KR20190060331A - 데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 염증성 장질환의 치료 및 개선에 이용되는 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 의한 조성물에 의할 경우, 뛰어난 항염효과 및 대장염 개선의 효과를 가짐으로 인해 특히 궤양성 대장염 및 크론병의 치료 및 개선에 이용될 수 있을 것이다.

Description

데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating inflammatory bowel disease(IBD)comprising dehydrocostus lactone as an active ingredient}
본 발명은 데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 대장 및 소장의 점막에서 만성적인 염증 또는 궤양이 야기되어, 장기적으로 설사, 혈변이 계속되고, 재발을 반복하는 난치병이다.
염증성 장질환은 서양인에서 보다 흔한 질환이나, 우리나라에도 1980년대부터 급증하고 있으며, 염증성 장질환의 호발연령은 15-35세이며 전 연령층에서 보고되고 있고, 그 중 15%는 60세 이상이며, 염증성 장질환 환자의 약 15%에서 직계가족에서 가족력을 갖고 있다.
염증성 장질환은 환경적 인자, 유전적 및 면역의 인자에 의해 유발될 수 있으며(Kitahora, T. (2012) Familial prevalence of inflammatory bowel disease, Nihon Rinsho, 70 Suppl 1, 44-47; Lowe, A. M., Roy, P. O., M, B. P., Michel, P., Bitton, A., St-Onge, L., & Brassard, P. (2009) Epidemiology of Crohn's disease in Quebec, Canada. Inflamm Bowel Dis, 15(3), 429-435), 염증성 장질환의 정확한 병인(etiology) 불명확한 것으로 남아있다(Toumi, R., Abdelouhab, K., Rafa, H., Soufli, I., Raissi-Kerboua, D., Djeraba, Z., & Touil-Boukoffa, C. (2013). Beneficial role of the probiotic mixture Ultrabiotique on maintaining the integrity of intestinal mucosal barrier in DSS-induced experimental colitis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 35(3), 403-409).
염증성 장질환의 발병 원인은 아직까지 불분명하지만, 환경적 또는 유전적 요인과 함께 자가면역질환 등이 원인으로 염증성 매개 인자와 면역세포의 활성화가 중요한 병인인 것으로 추정되고 있다.
염증성 장질환은 임상적으로 유사하면서 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohh's disease)의 두 가지 질환으로 분류되며, 이러한 염증성 장질환은 염증성 매개 인자와 면역세포의 활성화가 중요한 병인 것으로 알려져 있다.
장 면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 만성 점막염 염증의 병리생리에서 중요한 역할을 하며, 특히 호중구, 대식세포, 림프구 및 비만세포의 침윤에 의해 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다.
염증성 장질환의 발병 과정에서는 주요하게 수반되는 염증 반응에서, TNF-α(Tumor necrosis factor-α), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 인터루킨-8(IL-8)과 같은 염증반응 촉진 사이토카인(cytokines)이 주요한 역할을 하게 된다.
특히, TNF-α는 궤양성 대장염 환자의 대장 루멘과 대장 상피세포에서 높게 나타나며, 최근 연구에 의하면, TNF-α는 궤양성 대장염의 병인으로 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 항-TNF-α 항체인 인플릭시맵(infliximab)은 종기의 치료 뿐 아니라, 기존에 치료되지 않던 크론병의 치료에 효과적이라고 알려졌다. 그러나, 이러한 치료법은 비용이 많이 들고, 일부 환자에게서는 수액 반응 또는 전염성 합병증과 같은 부작용을 야기한다.
현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글라딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid, 5-ASA) 계통 약물 예를 들어, 설파살라진(sulfasalazine), 메살라진(mesalazine) 등을 이용하거나, 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있으며, 스테로이드 치료에 반응하지 않는 경우, azathioprine, 6-mercaptopurine, Cyclosporin 등의 면역 억제제도 사용되고 있으나 완치를 기대할 수 있는 약물은 없는 실정이다.
또한, 이러한 약물들의 장기간 투여 시 구역, 구토, 소화불량, 식욕부진, 두통뿐만 아니라 과민 반응에 의한 백혈구 감소증, 피부 발진, 발열, 췌장염, 간염, 용혈성 빈혈, 골수 억제 등의 부작용이 초래될 수 있다.
따라서, 이러한 약물들의 부작용을 해소하면서 염증 현상을 개선할 수 있는 치료제가 필요한 실정이다. 이에 본 발명자는 데히드로코스투스락톤의 염증성 장질환 치료 효과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
1. 김소연, 박재우, 류봉하 (2013) 唐木香이 DSS(Dextran sulfate sodium)로 유발된 염증성 장질환 동물모델에 미치는 영향. Korean J. Orient. Int. Med. 34(2), 134-146 2. Kitahora, T. (2012) Familial prevalence of inflammatory bowel disease, Nihon Rinsho, 70, 44-47 3. Lowe, A. M., Roy, P. O., M, B. P., Michel, P., Bitton, A., St-Onge, L., & Brassard, P. (2009) Epidemiology of Crohn's disease in Quebec, Canada. Inflamm Bowel Dis, 15(3), 429-435 4. Toumi, R., Abdelouhab, K., Rafa, H., Soufli, I., Raissi-Kerboua, D., Djeraba, Z., & Touil-Boukoffa, C. (2013) Beneficial role of the probiotic mixture Ultrabiotique on maintaining the integrity of intestinal mucosal barrier in DSS-induced experimental colitis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 35(3), 403-409 5. Moreau J. (2014) Crohn's disease and ulcerative colitis. Rev Infirm. 199, 16-18 6. Shi D, Das J, Das G. (2006) Inflammatory bowel disease requires the interplay between innate and adaptive immune signals. Cell Res. 16(1), 70-74 7. Mashhadi NS, Ghiasvand R, Askari G, Hariri M, Darvishi L, Mofid MR. (2013) Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of ginger in health and physical activity: review of current evidence. Int J Prev Med. 4, 36-42 8. Shen CL, Hong KJ, Kim SW. (2005) Comparative effects of ginger root (Zingiber officinale Rosc.) on the production of inflammatory mediators in normal and osteoarthrotic sow chondrocytes. J Med Food. 8(2), 149-153 9. Thomson M, Al-Qattan KK, Al-Sawan SM, Alnaqeeb MA, Khan I, Ali M. (2002) The use of ginger (Zingiber officinale Rosc.) as a potential anti-inflammatory and antithrombotic agent. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 67(6), 475-478 10. Kim HR, Kim JM, Kim MS, Hwang JK, Park YJ, Yang SH, Kim HJ, Ryu DG, Lee DS, Oh H, Kim YC, Rhee YJ, Moon BS, Yun JM, Kwon KB, Lee YR. (2014) Saussurea lappa extract suppresses TPA-induced cell invasion via inhibition of NF-κB-dependent MMP-9 expression in MCF-7 breast cancer cells. BMC Complement Altern Med. 14, 170-178 11. Choi HG, Lee DS, Li B, Choi YH, Lee SH, Kim YC (2012) Santamarin, a sesquiterpene lactone isolated from Saussurea lappa, represses LPS-induced inflammatory responses via expression of heme oxygenase-1 in murine macrophage cells. Int Immunopharmacol. 13(3), 271-279 12. Zhao F, Xu H, He EQ, Jiang YT, Liu K. (2008) Inhibitory effects of sesquiterpenes from Saussurea lappa on the overproduction of nitric oxide and TNF-alpha release in LPS-activated macrophages. J Asian Nat Prod Res. 10(11-12), 1045-1053 13. Gokhale AB, Damre AS, Kulkami KR, Saraf MN. (2002) Preliminary evaluation of anti-inflammatory and anti-arthritic activity of S. lappa, A. speciosa and A. aspera. Phytomedicine. 9(5), 433-437
염증성 장질환 치료를 위해 기존의 항염증제로 5-ASA(5-aminosalicylic acid)이 사용되고 있다. 그러나 5-ASA 자체로는 경구투여 시에 장에서 흡수가 잘되지 않는 문제 및 장기 투여시 부작용이 나타나는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 문제점을 해결하기 위해 독성작용이 없으면서도 경구투여만으로도 대장에서 항염효과를 발휘할 수 있는 염증성장질환치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은 데히드로코스투스락톤을 포함하는 염증성장질환 치료, 예방 및/또는 개선용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 천연식물에서 데히드로코스투스락톤 또는 엘라그산을 추출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적으로는 상기 염증성장질환 치료, 예방 및/또는 개선용 조성물을 포함하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
데히드로코스투스락톤(dehydrocostus lactone), 그의 염 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증질환의 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 염증질환의 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 엘라그산(ellagic acid) 또는 엘라지탄닌 그 자체, 그의 염 또는 그의 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 염증질환의 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 6-진저놀(6-gingerol)그 자체, 그의 염 또는 그의 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 염증질환은 염증성 장질환을 포함할 수 있다.
본 발명은 데히드로코스투스락톤(dehydrocostus lactone), 그의 염 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 엘라그산 또는 6-진저놀중 어느 하나 이상을 추가로 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
특히, 본 발명의 조성물은 크론병, 궤양성 대장염에 그 효과가 뛰어나다.
상기 조성물은 항염증 효과, 특히 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방의 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 장 상피세포의 단핵구 부착능을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 대식세포의 일산화질소(NO) 생성양을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 염증관련 단백질의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 염증성 사이토카인의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ, IL-6 및 IL-10 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물은 면역반응을 매개하는 인자의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 면역반응 매개 인자는 TLR-4, iNOS 및 COX-2 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 염증성 장질환 동물모델에서 대장의 길이의 축소를 억제하여 정상길이를 유지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 체중감소, 설사, 변비, 부종 및 혈변 중 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있다. 일 구체예로, 상기 조성물은 MPO 활성을 억제 시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은
데히드로코스투스 락톤을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 및 엘라그산을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 및 6-진저놀을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 6 내지 16: 10 내지 26: 0.5 내지 2의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 6.6 : 10: 1 의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 9.9 : 18.5 : 1.3 의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 15.4 : 25.1 : 1.9 의 비율을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 천연식물로부터 본 발명의 조성물의 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 천연식물은 목향, 아티초크 (Artichoke), 월계수, 함박꽃나무(Magnolia sieboldii), 조개우산이끼(Targioniaceae), 가자, 구아바, 바나바, 석류, 라스베리, 딸기, 포도, 복분자, 블랙베리, 호두 및 건강 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 목향, 가자, 건강일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 목향으로부터 데히드로코스투스 락톤을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 가자로부터 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 건강으로부터 6-진저놀 또는 진저놀을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(1) 천연식물의 전처리 및 용매에 의해 추출하는 단계
(2) 상기 단계의 추출물을 농축하는 단계
(3) 상기 농축물로부터 크로마토그래피를 이용하여 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리하는 단계
를 포함하는 천연식물로부터 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 추가적으로 열처리 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(1) 천연식물의 전처리 및 용매에 의해 추출하는 단계
(2) 상기 단계의 추출물을 농축하는 단계
(3) 상기 농축물로부터 크로마토그래피를 이용하여 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리하는 단계
(4) 상기 분리된 유효물질을 열처리 공정을 거치는 단계
를 포함하는 천연식물로부터 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
일 구체예로, 상기 열처리 공정은 상기 제조한 추출물의 질량 대비 1배 내지 20배의 증류수에 현탁시켜, 60~100℃ 온도에서 1시간 내지 32시간 동안 열을 가함으로써 시행될 수 있다. 상기 추출물은 분말 또는 액상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 열 가열 시간은 10시간 내지 30시간 일 수 있다.
바람직한 구체예로, 상기 열처리 공정은 상기 제조한 분말 형태의 추출물 질량 대비 5배~10배의 증류수에 현탁시켜, 70~90℃ 온도에서 18시간 내지 30시간 동안 열을 가함으로써 시행될 수 있다.
상기 열처리 공정을 통해 유효성분의 추출양을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 열처리 공정을 통해 엘라그산의 추출양을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 약학적 조성물은 추가적인 항염증제, 부신피질호르몬제, 면역억제제, 항생제, 내강변환제, 항산화제 및 국소마취제 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 염증성 장질환의 개선 및 예방을 위한 식품용 조성물을 제공할 수 있다. 이때, 식품은 건강기능 식품을 포함하는 개념이다.
본 발명은 데히드로코스투스락톤을 포함하는 조성물; 또는 이에 추가적으로 엘라지산 또는 6-진저놀 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물로 장 상피세포에서 단핵구 부착능 억제효과, 염증관련 단백질의 발현억제효과를 가져올 수 있다.
또한, 염증성 대장염에 의한 대장 길이 회복 및 체중감소, 설사, 혈변의 상태 개선 중 어느 하나 이상에 효과를 보이므로 특히, 궤양성 대장염 및 크론병에 효과가 뛰어나다.
따라서 본 발명은 상기 효과를 보이는 조성물의 유효량을 이용하는 다양한 용도를 포함할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 데히드로코스투스락톤을 유효성분으로 포함하는 조성물은 우수한 항염증 및 대장염의 개선효과를 가짐으로써, 염증성 장질환 특히, 궤양성 대장염 및 크론병에 뛰어난 효과를 가진다. 상기 조성물은 천연식물로부터 분리한 생리활성물질을 유효물질로 하여 독성이 없고 장기간 투여에도 부작용을 줄일 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명을 이용한 약학적 조성물 또는 식품용 조성물을 이용하여 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방에 뛰어난 효과를 얻을 수 있을 것이다.
도 1은 대식세포에서의 데히드로코스투스락톤의 세포독성 측정 결과이다.
도 2는 장 상피세포에서의 데히드로코스투스락톤의 단핵구 부착능 억제효능에 관한 결과이다.
도 3은 데히드로코스투스락톤의 일산화질소 생성량 측정 결과이다.
도 4는 데히드로코스투스락톤의 TNF-α의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 5는 데히드로코스투스락톤의 INF-α의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 6은 데히드로코스투스락톤의 TLR-4의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 7은 데히드로코스투스락톤의 iNOS의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 8은 데히드로코스투스락톤의 COX-2의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 9는 데히드로코스투스락톤의 IL-6의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 10은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 대장 길이 축소 억제효과에 관한 결과이다.
도 11은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 체중감소, 설사, 혈변의 질병활성도(DAI)를 나타낸 결과이다.
도 12는 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 길이당 장의 무게를 나타낸 결과이다.
도 13은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 MPO 활성 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 14는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 대장 길이 축소 억제효과에 관한 결과이다.
도 15는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 체중감소, 변비, 부종, 소장상태, 혈변의 질병활성도(DAI)를 나타낸 결과이다.
도 16은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 길이당 장의 무게를 나타낸 결과이다.
도 17은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 MPO 활성 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 18은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 체중감소, 설사, 혈변의 질병활성도(DAI)를 나타낸 결과이다.
도 19는 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 MPO 활성 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 20은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 길이당 장의 무게를 나타낸 결과이다.
도 21은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 IL-6의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 22는 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 TNF-α의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 23은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 체중감소, 설사, 혈변의 질병활성도(DAI)를 나타낸 결과이다.
도 24는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 MPO 활성 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 25는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 길이당 장의 무게를 나타낸 결과이다.
도 26은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 IL-6의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 27은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 TNF-α의 발현 저해효과에 관한 결과이다.
도 28은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 질병활성도(DAI)를 대조약과 비교한 결과이다.
도 29는 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 길이당 장의 무게를 대조약과 비교한 결과이다.
도 30은 DSS(Dextran sodium sulfate) 유발 궤양성 대장염 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 장의 길이를 대조약과 비교한 결과이다.
도 31은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 질병활성도(DAI)를 대조약과 비교한 결과이다.
도 32는 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 길이당 장의 무게를 대조약과 비교한 결과이다.
도 33은 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 유발 크론병 동물 모델에서의 조성물(데히드로코스투스락톤;엘라그산;6-진저놀을 유효물질로 포함)처리시 장의 길이를 대조약과 비교한 결과이다.
도 34는 본 발명의 유효물질 추출방법 중 열공정 단계의 시간당 유효물질(엘라그산) 함량을 나타낸 결과이다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해 시키는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미하며, 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
"예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 또는 식품조성물의 섭취에 의해 염증성 장질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
"건강기능식품"이란, 일반 식품에 본 발명의 일 구체예의 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '건강 기능식품'이라 정의한다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.
또한 본 명세서에서는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 게재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
염증성장질환
본 발명은 데히드로코스투스 락톤을 유효성분으로 포함하는 조성물의 염증성 질환의 예방, 치료 및 /또는 개선 기능에 관한 것이다.
상기 조성물은 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 추가로 포함하는 염증성 질환의 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이다.
또한, 상기 조성물은 6-진저놀을 추가로 포함하는 염증성 질환의 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이다.
본 발명에서 염증성 질환은 외부의 물리화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 다른 원인에 의한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태이다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포의 활성화에 의할 수 있으며, 이와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증성 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타날 수 있다.
상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 가질 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다.
또한, 본 발명에서 상기 염증성 질환은 염증성 장질환을 포함할 수 있다.
'염증성 장질환 (Inflammatory bowl disease: IBD)'은 소화관을 침범하는 원인미상의 만성적인 염증성 질환으로, 장기적으로 설사, 혈변이 계속되며, 재발을 반복하는 난치병이다.
본 발명에서 사용되는 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염을 포함하도록 해석할 수 있다.
염증성 장질환은 통상적으로 궤양성 대장염과 크론병으로 대별되지만, 우리나라에 비교적 흔한 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease)감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염도 이에 속한다고 할 수 있다.
'크론병 (CD)' 및 '궤양성 대장염 (UC)'은 병인이 공지되지 않은 만성 염증성 장 질환이다.
크론병은 궤양성 대장염과는 달리, 장의 어떠한 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 크론병의 가장 두드러진 양상은 장벽에 과립형의 적색을 띤 자주색 부종이 비대해지는 것이다. 염증이 발생함에 따라, 이들 육아종은 종종 자신의 국한성 경계를 상실하고 주위 조직과 통합된다. 설사 및 장 폐쇄가 주요 임상 양상이다. 궤양성 대장염과 같이, 크론병의 과정은 지속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있지만, 궤양성 대장염과는 달리, 크론병은 병의 원인이 되는 장 절편을 절제함으로써 치유될 수 없다. 크론병이 발생한 대부분의 환자는 몇몇 시점에서는 수술이 필요하지만, 후속 재발이 흔하기 때문에 지속적인 의료 치료가 통상적이다.
'궤양성 대장염 (UC)'은 대장에 침범한다. 질환 과정은 연속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있다. 가장 초기 병변은 리베르쿤 음와의 기저부에 농양이 형성되는 염증 침윤이다. 이들 팽창되고 파열된 음와의 유착은 위에 가로놓인 점막을 그의 혈액 공급으로부터 분리시켜 궤양화를 유발하는 경향이 있다. 이러한 질환의 증상은 경련, 하복부통, 직장 출혈, 및 희박한 대변 입자와 함께 혈액, 고름 및 점액으로 주로 이루어진 빈번하고 무른 배설물을 포함한다. 급성, 중증 또 만성, 끊임없는 궤양성 대장염에는 전체 결장절제술이 요구될 수 있다. UC의 임상 양상은 고도로 가변적이고, 그 발병은 잠행성이거나 돌연성일 수 있고, 설사, 이급후중 및 재발성 직장 출혈을 포함할 수 있다. 전체 결장의 전격성 병발에 따라, 생명을 위협하는 응급 상황인 독성 거대결장증이 생겨날 수 있다. 장외 징후는 관절염, 괴저 농피증, 포도막염 및 결절성 홍반을 포함한다.
'베체트 장염'은 베체트병이 있으면서 소장이나 대장에 궤양이 확인되면 진단 가능한 것으로, 베체트병은 전신 재발성 만성 면역질환으로 피부, 점막, 눈, 장, 관절, 비뇨생식기 및 신경계 등을 침범하여 염증과 궤양이 나타나는 질환이다.
베체트 장염의 경우 주로 소장끝과 대장이 연결되는 부위에 가장 흔히 발생하며, 장궤양이 나타날 수 있다. 또한, 일반적인 증상으로 복통, 설사, 구토, 배변습관의 변화, 체중감소 등이 나타날 수 있고 누공, 장 천공, 대량출혈과 같은 심한 합병증이 발생할 가능성이 있다.
'허혈성 장염'은 주로 고령층에서 조직혈류의 감소로 인해 발생하며 원인은 명확치 않으나 혈압저하, 동맥경화, 혈관염, 미소혈관 경련과 같은 혈관인자와 만성변비나 관장 등에 의한 장관내압 증가 및 장유동 등의 장관측 인자가 장관벽의 혈류 저하를 일으켜 허혈상태를 유발하는 것으로 알려져 있다.
호발부위는 직장-구불결장 접합부나 비만곡부이며 직장은 침범하지 않는 것이 전형적이다. 급성기의 경우 발적이 산재하며 점막혈관의 심한 수축으로 창백한 부위가 나타나고 점막하 출혈 및 부종이 생긴다. 아급성기의 경우 궤양이 발견된다.
'감염성 장염'은 살모넬라, 이질균, 아메바(Entamoeba histolytica), 거대세포바이러스, 클로스트리듐(Clostridium difficile) 등에 의해 감염될 수 있으며, 점막부종과 발적, 출혈성 반점, 출혈, 미란, 아프타궤양 등의 소견을 보인다.
'방사선성 대장염'은 골반 내 장기의 방사선 치료로 유발되며 직장 및 구불결장이 호발부위이다. 설사, 출혈 및 뒤무직 증상을 보이며, 홍반, 부종, 궤양 등이 보일 수 있다.
본 발명의 염증성 장질환 치료용 조성물은 궤양성 대장염, 크론병, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 질환에 대하여 치료, 개선 및/또는 예방의 효과가 있다.
상기 조성물은 특히, 궤양성 대장염 및 크론병에 대하여 치료, 개선 및/또는 예방의 효과가 뛰어나다.
유효물질
본 발명은 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 조성물의 염증성 질환의 예방, 치료 및 /또는 개선 기능에 관한 것이다.
본 발명은 특히 상기 조성물의 염증성 장질환 예방, 치료 및/또는 개선 기능에 관한 것이다.
데히드로코스투스 락톤( dehydrocostus lactone )
본 발명의 염증성장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물의 데히드로코스투스 락톤(dehydrocostus lactone)은, 데히드로코스투스 락톤(dehydrocostus lactone) 그 자체, 그의 염 및/또는 그의 유도체를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 '염'이란, 산의 음이온과 염기의 양이온이 정전기적 인력으로 결합하고 있는 이온성물질의 화합물을 의미하며, 본 발명의 염이란 금속염(나트륨염, 칼슘염 등), 아민염(메틸글루타민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등), 콜린 또는 비스의 염, 아미노산의 염(아르기닌염, 리신염, 오르니틴염 등), 금속착물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다.
상기에서 '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
산부가 염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고 이 염을 수혼화성 유기 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴)를 사용하여 침전시켜 제조한다.
이때, 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 '유도체'란 어떤 화합물을 모체로 하여 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등 모체의 구조와 성질을 대폭 변하지 않는 한도에서 변한 화합물을 의미하며, 본 발명의 유도체란 포화 또는 불포화아실기를 포함하는 모노아실화, 폴리아실화 유도체 (아실기: 아세트산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 스테아르산, 브라시드산, 에루크산, 베헨산, 에이코사펜타엔산 등), 모노에테르 또는 폴리에테르 유도체(알콕시유도체)등 을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
상기 데히드로코스투스 락톤의 유사체는 하기의 화학식 1로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3 는 서로 독립적이며, 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C1-C6 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다. 바람직하게는 CH2 또는 CH3 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 데히드로코스투스 락톤은 퓨라논의 구조를 갖는 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)로, 화학식 2와 같다.
[화학식 2]
Figure pat00002
본 발명의 일 구체예로 데히드로코스투스 락톤의 IUPAC 명칭은 데카하이드로-3,6,9-트리(메틸렌)아줄레노[4,5-b]퓨란-2(3H)-온(Decahydro-3,6,9-tris(methylene)azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one)일 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 화합물은 실온에서의 성상은 백색 결정성 분말이며, 목향(Aucklandia lappa Decne), 아티초크 (Artichoke), 월계수, 함박꽃나무(Magnolia sieboldii), 조개우산이끼(Targioniaceae) 등 으로부터 분리하거나, 화학적으로 합성 또는 시판의 일반시약을 입수하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 추가로 포함하는 것으로 염증성 질환 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이다.
또한, 상기 조성물은 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 추가로 포함하는 것으로 염증성 장질환 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이다.
엘라그산
본 발명의 염증성장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물의 엘라그산(ellagic acid)은 엘라그산 그 자체, 그의 염 및/또는 그의 유도체를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 '염'이란, 산의 음이온과 염기의 양이온이 정전기적 인력으로 결합하고 있는 이온성물질의 화합물을 의미하며, 본 발명의 염이란 금속염(나트륨염, 칼슘염 등), 아민염(메틸글루타민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등), 콜린 또는 비스의 염, 아미노산의 염(아르기닌염, 리신염, 오르니틴염 등), 금속착물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 '유도체'란 어떤 화합물을 모체로 하여 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등 모체의 구조와 성질을 대폭 변하지 않는 한도에서 변한 화합물을 의미하며, 본 발명의 유도체란 포화 또는 불포화아실기를 포함하는 모노아실화, 폴리아실화 유도체 (아실기: 아세트산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 스테아르산, 브라시드산, 에루크산, 베헨산, 에이코사펜타엔산 등), 모노에테르 또는 폴리에테르 유도체(알콕시유도체), 엘라그산의 하나 이상의 히드록실기와 당 또는 당 사슬의 축합유도체 등을 포함하여 이에 한정되지 않는다.
상기 엘라그산 유도체는 다음의 화학식 3와 같다.
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 화학식 3에서, R1, R2, R3 및 R4는 서로 독립적이며, 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C1-C6 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다. 바람직하게는 H, OH 또는 C1~C3의 알콕시기일 수 있다.
상기 엘라그산은 하기 화학식 4로 나타낼 수 있다.
[화학식 4]
Figure pat00004
상기 화학식 4의 엘라그산은 폴리페놀 4개의 링으로 구성되어 있으며, 식물체 내에서는 전구물질인 엘라지탄닌(ellagitannin) 형태로 존재한다.
본 발명의 일 구체예로, 엘라그산은 2, 3, 7, 8- 테트라하이드록시-크로메노[5,4,3-cde]크로메네-5,10-다이온(2,3,7,8-Tetrahydroxy-chromeno[5,4,3-cde]chromene-5,10-dione)의 IUPAC 명칭을 가질 수 있다.
상기 엘라그산은 가자(Terminalia chebula Retzius), 구아바, 바나바, 석류, 라스베리, 딸기, 포도, 복분자, 블랙베리 및 호두 등으로부터 분리하거나 화학적으로 합성 또는 시판의 일반시약을 입수하여 사용할 수 있다.
본 발명의 염증성장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물의 엘라지탄닌은 엘라지탄닌 그 자체, 그의 염 및/또는 그의 유도체를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 엘라지탄닌은 화학식 5로 나타낼 수 있다.
[화학식 5]
Figure pat00005
상기 엘라지탄닌은 엘라그산 전구체로 생체 내 또는 별도의 공정에 의해 가수분해시켜 엘라그산을 제조할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 진저놀 또는 6-진저놀을 추가로 포함하는 것으로 염증성 장질환 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이다.
6- 진저놀
본 발명의 염증성장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물의 6- 진저놀(6-Gingerol)은 6-진저놀 그 자체, 그의 염 및/또는 그의 유도체를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 6-진저놀 유도체는 다음의 화학식 6와 같다.
[화학식 6]
Figure pat00006
상기 화학식 3에서, R1, R2 및 R3 는 서로 독립적이며, 수소원자, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로필옥시기, C1-C6 저급 알킬기, 할로겐 원자 및 카르복실산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다. 바람직하게는 H, OH 또는 C1~C3의 알콕시기일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 6-진저놀의 구조는 하기의 화학식 7과 같을 수 있다.
[화학식 7]
Figure pat00007
본 발명의 일 구체예로, 6-진저놀의 IUPAC 명칭은(5S)-5-하이드록시-1- (4-하이드록시-3-메톡시페닐)-3-데카논((5S)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)decan-3-one)일 수 있다.
상기 6- 진저놀(6-Gingerol)은 건강 (Zingiber officinale Roscoe, Zingiberacae)으로부터 분리가능 하거나, 화학적 합성 또는 시중에서 구입 가능하다.
염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물
본 발명은 데히드로코스투스 락톤을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료, 개선 및/또는 예방 효과가 있는 항염증 조성물에 관한 것이다.
상기 항염증 조성물은 추가적으로 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항염증 조성물은 추가적으로 6-진저놀을 포함할 수 있다.
상기 항염증 조성물은 목향의 생리활성성분을 포함할 수 있다.
상기 항염증 조성물은 추가적으로 가자 및/또는 건강의 생리활성성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 생리활성성분이란 생명체가 생명을 유지하는 데 생체의 생리활동을 증진시키거나 혹은 억제시키는 물질로 생체조직 내에 각종 세포조직에 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의한 비정상적인 병태를 보일 때 바로잡아주는 것으로, 본 발명에서는 식물에서 유래한 생리활성물질인 파이토케미칼을 포함하는 개념으로 사용된다.
또한, 상기 항염증 조성물은 추가적으로 코스튜놀라이드(costunolide), 알란토락톤(alantolactone), 트랜스-카리오필렌(trans-caryophyllene), 베타-세드렌(β-cedrene), 알파-후물렌(α-humulene), 베타-세드롤(β-cedrol), 알파-펠란드렌(α-phellandrene), 베타-이오논(β-ionone), 알파-이오논(α-ionone), 베타-코스톨(β-costol), 코스투스락톤(costuslactone), 사이클로헥산에탄올(cyclohexaneethanol), 아우크랜다이안올 에이(aucklandianol A), 1-베타, 6-알파-디하이드록시코스틱 산(1β,6α-dihydroxycostic acid) 및 코스틱 산(costic acid)중에 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 항염증 조성물은 추가적으로 진지베롤(zingiberol), 진지베렌(zingiberene), 6-진저놀(6-gingerol), 진저론(zingerone), 6-쇼가올(6-shogaol), 및 감마-아미노부티르산(gamma-aminobutyric acid)중에 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 항염증 조성물은 추가적으로 펜타갈로일 글루코스(pentagalloyl glucose: PGG) 및 코릴라진(corilagin) 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 즉, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환을 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 추가적으로 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 포함할 수 있다.
또한, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 추가적으로 6-진저놀을 포함할 수 있다.
본 발명의 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 조성물은 항염증 효과, 특히 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방의 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 데히드로코스투스 락톤에 추가적으로 엘라그산 또는 6-진저놀 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물은 항염증 효과 특히 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방의 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 장 상피세포의 단핵구 부착능을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 대식세포의 일산화질소(NO) 생성양을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 염증관련 단백질의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 염증성 사이토카인의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ, IL-6 및 IL-10 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물은 면역반응을 매개하는 인자의 발현양을 감소시킬 수 있다.
상기 면역반응 매개 인자는 TLR-4, iNOS 및 COX-2 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 염증성 장질환 동물모델에서 대장의 길이의 축소를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 체중감소, 설사, 변비, 부종 및 혈변 중 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 조성물은 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있다.
일 구체예로, 상기 조성물은 MPO 활성을 억제 시킬 수 있다.
또한, 상기 조성물은 염증반응으로 활성화된 면역세포를 조절할 수 있다.
상기 조성물은 NF-κB의 활성을 조절할 수 있다.
상기 조성물은 대식세포의 활성을 조절할 수 있다.
상기 조성물은 자연살해 세포(NK 세포)의 활성을 조절할 수 있다.
상기 조성물은 호산구, 호중구, 호염구의 활성을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은
데히드로코스투스 락톤; 엘라그산 및 6-진저놀 중 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 및 엘라그산을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 및 6-진저놀을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 6 내지 16: 10 내지 26: 0.5 내지 2의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 6.6 : 10: 1 의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 9.9 : 18.5 : 1.3 의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 염증성 장질환 치료, 개선 및/또는 예방용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 15.4 : 25.1 : 1.9 의 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 조성물에 의할 경우, 항염효과 특히, 염증성장질환의 치료, 개선 및/또는 예방 효과를 낼 수 있다.
특히, 상기 조성물에 의할 경우, 천연식물로부터 분리한 생리활성물질을 유효물질로 포함하므로 독성이 없고 지속적 투여에도 부작용이 적다는 장점이 있다.
유효물질추출방법
본 발명의 유효물질을 얻는 방법은 천연식물로부터 분리하는 방법 또는 화학적 합성 또는 시중에서 구입 가능하다. 그 중 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음과 같다.
본 발명은 천연식물로부터 본 발명의 조성물의 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 천연식물로부터 데히드로코스투스 락톤을 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 천연식물로부터 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 천연식물로부터 6-진저놀을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 천연식물은 식물 그 자체; 추출, 분획 또는 정제를 통한 추출액; 분획 및 정제물; 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
상기 천연식물은 목향, 아티초크 (Artichoke), 월계수, 함박꽃나무(Magnolia sieboldii)및 조개우산이끼(Targioniaceae) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 천연식물은 가자, 구아바, 바나바, 석류, 라스베리, 딸기, 포도, 복분자, 블랙베리 및 호두 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 천연식물은 건강일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 천연식물은 목향, 가자 또는 건강 중 어느 하나 이상일 수 있다.
목향(Aucklandia lappa Decne)은 국화과(Asteraceae/Compositae)에 속하는 여러해살이풀로, 개화기는 7~9월이고 결실기는 8~10월이다. 비교적 높은 산지에서 자라며, 원산지는 인도이며 중국에서는 운남, 광성, 사천에서 재배하고, 목향의 여러 가지 이름은 밀향(蜜香), 청목향(靑木香), 오향(五香), 오목향(五木香), 남목향(南木香), 광목향(廣木香), 운목향(雲木香), 월서목향(越西木香), 천목향(川木香) 등으로 부른다.
목향은 약성이 따뜻하므로 복부가 차가워서 일어나는 복통, 헛배가 부른 증상, 구토, 설사 등에 좋은 치료 효과를 나타내며, 이질에도 효력이 있고, 대장의 기능을 증강시키는 효능, 소변을 잘 나오게 하는 효능 및 통증을 그치게 하는 효능을 가진다고 알려져 있다.
건강(Zingiber officinale Rosc.)은 생강의 근경을 말린 것으로, 생강과 생강속에 속하는 열대 아시아 원산의 다년생 풀로, 생강과는 주로 열대에 많이 나며 전세계에 약 47속 1,400여종이 있으며, 생강 속은 동아시아, 인도, 말레이시아에 약 50종이 분포되어 있으며 우리나라에는 생강속에 양하, 생강이 재배되고 있으며 꽃생강속에 꽃생강이 재배되고 있고, 꽃양하속에 꽃양하가 남부지방 섬의 숲 밑에 자생하고 있다. 건강은 건생강(乾生薑), 균강(均薑), 백강(白薑), 생건강(生乾薑)으로도 불린다.
건강은 맵고 성질은 따뜻하며 독이 없어 폐, 위, 비경에 작용하며, 또한 심경, 간경, 담경에도 작용한다. 표사를 발산시키고 찬기운을 풀어주며 구토를 멎게 하고 가래를 소통시키는 효능이 있으며, 감기, 풍한, 구토, 담음, 천식, 해수, 창만, 설사를 치료한다. 또한, 기력을 돕고 혈액순환을 촉진키며 냉한 것과 풍을 제거시키고 해독, 소염작용을 하며 치통의 약취를 제거하고 통증을 멎게 하며 습양(濕痒)을 가라앉힌다고 알려져 있다.
가자(Terminalia chebula Retzius)는 가자나무의 성숙한 과실로, 가자나무는 인도, 미얀마, 말레이시아, 중국 사천성 등에 자생하는 열대성 큰키나무로 과즙에서는 미로발란(myrovalan)이란 노란 색소를 추출하기도 하며 가구용 목재로도 쓰인다. 가자의 여러 가지 이름은 가려늑(訶黎勒), 가리늑(訶梨勒), 수풍자(隨風子), 가리(訶梨), 가려(訶黎) 등으로 부른다.
가자는 약간의 특이한 냄새가 나며, 약성은 쓰고 조금 시며 떫고 따뜻하다. 기(氣)를 내리고 오래된 담과 기침을 삭히고 숨이 차는 것, 오래된 설사, 이질, 대학, 탈항에 효과가 있고, 소화를 돕고 입맛을 돋우며 뱃속의 태아를 편안하게 하는 작용도 한다. 또한, 약리작용으로는 수렴, 지사, 녹농균 등에 대한 균을 억제하는작용이 보고되었다.
본 발명의 일 구체예로 상기 목향으로부터 데히드로코스투스 락톤을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 가자로부터 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 건강으로부터 6-진저놀 또는 진저놀을 분리할 수 있다.
상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(1) 천연식물의 전처리 및 용매에 의해 추출하는 단계
(2) 상기 단계의 추출물을 농축하는 단계
(3) 상기 농축물로부터 크로마토그래피를 이용하여 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리하는 단계
를 포함하는 천연식물로부터 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 (1)단계의 천연식물의 전처리는 세척, 건조 및 분쇄 중 어느 하나의 방법 또는 이들의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
상기 건조는 이에 한정되는 것은 아니지만, 자연건조, 동결건조, 냉풍건조, 온풍건조, 분무식건조, 적외선건조 및 마이크로웨이브 건조 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
상기 분쇄란 고형의 대상체에 힘을 가해 잘게 부수거나 잘라내어 작은 입자로 만드는 입도 감소를 하기 위한 공정을 의미하는 것이다. 즉, 보다 더 큰 부피를 가지는 고형의 대상체를 보다 더 작은 부피를 가지는 복수의 입자들로 만드는 것을 분쇄라고 한다. 본 명세서에 있어서, '세절'이라는 용어가 '분쇄'라는 용어와 비슷한 개념으로 사용될 수 있다.
상기 (1)단계의 추출은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용될 수 있다.
예컨대, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열 추출법으로 추출할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 열수 추출 또는 환류냉각 추출을 통해 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회, 1회 내지 8회 또는 1회 내지 6회 반복 추출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 '추출물(extract)'은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 명세서에서는 분획물 또한 상기 추출물에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 '조추출물'은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
추출 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 추출용매는 예를 들어, 50~100%, 50~95%, 50~90%, 50~85%, 50~80%, 50~75%, 50~70%, 50~65%, 또는 50~60% 농도로 사용할 수 있다. 바람직하게는 50~60% 농도로 사용할 수 있다.
추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 천연식물 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 120인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 비제한적으로 1 내지 20시간, 바람직하게는 1 내지 15시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 6시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 천연식물의 추출물은 혼합추출물일 수 있고, 이는 단일 또는 복수의 식물로부터 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예로, 상기 혼합추출물은 단일 식물로부터 추출후 각 식물로부터 얻은 추출물을 혼합하거나, 복수의 식물의 혼합으로부터 직접 혼합추출물을 얻을 수도 있다.
상기 혼합추출물로부터 본 발명의 유효물질인 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 목향;및 가자 또는 건강 중 하나 이상을 포함하는 혼합 추출물, 예를 들어, 목향 및 가자 혼합 추출물, 목향 및 건강 혼합 추출물 또는 목향, 건강 및 가자 혼합 추출물을 제조하는 경우, 혼합 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 예를 들어, 50% ~ 100% 에탄올을 가하여, 약 20 내지 120, 바람직하게는 60 내지 100에서 1 내지 15시간, 바람직하게는 1 내지 6시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 환류추출법으로 추출한 후 여과하여 얻을 수 있다. 또한, 이후 건조단계를 추가로 거쳐 목향 : 가자, 목향 : 건강 또는 목향: 건강 : 가자를 포함한 혼합 조추출물을 얻을 수 있다.
상기 (2)단계의 추출물을 농축하는 단계는 용매 등을 제거하여 주요 고체성분의 농도를 높이는 방법이다.
상기 농축은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 냉침 농축, 환류냉각 농축, 스크류 농축, 진공 농축, 열수 농축 및 가압 농축 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 이루어 질 수 있다.
상기 (2)단계는 농축물을 분리하여 침전물을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 침전물은 농축물을 원심분리를 통해 상등액과 침전을 분리하여 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (3)단계의 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 아비셀 컬럼 크로마토그래피(avicel column chromatography), 알루미나 컬럼 크로마토그래피(alumina column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 실리카겔 박층 크로마토그래피(preparative thin layer chromatography), 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography), 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피(ion excahnge chromatography), 향류분배 크로마토그래피(Countercurrent Chromatography), 역상 크로마토그래피, 및 고성능 액체 크로마토그래피(high preformance liquid chromatography) 중 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합을 이용할 수 있다.
상기 크로마토그래피를 통해 천연식물의 생리활성물질인 데히드로코스투스 락톤, 엘라지탄닌, 엘라그산 또는 6-진저놀을 얻을 수 있다.
상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 추가적으로 열처리 공정을 포함할 수 있다.
상기 열처리 공정을 추가함으로 인해 유효물질의 추출함량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(1) 천연식물의 전처리 및 용매에 의해 추출하는 단계
(2) 상기 단계의 추출물을 농축하는 단계
(3) 상기 농축물로부터 크로마토그래피를 이용하여 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리하는 단계
(4) 상기 분리된 유효물질을 열처리 공정을 거치는 단계
를 포함하는 천연식물로부터 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 엘라지탄닌은 열처리 공정을 통해 엘라그산을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 열처리 공정을 통해 엘라그산의 추출양을 증가시킬 수 있다.
일 구체예로, 상기 열처리 공정은 상기 제조한 추출물의 질량 대비 1배 내지 20배의 증류수에 현탁시켜, 60~100℃ 온도에서 1시간 내지 32시간 동안 열을 가함으로써 시행될 수 있다. 상기 추출물은 분말 또는 액상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 열 가열 시간은 10시간 내지 30시간 일 수 있다.
바람직한 구체예로, 상기 열처리 공정은 상기 제조한 분말 형태의 추출물 질량 대비 5배~10배의 증류수에 현탁시켜, 70~90℃ 온도에서 18시간 내지 30시간 동안 열을 가함으로써 시행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(1) 천연식물의 전처리 및 용매에 의해 추출하는 단계
(2) 상기 단계의 추출물을 농축하는 단계
(3) 상기 농축물로부터 크로마토그래피를 이용하여 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산, 엘라지탄닌 또는 6-진저놀을 분리하는 단계
(4) 상기 분리된 유효물질을 70~90℃ 온도에서 18시간 내지 30시간 동안 열처리 공정을 거치는 단계
를 포함하는 천연식물로부터 유효물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 유효물질을 천연식물로부터 분리하는 방법은 (4)단계의 열처리 공정에 의해 그 함량이 증가 될 수 있으며 열처리 시간별 유효물질의 함량은 다음의 표 1 및 도 34와 같다.
열처리 시간 Ellagic acid( % )
0hr 0.761
6hr 0.900
12hr 1.177
18hr 1.182
20hr 1.312
22hr 1.344
23hr 1.433
24hr 1.456
25hr 1.422
26hr 1.664
28hr 1.681
30hr 1.579
상기 표 1 및 도 34를 볼 때, 열처리 전, 후에 따라 유효물질인 엘라그산의 함량이 증가하였으며 20~25시간까지 함량의 증가폭은 감소하였다가 25시간 이후 소폭 상승후 유지하는 양상을 보였다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 증가하는 엘라그산의 함량은 상기 (3)단계에 의해 분리된 엘라그산의 약 1.1배 내지 3배일 수 있다. 바람직하게는 약 1.5배 내지 2.4배 일 수 있다.
상기 천연식물로부터 유효물질을 추출하는 방법을 통해 안정적이고 효율적으로 본 발명의 염증성장질환 치료용 조성물의 유효물질을 얻을 수 있다.
약학적조성물
본 발명은 일 관점에서 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 추가적으로 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 추가적으로 6-진저놀을 포함할 수 있다.
상기 염증성 장질환의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물은 약학적 조성물에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 이미 사용되고 있는 스테로이드성 약물, 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 항염증제를 포함할 수 있다.
상기 항염증제는 설파살라진, 메살라진을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 부신피질 호르몬제를 포함할 수 있다.
상기 부신피질호르몬제는 프레드니손, 프레드니솔론, 하이드로 콜티손, 엔토코트를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 면역억제제를 포함할 수 있다.
상기 면역억제제는 이뮤란, 6-MP, 사이클로스포린, 메토트렉세이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 항생제를 포함할 수 있다.
상기 항생제는 메트로니다졸, 시프로베이를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 내강변환제를 포함할 수 있다.
상기 내강변환제는 단쇄 지방산, 글루타민을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 항산화제를 포함할 수 있다.
상기 항산화제는 알로퓨리올, 디메틸 설폭사이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 국소마취제를 포함할 수 있다.
상기 국소마취제는 리도카인을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 약학적조성물은 추가적으로 니코틴, 헤파린 케로티펜, 탈리도마이드, 콜로니 자극인자 및 표피성장인자 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 추가적인 항염증제, 부신피질호르몬제, 면역억제제, 항생제, 내강변환제, 항산화제, 국소마취제 등을 포함함으로 인해 염증성 장질환의 증상을 치료 및/또는 개선하는 데에 도움을 줄 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 바람직하게는 경구형 제형으로 제제할 수 있다.
본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 바람직하게는 경구로 투여할 수 있다.
본 발명 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 1000mg/day으로 투여할 수 있다. 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 300~900mg/day로 투여할 수 있다.
또한, 다른 구체예로, 상기 조성물은 1일 2회 400mg/회으로 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 데히드로코스투스 락톤을 유효성분으로 1~200mg/kg으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 데히드로코스투스 락톤은 20~100mg/kg으로 투여할 수 있다. 또한 다른 구체예로, 10~50mg/kg으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 조성물은 엘라그산을 1~300mg/kg으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 엘라그산은 20~200mg/kg으로 투여할 수 있다. 또한 다른 구체예로, 10~100mg/kg으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 장질환 또는 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 투여함으로 인해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-γ의 감소를 가져오며, 면역반응을 매개하는 iNOS 발현, COX-2의 발현, TLR-4의 발현 감소를 가져오며 면역세포에 관한 활성의 감소 효과가 있다. 따라서, 면역세포의 활성 감소로 인한 항염증 효과를 가질 수 있다.
또한, 대장 길이 회복 및 체중감소, 설사, 혈변의 상태 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 가짐으로 인해 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염, 장결핵 및 장염, 설사의 치료 및 개선의 효과를 가질 수 있다.
특히 궤양성 대장염 및 크론병의 치료 및 개선 효과가 뛰어나다.
식품용조성물
본 발명은 다른 관점에서 데히드로코스투스 락톤을 포함하는 염증성 장질환의 개선 및 예방을 위한 식품용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 식품용 조성물은 추가적으로 엘라그산 또는 엘라지탄닌을 포함할 수 있다.
상기 식품용 조성물은 추가적으로 6-진저놀을 포함할 수 있다.
상기 염증성 장질환의 개선 및 예방을 위한 식품용 조성물은 염증성 장질환증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예를 들어 식품의 주원료, 부원료, 식품첨가제, 건강 기능 식품 또는 음료 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '건강기능식품'이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체 방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 질병의 예방 또는 건강의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.
상기 건강기능 식품의 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 조성물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다.
예를 들어, 본 발명의 항염증 조성물은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염, 장결핵 및 장염, 설사 등의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다. 또한, 이를 이용한 기능성 강화식품 등을 제조할 수 있을 것이다.
즉, 본 발명의 항염증 조성물 및/또는 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강기능성 식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌류, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 차, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 항염증조성물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 식품용 조성물의 섭취로 인해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-γ의 감소를 가져오며, 이와 면역반응을 매개하는 iNOS 발현, COX-2의 발현, TLR-4의 발현 감소를 가져오며 면역세포에 관한 활성의 감소 효과가 있다. 따라서, 이로 인한 항염증 효과를 가질 수 있다.
또한, 상기 식품용 조성물을 섭취할 경우, 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염 중 어느 하나 이상의 개선 및 예방효과를 가져올 수 있다.
특히, 대장 길이 회복 및 체중감소, 설사, 혈변의 상태 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 가짐으로 인해 궤양성 대장염 및 크론병의 개선 및 예방효과가 뛰어나다.
따라서, 본 발명은 데히드로코스투스락톤을 포함하는 조성물; 또는 이에 추가적으로 엘라그산 또는 6-진저놀 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물로 장 상피세포에서 단핵구 부착능 억제효과, 염증관련 단백질의 발현억제효과를 가져올 수 있다. 또한, 염증성 대장염에 의한 대장 길이 회복 및 체중감소, 설사, 혈변의 상태 개선 중 어느 하나 이상에 효과를 보이므로 상기 효과를 보이는 조성물의 유효량을 이용하는 다양한 용도를 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험재료
1. 본 발명의 조성물의 유효물질의 준비
실험에서 사용되는 유효물질인 데히드로코스투스락톤, 엘라그산 및 6-진저놀은 시중에서 화합물을 구입하여 사용하였다.
2. 시약 및 기기
(1) 세포독성 측정 시약 및 기기
대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA), MTT( (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), Sigma-Aldrich, USA), Dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)와 측정을 위한 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)를 사용하였다.
(2) 일산화질소 생성량 측정 시약 및 기기
대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA), Lipopolysaccaride(LPS, Sigma-Aldrich), Griess 시약(Promega, USA)과 측정을 위한 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)를 사용하였다.
(3) 장 상피세포에서 단핵구 부착능 억제 효과 측정 시약 및 기기
인간 대장 상피 세포주 HT-29 세포 (American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA), 인간 단핵구 세포주 U937 세포 (ATCC, Rockville, MA, USA), 태아소혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신, 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF/AM), 5-ASA(Sigma-Aldrich, USA), rh-TNF-α(Sigma-Aldrich, USA)와 측정을 위한 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)를 사용하였다.
(4) 염증관련 단백질의 mRNA 발현 억제 효과 측정 시약 및 기기
대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA), Lipopolysaccaride(LPS, Sigma-Aldrich), Trizol reagent(필코리아, 한국), cDNA 합성 키트(필코리아, 한국), SYBR 형광 시약(New England BioLabs Inc., England), DEPC-Water(Sigma-Aldrich, USA)와 RNA 농도 측정을 위한 분광광도계(DS-11, Denovix, USA), 중합효소연쇄반응 기기(SimpliAmp Thermal Cycler, ThermoFisher Scientific, USA), 실시간 중합효소연쇄반응 기기(QuantStudio3, ThermoFisher Scientific, USA)를 사용하였다.
(5) DSS 동물 모델 제작 시약
C57BL/6 female 마우스 (17~19g, 6주령, 대한바이오링크(음성, 한국)), 5-아미노살리실산(5-ASA), CMC(Carboxymethyl Cellulose), DSS (Dextransodium sulfate)를 사용하였다.
(6) TNBS 동물 모델 제작 시약
ICR female 마우스 (25~30g, 7주령, 대한바이오링크(음성, 한국)), 5-아미노살리실산(5-ASA), CMC(Carboxymethyl Cellulose), TNBS (Trinitrobenzene sulfonic acid)를 사용하였다.
실험방법
(1) 세포독성 평가 시험(Cell viability 시험)
대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 배양하고, 95% 공기 및 5% CO2의 환경 하 37에서 상기 세포주를 유지하였다. 96 Well plate에 대식세포 1 X 104 cells/well을 분주하여 24시간 배양한 뒤 Dehydrocostus Lactone 0.03125㎍/㎖부터 2배수로 각각 5 well 씩 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 각 well 에 MTT 5㎎/㎖ 시약을 10㎕씩 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 세포배양액 및 MTT 시약 제거 후, DMSO를 100㎕씩 처리하고 결정이 생기지 않도록 충분히 흔들어 주고 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)로 595nm파장의 흡광도를 측정하였다.
(2) 일산화질소(NO) 생성 억제 효과 확인 실험
96 Well plate 에 1 X 104 cells/well 로 분주하여 24시간 배양한 대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 Dehydrocostus Lactone 0.03125㎍/㎖부터 2배수로 각각 5 well 씩 처리하고, 일산화질소 생성을 유도하기 위하여 LPS 1㎍/㎖을 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 각 well에서 세포배양액 50㎕를 새 96 well plate에 옮기고 Griess reagent kit 의 시약 A, B를 각각 50㎕를 첨가하여 일산화질소양에 따른 발색을 유도하였다. 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)로 540nm 파장의 흡광도를 측정하였다.
(3) 장 상피세포에서 단핵구 부착능 억제 효과 확인 실험
인간 대장 상피 세포주 HT-29 세포 (American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)와 인간 단핵구 세포주 U937 세포 (ATCC,Rockville, MA, USA)를 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640에서 배양하고, 95%공기 및 5% CO2의 환경 하 37℃ 에서 상기 세포주를 유지하였다.
단핵구-대장 상피세포 부착은 37에서 30분 동안 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF/AM, 10㎍/㎖)로 표식된 U937 세포를 이용하여 측정하였다.
48 Well plate에서 24시간 배양된 HT-29 세포(2 X 106 cells/well)는 TNF-α(100ng/㎖)를 처리함과 동시에 제조한 추출물(100㎍/㎖)을 처리하여 24시간 배양하였다. 이때, 양성대조군으로, 20mM의 5-아미노살리실산(5-ASA)을 사용하였다. 그후, HT-29 세포는 37에서 30분 동안 BCECF/AM-표식된 U937 세포(5 X 105 cellls/well)와 공배양 되었다.
부착되지 않은 U937 세포는 제거되고 PBS로 2회 세정되었다. U937 세포가 부착된 HT-29 세포는 0.1 mol/l Tris 에 용해된 0.1% Triton X-100를 이용하여 용해시켰다. 이들 세포 용해물을 485nm 및 520nm에서 발광을 이용하여 마이크로플레이트 리더(TECAN, Gr, Austria)로 형광을 측정하였다.
(4) 염증관련 단백질의 mRNA 발현 억제 효과 확인 실험
100mm 세포배양접시에 1 X 106 cells 씩 배양된 대식세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)에 Dehydrocostus Lactone 1uM 농도로 처리하고 1시간 후 염증반응을 유도하기 위하여 LPS 1㎍/㎖을 추가하여 24시간 배양하였다.
세포배양액을 제거하고 Trizol reagent를 이용하여 각 sample 별 RNA를 추출하였다. RNA의 농도를 분광광도계를 이용하여 측정하고, RNA 1㎍을 이용하여 cDNA 합성키트와 중합효소 연쇄반응 기기를 이용하여 각 sample 에 대한 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA와 SYBR 형광 시약, [표 2]의 각 단백질에 대한 primer로 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하여 염증관련 단백질의 발현 억제 효과를 분석하였다.
Primer Forward Reverse
GAPDH GTCTTCCTGGGCAAGCAGTA CTGGACAGAAACCCCACTTC
iNOS CGAAACGCTTCACTTCCAA TGAGCCTATATTGCTGTGGCT
COX-2 AACCGCATTGCCTCTGAAT CATGTTCCAGGAGGATGGAG
IL-6 ACAACCACGGCCTTCCCTACTT CACGATTTCCCAGAGAACATGTG
IL-10 TGGCCCAGAAATCAAGGAGC CAGCAGACTCAATACACACT
TNF-a CACAGAAAGCATGATCCGCGACGT CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTTCT
IFN-r TGAACGCTACACACTGCATCTTGG CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG
TLR4 ACCTGGCTGGTTTACACGTC CTGCCAGAGACATTGCAGAA
(5) DSS 동물 모델에서의 대장염 개선효과 확인 실험
염증성 장질환의 실험적 모델을 구축하기 위하여 C57BL/6 female 마우스 (17~19g)로 6주령을 대한바이오링크(음성, 한국)에서 구입하여 1주 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 일정한 습도(50%)와 일정한 온도 (22) 및 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에 1주간 적응시켰다.
1주일 동안 적응 기간을 거친 후, 정상대조군, 대장염 유발군, 대조약 투여군 (5-ASA 200mg/kg), 데히드로코스투스락톤 투여군(각 10mg/kg 및 50mg/kg) 및 엘라그산 투여군(각 10mg/kg 및 100mg/kg)으로 나누어 장길이, 장길이당 무게, DAI. MPO 수치를 측정하였다.
또한, 추가적인 실험으로 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물 투여군에 대하여 염증관련 단백질의 발현양 측정(IL-6, TNF-α), DAI,MPO 수치를 확인하였다.
데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 일정 용량별로 포함하는 조성물 투여군(sample 1,2,3) 및 대조약 투여군(5-ASA 및 Tofacitinib)으로 그룹을 나누어 장길이, 장길이당 무게, DAI를 측정하는 실험 또한 수행하였다.
대조약(5-ASA) 및 추출물은 0.5% CMC(Carboxymethyl Cellulose)에 용해 시킨 후, 3% DSS (Dextran sodium sulfate) 섭취와 동시에 하루에 한 번씩 경구투여를 7일간 하였으며, 정상 대조군과 대장염 유발군은 0.5% CMC를 경구투여하였다.
대장염 유발군과 대조약 투여군 및 본 발명의 조성물 투여군은 3% DSS를 1주일간 자유롭게 섭취하였으며, 정상 대조군은 물을 자유롭게 섭취하였다.
이후, 8일째에 마우스를 희생하여, 대장 부위 중 맹장부위부터 항문 직전부위까지의 대장을 적출하였다. 적출한 대장의 길이 및 외관을 관찰하여 체중감소, 설사, 혈변의 정도를 확인하고 [표 3]의 기준을 따라 점수로 표기하여 질병활성수치(DAI)를 표시하였다.
점수 체중 감소 (%) 대변의 농도 출혈 정도
0 없음 보통 없음
1 1-5
2 5-10 묽음 잠재 출혈
3 10-20
4 >20 설사 심한 출혈
(6) TNBS 동물 모델에서의 크론병 개선효과 확인 실험
염증성 장질환의 실험적 모델을 구축하기 위하여 ICR female 마우스 (22~25g)로 8주령을 대한바이오링크(음성, 한국)에서 구입하여 1주 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 일정한 습도(50%)와 일정한 온도 (22) 및 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에 1주간 적응시켰다.
1주일 동안 적응 기간을 거친 후, 정상대조군, 대장염 유발군, 대조약 투여군 (5-ASA 200㎎/㎏) 데히드로코스투스락톤 투여군(각 10mg/kg 및 20mg/kg) 및 엘라그산 투여군(각 10mg/kg 및 100mg/kg)으로 나누어 장길이, 장길이당 무게, DAI. MPO 수치 및 염증관련 단백질의 발현양 측정(IL-6, IL-10, TNF-α,IFN-γ)를 측정하였다.
또한, 추가적인 실험으로 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물 투여군에 대하여 염증관련 단백질의 발현양 측정(IL-6, TNF-α), DAI,MPO 수치를 확인하였다.
데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 일정 용량별로 포함하는 조성물 투여군(sample 1,2,3) 및 대조약 투여군(5-ASA 및 Tofacitinib)으로 그룹을 나누어 장길이, 장길이당 무게, DAI를 측정하는 실험 또한 수행하였다.
대장염 유도를 위해 24시간 절식시킨 동물에 50% 에탄올로 용해시킨 TNBS (0.5㎎) 0.15㎖을 경구투여용 플라스틱 존대로 항문에 삽입하였다.
이후 동물의 머리를 아래로 1분간 유지시켜 TNBS 가 새지 않도록 조치하였다.
대조약(5-ASA) 및 추출물은 0.5% CMC(Carboxymethyl Cellulose)에 용해 시킨 후, 하루에 한 번씩 경구투여를 5일간 하였으며, 정상 대조군과 대장염 유발군은 0.5% CMC를 경구 투여하였다. 이후, 6일째에 마우스를 희생하여, 대장 부위 중 맹장부위부터 항문 직전부위까지의 대장을 적출하였다. 적출한 대장의 길이 및 외관을 관찰하여 체중감소, 대장 염증 상태, 변 상태, 부종의 정도를 확인하고 [표 4]의 기준을 따라 점수로 표기하여 질병활성수치(DAI)를 표시하였다.
체중 감소 (%) 변비 대장 부종 소장 상태 대장 출혈 사망
없음 (0) 증상없음(0) 증상없음(0) 증상없음(0) 증상없음(0) 생존 시 (0)
1-5 (1) (1) (1)
5-10 (2) mild (2) mild (2) mild (1) mild (1)
10-20 (3) (3) (3)
>20 (4) sever (4) sever (4) sever (2) sever (2) 사망 시(16)
실시예 1. 데히드로코스투스 락톤(dehydrocostus lactone) 및 엘라그산(ellagic acid)의 염증성장질환 개선효과 확인
1-1. 세포 독성평가 결과
세포 독성 정도를 데히드로코스투스 락톤을 첨가하지 않은 대조군을 기준으로 백분율로 표시한 결과를 도 1 및 표 5에 도시하였다. 데히드로코스투스 락톤은 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25㎍/㎖ 의 양으로 처리시에는 흡광도가 대조군과 유의한 차이가 나지 않는 90% 정도의 생존율을 보였으나, (각 농도별 순서대로 96%, 94%, 94%, 92%의 세포생존율을 보임) 0.5㎍/㎖이상 처리시 생존세포수는 급감하였다(생존율 70%).
특히, 1㎍/㎖를 처리한 경우에는 생존율은 40% 정도로 생존세포수는 절반 이하로 떨어지는 결과를 보였다.
즉, 데히드로코스투스 락톤의 처리 양이 증가할수록 세포생존율은 감소하며, 0.25㎍/㎖ 이하의 양을 처리한 경우 세포생존율에 크게 영향이 없으나, 0.5㎍/㎖이상 처리시 급감하기 시작하였고, 1㎍/㎖를 처리한 경우에는 생존율은 50% 이하로 떨어지는 것을 알 수 있었다.
데히드로코스투스락톤 투여량(ug/ml) 세포생존능 ( % )
대조군 100
0.03125 96
0.0625 94
0.125 94
0.25 92
0.5 70
1 40
1-2. 단핵구의 부착능 억제 효과 확인
본 발명의 데히드로코스투스 락톤의 단핵구 부착능 억제 효능을 확인하였다.
그 결과, 인간 대장 상피세포 HT-29에 대한 TNF-α의 처리에 의해 BCECF-AM 표식된 세포를 추출한 결과 대조군에 비해 약 5배 정도 증가 된 결과를 볼 수 있었다.
상기 추출된 세포를 양성대조군인 20mM 5-ASA(5-아미노살리실산)을 첨가한 경우 약 29.17%의 억제효과를 보였고, 데히드로코스투스 락톤의 경우 0.5㎍/㎖ 의 양으로 첨가시에는 25%의 억제율을 1㎍/㎖의 양으로 첨가시에는 33.33%의 억제율을 보였다. (도 2 및 표 6)
상기 결과를 볼 때, 데히드로코스투스 락톤의 경우 0.5㎍/㎖ 이상의 양을 첨가할 경우, 기존에 사용하고 있었던 염증성장질환제인 5-ASA과 유사한 단핵구 부착능을 억제하는 효능을 보이며, 특히 1㎍/㎖ 처리할 경우에는 5-ASA 보다 우수한 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.
또한, 5-ASA에 비해 현저히 적은 용량을 첨가하였음에도 단핵구 부착능의 억제 효과를 보인 것으로 볼 때, 기존에 사용하였던 염증성장질환제의 대체가능성을 볼 수 있었다.
구분 농도 부착 억제능 ( % )
정상대조군 -
TNF-α -
5-ASA(양성대조군) 20mM 29.17
데히드로코스투스락톤 0.5㎍/ml 25
데히드로코스투스락톤 1㎍/ml 33.33
1-3. 일산화질소(NO) 생성 억제 효과 확인
대식세포에 일산화질소 생성을 유도하기 위해 LPS를 처리한 후, 데히드로코스투스락톤을 처리한 양별로 일산화질소의 생성 양을 비교하였다.
그 결과 데히드로코스투스락톤의 처리량이 증가할수록 일산화질소의 생성이 감소함을 볼 수 있었다. (도 3 및 표 7)
0.03125㎍/㎖부터 각 2배의 양으로 처리할 경우 0.25㎍/㎖ 까지는 평균 약 18.75%의 감소율을 보였고, 특히 0.125㎍/㎖의 양 이상으로 처리시에는 음성대조군의 45% 이하의 일산화질소 생성양을 보이며, 0.5㎍/㎖ 이상을 첨가할 경우에는 양성대조군과 유사한 수치를 보였다.
즉, 0.5㎍/㎖ 이상의 데히드로코스투스락톤을 처리할 경우 염증유발물질을(LPS) 첨가하지 않는 때와 동등한 수준의 일산화질소 생성을 보이므로 항염증효과가 나타남을 알 수 있었다.
데히드로코스투스락톤 투여량( ug /ml) NO 생성량( % )
음성 대조군 100
0.03125 82
0.0625 70
0.125 45
0.25 25
0.5 20
1 18
1-4. 염증관련 단백질 발현 저해 효과 확인
본 발명의 데히드로코스투스 락톤의 염증관련 단백질의 발현 저해 효능을 확인하였다.
(1) TNF -α 발현저해 효과
TNF-α의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 TNF-α의 mRNA 발현양이 53.57% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 4)
즉, 대식세포의 활성에 의해 발현된 염증관련 단백질인 TNF-α의 mRNA 발현양은 50%이상 감소됨을 볼 수 있어 TNF-α에 의해 유도되는 염증반응의 감소효과를 유추할 수 있었다.
(2) INF -γ 발현저해 효과
INF-γ의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 INF-γ의 mRNA 발현양이 42.9% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 5)
즉, 대식세포의 활성에 의해 발현된 염증관련 단백질인 INF-γ의 mRNA 발현양은 40%이상 감소됨을 볼 수 있어 INF-γ에 의해 유도되는 염증반응의 감소효과를 유추할 수 있었다.
(3) TLR -4 발현저해 효과
TLR-4의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 TLR-4의 mRNA 발현양이 28% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 6)
즉, 대식세포를 활성시키는 인자인 TLR-4의 mRNA 발현양은 감소된 것을 볼 수 있어 염증반응에 의한 대식세포의 활성이 감소 됨을 확인할 수 있고, LPS와 TLR-4의 상호 작용에 의해 유도되는 염증반응의 감소효과를 유추할 수 있었다.
(4) iNOS 발현저해 효과
iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 iNOS 의 mRNA 발현양이 18.75% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 7)
즉, 대식세포의 활성에 의해 발현된 염증관련 단백질인 iNOS의 mRNA 발현양이 감소됨을 볼 수 있어 iNOS에 의해 유도되는 염증반응의 감소효과를 유추할 수 있었다.
또한, iNOS의 유도는 nuclear factor kappa B(NF-κB전사요소들을 포함한 일련의 신호전달 경로에 의해 유인되어지거나 조절되므로 NF-κB 신호전달과 관련된 전사요소의 발현 감소 또는 NF-κB신호전달과 관련된 염증반응의 감소효과 또한 유추할 수 있었다.
(5) COX-2 발현저해 효과
COX-2(cycoloxygenase-2)의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 COX-2의 mRNA 발현양이 42.1% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 8)
즉, 염증성 자극 사이토카인 증식인자 중 하나인 COX-2의 발현감소를 통해 염증반응의 감소효과를 예측할 수 있었다.
(6) IL-6 발현저해 효과
IL-6(Interleukin 6)의 mRNA 발현양을 보았을 때, LPS만을 처리한 경우보다 IL-6의 mRNA 발현양이 56.25% 정도 감소됨을 볼 수 있었다. (도 9)
즉, 염증성 자극 사이토카인 중 하나인 IL-6의 발현감소를 통해 염증반응의 감소효과를 예측할 수 있었다.
1-5. DSS( Dextran sulfate sodium)동물 모델에서의 궤양성 대장염 개선 효과 확인
DSS 염증성 장질환 동물모델에서 데히드로코스투스 락톤 및 엘라그산의 대장염 치료 및 개선 효과를 확인하였다. 결과는 도 10 내지 13 및 표 8에 기재하였다.
(1) 장길이 (colon length) 확인
장 길이는 정상대조군에 비하여 DSS 염증성 장질환 동물모델인 대장염 유발군에서 약 2.3cm정도 짧아진 것을 확인할 수 있었다. 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 오히려 약 0.1cm 정도 길이가 짧아진 반면, 데히드로코스투스락톤 투여군의 경우 각각 6.1cm, 6.4cm으로 장의 길이가 각각 약 0.2cm 및 0.5cm 증가함을 확인할 수 있었다. (도 10)
대장염 유발군에 대한 장 길이 증가율을 보면, 데히드로코스투스락톤 10㎎/㎏ 및 50㎎/㎏ 처리시, 각각 약 3.39%, 8.57%으로 처리양에 비례하여 장의 길이 증가율이 증가함을 볼 수 있었다.
또한, 엘라그산 투여군의 경우 투여량에 관계 없이 모두 6cm으로 장의 길이가 각각 약 0.1cm 증가함을 확인할 수 있었다.
대조약에 비해 장의 길이 유지효과가 높았음을 볼 때, 대조약 이상의 대장염 개선효과를 보임을 알 수 있다.
(2) 질병활성도(Disease activity index: DAI ) 확인
질병활성도는 체중감소, 대변의 농도, 출혈정도의 외관 상태를 관찰하여 나타낸 결과로 대장염 유발군의 경우 약 3%의 체중 감소가 일어났으며 대조약 투여군에서 약 1%, 데히드로코스투스 락톤, 엘라그산을 처리한 군에서 약 1~2%의 체중 감소가 일어나는 것을 확인 하였다.
대변의 농도, 출혈 정도의 경우 대장염 유발군에서 무른 대변과 설사가 빈번하게 발생 하였고 대장 조직의 심한 출혈이 관찰 되었으며 대조약 투여군에서도 대변의 상태는 개선되지 않은 것으로 보였으나 출혈 정도는 약간 개선 되는 것으로 확인 되었다.
데히드로코스투스락톤을 처리한 군에서는 약간 물러진 대변만이 관찰 되었고 잠재적인 출혈만 확인 되어 대변의 상태 및 출혈이 개선됨을 확인 하였다.
또한, 엘라그산을 처리 한 경우 대변의 상태, 출혈의 개선됨을 확인 하였으나 데히드로코스투스락톤보다는 효과가 떨어지는 것을 알 수 있었다.
위의 항목을 토대로 종합적으로 질병활성도를 평가한 결과 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 24% 개선효과를 보임에 비해 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 처리한 양에 관계 없이 약 49% 개선효과를 나타내어 대조약 투여군 이상의 대장염 개선효과를 보임을 알 수 있었다. (도 11)
또한, 엘라그산을 처리한 경우 10mg/kg을 처리한 경우 약 28.1% 개선효과를 보이며, 100mg/kg을 처리한 경우 약 42.25% 개선효과를 나타내어 데히드로코스투스락톤보다는 효과가 떨어지나, 대조약 투여군 이상의 대장염 개선효과를 보임을 알 수 있었다.
(3) 장 길이당 장의 무게(colon weight per colon length)확인
적출한 대장에 대하여 장의 길이당 무게를 측정하여 도 12에 도시하였다.
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 부종 및 염증세포 침착으로 인해 장의 무게가 160% 증가한 것을 볼 수 있었다.
대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 0.5mg/cm 감소하여 유의한 감소를 보이지 않은 반면, 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 10㎎/㎏ 및 50㎎/㎏ 처리시 각각 약 3mg/cm 및 4mg/cm 감소하여 각 9.3% 및 12.5%의 감소율을 보였다.
엘라그산을 처리시 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏ 처리시 대장염 유발군에 비해 각각 약 1mg/cm 및 1.5mg/cm 감소하여 약 3.1% 및 4.7% 감소율을 보여 감소율은 크지 않았다.
상기 결과를 볼 때, 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 대조약 투여군 이상의 대장염 개선 효과를 확인할 수 있었다.
(4) 산화적 스트레스( myeloperoxidase : MPO )억제 확인
부검시 적출한 대장 조직에 Pro-Prep 400㎕를 첨가하고 homogenize를 이용 하여 균질화 시킨 후 저온원심분리기를 이용하여 10000rpm으로 20분간 원심분리 하여 상등액을 수득하였다.
수득한 상등액은 R&D system 사의 mouse MPO ELISA kit 을 이용하여 대장 조직의 MPO 활성을 측정하였다.
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 백혈구 속의 효소인 MPO 활성 증가로 인해 정상대조군에 비해 약 288% 증가한 것을 볼 수 있었다. (도 13)
대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 21.74% 감소하였고, 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우는 투여한 용량에 관계없이 모두 47.82% 감소된 MPO 활성수치를 확인할 수 있었다.
엘라그산을 처리한 경우는 10mg/kg 처리한 경우 대조약 투여군과 동등한 감소율을 보였고, 100mg/kg을 투여한 경우 약 30.4% 감소율을 보였다. 이를 볼 때, 엘라그산은 투여양에 비례하여 MPO 활성수치의 감소를 확인할 수 있었다.
즉, 대조약 투여군 이상의 MPO 활성 감소효과를 보임에 따라 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 항염효과가 뛰어나며, 산화적 스트레스 억제 효과 또한 우수한 것을 알 수 있었다.
구분 대장길이(cm) DAI Colon weight per colon length(mg/cm) MPO
정상 대조군 8.2 - 20 320
대장염 유발군 5.9 7.1 32 920
대조약 투여군 5.8 5.4 31.5 720
엘라그산(10mg/kg) 6 5.1 31 720
엘라그산(100mg/kg) 6 4.1 30.5 640
데히드로코스투스락톤(10mg/kg) 6.1 3.6 29 480
데히드로코스투스락톤(50mg/kg) 6.4 3.6 28 480
1-6. TNBS(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid)동물 모델에서의 크론병 개선효과 확인
TNBS 염증성 장질환 동물모델에서 데히드로코스투스 락톤 및 엘라그산의 대장염 치료 및 개선 효과를 확인하였다. 결과는 도 14 내지 17 및 표 9에 기재하였다.
(1) 장길이(colon length) 확인
장 길이는 정상대조군에 비하여 TNBS 염증성 장질환 동물모델인 대장염 유발군에서 약 1.6cm정도 짧아진 것을 확인할 수 있었다. 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 0.6cm 정도 길이가 증가 하였고, 데히드로코스투스락톤 투여군의 경우 투여용량 10㎎/㎏ 및 20㎎/㎏일 때 각각 1.2cm, 1.8cm 장의 길이가 증가함을 확인할 수 있었다. (도 14)
대장염 유발군에 대한 장 길이 증가율을 보면, 데히드로코스투스락톤 10㎎/㎏ 및 20㎎/㎏ 처리시, 대장염 유발군에 비하여 각각 약 14.6% 및 21.9%으로 처리양에 비례하여 장의 길이 증가율이 증가함을 볼 수 있었다.
엘라그산 투여군의 경우 대장염 유발군에 비해 투여용량 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏일 때 각각 1cm, 1.6cm 장의 길이가 증가함을 확인할 수 있었다. (도 14)
장 길이 증가율을 보면, 엘라그산 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏ 처리시, 각각 약 12.2% 및 19.5%으로 처리양에 비례하여 장의 길이 증가율이 증가하며, 100㎎/㎏ 처리할 경우에는 정상군과 동일한 장의 길이에 도달 함을 볼 수 있었다.
또한, 데히드로코스투스락톤 및 엘라그산 대조약 이상의 대장의 길이를 유지시키는 효과를 보임을 알 수 있다.
(2) 질병활성도(Disease activity index: DAI )
질병활성도는 체중감소, 대변의 농도, 출혈정도의 외관 상태를 관찰하여 나타낸 결과로 대장염 유발군의 경우 약 22.2%의 체중 감소가 일어났으며 대조약 투여군에서 약 14%, 데히드로코스투스 락톤을 처리한 군에서 약 16%, 엘라그산을 처리한 군에서 약 3~12.5%의 체중 감소가 일어나는 것을 확인하였다.
대장의 부종, 변비 정도의 경우 대장염 유발군에서 대장의 심한 부종 및 염증으로 배변이 원활하지 않아 변비가 빈번하게 발생 하였으나 대조약 투여군에서 변비 및 대장의 부종이 줄어 드는 것이 관찰 되어 대장염 유발군에 비해 개선 되는 것을 확인 하였다.
데히드로코스투스락톤을 처리한 군과 엘라그산을 처리한 군에서는 대장의 부종이 많이 줄어 들어 대변 상태가 회복되어 가는 것을 관찰 하였으며 대조약 대비 대변의 상태 및 부종이 개선됨을 확인하였다.
위의 항목을 토대로 종합적으로 질병활성도를 평가한 결과 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 30.35% 개선효과를 보였으며, 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 10㎎/㎏ 및 20㎎/㎏ 처리시, 각각 약 25% 및 33.92% 개선효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다. (도 15) 또한, 엘라그산을 처리한 경우 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏ 처리시, 각각 약 53.5% 및 67.8% 개선효과가 뛰어난 것을 볼 수 있었다.
상기 결과를 볼 때, 수치상으로는 엘라그산을 처리한 경우 크론병의 외적인 증상의 감소효과가 큰 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 조성물을 사용할 경우 대조약과 대체 가능한 물질임을 확인할 수 있었다.
(3) 장 길이당 장의 무게(colon weight per colon length) 확인
적출한 대장에 대하여 장의 길이당 무게를 측정하여 도 16에 도시하였다.
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 부종 및 염증세포 침착으로 인해 장의 무게가 275% 증가한 것을 볼 수 있었다.
대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군보다 약 18.2% 감소하였고, 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우 10㎎/㎏ 및 20㎎/㎏ 처리시 각각 약 15.9% 및 29.5% 감소율을 보였다.
또한, 엘라그산을 처리한 경우 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏ 처리시 각각 약 40.9% 및 47.7% 감소율을 보였다.
상기 결과를 볼 때, 데히드로코스투스락톤을 20㎎/㎏ 처리할 경우 대조약 투여군 이상의 대장염 개선 효과를 확인할 수 있었으며, 엘라그산의 경우에는 크론병의 개선 효과가 우수함을 볼 수 있었다.
(4) 산화적 스트레스( myeloperoxidase : MPO )억제 확인
상기 실시예 1-5 (4)의 MPO활성수치 측정방법과 동일한 방법으로 실험한 결과, 대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 백혈구 속의 효소인 MPO 활성 증가로 인해 정상대조군에 비해 약 362% 증가한 것을 볼 수 있었다. (도 17)
대조약 투여군(5-ASA)의 경우 대장염 유발군에 비해 유의한 감소가 없었고, 그에 반면 데히드로코스투스락톤을 처리한 경우는 10㎎/㎏ 및 20㎎/㎏ 처리시 각각 약 55.2% 및 15.5% 감소된 MPO 활성수치를 확인할 수 있었다.
엘라그산을 처리한 경우는 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏ 처리시 각각 약 31% 및 25.8% 감소된 MPO 활성수치를 확인할 수 있었다.
이 경우, 데히드로코스투스락톤은 투여량이 증가한 경우 MPO 활성수치 감소율이 오히려 떨어지는 것을 알 수 있었다. 즉, 데히드로코스투스락톤 및 엘라그산은 대조약 투여군 이상의 MPO 활성 감소효과를 보임에 따라 대장염 개선 효과가 뛰어나며, 산화적 스트레스 억제 효과 또한 우수한 것을 알 수 있었다.
구분 대장길이(cm) DAI Colon weight per colon length(mg/cm) MPO
정상 대조군 9.8 - 32 160
대장염 유발군 8.2 11.2 88 580
대조약 투여군 8.8 7.8 72 580
엘라그산(10mg/kg) 9.2 5.2 52 400
엘라그산(100mg/kg) 9.8 3.6 46 330
데히드로코스투스락톤(10mg/kg) 9.4 8.4 74 260
데히드로코스투스락톤(50mg/kg) 10 7.4 62 490
실시예 2. 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물의 염증성장질환 개선효과 확인
2-1. DSS 동물 모델에서의 대장염 개선 효과 확인
(1) 질병활성도 확인
질병활성도는 체중감소, 대변의 농도, 출혈정도의 외관 상태를 관찰하여 나타낸 결과로 대장염 유발군의 경우 약 1%의 체중 감소가 일어났으며 대조약 투여군에서 약 2%, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 약 0.5~3%의 체중 감소가 일어나는 것을 확인 하였다.
대변의 농도, 출혈 정도의 경우 대장염 유발군에서 무른 대변과 설사가 빈번하게 발생 하였고 대장 조직의 심한 출혈이 관찰 되었으나 대조약 투여군에서는 무른 대변의 상태, 잠재적인 출혈이 관찰 되어 대장염 유발군에 비해 개선 되는 것을 확인 되었다.
데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 약간 물러진 대변만이 관찰 되었고 잠재적인 출혈만 확인 되어 대변의 상태 및 출혈이 개선됨을 확인 하였으며 대조약 투여군에 비하여 개선 효과가 큰 것을 알 수 있었다.
위의 항목을 토대로 종합적으로 질병활성도를 평가한 결과 대조약 투여군 중 5-ASA 200mg/kg 및 Pre(prednisolone) 5mg/kg의 경우 대장염 유발군보다 개선효과를 보였다. 이에 비해 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 200mg/kg부터 600mg/kg까지 투여된 양에 비례하여 질병활성도의 감소효과를 보였으나, 800mg/kg을 처리한 경우에는 오히려 질병활성도가 증가함을 볼 수 있었다. 따라서 상기 유효물질을 포함하는 조성물을 200mg/kg이상 투여시에는 대조약 투여군 이상의 대장염 개선효과를 보임을 알 수 있었다. (도 18)
(2) 산화적 스트레스 억제 확인
상기 실시예 1-5 (4)의 MPO활성수치 측정방법과 동일한 방법으로 실험한 결과, 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 200mg/kg 투여시 대장염 유발군보다 감소하였고, 대조약 투여군 중 Pre(prednisolone)의 경우에는 5mg/kg 이상 투여할 경우 5-ASA 보다 감소율이 컸다. 또한, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 200mg/kg부터 400mg/kg까지 투여된 양에 비례하여 MPO 활성수치의 감소효과를 보였으나, 600mg/kg 이상을 처리한 경우에는 오히려 활성도가 증가함을 볼 수 있었다.
그러나 200mg/kg 이상 처리할 경우 모두 대조약 투여군 이상의 개선효과를 보임을 알 수 있었다.
즉, 세가지 유효물질을 모두 포함한 조성물의 경우에도 산화적 스트레스 억제 효과 및 대장염의 개선 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. (도 19)
(3) 장 길이당 장의 무게 확인
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 부종 및 염증세포 침착으로 인해 장의 무게가 150% 증가한 것을 볼 수 있었고, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 감소율은 크지 않았으며 그 투여량에 따라서도 큰 변화는 없었다.(도 20)
그러나 상기 조성물을 처리한 경우 투여량과는 상관 없이 대조약 투여군(5-ASA 및 Pre)과 동등 또는 그 이상의 대장염 개선 효과는 확인할 수 있었다.
(4) 염증관련 사이토카인(IL-6, TNF-α)발현 저해 효과 확인
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 염증반응으로 IL-6의 발현양이 약 2배 정도 증가한 것을 볼 수 있었고, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우에는 200mg/kg까지는 대조약 처리한 경우와(5-ASA 및 Pre 5mg/kg처리한 경우) 유사하게 발현 감소를 보였으나, 400mg/kg이상 투여 시 IL-6의 발현양은 투여양에 비례하여 감소되었다. 다만 800mg/kg 투여시에는 발현양이 오히려 증가하였으나 200mg/kg이상 투여할 경우에는 대조약보다 모두 IL-6의 발현양이 감소되었다. (도 21)
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 염증반응으로 TNF-α의 발현양이 약 2.5배 정도 증가한 것을 볼 수 있었고, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우에는 200mg/kg까지는 대조약 처리한 경우와(5-ASA 및 Pre 5mg/kg처리한 경우) 유사하게 발현 감소를 보였으나, 400mg/kg이상 투여 시 TNF-α의 발현양은 투여양에 비례하여 감소되었다. 800mg/kg 투여시에는 발현양이 오히려 증가하였으나 대조약과 동등 정도의 수준이었다. (도 22)
즉, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물의 염증관련 사이토카인의 발현 저해 효과는 600mg/kg까지는 투여양에 비례하여 발현 저해 효과를 보이며, 800mg/kg 이상 투여시에도 대조약을 투여한 경우와 동등 또는 그 이상의 효과를 보여 항염효과를 확인할 수 있었다.
2-2. TNBS 동물 모델에서의 크론병 개선효과 확인
(1) 질병활성도( DAI )
질병활성도는 체중감소, 대변의 농도, 출혈정도의 외관 상태를 관찰하여 나타낸 결과로 대장염 유발군의 경우 약 24%의 체중 감소가 일어났으며 대조약 투여군에서 약 11%, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 대장의 부종, 변비 정도의 경우 대장염 유발군에서 대장의 심한 부종 및 염증으로 배변이 원활하지 않아 변비가 빈번하게 발생 하였으나 대조약 투여군에서 변비 및 대장의 부종이 줄어 드는 것이 관찰 되어 대장염 유발군에 비해 개선 되는 것을 확인 되었다.
데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 군에서는 대장의 부종이 줄어 들어 대변 상태가 회복 되어 가는 것을 관찰 하였으며 대조약 대비 대변의 상태 및 부종이 개선됨을 확인 하였다.
위의 항목을 토대로 종합적으로 질병활성도를 평가한 결과 대조약 투여군(5-ASA)의 경우 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물 200mg/kg 투여한 경우와 유사하게 질병활성도 감소를 보였고,
400mg/kg부터 600mg/kg까지 투여된 양에 비례하여 질병활성도의 감소효과를 보였으나, 800mg/kg을 처리한 경우에는 오히려 질병활성도가 증가함을 볼 수 있었다. 상기 유효물질을 포함하는 조성물을 200mg/kg이상 투여할 경우에는 대조약 Pre 10mg/kg을 처리한 군 외에는 대조약 이상의 대장염 개선효과를 보임을 알 수 있었다. (도 23)
(2) 산화적 스트레스 억제 확인
상기 실시예 1-5 (4)의 MPO활성수치 측정방법과 동일한 방법으로 실험한 결과, 대장염 유발군의 경우에는 정상군 대비 약 2배 증가율을 보였으나, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 200mg/kg부터 600mg/kg까지 투여된 양에 비례하여 MPO 활성수치의 감소효과를 보였다.
대조약 투여군(5-ASA)의 경우 상기 조성물을 200mg/kg 처리한 경우 및 대조약 투여군(Pre 5, 10 mg/kg 처리한 경우) 보다 큰 MPO 활성수치의 감소효과를 보였으나 그 차이는 크지 않았다.
즉, 세가지 유효물질을 모두 포함한 조성물의 경우에도 산화적 스트레스 억제 효과 및 대장염의 개선 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. (도 24)
(3) 장 길이당 장의 무게 확인
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 부종 및 염증세포 침착으로 인해 장의 무게가 250% 증가한 것을 볼 수 있었고, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우 200~600mg/kg까지는 그 투여양에 비례하여 감소효과를 보였다. (도 25)
즉, 상기 조성물을 처리한 경우 투여량과는 상관없이 대조약 투여군 동등 또는 그 이상의 크론병 개선 효과를 확인할 수 있어 대조약의 대체가능성을 확인할 수 있었다. (다만, 대조약 Pre 10mg/kg 투여한 경우에만 조성물 400mg/kg투여한 경우보다 효과가 좋았음)
(4) 염증관련 사이토카인(IL-6, TNF-α)발현 저해 효과 확인
대장염 유발군의 경우와 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 200mg/kg 처리한 경우까지는 그 수치의 차이가 없어, 대조약보다 IL-6 발현 저해 효과가 떨어진다는 것을 알 수 있었다. 그러나 400mg/kg이상 처리한 경우에는 모두 대조약보다 발현 저해 효과가 크며, 특히 600mg/kg까지는 투여양에 비례하여 발현양이 감소됨을 보였다. (도 26)
대장염 유발군의 경우 정상대조군에 비해 염증반응으로 TNF-α의 발현양이 증가한 것을 볼 수 있었고, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물을 처리한 경우에는 200mg/kg는 대조약 처리한 경우(5-ASA)와 400mg/kg 투여 시 대조약(Pre 10mg/kg) 과 발현양이 유사하였으나 600 mg/kg 투여시 TNF-α의 발현양은 대조군보다 효과가 좋았다. 또한, 조성물 투여시 투여양에 비례하여 감소되었다. 800mg/kg 투여시에는 발현양이 오히려 증가하였으나 대조약보다는 낮은 수준이었다. (도 27)
즉, 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물의 염증관련 사이토카인의 발현 저해 효과는 600mg/kg까지는 투여양에 비례하여 발현 저해 효과를 보이며, 대조약을 투여한 경우와 동등 또는 그 이상의 효과를 보여 항염효과를 확인할 수 있었다.
실시예 3. 대조약과 데히드로코스투스락톤 ; 엘라그산;및 6- 진저놀을 함량별로 포함하는 조성물간의 염증성장질환 개선효과 비교
염증성 대장염 동물모델에서 기존에 염증성장질환에 사용되었던 대조약인 5-ASA 및 Tofacitinib과 데히드로코스투스락톤; 엘라그산; 및 6-진저놀을 포함하는 조성물 간의 개선효과를 비교하였다. 특히 투여되는 조성물은 각 유효물질의 함량을 달리하여 그 효과를 비교하여 도 28 내지 33에 도시하였다.
이때, 5-ASA: 200mg/kg ; Tofacitinib : 10mg/kg ; 조성물 (sample 1~3): 400mg/kg을 기준으로 실험을 진행하였다.
또한 각 조성물(sample 1~3)에 포함된 각 유효물질의 함량은 하기 표 10에 도시하였다.
조성물별 각 유효물질 함량(mg) 데히드로코스투스락톤(DCL) 엘라그산 6-진저놀
sample 1 2.64 4.24 0.4
sample 2 3.96 7.4 0.52
sample 3 6.16 10.04 0.76
3-1. DSS 동물 모델에서의 궤양성 대장염 개선 효과 비교
질병활성도(DAI)의 경우 각 조성물(sample 1~3)의 경우 모두 대조약 5-ASA 및 Tofacitinib 보다 감소된 질병활성도를 보였다. 또한, 각 유효물질의 함량의 차이와는 관계 없이 유사한 질병 활성도 수치를 보여 데히드로코스투스락톤; 엘라그산;및 6-진저놀을 포함하는 조성물의 경우에는 대조약보다 뛰어난 궤양성 대장염의 외관상 개선 효과를 보임을 알 수 있었다. (도 28)
장 길이별 무게의 경우 대조약 및 조성물의 경우 모두 유사한 수치를 보였으나, 조성물의 경우 각 유효물질의 함량이 증가할 때 마다 감소율은 점차 증가하는 것을 볼 수 있었다. (도 29)
즉, 각 유효물질의 함량이 증가시에는 장의 부종 및 염증 증상의 개선효과가 증가함을 알 수 있다.
그러나 장의 길이는 대조약보다 증가하며 유효물질의 함량이 증가될 수록 장의 길이도 증가되는 결과를 보였다. (도 30)
궤양성 대장염 동물모델에서 대조약과의 비교 결과 장의 길이 유지효과 외에는 모두 대조약보다 개선효과가 동등 또는 그 이상임을 알 수 있었고, 특히 장의 길이별 무게의 경우에는 유효물질의 함량이 증가할수록 개선효과가 큰 것을 볼 수 있었다.
3-2. TNBS 동물 모델에서의 대장염 개선 효과 비교
질병활성도(DAI)의 경우 각 조성물(sample 1~3)의 경우 대조약 중 5-ASA 보다 감소된 질병활성도를 보였으나, Tofacitinib 보다 뛰어난 효과를 보기 위해서는 조성물 샘플 2와 동등 또는 그 이상의 유효물질의 함량을 가져야 한다는 것을 알 수 있다. 또한, 질병활성도 측면에서는 각 조성물의 유효물질 함량이 증가할 수록 그에 비례하여 질병활성도 역시 감소함을 뚜렷하게 볼 수 있었다. (도 31)
장 길이별 무게의 경우 대조약 중 5-ASA의 경우 가장 감소율이 작았고, 본 발명의 조성물의 경우는 Tofacitinib 보다 그 효과가 동등 또는 이상이였다. 또한, 조성물의 경우 각 유효물질의 함량이 증가할 수 록 개선 효과가 증가됨을 볼 수 있었다. (도 32)
즉, 궤양성 대장염 동물모델과 같이 각 유효물질의 함량이 증가시에는 대장염의 개선효과가 증가함을 알 수 있다.
그러나 장의 길이는 대조약보다 증가하며 유효물질의 함량이 증가될 수록 장의 길이도 증가되는 결과를 보였다. (도 33)
크론병 동물모델에서 대조약과의 비교 결과 장의 길이 유지효과 외에는 모두 대조약보다 개선효과가 동등 또는 그 이상임을 알 수 있었고, 특히 장의 길이별 무게의 경우에는 유효물질의 함량이 증가할수록 개선효과가 큰 것을 볼 수 있었다.

Claims (12)

  1. 데히드로코스투스락톤(dehydrocostus lactone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    엘라그산(ellagic acid) 및 6-진저놀(6-gingerol)중 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물은 데히드로코스투스 락톤: 엘라그산: 6-진저놀 = 6 내지 16: 10 내지 26: 0.5 내지 2의 비율을 가지는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 염증관련 단백질의 발현을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 염증관련 단백질은 TNF-α, IFN-γ, TLR-4, iNOS, COX-2, IL-6 및 IL-10 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 대장 길이를 정상상태와 같이 유지시키는 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 염증성장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 체중감소, 부종, 혈변, 변비 및 설사 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 개선시키는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 장의 상피세포의 단핵구 부착능을 억제 시키는 것을 특징으로 하는 염증성장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 MPO(myeloperoxidase)의 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 데히드로코스투스락톤(dehydrocostus lactone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제 11항에 있어서,
    엘라그산(ellagic acid) 및 6-진저놀(6-gingerol)중 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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