KR20200036022A - 암에서 다중 돌연변이를 표적화하기 위한 약물 조합(drug combinations for targeting multiple mutations in cancer) - Google Patents
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Abstract
환자에서 암을 치료하는 방법이 개시된다. 본 방법은: (a) NGS 또는 다른 기술에 의해 환자로부터의 암 세포 시료를 스크리닝함으로써 식별된 병원성 유전자를 표적화하는 물질의 세트를 정의하는 단계; (b) 암 세포에서 각각 치료가능한 돌연변이를 함유하는 2개 이상의 표적 유전자를 식별하는 단계; (c) 시험관내 배양 세포 실험을 이용하여, 식별된 2개 이상의 표적 유전자 각각에 대해 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 (순차적으로 또는 동시에 투여된) 1개 이상의 물질의 효능을 시험하는 단계; 및 (d) 환자의 암을 치료하기 위해 이용될 잠재적이고 효과적인 치료적 선택지(options)를 지정하는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2017년 8월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/544,693호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 성명
해당 없음.
분야
본 발명은 암 치료 및, 보다 특히, 다중 암 세포 돌연변이의 식별 및 동시 표적화에 관한 것이다.
도입
고급 분자 기술의 개발과 함께, 맞춤 의학(Personalized Medicine)이 암 진단 및 치료에서 선두로 부상했다(1). 이것은 세포독성, 비-특이적 화학요법에서부터 분자적으로 표적화된 접근법으로의 이동을 야기했다. 고속으로, 대량의 병렬 염기서열분석을 수행하는 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing(NGS)) 기술 개발의 결과로서 이러한 표적화된 접근법이 주로 가능했다.
췌관 선암종(Pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC))은 췌장 내 작은 튜브 또는 관을 피복하는(lining) 세포로부터 발생하는 외분비 췌장 종양이다: PDAC가 단지 약 25%의 5년 생존율을 나타내며 세계적으로 모든 암 관련 사망의 최대 4%를 차지한다는 점에서, 이것은 극히 공격적인 암이다(5).
따라서, 본원의 발명자들은 PDAC를 포함하는 암의 치료를 위한 개선된 접근법을 고안하는 데에 성공하였다. 본 접근법은 암 세포에서 2개 이상의 유전자 또는 경로에서 치료가능한(actionable) 돌연변이를 표적화하는 것과 연관되어 있다.
이에 따라, 다양한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암 세포에서, 각각 병원성(pathogenic) 및 치료가능한 돌연변이를 갖는 2개 이상의 표적 유전자를 식별(identifying)하는 단계(NGS 염기서열분석 또는 다른 방법을 이용하여); (a) 유전자-약물 물질(substance) 상호작용의 목록, 및 (b) 환자의 종양/암 시료에서 식별된 2개 이상의 표적 유전자 각각에 대해 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 1개 이상의 물질을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 시료는 암 세포 또는 암 DNA를 함유하는 세포-무함유 시료일 수 있고 2개 이상의 표적 유전자는 상이한 경로에 맵핑(mapping)된다. 다양한 구현예에서 암은 PDAC일 수 있고 2개 이상의 표적 유전자는 KRAS(또는 미토겐(mitogen)/세포외 신호-관련 키나제(MEK) 경로를 통해 신호 전달하는 유전자) 및 ABL1(또는 티로신 키나제(TK) 경로를 통해 신호 전달하는 유전자)일 수 있다. 억제제는 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK) 억제제, 트라메티닙 및 다중 티로신 키나제 억제제, 레고라페닙일 수 있다).
다양한 다른 구현예에서, 암을 가진 환자를 위한 치료법을 식별하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 환자로부터, 암 세포를 함유하는 시료를 수득하는 단계, (b) NGS 기술을 이용하여 시료를 스크리닝(screening)하는 단계, (c) 암 세포에서 각각 병원성 및 치료가능한 돌연변이를 갖는 2개 이상의 표적 유전자를 식별하는 단계, (d) (c)에서 식별한 2개 이상의 식별된 표적 유전자의 각각에 대하여 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 1개 이상의 물질의 존재 하에서, 암 세포를 배양하는 단계, (e) 1개 이상의 물질의 존재 하에서 암 세포의 생존도(viability)를 측정하는 단계 및 (f) 1개 이상의 표적화된 물질의 존재 하에서 세포의 생존도가 (i) 2개 이상의 물질의 부재 하에서의 생존도보다 낮은지; (ii) 1개 이상의 비-표적화된, 표준 치료(standard-of-care) 물질의 존재 하에서의 생존도보다 낮은지; (iii) 표적화되었지만 비-매칭된(non-matched) 물질(음성 대조군)의 존재 하에서의 생존도보다 낮은지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 2개 이상의 식별된 표적 유전자 각각은 상이한 경로에 영향을 미친다. 다양한 구현예에서, 암은 PDAC이고 2개 이상의 식별된 표적 유전자는 KRAS 및 ABL1이다. 억제제는 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK) 억제제, 트라메티닙 및 티로신 키나제 억제제, 레고라페닙일 수 있다. 비-표적화된 표준 치료 물질은 젬시타빈일 수 있고 표적화되었지만 비-매칭된 물질은 팔보시클립일 수 있다.
다양한 다른 구현예는 암을 가진 환자를 위한 치료법의 식별용 키트에 관한 것이다. 본 키트는: (a) NGS(또는 다른 기술)로 수득한 환자의 암 세포 변이(aberration)의 목록; (b) 유전자-약물 물질 상호작용의 목록; (c) 목록 (a)로부터 식별된 2개 이상의 표적 유전자 각각에 대해 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 1개 이상의 물질; 및 (d) (b)에서의 1개 이상의 물질 각각의 존재 하에서 환자로부터의 암 세포를 배양하기 위한 배지를 포함하며, 1개 이상의 용기(container)에 패키징(packaging)된다. 다양한 구현예에서, 암은 PDAC이고 2개 이상의 식별된 표적 유전자는 KRAS 및 ABL1이다. 억제제는 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK) 억제제, 트라메티닙 및 티로신 키나제 억제제, 레고라페닙일 수 있다.
이들 및 본 교시내용의 다른 특징, 양태 및 이점은 하기의 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 청구범위를 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
당업자는 아래에 기재된 도면이 단지 예시적인 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 본 도면은 어떠한 방식으로든 본 교시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1. 본 도면은 (A) 젬시타빈, (B) 트라메티닙, (C) 레고라페닙, 또는 (D) 팔보시클립 중 어느 하나의 증가하는 농도로 처리한 CAPAN2 세포의 그래프를 나타내는, CAPAN2 세포 생존에 대한 단일요법의 효과를 예시하며, 이때 검정색 원(각 그래프에서 하단 곡선)은 약물 처리이고 빨간색(칼라 버전에서) 원(각 그래프에서 상단 곡선)은 연속 희석된 약물 내 DMSO의 백분율과 동등한 농도로 DMSO-처리된 것으로, 여기서 약물에 노출되고 48시간 후에, 젬시타빈(B)의 경우 1 mM만큼 높은 농도는 세포사(cell death)를 유도하는 데에 거의 효과가 없는 반면에, 트라메티닙(B) 및 레고라페닙(C)의 매칭된 단일요법 둘 다는 세포 생존에 유의적인 부작용을 유도하며, 여기서 (D) 팔보시클립은 심지어 더 높은 농도에서도 세포 생존에 거의 효과를 나타내지 않는 것으로 발견되었다. 약물의 농도는 μM 농도의 log10(예를 들어, 1000 μM = 3.00)으로 나타낸다(평균±SD; N≥3).
도 2. 본 도면은 매칭된 조합 요법의 효과를 예시한다. (A) 레고라페닙(파란색(칼라 버전에서) 원), 트라메티닙(빨간색(칼라 버전에서) 삼각형), 또는 레고라페닙 및 트라메티닙의 1:1 조합(보라색(칼라 버전에서) 사각형) 중 각각의 연속적으로 증가하는 농도로 48시간 동안 처리된 CAPAN2 세포의 생존 그래프. - 검은색 상단 선은 DMSO-처리이며 여기서 2개 약물의 1:1 조합으로 처리된 이후의 세포 생존 그래프는, 증가된 세포 생존 영역을 둘러싼 유의적으로 감소된 세포 생존의 2개의 구별된 영역을 갖는 2상(biphasic) 유형의 곡선을 나타내었으며 여기서 대시(dash) 기호로 된 상자들 사이의 강조된 영역(음영 처리된 상자)은 잠재적인 호르메시스(hormesis)의 영역을 나타내고(B-C) 여기서 3개 바아(bar)의 각각의 세트(set)는 좌측 상에 레고라페닙, 중간에 트라메티닙, 및 우측 상에 레고라페닙 및 트라메티닙을 묘사하며, 강조된 영역(대시 기호로 된 상자들로 둘러싸인)에서의 세포사가 A에 나타나 있다.
도 3. 본 도면은 (A) 레고라페닙(파란색(칼라 버전에서) 원), 트라메티닙(빨간색(칼라 버전에서) 삼각형), 또는 레고라페닙 및 트라메티닙의 2:1 조합(보라색(칼라 버전에서) 사각형) 중 각각의 연속적으로 증가하는 농도로 48시간 동안 처리된 CAPAN2 세포의 생존 그래프를 나타내는 매칭된 조합 요법의 효과를 예시한다 - 검은색 선은 DMSO-처리이며 여기서 2개 약물의 2:1 조합으로 처리된 이후의 세포 생존 그래프는 증가된 세포 생존 영역을 둘러싼 유의적으로 감소된 세포 생존의 2개의 구별된 영역을 갖는 2상 유형의 곡선을 나타내었다. 대시 기호로 된 상자들 사이의 강조된 영역(음영 처리된 상자)은 잠재적인 호르메시스의 영역을 나타내고(B-C) 여기서 3개 바아의 각각의 세트는 좌측 상에 레고라페닙, 중간에 트라메티닙, 및 우측 상에 레고라페닙 및 트라메티닙을 묘사하며, 강조된 영역(대시 기호로 된 상자들로 둘러싸인)에서의 세포사가 A에 나타나 있다.
도 4. 본 도면은 CAPAN2 세포에서 레고라페닙과 트라메티닙 사이의 상승 작용적 효과를 예시한다 -- 레고라페닙 대 트라메티닙의 상이한 비율에 대해 생성된 CI 값을 나타내는 조합 지수(CI) 분석. 추세선은 임의의 주어진 효과에서의 CI 값을 나타내며, 기호는 실제 데이터 점수에서 유래된 CI 값을 의미한다. CI = 1, 상가 작용(additivity); CI > 1, 길항 작용; CI < 1, 상승 작용. 1:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 파란색)은 EC60에서 가장 높은 값을 갖고, 10:1에서 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 초록색)은 EC60에서 두 번째로 높은 값을 갖고, 5:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 빨간색)은 EC60에서 세 번째로 높은 값을 가지며, 2:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(컬러 버전에서 노란색)은 EC60에서 네 번째로 높은 값을 갖는다.
도 5. 본 도면은 CAPAN2 세포에서 레고라페닙과 트라메티닙 사이의 상승 작용적 효과를 예시한다 - 아이소볼로그래픽(Isobolographic) 분석. (AB) 1:1 및 2:1 조합 비율에서 레고라페닙 및 트라메티닙의 상승 작용적 효과를 나타내는 아이소볼로그램으로, 여기서 대각선의 칼라 선은 상가 작용을 나타내며, 칼라 부호는 20%(ED80 - 파란색 (칼라 버전에서) 하단 선), 25%(ED75 - 노란색(칼라 버전에서) 중간 선), 또는 40%(ED60 - 빨간색(칼라 버전에서) 상단 선) CAPAN2 세포사를 각각 달성하기 위한 용량 요건을 나타내고, 여기서 상가 작용 선 아래의 데이터 지점은 상승 작용을, 위의 데이터 지점은 길항 작용을 의미한다.
도 6. 정상적인 KRAS 세포간 신호전달의 개요. 성장 인자(성장 인자로 표지된 삼각형; 칼라 버전에서 빨간색/분홍색)가 이의 수용체의 세포외 부분(성장 인자 수용체로 표지된, 원형질 막을 관통하는 Y-형태의 구조; 칼라 버전에서 검은색과 파란색)에 결합하면, RAS(KRAS, NRAS, 또는 HRAS)의 활성화로 이어지는 일련의 소분자(small molecule) 중간체(원으로 그려짐(칼라 버전에서 초록색))를 통한 하류(downstream) 신호전달 사건이 개시되어 그후에 MEK1/2 및 ERK1/2를 이어서 활성화시키는 RAF(BRAF, CRAF)가 활성화되어 전사 및 세포 생존 및 증식을 증가시킨다.
도 7. 정상적인 ABL 신호전달의 개요(B). ABL은 성장 인자(삼각형; 칼라 버전에서 보라색), 케모카인(정사각형; 칼라 버전에서 파란색) 및 인테그린 신호전달(검은색 칼럼)을 포함한 많은 자극에 의해 조절된다. ABL(원; 칼라 버전에서 주황색)은 세포질(유리 및 액틴-결합된 것 둘 다) 및 핵에서 세포간으로(intercellularly) 발견된다. 핵 ABL은 전사를 조절하는 반면에, 세포질 ABL은 유리 및 액틴-결합된 것 둘 다로 발견될 수 있다. 유리 세포질 ABL은 키나제 활성을 가지며, 세포 화학주성(chemotaxis) 및 유사 분열 발생(mitogenesis)에서 역할을 한다. 액틴-결합된 ABL은 키나제 활성을 갖지 않지만, 인테그린 신호전달에 대한 반응으로 액틴으로부터 방출될 수 있다.
도 1. 본 도면은 (A) 젬시타빈, (B) 트라메티닙, (C) 레고라페닙, 또는 (D) 팔보시클립 중 어느 하나의 증가하는 농도로 처리한 CAPAN2 세포의 그래프를 나타내는, CAPAN2 세포 생존에 대한 단일요법의 효과를 예시하며, 이때 검정색 원(각 그래프에서 하단 곡선)은 약물 처리이고 빨간색(칼라 버전에서) 원(각 그래프에서 상단 곡선)은 연속 희석된 약물 내 DMSO의 백분율과 동등한 농도로 DMSO-처리된 것으로, 여기서 약물에 노출되고 48시간 후에, 젬시타빈(B)의 경우 1 mM만큼 높은 농도는 세포사(cell death)를 유도하는 데에 거의 효과가 없는 반면에, 트라메티닙(B) 및 레고라페닙(C)의 매칭된 단일요법 둘 다는 세포 생존에 유의적인 부작용을 유도하며, 여기서 (D) 팔보시클립은 심지어 더 높은 농도에서도 세포 생존에 거의 효과를 나타내지 않는 것으로 발견되었다. 약물의 농도는 μM 농도의 log10(예를 들어, 1000 μM = 3.00)으로 나타낸다(평균±SD; N≥3).
도 2. 본 도면은 매칭된 조합 요법의 효과를 예시한다. (A) 레고라페닙(파란색(칼라 버전에서) 원), 트라메티닙(빨간색(칼라 버전에서) 삼각형), 또는 레고라페닙 및 트라메티닙의 1:1 조합(보라색(칼라 버전에서) 사각형) 중 각각의 연속적으로 증가하는 농도로 48시간 동안 처리된 CAPAN2 세포의 생존 그래프. - 검은색 상단 선은 DMSO-처리이며 여기서 2개 약물의 1:1 조합으로 처리된 이후의 세포 생존 그래프는, 증가된 세포 생존 영역을 둘러싼 유의적으로 감소된 세포 생존의 2개의 구별된 영역을 갖는 2상(biphasic) 유형의 곡선을 나타내었으며 여기서 대시(dash) 기호로 된 상자들 사이의 강조된 영역(음영 처리된 상자)은 잠재적인 호르메시스(hormesis)의 영역을 나타내고(B-C) 여기서 3개 바아(bar)의 각각의 세트(set)는 좌측 상에 레고라페닙, 중간에 트라메티닙, 및 우측 상에 레고라페닙 및 트라메티닙을 묘사하며, 강조된 영역(대시 기호로 된 상자들로 둘러싸인)에서의 세포사가 A에 나타나 있다.
도 3. 본 도면은 (A) 레고라페닙(파란색(칼라 버전에서) 원), 트라메티닙(빨간색(칼라 버전에서) 삼각형), 또는 레고라페닙 및 트라메티닙의 2:1 조합(보라색(칼라 버전에서) 사각형) 중 각각의 연속적으로 증가하는 농도로 48시간 동안 처리된 CAPAN2 세포의 생존 그래프를 나타내는 매칭된 조합 요법의 효과를 예시한다 - 검은색 선은 DMSO-처리이며 여기서 2개 약물의 2:1 조합으로 처리된 이후의 세포 생존 그래프는 증가된 세포 생존 영역을 둘러싼 유의적으로 감소된 세포 생존의 2개의 구별된 영역을 갖는 2상 유형의 곡선을 나타내었다. 대시 기호로 된 상자들 사이의 강조된 영역(음영 처리된 상자)은 잠재적인 호르메시스의 영역을 나타내고(B-C) 여기서 3개 바아의 각각의 세트는 좌측 상에 레고라페닙, 중간에 트라메티닙, 및 우측 상에 레고라페닙 및 트라메티닙을 묘사하며, 강조된 영역(대시 기호로 된 상자들로 둘러싸인)에서의 세포사가 A에 나타나 있다.
도 4. 본 도면은 CAPAN2 세포에서 레고라페닙과 트라메티닙 사이의 상승 작용적 효과를 예시한다 -- 레고라페닙 대 트라메티닙의 상이한 비율에 대해 생성된 CI 값을 나타내는 조합 지수(CI) 분석. 추세선은 임의의 주어진 효과에서의 CI 값을 나타내며, 기호는 실제 데이터 점수에서 유래된 CI 값을 의미한다. CI = 1, 상가 작용(additivity); CI > 1, 길항 작용; CI < 1, 상승 작용. 1:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 파란색)은 EC60에서 가장 높은 값을 갖고, 10:1에서 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 초록색)은 EC60에서 두 번째로 높은 값을 갖고, 5:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(칼라 버전에서 빨간색)은 EC60에서 세 번째로 높은 값을 가지며, 2:1 레고라페닙:트라메티닙 곡선(컬러 버전에서 노란색)은 EC60에서 네 번째로 높은 값을 갖는다.
도 5. 본 도면은 CAPAN2 세포에서 레고라페닙과 트라메티닙 사이의 상승 작용적 효과를 예시한다 - 아이소볼로그래픽(Isobolographic) 분석. (AB) 1:1 및 2:1 조합 비율에서 레고라페닙 및 트라메티닙의 상승 작용적 효과를 나타내는 아이소볼로그램으로, 여기서 대각선의 칼라 선은 상가 작용을 나타내며, 칼라 부호는 20%(ED80 - 파란색 (칼라 버전에서) 하단 선), 25%(ED75 - 노란색(칼라 버전에서) 중간 선), 또는 40%(ED60 - 빨간색(칼라 버전에서) 상단 선) CAPAN2 세포사를 각각 달성하기 위한 용량 요건을 나타내고, 여기서 상가 작용 선 아래의 데이터 지점은 상승 작용을, 위의 데이터 지점은 길항 작용을 의미한다.
도 6. 정상적인 KRAS 세포간 신호전달의 개요. 성장 인자(성장 인자로 표지된 삼각형; 칼라 버전에서 빨간색/분홍색)가 이의 수용체의 세포외 부분(성장 인자 수용체로 표지된, 원형질 막을 관통하는 Y-형태의 구조; 칼라 버전에서 검은색과 파란색)에 결합하면, RAS(KRAS, NRAS, 또는 HRAS)의 활성화로 이어지는 일련의 소분자(small molecule) 중간체(원으로 그려짐(칼라 버전에서 초록색))를 통한 하류(downstream) 신호전달 사건이 개시되어 그후에 MEK1/2 및 ERK1/2를 이어서 활성화시키는 RAF(BRAF, CRAF)가 활성화되어 전사 및 세포 생존 및 증식을 증가시킨다.
도 7. 정상적인 ABL 신호전달의 개요(B). ABL은 성장 인자(삼각형; 칼라 버전에서 보라색), 케모카인(정사각형; 칼라 버전에서 파란색) 및 인테그린 신호전달(검은색 칼럼)을 포함한 많은 자극에 의해 조절된다. ABL(원; 칼라 버전에서 주황색)은 세포질(유리 및 액틴-결합된 것 둘 다) 및 핵에서 세포간으로(intercellularly) 발견된다. 핵 ABL은 전사를 조절하는 반면에, 세포질 ABL은 유리 및 액틴-결합된 것 둘 다로 발견될 수 있다. 유리 세포질 ABL은 키나제 활성을 가지며, 세포 화학주성(chemotaxis) 및 유사 분열 발생(mitogenesis)에서 역할을 한다. 액틴-결합된 ABL은 키나제 활성을 갖지 않지만, 인테그린 신호전달에 대한 반응으로 액틴으로부터 방출될 수 있다.
본 발명은 암 환자의 치료에서 암 세포 내 2개 이상의 돌연변이의 식별 및 표적화에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하기의 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기의 의미로 정의된다.
용어 "약"은, 범위를 포함하여, 예를 들어, pH, 온도, 양, 농도, 및 분자량의 수치 지정 전에 사용되는 경우, ± 5%, ±1% 또는 ±0.1%만큼 변할 수 있는 근사치를 나타낸다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 이들의 혼합물을 포함하여, 다수의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
용어 "및/또는"은 본 발명의 2개의 성분 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "대상체(subject)", "개체(individual)" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 포유 동물 및, 특히 인간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "장치(device)"는 약물을 이를 필요로 하는 환자에게 전달할 수 있는 기구(apparatus) 또는 시스템을 지칭한다.
치료와 관련하여 용어 "치료를 필요로 하는"과 용어 "이를 필요로 하는"은 상호교환적으로 사용되며 간병인, 예를 들어, 의사, 간호사, 임상 간호사에 의해 환자가 치료로 이익을 얻을 것이라고 내려지는 판단을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 지나치게 해롭지 않은 약제학적 조성물의 성분을 지칭한다.
용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭하며, 이에 제한되지는 않으나 친수성 물질, 소수성 물질 및 유화제와 같이 친수성 및 소수성 특성을 둘 다 가지는 물질인 그러한 액체 및 분말을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 연구자, 의료인 또는 개체가 추구하고 있는 조직(tissue), 시스템, 또는 개체에서 생물학적 또는 약효 반응을 유도해내는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "w/w"는 질량 분율, 즉 성분의 질량을 전체의 총 질량으로 나눈 것을 지칭하도록 의도된다. 용어 "% w/w"는 질량 분율에 100을 곱한 것을 지칭하도록 의도된다. 유사하게, 용어 "w/v"는 부피 농도, 즉 성분의 질량을 전체의 총 부피로 나눈 것을 지칭하고, 용어 "% w/v"는 부피 농도에 100을 곱한 것을 지칭한다.
본 발명의 다양한 구현예는 암의 치료를 필요로 하는 암 환자에서 암을 치료하는 방법 및 암을 가진 환자를 위한 치료 방법을 식별하는 방법에 관한 것이다.
용어 "암"은 비정상 세포가 종종 주변 조직을 침범하고 혈액 및 림프 시스템을 통해 신체의 다른 부분으로 퍼지면서 제어 없이 분열하는 질환의 군을 지칭한다. 하나의 특정한 암은 췌관 선암종(PDAC)이다. PDAC는 췌관으로부터 발생하고 단지 약 25%의 5년 생존율을 나타내며 세계적으로 모든 암 관련 사망의 최대 4%를 차지하는 극히 공격적인 암이다(5).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시료"는, 환자의 암으로부터의, 예컨대, 예를 들어, 중심부 생검(core biopsy), 바늘 흡인 생검 등을 포함하는 절제(excisional) 또는 절개 생검(incisional biopsy)으로부터의 암성 조직 또는 세포의 군을 지칭한다. "시료"는 또한 암의 DNA를 함유하는 환자로부터 수득한 세포 무함유 유체일 수 있다.
환자로부터의 시료는 차세대 염기서열분석(NGS)을 이용하여 스크리닝될 수 있다. NGS는 수백 만 개의 DNA 주형을 대량으로 병렬 염기서열분석할 수 있는 기술을 지칭한다(3, 4). 본 용어는 1세대 디데옥시 '생어(Sanger)' 염기서열분석과 구별되는 2세대 및 3세대 염기서열분석을 포함한다. NGS 기술은 고체의 지지 매트릭스 상에서 DNA 주형의 클론 증폭에 뒤이어 주기적인 염기서열분석을 사용한다. NGS의 예는 MiSeq®, HiSeq® 및 NextSeq®(일루미나 인크.(Illumina Inc.), 샌디에고, CA)와 같은 제품에서의 합성에 의한 염기서열분석(sequencing-by-synthesis)(가역적 종결인자 기반), Ion Torrent®, Ion Proton®,(라이프 테크놀로지스® 써모 피셔 사이언티픽(Life Technologies® Thermo Fisher Scientific), 월섬, MA)와 같은 제품에서의 합성에 의한 염기서열분석(반도체 기반), 및 PACBIO® RSII(퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences), 멘로 파크, CA)와 같은 제품에서의 단일 분자 실시간 염기서열분석을 포함한다.
용어 "병원성 돌연변이"는 암과 같은 특정한 질환 또는 장애에 대한 개체의 감수성 또는 소인을 증가시키는 유전적 변경(alteration)을 지칭한다.
용어 "치료가능한 돌연변이"는 암과 같은 특정한 질환 또는 장애를 효과적으로 치료함에 있어 약물에 의해 표적화될 수 있는 유전자 또는 경로에 영향을 미치는 돌연변이를 지칭한다(6, 7). 치료가능한 돌연변이는 경로-표적화된 치료제가 효과적일 수 있도록 공지된 경로에 맵핑될 수 있다(8). 이러한 치료제는 특히 PDCA의 치료를 위해, MEK 억제제, 트라메티닙 및 다중 티로신 키나제 억제제, 레고라페닙과 같은 억제제를 포함할 수 있다.
원-종양 유전자는, 돌연변이 또는 증가된 복제수(copy number)에 의해 활성화되는 경우, 종양 유전자가 되어 암의 원인이 될 수 있는 정상적인 유전자이다. 원-종양 유전자는 세포에서 세포 분열로 이어지는 신호를 제공하거나 아폽토시스(apoptosis)를 조절하는 것과 같은 많은 상이한 기능을 가질 수 있다.
표적 유전자 중 하나는 돌연변이 KRAS 유전자일 수 있다. 돌연변이된 KRAS 종양 유전자는 세포 성장 및 분화를 제어하는 미토겐-활성화된(MAP) 키나제 경로에 기여한다(9). KRAS는 RAF 키나제, MEK 키나제 및 ERK 키나제의 연속적인 활성화를 일으키는 GTP에 의해 활성화되며, ERK는 전사 인자를 인산화시켜 세포 증식으로 이어진다(10). 하나의 치료가능한 MEK 억제제는, MEK의 RAF-의존적 활성화를 통해 ERK 인산화를 억제하는 트라메티닙이다(11). 트라메티닙은 약 1 내지 약 3 mg/일 경구 투여(P.O.) 및, 특히, 2 mg/일 P.O.로 투여될 수 있다.
또다른 표적 유전자는, 비정상적으로 활성화되어 종양 유전자가 되는 경우, 하류 신호전달 경로를 방해하여, 강화된 세포 증식, 분화 정지 및 세포사에 대한 내성을 야기하는, 단백질 티로신 키나제를 암호화하는 ABL1 원-종양 유전자일 수 있다(12). 하나의 치료가능한 ABL1 키나제 억제제는 다중 단백질 키나제의 억제제인 레고라페닙이다(13). 레고라페닙은 약 80 내지 약 240 mg/일 P.O. 및, 특히, 약 160 mg/일 P.O.로 투여될 수 있다.
다양한 다른 구현예는 암을 가진 환자를 위한 치료 방법의 식별용 키트(kit)에 관한 것이다. 본 키트는 유전자-약물 상호작용의 목록; 환자로부터의 암 세포 시료를 포함할 수 있다. NGS 또는 다른 기술로 수득한 이들 암 세포에서의 변이의 목록. 본 키트는 가능한 조합 표적화된 요법의 목록을 생성한다. PDAC를 가진 환자를 위한 치료 방법의 식별용 키트에서, 2개의 표적 유전자는 KRAS 및 ABL1일 수 있다. 이들 2개의 표적 유전자의 경우, 트라메티닙(MEK 억제제) 및 레고라페닙(티로신 키나제 억제제)이 키트에 포함된다. 추가로, 키트에는 환자로부터 수득한 시료 암 세포를 배양하기 위한 배지가 포함될 수 있다. 이러한 배지는 예컨대, 예를 들어, 캘리포니아 주, 칼스 배드의 라이프 테크놀로지스-깁코(Gibco)로부터 입수할 수 있는 바와 같이, 10% FCS, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 1X 암포 테리신이 보충된 맥코이의 수정 5A 배지(McCoy's Modified 5A media)와 같은 임의의 표준 배양 배지일 수 있다. 본 키트의 성분 각각은 적절한 설명서(instruction)와 함께 1개 이상의 용기에 패키징되어 있다.
실시예
본 교시내용의 양태는 하기의 실시예에 비추어 추가로 이해될 수 있으며, 본 교시내용의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
이 실시예는 배양 방법에서 치료제의 조합을 이용하여 암 세포 내 다중 치료가능한 돌연변이를 동시적으로/순차적으로 표적화하는 것의 효과를 예시한다.
서론
암 치료는 여전히, 주로 특정한 유형의 암(예를 들어, 간암, 폐암, 결장직장암)과의 투쟁을 목표로 하는 대부분의 치료 선택지 및 절차(예를 들어, 수술, 방사선 요법, 화학요법)와 함께 주로 "널리 적용되도록 만든" 접근법이다(14). 그러나 지난 몇 년간, 차세대 염기서열분석 전략의 사용은 암 감수성과 진행을 유발하는 유전적 변경에 대한 우리의 지식을 매우 증가시켰을 뿐만 아니라, 개별적인 환자의 암의 고유한 특징을 명확하게 예시했다(15). 이러한 많은 유전적 변경에 의해 영향을 받는 단백질 및 경로를 표적화하는 요법 개발에서의 진전과 함께, 이는 한 환자의 암을 공격하는 것을 목표로 하는 개인맞춤 암 치료 전략을 이용할 가능성을 높였다(16).
이 개념을 지지하기 위해, 많은 연구가 여러 가지 상이한 유형의 암 치료에서 특정한 돌연변이를 표적화하는 단일요법의 효능을 입증했다. 일부 위험성(예를 들어, 독성 및 약물 내성)이 없지는 않지만, 이러한 많은 연구는 비-표적화된 접근법과 비교하여 반응률 및 무진행 생존(progression free survival)이 유의하게 증가하는 것을 입증했다(16-20). 그러나, 전체 게놈 염기서열분석이 입증했던 바와 같이, 암 게놈은 일반적으로 단일 유전자 내의 변경보다는, 전반적인 유전적 불안정성(즉, 돌연변이 부담(mutational burden)으로부터 기인하는 유전적 변이)의 혼합에 의해 특징지어진다(21). 그럼에도 불구하고, 표적화 요법이 이행되는 대부분의 암 환자는 일반적으로 단일-제제 매칭된 변이를 목표로 하는 요법(단일요법)으로 치료된다. 이것은, 이러한 표적화된 단일요법의 결과에 기반하여, 본원의 발명자들이 환자의 암 게놈 프로파일에 의해 나타난 치료가능한 변경의 전체 세트와 매칭된 요법의 조합이 아마 더 우수한 반응을 야기할 것 같다고 믿음에도 그러하다.
매칭된 조합 요법의 효능의 원리 검증으로서, 본 발명자들은, 인간/환자 췌관 선암종으로부터 유래한 확립된 세포주인 CAPAN2를 이용하여 시험관내(in vitro) 세포-기반 생존 어세이를 수행하였다(22). 이 세포주는 특징지어졌고 여러 가지 돌연변이를 보유하는데, 이들 중 일부는 세포에서 발견되는 유전자 변이에 의해 영향을 받는 경로를 특이적으로 억제하는, 이용가능한 FDA-승인 약물과 매칭되었다("매칭된" 요법). 이에 따라, 이 연구에서, 세포 생존도의 비교는: 1) 췌관 선암종에 대한 표준 치료(즉, 젬시타빈)(23); 2) 세포에서 변경된, 선택된 단일/고유한 신호전달 경로를 표적화하는 개별적인 약물/억제제를 이용한 매칭된 단일요법; 및 3) 동일한 선택된 변이와 매칭된 조합 요법 중 어느 하나로 처리된 세포들 사이에서 이루어졌다.
재료 및 방법
재료
달리 나타내지 않는 한, 젬시타빈, 트라메티닙, 팔보시클립, 및 레고라페닙을 포함하여, 모든 화학물질은 셀렉켐(SelleckChem, 휴스턴, TX)으로부터 입수하였다. 맥코이의 5A 수정 성장 배지, 페니실린-스트렙토마이신, 암포테리신, 및 태아 소 혈청은 라이프 테크놀로지스-깁코(칼즈배드, CA)로부터 입수하였다. 조직 배양 디쉬(dish), 혈청 파이펫(pipette), 파이펩 팁(tip), 및 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브를 포함하여, 모든 플라스틱 제품은 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific, 세인트루이스, MO)로부터 입수하였다.
세포주 선택
세포주는 1,000개의 암 세포주에 대한 DNA 복제 수, mRNA 발현, 돌연 변이 데이터 및 그밖에 것의 분석 및 시각화를 이용할 수 있도록 하는 암 세포주 백과사전(Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE))의 분석으로 선택하였다(24). 관심 있는 세포주의 선택을 위한 기준은 다음을 포함하였다: 1) 세포주에 의해 나타나는 돌연변이의 총 수가 적어도 5개이되, 10개를 초과하지 않아야 함(추가적인 혼동 요인의 복잡성을 피하기 위해); 2) 치료가능한 표적의 수가 적어도 2개이되, 3개를 초과하지 않아야 함(시험할 잠재적인 약물 조합의 수를 제한하기 위해); 3) 돌연변이는 유의적으로 중첩될 수 없으며 별개의 발암 경로에 영향을 미쳐야함(약물 치료에서의 중복성을 피하기 위해). 18개의 세포주 세트로부터, 본 발명자들은 인간 췌장 선암종 1차 종양으로부터 기원된 CAPAN2를 선택하였다.
세포 배양
인간 췌장 암 세포주 CAPAN2는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC; 매너서스, VA))으로부터 구입하였다. 세포는 10% FCS, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 1X 암포테리신이 보충된 맥코이의 수정 5A 배지에서 성장시켰다. 시험을 위해, 세포를 ~30분 동안 PBS(칼슘 없이)로, 뒤이어 37C에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 디쉬로부터 방출시켰다. 세포를 15 ml 원심분리 튜브에 수집하고 임상 원심분리기에서 5분 동안 스핀-다운(spin-down)시키고 그후에 1ml의 신선한 배지 중에 재현탁시켰으며 혈구계를 이용하여 세포를 계수하였다. 그후에 세포(1 x 103 - 5 x 103)를 100μL의 배지 내의 96-웰 플레이트 내로 시딩하였고 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후, 배지를 교체하고 약물로 처리하기에 앞서 또다른 24시간 동안 세포를 재-인큐베이션하였다.
세포 처리, 생존도 어세이 및 용량-반응 평가
관심 있는 세포 주에 상응하는 게놈 정보(즉, 돌연변이 상태, 복제수 변화 등)를 분석하였고 트라메티닙(MEKINIST®, KRAS 활성화 돌연변이를 중화하는 MEK 억제제) 및 레고라페닙(STIVARGA®, ABL1 활성화 돌연변이를 중화하는 다중-키나제 억제제)의 조합을 CAPAN2 세포에 대한 잠재적 치료 섭생(regimen)으로서 선택하였는데, 이들이 이 2개의 치료가능한 돌연변이를 표적화하기 때문이다.
제조사의 설명서에 따라 DMSO 중에서 제조된 마스터 저장(master stock) 용액으로부터 완전 배지 중에서 저장 약물 용액을 제조하였다. 이 저장 용액을 이용하여, 레고라페닙 및 트라메티닙의 1:1, 2:1, 5:1, 및 10:1 부피-부피(v/v) 혼합물을 제조하였다. 그후에 이들 혼합물을 2배 연속 희석하여 각각의 경우에서 20개 농도 범위를 생성하였다. 세포 생존도 어세이/평가 전에 48 내지 72시간 동안 세포를 약물 혼합물 중에서 인큐베이션하였다.
세포 생존도는 WST-1 비색 세포 증식 어세이(로쉐(Roche))를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 결정하였다. 안정한 테트라졸륨 염 WST-1은 주로 세포 표면에서 발생하는 복잡한 세포 메커니즘에 의해 가용성 포르마잔으로 절단된다. 이 환원은 생존가능한 세포에서 NAD(P)H의 해당작용성 생산에 주로 의존한다. 그러므로, 형성되어, 분광광도계(BIO-TEK 340, 바이오테크(BIOTEK))를 이용해 측정된 포르마잔 염료의 양은 배양물 중 대사적으로 활성인 세포의 수와 직접적인 연관성이 있다. 모든 시험 포인트(point)는 적어도 3회 수행되었다.
데이터는 엑셀(Excel) 2016(마이크로소프트), 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism 5)(그래프패드 소프트웨어), 및 Dr-핏(Fit)(Dr-핏 소프트웨어)에서 처리하였다(12). 이 데이터를 용량-반응 곡선을 생성하는 데에 사용하였고 추가적인 분석을 위해 20%, 25% 또는 40%의 성장 억제(각각 IC20, IC25 및 IC40)을 나타내는 약물 농도를 결정하였다.
아이소볼로그래픽 분석
조합하여 수득한 약물은 그들의 개별적인 효능(potency)으로부터 예측되는 효과보다 크거나 적은 효과를 생산할 수 있다. 약물 쌍 사이의 상승 작용, 상가 작용, 또는 길항 작용을 검출하는 아이소볼로그래픽 분석(26)을 약물 조합의 효과를 평가하기 위해 수행하였다. 일반적으로, 약물 쌍이 억제 효능을 각각의 약물 단독의 것에 비해 향상시키는 경우, 조합은 상승 작용적인 것으로 간주된다; 효능이 변화하지 않고 남아있는 경우, 효과는 상가 작용적인 것으로 간주된다; 그리고 효능이 감소하는 경우, 효과는 길항 작용적인 것으로 간주된다. 트라메티닙 및 레고라페닙의 용량-의존적 상호작용을 개시하기 위해, 암 세포 증식의 20%, 25% 및 40% 억제 효과 수준에서의 아이소볼로그램을 생성하였다. 이들 각각에서, 조합한 약물 각각에 대하여 이들의 단일 이용(IC20, IC25, 및 IC40)으로부터 용량 요건을 추정함으로써 상가 작용을 결정하였다. 상가 작용의 선 위 또는 아래의 데이터 지점은 각각 길항 작용 또는 상승 작용을 나타낸다.
y-축 상의 트라메티닙의 농도 및 x-축 상의 레고라페닙의 농도를 플롯팅(plotting)함으로써 아이소볼로그램을 구축하였다. 상가 작용의 아이소볼(isobole)은 그들의 각각의 축 상에서 약물 각각의(단일요법에서 이용되는 경우) IC20(또는 IC25, IC40)을 플롯팅하고 이들을 사선으로 연결함으로써 생성하였다. 그후에 상이한 용량 비율에서의 트라메티닙 및 레고라페닙의 조합 효과를 이들 각각의 IC20(또는 IC25, IC40)를 이 XY 그래프 상에 플롯팅함으로써 결정하였다.
통계학적 분석
모든 값은 평균 +/-SD로 보고하였다. 스튜던트의 t-검정을 사용하여 처리들 사이의 차이점을 평가하였다. 모든 결과의 유의성을 위해 0.05 이하의 p-값을 고려하였다.
결과
세포주의 선택.
선택된 약물 섭생의 효능을 시험하기 위한 세포주는 ~1,000개 세포주의 분자 주석(molecular annotation)을 아우르는 데이터베이스(암 세포주 백과사전, CCLE, 노바티스/브로드 연구소(Broad Institute))로부터 선택하였다(24). 많은 기준(예를 들어, 돌연변이의 수 및 종류, 돌연변이의 병원성 및 조치가능성(actionability))을 이용하여 관심 있는 세포주 목록을 18개의 가능한 종류로 감소시켰다(표 1).
표 1. 시험 가능한 암 세포주
이 목록으로부터, 분석을 위해 56세 백인 남성의 췌관 선암종(PDAC)로부터 유래한 상피 세포주인 CAPAN2(23)을 선택하였다. 최적의 배양 조건에서, 세포는 대략 96h의 배가 시간(doubling time)을 나타낸다(9). CCLE에 따르면, CAPAN2 세포는 ~8개의 미스센스 돌연변이를 가지며, 이중 3개(KRAS p.G12V; ABL1 p.G1060D; FANCC p.E521K)가 치료가능한 표적으로 발견되었다(표 1). 그러나, FANCC p.E521K가 기능적 유의성이 불명확한 이형접합성 돌연변이이기 때문에(27), 본 발명자들은 2개의 다른 치료가능한 돌연변이에 집중하였다.
KRAS
작은 GTP아제(GTPase)인 KRAS는, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 신호 전달 경로(도 6)에 참가함으로써 세포 성장 및 증식을 조절하는 기능을 한다. 정상 조건 하에서, KRAS는 성장 인자(예를 들어, EGF, VEGF, PDGF 등)가 이의 상응하는 수용체 티로신 키나제(예를 들어, EGFR, VEGFR, PDGFR 등)에 결합하는 경우 활성화된다. 그후에 이러한 KRAS의 유도 활성은
하류 분자, RAF(ARAF, BRAF 및 CRAF)를 자극하는데, 이는 이어서 하류 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나제 키나제, MEK1 및 MEK2, 및 ERK1 및 ERK2를 인산화하고 활성화시킨다(도 6). 궁극적으로, ERK1/2가 핵으로 이동하고 세포 증식에 필요한 유전자의 전사를 강화한다. 성장 인자 자극의 부재 하에서, KRAS는 정상적으로 GTP를 GDP로 탈인산화함으로써 불활성화 상태로 유지된다. 그러나, 돌연변이된 형태에서, KRAS는 GTP에서 GDP로 절단하는 그의 능력을 상실하고 그러므로 이것은 구성적으로 활성화인 채로 남아(심지어 성장 인자 결합의 부재 하에서도)-비제어된 지속적인 세포 증식 및 성장으로 이어진다.
표 2. CAPAN2 세포에서 발견된 유전자 변이의 목록. 변경된 유전자가 나열되어 있고 이들의 게놈 서열(알려져 있는 경우) 및 결과적인 단백질 서열을 나타낸다. 단백질의 기능에 대한 돌연변이의 효과 및 변이가 치료가능한지(즉, 돌연변이 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 치료하는 약물이 있는가?)를 또한 나타낸다.
모든 PDAC 중 대략 90%가 KRAS에서 돌연변이 활성화를 나타내며, 이는 그것을 PDAC 중 가장 빈번하게 돌연변이화되는 종양-단백질이 되도록 한다(15). 게다가, 치환 p.G12V과 같은 12번째 코돈에서의 돌연변이가 PDAC에서 모든 KRAS 돌연변이의 ~98%를 차지한다(16). p.G12V 돌연변이는 키나제의 구성적 활성을 야기하고(17) 결장직장암 및 비소세포성 폐 선암종과 같은 추가적인 종양 유형에서 관찰된다.
ABL1
ABL1 원발암 유전자는 세포 분화, 세포 분열, 세포 부착 및 스트레스 반응과 연관된 비-수용체 티로신 키나제를 암호화한다(31)(도 7). ABL1은 일반화된 세포하 국재성(subcellular localization)을 나타내어, 핵, 세포질에서 발견되거나 액틴 세포골격에 결합한다(32). 핵에서, ABL1은 세포-주기 의존적 및 DNA 손상-유도 전사를 제어하는 기능을 한다(33). 세포질에서, 이 비-수용체 티로신 키나제는 유리되어 있거나 섬유성 액틴에 결합된 것 둘 다로 발견된다. 유리 분자로서, ABL1은 여러 가지 잠재적인 조절 신호의 하류이며, 결국, 세포 침윤 및 성장과 연관된 많은 하류 단백질의 활성을 조절하고, 액틴 세포골격에 결합하는 동안 이 키나제의 활성이 꺼진다(33)(도 7).
티로신 키나제의 구성적 발현 및 추가적인 과다-활성으로 이어지는 만성림프성 백혈병의 특징인, 발암성 융합 단백질 BCR-ABL1의 잘 확립된 역할과는 대조적으로(34), 고형 종양에서의 점 돌연변이에 의해 돌연변이화된 경우의 ABL1의 역할에 대해서는 훨씬 덜 알려져 있다(31). 그러나, 이 비-수용체 티로신 키나제를 활성화하여 세포 암화(cell transformation)로 이어지도록 하는 것으로 발견된, ABL1의 티로신 키나제 도메인 내에 위치한 많은 점 돌연변이와 달리(35), 이들 세포에서 나타나는 ABL1의 pG1060D 돌연변이는 키나제의 액틴-결합 도메인에서 발생한다. 기능적으로 특징지어지지는 않았지만, 이 도메인이 키나제의 액틴 세포골격(AB1 키나제 활성을 차단함)으로의 세포하 국재성의 주요한 결정요인이기 때문에 그리고 현재까지 식별된 ABL1 돌연변이의 암화는 대부분 키나제의 세포질 축적을 배타적으로 야기하기 때문에(33, 34) - ABL1의 키나제 활성은 단백질이 F-액틴에 결합되는 경우 억제되므로, 이 변경은 추정적으로 이의 세포질 수준 및 추가적인 활성화의 증가로 이어진다(32, 35).
약물 처리
젬시타빈 단일요법.
수십 년 동안 췌장암의 표준 치료였던 젬시타빈(GEMZAR®) 단일요법은 이 질환을 치료하는 데에 이용되는 가장 일반적인 세포독성 약물이다(23). 이 피리미딘 유사체(analogue)는 세포 내에서 인산화되고 이것이 DNA 합성을 억제하는 DNA 내로 도입되어(37), 그러므로 모든 증식 세포(종양 세포에 대한 제한 없이)를 표적화하여, 이에 따라 중요한 부작용(호중성백혈구감소증 및 출혈, 탈모, 구역 및 구토, 피로를 동반하는 중증의 골수 억제와 같은)을 야기한다. 젬시타빈-치료가 전반적인 생존의 측면에서 최적 지지 요법(best supportive care)과 비교하여 단지 적당한 개선만을 나타낸다(3개월과 비교하여, 5 내지 6개월)는 사실에도 불구하고, 2017년 부로, 젬시타빈은 후기 췌장 선암종에 대한 표준 치료로 남아있다(38).
본 연구에서는, 2배 연속 희석된 젬시타빈을 48 내지 72시간 동안 2 nM 내지 1 mM 범위의 농도로 CAPAN2 세포에 처리하였다. 이러한 배양 조건 하에서, 젬시타빈은 세포 생존에 극히 적은 영향을 갖는 것으로 발견되었다(도 1a)(단지 1 mM의 농도를 이용하여 달성된 ~30%의 세포 생존도의 최대 감소와 함께, IC20 = 111 μM)(p≤0.001).
트라메티닙 단일요법.
CAPAN2 세포에서, KRAS 내 p.G12V 돌연변이는 구성적으로 활성인 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK)를 야기하며, 이는 MAPK 신호전달 경로에서 KRAS의 하류이다(도 6). MEK의 선택적 억제제로서 트라메티닙(MEKINIST®)은 이러한 구성적으로 활성화된 경로의 하류 억제제이다(39). 젬시타빈을 이용한 처리와 대조적으로, 48시간 내지 72시간 동안 100 μM 내지 0.2 nM 범위의 농도인 트라메티닙의 단일요법으로 처리된 CAPAN2 세포는, 4 nM의 IC20(p≤0.05) 및 28 nM의 IC50(p≤0.05)로, 세포 생존이 현저하게 감소하였다(도 1b).
레고라페닙 단일요법.
상기에 기재된 바와 같이, ABL1 내 p.G1060D 돌연변이는 아마 이 비-수용체 티로신 키나제의 세포질 농도를 증가시키는 활성화 돌연변이일 것이다(도 7). 레고라페닙(STIVARGA®)은 다른 많은 것들 중에서도 RET, VEGFR1-3, FGFR1-2, TIE2 및 ABL1을 포함하여 수용체 및 비-수용체 티로신 키나제를 표적화하는 다중-키나제 억제제이며(40), 이에 따라 활성화된 경로를 억제해야 한다. CAPAN2 세포의 2배 연속 희석된 레고라페닙 단독 처리(즉, 2 nM 내지 1 mM 범위의 농도)는, ~2 μM의 IC20(p≤0.05)(도 1c) 및 7.1 μM의 IC50(p≤0.05)로, 세포 생존의 유의적인 감소를 야기하였다.
팔보시클립 단일요법.
췌관 선암종은, p16ink4a 단백질(시클린 의존성 키나제 4 및 6(CDK4/6)의 억제제)을 암호화하는 종양 억제자 유전자인 CDKN2A의 손실 또는 침묵(silencing)을 포함하여 다양한 유전적 변경을 나타내는 것으로 발견되었다(41). CDKN2A의 기능 손실 돌연변이는 CDK4 및 CDK6을 통한 세포 주기의 탈조절(deregulation)을 야기하여 세포 증식을 강화시킨다. CAPAN2 세포 내 CDKN2A의 상태는 불명확하게 남아있지만, 일부 군은 p16 단백질의 발현을 입증하였고, 반면에 다른 군들은 CDKN2A가 이 세포들에서 불활성화되어 있다는 사실을 나타냈다(42). 세포를 48 내지 72시간동안 125 μM 내지 2 nM 범위의 농도의, 2배 연속 희석된 CDK4/6 억제제, 팔보시클립으로 처리하였다. 팔보시클립은 본 연구에서 이용된 CAPAN2 세포의 생존에 유의한 효과를 갖지 않는 것으로 발견되었다(도 1d)(IC20 = 15 mM). 이 발견은 p16 기능적 활성의 지속성을 입증하고, 적어도 CAPAN2 세포의 이 특정한 유형(strain)에서는, 증식이 CDK4 및/또는 CDK6에 의존적이지 않다는 사실을 나타낸다. 더욱이, 이 결과는 또한 팔보시클립을, 비매칭된 단일요법으로서, 음성 대조군으로 작용하도록 한다.
트라메티닙 및 레고라페닙을 이용한 조합 요법
그후에 트라메티닙 및 레고라페닙을 이용한 CAPAN2 세포의 동시 처리를 이용하여 CAPAN2 세포 생존에 대한 매칭된 조합 요법의 효과를 연구하였다. 이 두 억제제를 1:1 농도로 공동-투여하면 2 nM의 IC20으로 약물 중 어느 하나의 단독(즉, 단일요법)으로 처리한 것에 비해 세포사에서의 유의적인 증가가 야기되었다.
그러나 흥미롭게도, 이러한 약물의 이 1:1 조합에 대한 세포 생존도의 용량-반응 곡선은, 15 nM 내지 1 μM의 효율의 손실과 함께 2상의 U가 뒤집힌 형태를 나타내었다(도 2). 그럼에도 불구하고, 이 효과의 직전 및 직후에 위치한 2개 농도 지역의 검토는 세포사의 통계학적으로 유의한 증가를 나타내는데(도 2b 및 2c)(레고라페닙 및 트라메티닙 단독의 경우 -2% 및 -10%인 것과 비교하여, 1:1 조합의 경우 300 nM에서 -55%임-(p≤0.05)), 이는 세포 증식에 대한 약물 조합의 잠재적인 상승 작용적 억제 효과를 나타낸다.
두 약물의 존재가 각각의 약물 단독의 개별적인 효과를 강화시키는지 여부를 조사하기 위해, "고정-비율-모델(Fixed-Ratio-Model)"을 사용하였다(43-45). 이 모델에서는, 로에베의 개념에 기반하는데(43-45), 조합 지수(CI)는 각각의 약물-반응 곡선(약물 단독 또는 조합하여)의 기울기 및 ICx 값에 기반하여 계산되었으며 약물-약물 상호작용이 상승 작용적(CI<1)인지, 상가 작용적(CI=1)인지, 또는 길항 작용적(CI>1)인지를 규정하는 데에 이용되었다(도 4). 이에 따라, 세포 생존의 20% 감소를 야기하는 조합 지수(CI)는 0.345와 동일하고, 세포 생존의 25%는 0.320과 동일한 반면에 40% 생존에 대한 것은 1보다 큰 것으로 발견되었다. 이는 ED80 및 ED75의 경우, 두 약물이 동일한 농도로 사용될 때 CAPAN2 세포 증식에 대한 약물 조합의 상승 작용적 효과가 있음을 나타낸다(33).
그러나, 레고라페닙 대 트라메티닙의 2:1 농도에서 약물의 공동-투여는 다소 상이하였다(도 3). 상기와 같이, 0.78-0.39 μM과 6.25/3.125 μM의 농도 사이에서 명백하게 증가된 세포 생존의 작은 지역에 인접한, 증가된 세포사의 2개 영역을 포함하는 2상 약물 반응 곡선이 나타났다(도 4b, 4c). 그럼에도 불구하고, 두 경우(예를 들어, 1:1, 2:1 농도)에서 세포 생존의 전반적인 수준은 레고라페닙 단독으로 나타나는 것보다 유의적으로 낮았으며(도 2-3), 약물의 조합은 상승 효과적으로 유지된다(비율 2:1이 사용된 경우, CI20% = 0.568, CI25% = 0.546 및 CI40% = 0.471 - CI50%는 1보다 큼)(도 4). 유사한 실험을 레고라페닙 대 트라메티닙의 5:1 및 10:1의 농도에서 수행하였지만 이 농도 비율에서는 세포사에서의 유의적인 차이가 나타나지 않았다(데이터 나타내지 않음).
트라메티닙 및 레고라페닙 세포독성은 췌관 선암종 암 세포에서 상승 작용을 낸다.
다음으로, 본 발명자들은 아이소볼로그램을 생성하였고 상승 작용에 대한 판독값으로서 20%, 25% 및 40% 암 세포사에서의 각각의 약물의 용량 요건을 결정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 1:1 및 2:1 레고라페닙:트라메티닙 조합의 아이소볼은 강한 상승 작용을 나타내는 각각의 효과 수준에 대하여 상가 작용적 아이소볼 아래에 있었다. 5:1 및 10:1 레고라페닙:트라메티닙 조합의 아이소볼은 각각의 효과 수준에 대하여 상가 작용적 아이소볼에 훨씬 가까웠는데, 이는 조합에 대하여 약간의 상가 작용적 효과를 나타낸다(데이터 나타내지 않음)
토의
췌장암의 80% 이상이 관 선암종(PDAC)이며(47) 암-관련 사망의 네 번째로 가장 흔한 원인으로서, 이것은 가장 치명적인 고형 악성종양 중 하나이다(48). 비록 젬시타빈이 10년 이상동안 후기 PDAC에 대해 유일하게 검증된 표준 섭생이었지만, 이 질환에 대한 5년 생존율은 지난 40년 동안 유의적으로 개선되지 않았다(38).
모든 PDAC의 대략 90%는 키르스텐 쥐 육종 바이러스 종양유전자 상동체(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog(KRAS))에서 돌연변이를 나타내며, 이는 PDAC에서 가장 빈번하게 돌연변이화되는 종양유전자/단백질이다(28). 게다가, p.G12V(본 연구에 이용된 CAPAN2 세포에서 나타남)와 같은 12번째 코돈에서의 돌연변이는 PDAC 내 모든 KRAS 돌연변이의 ~98%를 차지한다(29). p.G12V 돌연변이는, 세포 증식, 운동성, 접착, 침윤, 아폽토시스의 차단 및 화학요법에 대한 내성의 비제어된 증가를 조정하는 일련의 하류 신호전달 사건으로 이어지는, 이 단백질 키나제의 구성적 활성화를 야기한다(30). 이럼에도 불구하고, 특이적인 RAS 억제제가 식별되지 않았으며, 이 단백질 키나제는 "약물 개발이 어려운(undruggable)"것으로 널리 인식되었다(49).
그럼에도 불구하고, KRAS 기능을 이의 하류 효과기(effector)의 억제를 통해 적어도 간접적으로 차단할 수 있는 치료제의 개발 및 상업화가 발달되었다. 예를 들어, MEK의 선택적 억제제, 트라메티닙(MEKINIST®)은 KRAS p.G12V 돌연변이에 의해 구성적으로 활성화된 MAP 키나제 신호전달 경로의 하류 억제제이며(49), 이러한 MAP 키나제 억제제가 RAS 표적화를 위한 중요한 요법이라는 것이 입증되었다(40).
비-수용체 티로신 키나아제인 ABL1은 세포 성장, 생존, 침윤, 접착 및 이동을 제어하는 다양한 세트의 세포 과정을 조절한다(31). 이들 CAPAN2 세포에서 나타나는, ABL1의 p.G1060D 돌연변이는 키나제의 액틴-결합 도메인에서 발생하며, 기능적으로 특징지어지지는 않았지만, 이 돌연변이는 ABL의 세포질 수준 및 그에 따른 이의 키나제 활성을 증가시키는데, 이러한 활성이 ABL의 섬유성 액틴 세포골격에의 결합으로 차단되기 때문에, 이 돌연변이는 활성화 돌연변이인 것으로 믿어진다(33, 34). 다중-키나제 억제제 레고라페닙은 ABL1을 포함하여 비-수용체 티로신 키나제를 표적화하는 것으로 나타났다(40).
현재의 연구에서, 본 발명자들은 트라메티닙 및 레고라페닙 둘 다(개별적으로 및 조합하여) KRAS 및 ABL1 내 활성화 돌연변이를 갖는 CAPAN2 세포에서 세포 증식을 억제함을 나타낸다. 사실, 이들 두 억제제의 조합은 분리된 약물 중 어느 것보다도 훨씬 낮은 농도에서 세포사를 증가시키는 것으로 발견되었다(도 1-3). 관찰된 약물-약물 상호 작용의 정확한 유형을 평가하기 위해, 아이소볼로그래픽 분석을 적용하였다. 이 방법은 이들의 작용 메커니즘(mechanism of action)에 관계없이 활성 제제 조합의 유효성을 평가할 수 있게 한다(38,39). 레고라페닙 대 트라메티닙의 1:1 조합 및 2:1 조합은 둘 다 EC80 및 EC75에서 세포사에 대해 상승 작용적 효과를 갖는 반면에, 이들 두 약물의 2:1 조합은 EC60에서 세포사에 대해 상승 작용적인 것으로 발견되었다(도 5).
세포를 트리메티닙과 레고라페닙의 조합으로 처리하는 경우 관찰된 2상 반응은 매칭된 단일요법 중 어느 하나로 처리한 이후의 어떠한 농도에서도 나타나지 않았다(도 1-3). 이 2상 반응은 다양한 화학 작용제로 처리된 많은 인간 종양 세포주에서 설명되었던 호르메틱(hormetic) 효과를 연상시킨다(53). 이 효과의 정확한 원인은 불명확하지만, 적어도 부분적으로는, 스트레스에 대한 세포의 반응으로 인한 호르메시스인 것으로 생각된다(53). 전술한 바와 같이, 단독 약물 중 어느 하나를 이용한 처리는 그러한 효과를 나타내지 않고, 두 약물을 조합하여 이용한 경우에만 나타난다는 것은 흥미로운데, 이는 비록 결정되어야 하는 채로 남아있지만, 어떤 농도에서 키나제의 조합된 억제가 아마도 단독 약물 중 어느 하나보다 세포에 더 스트레스성일 가능성을 제기한다.
전반적으로 본 연구는 게놈 변경과 매칭된 항암 약물의 단일요법 및 조합의 체계적인 분석을 보고하고 다음과 같은 개념을 뒷받침한다: 1) 치료가능한 변경을 표적화하는 매칭된 단일요법은 표준 치료와 비교하여 세포사의 유의적인 증가를 제공한다; 그리고 2) 더 중요하게는, 매칭된 조합 요법이 매칭된 단일요법 또는 표준 치료 중 어느 하나보다 훨씬 더 효과적인 치료를 제공할 가능성을 갖는다. 암 종양 유전체학 분석, 및 약물 설계 및 개발에서의 최근의 발전과 종합하여 볼 때, 이제 연구자와 임상의가 개인 질병으로서 암을 치료할 수 있는 기회와 수단을 가지고 있음이 분명하다.
다른 구현예
상기에 제시된 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 그러나, 이들 구현예는 본 발명의 여러 가지 양태의 예시로서 의도되므로, 본원에 기재되고 청구되는 본 발명은 본원에 개시된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 임의의 동등한 구현예는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 실제로, 본 발명의 발견의 사상 또는 범위를 벗어나지 않는 전술된 상세한 설명으로부터, 본원에 나타나고 기재된 것뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
참조 문헌
본 출원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 참조 문헌은, 모든 목적을 위해 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 참조 문헌이 구체적이고 개별적으로 그 전체가 참조로 포함된 것으로 나타나는 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 참조 문헌의 인용은 그러한 것이 본 발명의 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되지 않아야한다.
구체적으로, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도되며, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 것은 하기의 간행물이다:
Claims (31)
- 암을 가진 환자를 위한 치료법을 식별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
(a) 환자로부터, 암 세포를 함유하는 시료를 수득하는 단계;
(b) 이 시료의 NGS 염기서열분석의 결과를 수득하는 단계;
(c) 암 세포에서 각각 치료가능한 돌연변이를 갖는 2개 이상의 표적 유전자를 식별하는 단계;
(d) (c)에서 식별한 2개 이상의 식별된 표적 유전자의 각각에 대하여 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 1개 이상의 물질의 존재 하에서, 암 세포를 배양하는 단계;
(e) 1개 이상의 물질의 존재 하에서 암 세포의 생존도(viability)를 측정하는 단계; 및
(f) 1개 이상의 물질의 존재 하에서 세포의 생존도가 (i) 2개 이상의 물질의 부재 하에서의 생존도보다 낮거나; (ii) 1개 이상의 비-표적화된, 표준 치료(standard-of-care) 물질의 존재 하에서의 생존도보다 낮거나; (iii) 표적화되었지만 비-매칭된 물질(=음성 대조군)의 존재 하에서의 생존도보다 낮은 경우에, 환자에게 치료법이 효과적일 수 있다는 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 암을 가진 환자를 위한 치료법을 식별하기 위한 정보를 제공하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 식별된 표적 유전자 각각은 상이한 경로에 맵핑되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 암이 췌관 선암종이고 2개 이상의 식별된 표적 유전자가 KRAS 및 ABL1인, 방법.
- 제3항에 있어서, KRAS가 병원성 변경을 함유하거나. 또는 ABL1이 병원성 변경을 함유하거나, 또는 KRAS 및 ABL1 둘 다 병원성 변경을 함유하는, 방법.
- 제3항에 있어서, KRAS, ABL1, 및 FANCC가 병원성 변경을 함유하는, 방법.
- 제3항에 있어서, KRAS의 G12가 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 ABL1의 G1060이 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되는, 방법.
- 제3항에 있어서,
KRAS의 G12가 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되고/되거나;
ABL1의 G1060이 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되는, 방법. - 제3항에 있어서,
KRAS의 G12가 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되고/되거나;
ABL1의 G1060이 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되고/되거나;
FANCC의 E521이 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-표준 아미노산으로 치환되는, 방법. - 제3항에 있어서, 상기 KRAS 유전자를 표적화하는 1개 이상의 물질이 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK)의 억제제인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 트라메티닙인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 ABL1 유전자를 표적화하는 1개 이상의 물질이 티로신 키나제 억제제인, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 레고라페닙인, 방법.
- 제1항에 있어서, 트라메티닙과 레고라페닙의 조합 요법이 암을 가진 환자를 위한 치료 방법으로서 식별되는, 방법.
- 유효량의 트라메티닙으로 이루어진 제1 성분 및 유효량의 적어도 1개의 추가적인 항암제를 포함하는 제2 성분을 포함하는, 암 치료용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 트라메티닙 및 적어도 1개의 추가적인 항암제의 총량(collective amount)이 상승 작용적인 치료적 항암 효과를 제공하는, 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 트라메티닙 및 적어도 1개의 추가적인 항암제의 총량이 강화된 치료적 항암 효과를 제공하는, 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 트라메티닙 및 적어도 1개의 추가적인 항암제의 총량이 상승 작용적인 치료적 항암 효과를 제공하는, 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 암이 고형 종양 및 비-고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 암이 결장직장암, 위암, 결장직장암, 췌장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형 종양인, 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 적어도 1개의 추가적인 항암제가 화학요법제인, 조성물.
- 유효량의 레고라페닙으로 이루어진 제1 성분 및 유효량의 적어도 1개의 추가적인 항암제를 포함하는 제2 성분을 포함하는, 암 치료용 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 레고라페닙 및 적어도 1개의 추가적인 항암제의 총량이 강화된 치료적 항암 효과를 제공하는, 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 레고라페닙 및 적어도 1개의 추가적인 항암제의 총량이 상승 작용적인 치료적 항암 효과를 제공하는, 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 암이 고형 종양 및 비-고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 암을 가진 환자를 위한 치료법의 식별용 키트로서,
(a) 암 세포에서 각각 병원성 및 치료가능한 돌연변이를 갖는 2개 이상의 표적 유전자의 데이터(NGS 염기서열분석 또는 다른 방법을 이용함);
(b) 유전자-약물 물질 상호작용의 목록, 및
(c) (a)에서 식별한 2개 이상의 식별된 표적 유전자 각각에 대해 치료가능한 돌연변이를 표적화하는 1개 이상의 물질, 및
(d) (c)에서의 1개 이상의 물질 각각의 존재 하에서 환자로부터의 암 세포를 배양하기 위한 배지를 포함하며,
1개 이상의 용기(container)에 패키징(packaging)된, 암을 가진 환자를 위한 치료법의 식별용 키트. - 제26항에 있어서, 상기 암이 췌관 선암종이고 2개 이상의 식별된 표적 유전자가 KRAS 및 ABL1인, 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 KRAS 유전자를 표적화하는 1개 이상의 물질이 미토겐/세포외 신호-관련 키나제(MEK)의 억제제인, 키트.
- 제28항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 트라메티닙인, 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 ABL1 유전자를 표적화하는 1개 이상의 물질은 티로신 키나제 억제제인, 키트.
- 제30항에 있어서, 티로신 키나제 억제제가 레고라페닙인, 키트.
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