 펩타이드는 이의 유효 투여량의 단일 투여만으로, 현저하고 지속적인 효과를 나타내었다.
본 기재내용의 추가의 국면에서, 이러한 치료가 요구되는 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한, 또한 p2TA로 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르가 기재되어 있으며, 여기서 당해 방법은 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 상기 펩타이드를 단일 투여함을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "단일 투여"는 1회 투여량으로서, 특정 시점에, 하나의 용량으로 약물을 투여하는 것을 말한다.
본원에 기재된 주제의 상기 및 다른 구현예들에서, 상기 유도체는 D-알라닌 잔기들을 지닌 이의 말단들 둘다에 인접한, 아미노산 서열 SPMLVAYD (서열 번호: 1)을 포함하는 펩타이드일 수 있으므로, 펩타이드는 또한 D-Ala-p2TA로 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진다.
본 기재내용의 여전히 추가의 국면에서, 이를 필요로 하는 사람 피검자에게 치료학적 유효량의 상기 펩타이드 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 기능성 단편, 염 또는 에스테르를 단일 투여함을 포함하여, 상기 피검자에서 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들 중의 적어도 하나에 의해 유발된 감염 또는 이와 관련된 급성 염증으로부터 발생하거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 당해 손상을 억제시키며 완화시키기 위한 방법에서 사용하기 위한, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 유도체 D-Ala-p2TA를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 또한 p2TA로 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또한 이의 특정한 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르가 기재되어 있다.
치료가 상기 및 다른 구현예들에서와 같이, 상기 펩타이드 또는 이의 기능성 단편들 및 유도체들의 단일 투여를 포함하는, 본원에 기재된 주제의 이들 국면들에서, 상기 치료학적 유효량은 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중일 수 있다. 따라서, 상기 양은 0.025 mg 내지 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중, 예를 들면, 0.05 내지 1.0, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.4 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.6 내지 1.0, 0.7 내지 1.0, 0.8 내지 1.0, 0.9 내지 1.0, 0.05 내지 0.7, 0.1 내지 0.7, 0.2 내지 0.7, 0.3 내지 0.7, 0.4 내지 0.7, 0.5 내지 0.7, 0.6 내지 0.7, 0.05 내지 0.4, 0.05 내지 0.3, 0.05 내지 0.2일 수 있다. 구체적으로, 치료학적 유효량은 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975 또는 1.0 mg의 펩타이드/kg 체중 중의 어느 하나일 수 있다. 달리는 또는 추가로, 본 기재내용에 따른 펩타이드는 상기 사람 피검자에게 피검자의 체중 1kg 당 약 0.1 mg 내지 약 0.75 mg 펩타이드의 양, 또는 피검자의 체중 1kg 당 약 0.25 mg 내지 약 0.5 mg 펩타이드의 양으로 투여된다. 다음의 실시예들에서 밝혀질 바와 같이, 본 발명자들은 여전히 협소한 범위의 투여량들에서 제공된 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료가 광범위한 상태들하에서 최적이었음을 발견하였다.
치료가 상기 및 다른 구현예들에서와 같이 상기 펩타이드 또는 이의 기능성 단편들 및 유도체들의 단일 투여를 포함하는 본원에 기재된 주제의 이들 국면들에서, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나는 모두 위에서 정의된 것을 약간 수정하여, 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염, 세균 독소들 및 다른 독성 세균 성분들 중의 적어도 하나에 의해 유발된다.
또한, 치료가 상기 및 다른 구현예들에서와 같이, 상기 펩타이드 또는 이의 기능성 단편들 및 유도체들의 단일 투여를 포함하는, 본원에 기재된 주제의 이들 국면들에서, 상기 손상은 무타티스 무탄디스(mutatis mutandis) 전신계 손상 또는 감염 부위에서의 손상이다. 상기 손상은 괴사성 연조직 감염(NSTI)에 의해서, 다균성 복부내 감염에 의해서, 또는 화상들에 의해서 나타나며, 여기서 상기 손상은 다중 기관 기능장애, 중증 패혈증, 패혈성 관절염 또는 패혈성 쇼크를 초래할 수 있다.
또한 치료가 상기 및 다른 구현예들에서와 같이, 상기 펩타이드 또는 이의 기능성 단편들 및 유도체들의 단일 투여를 포함하는 본원에 기재된 주제의 이들 국면들에서, 상기 투여는 경구 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 수막내 또는 피하 주사, 직장 투여, 비강내 투여, 안구 투여 및 국소 투여로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경로들 중의 어느 것을 약간 수정한 것에 의한다. 투여 시간은 기재된 주제의 상기한 및 다른 구현예들에 대해 정의된 바와 같을 수 있다.
또한, 치료가 상기 및 다른 구현예들에서와 같이, 상기 펩타이드 또는 이의 기능성 단편들 및 유도체들의 단일 투여를 포함하는 본원에 기재된 주제의 이들 국면들에서, 상기 방법은 위에서 상세히 기재한 바와 같이, 치료학적 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제 및 관리 치료의 지원 표준을 상기 피검자에게 투여함을 약간 수정하여 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 상기 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제는 최적 이하 투여량 또는 치료학적 투여량에서 투여된, 항세균제들, 항바이러스제들, 항진균제들, 항생제들, 세균정지제들 및 살세균제들, 스테로이드들 및 항미생물 제제들로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 보호 치료의 상기 지원 표준은 환기, 수술, 상처 치유, 고압 산소, IVIG(정맥내 면역글로불린들), 코르티코스테로이드들, 혈장분리교환술, 음성압 상처 치료요법[백 그레싱들(vac dressings)] 및 활성화된 단백질 C이다. 기재된 펩타이드 및 상기 추가의 치료학적 유효 제제는 동시에, 또는 상이한 시점들에서, 또는 투여들 사이의 상이한 투여 간격들로, 상이한 기간 동안, 또는 상이한 순서로 투여된다. 상기 펩타이드 및 상기 추가의 치료학적 유효 제제의 투여 사이의 상기 간격은 0 내지 72 시간이다.
또한, 하기 치료가 요구되는 사람 피검자에게 치료학적 유효량의 또한 p2TA로 나타낸, 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 투여함을 포함하여, 상기 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료 방법이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 상기 치료학적 유효량은 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중이다. 상기 유도체들은 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 치료가 요구되는 사람 피검자에서, 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들 중의 적어도 하나에 의해 유도된, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로부터 발생되거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 당해 손상을 억제시키고 완화시키는 것들 중의 적어도 하나를 위한 방법이 본원에 기재되어 있으며, 상기 방법은 p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 치료학적 유효량의 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 투여함을 포함하며, 여기서 상기 치료학적 유효량은 약 0.025 mg 내지 약 1.0 mg의 펩타이드/상기 피검자의 kg 체중이다. 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 투여함을 포함하여, 하기 치료가 요구되는 사람 피검자에서 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 상기 방법은 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 상기 펩타이드를 단일 투여함을 포함한다. 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD로 이루어진 펩타이드, 또는 이의 임의의 기능성 유도체, 단편, 염 또는 에스테르를 투여함을 포함하여, 하기 치료가 요구되는 사람 피검자에서 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 다균성 감염 및 세균 독소들 중의 적어도 하나에 의해 유발된, 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나로부터 발생되거나 이와 관련된 손상의 악화를 방지하고, 당해 손상을 억제시키며 완화시키는 것들 중의 적어도 하나를 위한 방법이 본원에 기재되어 있다. 상기 유도체는 D-Ala-p2TA로 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
언급된 바와 같이, 상기 손상은 전신 손상 또는 감염 부위에서의 손상일 수 있다. 다음의 실시에들에 나타날 바와 같이, 펩타이드 D-Ala-p2TA는 투여 후 조기 시점들에서 이미 림프절들 및 가슴샘(T 세포들을 함유하는 기관들)와 같은 림프 기관들에서 축적을 나타내었으며, 이는, 이론에 얽메이지 않고, 이의 표적 부위들에서 구분 및 보유를 나타낼 수 있다.
상기 및 다른 구현예들의 설명은 본원에 기재된 치료 방법들에 대해 또한 약간 수정하여 적용된다.
다음의 실시예들은 본원에 기재된 주제의 국면들을 수행하는데 사용된 대표적인 기술들이다. 이들 기술들이 기재된 구현예들의 예시이지만, 당해 분야의 숙련가들은 본 기재내용의 측면에서 다수의 변형들이 본 기재내용의 의도된 영역을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 인지할 것이라는 것이 인식되어야 한다.
실험 과정들
시약들
달리 기술하지 않는 한, 모든 화학 시약들은 시그마(Sigma)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 모든 초항원들(superantigens) 및 독소들은 플로리다주 사라소타 소재의 Toxin Technology로부터 구입하였다.
세균들
대장균 지질다당류(LPS) 0111:B4를 List Biological Laboratories(캘리포니아주 캠프벨 소재)로부터 수득하였다.
임상적으로 관련된 그람-음성 세균 분리체인, 대장균 균주 O18:K1:H7을 복막염 연구들을 위해 사용하였다.
스타필로코쿠스 펩티도글리칸들[16]은 안드르제 타르코브스키(Andrzej Tarkowski) 박사(스웨덴, 코텐부르크 대학)에 의해 고도로 정제되었으며 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주 LS-1 그룹, 그람-양성 세균 분리체[15]는 안드르제 타르코브스키 박사(스웨덴 고텐부르크 대학)로부터 입수하였다.
그룹 A 스트렙토코쿠스(GAS) 스트렙토코쿠스 피오게네스(에스. 피오게네스) 균주(스칼렛 열 혈청형 M1T1)은 조나단 코헨(Jonathan Cohen) 박사(영국 런던 햄머스미쓰 병원)가 기증한 임상 분리체이다. 당해 균주는 다수의 초항원 외독소들을 생산하는 것으로 이미 밝혀졌다. 당해 균주는 토드-헤위트 브로쓰(Todd-Hewitt broth)(제조원: Becton Dickinson)에서 37℃에서 호기성 조건들하에 배양되었다. 당해 균주는 중기-대수 상까지 성장하도록 하였다. 배양물을 농축시키고 PBS로 2회 세척하였다. 이후에 요구된 수의 세균들을 추가의 사용을 위해 PBS 속에 재현탁시켰다.
동물들
특수한 병원체가 없는 암컷 BALB/c 마우스들(8 내지 12주령) 및 CD1 교배된 마우스들(6 내지 8주령)을 Charles River Laboratories(매사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 입수하였다. 모든 동물 연구들은 브라운 대학(Brown University) 및 매릴랜드 대학 기관 동물 보호 및 사용 위원회(University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committees: IACUC)에 의해 실험들이 개시되기 전에 승인되었다. 동물들을 IACUC-승인된 시설 안에 BSL-2 안전성 조건들하에 가두고 브라운 대학 및 매릴랜드 대학 수의학 스태프가 모니터하였다.
실시예 1에서, 수컷 BALB/c 마우스들(8주령들)을 ALAB(스웨덴 스톡홀름 소재)로부터 입수하였다. 모든 동물 연구들은 고텐부르크 대학 IACUC에 의해 실험들이 개시되기 전에 승인되었다. 동물들을 IACUC-승인된 시설 안에 BSL-2 안전성 조건들하에 가두고 고텐부르크 대학 수의학 스태프가 모니터하였다.
기관들내 세균 수들
감염된 마우스들을 마취한 후, 국소 감염 부위(대퇴부 근육 조직), 비장 및 간을 각각의 마우스로부터 수거하였다. 기관들의 중량들을 측정한 후 기관들을 멸균 PBS를 함유하는 튜브 속에 두었다. 조직 샘플들을 Omni TH 균질화기를 사용하여 균질화한 후 PBS 속에 일련 희석시켰다. 상이한 희석물들을 5% 양 혈액 아가 플레이트들(5% sheep blood agar plates)에 두고 CFU/mg을 각각의 시험 그룹에서, 각각의 조직에 대해 측정하였다.
초항원들에 대한 항체들
다양한 초항원들에 대한 면역글로불린 항체의 수준들을 측정하기 위하여, GAS 챌린지(challenge)에서 생존한 D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 마우스들을 마취시켰다. 심장 혈액을 수득하고, 혈청을 분리하였다. 탄산염-중탄산염 완충액 pH 9.6에, 10μg/ml의 농도로 용해된 재조합체 스트렙토코쿠스 발열성 외독소 A(SPEA), 스트렙토코쿠스 발열성 외독소 B(SPEB), 프로테아제 및 스트렙토코쿠스 발병력 인자, 또는 스트렙토코쿠스 발열성 외독소 C(SPEC)를 사용하여 96-웰 효소-연결된 면역흡착성 검정 미세역가 플레이트들을 피복하였다. 비특이적 결합 부위들을 PBS 중 50% 태아 소 혈청(FCS)으로 차단하였다. 플레이트들을 0.5% FCS 중 0.05% 트윈20(제조원: 매사츄세츠 피츠스버그 소재의 Fisher Scientific)으로 세척하였다. 1% FCS 속에 1:100로 희석된 혈청을 웰들에 적용하였다. 1% FCS 속에 1:10,000로 희석된 마우스에 대한 염소 IgM 항체(제조원: Sigma) 또는 마우스에 대한 알칼린 포스파타제-접합된 양 IgG 항체를 기질, p-니트로페닐 포스페이트의 첨가 전에 적용시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
면역조직화학
근육 샘플들을 단면화하고, 봉매(embedding)하여 5μm에서 고정시키고 pH 6.0의 lOmM 시트레이트 완충액 속에 두고 10 분 동안 가열 하였다. 단면들을 15분 동안 메탄올 중 3% 과산화수소(제조원: Sigma-Aldrich) 속에 두고, 증류수 및 PBS로 5분 동안 각각 세척하고, 0.3% 트리톤(제조원: Sigma-Aldrich) 속에 15분 동안 및 0.1% 트윈20 속에 5분 동안 투과시키고, PBS중 10% 정상 소 혈청 속에서 실온(RT)에서 1시간 동안 차단시킨 후, 일차 항체-절단된 카스파제-3(Asp175)[제조원: 매사츄세츠주 보스톤 소재의 셀 시그날링(Cell Signaling)]과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 세척 후, 단면들을 접합된 염소 항-토끼 IgG(제조원: 캘리포니아주 버링겜 소재의 Vector Laboratories)와 함께 1시간 동안 RT에서 항온치료한 후, 0.1% 트윈20으로 5분 동안 2회 치료하여 투과시키고, 세척하고, 1시간 동안 RT에서 R.T.U. 벡타스타인 엘라이트 ABC 시약(Vectastain Elite ABC Reagent)(제조원: Vector Laboratories)와 함께 제조업자의 프로토콜에 따라 항온치료하였다. 세척 후, 단면을 디아미노벤지딘 기질 Ki, 3,3'-디아미노벤지딘(제조원: Vector Laboratories)으로 현상시켜 갈색 내지 회색/흑색 색상을 수득하였다. 슬라이드들을 일련의 에탄올 및 크실렌 용액 속에서 탈수시키고 영구적으로 두었다. 영상들을 Olympus BX51 현미경을 사용하여 X100배 확대로 디지탈적으로 포착하였다. 절단된 카스파제-3 염색의 정량화를 조직 단면당 다수의 무작위 현미경 장들에서 양성 세포들을 계수함으로써 맹검 방식으로 수행하였다.
표현형 및 세포자멸사의 평가
유동 세포측정 분석법을 다음과 같이 수행하였다: 비장 세포들은 알로피코시아닌(APC)-표지된 항-CD3(클론:145-2C11, 제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BioLegend), -F4/80(클론:BM8, 제조원: BioLegend), -CD4(클론:GK1.5, 제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 e-Bioscience, Inc.), -CD8(클론:53-6.7, 제조원: e-Bioscience, Inc.), -B220(클론:RA3-6B2, 제조원: e-Bioscience, Inc.) 또는 -Gr-1(클론:RB6-8C5, 제조원: e-Bioscience, Inc.)을 표현형의 경우 PE-표지된 항-CD28(클론:37.51, 제조원: e-Bioscience, Inc.)과 함께 또는 세포사멸사의 경우 아넥신 V(제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BD Biosciences)와 함께 염색하였다. 혈액 세포들을 항-CD3 또는 -Gr-1으로 표현형의 경우 항-CD28과 함께 또는 세포자멸사의 경우 아넥신 V와 함께 염색하고 BD FACSArray 생분석기(Bioanalyzer)로 분석하였다[11].
펩타이드 합성
펩타이드 p2TA는 서열 번호: 1로 나타낸 서열 SPMLVAYD를 갖는다. 펩타이드 D-Ala-p2TA는 이의 N- 및 C-말단 둘다에 첨가된 D-알라닌 잔기를 가짐으로써 이의 안전성 및 프로테아제 내성을 증가시킨다(D-Ala-p2TA는 또한 서열 번호: 2로 나타낸다). 펩타이드를 플루오로닐-메톡시카보닐 화학을 사용하여 합성하였다[10]. 대조군 스크램블된(scrambled) 펩타이드(D-Ala-Ala-Ser-Met-Asp-Tyr-Pro-Val-Leu-D-Ala, 서열 번호: 3으로 또한 나타냄)을 상기와 같이 제조하였다.
인산염-완충된 염수(PBS) 중 1 mg 펩타이드/ml의 신선한 원료 용액들을 제조하고, PBS를 사용하여 바람직한 작업 농도들로 추가로 희석하였다. 용해되면, 펩타이드들을 즉시 사용하였다.
혈청 화학
감염 후 5일째에 PBS 또는 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 감염되지 않거나 감염된 마우스들로부터의 혈청을 크레아티닌, BUN, ALT, AST, 알칼린 PO4 및 빌리루빈을 사용하여 혈액 화학에 대해 분석하였다. 혈청 시료들을 ANTECH 진단법(매릴랜드 록빌 소재)로 분석하였다.
동종이계 혼합된 림프구 반응
건강한 개인들로부터의 단핵구들을 시판되는 음성 선택 키트들(제조원: Stemcell Technologies)를 사용하여 PBMC로부터 정제하고 50ng/ml의 GM-CSF 및 25ng/ml의 IL-4(제조원: 둘 다 R & D Systems)이 보충된 cRPMI 속에서 3일 동안 배양하여 미성숙 단핵구-기원한 수지 세포들(moDCs)을 생성시켰다. moDC들을 배양물들로부터 수거하고, cRPMI 속에서 2회 세척하고, 96-웰 U-바닥 배양 플레이트들(제조원: Denville Scientific, Inc.)의 3중 웰들 속에 2 x 104, 2 x 103, 및 2 x 102 세포들/웰에서 플레이트하였다. 동종이계 반응인자 PBMC들을 각각의 웰에 2 x 105 세포/웰에서 0.1, 1, 또는 10㎍/ml의 펩타이드 D-Ala-p2TA의 부재 및 존재하에서 200μl의 최종 용적으로 가하였다. 세포들을 37℃에서 3일 동안 5% CO2 속에서 항온치료하고, 1.0μCi 3중수소화된 티미딘(제조원: 매사츄세츠 보스톤 소재의 Perkin Elmer)으로 16시간(또한 hrs 또는 hr로 나타냄) 동안 펄스하고, 자동화된 다중웰 수거기[제조원: 커넥티컷주 오렌지 소재의 톰테크(Tomtec)]를 사용하여 수거하였다. 반응인자 세포들내로 혼입된 3중수소화된 티미딘의 양을 마이크로베타 트리룩스 액체 신틸레이션 계수기(MicroBeta TriLux liquid scintillation counter)[제조원: 핀란드 쿠르쿠 소재의 왈락(Wallac)]를 사용하여 측정하였다.
패혈성 관절염의 쥐 모델
패혈성 관절염의 쥐 모델[15, 16]을 사용하여 살아있는 에스. 아우레우스로 감염된 마우스들에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과를 평가하였다. 마우스들에게, 살아있는 에스. 아우레우스 LS-1(800개의 콜로니-형성 단위들/무릎 관절)의 단일 관절내 주사를 제공하였다. 6, 12, 및 24 시간 후, 마우스들에게 D-Ala-p2TA(200 ng/마우스) 또는 마우스 혈청 알부민(MSA)(200 ng/마우스)으로 복강내 주사하였다. 대안적으로, 마우스들에게, D-Ala-p2TA(200ng/무릎 관절) 또는 MSA(200ng/무릎 관절)와 함께 정제된 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들(25μg/무릎 관절)을 동맥내 단일 주사하고,; 6, 12, 및 24시간 후, 마우스들에게 D-Ala-p2TA(200ng/마우스) 또는 MSA(200ng/마우스)를 복강내 주사하였다. 모든 마우스들을 실험 시작(즉, 관절내 주사들) 후 72시간 째에 사멸시켰다. 모든 관절 단면들을 관절염 및 관절 파괴의 중증도에 대해 맹검 분석하였다.
림프구 증식 검정들
펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료하거나 치료하지 않은 sham 마우스 또는 CLP 마우스들로부터 입수한 분리된 비장세포들을 림프구 증식 검정들에서 시험하였다. 비장세포들을 항-CD3 단독으로 또는 항-CD3+항-CD28 항체들로 자극시키고 72시간 동안 배양하였다. 이후에, 세포 증식을 CyQuant 검정을 사용하여 평가하였다. 증식 지표를 항-CD3 + 항-CD28 자극의 흡광도/항-CD3 자극 단독의 흡광도로 계산하였다.
사이토킨 분석
마우스 사이토킨 수준들을 혈장 및 복막액 속에서 16-멀티플렉스 면역검정(multiplex immunoassay)(제조원: 유타주 로간 소재의 Quansys Biosciences)을 사용하여 측정하였다. KC, Rantes(둘 다는 미네소타주 미네아폴리스 소재의 R&D Systems으로부터 입수함), IL-3(제조원: BD biosciences) 및 IL-17A(제조원: Biolegend) 수준들을 혈장, 복막액 또는 조직 균질물들 속에서 "샌드위치 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)" 기술에 의해 모노 클로날 항체 쌍들 및 앞서 기술한 바와 같은 마우스 사이토킨 표준물들을 사용하여 측정하였다[12].
통계학
모든 값들은 평균 ± 표준 편차로 나타낸다. 그룹들 사이의 차이들은 스튜던츠 t-시험을 사용하여 그래프파드 프리즘(GraphPad Prism)(윈도우즈용 버젼 4.03, 제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Software)로 분석하였다. 차이들은 P<0.05에서 유의적인 것으로 고려된다.
실시에 1 패혈성 관절염의 쥐 모델
1.1
펩타이드 D-Ala-p2TA는 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발된 패혈성 관절염을 감소시킨다.
펩타이드 D-Ala-p2TA를 그람-양성 패혈성 관절염의 대표적인 모델로 고려된, 에스. 아우레우스 무릎 관절 감염에서 집중적으로 연구하였다[15]. 당해 모델을 사용하여 에스. 아우레우스 감염의 발병기전을 연구하였다. 살아있는 세균들, 에스. 아우레우스 LS-1 그룹을 무릎 관절내로 관절내 주사하고 D-Ala-p2TA를 6, 12 및 24 시간 후에 복강내 주사하였다. 관절내 주사들 후 72시간 째에, 모든 관절 단면들을 관절염 및 관절 파괴의 중증도에 대해 맹검 분석하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹에서, 마우스 혈청 알부민으로 치료한 마우스들 모두(7/7)는 패혈성 관절염의 명백한 신호들을 나타내었다. 대조적으로, D-Ala-p2TA로 치료한 8마리의 마우스들 중에서, 단지 3마리(38%)만이 패혈성 관절염의 신호들을 나타내었다(*, p<0.05).
1.2
펩타이드
D-Ala-p2TA는 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들에 의해 유발된 패혈성 관절염을 감소시킨다.
펩타이드 D-Ala-p2TA를 그람-양성 패혈성 관절염의 대표적인 모델로 고려된, 고도로 정제된 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들에 의해 유발된 무릎 관절 감염의 모델에서 집중적으로 연구하였다[16]. 스타필로코쿠스 펩티도글리칸들을 무릎 관절내에 D-Ala-p2TA 또는 MSA와 함께 관절내 주사하고; D-Ala-p2TA 또는 마우스 혈청 알부민(MSA)을 6, 12 및 24 시간 후에 복강내 주사하였다. 관절내 주사들 후 72시간 째에, 모든 관절 단면들을 관절염 및 관절 파괴의 중증도에 대해 맹검 분석하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹에서, MSA로 봉강내 치료된 모든 마우스들 (10/10)은 당해 그룹의 경우 13의 중증도 지표로, 패혈성 관절염의 명백한 신호들을 나타내었다. 대조적으로, D-Ala-p2TA로 치료한 10마리의 마우스들 중에서, 4마리(40%) 만이 패혈성 관절염의 신호들을 나타니였으며, 관절 파괴의 누적 중증도 점수는 13에서 4.5로 감소(35%)하였다(*, p<0.05).
실시예 2
연조직 감염의 모델
펩타이드 D-Ala-p2TA를 괴사성 연 조직 감염(NSTI)의 대표적인 모델로 고려된, 그람-양성 연 조직 감염의 모델에서 집중적으로 연구하였다[13, 14]. 이는 에스. 피오게네스에 의한 대퇴부 감염의 모델이며, 이는 이의 발병기전을 연구하는데 광범위하게 사용된다. 에스. 피오게네스는 감염 부위에서 신속하게 확산하여 전신으로 퍼지는 능력을 가지며 괴사성 근막염을 포함하는 광범위한 침입성 감염들을 유발한다. 괴사성 근막염을 일반적으로 동반하는 심각한 쇼크의 많은 전신 특징들은 초항원들을 포함하는 외독소들의 세균 방출로부터 기원한다.
침입성 그람-양성 치사성 세균 감염(에스. 피오게네스)의 존재하에서 전체 생존을 증가시키는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 능력을 단일 투여량에서 단독 투여한 경우 평가하였다. 동결된 에스. 피오게네스를 5% 양 혈액이 보충된 트립티카제 대두 아가 위에 플레이팅하고 밤새 37℃에서 5% CO2 하에 항온치료하였다. 일야 플레이트들을 0.5% 효모 추출물(THYE)이 보충된 토드 헤위트 브로쓰(Todd Hewitt broth)로 세척하여 플레이트 성장물을 현탁시켰다. 재-현탁액을 THYE 속에 대략 109 CFU/ml(A600nm = 1.0)의 농도로 조절하였다. 감염되는 접종물은 1mL의 일야 현탁액을 9 mL의 THYE내로 희석시켜, 마우스들에게 투여하기 전 10-배 희석액(대략 1.0X108 CFU/ml)을 만들어서 생성시켰다. BALB/c 마우스들(6 내지 8주령)에 한쪽 뒷다리의 우측 대퇴부 근육내로 1 내지 1.5X107 CFU의 에스. 피오게네스를 0.1 ml의 용적으로 근육내 주사하였다.
2.1.
지연된 치료시 세균 감염로부터 보호
확립된 급성 세균 감염시 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과를 초기에 평가하기 위하여, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 5 mg/kg의 단일 정맥내 투여량으로서 15마리의 감염된 마우스들의 그룹들 감염 후 1시간 또는 5시간 째에 투여하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이들 투여들은 각각 80% 및 50%의 생존율을 제공하였다. 통계적 분석은, 치료 그룹들 각각의 경우, 치료되지 않은 대조군 그룹과 비교하여 p<0.05임을 나타내었다. 이들 결과들은, 세균 감염 후, 추가의 어떠한 항생제 치료없이 펩타이드 D-Ala-p2TA의 단일 투여 동안 적어도 5시간의 시간 프레임이 존재함을 나타낸다. 중요하게도, 동일한 투여량의 5 mg/kg은 감염 후 1 또는 5시간 째에, 감염 시기에 제공되거나 지연된 치료에 상관없이 효과적인 투여량이었다.
2.2.
지연된 치료 조건들 하의 투여량 반응
지연된 치료로서 투여하는 경우, 치명적인 에스. 피오게네스 감염으로부터 마우스들을 보호하는데 있어서 상이한 투여량들의 효능을 평가하기 위해, 20마리의 마우스들의 그룹을 감염 후 1시간 째에 2.5 내지 10 mg/kg 범위의 투여량들에서 정맥내 제공된 펩타이드 D-Ala-p2TA의 단일 투여로 치료하였다. 생존은 도 3에 나타낸 바와 같이, 감염 후 8일 동안 지속되었다.
생존 곡선 분석을 그래프파드 프리즘(버젼 5)에서 생존 시간 사이의 차이를 측정하기 위한 경향성들에 대한 대수 순위 시험으로 수행하였다. 경향성에 있어서의 차이가 검출된 경우, 대수 순위 시험들을 대조군 및 치료군들에 대해 수행하여 어떤 치료들이 이들의 집단들로부터 상이하였는지를 측정하였다. <0.05의 p 값은 유의적인 결과에 대한 한계였다.
임의의 치료의 부재하에서, 2 내지 4일로부터 20%의 최종 생존율에 있어 누적적인 사망률이 발생하였다. 2.5 mg/kg의 투여가 가장 효과적이며, 치료되지 않은 대조군 동물들과 비교하여 생존율이 3.25배까지 유의적으로 증가하였으며 대조군에 대해 p<0.005로 65%의 전체 생존율을 제공하였다. 당해 요법(regimen)에 대한 중간 생존 시간은 2.5 mg/kg에서 >8일이었고 감염 대조군, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 경우 3일이었다. 5 및 10 mg/kg의 투여량들은 거의 효과적이지 않았으며, 생존율들은 각각 45% 및 30%로 증가하였으며(p<0.05 대 2.5 mg/kg), 이는, 지연된 치료 조건들하에서, 2.5 mg/kg의 투여량을 사용한 치료가 최적임을 제안한다.
2.3.
펩타이드 D-Ala-p2TA는 확립된 에스. 피오게네스 감염을 치료하기 위한 항생제들의 치료학적 윈도우를 확장시킨다.
BALB/c 마우스들(10마리의 그룹들)를 에스. 피오게네스를 사용하여, 사망률이 첫날 후 이미 발생하여 7일 후 57%의 전체 생존율에 있어서 누적된 조건들 하에 감염시켰다. 도 4에 예시된 바와 같이, 당해 확립된 감염은 감염 후 말기 시점에(36시간) 항생제들만(세프트리악손, 0.25 mg/kg)으로 치료하였으며, 사망률은 지연되어 3일째에 시작하고, 이러한 치료는 부분적인 보호를 제공하여, 70% 생존으로 누적되었다. 그러나, 항생제들과 펩타이드 D-Ala-p2TA 둘 다를 감염 후 36시간 째에 동시 제공하는 경우, 생존 비율들은 증가하였다. 항생제 및 2.5 mg/kg의 펩타이드 D-Ala-p2TA의 조합된 치료는 생존률을 86%로 증가시켰고, 항생제와 5 mg/kg의 조합된 치료는 100% 보호를 제공하였으며, 여기서 마우스들의 어느 것도 죽지 않았다. 이들 결과들은, 단일 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA를 표준 항생제 치료에 첨가하는 것이 항생제들의 존재하는 치료학적 윈도우를 연장시킬 수 있으며, 치사 감염으로부터 완전한 보호를 부여함을 나타낸다. 이러한 특성은 임상 세팅들에서 잠재적으로 중요할 수 있으며, 여기서 항생제 치료는 흔히 확립된 감염들에 제공된다.
2.4
감염의 국소 부위에서 감염 신호들의 증진
연 조직 감염의 주요 특성은 독소들 및 효소들과 같은 세균 감염성 인자들로부터 뿐만 아니라 사이토킨들의 방출로부터도 생성되는, 감염 부위에서의 염증 및 괴사의 신속한 진행이다. 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료가 감염의 국소 부위에 직접적인 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 감염 부위를 감염 후 조기 시점에서 모니터하였다. Balb/c 마우스들을 이들의 좌측 뒷다리의 대퇴부에 에스. 피오게네스로 갑염시키고, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 지연된 치료로서 감염 후 1시간 째에 투여하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 감염 후 24시간 째에, 실질적인 괴사 병변이 검출될 수 있으며, 이는 또한 감염된 마우스들의 발바닥으로 확산되었고, 이는 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료되지 않았다(중간의 마우스들 참조). 그러나, 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 마우스들은, 염증 및 괴사의 신호들을 나타내지 않았으며, 이들의 발바닥은 염수를 주사한 대조군의 건강한 마우스들(좌측 마우스)의 발바닥과 유사하게 깨끗해 보였다(우측 마우스들 참조).
이들 결과들은, 펩타이드 D-Ala-p2TA가 감염 부위에서 국소적으로 뿐만 아니라 전신으로 둘 다 질병 증상들을 개선시켜, 증가된 생존을 누적시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, D-Ala-p2TA는 단일의 치사 투여량의 초항원을 사용한 챌린지에 의해 유발된 독성 쇼크를 차단할 뿐만 아니라[4, 5], 다양한 초항원들을 생산하는 살아서 복제하는 에스. 피오게네스에 대해 마우스들을 보호하기도 한다.
2.5.
투여량 요법
가장 양호한 치료 효과를 제공할 단일 치료요법으로서 제공된 경우 펩타이드 D-Ala-p2TA의 최적의 투여량 요법을 설명하기 위하여, 실험들을 수행하여 가장 유리한 치료를 위해 요구되는 투여량들의 수, 투여량들 사이의 간격, 및 또한 보다 적은 투여량들로 각각의 투여량의 분획화를 수행하기 위한 선택사항을 이행하였다. 이들 요법들을 에스. 피오게네스로 감염된 BALB/c 마우스들에서 시험하고, 감염 후 지연된 시점에서 치료하였다.
1회 투여량 대 다중 투여량들
마우스들(n=5)을 펩타이드 D-Ala-p2TA로 5 mg/kg의 투여량(정맥내 제공)에 의해 치료하는 것을 감염 후 5시간 째에 개시하는 경우 2회 투여량들에 대해 비교한 1회 투여량의 효과를 시험하였다. 제2 투여량을, 적용가능한 경우 감염 후 24시간 째에 제공하였다. 결과들은 도 6에 나타내며, 임의의 치료없이, 마우스들은 3일째에 죽기 시작하여, 5일째까지, 100%의 사망율이 명백하였음을 나타낸다. 1회 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 60%의 생존율을 제공한 반면, 2일 투여량들을 사용한 치료는 단일 투여량과 비교하여 실질적으로 감소된 효과를 가졌으며 7일째에 모든 동물들의 사망으로 끝났고, 당해 비율은 치료되지 않은 감염된 동물(치료 아암(arm)들 및 대조군 사이에서 P<0.05 값들을 가짐)의 사망률보다 더 낮았다.
2회 투여량들과 비교한 것으로서 단일 투여량의 효과를 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 제1 투여량의 치료를 감염 후 1시간 째에 개시하고 투여량들 사이의 간격이 12시간인 조건들하에서 또한 시험하였다. 2개의 상이한 투여량들, 2.5 및 5 mg/kg을 평가하였다. 대조군의 치료되지 않은 마우스들(n=20)은 20% 생존률을 나타내었다. 단일 투여량의 2.5 mg/kg(n=20의 그룹들에서)을 사용한 치료는 60%의 생존률을 제공하였으며, 2.5 mg/kg의 2개 투여량들이 단지 30% 생존률(p<0.005는 처리된 그룹과 대조군 그룹들 사이에서, 대수 순위 시험을 사용하여 계산하였다)을 제공하였으므로, 시험한 실험 조건들하에서 최적 효능인 것으로 측정되었다.
단일 투여량으로서 n=10의 동물들의 그룹에 제공된 5 mg/kg의 투여량의 경우 유사한 결과가 관측되었으며, 여기서 45% 생존이 검출된 반면, 2개의 투여량들은 단지 30% 보호를 제공하였다. 2회 이상의 투여량들(3 또는 4회 투여량들)의 첨가는 2회 투여량들의 결과를 증진시키지 않았고, 1회 투여량보다 덜 효과적이었다.
투여량들 사이의 간격
단일 투여량(감염 후 1시간 째에 제공된 제1 투여량)과 비교하여 2개 용량의 효과를 또한 2.5, 또는 5 또는 10 mg/kg의 다양한 투여량 강도들을 사용하여, 투여량들 사이의 시간 간격의 함수로서 측정하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 1회 투여량은 2회 투여량들과 비교하여, 이들 투여량들이 12 또는 24시간 간격으로 제공된 것에 상관없이 우수하였거나, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 1회 투여량은 또한 이들 투여량들이 48 또는 72시간 간격에서 제공되는 경우, 2회 투여량들과 비교하여 우수하였다. 이들 데이타는 시험한 모든 투여량들(2.5, 5 및 10 mg/kg)에 걸쳐 이루어졌다. 시험한 모든 투여량들 중, 2.5 mg/kg이 최고의 치료 이점을 가졌으며, 단일 투여량으로 제공된 경우 90% 생존률을 제공하였다(대조군에 대해 p=0.0043 및 2개 투여량들에 대해 0.0057).
2.5 mg/kg의 단일 투여량의 우수성에 대한 추가의 지지가 중간 생존 시간의 계산으로부터 발견될 수 있으며, 이는 모든 상기 치료된 그룹들 뿐만 아니라 대조군의 치료되지 않은 그룹의 경우 3일인 것으로 밝혀졌으며, 단 2.5 mg/kg(이는 >8일의 중간 생존 시간을 가졌다)의 단일 투여량을 제공한 그룹의 경우는 예외이다. 이들 결과들은 하기 표 1에 나타낸다.
| 치료 요법 | 투여량 | 중간 생존 |
| 감염성 대조군 | NA | 3 일 |
| D-Ala-p2TA, 단일 투여량 | 2.5 mg/kg | >8 일 |
| D-Ala-p2TA, 2회 투여량들 (1+12 시간) | 2.5 mg/kg | 3 일 |
| D-Ala-p2TA, 2회 투여량들 (1+24 시간) | 2.5 mg/kg | 3 일 |
| D-Ala-p2TA, 단일 투여량 | 5 mg/kg | 3 일 |
| D-Ala-p2TA, 2회 투여량들 (1+12 시간) | 5 mg/kg | 3 일 |
| D-Ala-p2TA, 2회 투여량들 (1+24 시간) | 5 mg/kg | 3 일 |
투여량 분획화:체중 kg당 2.5 mg의 펩타이드 D-Ala-p2TA의 유효한 총 투여량의 투여를 단일 투여량으로 제공한 경우, 및 각각 1.25 mg/kg의 2회 투여량으로 분획화하여, 투여량들 사이에 5분의 간격에서 제공한 경우 에스. 피오게네스 감염 (n=10)에서 시험하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 단일 투여량의 투여는 85% 생존을 제공하였으며, 단지 50% 생존을 제공하는 분획화된 누적된 동일한 투여량과 비교하여 보다 높은 효능을 제공하였다. 분획화된 투여량들 사이의 간격이 보다 긴(4 내지 12시간) 경우에 유사한 결과들이 수득외었다. 이들 데이타는, 유효 투여량에 대한 마우스들의 초기 노출이 보호를 전달하는데 중요할 수 있으며 유효 투여량을 보다 작은 분획들로 나누는 것이 효능을 감소시킴을 제안할 수 있다.
2.6
사이토킨 생산에 있어서 D-Ala-p2TA 펩타이드의 효과
사이토킨 생산에 있어서 에스. 피오게네스에 의한 그람-양성 감염의 조건들 하에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과들을 탐색하였다.
Balb/c 마우스들(치료한 10마리 및 10마리의 대조군들)을 에스. 피오게네스로 감염시키고, 펩타이드 D-Ala-p2TA(5 mg/kg에서)를 감염 후 1시간 째에 투여하였다. 감염되고 치료되지 않은 마우스들에게 PBS를 주사하고 대조군으로서 제공하였다. 감염 후 12시간 째에, 마우스들을 마취시키고, 혈액을 멀티플렉스 면역검정(multiplex immunoassay)을 사용하여 혈장 속에서 사이토킨들 및 케모킨들의 측정을 위해 수집하였다.
전체적으로, 9개의 사이토킨들 및 케모킨들을 평가하고 Th1 사이토킨들 (IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-17A) Th2 사이토킨들(IL-10) 및 염증성 사이토킨들/케모킨들(IL-6, KC(마우스 IL-8), RANTES, MCP-1)을 포함시켰다. 결과들은 도 10a 및 10b에 나타낸다. 사이토킨 수준들에 있어서의 감소는 모든 시험한 사이토킨들/케모킨들, 즉, 도 10a-1, 도 10a-2, 도 10a-3 및 도 10a-4 각각에 나타낸 바와 같은 IFN-γ, IL-17A, TNF-α및 IL-1β 및, 도 10b-1, 도 10b-2, 도 10b-3 및 도 10b-4 각각에 나타낸 바와 같은 IL-8, IL-6, RANTES 및 MCP-1에 대해 관찰하였으며, 이는, 감염 후 조기 시점에서 이미 다수의 사이토킨들의 수준이 감소함을 나타내며, 이러한 사실은 수득된 시험관내 결과들 및 예측된 작용 메카니즘과 일치한다. 다수의 사이토킨들에 있어서 감소 효과는 상승적이므로, 각각의 사이토킨 수준의 영향은 염증성 반응의 보다 큰 정도의 감소인, 상승효과의 측면에서 증폭될 것이다.
흥미롭게도, Th2 사이토킨 IL-10의 수준은 증가하여 감염 후 24시간 째에 정점(피크)에 도달함을 나타내었다(도 10c에 나타낸 바와 같음). 24시간의 더 늦은 시점에서 IL-10의 증강된 수준들은, Th1 전-염증성 사이토킨들 수준들에 있어서의 초기 감소가 세균 감염의 보다 우수한 관리에 기여할 수 있는 항-소염성 Th2 사이토킨들에 있어서의 증가를 후속적으로 수반함을 제안한다.
감염된 마우스들에서 전-염증성 사이토킨 생산의 약화는 펩타이드 D-Ala-p2TA에 의해 확장된다.
T 세포들에서 APC들 및 TCR들에 있어 MHC II 분자들의 "브릿징(bridging)"시, 초항원들(SAgs)은 전-염증성 사이토킨들의 대량 방출 및 후속적인 치사 쇼크와 함께 T 세포들을 >20% 활성화시킨다.
감염 후 12, 24, 48 및 72h째에 수거한 혈청 시료들을 GAS로 감염되고 펩타이드 D-Ala-p2TA 또는 PBS(대조군)으로 감염 후 1시간 째에 치료된 마우스들로부터 취한 시료들 속에서 사이토킨들(IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6 IL-17, 및 IL-10) 및 케모킨들(KC, RANTES, MCP-1)에 대해 시험하였다. 실제로, 치료되지 않은 대조군들과 비교하여, D-Ala-p2TAa로 치료한 마우스들에서 몇가지 전-염증성 사이토킨들의 수준에 있어서 유의적인 감소가 D-Ala-p2TA 투여 후 12시간째와 같이 조기에 관찰되었으며, 이는 시험관내 데이타와 일치한다.
|
에스. 피오게네스
48 hr (pg/ml) |
D-Ala-p2TA 펩타이드 치료
48 hr (pg/ml) |
p 값 | |
| IL6 | 3707 +/- 1380 | 997 +/- 559 | 0.02* |
| IL1β | 31 +/- 3 | 21 +/- 5 | 0.13 |
| TNFα | 18 +/- 2 | 14 +/- 1 | 0.57 |
| IFNγ | 10 +/- 1 | 5 +/- 2 | 0.5 |
| IL17 | 0.8 +/- 0 | 0.4 +/- 0 | 0.8 |
| IL10 | 48 +/- 4 | 29 +/- 14 | 0.04* |
| KC | 4009 +/- 1936 | 2250 +/- 1481 | 0.75 |
| MCP1 | 278 +/- 27 | 140 +/- 21 | 0.025* |
| RANTES | 19 +/- 4 | 12 +/- 3 | 0.1 |
|
에스. 피오게네스
72 hr (pg/ml) |
D-Ala-p2TA 펩타이드 치료
72 hr (pg/ml) |
p 값 | |
| IL6 | 6895 +/- 468 | 889 +/- 681 | 0.009** |
| IL1β | 26 +/- 1 | 11 +/- 4 | 0.17 |
| TNFα | 27 +/- 5 | 13 +/- 2 | 0.04* |
| IFNγ | 9 +/- 1 | 3 +/- 2 | 0.35 |
| IL17 | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 0.67 |
| IL10 | 113 +/- 31 | 54 +/- 13 | 0.01** |
| KC | 4103 +/- 648 | 2373 +/- 1193 | 0.88 |
| MCP1 | 265 +/- 6 | 192 +/- 34 | 0.1 |
| RANTES | 25 +/- 6 | 8 +/- 3 | 0.11 |
치료되지 않은 마우스들과 비교하여, 펩타이드-치료된 마우스들에서 IFN-γ, IL1-β 및 IL-6의 수준들은 모든 4개 시점들에서 유의적으로 약화되었다. 48 및 72시간에서 사이토킨들/케모킨 수준들은 상기 표 2에 나타낸다.마우스들의 당해 세트에서 수행된 동시 생존 분석은, 10마리의 치료되지 않은 마우스들 중의 단지 5마리 만이 감염 후 48시간 째에 생존하였으며, 10마리의 치료되지 않은 마우스들 중의 2마리가 72시간 동안 생존한 반면, 10마리의 D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 마우스들 중의 10마리가 72시간 동안의 세균 챌린지에서 생존하였음을 나타내었다.
모든 시점들에서 각각의 사이토킨에 대한 중간은 다음과 같이 도 11a 내지 11d에 나타낸다: 도 11a-1는 감염 후 12 시간째에 IFN-γ에 대해 수득된 결과들을 나타내며 24, 48 및 72 시간째에 IFN-γ에 대해 수득된 결과들은 각각 도 11a-2, 도 11a-3 및 도 11a-4에 나타낸다. 도 11b-1은, 감염 후 12시간째에 IL-1β에 대해 수득된 결과들을 나타내고 24, 48 및 72 시간째에 IL-1β에 대해 수득된 결과들은 각각 도 11b-2, 도 11b-3 및 도 11b-4에 나타낸다. 유사하게, 도 11c-1는 감염 후 12시간째에 IL-6에 대해 수득된 결과들을 나타내며 24, 48 및 72 시간째에 IL-6에 대해 나타낸 결과들은 각각 도 11c-2, 도 11c-3 및 도 11c-4에 나타낸다. 도 11d는 8개의 사이토킨들, 즉 TNF-α IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-10, KC (마우스 IL-8), MCP-1 및 RANTES에 대해 감염 후 48h(도 11d-1) 및 72h(도 11d-2)째에 표 2에 나타낸 결과들의 그래프적 표시를 나타낸다.
2.7.
에스. 피오게네스에 의한 감염 후 세균 부하에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과
세균들에 의한 감염 후, 세균들은 국소 감염 부위들로부터 비장, 간 및 신장과 같은 주요 기관들로 확산하며, 여기서 이들은 독성 성분들을 지속적으로 분비함으로써 기관 손상에 기여한다. 에스. 피오게네스로 감염된 마우스들은 항생제들로 치료하지 않았지만, 여전히 이들은 감염에서 생존하였다. 따라서, 항-세균 특성들이 없는, 펩타이드 D-Ala-p2TA가 감염 부위 또는 주요 기관들내에서 세균 부하에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는지를 시험하였다.
5마리의 Balb/c 마우스들의 그룹들을 에스. 피오게네스로 감염시키고 펩타이드 D-Ala-p2TA 또는 PBS로 치료하였다. 치료되지 않은 마우스들은 감염 대조군으로 제공하였다. 마우스들을 감염 후 24 및 48 시간째에 마취시키고, 감염된 대퇴부들 및 비장으로부터의 조직 시료들을 수집하고 균질화하였다. 일련의 희석 후, 균질물을 플레이팅하여 각각의 그룹에 대한 조직의 CFU/mg의 수준을 측정하였다. 결과들은 도 12에 나타내며, 항생제들의 부재하에서 및 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료 후, 감염 부위 및 먼 기관 둘다에서 퍼진 세균들의 수준에 있어서의 감소는 24시간째에 이미 명백하며(참조: 도 12a, 근육 및 도 12c, 비장), 48 시간까지 지속됨(참조: 도 12b, 근육 및 도 12d, 비장)을 나타낸다. 세균 부하가 감소된 마우스들은 세균 독소에 대해 항체들을 발달시킬 수 있으므로 이들의 유해한 독성을 중화시킨다.
펩타이드 D-Ala-p2TA는 감염 후 72시간까지 세균 부하를 약화시킨다.
놀랍게도, 세균 수에 있어서 유의적인 차이가 치료되지 않은 마우스들과 D-Ala-p2TA 치료된 마우스들 사이에서 근육 조직 속에서 감염 후 72시간까지 관찰되었다(도 13a).
감염 후 3일째에, 감염 부위로부터 먼 부위들, 즉 폐들, 신장, 간 또는 전신 혈액으로 병원체의 대량 확산은 감염된 동물들에서 관찰되지 않았다. 그러나, 세균들의 낮은 수준이 비장 및 간에서 치료된 그룹과 치료되지 않은 그룹들 사이에 약간의 차이로 검출되었다(도 13b 및 도 13c). 이들 데이타들은, 마우스드를 GAS로 감염시키는 동안, 치사 결과로 이끄는 우세한 효과들이 독소들 및 효소들과 같은 세균 발병성 인자들로부터 뿐만 아니라 사이토킨들의 방출로부터도, 원격으로 작용하여 생성될 수 있음을 제안한다.
펩타이드 길항제는 근 조직에서 근염을 효과적으로 약화시킨다.
치료되지 않은 마우스들에서, 괴사 근막염의 발병이 감염 후 24시간째에 조기에 관찰되었다. 조직 병리학을 연구하기 위하여, 근육 단면들을 의학적 진단에서 광범위하게 사용된 염색인 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색으로 염색하였다. 감염 후 48시간까지, 근육 단면들은 근막내에 주로 심각한 급성 염증성 침윤물을 나타내었다. 치료되지 않은 대조군들과 비교하여, D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 마우스들로부터의 근육 단면들은 약간의 침윤물을 나타내었다(도 14a 내지 14b). 72시간 째에 치료되지 않은 대조군들로부터 취한 근육 단면들에서, 주로 호중구들로 구성된, 근육 세포들의 명백하게 심각한 괴사가 존재하였지만, D-Ala-p2TA-치료된 마우스들에서는 괴사가 유의적으로 더 약했다(도 14c 내지 14d).
위에 나타낸 조직학 데이타는 이들 시점들에서 관찰된 사이토킨 프로파일과 일치하며(상기 표 2에 나타낸 바와 같음) 도 5에 나타낸 감소된 조직 손상(괴사)와 일치한다. 치료되지 않은 마우스들에서 감염 부위에 대한 염증성 세포들의 심각한 침윤은 감염되고 치료되지 않은 동물들에서 케모킨 수준들에 있어 유의적인 증가, 및 D-Ala-p2TA 치료 후 케모킨들(특히 KC에 있어서)의 수준들에 있어서의 감소와 상호 관련되어 있다.
감염 부위에서 관찰된 병리학적 변화들과는 대조적으로, 간 및 신장과 같은 먼 기관들에서 치료된 그룹들과 치료되지 않은 그룹들 사이에 조직 병리학에 있어 차이들은 관찰되지 않았다. 이는 이들 마우스들로부터의 혈청을 크레아티닌, ALT, AST, 알칼린 PO4 및 빌리루빈에 대해 시험한 경우 2개 그룹들 사이의 신장 및 간 기능들에 있어서 관찰가능한 차이들 또는 비정상들이 없는 것에 의해 추가로 지지된다(하기 표 3에 나타낸 바와 같음).
| 에스. 피오게네스 감염된 마우스들 | 감염 후 D-Ala-p2TA 펩타이드 치료된 마우스들 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 크레아티닌(mg/dL) | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.2 |
| AST (U/L) | 88 | 13 8 |
93 | 12 9 |
14 2 |
60 | 12 7 |
18 5 |
14 4 |
29 0 |
| ALT (U/L) | 17 | 22 | 18 | 19 | 27 | 17 | 22 | 31 | 17 | 32 |
| 알칼린 P04 (U/L) | 28 | 30 | 30 | 28 | 44 | 34 | 33 | 44 | 28 | 26 |
| 빌리루빈(mg/dL) | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.2 |
펩타이드 D-Ala-p2TA는 마우스들에서 독혈증을 약화시킨다.다음에, 본 발명자들은, 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료하고 그룹 A 에스. 피오게네스로 챌린지한 마우스들이 스트렙토코쿠스 피로겐성 외독소들 A 또는 C 또는 스트렙토코쿠스 발병성 인자 B에 대해 항체들을 생산할 수 있는지를 시험하였다. 항체 역가들을 감염 후 5일째에(이 시점에서 치료되지 않은 마우스들은 전형적으로 빈사상태였다), 및 감염 후 14일째에 평가하였다.
도 15에 입증된 바와 같이, 모든 3개의 외독소들에 대한 역가들은 5일째의 조기 시점에서 관찰되었다(도 15d, e 및 f). 감염 후 2주째에, 대부분의 마우스들(17/20)은 시험된 스트렙토코쿠스 초항원/발병성 인자 분자들의 적어도 1개 또는 2개에 대해 항체 역가들을 입증하였고(도 15a, b 및 c), 당해 수준들은 5일째에 역가들과 비교하여 더 높았다.
생존하는 마우스들 중의 3마리만이 SPEA, SPEB 및 SPEC 중의 어느 것에 대해 항체들을 발달시키지 않았다(도 15a 내지 15c). 이들 마우스들이 GAS 독소들에 대해 항체들을 생성하지 않았거나 이들이 당해 실험에서 검정되지 않았던 스트렙토코쿠스 유사분열성 외독소 Z 또는 스트렙토코쿠스 발열성 외독소 J와 같은 다른 스트렙토코쿠스 독소들에 대해 항독소 역가들을 발달시키지 않았던 것이 가능하다. 점증적으로, 이들 데이타는, 펩타이드 D-Ala-p2TA가 균혈증보다는 독혈증을 약화시킴으로써 GAS 챌린지에 대해 마우스들을 보호함을 제안한다.
펩타이드 D-Ala-p2TA는 T-세포 증식의 항원 제시 세포(APC) 매개된 동시-자극의 유도를 지연시키지 않는다.
감염 후 투여된 D-Ala-p2TA는 초항원 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 챌린지 둘 다 이후에 마우스들의 생존을 효과적으로 촉진하였고 이들 챌린지들은 사이토킨 반응을 유발하였으므로(상기 표 2에 나타낸 바와 같음), 세포 증식에 있어서 펩타이드의 잠재적인 효과를 또한 시험하였다. 이러한 목적으로, 혼합된 림프구 반응(MLR) 모델을 이용하였으며, D-Ala-p2TA의 존재 및 부재하에서 CD-28/TCR의 동시-자극을 통해 T-세포 증식을 유발하는 항원 제시 세포들(APCs)의 능력을 측정하였다. 당해 모델은 T-세포들을 자극시키기 위한 감염성 제제를 필요로 하지 않으므로 다양한 투여량들의 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용하는 경우, 펩타이드의 억제 효과(혼합된 림프구 반응의 차단)는 관찰되지 않았음이 밝혀졌다(도 16).
실시예 3
폐 감염의 모델
폐 감염 모델을 그람-양성 세균들 스트렙토코쿠스 뉴모니아에로 감염시킨(107 CFU/마우스들에서) BALB/c 마우스들에서 3 내지 5일내 100% 사망률을 생성하는 조건들하에서 확립하였다. 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 항생제 치료에 부가되었으며, 감염이 이미 확립된 경우, 지연된 시점에서 제공하였다.
3.1
치사성 폐 감염으로부터 보호
치료를 제공받지 않았던 에스. 뉴모니아에로 감염된 마우스들(치료 그룹 당 10 마리 동물들을 사용)은 감염 후 3일째에 시작하여 매우 신속하게 진행하는 사망 과정을 나타내어, 2일 이상 후(5일째에) 모든 동물들이 죽었다. 동물들을 감염 후 24시간 째에 제공된, LD25(1 mg/kg)의 최적 이하 투여량에서 복강내(i.p.) 투여된, 세프트리악손만으로 치료한 경우, 생존율들은 20%까지 증가하였다. 그러나, 펩타이드 D-Ala-p2TA(5 mg/kg에서)을 항생제들과 함께 감염 후 24시간 째에 제공한 경우, 50%까지의 생존에 있어서의 실질적인 증가가 관찰되었다(참조: 도 17).
3.2
치사성 폐 감염으로부터 보호: 투여량 반응
펩타이드 D-Ala-p2TA의 생존 이점 및 상이한 투여량들 사이의 상관관계는, 에스. 뉴모니아에 감염된 동물들(n=10)에게, 고정된 투여량의 항생제들(세프트리악손, 1 mg/kg의 최적 이하 투여량에서 복강내 투여) 및, 감염 후 24시간 째에 항생체 치료 후 2분째 제공된 상이한 투여량들의 펩타이드 D-Ala-p2TA의 조합물을 제공한 경우에 시험하였다. 이들 실험 조건들하에서(참조: 도 18), 치료되지 않은 마우스들은 2일째에 시작하여 신속하게 죽었으며, 3일째까지, 모든 동물들이 이미 죽었다. 항생제 치료만은 생존에 있어서 약간의 변화를 제공하여, 20%까지 생존시켰다. 5 mg/kg의 펩타이드 D-Ala-p2TA와의 병용 치료는 생존에 있어서 실질적인 증가(50%)를 제공하였으며, 2.5 또는 10 mg/kg의 투여량이 항생제 만의 효과를 초과하는 동물 생존에 기여하지 않았으므로, 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 4
그람-음성 감염들: 복막염 대장균의 모델들
침입성 그람-음성 세균 감염(대장균 복막염)의 존재하에서 전체적인 생존을 증가시키는 펩타이드 D-Ala-p2TA의 능력을 항생제 세페핌과 함께 투여한 경우 평가하였다.
급성 세균성 복막염은 BALB/c 마우스들을 대장균의 침입성 발병성 분리체인, 대장균 균주 018:K1으로 복강내 챌린지함으로써 유발시켰다. 챌린지 균주를 TSB 속에서 중기-대수 상으로 성장시킨 후 정상 염수 속에서 세척하고, 일련 희석시키고, 동물들에게 투여하였다. 1차 실험들에서, 아-억제성 투여량의 항생제 세페핌(Elan)은 챌린지 후 4시간 째에 제공된 경우(일반적인 유효 투여량의 25%를 반영), 5 mg/kg의 근육내(i.m.)인 것으로 확립되었다.
또한, 1차 실험들을 수행하여 복강내 챌린지 후, BALB/c 마우스들에서 대장균의 LD50을 정의하고, 107 콜로니 형성 단위들(CFU)인 것으로 확립하였으며, 당해 LD50 값은 세페핌의 아-억제성 농도들의 존재하에서 반복한 경우 유사하였다. 이러한 최적 이하 항미생물 치료요법의 존재하에서, 대장균 복막염의 유발 후 동물들을 추가로 보호하기 위한 펩타이드 D-Ala-p2TA(0.5 내지 5.0 mg/kg에서, i.v.)의 능력을 다음과 같이, 이후에 시험하였다.
대장균 복막염의 유발 후, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 감염 시기에 마우스들에게 최적 이하 투여량의 세페핌과 함께, 정맥내 투여하였다. 동물들의 생존을 7일의 기간에 걸쳐 모니터하였다. 스크램블드 펩타이드(동일한 아미노산 조성을 가지지만 서열이 상이함)로 치료한 동물들의 생존율은 염수 치료된 대조군과 비교가능하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 어떠한 치료의 부재하에서도, 감염된 마우스들의 대부분은 급속하게 죽었으며(24시간내), 여기서 마우스들의 단지 15%만이 생존하였다. 세페핌만을 사용한 마우스들의 치료는 20%의 전체 생존으로 최종 결과를 증진시키지 않았지만, 사망까지의 시간이 약간 지연되었다. 대장균로 감염시켰지만 최적 이하 투여량의 세페핌과 펩타이드 D-Ala-p2TA(0.5 및 5 mg/kg의 투여량에서)의 조합으로 치료한 마우스들은, 7일 이후, 각각 90 및 100%의 전체 생존으로서, 통계적으로 유의적인 증진을 나타내었다. 스크램블드 펩타이드(동일한 아미노산 조성을 가지지만, 서열이 상이함)로 치료한 동물들의 생존율은 염수 치료한 대조군과 비교가능하였다.
4.1.
감염된 동물들의 치료 효능에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 투여량 분획화의 효과
급성 세균성 복막염을 BALB/c 마우스들에서 유발시켰다. 대장균 감염으로부터 마우스들의 100% 보호를 나타내는 것으로 밝혀진 최적 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA(감염 시기에 제공됨)는 5 mg/kg이었다. 동물 생존이 24시간내에 20%로 신속하게 감소하는 감염 대조군과 비교하여, 세페핌만의 첨가(감염 후 4시간 째에, LD25에서)는, 비록 보다 느린 속도에서라 하더라도 동물들의 수명에 영향을 미치지 않았으며, 여전히 20% 생존에 도달하였다. 5 mg/kg에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 완전히 효과적인 투여량의 단일 투여의 치료 이점은 투여량들 사이에 12시간 간격들로 제공된, 각각 1.25 mg/kg의 4개의 동일한 부분들로 나누어진 투여량에 대해 비교하였으며, 투여량 분획이 도 20에 나타낸 바와 같이, 거의 효과적이지 않으며, 70% 생존에서 끝남을 나타내었다.
실시예 5
다균성 감염: 맹장 결찰 및 천자(CLP)의 모델
쥐 맹장 결찰 및 천자(CLP) 모델은 다균성 감염들을 시험하고 복부내 감염들 또는 패혈증에 있어서 치료제들의 효과들을 수반하는 임상적으로 관련된 모델이다. 당해 동물들을 길항 제제(reversal agent)로서 아티파메졸 하이드로클로라이드 5mg/kg으로 마취(케타민; 75 mg/kg 및 덱사메토니딘; 1mg/kg)으로 마취시켰다. 맹장을 1.5 cm 중간 절개를 통해 몸밖으로 꺼내고 5-0 나일론 모노필라멘트 봉합선으로, 회맹부 연결과 매우 근접한 이의 길이의 90%에서 결찰시켰다. 이후에, 맹장을 23 게이지 침(gauge needle)을 사용하여 맹장의 장간막-앞쪽 측면(ante-mesenteric side)을 따라 2회 천자하였다. 효능은 부족한 양의 박막 성분을 천자 부위를 통해 발현시킴으로써 보증하였다. 기관을 복강내로 다시 넣고, 근막 및 피부를 봉합하고, 국소 리도카인 및 바키트라킨을 수술 부위에 적용하였다. 각각의 동물에게 20 mg/kg의 근육내 투여량의 목시플록사신(최적 이하 투여량의 LD25을 나타냄) 및 1 ml의 피하 덩어리의 정상 염수를 제공하였다. 동물들을 완전한 의식이 있을때 까지 재-가온되도록 한 후 이들의 우리들에 다시 두었다.
정맥내(i.v.) 제공하는 경우, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효능을 시험하고 동물들을 패혈증 및 생존의 명시적인 신호들에 대해 총 7일 동안 매일 시험하였다. 빈사 상태의 동물들(<30℃의 저체온증 및 정상 체위를 유지할 수 없는 것으로 정의함)을 마취시키고 치사적으로 감염된 동물들로 기록하였다. 7일 말기에, 생존 동물들을 마취시켰다. 동물들을 기관 조직들(혈액, 복막, 간, 폐, 및 비장)의 정량적 미생물학에 대해 시험하였다.
5.1.
CLP 후 1회 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA 투여의 시간 윈도우
펩타이드 D-Ala-p2TA는 그람-양성 감염들의 경우들에서 단일 투여량으로서 투여되는 경우 가장 효과적인 것으로 밝혀졌으므로, 단일 투여량으로서 이의 투여를 또한 다균성 감염 모델에서 평가하였다(도 21). 모든 동물들에게 수술 말기에 목시플록사신(이의 LD25에서)을 제공하였으며, 이러한 치료는 동물들의 생존에 기여하지 않았으며, 이는 단지 5%였다. 그러나, 단일 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA (5 mg/kg)을 CLP 후 2시간 째에 마우스들에 제공한 경우, 생존율은 90%(p<0.001)까지 현저하게 증가하였다. 이들 데이타는, 다균성 감염에 마우스들을 노출한 후 2시간 째에 투여된 1회 투여량이 고 수준의 보호를 제공하는데 충분함을 제안한다.
5.2.
단일 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA에 의한 지연된 치료의 시간 윈도우
이미 확립된 감염 후 말기(또는 지연된) 시점에 투여된 치료제의 우수한 효능을 수득하는 것은 임상 세팅들에서 챌린지이다. 펩타이드 D-Ala-p2TA가 단일 투여량으로서 투여될 수 있고 치사 감염으로부터 동물들을 여전히 구조할 수 있는 동안, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 잠재적인 시간 윈도우의 시험을 수행하였다(참조: 도 22). CLP에 적용시키고 치료되지 않은 채로 남은(85%), 동물들의 대부분(85%)이 3 내지 6일내에 죽었다. 이러한 동물들은 CLP 후 12 시간째에 투여한, 고 유효 투여량의 항생제들(목시플록사신; LD90)로 치료한 경우, 생존율들은 실질적인 변화를 나타내지 않았으며, 단지 22%까지 증가하였고, 이는, 당해 시점에서, 항생제들만의 첨가는 이의 최대 유효 투여량에서 사용되었다고 하더라고 유리하지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 동물들을 고 투여량의 항생제들과 함께 단일 투여량의 5 mg/kg의 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료하는 경우(모두 CLP 후 12시간 째에 투여됨), 100%의 생존이 수득되었다. 펩타이드 D-Ala-p2TA 치료가 보다 늦은 시점에, 즉, CLP 후 24시간 째에(항생제들은 CLP 후 12 시간째에 제공된다) 제공되는 경우, 동물들의 생존율은 65%이었으며, 이는 항생제들만으로 치료한 후 생존과 비교하여 실질적으로 더 높다. 이들 결과들은, 항생체들 치료만이 생존에 기여하지 않는 조건들 하에서, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 첨가는 생존을 현저히 증진시켰음을 나타낸다.
5.3.
펩타이드 D-Ala-p2TA의 1회 투여량 대 다수 투여량들의 효과
4회 투여량들의 펩타이드 D-Ala-p2TA와 비교한 것으로서 1회 투여량의 투여의 명백한 치료학적 장점으로 인하여, 단일 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA 내지 2회 투여량들 및 3회 투여량들 사이의 비교는, 제1 투여량을 CLP 후 2시간 째에 제공한 경우에 수행하였다(도 23). 1회 투여량의 5 mg/kg은 2 또는 4회 투여량들보다 우수한 것으로 밝혀졌으며, 40 및 60% 보호(대조군의 치료되지 않은 동물에 대해 각각 0.0002 및 0.0007의 p 값으로)와 비교하여 90% 보호(대조군에 대해 p=0.001)를 제공한다. 4회 투여량들의 투여가 2회 투여량들의 투여보다 더 효과적인 것으로 여겨진다고 해도, 2회 및 4회 투여량들 사이의 생존에 있어서의 차이는 통계적으로 유의적이 아니었다.
5.4.
CLP 모델에서 D-Ala-p2TA의 단일 투여의 투여량 반응
CLP에 적용시킨 동물들에 대한 단일 투여량으로서 투여한 경우, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 투여량 반응 상관관계들을 시험하였다. 동물들을 수술 후 2시간 째에 1.25, 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 각각의 펩타이드 D-Ala-p2TA(n=8마리의 동물들)의 단일 투여량으로 치료하였다. 최적 이하 투여량의 목시플록사신(LD25)을 0시에 제공하고, 단지 20% 생존율을 제공하였다. 결과들은 도 24에 나타낸다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 단일 투여량의 2.5 mg/kg은 보다 우수한 것으로 여겨지며, 90% 생존(대조군의 치료되지 않은 동물들에 대해 p=0.006)을 제공하였다. 1.25, 5 및 10 mg/kg의 투여량들은 각각 40%, 65%(대조군에 대해 p=0.01) 및 75%(대조군에 대해 p=0.054) 생존을 부여하였다. 2.5, 5, 및 10 mg/kg의 투여량들 사이에서 통계적인 유의성은 수득되지 않았다. 이들 데이타는, 치료 이점을 제공하는 최적 투여량은 2.5 mg/kg이며, 유사한 효과가 2.5 내지 10 mg/kg의 투여량 범위까지 나타내었음을 제안한다. 그러나, 1.25 mg/kg의 투여량은 거의 효과적이지 않음이 밝혀졌다.
5.5.
펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료 후 사이토킨 반응
CLP 후 사이토킨 및 케모킨 생산에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 잠재적인 효과를 추가로 시험하였다.
CLP에 적용시킨 Balb/c 마우스들을 항생제들의 어떠한 첨가없이 펩타이드 D-Ala-p2TA (5 mg/kg)의 단일 투여량으로 치료하고, 수술 후 2시간 째에 개시하였다. 마우스들(치료된 6 내지 8마리 및 치료되지 않은 6 내지 8 마리 대조군, 및 추가의 대조군으로서 제공된, 2마리의 sham-수술된 동물들)을 수술 후 12 및 24시간 째에 마취시키고, 혈액을 헤파린 처리된 주사기들 속에 심장 천자로 수집하여다. 이후에 혈장을 원심분리하여 수득하고 분석할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 복막액들을 마우스들로부터 세척(lavage)에 의해 수득하고, 원심분리로 투명화한 후 분석할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 대표적인 Th1 사이토킨들로서, TNF-α의 수준들을 측정하고, 전-염증 반응과 관련된 대표적인 케모킨들로서, RANTES 및 KC의 수준들을 측정하였다. 감소를 D-Ala-p2TA 펩타이드-치료된 동물들의 혈액(혈장) 및 국소 감염 부위(복막액) 둘다에서 검출하였다(도 25a 내지 25f). 최대 효과를 TNF-α(참조 도 25a 및 25b) 및 RANTES(참조: 도 25c 및 25d)에 대해 24시간 째에 혈장 및 복막액 둘다에서, 및 KC에 대해 혈액 속에서(참조: 도 25e) 관찰하였다. 이들 결과들은, 펩타이드 D-Ala-p2TA 치료가 감소된 염증성 사이토킨/케모킨 반응과 관련되어 있으며 사이토킨 반응의 조절인자로서 p2TA의 예측된 역활과 일치함을 제안한다. 통계적인 분석을 1-방식 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 기호 *는 SHAM에 대해 P<0.05를 나타내고 기호 #는 펩타이드 D-Ala-p2TA에 대해 P<0.06을 나타낸다.
CLP 후 복막 및 혈액내 추가의 사이토킨/케모킨의 수준들을 평가하였다. 하기 표 4는 CLP 후 12 또는 24시간 째에 취한 복막액 및 혈장속에서 TNF-α, IL-6, IL-17A, IL-10, Rantes, MCP-1 및 KC의 수준들을 요약하였다. 시험한 모든 사이토킨들/케모킨들은 패혈증의 유발 후 증가하였다. 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료가 CLP 후 12 및 24시간 째에 복막 및 혈장 속에서 TNF-α, Rantes, KC 및 IL-17A 수준들의 일반적인 감소를 나타내었지만, 이러한 차이들은 비히클-치료된 대조군 마우스들과 비교하여 24시간 째에 TNF-α 및 Rantes에 대해 복막내에서 및 12시간 째에 KC에 대해서만 유의적이었다. 그러나, 펩타이드 D-Ala-p2TA는 측정된 임의의 시점들에서도 혈액 및 복막액 어느 것 속에서도 CLP-유발된 IL-6, IL-10 및 MCP-1 수준들에 있어 효과가 없었다.
| 사이토킨/케모킨 pg/mL | SHAM | CLP+비히클 | CLP+D-Ala-p2TA 펩타이드 |
| P.F. TNF-α 12h | 9.2±3.0 | 276.3±43.3* | 235.5±33.0* |
| 혈장 TNF-α 12h | 20.1±7.4 | 197.2±27.3* | 148.7±20.3* |
| P.F. TNF- a 24h | 1.6±1.6 | 174.4±33.9*# | 51.6±13.6* |
| 혈장 TNF-α 24h | 0.0±0.0 | 41.4±34.4* | 18.2±10.9* |
| P.F. Rantes 12h | 8.7±0.7 | 163.5±22.7* | 121.2±22.5* |
| 혈장 Rantes 12h | 44.9±12.2 | 147.5±20.0* | 121.3±13.1* |
| P.F. Rantes 24h | 4.6±2.1 | 165.5±41.8*# | 74.5±15.8* |
| 혈장 Rantes 24h | 5.6±2.3 | 46.8±15.7* | 23.3±5.3* |
| P.F. KC 12h | 0.0±0.0 | 154.2±10.6*# | 120.6±5.2* |
| 혈장 KC 12h | 2.6±2.3 | 155.0±8.9* | 148.1±5.5* |
| P.F. KC 24h | 1.1±0.03 | 30.5±4.3* | 25.3±1.4* |
| 혈장 KC 24h | 1.5±0.003 | 124.1±50.4* | 45.9±10.7* |
| P.F. IL-17A 12h | 0.6±0.6 | 144.0±43.9* | 111.6±58.7* |
| 혈장 IL-17A 12h | 3.2±3.2 | 41.2±20.7* | 34.7±11.3* |
| P.F. IL-17A 24h | 1.4±1.4 | 214.0±63.1* | 118.5±38.1* |
| 혈장 IL-17A 24h | 1.2±0.8 | 69.2±26.2* | 70.6±21.1* |
| P.F. MCP-1 12h | 520.9±117.9 | 6317.9±1005.9* | 6684.2±987.3* |
| 혈장 MCP-1 12h | 60.1±31.6 | 403.3±84.5* | 442.6±52.6* |
| P.F. MCP-1 24h | 91.0±20.8 | 2344.4±606.2* | 1265.7±544.7* |
| 혈장 MCP-1 24h | 29.6±21.3 | 653.5±141.6* | 434.1±85.7* |
| P.F. IL-10 12h | 15.9±5.2 | 440.1±119.7* | 338.5±119.1* |
| 혈장 IL-10 12h | 9.0±3.7 | 51.9±9.0* | 47.9±10.2* |
| P.F. IL-10 24h | 8.42±3.6 | 165.5±63.2* | 142.3±71.1* |
| 혈장 IL-10 24h | 0.0±0.0 | 42.7±8.8* | 41.2±9.7* |
| P.F. IL-6 12h | 295.5±59.4 | 8046.8±919.5* | 7946.0±1202.7* |
| 혈장 IL-6 12h | 17.9±7.9 | 2427.4±612.3* | 1797.3±671.1* |
| P.F. IL-6 24h | 30.1±12.9 | 4294.5±759.3* | 4040.2±853.0* |
| 혈장 IL-6 24h | 2.1±2.1 | 267.2±43.1* | 198.5±49.3* |
5.6. CLP에 적용된 동물들에서 세균 부하에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과 CLP에 적용된 동물들은 혈액 및 복막액 속에서 세균의 높은 부하를 나타낸다. 세균들은 일반적으로 복막액으로부터 혈액을 침입하며 대식구 표면들에 결합된 세균 성분들을 인식하는 순환하는 다형체 핵 세포들(PMN) 및 이차적으로 잔류하는 대식구들 자체에 의해 주로 사멸된다. 혈액으로부터 세균들은 간 및 비장(이들은 전신 순환으로부터 세균을 청소하기 위한 일차 부위들이다)으로 이주하며, 여기서 이들은 잔류하는 대식구들에 의해 정리된다. 세균 부하에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 잠재적인 효과를 연구하기 위하여, 이들 조직들/기관들 속에서 세균들의 확산을 측정하였다. CLP에 적용된 마우스들을 3개 그룹들(각각의 그룹에서 n=6 내지 8마리)로 나누고, 이들을 CLP 후 2시간 째에 펩타이드 D-Ala-p2TA (5 mg/kg)로 치료하거나, PBS를 주사하고 대조군으로서 제공하거나, sham-수술하였다. 동물들 중의 어느 것도 항생제들을 제공하지 않았다. 마우스들을 수술로부터 12 및 24 시간 후 마취시키고, 조직 시료들을 각각의 동물의 혈액, 복막액, 간, 신장 및 비장으로부터 수득하였다. 세균들의 수준은 콜로니 수들로 측정하였으며 치료된 그룹과 대조군 그룹 사이에서 비교하였다.
도 26a 내지 26e에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 조직들/기관들로부터 성장한 세균들의 수준들은 PBS 대조군 그룹과 비교한 것으로서, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 제공받은 그룹에서 더 낮았다. 혈액 시료(도 26a) 속에서, 실질적이고 통계적으로 유의한 감소가 12시간 째에 이미 검출되었다. 국소 감염 부위(복막액)에서, 감소는 또한 24시간째에 지속되었다. 다른 주요 기관들에서, 세균 수에 있어 최대 감소가 CLP 후 24시간 째에 검출되었다. 이들 결과들은, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료가 복막 및 혈액에서 뿐만 아니라 대식구들이 풍부한 다른 기관들에서도 감염 부위로부터 세균들의 증가된 청소율과 관련됨을 제안한다. 통계적 분석은 1-방식 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 기호 *는 SHAM에 대해 P<0.05를 나타내고 기호 #는 펩타이드 D-Ala-p2TA에 대해 P<0.06을 나타낸다.
5.7.
주요 기관들내로 백혈구 침윤에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과
펩타이드 D-Ala-p2TA는 기관 기능부전을 초래하는, 패혈증 동안 전신 염증의 발달에 있어서 주요 과정으로 연류되어 온 표적 기관들내로 다형체 핵 세포들(PMN)의 보충 및 축적에 관여하는 중요 성분인, 각질세포 케모킨(KC)의 감소된 수준들을 개시하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, PMN의 수준들을 CLP 후 비장, 간 및 신장에서 평가하고, PMN 활성과 관여하여, 호중구의 존재에 대한 직접적인 마커로서 제공되는 주요 효소인 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 활성에 의해 측정하였다. MPO 활성은 CLP후 12 및 24시간 째에 균질화된 조직들에서 측정하였다. 판독은 460nm에서 10분 동안 1분 간격들로 분광광도법으로 수행하였다. MPO 활성은 (단위들/min/mg)=A460 X 13.5/g(여기서 A460은 흡광도에 있어서의 변화율과 동일하다)로 나타낸다. 당해 결과들을 도 27a 내지 27c에 나타내며, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료 후, MPO 활성에 있어서 실질적이고 통계적으로 유의적인 감소를 CLP(12 시간) 후 조기 시점에서 검출할 수 있으며, 감소된 활성은 적어도 24시간 이후까지 유지됨을 입증한다. 통계적 분석은 1-방식 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 기호 *는 SHAM에 대해 P<0.05를 나타내고 기호 #는 펩타이드 D-Ala-p2TA에 대해 P<0.06을 나타낸다.
주요 기관들에서 PMN의 감소된 수준들에 대한 추가의 지지는 호중구 유입의 평가를 위해, 면역조직화학 염색 후, CLP 이후 동물들의 특수 조직들로부터 수득된 조직학적 슬라이드들 속에서 PMN을 직접 계수함으로써 예시되었다. CLP 후 24시간 째에 CLP 동물들로부터 수득된 포르말린-고정된 단면들을 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스테라제(백혈구-특이적인 에스테라제)로 염색하고, 길스 헤마톡실린(Gills hematoxylin) 용액으로 역-염색하고 커버슬립으로 덮었다. 간 단면들 속에 존재하는 다수의 호중구들(세포들을 양으로 염색한 에스테라제)를 x400에서 현미경적으로 무작위로 스크리닝(5 내지 7개 장들/시료)하였다.
예로서, 간 단면들에서 PMN의 감소된 수는 도 28에 나타낸다. 통계적 분석을 1-방식 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 기호 *는 SHAM에 대해 P<0.05를 나타내고 기호 #는 펩타이드 D-Ala-p2TA에 대해 P<0.06을 나타낸다.
펩타이드 D-Ala-p2TA는 CLP 후 CD28 발현 또는 림프구 증식에 있어서 효과를 가지지 않았다.
펩타이드 D-Ala-p2TA 치료가 면역 효과기 세포들에서 CD28의 발현에 영향을 미쳤는지를 측정하기 위하여, 말초 혈액 세포들 및 비장세포들을 수술 후 12 및 24 시간째에 시험하였다. 결과들은, CD3+ 혈액 T 림프구들 및 CD4 또는 CD8 세포들을 발현하는 비장 T 세포들에서 CD28 발현의 보통의 하향 조절을 나타내었다. 그러나, 시험한 모든 세포 집단들에서 CD28 발현에 대해 D-Ala-p2TA 치료된 그룹 및 비히클-치료된 그룹 사이에 유의적인 변화들은 관찰되지 않았으며(도 29a 내지 29d): 유동 세포분석법으로 측정한 것으로서 CD28의 표면 발현은 D-Ala-p2TA 펩타이드에 의한 치료의 존재 및 부재하에 CLP 후 12 및 24시간 째에 비장(도 29a) 및 혈액(도 29c) CD3+ T 림프구들에 있어서 수준들의 유의적인 감소를 나타내었다. 비장(도 29b) 및 혈액(도 29d) Gr1+ 골수 세포들은 CLP 후 증가된 발현을 나타내었지만, D-Ala-p2TA 펩타이드 치료에 의한 효과는 관찰되지 않았다.
세포 증식에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과를 시험하기 위하여, 생체외 실험들을 sham, 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료하거나 치료하지 않고, 항-CD3 단독 또는 항-CD3+항-CD28 항체들로 자극시키고 72시간 동안 배양한 sham, CLP 마우스들로부터 취한 분리된 비장세포들로 수행하였다. 비장세포 증식 지수는 sham 동물들로부터 취한 세포들과 비교하여 CLP 후 12 및 24 시간 둘다에서 감소하였다. CLP 후 24시간째에, 펩타이드 D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 치료하지 않은 그룹과 비교하여 증식 지수를 감소시켰지만 이들 차이들은 통계적으로 유의적이지 않았다.
5.8.
주요 기관들(신장 및 비장)에서 세포자멸사에 대한 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효과
신장, 간 및 비장과 같은 주요 기관들에서 증가된 세포자멸사 과정들은 기관 기능부전에 기여하는, 패혈증의 결과에 있어 측정하는 병리학적 역활을 한다. 따라서, CLP에 적용된 동물들에서 신장 및 비장 세포자멸사에 있어서 펩타이드 D-Ala-p2TA 치료의 잠재적인 효과를 연구하였다(n=6-8 동물들/그룹). 세포자멸사를 CLP 후 24시간 째에 동물들로부터 취한 조직학적 슬라이드들 속에서 TUNEL 염색을 사용하여 측정하였다. 슬라이드들은 세포자멸사의 증거를 위해 형광 현미경하에 실험하고, 결과들을 도 30에 나타낸다. 세포자멸사의 정도에 있어서의 감소는 기관들 둘 다에서 나타난다. CLP (200x) 후 24시간 째에 비장의 조직 단면들에서 TUNEL 염색의 대표적인 현미경 사진은 도 31a 내지 31c에 Sham(도 31a), CLP(도 31b) 및 D-Ala-p2TA로 처리된 CLP로 나타낸다. CLP 후, 실질적인 세포자멸사 과정은 비장에서 명백하나, 펩타이드 D-Ala-p2TA(CLP 후 2시간 째에)를 사용한 단일 치료는 당해 수준을 실질적으로 감소시킬 수 있었으므로, 감소된 기관 손상을 나타내며, 이는 또한 신장 및 비장 둘 다에 대한 낮은 수준의 PMN 보충과 일치한다.
D-Ala-p2TA-치료된 마우스들과 비히클-치료된 마우스들 사이에서 CLP 후 패혈증-유발된 세포자멸사의 정도를 비교하기 위해, 분리된 비장세포들을 또한 조직 세포자멸사 마커인, 안넥신 V로 염색하고, 세포 표면 마커(CD3, CD4, CD8, B220, Gr-1)와 합하고 유동 세포분석법으로 분석하였다.
도 32(a-f)에 나타낸 바와 같이, CLP 후 12 및 24 시간째에 sham들과 비교하는 경우 CLP 후 분리된 비장세포들의 세포자멸사의 빈도에 있어 약간의 증가가 존재하였으나, D-Ala-p2TA를 사용한 치료는 안넥신 V 염색에 의해 평가된 것으로서 CLP-유도된 세포자멸사의 정도를 변화시키지 않았다. 도 32a 내지 32f에 나타낸 영상들의 정량화를 진행하고 아이비젼 소프트웨어(iVision software)를 사용하여 분석하였다(및 도 30에 나타냄). 양성 염색은 한계점(thresholding)을 통해 정의되었으며, 수득되는 영상들을 분석하고, 데이타는 전체 면적에 걸쳐 염색된 면적 퍼센트(염색된 면적%)로서 표현하였다.
5.9.
CLP에 적용된 마우스들에서 펩타이드 D-Ala-p2TA 효과들의 요약
다균성 복부내 감염 모델을 사용하여, 단일 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA가 CLP 후 12 및 24 시간째로 늦게 제공된 경우 증진된 생존을 가져옴을 입증하였다. 이는, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 투여가 예를 들면, 다음과 같이, 유의적인 효과들과 관련됨을 또한 나타낸다:
· 혈액, 감염된 부위(복막) 및 주요 기관들(비장, 간, 신장)에서 감소된 세균 부하;
· 혈액 및 복막액 속에서 사이토킨/케모킨 수준들(TNF-α, Rantes, KC)에 있어서의 감소;
· 신장 및 비장 둘다에서 세포자멸사의 감소;
· 비장, 간 및 신장에서 호중구 PMN 활성의 감소;
·간내로 호중구 보충의 감소(PMN 수의 직접적인 측정).
또한, 펩타이드 D-Ala-p2TA는 패혈증의 치료를 위한 유효한 치료학적 시도일 수 있음이 제안된다.
실시예 6
세균 감염들의 모델들에서 펩타이드 D-Ala-p2TA 효능의 요약
6.1
각종 공급원들로부터 감염들에 대한 활성의 광역 스펙트럼
단일 투여량으로 제공된 펩타이드 D-Ala-p2TA의 효능을 그람-양성 감염들(에스. 피오게네스 및 에스. 뉴모니아에에 의함), 그람-음성 감염들(대장균) 및 혼합 감염들(CLP 후 복막내 다균성 감염)을 포함하는, 세균 감염들의 수개의 모델들에서 실험하였다. 이는 모든 감염들에서 독립된 치료(에스. 피오게네스에서)로서 또는 아-최적 투여량들의 항생제들과의 병용 치료로서 시험하였다. 이들 모든 경우들에서, 실질적이고 높은 치료 이점이 검출되었으며(도 33에 나타냄), 이는, 숙주면역 시스템을 약화시키기 위해 작용하는 면역조절인자로서, 펩타이드 D-Ala-p2TA가 특수 유형의 감염에 대해 특이적이지 않으며 다양한 공급원들로부터의 감염들에 대한 활성의 광역 스펙트럼을 가짐을 나타낸다.
6.2.
각종 모델들에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 유효 투여량들의 요약
투여량 반응 연구들을 세균 감염들의 다양한 모델들에서 수행하였으며, 여기서 펩타이드 D-Ala-p2TA는 단일 투여량으로 제공되었다. 흥미롭게도, 결과들은, 본원에 사용된 모델들 모두에서, 펩타이드 D-Ala-p2TA가 단일 치료요법으로 또는 항생제들과 함께 제공되는 것에 상관업이, 최대 효능을 제공한 최적 투여량들은 2.5 내지 5 mg/kg의 동일한 범위내에 있었음을 나타내었다. 동일한 투여량들은 또한, (i) 그람-음성 또는 그람-양성 또는 혼합 감염에 기인한 감염에 대한 치료로서 (ii) CLP 모델에서 항생제들의 아-치료학적 또는 완전한 치료학적 투여량으로 (iii) 에스. 피오게네스 모델에서과 같이, 항생제들이 전혀 없이 (iv) 항생제들 치료의 투여에 대해 상이한 시점들에서 (v) 지연된 치료로서, 에스. 피오게네스, 에스. 뉴모니아에, 대장균 및 CLP 모델의 경우에 감염 후 상이한 시점들에서 제공된 경우 효과적이었다. 모든 모델들에 따른 이러한 투여량들의 균일성은, 실제로, 펩타이드의 면역조절 효과가 세균 감염의 유형 및 부하와은 독립적으로 숙주 면역 반응을 표적화함을 제안한다. 이들 연구들은 하기 표 5에 요약한다.
| 모델 | 시험한 투여량들 범위 | 최적 투여량 |
| 대장균 | 0.05-5 mg/kg | 5 mg/kg |
| 다균성 | 1.25-10 mg/kg | 2.5-5 mg/kg |
| 에스. 피오게네스 | 1-10 mg/kg | 2.5-5 mg/kg |
| 에스. 뉴모니아에 | 2.5-10 mg/kg | 5 mg/kg |
6.3. 각종 모델들에서 투여 요법의 요약투여 요법(투여량의 수 및 이들 사이의 간격)을 본원에 사용된 각종 감염들 모델들에서 시험하였다. 모든 경우들에서, 단일 투여량(감염 후 상이한 시점들에서 투여됨)을 4 내지 24시간 범위의, 이들 사이의 다양한 간격들에서 제공된 수개의 투여량들(2, 3 및 4개 투여량들)과 비교하였다. 중요하게도, 시험한 모든 모델들에서, 1회 투여량(감염 시점 또는 감염 후 지연된 시점에서와 상관없이, 및 단독치료요법으로서 또는 항생제들과 함께 제공된 것에 상관없이)은 다중 투여량들보다 우수하였다. 그러나, 흥미롭게도, 모든 경우들에서, 다중 투여량들의 투여는 대조군의 치료되지 않은 동물들보다 여전히 우수한 효과를 가졌다. 이들 비교들의 요약은 하기 표들에 나타낸다. 이들 결과들은, 효능을 여전히 지지하는 시간 윈도우내에서 투여된 p2TA의 1회 투여량이 세균 감염으로부터 동물들을 보호하는데 충분하며 추가의 투여량들이 훨씬 덜 유리할 수 있음을 제안한다.
건강한 또는 병든 동물들에게 투여된 다중 투여량들이 어떠한 독성 신호들과 연관되지 않았으므로, 다중 투여량들을 사용한 치료 시 감소된 효능은 펩타이드 D-Ala-p2TA 투여의 독성 효과들에 기인하지 않았다(표 6에 나타냄).
| 모델 | 생존% (1회 투여량) | 생존 % (2회 투여량들) |
대조군 | 코멘트들 |
| 에스. 피오게네스 | 60 | 0 (지연된 사망) | 0 | 5 mg/kg, 감염 후 5 hr |
| 에스. 피오게네스 | 90 | 40 | 20 | 2.5 mg/kg, 감염 후 1 hr |
| 에스. 뉴모니아에 | 50 | 20 | 0 | 5 mg/kg, 감염 후 24 hr |
| CLP | 90 | 40 | 10 | 5 mg/kg, 감염 후 2 hr |
마우스들 및 돼지들에서 수행되었으며, 5 mg/kg의 펩타이드 D-Ala-p2TA의 14일 투여량들의 투여를 포함한 독성 연구들은 독성 효과들이 없음을 나타내었다.
실시예 7
동물들 및 사람 혈장에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 약동학
동물들 및 사람내로 펩타이드 D-Ala-p2TA의 전신계 투여 시, 혈장으로부터 이의 명백한 제거는 신속하다. 펩타이드 D-Ala-p2TA의 약동학들을 마우스들 및 돼지들 둘 다에서 5 mg/kg의 투여량을 사용하고, 사람에서 0.45 mg/kg의 동등한 투여량을 사용하여 마우스들, 돼지들 및 사람에서 연구하였다. 결과들은, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 약동학 매개변수들이 종들에 따라 일관되며 예측가능하고, 마우스, 돼지 ? 사람에서, 전신 정화(systemic clearance: CLs) 값들은, 관여된 정화 과정들이 고 용량 및 속도임을 입증함을 나타내었다(표 7).
| 종들 | 마우스들 | 돼지들 | 사람 |
| Cmax (ng/ml) | 21679 | 1750 | 700 |
| AUC (ng-min/mL) | 82839 | 6030 | 7154 |
| VOD (mL/kg) | 231 | 1380 | 191 |
| CL (mL/min/kg) | 60.4 | 829 | 69 |
| T 1/2 (min) | 2.65 | 1.3 min | 1.83 |
상기 나타낸 동물에 대한 데이타(표 7)는 마우스들 및 돼지들의 그룹들에게 펩타이드 D-Ala-p2TA(3회의 투여량 수준들에서)의 정맥내 투여 후 수득되었으며, 혈장은 투여량 전 및 투여량 후 수개의 시점들에서 수집하였다.상기 나타낸 사람들에 대한 데이타(표 7)는 "건강한 자원자들에서 펩타이드 길항제인, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 제1상, 이중 맹검, 위약-조절된, 투여량 확대, 안전성 및 약동학적 임상 시험"이라는 명칭으로 건강한 자원자들에서 수행된 임상 연구에서 설명되었다.
당해 시도에서, 25명의 건강한 자원자들에서 4개의 상이한 투여량 수준들의 펩타이드 D-Ala-p2TA를, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 투여하였다:
| 집단 # | 펩타이드 D-Ala-p2TA 투여량/위약에 대해 활성인 비 |
| 1 | 7.5 ㎍/kg 5:1 |
| 2 | 37.5 ㎍/kg 5:1 |
| 3 | 150 ㎍/kg 5:2 |
| 4 | 450 ㎍/kg 5:1 |
| 전체 단일 투여량 피검자들 | 20:5 |
| 전체 모든 피검자들 | 25 |
각각의 피검자에게 펩타이드 D-Ala-p2TA 또는 위약 대조군을 단일의 정맥내 주입으로 제공하였다. 혈액을 주입 후 상이한 시점들에서 PK를 위해 수집하였다. 모든 집단들에서 펩타이드 D-Ala-p2TA 혈장 농도들은 주입 말기 근처에서 최대이며 1분에 걸쳐 약간씩 T1/2로 신속하게 감소한다. T1/2은 투여량 수준들에 걸쳐 매우 유사하다. Cmax 및 AUC에 대해 측정된 것으로서 펩타이드 D-Ala-p2TA에 대한 전신계 노출은 투여량 비례적인 것으로 여겨진다. 결과적으로, AUC 및 투여량으로부터 기원한 혈장 청소율(CL)은 모든 투여량들에 대해 유사하다.연속적인 주입 및 1회-구간 제거의 PK 모델은 데이타를 설명하는데 가장 적절한 것으로 측정되었다. 당해 모델에 의해 검정된 사람들(건장한 자원자들)에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 PK 매개변수들은 마우스들에게 제공된 유효 투여량의 사람의 동등한 투여량인, 사람에게 제공된 최대 투여량(0.45 mg/kg)에 대해 표 7에 나타낸 바와 같다. 이들 데이타에 따라서, 혈장에서 펩타이드 D-Ala-p2TA의 반감기는 매우 짧으며, 이는 단일 투여량의 약물을 세균으로 감염된 동물들에게 투여하는 경우 관찰된 이의 생물학적 장기 지속 효과와 관련되지 않는다. 대조적으로, 동물들에게 약물들의 혈장 수준들을 증가시킬 수 있는 다중 투여량들의 펩타이드 D-Ala-p2TA를 투여한 경우에서도, 효능은 증진되지 않으며, 이는, 실제로 혈장 수준들은 약물 효과와 직접 관련되어 있지 않음을 나타낸다.
또한, 대략 200 mL/kg인 명백한 분포 용적은, 검정에서 측정된 혈장 구획 외부의 부위들로의 잠재적인 분포와 일치하는 혈장 용적보다 훨씬 더 크다. 따라서, 펩타이드 D-Ala-p2TA는 이를 안정화시킬 수 있는 다른 성분들에 대해 구분함으로써 혈장으로부터 제거할 수 있다.
실시예 8 펩타이드 D-Ala-p2TA의 조직 생체분포
동물들내로 정맥내 주사 시 펩타이드 D-Ala-p2TA의 운명을 탐색하기 위하여, 펩타이드를 이의 내부 아미노산들(발린) 중의 하나에 14C로 방사선표지하였다. 생성물, [발린-14C]-D-Ala-p2TA, 즉 H-D-Ala-Ser-Pro-Met-Leu-[U-14C]Val-Ala-Tyr-Asp-D-Ala-OH)을 HPLC에 의해 97.7%의 화학적 순도 및 98%의 방사화학 순도로 정제하고, 비 활성(specific activity)이 260 mCi/mmol이 되도록 하였으며 수컷 Balb/C 마우스들에서 생분포 연구들의 세트를 위해 사용하였다. 마우스들에게 체중 Kg당 5 mg의 염기-당량/1000 μCi의 단일 정맥내 투여량을 주사하였다.
36마리의 마우스들의 그룹에게 방사선표지된 펩타이드 D-Ala-p2TA를, 나타낸 투여량에서, 및 상이한 시점들(2, 4, 6, 8, 10, 20, 및 30분, 1, 2, 4, 8, 및 24 h)에서 주사하고, 3개 마우스들의 그룹들을 마취시켰다. 혈액 시료들(시점 당 3마리의 마우스들로부터 취한 1mL)를 K3EDTA를 함유하는 주사기 내로 CO2-유도된 마취하에 심장 천자로 취하였다. 전혈 시료 및 혈장 시료 둘다를 방사활성 측정을 위해 취하였다. 말기 혈액 시료를 위한 후, 다음의 조직들을 수집하였다: 간, 신장, 비장, 심장, 폐, 뇌, 소장, 대장, 위벽, 골격근, 고환들, 췌장, 골, 가슴샘, 갑상선, 부신들, 방광, 쓸개벽, 림프구들, 대동맥 및 대정맥. 각각의 조직을 칭량하고 분석 전에 -20℃에 보관하였다.
이후에 조직들을 다음과 같이 진행시켰다; 골(잘게 썰어 혼합함), 가슴샘(잘게 썰어 혼합함), 갑상선, 부신들, 방광, 쓸개벽, 비장, 신장, 심장, 폐, 고환들, 췌장, 림프절들, 대동맥 및 대정맥을 연소 보트들 위에 직접 두고 후드 속에 위치시켜 건조시킨 후, 하비 바이올로지컬 시료 산화기(Harvey Biological Sample Oxidizer)에 이어서, 액체 신틸레이션 카운터(LSC)를 사용하여 연소시켰다. 간, 뇌, 소장, 대장, 위벽 및 골격근과 같은 다른 조직들은 균질화하여 분취량들을 취하고 위에서와 같이 진행시켰다.
조기 시점들에서 분포 패턴은 다수 조직들, 특히 고도로 살포된 조직들 및 기관들내로의 [14C]-D-Ala-p2TA의 배치와 일치한다. 흥미롭게도, 도 34a 내지 34b에 나타낸 바와 같이, 조기 시점들에 걸친 실질적인 축적은 혈장으로부터의 정화(도 34b)와 비교하여, 림프절(도 34a) 및 가슴샘(나타내지 않음)과 같은 림프 기관들에서 명백하다. 축적은 감염 후 4분째에 시작하며, 20분째에 최대에 도달한다. 이후에, 방사활성 수준은 점진적으로 감소하여, 주사 후 심지어 수 시간까지도 혈장내에서 보다 더 높게 잔존한다.
림프 기관들(림프절들 및 비장)내에서 [14C]-D-Ala-p2TA의 축적은 조직 대 혈장 비로서 가장 잘 설명된다(도 35a 내지 35b에 나타냄). 주입 후 이미 4분째에, 림프절들 대 혈장 [14C]-D-Ala-p2TA의 비는 1보다 크며, 이는, 당해 기관에서 방사활성의 증강을 나타낸다. 20분째에, 림프절들에서의 수준들은 혈장에서보다 22배 더 높으며, 2시간 동안 5배 이상 더 높게 잔존하며, 흥미롭게도, 투여 후 24시간 동안에도, 당해 비는 3배 보다 더 크다(도 35a). 비장에서, 더 낮은 정도라고 해도, 유사한 축적 공정이 일어나며; 주사 후 20분째에, 혈장과 비교하여, 비장에서 방사활성의 비는 6배보다 더 크며 주사 후 24시간 째에, 당해 비는 3배보다 더 크다(도 35b).
다른 조직들 및 기관들과 비교하여 림프절들에서 상대적으로 높은 수준들은 도 36a 내지 36c에 나타내며, 주사 후 10분 및 20분째에 이미(각각 도 36b 및 36c), 다른 기관들에서의 수준은 2분들째에 발견된 수준(도 36a)로부터 서서히 감소하는 반면 림프절들에서의 수준이 생성됨을 입증한다.
잠재적으로, 림프 기관들로부터의 T 세포들이 재순환하면서, 결합된 약물은 림프 기관들로부터 전신 순환으로 재-분포될 수 있으므로, 이의 이용가능성은 이의 혈장 반감기를 능가한다. 약물이 전신으로 작용하므로, 이는 전신 순환으로 확산된 심각한 세균 감염들의 경우들에서 이의 효과를 발휘할 수 있다.
실시예 9
제II 상 임상 시험
펩타이드 D-Ala-p2TA의 안전성 및 약동학을 평가하고, 당해 펩타이드의 임상 효과를 입증하며 투여량 선택을 안내하기 위하여, 괴사 연 조직 감염(NSTI)으로 고생하는 사람 환자들에서 제II 상 연구를 다음과 같이 수행하였다.
환자들을 NSTI로 고생하는 이들의 진단을 기준으로 주로 선택하였다(예비-스크리닝된 343명의 환자들 중, 43명의 무작위처리된 환자들을 선택하여 이중의 40명의 환자들을 효능 분석에 포함시켰다). 상기 40명의 무작위처리된 환자들 중, 10명의 환자들에게 위약을 투여하고, 15명의 환자들은 0.25 mg/kg의 D-Ala-p2TA 펩타이드로 1회 치료하고 15명의 환자들은 0.5 mg/kg의 D-Ala-p2TA 펩타이드로 1회 치료하였다). 환자들에게 단일 투여량에서 임상 진단 6시간 내에 펩타이드를 투여하였다.
또한, 모든 환자들을 광범위한 항생제 치료, 괴사조직 제거 수술 및 환기되거나 환기되지 않은 집중 치료실(ICU)내에 제공된 지지된 보호를 포함하는, 보호 치료 기준으로 치료하였다. 괴사조직제거 공정은 수술실에서 다량의 괴사 조직을 제거하기 위해 수행된 외과적 개입이다. 드레싱 변화와 같은 과정들 외에, 가장자리들을 제거하기 위한 최소 과정들은 본 분석의 목적을 위한 괴사 조직 제거 과정으로서 고려되지 않았다. 환자들을 28일 동안 후속 진행하였다.
세균학적 분석
감염들의 세균학적 분석은, NSTI이 그람-음성(예를 들면, 프로테우스 종들, 대장균 등) 및 그람-양성(예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오게네스(그룹 A 또는 B), 스트렙 비리단스 등)을 포함하는 각종 세균 병원체들을 포함하였음을 나타내었다. 병원체들은 호기성 또는 혐기성이었으며, 감염들은 단일 병원체 또는 혼합 병원체들에 의하였다.
집중 치료실(ICU)에서의 체류
임상 연구의 결과들은 명확한 치료 이점을 나타낸다. 예를 들면, 도 37에 입증된 바와 같이, 집중 치료실(ICU)내에서의 체류 기간은 낮은(0.25 mg/kg) 또는 높은(0.5 mg/kg) D-Ala-p2TA 펩타이드 투여량을 사용한 치료시 대략 2배로 감소하였다. 일수들은 ICU에 참여시 출발하여 24시간 시계를 기준으로 계산하였다. 유사하게, 환기시킨 일 수 뿐만 아니라 병원 체류 기간도 2배 감소하였다.
요구된 괴사조직제거 수술들
흥미롭게도, 임상 연구의 시간 프레임(28일)내에 환자들의 보호 치료의 표준으로서 요구되었던 괴사조직제거 수술들(위에 정의된 바와 같음)의 수는 유의적으로 감소하였다. 도 38a 및 도 38b에 나타낸 바와 같이, 위약을 투여받은 환자들은 2.8회의 괴사조직제거 수술들을 필요로 하였지만 낮거나 높은 투여량의 펩타이드 D-Ala-p2TA를 투여받은 환자들은 단지 각각 2.3 또는 2.2회의 괴사조직제거 수술들 만을 필요로 하였다.
흥미롭게도, 펩타이드로 치료한 환자들의 보다 높은 비율이 위약과 비교하여 단지 1회의 괴사 조직 제거에 적용되었다(도 38b). 0.5mg/kg의 투여량을 투여받은 환자들에서, 33%가 치유를 위해 단지 1회의 괴사조직제거를 필요로 하였지만, 위약의 20%는 1회의 괴사조직 제거 수술들 겪지 않았다.
일관되게, 4회 이상의 괴사조직제거들을 필요로하는 환자들의 비율은 0.5mg/kg의 투여량을 제공받은 그룹(13%)과 비교하여 위약 그룹에서 30% 더 높았다. 이들 데이타는, 감염의 보다 우수한 국소 조절이 펩타이드를 사용한 치료에 기인하여 수득됨을 제안한다.
기관 기능장애의 시간에 따른 해결(SOFA)
상기 결과들 외에 및 도 39에 입증된 바와 같이, 기관 기능부전을 지닌 환자들의 비율은 위약으로 치료한 환자들과 비교하여 펩타이드로 치료한 환자들의 경우 더 낮았다(0.25 또는 0.5 mg/kg의 투여량). 14일째에, 위약 그룹에 속한 50%와 비교하여 0.5 mg/kg을 제공받은 경우 환자들 중의 6.7%가 기관 기능부전을 가졌다(기관 기능부전은 SOFA 점수≥3으로 정의되었다). SOFA 점수에서의 변화들은 1 내지 14일 사이에 평가하였으며, 여기서 용어 시간 경과에 따른 기관 회복 및 기능부전을 지닌 환자들의 비율 뿐만 아니라 기관 기능장애/기능부전이 회복되는 시간도 분석하였다.
전신 생마커들의 분석
시간 경과에 따른 전신 생마커들에 있어서의 변화들을 또한 위약을 투여한 환자들과 비교하여 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 환자들에서 분석하였다.
사이토킨 수준들을 위한 혈장을 약물 투여 전과 후에(72시간까지) 수집하고, 10개의 상이한 사이토킨들을 시험하였다(전-염증성, 소염성 및 사이토킨들). 사이토킨 수준을 기본선(약물 투여 직전) 및 4, 24, 48 및 72 시간까지의 변화로 분석하였다. 5개의 사이토킨들에 대한 당해 분석의 결과들을 하기 표 9에 나타낸다. 이들 결과들은, 0.5mg/kg 투여량으로 치료한 환자들의 사이토킨 수준들이 위약 그룹과 비교하여 감소하며, 이러한 감소는 치료 후 24시간 째에 조기 발생하는 반면, 위약 그룹에서의 감소는 전적으로 후에 발생한다(48-72h). 또한, 사이토킨 수준들에 있어서의 변화들은 IL-17, IFN-γ, IL1-β 또는 IL3와 같은 전-염증성 사이토킨들에서만 검출되었으며, 소염성 사이토킨, IL-10에서는 변화가 관찰되지 않았다. 이는 명시된 바와 같이 예측된 MOA와 일치한다[9].
치료에 대한 환자의 반응의 요약을 하기 표 10에 나타낸다.
| 전 염증성 | 치료 | 변화에 대한 시간(hr) | 감소 정도 | p 값 |
| IL-17 | 0.5 mg/kg | 24 | 80% | 0.009 |
| 위약 | 48 | |||
| IFN-γ | 0.5 mg/kg | 24 | 81% | 0.11 |
| 위약 | 72 | |||
| IL-1β | 0.5 mg/kg | 24 | 71% | 0.10 |
| 위약 | 없음 | |||
| IL-3 | 0.5 mg/kg | 24 | 64% | 0.25 |
| 위약 | 없음 | |||
| 소염성 | ||||
| IL-10 | 0.5 mg/kg | 24 | 효과 없음 | 0.55 |
| 위약 | 24 | |||
| 치료 | 0.5 mg/kg | 위약 |
| 1 내지 14일째에 SOFA 점수에 있어서의 변화% | 89 | 53 |
| 14일째에 기관 기능부전이 없은 환자들의 % | 40 | 25 |
| 14일째에 기관 기능부전이 있는 환자들 % | 10 | 50 |
| ICU에 있었던 일 수들 | 5.4 | 8.9 |
| 환기시킨 일 수 | 2.7 | 5.2 |
| 1회의 괴사조직제거을 한 환자 % | 33 | 20 |
| 4회 이상의 괴사조직제거를 한 환자의 % | 13 | 30 |
결론적으로, 위약과 비교하여 임상 반응을 나타낸 펩타이드 D-Ala-p2TA로 치료한 환자들의 보다 높은 비율과 함께, 질병과 관련된 임상적으로 의미있는 매개변수들에 영향을 미치면서, 펩타이드 D-Ala-p2TA는 다수의 말기 시점들에 걸쳐 일관된 치료 이익을 입증하였다. 0.5 mg/kg의 투여량의 우수성이 확인되었으며, 이는 전임상 모델들에서의 발견들과 일치하며, 이는, 동일한 동물 투여량(0.5 mg/kg)이 최적 투여량임을 제안한다. 또한, 상기 상세한 효과들은 약물 투여 직후 시작되며 단지 1회 투여된다고 해도, 시간에 걸쳐 지속되며, 상기 본원에 상세히 설명한 바와 같이, 펩타이드 D-Ala-p2TA의 제안된 작용 메카니즘과 일치한다.
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Xaa Ala Ser Met Asp Tyr Pro Val Leu Xaa
1 5 10
Claims (17)
- 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 치료가 요구되는 사람 피검자에서, 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 조성물이 치료 유효량의 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 SPMLVAYD(p2TA)로 이루어진 펩타이드 또는 D-Ala-p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드 또는 이의 염을 포함하고,
상기 치료가 치료학적 유효량의 상기 펩타이드를 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 발병 후에 상기 피검자에게 단일 투여함을 포함하며, 상기 펩타이드의 치료학적 유효량은 상기 피검자의 체중 1kg 당 0.1 mg 내지 1mg 펩타이드인 약제학적 조성물. - 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 D-Ala-p2TA로서 또한 나타낸, 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (D-A)SPMLVAYD(D-A)로 이루어진 펩타이드 또는 이의 염인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드의 치료학적 유효량이 상기 피검자의 체중 1kg 당 0.1 mg 내지 0.75 mg의 펩타이드인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드의 치료학적 유효량이 상기 피검자의 체중 1kg 당 0.25 mg 내지 0.5 mg의 펩타이드인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나는 그람-양성 세균들, 그람-음성 세균들, 세균 독소들 및 다른 독성 세균 성분들의 조합 중의 적어도 하나에 의해 유발되는 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 그람-음성 세균들이 프로테오박테리아, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라, 시겔라, 엔테로-박테리아세아에, 슈도모나스, 모락셀라, 헬리코박터, 브델로비브리오, 스테노트로포모나스, 아세트산 세균들, 레지오넬라, 알파-프로테오박테리아, 볼바키아, 그람-음성 콕시, 나이세리아 종들, 나이세리아 고노로에아에, 나이세리아, 메닌기티디스, 모락셀라 카타랄리스, 그람-음성 바실리, 헤모필루스 인플루엔자에, 클렙시엘라 뉴모니아에, 레지오넬라 뉴모필라, 슈도모나스 아에루기노사, 프로테우스 미라빌리스, 엔테로박터 클로아카에, 세라티아 마르케스켄스, 헬리코박터 파일로리, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피, 악시네토박터 바우만니이, 프란키셀라 툴라레미아, 비브리오, 불니피쿠스, 콜레라에, 플루비알리스, 파라헤몰리티쿠스, 알기놀리티쿠스, 포토박터 담셀라, 아에로모나스 하이드로필라, 클로스트리디움 페르프린겐스, 클로스트리디움 히스톨리티쿰, 포르피로모나스/프레보텔라 아종 프레보텔라 인테르메디아, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 아종, 박테로이데스 우니포르미스 및 NDM-1 세균 균주들로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기서 상기 그람-양성 세균들은 그룹 A 스트렙토코쿠스, 에스. 피오게네스, 에스. 뉴모니아, 그룹 B 스트렙, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 그룹 D 스트렙토코쿠스, 그룹 G 스트렙토코쿠스, 스트렙토코쿠스 비리단스, 스트렙토코쿠스 밀레리, 프로피오니박테리움 아종, 엔테로코쿠스 파에키움, 펩토스트렙토코쿠스 아종, 스트렙토코쿠스 미크로아에로필릭, 락토바실루스 아종, 스타필로코쿠스 에피데르미스 및 스타필로코쿠스 아우레우스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 독성 세균 성분들은 외독소들, 내독소들, 초항원 독소들, 병원체 관련된 분자 패턴들(PAMPs), 손상 관련된 분자 패턴 분자들(DAMPs), 지질다당류들, 펩티도글리칸들 또는 이의 독성 성분들, 선천적인 면역계의 세포들에 의해 인식되는 병원체들의 그룹들과 관련된 분자 및 톨-유사 수용체들(TLRs)에 의해 인식되는 병원체들의 그룹들과 관련된 분자들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나는 전신 또는 감염 부위에 있는 약제학적 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나는 괴사 연조직 감염(NSTI), 다균성 복부내 감염, 또는 화상들에 의해 나타내며 다중-기관 기능장애, 패혈증, 심각한 패혈증, 패혈성 관절염 또는 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있는 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 경구 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 수막내 또는 피하 주사, 직장내 투여, 비강내 투여, 안구 투여 및 국소 투여로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경로에 의한 투여를 위한 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 발병 후 투여는 발병 직후, 또는 상기 세균 감염 및 이와 관련된 급성 염증 중의 적어도 하나의 발병 후 30분 내지 72시간의 범위 내에, 또는 발병 후 30분 내지 7일의 범위 내에 있는 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 치료가 상기 피검자에게 치료학적 유효량의 (i) 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제 및 (ii) 보호 치료의 지원 표준을 투여함을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제가 항세균제들, 항바이러스제들, 항진균제들, 항생제들, 세균정지제들 및 살세균제들, 스테로이드들 및 항미생물 제제들로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 상기 보호 치료의 지원 표준이 환기, 수술, 상처 치유, 고압 산소, IVIG(정맥내 면역글로불린들), 코르티코-스테로이드들, 혈장분리교환술, 음성압 상처 치료요법(vac 드레싱들) 및 활성화된 단백질 C로 이루어진 그룹 중에서 선택된 약제학적 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 상기 추가의 치료학적 활성제가 치료학적 투여량으로 투여되는 약제학적 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 상기 펩타이드와, 상기 추가의 치료학적 유효 제제 및 보호 치료의 지원 표준 중의 적어도 하나가 동시에, 상이한 시점들에서, 상이한 투여 간격들로, 상이한 기간 동안, 또는 상이한 순서로 투여되는 약제학적 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 상기 펩타이드와 상기 추가의 치료학적 유효 제제의 투여들 사이의 상기 간격이 0 내지 72 시간인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생리학적으로 허용되는 첨가제들, 담체들, 희석제들 및 부형제들 중의 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물.
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