KR20200043150A - 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 괭생이모자반(Sargassum horneri)의 기관 또는 부분으로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 대식세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서, 면역반응을 유도하는 NO 및 사이토카인의 생성량을 대폭 증폭시키므로 면역증강 효과가 뛰어나다.

Description

괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물{Composition for enhancing immunity comprising extract of Sargassum horneri as an active ingredient}
본 발명은 면역증강 활성을 갖는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기 또는 매개하거나 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 국내뿐만 아니라, 전 세계적으로 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다.
이러한 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인, 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인, 독소·약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품, 알레르기, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.
한편, 괭생이모자반(Sargassum horneri)은 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류로 우리나라 동남해안 및 일본의 전 연안에서 서식하고 있으며, 동물의 사료로 많이 사용되고 있다. 괭생이모자반에 대한 현재까지의 연구를 살펴보면, 괭생이모자반 추출물이 골다공증을 방지하는 기능이 있고(Yakugaku Zasshi 2006, 126, 1117-1137), 혈액응고를 방지하는 효과가 있다고 보고되었다(Bioresour. Technol, 2007, 98, 1711-1716). 또한, 괭생이모자반의 열수 추출물이 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus type 1)의 억제 효과가 있음이 보고되었다(Cham Pharm. Bull. 2001. 49, 484-485; Biol, Pharm. Bull. 1998, 21, 730-734).
그러나, 아직까지 면역관련 질환과 관련된 실질적인 연구는 진행되고 있지 않으며, 연구결과 역시 보고된 바 없다. 또한, 관련 선행기술들을 살펴보더라도 괭생이모자반 추출물을 이용한 대부분의 기술들이 화장료 조성물에 치중되어 있는 실정임을 볼 수 있다.
이에 본 발명자들은 괭생이모자반 추출물로부터 면역관련 질환 효능을 확인하고자 예의 연구한 결과, 괭생이모자반 추출물이 NO 분비능과 사이토카인 분비 유도능이 우수하고 면역세포에서의 세포생존율이 높음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 등록특허 제10-1772494호(2017.08.23. 괭생이모자반 추출물을 포함하는 미백용 조성물 및 그 제조방법) 한국 공개특허 제10-2009-0027387호(2009.03.17. 괭생이모자반 추출물을 포함하는 피부외용제 조성물) 한국 공개특허 제10-2015-0062625호(2015.06.08. 넓패, 꼬물꼬시래기, 참가죽그물바탕말 및 괭생이모자반의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물)
본 발명은 대식세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서, 면역반응을 유도하는 NO 및 사이토카인의 생성량을 대폭 증폭시켜 면역증강 효과가 뛰어난 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공함에 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 과제 해결 수단 구성은,
괭생이모자반(Sargassum horneri)의 기관 또는 부분으로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 특징으로 한다.
일 실시예로서, 상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계;
c) 정제수에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 80 - 100℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출액을 수득하는 단계;
d) 상기 c)단계의 추출액을 50 - 60㎛의 여과기로 여과 후, 여과하여 수득한 여액을 고형분 함량이 18 - 22% brix가 될 때까지 농축하여 농축물을 수득하는 단계;
e) 상기 d)단계의 농축물을 90 - 100℃의 온도로 50 - 70분간 살균처리하는 단계; 및
f) 상기 e)단계에서 살균처리된 농축물에 전체 중량 대비 덱스트린(dextrin) 20 - 40중량%를 첨가한 후, 분무건조하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
다른 실시예로서, 상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계;
c) 발효주정에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 70 - 90℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및
d) 상기 c)단계의 추출물을 70 - 90℃의 온도하에서 감압농축기를 통해 상기 추출물 전체 부피 대비 2 - 4%의 부피로 감압농축한 다음 영하 70℃ 이하의 온도에서 분무건조하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
또 다른 실시예로서, 상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 1 - 5㎜ 입경으로 분쇄하여 괭생이모자반 분말을 수득하는 단계;
c) 상기 b)단계의 괭생이모자반 분말을 초임계유체 추출기에 투입하고, 45 - 50℃의 온도로 300 - 400bar의 압력하에서 250 - 300분 동안 추출하여 초임계 추출물을 수득하는 단계; 및
d) 상기 c)단계의 초임계 추출물을 감압농축기를 이용하여 45 - 55℃의 온도에서 농축하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물은,
대식세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서, 면역반응을 유도하는 NO 및 사이토카인의 생성량을 대폭 증폭시키므로 면역증강 효과가 뛰어나다.
또한, 식품 조성물, 약학 조성물, 건강기능식품 등으로 다양하게 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 처리농도에 따른 면역(대식)세포의 생존율을 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 처리농도에 따른 면역(대식)세포의 NO 분비 유도 면역활성 및 세포내 iNOS 발현을 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 처리농도에 따른 면역(대식)세포의 사이토카인(TNF-α, IL-6) 분비 유도 면역활성을 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 처리농도에 따른 면역(비장)세포의 생존율을 나타낸 그래프.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 처리농도에 따른 면역(비장)세포의 사이토카인(IL-2, IFN-γ) 분비 유도 면역활성을 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물을 투여한 마우스의 면역(비장)세포 증식능을 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 괭생이모자반 추출물을 투여한 마우스의 면역(비장)세포의 사이토카인(IL-2, IFN-γ) 유도 분비 면역활성을 나타낸 그래프.
이하, 본 발명에 따른 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명은, 괭생이모자반(Sargassum horneri)의 기관 또는 부분으로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
상기 괭생이모자반은 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류로 자연에서 채취하여 이용할 수 있고, 양식하여 이용할 수도 있다. 또한, 괭생이모자반은 신선한 상태로 이용할 수도 있으며, 자연건조, 열풍건조 및 동결건조 등을 한 상태로 보관하여 이용할 수도 있다.
한편, 상기 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물은, 정제, 시럽, 액상, 캡슐, 에어로졸, 환제, 분말, 과립 및 음료 중에서 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 이루어지며, 식품용 조성물, 건강기능식품 첨가 조성물, 약학 조성물 등으로 사용될 수 있다.
일례로, 상기 조성물을 식품용 조성물로 제조할 경우, 각종 식품류, 캔디, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등의 형태일 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료 등 다양한 형태로 제공될 수 있다.
또한, 상기 조성물을 약학 조성물로 제조할 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 괭생이모자반 추출물은, a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계; b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계; c) 정제수에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 80 - 100℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출액을 수득하는 단계; d) 상기 c)단계의 추출액을 50 - 60㎛의 여과기로 여과 후, 여과하여 수득한 여액을 고형물 함량이 18 - 22% brix가 될 때까지 농축하여 농축물을 수득하는 단계; e) 상기 d)단계의 농축물을 90 - 100℃의 온도로 50 - 70분간 살균처리하는 단계; 및 f) 상기 e)단계에서 살균처리된 농축물에 전체 중량 대비 덱스트린(dextrin) 20 - 40중량%를 첨가한 후, 분무건조하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 a)단계에서는 괭생이모자반에 잔존하는 협잡물 등이 제거되도록 세척한 후, 세척된 괭생이모자반을 자숙시킨다. 본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 상기 자숙은 통상의 자숙탱크에 넣어 열수로 자숙시킬 수 있다. 이때, 상기 괭생이모자반을 자숙하는 것은 살균 및 소독을 하기 위함이다.
상기 b)단계에서는 a)단계를 거쳐 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 열풍건조 또는 자연건조한 다음, 건조된 괭생이모자반을 길이방향으로 바람직하게는 50 내지 150㎜, 보다 바람직하게는 80 내지 120㎜ 길이로 절단한다.
상기 c)단계에서는 정제수에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을, 바람직하게는 15:1 내지 22:1, 보다 바람직하게는 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 바람직하게는 70 내지 100℃, 보다 바람직하게는 80 내지 100℃의 온도로, 바람직하게는 200 내지 280분, 보다 바람직하게는 220 내지 260분간 추출하여 추출액을 수득한다.
추가의 실시예로서, 상기 온도조건에 의해 정제수의 부피가 대략 절반정도로 줄어들 때, 괭생이모자반과 상등액을 분리한 다음, 다시 상기 괭생이모자반에 정제수를 가하여 상기의 과정을 반복할 수 있다. 이로써 유효성분의 회수율을 더욱 높일 수 있는 이점이 발생하는 것이다.
상기 d)단계에서는 c)단계에서 수득한 추출액을 바람직하게는 40 내지 80㎛, 보다 바람직하게는 50 내지 60㎛의 여과기로 여과 후, 여과하여 수득한 여액을 고형물 함량이 바람직하게는 16 내지 24% brix, 보다 바람직하게는 18 내지 22% brix가 될 때까지 농축하여 농축물을 수득한다.
상기 e)단계에서는 d)단계에서 수득한 농축물을 바람직하게는 80 내지 100℃, 보다 바람직하게는 90 내지 100℃의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80분, 보다 바람직하게는 50 내지 70분간 살균처리한다.
상기 f)단계에서는 e)단계에서 살균처리된 농축물에 전체 중량 대비 덱스트린을 바람직하게는 10 내지 50중량%, 보다 바람직하게는 20 내지 40중량%를 첨가한 후, 분무건조함으로써 본 발명에 따른 괭생이모자반 추출물을 최종 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 다른 실시예로서, 상기 괭생이모자반 추출물은, a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계; b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계; c) 발효주정에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 70 - 90℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및 d) 상기 c)단계의 추출물을 70 - 90℃의 온도하에서 감압농축기를 통해 상기 추출물 전체 부피 대비 2 - 4%의 부피로 감압농축한 다음 영하 70℃ 이하의 온도에서 분무건조하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 a)단계에서는 괭생이모자반에 잔존하는 협잡물 등이 제거되도록 세척한 후, 세척된 괭생이모자반을 자숙시킨다. 본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 상기 자숙은 통상의 자숙탱크에 넣어 열수로 자숙시킬 수 있다.
상기 b)단계에서는 a)단계를 거쳐 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 열풍건조 또는 자연건조한 다음, 건조된 괭생이모자반을 길이방향으로 바람직하게는 50 내지 150㎜, 보다 바람직하게는 80 내지 120㎜ 길이로 절단한다.
상기 c)단계에서는 발효주정에 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 바람직하게는 15:1 내지 25:1, 보다 바람직하게는 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 바람직하게는 60 내지 100℃, 보다 바람직하게는 70 내지 90℃의 온도로, 바람직하게는 200 내지 280분, 보다 바람직하게는 220 내지 260분간 추출하여 추출물을 수득한다.
상기 d)단계에서는 c)단계에서 수득한 추출물을 바람직하게는 60 내지 100℃, 보다 바람직하게는 70 내지 90℃의 온도하에서 감압농축기를 통해 바람직하게는 상기 추출물 전체 부피 대비 1 내지 5%, 보다 바람직하게는 2 내지 4%의의 부피로 감압농축한 다음 영하 70℃ 이하의 온도에서 분무건조함으로써, 본 발명에 따른 괭생이모자반 추출물을 최종 제조할 수 있다.
추가의 실시예로서, 상기 d)단계 이후, 동결건조된 추출물을 분쇄하여 분말화한 다음, 증류수 100중량부에 대하여, 상기 추출물을 분쇄하여 된 분말을 중량 대비 10 내지 80중량부로 포함되도록 희석하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
또한, 상기 동결건조의 일 구현예로서, 진공 동결건조장치를 사용할 수 있으며, 영하 70℃ 이하의 온도에서 건조함으로써 괭생이모자반의 유용성분이 함유된 추출물을 분말 형태로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 분말 형태는 분산성이 높을 뿐 아니라, 경구 투여시 체내에 흡수율이 보다 높아질 수 있고, 외형제로 사용하는 경우 피부장벽에 쉽게 침투될 수 있는 장점을 가진다.
한편, 본 발명의 바람직한 또 다른 실시예로서, 상기 괭생이모자반 추출물은, a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계; b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 1 - 5㎜ 입경으로 분쇄하여 괭생이모자반 분말을 수득하는 단계; c) 상기 b)단계의 괭생이모자반 분말을 초임계유체 추출기에 투입하고, 45 - 50℃의 온도로 300 - 400bar의 압력하에서 250 - 300분 동안 추출하여 초임계 추출물을 수득하는 단계; 및 d) 상기 c)단계의 초임계 추출물을 감압농축기를 이용하여 45 - 55℃의 온도에서 농축하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 a)단계에서는 괭생이모자반에 잔존하는 협잡물 등이 제거되도록 세척한 후, 세척된 괭생이모자반을 자숙시킨다. 본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 상기 자숙은 통상의 자숙탱크에 넣어 열수로 자숙시킬 수 있다.
상기 b)단계에서는 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 바람직하게는 0.5 내지 10㎜, 보다 바람직하게는 1 내지 5㎜ 입경으로 분쇄하여 괭생이모자반 분말을 수득한다.
상기 c)단계에서는 b)단계에서 수득한 괭생이모자반 분말을 통상의 초임계유체 추출기에 투입하고, 바람직하게는 40 내지 55℃, 보다 바람직하게는 45 내지 50℃의 온도로, 바람직하게는 250 내지 500bar, 보다 바람직하게는 300 내지 400bar의 압력하에서, 바람직하게는 200 내지 400분, 보다 바람직하게는 250 내지 300분 동안 추출하여 초임계 추출물을 수득한다.
여기서, 상기 초임계유체로서 이산화탄소(CO2)를, 초임계 추출시 보조용매로서 발효주정을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 초임계유체 보조용매의 공급 속도, 즉 유속은 각각 3ℓ/min, 0.3ℓ/min인 것이 바람직하다.
상기 d)단계에서는 c)단계에서 수득한 초임계 추출물을 감압농축기를 이용하여 바람직하게는 40 내지 60℃, 보다 바람직하게는 45 내지 55℃의 온도에서 농축함으로써, 본 발명에 따른 괭생이모자반 추출물을 최종 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성에 따른 효과가 더욱 명확해지도록 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다.
[실시예 1] 열수 추출물의 제조
열수 추출을 위한 괭생이모자반 원물은 세척 및 자숙과정을 거쳐 수분함량이 10% 이내로 1차 가공된 건조물의 공시재료를 100㎜ 수준으로 절단(세절)한 다음, 해조류 건물의 함수를 고려하여 시료 1㎏에 원물 대비 20배에 상당한 정제수 20ℓ를 가하여 온도 90℃에서 240분 동안 추출하였다. 괭생이모자반 열수 추출물은 55㎛의 백필터(bag filter) 여과 후 감압농축기(evaporator, CEP-LABO, Okawahara, Japan)를 이용하여 고형분 함량이 20.0% brix가 되도록 농축하였고, 이후 95℃에서 60분간 살균처리한 다음 고형분 함량 대비 덱스트린(DE 10) 30%를 첨가하여 분무건조(spray dryer, HKC-100-DJ, Niro, 덴마크)한 것을 괭생이모자반 열수 추출물로 하였다. 이때, 상기 열수 추출물은 암갈색 색상을 띄는 분말 성상으로써, 상온에서 보관하며 실험을 진행하였다.
[실시예 2] 알코올 추출물의 제조
괭생이모자반의 알코올 추출은 열수 추출에서 사용한 원물과 동일한 시료를 이용하였고, 50% 발효주정을 용매로 하여 시료 1㎏에 용매 20ℓ를 가하여 온도 80℃에서 240분 동안 추출하였다. 이후 괭생이모자반 알코올 추출물은 감압농축기(evaporator, HS-20SP, Hahnshin S&T, 대한민국)를 이용, 80℃의 온도하에서 농축물 부피 3ℓ 수준으로 감압농축한 다음 영하 80℃ 이하에서 동결건조(freeze dryer, OPR-FDT-8650, Operon, 대한민국)한 것을 사용하였다. 이때, 괭생이모자반 알코올 추출물은 암갈색 분말의 성상을 갖는다.
[실시예 3] 초임계 추출물의 제조
괭생이모자반의 유용물질이 함유된 추출물은 초임계 추출법을 이용하였고, 주요 용매는 이산화탄소(CO2)로서 임계압력 73.76bar와 임계온도 30.95℃ 이상으로 액체와 기체의 확산계수와 점도, 밀도와 같은 물리화학적 특성을 모두 갖춘 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide, Sc-CO2)를 사용하였고, 보조용매는 발효주정(fermentation ethanol)을 사용하였다. 괭생이모자반의 초임계 추출법은 이산화탄소 저장조, 냉각 응축기, 고압펌프, 열교환기, 압력조절 밸브, 추출조, 분리조가 듀얼로 구성되어 있으며, 추출물 간의 교차 오염(cross-contamination)을 방지하기 위한 시스템 세척 공정(cleaning in place, CIP)이 가능한 간헐적 연속 회분식 초임계추출 시스템(intermittent sequencing batch type supercritical extract system)을 이용하였다. 상기 초임계추출 시스템에 있어서, 이산화탄소 저장조는 액화 이산화탄소를 용량 500ℓ, 압력 50bar로 보관이 가능하고 고압펌프는 액체 이산화탄소에 일정 압력을 가하고 유지될 수 있도록 하며 열교환기는 고압펌프에 의해 일정 압력이 유지된 액체 이산화탄소에 일정 온도를 가하여 초임계유체 상태를 유지할 수 있도록 한다. 추출조는 용량 400ℓ로서 별도의 추출바스켓에 원물을 투입하고 이를 추출조에 장착함으로써 목적한 물질(extract)의 추출이 가능하고, 압력조절 밸브는 추출조와 분리조 사이에서 초임계 이산화탄소의 압력을 조정할 수 있다. 분리조에서 이산화탄소는 압력조절 밸브에 의해 초임계 상태에서 기체상의 이산화탄소로 전환됨으로서 추출물을 분리 수득할 수 있다. 이후 기체상의 이산화탄소는 응축기를 통과하면서 액화 이산화탄소로 전화되고, 이산화탄소 저장조로 회수하여 재활용(recycling)할 수 있는 시스템으로 구성되어 있다.
한편, 초임계 추출에 사용된 괭생이모자반 원물은 전처리 과정으로 건조, 분쇄를 실시한다. 건조는 수분함량 10% 이하로 열풍건조 하였고, 분쇄는 2㎜의 입자크기로 조분쇄하였다. 괭생이모자반은 전처리된 건조 분쇄 원물 60㎏을 투입하였고 추출은 예비 실험을 통해 추출 수율이 가장 높은 조건으로서 초임계 이산화탄소의 임계압력과 임계온도의 이상 압력 및 온도로서 400bar와 50℃로 설정하고, 추출 보조용매로서 발효주정을 투입하였다. 이산화탄소와 보조용매의 공급은 각각 3ℓ/min과 0.3ℓ/min의 유량으로 설정하였다. 추출공정은 액화 이산화탄소를 등압 후 고압펌프를 이용하여 가압하고 추출조 내부 압력이 400bar까지 도달하면 30분 동안 등압을 유지하였다. 이후 추출 보조용매로서 발효주정을 이산화탄소와 혼합하여 120분 동안 주입하였다. 발효주정 주입 완료 후 120분 동안 이산화탄소만을 공급하여 400bar의 등압을 유지하여 총 270분 동안의 초임계 추출 공정을 통해 괭생이모자반 초임계 추출물을 수득하였다. 이후 감압농축기(evaporator, HS-20SP, Hahnshin S&T, 대한민국)를 이용, 50℃ 온도하에서 발효주정이 함유된 괭생이모자반 초임계 추출물을 완전 농축함으로서 발효주정을 제거한 것을 최종 괭생이모자반 초임계 추출 농축물로 하였다. 이때, 괭생이모자반 초임계 추출 농축물은 암갈색의 농축진액의 성상을 갖으며 암실에서 4℃ 이하로 냉장보관하였다.
[실험예 1] 대식세포 생존율 평가
괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 세포독성 평가는 마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 농도(12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)별 추출물을 처리하고 24시간 후 MTT 방법에 따라 수행되었으며 세포생존율은 무처리구 대비 생존%로 나타내었다.
도 1은 실험예 1에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 추출방법별 대식세포 생존율을 나타낸다. 또한, 도 1에서 "CON"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내고, "LPS"는 대식세포의 mitogen인 lipopolysaccharide 처리구를 나타낸다.
한편, 도 1에 나타낸 바와 같이, 대식세포 생존율을 평가한 결과, 괭생이모자반의 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 처리는 상기 농도(12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)에서 대식세포에 대한 세포독성을 유발하지 않는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 2] 대식세포 NO 분비능 평가
96 well plate에 RAW 264.7 세포를 2×104 cell/well로 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물을 1.5625㎍/㎖, 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖의 농도로 처리하고, 24시간 후 분리된 배양 상등액에서 NO의 함량을 측정하였다. NO의 함량은 분리된 배양 상등액 100㎕에 동량의 Griess(Sigma) 시약을 처리하여 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소의 농도는 sodium nitrite(NaNO2, Sigma)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.
도 2는 실험예 2에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 추출물의 NO 분비 유도능 평가를 나타낸다. 또한, 도 2에서 "CTRL"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내고, "LPS"는 대식세포의 mitogen인 lipopolysaccharide 처리구를 나타낸다.
한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 처리는 상기 농도(1.5625㎍/㎖, 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)에서 대식세포에 대한 NO 분비 유도 면역활성을 나타내었으며, 특히 괭생이모자반 열수 추출물에서 NO 분비 유도 면역활성이 크게 나타났는데, 이는 열수 추출물의 처리가 NO를 형성하는 iNOS 단백질의 발현을 증가시키는 원인 때문인 것으로 판단된다.
[실험예 3] 대식세포 사이토카인 분비능 평가
96 well plate에 RAW 264.7 세포를 2×104 cell/well로 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물을 1.5625㎍/㎖, 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 후 분리된 배양 상등액에서 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 함량을 측정하였다. 사이토카인 함량은 ELISA kit(eBioscience Co., San Diege, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함되어 있는 standard 표준 용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.
도 3은 실험예 3에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 대식세포 사이토카인 분비 유도능 평가를 나타낸다. 또한, 도 3에서 "CTRL"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내고, "LPS"는 대식세포의 mitogen인 lipopolysaccharide 처리구를 나타낸다.
한편, 도 3에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 처리는 상기 농도(1.5625㎍/㎖, 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)에서 대식세포에 대한 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 분비 유도 면역활성을 나타내었으며, 특히 괭생이모자반 열수 추출물에서 사이토카인 분비 유도 면역활성이 가장 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4] 비장세포 생존율 평가
마우스로부터 비장을 적출하여 비장세포를 유리시킨 후, 96 well plate에 2×105 cell/well로 분주하고 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물을 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 후 MTT 방법에 따라 세포 생존율을 측정하였으며, 세포생존율은 무처리구 대비 생존%로 나타내었다.
도 4는 실험예 4에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 추출방법별 비장세포 생존율을 나타낸다. 또한, 도 4에서 "CTRL"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내고, "CON A"는 비장세포의 mitogen인 concanavalin A 처리구를 나타낸다.
한편, 도 4에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 처리는 상기 농도(3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)에서 비장세포에 대한 세포독성을 유발하지 않으며, 열수 추출물 및 알코올 추출물의 처리는 비장세포의 세포 증식능을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 5] 비장세포 사이토카인 분비능 평가
마우스로부터 분리된 비장세포를 48 well plate에 1×106 cell/well로 분주한 후, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물을 3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 후 분리된 배양 상등액에서 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 함량을 측정하였다. 사이토카인 함량은 ELISA kit(eBioscience Co., San Diege, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함되어 있는 standard 표준 용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.
도 5는 실험예 5에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 추출방법별 비장세포에 대한 사이토카인 분비 유도능을 나타낸다. 또한, 도 5에서 "CTRL"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내고, "CON A"는 비장세포의 mitogen인 concanavalin A 처리구를 나타낸다.
한편, 도 5에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 처리는 상기 농도(3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖)에서 비장세포에 대한 사이토카인(IL-2, IFN-γ)의 분비 유도 면역활성을 나타내었으며, 특히 괭생이모자반 열수 추출물에서 사이토카인 분비 유도 면역활성이 가장 크게 나타나는 것을 확인할 수 있고, 알코올 추출물의 처리도 비장세포의 사이토카인의 분비유도 면역활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 6] 동물실험
1. 괭생이모자반 추출물 투여 마우스의 비장세포 증식능 평가
6주령의 BALB/C 마우스를 구입하여 1주간 순화하고, 14일 동안 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물 및 홍삼 추출물 50, 100㎎/㎏ body weight로 투여하고, 15일째 마우스를 희생하여 비장을 분리하였다. 분리된 비장에서 비장세포를 유리하였으며, 유리된 비장세포를 96 well plate에 2×105 cell/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였으며, 각각의 mitogen(CON A, LPS) 첨가에 따른 세포생존율을 비교하였다. 세포생존율은 MTT 방법에 따라 수행되었으며 추출물 무투여구 대비 생존%로 나타내었다.
도 6은 실험예 6의 괭생이모자반 추출물 투여 마우스의 비장세포 증식능 평가에 대한 결과 값으로, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물 및 홍삼 추출물을 50, 100㎎/㎏ body weight로 경구 투여한 마우스의 비장세포 증식능을 나타낸다. 또한, 도 6에서 "CTRL"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타낸다.
한편, 도 6에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 투여는 mitogen(CON A, LPS) 처리구 및 비처리구에서 상기 투여농도(50, 100㎎/㎏ body weight)에서 면역세포인 비장세포의 증식능을 증가시키는 것을 확인할 수 있으며, 비장세포의 증식능은 괭생이모자반 추출물 중 초임계 추출물의 투여군에서 가장 높게 증가되는 것을 확인할 수 있다.
2. 괭생이모자반 추출물 투여 마우스의 비장세포 사이토카인 분비능 평가
14일 동안 괭생이모자반 추출물 및 홍삼 추출물을 투여한 마우스로부터 분리된 비장세포를 48 well plate에 1×106 cell/well로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였으며, 분리된 배양 상등액에서 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 함량을 측정하였다. 사이토카인 함량은 ELISA kit(eBioscience Co., San Diege, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함되어 있는 standard 표준 용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.
도 7은 실험예 6의 괭생이모자반 추출물 투여 마우스의 비장세포 사이토카인 분비능 평가에 대한 결과 값으로, 14일 동안 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물 및 홍삼 추출물을 50, 100㎎/㎏ body weight로 경구 투여한 마우스의 비장세포 사이토카인 유도 분비능을 나타낸다. 또한, 도 7에서 "CON"은 아무것도 처리하지 않은 군을 나타낸다.
한편, 도 7에 나타낸 바와 같이, 괭생이모자반 열수 추출물, 알코올 추출물, 초임계 추출물의 투여는 mitogen(CON A) 처리구 및 비처리구에서 상기 표기된 투여농도(50, 100㎎/㎏ body weight)에서 면역세포인 비장세포의 사이토카인(IL-2, IFN-γ)의 유도 분비 면역활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있으며, 비장세포 사이토카인(IL-2, IFN-γ)의 유도 분비 면역활성은 괭생이모자반 추출물 중 초임계 추출물의 투여군에서 가장 높게 증가되는 것을 확인할 수 있다.

Claims (7)

  1. 괭생이모자반(Sargassum horneri)의 기관 또는 부분으로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
    a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
    b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계;
    c) 정제수에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 80 - 100℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출액을 수득하는 단계;
    d) 상기 c)단계의 추출액을 50 - 60㎛의 여과기로 여과 후, 여과하여 수득한 여액을 고형물 함량이 18 - 22% brix가 될 때까지 농축하여 농축물을 수득하는 단계;
    e) 상기 d)단계의 농축물을 90 - 100℃의 온도로 50 - 70분간 살균처리하는 단계; 및
    f) 상기 e)단계에서 살균처리된 농축물에 전체 중량 대비 덱스트린(dextrin) 20 - 40중량%를 첨가한 후, 분무건조하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
    a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
    b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 80 - 120㎜ 길이로 절단하는 단계;
    c) 발효주정에 상기 b)단계에서 절단된 괭생이모자반을 18:1 내지 22:1의 중량비로 첨가하고, 70 - 90℃의 온도로 220 - 260분간 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및
    d) 상기 c)단계의 추출물을 70 - 90℃의 온도하에서 감압농축기를 통해 상기 추출물 전체 부피 대비 2 - 4%의 부피로 감압농축한 다음 영하 70℃ 이하의 온도에서 분무건조하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 d)단계 이후, 분무건조된 추출물을 분쇄하여 분말화한 다음, 증류수 100중량부에 대하여, 상기 추출물을 분쇄하여 된 분말을 중량 대비 10 - 80중량부로 포함되도록 희석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 괭생이모자반으로부터 추출한 추출물은,
    a) 추출 원물인 괭생이모자반을 세척 및 자숙하는 단계;
    b) 상기 a)단계에서 세척 및 자숙된 괭생이모자반을 수분함량이 10% 이내가 되도록 건조한 다음, 1 - 5㎜ 입경으로 분쇄하여 괭생이모자반 분말을 수득하는 단계;
    c) 상기 b)단계의 괭생이모자반 분말을 초임계유체 추출기에 투입하고, 45 - 50℃의 온도로 300 - 400bar의 압력하에서 250 - 300분 동안 추출하여 초임계 추출물을 수득하는 단계; 및
    d) 상기 c)단계의 초임계 추출물을 감압농축기를 이용하여 45 - 55℃의 온도에서 농축하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 c)단계의 초임계유체로서 이산화탄소(CO2)를 사용함과 동시에 초임계 추출시 보조용매로서 발효주정을 사용하는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 조성물은 정제, 시럽, 액상, 캡슐, 에어로졸, 환제, 분말, 과립 및 음료 중에서 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
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