KR20200047893A - 염증성 위장 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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임순민
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Abstract

본 발명은 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 가자 추출물의 항염증 효과인 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6)의 생성 저해효과, ROS 및 NO 생성 저해효과, 염증 반응 및 면역 반응에 중요한 인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성 저해효과; 알러지 반응에 관여하는 β-Hexosaminidase의 활성 저해효과; 및 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델의 손상된 위 면적의 감소 및 개선 효과를 가지는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

염증성 위장 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of inflammatory gastrointestinal disease}
본 발명은 가자 추출물의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 및 이의 이용에 관한 것이다.
위는 음식물을 소화시키기 위해 강산인 위산을 분비하는데, 이때 점막 보호층이 위산에 의해 위점막이 손상되지 않도록 작용한다. 위를 보호하는 위점막 보호층은 여러 종류의 인자로부터 공격을 받아 손상 받기 쉽다. 대표적인 공격인자로 위산, 펩신, 알코올, 흡연, 아스피린 등의 비스테로이드성 소염제(NSAID), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 등의 세균, 스트레스에 의해 유도된 위점막의 미세순환장애와 저혈압 등이 있다. 이러한 요인으로 인해 위점막층이 손상되었을 때 미란, 발적, 출혈, 부종을 동반한 염증이 발생하게 된다. 염증은 크게 급성 염증(acute inflammation)과 만성염증(chronic inflammation)으로 나뉘며, 만성적으로 염증반응이 일어날 경우 염증전 사이토카인과 케모카인이 과도하게 방출되어 주변 조직까지 손상된다. 이러한 염증성 병변이 위 점막에 한정되어 발생할 때를 위염이라 하고, 손상이 심하여 위 점막을 뚫고 점막하 조직과 근육층까지 손상되었을 때 이를 위궤양이라 한다. 또한 위와 직적 연결되어 있는 십이지장도 비슷한 요인에 의해 염증과 십이지장궤양이 발생할 수 있으며, 위궤양과 십이지장궤양을 소화성궤양으로 통칭하고 있다.
위염은 대한민국 국민 9명 중 1명이 앓고 있는 가장 흔환 소화기계 질환으로 지난 5 년간 평균 4%씩 빠르게 성장하고 있다. 또한, 위염 또는 위궤양은 국내 다빈도 질환으로써 2011년을 기준으로 각각 국내 다빈도 질환 6위, 45위에 이를 정도로 흔하게 발생하는 질환이다. 이들 위염 및 위궤양에 소비되는 의료비는 10,100억원에 달라며, 이 중 항염증 및 항궤양 치료제 시장은 2011년을 기준으로 약 7,600억원으로 알려져 있다.
위염 및 위궤양 유발 원인은 크게 위산분비 과다 등 공격인자의 병적 과잉에 의한 것과 위산에 의한 공격으로부터 위점막 세포를 보호하는 방어인자의 약화로 나뉠 수 있다. 위궤양 치료제는 공격인자의 억제제와 방어인자의 증강제로 개발 및 사용되고 있다. 이때, 방어인자의 약화 요인으로는 위 점막의 구조나 형태의 결손, 점액 분비의 감소, 중탄산 이온 분비의 감소, 프로스타글란딘 생성의 저하 등을 들 수 있다.
공격인자로 유발된 위와 십이지장의 염증 및 궤양을 치료하기 위해서 위산분비 억제, 점액분비 촉진, 위점막 상피세포 재생 촉진, 헬리코박터 파이로리 균의 증식억제 및 항염증 약물의 투여가 필요하다. 가장 대표적인 위염 및 위궤양 치료제로는 제산제(antacid), 산분비 억제 목적의 히스타민 H2 수용체 길항제(H2-receptor antagonist; H2-RA)와 양성자 펌프 저해제(proton pump inhibitor; PPI) 및 위점막 보호제 등의 약물이며, 헬리코박터 파이로리를 제거할 목적으로 이들 약물과 항생제의 병용처방이 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 위산분비 억제제들은 약물투여 종료 후 높은 재발률이 문제로 대두되고 있다.
예를 들어, 양성자 펌프 억제제는 위궤양, 위식도 역유 질환에 일반적으로 사용되는 약물이지만, 위산 분비세포 증식, 분비선 낭종, 고가스트린혈증, 위저선 용종 등의 부작용을 일으킨다고 보고되고 있다. 또한 장기 복용 시 위축성 위염과 위암의 발병에도 영향을 줄 수 있으며, 5년간 양성자 펌츠 억제제를 복용한 환자 중 3분의 1 이상이 위축성 위염 소견을 보인다고 알려져 있다. 또한, 양성자 펌프 저해제로 알려진 오메프라졸(omeprazole)과 란소프라졸(lansoprazole) 등은 높은 재발률과 설사, 발열, 두통, 피로감 등의 부작용이 발생한다고 보고되고 있다. 다른 예로, 제산제의 경우, 제산제 복용을 통해 일시적으로 위 내의 pH를 상승시켜 펩신의 활성을 저하함으로서 근본적인 치료가 아닌 일시적인 효과를 나타낸다. 또한, 제산제를 사용할 시 무기질 투여에 의해 변비, 설사, 대사성 알칼로시스(alkalosis), 요로결성증 등과 같은 부작용이 보고되어 있으며, 최근에는 제산제에 의한 산반동(acid rebound) 현상 등이 문제시되고 있다. 또 다른 예로, 약물 중 가장 널리 사용되고 있는 히스타민 H2 수용체 길항제인 시메티딘(cimetidine)은 위점막 내의 히스타민 수용체를 차단하여 히스타민 분자를 위세포로 하여금 산의 분비 신호를 하지 못하도록 작용하나, 남성의 성욕 감퇴, 남성의 여성형 유방, 호중구 감소증 등의 부작용을 비롯하여 약물상호작용까지 나타내므로 사용을 기피하는 현상이 나타나고 있다.
또한, 위장 질환의 대부분은 재발하거나, 재현되는 현상이 빈번히 관찰되고 있으므로 치유된 후에도 장기간에 걸친 유지 요법이 필요하다. 따라서, 위장 질환에서 나타나는 증상들을 완화하고, 오랜 시간 복용시에도 부작용이 적으면서 위를 보호할 수 있는 약물 개발의 필요성이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 인체 부작용을 유발하지 않으면서 염증성 위장 질환 치료에 유용한 천연물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 가자 추출물이 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 가자 추출물의 다양한 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 일 목적은 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성믈 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약학 조성물 또는 건강기능식물을 위해 가자 추출물의 유효한 용량을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일 구체예로서, 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 가자 추출물은 가자의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있으며, 상기 조추출물은 정제수를 포함하는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물일 수 있고, 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매로부터 가용한 추출물일 수 있으며, 상기 비극성용매 가용 추출물을 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물일 수 있다.
바람직한 구체예에서는, 본 발명의 가자 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 이용할 수 있고, 특히 열수 추출물 또는 에탄올 추출물을 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 특히는 30~100%의 에탄올 추출물을 이용할 수 있다.
이때, 상기 가자 추출물은 20~120℃에서 1~15시간 동안 추출할 수 있으며, 예를 들어, 60~120℃에서 1~6시간 동안 추출할 수 있다.
한편, 상기 가자 추출물은 지유, 대황, 광곽향, 마화, 죽여, 파두, 애엽, 목향, 건강 등의 추출물을 추가로 혼합하여 혼합 추출물로 이용될 수 있다.
이때, 상기 혼합 추출물은 가자 추출물에 지유, 대황, 광곽향, 마화, 죽여, 파두, 애엽, 목향 및 건강 중 선택된 하나 이상의 천연물질의 추출물을 일정 비율로 혼합하여 생성된 혼합 추출물일 수 있다.
이때, 상기 혼합 추출물은 가자와 함께 지유, 대황, 광곽향, 마화, 죽여, 파두, 애엽, 목향 및 건강 중 선택된 하나 이상의 천연물질을 일정 비율로 혼합하고, 적합한 추출용매로 추출하여 생성된 혼합 추출물일 수 있다.
이때, 상기 일정 비율은 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 비율일 수 있다.
본 발명의 상기 가자 추출물은 염증반응에 영향을 미치는 인자인 NO, IL-6, TNF-α 또는 ICAM(intercellular adhesion molecules) 생성 중 어느 하나 이상을 억제하여 염증성 위장 질환을 예방 치료할 수 있다.
상기 염증성 위장 질환은 위염 또는 위궤양일 수 있다.
이때, 상기 위염은 급성 위염 및 만성 위염을 모두 포함할 수 있다.
이때, 상기 위궤양은 급성 위궤양 및 만성 위궤양을 모두 포함할 수 있다.
상기 염증성 위장 질환은 과도한 음주, NSAID 복용, 알러지 등에 의해 발병하는 급성 위염 또는 위궤양일 수 있다.
상기 염증성 위장 질환은 노화, 스트레스, 장기간 약물 복용, 헬리코박터 파이로리 감염, 자가면역기전, 잘못된 식습관 등에 의해 발병되는 만성 위염 또는 위궤양일 수 있다.
본 발명의 상기 가자 추출물은 β-Hexosaminidase의 활성을 저해하여 염증성 위장 질환을 예방 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 가자 추출물은 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델에서 손상된 위 면적을 감소시키는 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 구체예로서, 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 이의 이용을 제공한다.
상기 건강기능식품은 예를 들어, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료 등으로 제조될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예로서, 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방, 치료 또는 개선으 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품을 위해 상기 가자 추출물의 유효한 용량을 제공한다.
상기 가자 추출물의 우수한 효능을 가지는 유효량은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량% 일 수 있다. 바람직하게는 상기 가자 추출물은 50~400 mg/kg 일 수 있다.
이처럼, 본 발명은 가자 추출물의 항염증 기능, 보다 구체적으로 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6)의 생성 억제능, NO 생성 억제능, 염증 반응 및 면역 반응에 중요한 인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성 억제능; 알러지 반응에 관여하는 β-Hexosaminidase의 활성 저해능; 및 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델의 손상된 위 면적의 감소 또는 개선능을 이용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.
본 발명에 따른 가자 추출물은 우수한 항염증, β-Hexosaminidase의 활성 저해 및 위염 개선 효과를 가지고, 세포 독성이 거의 없으므로, 염증성 위장 질환, 특히 위염 및/또는 위궤양의 예방 및 치료를 위한 의약품, 가공식품, 기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 음료 또는 음료첨가제 등의 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 각각의 추출물에 의한 NO 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 각각의 추출물에 의한 세포 내 ROS 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 각각의 추출물에 의한 TNF-α 생성 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 각각의 추출물에 의한 IL-6 생성 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 각각의 추출물에 의한 부착인자(ICAM)의 발현 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 각각의 추출물에 의한 β-Hexosaminidase의 활성 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 가지 추출물에 의한 NSAIDS 유발 위염 모델의 손상된 위 조직의 면적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 8은 가지 추출물에 의한 HCl-EtOH 유발 위염 모델의 손상된 위 조직의 면적 감소를 보여주는 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 명세서에서는 분획물 또한 상기 추출물에 포함된다.
"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.
"가자 추출물"은 가자를 용매를 이용해 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 가자 추출물은 가자 나무의 전체 또는 일부분, 가자 열매의 전체 또는 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료를 용매를 이용하여 추출한 추출물일 수 있다.
"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해 시키는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미하며, 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
"건강기능식품"이란, 일반 식품에 본 발명의 일 구체예의 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '건강 기능식품'이라 정의한다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에서는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 게재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 가자 추출물의 용도에 관한 것으로, 가자 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.
[유효 물질]
가자(Terminalia chebula Retzius)는 가자나무의 성숙한 과실로, 가자나무는 인도, 미얀마, 말레이시아, 중국 사천성 등에 자생하는 열대성 큰키나무로 과즙에서는 미로발란(myrovalan)이란 노란 색소를 추출하기도 하며 가구용 목재로도 쓰인다. 가자의 여러 가지 이름은 가려늑(訶黎勒), 가리늑(訶梨勒), 수풍자(隨風子), 가리(訶梨), 가려(訶黎) 등으로 부른다.
가자는 약간의 특이한 냄새가 나며, 약성은 쓰고 조금 시며 떫고 따뜻하다. 기(氣)를 내리고 오래된 담과 기침을 삭히고 숨이 차는 것, 오래된 설사, 이질, 대학, 탈항에 효과가 있고, 소화를 돕고 입맛을 돋우며 뱃속의 태아를 편안하게 하는 작용도 한다. 또한, 약리작용으로는 수렴, 지사, 녹농균 등에 대한 균을 억제하는작용이 보고되었다.
본 발명의 일 태양으로, 상기 가자 추출물 또는 분획물을 이용한다.
상기 추출물 또는 분획물은 가자의 다양한 부위로부터 추출 또는 분획될 수 있다.
상기 가자 분획물은 가자 추출을 유기용매를 이용하여 비극성에서 극성으로 분회하는 과정을 통해 각 용매 분획물로서 얻을 수 있다. 분획하기 위한 적절한 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 가자 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 명세서에 의해 개시되는 방법으로 제조하여 사용될 수 있다.
예컨대, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열 추출법으로 추출할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 열수 추출 또는 환류냉각 추출을 통해 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회, 1회 내지 8회 또는 1회 내지 6회 반복 추출할 수 있다.
또한, 가자 추출물 또는 분획물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수도 있다. 또한, 상기 추출물 또는 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high preformance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획으로도 얻을 수 있다.
따라서 본 발명에 있어서, 가자 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
i) 가자에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
ii) 단계 i)의 추출물을 여과하는 단계; 및
iii) 단계 ii)의 여과한 추출물을 건조하는 단계.
i) 에서, 추출 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 추출용매는 예를 들어, 30~100%, 30~95%, 30~90%, 30~85%, 30~80%, 30~75%, 30~70%, 30~65%, 30~60%, 30~55%, 30~50%, 30~45% 또는 30~40% 농도로 사용할 수 있다. 바람직하게는 30~70% 농도로 사용할 수 있다.
추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 가자의 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출 온도는 20 내지 120℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 비제한적으로 1 내지 20시간, 바람직하게는 1 내지 15시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 6시간일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 iii)의 건조 방법으로는 감압건조, 진공건조, 비등 건조, 분무건조 또는 동결건조를 포함한다.
구체적인 일 예로서, 가자 추출물을 제조하는 경우, 가자 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 예를 들어, 30% ~ 100% 에탄올을 가하여, 약 20 내지 120℃, 바람직하게는 60 내지 100℃에서 1 내지 15시간, 바람직하게는 1 내지 6시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 환류추출법으로 추출한 후 여과하고 건조하여 본 발명의 가자 조추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 가자 추출물을 수득하였다.
선택적으로 본 발명의 추출물은 지유, 대황, 광곽향, 마화, 죽여, 파두, 애엽, 목향 및 건강으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 물질의 추출물을 추가로 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 가자 추출물을 제조하는 방법을 포함한다.
상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.
본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 가자 추출물 및 가자 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으며, 그에 대한 자세한 설명을 생략한다.
[염증성 위장 질환]
본 발명은 상기 제조한 가자 추출물의 염증성 위장 질환의 예방, 치료 및/또는 개선 기능에 관한 것이다.
본 발명에서 염증성 위장 질환은 위염 또는 위궤양일 수 있다.
이때, 상기 위염은 급성 위염 및 만성 위염을 모두 포함할 수 있다.
이때, 상기 위궤양은 급성 위궤양 및 만성 위궤양을 모두 포함할 수 있다.
상기 염증성 위장 질환은 과도한 음주, NSAID 복용, 알러지 등에 의해 발병하는 급성 위염 또는 위궤양일 수 있다.
상기 염증성 위장 질환은 노화, 스트레스, 장기간 약물 복용, 헬리코박터 파이로리 감염, 자가면역기전, 잘못된 식습관 등에 의해 발병되는 만성 위염 또는 위궤양일 수 있다.
본 발명의 일실시예들을 통해 가자 추출물의 항염증 효과, 보다 구체적으로 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6)의 생성 저해효과, ROS 및 NO 생성 저해효과, 염증 반응 및 면역 반응에 중요한 인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성 저해효과; 알러지 반응에 관여하는 β-Hexosaminidase의 활성 저해효과; 및 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델의 손상된 위 면적의 감소 및 개선 효과를 관찰함으로써, 다음과 같은 구체적인 기능을 확인하였다.
(i) 본 발명의 가자 추출물은 ROS(reactive oxygen species) 및 NO(nitric oxide) 생성 저해효과를 가진다.
ROS 및 NO의 생성을 세포에 손상을 유발하고 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 역할을 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 가자 추출물이 LPS에 의해 유도된 대식세포의 NO 생성이 저해시킴을 확인하였고, 또한 세포 내 ROS 생성의 저해효과도 확인하였다.
(ii) 본 발명의 가자 추출물은 염증성 사이토카인 및 부착인자(ICAM)의 생성 저해효과를 가진다.
TNF-α는 염증 반응 초기에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증 반응을 일으키고 악화시키는 인자이고, IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환의 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 한다. 또한, 부착인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 일부로, 염증 및 면역 반응에 중요한 역을 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 가자 추출물이 LPS에 의해 유도된 대식세포의 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 부착인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성을 저해시킴을 확인하였다.
(iii) 본 발명의 가자 추출물은 β-Hexosaminidase의 활성 저해효과를 가진다.
β-Hexosaminidase는 알러지 반응시 활성이 증가된다고 알려져 있는 물질로, 알러지성 위염 또는 위궤양의 경우, β-Hexosaminidase의 활성이 증가한다고 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 감작시킨 세포의 β-Hexosaminidase의 활성이 저해시킴을 확인하였다.
(iv) 본 발명의 가자 추출물은 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델에서의 위염 개선 효과를 가진다.
본 발명의 일 실시예에서, 염증성 위장 질환은 유발하는 요인 중 NSAIDS 및 알코올을 이용하여 AIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델을 만들고, 이 동물 모델을 이용하여 가자 추출물의 위염 개선 효과를 관찰하였다. 그 결과, 동물 모델의 손상된 위 조직의 면적이 감소하는 것을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명은 상기 가자 추출물의 염증성 위장 질환 예방, 치료 및/또는 개선 기능을 이용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.
[약학적 조성물]
일 구체예로서, 본 발명은 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 정의되는 염증성 위장 질환의 예방 및 치료 효과는 ROS(reactive oxygen species) 및 NO(nitric oxide)의 생성을 저해하며, 염증성 가이토카인 TNF-α, IL-6 및 부착인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성을 저해하며, β-Hexosaminidase의 활성을 감소시키고, 위염으로 인해 손상된 위 조직의 면적 감소, 즉 손상된 위 조직의 회복시키는 등의 작용을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 위장 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 위장 질환 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 가자 추출물을 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 및 치료를 위해 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 가자 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 가자 추출물은 50~400 mg/kg 농도로 사용한다.
본 발명의 가자 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 가자 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 스테로이드성 약물, 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
상기 가자 추출물을 함유하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 바람직하게는 경구형 제형으로 제제할 수 있다.
본 발명의 가자 추출물을 함유하는 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여법에 있어, 경구 투여 및 비경구 투여로 이용 가능하며 특정하게 투여법을 한정하지 않으나, 바람직하게 경구 투여제로 사용한다.
본 발명의 약학적 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 400mg/kg으로 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 가자 추출물의 유효한 투여용량에 따른 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델에서의 위염 개선 효과를 확인하였고, 그 결과 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델 모두 투여용량이 증가함에 따라 손상된 위조직의 면적이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 100-200mg/kg으로 투여한 경우 가장 좋은 위염 개선 효과를 보였다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 장질환 또는 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
[건강기능식품]
한편, 본 발명은 다른 구체예로서, 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 가자 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 가자 추출물의 위염 및/또는 위궤양 등의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다. 또한, 이를 이용한 기능성 강화식품 등을 제조할 수 있을 것이다.
즉, 본 발명의 가자 추출물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강기능성 식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 상기 가자 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌류, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 차, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 가자 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 가자 추출물은 생약 성분이기 때문에, 질병 치료, 개선 및 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용될 수 있다.
이처럼, 본 발명은 가자 추출물의 항염증 효과, 보다 구체적으로 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6)의 생성 저해효과, ROS 및 NO 생성 저해효과, 염증 반응 및 면역 반응에 중요한 인자인 ICAM(intercellular adhesion molecules)의 생성 저해효과; 알러지 반응에 관여하는 β-Hexosaminidase의 활성 저해효과; 및 NSAIDS 유발 위염 모델 및 HCl-EtOH 유발 위염 모델의 손상된 위 면적의 감소 및 개선 효과를 보이는 유효량을 이용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 재료 및 시료 추출
가자 10g에 시료 중량의 10배의 양인 100ml의 50% 에탄올 수용액을 가하여 80℃에서 2시간 환류추출하였으며, 수득한 추출액은 여과한 뒤 동결건조하여 분발상태로 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
실시예 1 : NO 생성 억제 효과 확인
96웰 플레이트에 배양된 대식세포 (American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 LPS (1 ㎍/mL)로 1시간 동안 전처리 한 후 추출물 100 ㎍/ml을 처리하여 24시간 배양한 세포배양액을 사용하였다. 먼저 새 plate에 시료를 처리하여 배양한 세포 배양액을 50 ㎕ 씩 넣고, Griess Reagent(Promega, USA)를 50 ㎕ 처리하여 10분간 상온에서 반응시킨 후 540nm로 흡광도를 측정하였다.
NO의 생성량을 측정한 결과, LPS만 처리한 군(negative control) 대비 모든 추출물 처리 군에서 유의하게 NO의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었으며(40-86%), 특히 가자 추출물의 경우 NO의 생성을 약 74% 억제 하였다(도 1).
실시예 2 : 세포 내 ROS 생성 억제 효과 확인
RBL-2H3 세포내 ROS를 측정하기 위하여 DCFH-DA(2', 7'-dichlorofluorescin-diacetate)를 이용하였다. DCF-DA는 세포내로 들어가면 intracellular esterase에 의하여 deacetylation되면서 DCFH로 전환되고 산소 라디칼에 의해 산화 되어 DCF라는 형광을 내는 물질로 전환된다.
Anti-DNP-IgE로 감작된 RBL-2H3 세포(5 × 105 cells/well)은 37℃에서 30분 동안 10μM DCFH-DA로 배양되었다. 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 DCFH-DA를 제거하고 추출물을 처리하여 30분동안 배양하고 DNP-HAS(10 ㎍/ml)에 10분동안 자극하였다. 얼음 위에서 반응을 정지시킨 후 485nm(excitation)과 535nm(emission)에서 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)를 이용 하여 ROS에 의해 산화된 DCF의 양을 측정하였다.
그 결과, negative control군 대비 모든 추출물 처리 군에서 ROS의 발생이 감소됨을 확인 할 수 있었으며 (34-69%), 특히 가자 추출물의 경우 ROS의 발생을 약 90%억제 하였다(도 2).
실시예 3 : TNF-α 생성 저해 효과 확인
TNF-α의 생성량을 ELISA 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
24웰 플레이트에 배양된 대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 LPS (1 ㎍/mL)로 1시간 동안 전처리 한 후 추출물 100 ㎍/ml을 처리하여 24시간 배양한 세포배양액을 사용하였다. 먼저 TNF-α capture antibody를 96well ELISA plate에 넣고 하룻밤 반응시켰다. plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1×PBS (PBS-T)로 3회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1× assay diluent 용액으로 실온에서 1시간 blocking하였다. Plate를 1× PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 배양액 또는 TNF-α 표준단백질을 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 detection antibody를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 avidin-HRP 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 이를 1× PBS-T용액으로 3회 세척한 다음 TMB 기질용액을 넣고 최종 30분간 실온에서 반응시키고, 반응정지액(1 M H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. Plate의 반응 정도를 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)에서 450nm 흡광도로 측정하였다.
TNF-α의 농도를 확인한 결과, LPS만 처리한 군 (negative control) 대비 모든 추출물 처리 군에서 유의하게 TNF-α의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었으며(47-84%), 특히 가자 추출물의 경우TNF-α의 생성을 약65% 억제 하였다(도 3).
실시예 4 : IL-6 생성 저해 효과 확인
IL-6의 생성량을 ELISA 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
24웰 플레이트에 배양된 대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 LPS (1 ㎍/mL)로 1시간 동안 전처리 한 후 추출물 100 ㎍/ml을 처리하여 24시간 배양한 세포배양액을 사용하였다. 먼저 IL-6 capture antibody를 96well ELISA plate에 넣고 하룻밤 반응시켰다. plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1×PBS (PBS-T)로 3회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1× assay diluent 용액으로 실온에서 1시간 blocking하였다. Plate를 1× PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 배양액 또는 IL-6 표준단백질을 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 detection antibody를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 avidin-HRP 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 이를 1× PBS-T용액으로 3회 세척한 다음 TMB 기질용액을 넣고 최종 30분간 실온에서 반응시키고, 반응정지액(1 M H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. Plate의 반응 정도를 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)에서 450nm 흡광도로 측정하였다.
IL-6의 농도를 확인한 결과, LPS만 처리한 군 (negative control) 대비 모든 추출물 처리 군에서 유의하게 IL-6의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었으며(42-90%), 특히 가자 추출물의 경우 IL-6의 생성을 약 60% 억제 하였다(도 4).
실시예 5 : 부착인자 (ICAM) 저해 효과 확인
ICAM의 생성량을 ELISA 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
24웰 플레이트에 배양된 대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 LPS (1 ㎍/mL)로 1시간 동안 전처리 한 후 추출물 100 ㎍/ml을 처리하여 24시간 배양한 세포배양액을 사용하였다. 먼저 ICAM capture antibody를 96well ELISA plate에 넣고 하룻밤 반응시켰다. plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1×PBS (PBS-T)로 3회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1× assay diluent 용액으로 실온에서 1시간 blocking하였다. Plate를 1× PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 배양액 또는 ICAM 표준단백질을 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 detection antibody를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1× PBS-T로 3회 세척하고 avidin-HRP 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 이를 1× PBS-T용액으로 3회 세척한 다음 TMB 기질용액을 넣고 최종 30분간 실온에서 반응시키고, 반응정지액(1 M H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. Plate의 반응 정도를 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)에서 450nm 흡광도로 측정하였다.
ICAM의 농도를 확인한 결과, LPS만 처리한 군 (negative control) 대비 모든 추출물 처리 군에서 유의하게 ICAM의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었으며(61-91%), 특히 가자 추출물의 경우 ICAM의 생성을 약 59% 억제 하였다(도 5).
실시예 6 : β-Hexosaminidase 활성 저해 효과 확인
RBL-2H3 세포(5 × 105 cells/well)를 500ng/ml의 IgE와 함께 CO2 incubator에서 12시간 배양 하여 세포를 감작시켰다. 감작시킨 세포를 siraganian buffer(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)로 2회 세척 한 후 450μl의 siraganian buffer (5.6mM glucose, 1mM CaCl2, 0.1% BSA)를 넣고 10분간 배양하였다. 각 생약 추출물 25μl를 넣어 30분간 반응 시키고 DNP-HAS (Sigma, USA)를 첨가한 후 다시 2시간 배양하여 세포를 활성화 시켰으며 ice bath에서 10분간 배양하여 반응을 정지 시켰다. 상등액 50 ㎕를 96wel plate에 옮기고, substrate buffer 50 ㎕를 넣어 3시간 반응시켰다. 반응 후, 각 well에 stop solution(0.1M Na2CO3 / NaHCO3) 200 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)에서 405nm 흡광도로 측정하였다.
그 결과, negative control군 대비 모든 추출물 처리 군에서 β-Hexosaminidase의 활성이 감소됨을 확인 할 수 있었으며 (60-92%), 특히 가자 추출물의 경우 β-Hexosaminidase의 활성을 약 70%억제 하였다(도 6).
실시예 7 : 가자 추출물의 NSAIDS 유발 위염 모델에서의 위염 개선 효과 확인
SD 랫드를 24시간 이상 절식 시킨 후 가자 추출물(50,100,200mg/kg)과 대조약물인 애엽추출물(30, 60mg/kg), 레바미피드(100mg/kg)를 각각 부형제에 녹여 경구 투여하고 1시간 후에 indomethacin 80mg/kg를 경구 투여하였다. 절수, 절식 하에 3시간 동안 방치한 후 치사시켜 위를 적출하고 대만부를 따라 절개하여 펼친 후 위 손상 양상 및 면적을 확인하기 위하여 사진촬영을 하여 imageJ 프로그램을 이용하여 위 손상면적을 측정하였다. 위 손상의 면적은 전체 위 면적 중 손상부위 면적의 비율(%)로 나타냈어다. 이때, 비율(%)은 '손상면적/전체면적×100 (%)'으로 계산하였다.
그 결과 대조약을 포함한 모든 약물 처리군에서 negative control 대비(25.42%) 손상 면적의 비율이 줄어드는 것으로 나타났으며(6.9-13.57%) 가자 50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg에서 대조약 대비 동등이상의 효과(각각 9.72%, 6.9%, 7.47%)가 나타나는 것을 확인하였다(도 7).
실시예 8 : 가자 추출물의 HCl-EtOH 유발 위염 모델에서의 위염 개선 효과 확인
SD 랫드를 24시간 이상 절식 시킨 후 가자 추출물(50,100,200mg/kg)과 대조약물인 애엽추출물(30, 60mg/kg), 레바미피드(100mg/kg)를 각각 부형제에 녹여 경구 투여하고 1시간 후에 HCl-EtOH(150mM HCl, 60% EtOH) 1.5ml을 경구 투여하였다. 절수, 절식 하에 3시간 동안 방치한 후 치사시켜 위를 적출하고 대만부를 따라 절개하여 펼친 후 위 손상 양상 및 면적을 확인하기 위하여 사진촬영을 하여 imageJ 프로그램을 이용하여 위 손상면적을 측정하였다. 위 손상의 면적은 전체 위 면적 중 손상부위 면적의 비율(%)로 나타냈어다. 이때, 비율(%)은 '손상면적/전체면적×100 (%)'으로 계산하였다.
그 결과 대조약을 포함한 모든 약물 처리군에서 negative control 대비(10.17%) 손상 면적의 비율이 줄어드는 것으로 나타났으며(2.00-5.07%) 가자 100mg/kg, 200mg/kg에서 대조약 대비 동등이상의 효과(각각 2.7%, 2.4%)가 나타나는 것을 확인하였다(도 8).
이러한 결과를 통해, 본 발명의 가자 추출물이 대부분의 투여용량에서 우수한 항염증 및 위염 개선 효과를 보였으므로, 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으로 사료된다.

Claims (12)

  1. 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가자 추출물은 가자의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가자 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 가자 추출물은 열수추출물 또는 에탄올추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경구용인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 가지 추출물을 50 ~ 400 mg/kg의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가자 추출물은 염증성 매개 인자인 IL-6, TNF-α 또는 ICAM 생성 중 어느 하나 이상을 억제하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 위장 질환은 위염 또는 위궤양인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 가자 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가지 추출물은 열수추출물 또는 에탄올추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 염증성 위장 질환은 위염 또는 위궤양인 것을 특징으로 하는 염증성 위장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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