JP2020530498A - 癌における複数の変異を標的とする薬物の組み合わせ - Google Patents
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- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
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Abstract
患者の癌を治療する方法が開示される。本方法は、(a)NGSまたは他の技法による患者からの癌細胞の試料のスクリーニングにより特定された病原性遺伝子を標的とする物質のセットを定義することと、(b)それぞれが作用可能な変異を含む癌細胞中の2つ以上の標的遺伝子を特定することと、(c)インビトロ培養細胞実験を使用して、特定された2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて作用可能な変異を標的とする(順次または同時に投与された)1つ以上の物質の効果を試験することと、(d)患者の癌の治療に使用される潜在的な効果的な治療オプションを指定することと、を含む。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
この出願は、2017年8月11日に出願された米国仮出願第62/544,693号から優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、2017年8月11日に出願された米国仮出願第62/544,693号から優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
適用しない。
適用しない。
本発明は、癌治療に関し、より具体的には、複数の癌細胞変異の特定および同時標的化に関する。
高度な分子技術の開発により、個別化医療が癌の診断と治療の最前線に登場した(1)。これにより、細胞毒性のある非特異的な化学療法から分子標的化アプローチへの移行がもたらされた(2)。このような標的化アプローチは、ハイスループットで大規模な並列シーケンスを実行する次世代シーケンシング(NGS)技術の開発の結果、ほぼ可能になった(3、4)。
膵管腺癌(PDAC)は、膵臓の小さな管または管の内側を覆う細胞から発生する外分泌性膵臓腫瘍である。これは、PDACが世界中のすべての癌関連死亡の最大4%を占め、わずか約25%の5年生存率であるいう点で非常に攻撃的な癌である(5)。
したがって、本明細書の発明者らは、PDACを含む癌の治療のための改善されたアプローチを考案することに成功した。このアプローチでは、癌細胞内の2つ以上の遺伝子または経路の作用可能な(actionable)変異を標的とする。
したがって、様々な実施形態において、本発明は、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法を対象とする。この方法には、(NGSシーケンシングまたは他の方法を使用して)それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞内の2つ以上の標的遺伝子を特定することと、(a)遺伝子−原薬相互作用のリスト、および(b)患者の腫瘍/癌試料で特定された2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて、作用可能な変異を標的とする1つ以上の物質を患者に投与することと、が含まれる。様々な態様において、試料は、癌細胞または癌DNAを含む無細胞試料でよく、2つ以上の標的遺伝子は異なる経路にマップされる。様々な実施形態において、癌はPDACであってもよく、2つ以上の標的遺伝子はKRAS(またはマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)経路を介してシグナル伝達する遺伝子)およびABL1(またはチロシンキナーゼ(TK)経路を介してシグナル伝達する遺伝子)でよい。阻害剤は、マイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)阻害剤、トラメチニブ、および複数のチロシンキナーゼ阻害剤、レゴラフェニブ)でよい。
様々な他の実施形態では、癌を有する患者の治療を特定する方法を対象とする。この方法は、(a)癌細胞を含む試料を患者から取得することと、(b)NGS技術を使用して試料をスクリーニングすることと、(c)それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞中の2つ以上の標的遺伝子を特定することと、(d)(c)で特定された2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて作用可能な変異を標的とする1つ以上の物質の存在下で癌細胞を培養することと、(e)1つ以上の物質の存在下で癌細胞生存率を測定することと、(f)1つ以上の標的物質の存在下で細胞の生存率が、(i)2つ以上の物質の非存在下での生存率よりも低く、(ii)1つ以上の標準治療対象外の物質の存在下での生存率より低く、(iii)標的とされているが適合しない物質(陰性対照)の存在下での生存率よりも低い場合に、決定することと、を含み得る。様々な側面において、2つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれは、異なる経路に影響を及ぼす。様々な実施形態において、癌はPDACであり、2つ以上の特定された標的遺伝子はKRASおよびABL1である。阻害剤は、マイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)阻害剤であるトラメチニブおよびチロシンキナーゼ阻害剤であるレゴラフェニブである。標準治療の非標的物質はゲムシタビンであり、標的であるが適合しない物質はパルボシクリブでよい。
様々な他の実施形態は、癌を有する患者の治療を特定するためのキットを対象とする。キットは、(a)NGS(またはその他の技法)によって得られた患者の癌細胞異常のリストと、(b)遺伝子−原薬相互作用のリストと、(c)リスト(a)から特定された2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて、作用可能な変異を標的とする1つ以上の物質と、(d)1つ以上の容器にパッケージされた、(b)の1つ以上の物質のそれぞれの存在下で患者から癌細胞を培養するための培地と、を含む。様々な実施形態において、癌はPDACであり、2つ以上の特定された標的遺伝子はKRASおよびABL1である。阻害剤は、マイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)阻害剤であるトラメチニブおよびチロシンキナーゼ阻害剤であるレゴラフェニブでよい。
本教示のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、実施例、および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解されるようになる。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を決して限定することを意図していない。
本発明は、癌患者の治療における癌細胞の2つ以上の変異の特定および標的化を対象とする。
本明細書で使用される以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味で定義される。
「約」という用語は、数値指定の前に使用される場合、例えばpH、温度、量、濃度、範囲などの分子量は、±5%、±1%、または±0.1%変化する可能性がある近似値を示す。
明細書および請求項で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「薬学的に許容される担体」という用語は、その混合物を含む複数の薬学的に許容される担体を含み得る。
「および/または」という用語は、本発明の2つの構成要素の一方または両方を意味することを意図している。
「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、哺乳動物、特にヒトを指す。
本明細書で使用される「デバイス」という用語は、薬物の送達を必要とする患者に薬物を送達することができる装置またはシステムを指す。
用語「治療を必要とする」および用語「それを必要とする」は、交換可能に使用され、患者が治療から利益を得るとの、介護者、例えば医師、看護師、看護師によって行われる判断を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに過度に有害ではない医薬組成物の成分を指す。
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指し、親水性物質、疎水性物質、および乳化剤などの親水性と疎水性の両方の性質を有する物質である液体および粉末を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、研究者、医療提供者、または個人が探している組織、システム、または個人の生物学的または医学的応答を引き出す活性化合物または医薬品の量を指す。
本明細書で使用される「w/w」という用語は、質量分率、すなわち、成分の質量を全体の総質量で割ったものを指すものとする。「w/w%」という用語は、質量分率に100を掛けたものを指す。同様に、「w/v」という用語は、体積濃度、すなわち全体の総体積で割った成分の質量を指し、「w/v%」という用語は体積濃度に100を掛けたものを指す。
本発明の様々な実施形態は、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法、および癌を有する患者の治療方法を特定する方法を対象とする。
「癌」という用語は、異常な細胞が制御されずに分裂し、しばしば近くの組織に侵入し、血液およびリンパ系を介して体の他の部分に広がる疾患のグループを指す。1つの特定の癌は膵管腺癌(PDAC)である。PDACは膵管から発生する極めて侵攻性の癌であり、世界中の癌関連死亡の最大4%を占め、5年生存率はわずか約25%である(5)。
本明細書で使用される「試料」という用語は、例えばコア生検、針吸引生検などを含む切除または切開生検などの患者の癌からの癌性組織または細胞群を指す。「試料」は、癌からのDNAを含む患者から得られた無細胞液であってもよい。
患者からの試料は、次世代シーケンシング(NGS)を使用してスクリーニングできる。NGSは、数百万のDNAテンプレートを大規模に並列配列できる技術を指す(3、4)。この用語には、第1世代のジデオキシ「サンガー」配列決定とは区別される、第2世代および第3世代の配列決定が含まれる。NGS技術では、固体支持体マトリックス上でDNAテンプレートのクローン増幅を行い、続いて周期的配列決定を行う。NGSの例には、MiSeq(登録商標)、HiSeq(登録商標)およびNextSeq(登録商標)(Illumina Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア)などの製品の合成によるシーケンス(リバーシブルターミネーターベース)、Ion Torrent(登録商標)、Ion Proton(登録商標)(Life Technologies(登録商標)、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム)などの製品、およびPACBIO(登録商標)RSII(Pacific Biosciences、メンロパーク、カリフォルニア州)などの単一分子リアルタイムシーケンスが含まれる。
「病原性変異」という用語は、癌などの特定の疾患または障害に対する個人の感受性または素因を高める遺伝子変化を指す。
「作用可能な変異」という用語は、癌などの特定の疾患または障害を効果的に治療する際に薬物が標的とする遺伝子または経路に影響を与える変異を指す(6、7)。作用可能な変異は、経路を標的とする治療が効果的であるように、既知の経路にマッピングされる(8)。そのような治療薬は、特にPDCAの治療のために、MEK阻害剤、トラメチニブおよび多重チロシンキナーゼ阻害剤、レゴラフェニブなどの阻害剤を含んでもよい。
癌原遺伝子は、変異またはコピー数の増加によって活性化されると癌遺伝子になり、癌の一因となる正常な遺伝子である。癌原遺伝子は、細胞分裂またはアポトーシスの調節につながるシグナルを提供するなど、細胞内で様々な機能を有している可能性がある。
標的遺伝子の1つは変異KRAS遺伝子であり得る。変異したKRAS癌遺伝子は、細胞の成長と分化を制御するマイトジェン活性化(MAP)キナーゼ経路に寄与する(9)。KRASはGTPにより活性化され、RAFキナーゼ、MEKキナーゼ、ERKキナーゼの連続的な活性化を引き起こし、ERKは転写因子をリン酸化して細胞増殖を引き起こす(10)。作用性のあるMEK阻害剤の1つはトラメチニブで、これはMEKのRAF依存性活性化を通じてERKリン酸化を抑制する(11)。トラメチニブは、約1〜約3mg/日PO、特に2mg/日POで投与されてもよい。
標的遺伝子のもう1つは、異常に活性化されて癌遺伝子になると下流のシグナル伝達経路を乱し、増強された増殖、分化停止、細胞死に対する抵抗性を引き起こすタンパク質チロシンキナーゼをコードするABL1癌原遺伝子でよい(12)。作用可能なABL1キナーゼ阻害剤の1つは、複数のプロテインキナーゼの阻害剤であるレゴラフェニブである(13)。レゴラフェニブは、約80〜約240mg/日PO、特に約160mg/日POで投与されてもよい。
様々な他の実施形態は、癌を有する患者の治療方法を特定するキットを対象とする。キットには、遺伝子と薬物の相互作用のリストが含まれる、患者由来の癌細胞の試料。NGSまたはその他の技法によって取得されたこれらの癌細胞の異常のリスト。キットは、可能な組み合わせ標的療法のリストを生成する。PDACを有する患者の治療方法を特定するためのキットでは、2つの標的遺伝子はKRASおよびABL1でよい。これらの2つの標的遺伝子には、トラメチニブ(MEK阻害剤)とレゴラフェニブ(チロシンキナーゼ阻害剤)がキットに含まれる。キットにさらに含まれるのは、患者から得られた試料癌細胞を培養するための培地でよい。そのような培地は、例えば、カリフォルニア州カールスバッドのLife Technologies−Gibcoから入手できる10%FCS、1Xペニシリン/ストレプトマイシンおよび1Xアンホテリシンを補充したマッコイ改変5A培地などの標準的な培地でよい。キットの各成分は、適切な説明書とともに1つ以上の容器にパッケージされる。
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができ、これらの実施例は、本教示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1
この実施例は、培養法で治療薬の組み合わせを使用して、癌細胞の複数の作用可能な変異を同時(concurrently)に/同時(simultaneously)に標的化する有効性を示す。
この実施例は、培養法で治療薬の組み合わせを使用して、癌細胞の複数の作用可能な変異を同時(concurrently)に/同時(simultaneously)に標的化する有効性を示す。
導入
癌治療は、依然として大部分が「すべてに適合する」アプローチであり、大半の治療選択肢と手順(例えば、手術、放射線療法、化学療法)が特定の種類の癌(例えば、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌)との闘いを主な目的とする(14)。しかし、過去数年にわたり、次世代配列決定戦略の活用により、癌の感受性と進行を促進する遺伝子変化に関する知識が大幅に増加しただけでなく、個々の患者の癌の特有の性質を明らかに示している(15)。これらの遺伝子変化の多くによって影響を受けるタンパク質と経路を標的とする治療法の開発の進歩とともに、これは一人の患者の癌を攻撃することを目的とした個別の癌治療戦略を利用する可能性を高めた(16)。
癌治療は、依然として大部分が「すべてに適合する」アプローチであり、大半の治療選択肢と手順(例えば、手術、放射線療法、化学療法)が特定の種類の癌(例えば、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌)との闘いを主な目的とする(14)。しかし、過去数年にわたり、次世代配列決定戦略の活用により、癌の感受性と進行を促進する遺伝子変化に関する知識が大幅に増加しただけでなく、個々の患者の癌の特有の性質を明らかに示している(15)。これらの遺伝子変化の多くによって影響を受けるタンパク質と経路を標的とする治療法の開発の進歩とともに、これは一人の患者の癌を攻撃することを目的とした個別の癌治療戦略を利用する可能性を高めた(16)。
この概念を支持する多くの研究が、いくつかの異なるタイプの癌の治療における特定の変異を標的とする単剤療法の有効性を実証している。いくつかのリスク(例えば、毒性および薬剤耐性)がないわけではないが、これらの研究の多くは、非標的アプローチと比較して、反応率と無増悪生存期間の大幅な増加を実証している(16〜20)。しかし、全ゲノムシーケンシングが実証しているように、癌ゲノムは一般に、単一遺伝子の変化ではなく、全体的な遺伝的不安定性(すなわち、変異の負荷)に起因する遺伝的異常のカクテルによって特徴付けられる(21)。それにもかかわらず、標的化療法が実施されているほとんどの癌患者は、一般に、単剤適合異常(単剤療法)を目的とした療法で治療されている。これは、そのような標的化単剤療法の結果に基づいて、本明細書の発明者らが、患者の癌ゲノムプロファイルによって示される作用可能な変化のセット全体に適合する療法の組み合わせがより良い応答をもたらす可能性が高いと考えている事実にもかかわらず、そうである。
適合した併用療法の有効性の証明として、ヒト/患者の膵管腺癌に由来する確立された細胞株であるCAPAN2を使用して、インビトロ細胞ベースの生存率アッセイを実施した(22)。この細胞株は特徴づけられており、いくつかの変異がある。そのいくつかは、細胞で見られる遺伝子異常の影響を受ける経路を特異的に阻害する利用可能なFDA承認薬と適合した(「適合」療法)。したがって、この研究では、次のいずれかで処理された細胞間で細胞生存率の比較が行われた:1)膵管癌(すなわち、ゲムシタビン)の標準治療(23)、2)細胞内で変更された選択された単一/固有のシグナル伝達経路を標的とする個々の薬物/阻害剤との単独療法との適合、および3)選択された同じ異常に適合する併用療法。
材料および方法
材料
特に明記しない限り、ゲムシタビン、トラメチニブ、パルボシクリブ、およびレゴラフェニブを含むすべての化学物質は、SelleckChem(ヒューストン、テキサス州)から入手した。McCoyの5A修飾成長培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、アンホテリシン、およびウシ胎児血清は、Life Technologies−Gibco(カリフォルニア州カールスバッド)から入手した。組織培養皿、血清ピペット、ピペットチップ、および微量遠心管を含むすべてのプラスチック製品は、Fisher Scientific(ミズーリ州セントルイス)製であった。
材料
特に明記しない限り、ゲムシタビン、トラメチニブ、パルボシクリブ、およびレゴラフェニブを含むすべての化学物質は、SelleckChem(ヒューストン、テキサス州)から入手した。McCoyの5A修飾成長培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、アンホテリシン、およびウシ胎児血清は、Life Technologies−Gibco(カリフォルニア州カールスバッド)から入手した。組織培養皿、血清ピペット、ピペットチップ、および微量遠心管を含むすべてのプラスチック製品は、Fisher Scientific(ミズーリ州セントルイス)製であった。
細胞株の選択
細胞株は、1,000個の癌細胞株についてDNAコピー数、mRNA発現、変異データなどの分析および視覚化へのアクセスを提供するCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)の分析によって選択された(24)。関心のある細胞株の選択基準には以下が含まれる:1)細胞株が提示する変異の総数は、少なくとも5であるが、10を超えてはならない(追加の交絡因子の複雑さを避けるため)、2)作用可能な標的の数は、少なくとも2つであるが、3つを超えるべきではない(試験する潜在的な薬物の組み合わせの数を制限するため)、3)変異は著しく重複することはなく、明確な発癌経路に影響を与えるべきである(薬物治療の重複を避けるため)。18の細胞株のセットから、ヒト膵臓腺癌原発腫瘍に由来するCAPAN2を選択した。
細胞株は、1,000個の癌細胞株についてDNAコピー数、mRNA発現、変異データなどの分析および視覚化へのアクセスを提供するCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)の分析によって選択された(24)。関心のある細胞株の選択基準には以下が含まれる:1)細胞株が提示する変異の総数は、少なくとも5であるが、10を超えてはならない(追加の交絡因子の複雑さを避けるため)、2)作用可能な標的の数は、少なくとも2つであるが、3つを超えるべきではない(試験する潜在的な薬物の組み合わせの数を制限するため)、3)変異は著しく重複することはなく、明確な発癌経路に影響を与えるべきである(薬物治療の重複を避けるため)。18の細胞株のセットから、ヒト膵臓腺癌原発腫瘍に由来するCAPAN2を選択した。
細胞培養
ヒト膵臓癌細胞株CAPAN2は、American Type Culture Collection(ATCC;バージニア州マナサス)から購入した。細胞は、10%FCS、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、および1Xアムホテリシンを添加したMcCoy’s Modified 5A培地で増殖させた。試験では、PBS(カルシウムを含まない)で約30分間、続いて0.25%トリプシン−EDTAで、37℃で5分間処理することにより、細胞を皿から放出した。細胞を15mlの遠心管に集め、臨床用遠心分離機で5分間遠心分離した後、1mlの新鮮な培地に再懸濁し、血球計を使用して細胞をカウントした。細胞(1×103〜5×103)、メディアの100μLで96ウェルプレートに播種し、細胞を48時間インキュベートした。48時間後、薬剤で処理する前に、培地を交換し、細胞をさらに24時間再インキュベートした。
ヒト膵臓癌細胞株CAPAN2は、American Type Culture Collection(ATCC;バージニア州マナサス)から購入した。細胞は、10%FCS、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、および1Xアムホテリシンを添加したMcCoy’s Modified 5A培地で増殖させた。試験では、PBS(カルシウムを含まない)で約30分間、続いて0.25%トリプシン−EDTAで、37℃で5分間処理することにより、細胞を皿から放出した。細胞を15mlの遠心管に集め、臨床用遠心分離機で5分間遠心分離した後、1mlの新鮮な培地に再懸濁し、血球計を使用して細胞をカウントした。細胞(1×103〜5×103)、メディアの100μLで96ウェルプレートに播種し、細胞を48時間インキュベートした。48時間後、薬剤で処理する前に、培地を交換し、細胞をさらに24時間再インキュベートした。
細胞処理、生存率アッセイ、用量反応評価
目的の細胞株に対応するゲノム情報(すなわち、変異状態、コピー数の変動など)を分析し、トラメチニブ(MEKINIST(登録商標)、KRAS活性化変異に対抗するMEK阻害剤)とレゴラフェニブ(STIVARGA(登録商標)、マルチキナーゼ阻害剤)の組み合わせABL1活性化変異に対抗する)は、これらの2つの作用可能な変異を標的とするため、CAPAN2細胞の潜在的な治療レジメンとして選択された。
目的の細胞株に対応するゲノム情報(すなわち、変異状態、コピー数の変動など)を分析し、トラメチニブ(MEKINIST(登録商標)、KRAS活性化変異に対抗するMEK阻害剤)とレゴラフェニブ(STIVARGA(登録商標)、マルチキナーゼ阻害剤)の組み合わせABL1活性化変異に対抗する)は、これらの2つの作用可能な変異を標的とするため、CAPAN2細胞の潜在的な治療レジメンとして選択された。
原薬溶液は、製造元の指示に従ってDMSOで調製したマスター原液から完全な培地で調製した。これらの原液を使用して、レゴラフェニブとトラメチニブの1:1、2:1、5:1、および10:1の体積−体積(v/v)混合物を調製した。次に、これらの混合物を2倍連続希釈して、それぞれの場合に20の濃度範囲を生成した。細胞生存率アッセイ/評価の前に、細胞を薬物混合物中で48〜72時間インキュベートした。
細胞の生存率は、WST−1比色細胞増殖アッセイ(Roche)を使用して、製造元の指示に従って決定した。安定したテトラゾリウム塩WST−1は、主に細胞表面で発生する複雑な細胞メカニズムによって、可溶性ホルマザンに切断される。この減少は、生細胞におけるNAD(P)Hの解糖生産に大きく依存する。したがって、形成され、分光光度計(BIO−TEK 340、BIOTEK)を使用して推定されるホルマザン色素の量は、培養中の代謝的に活性な細胞の数と直接相関する。すべての試験ポイントは、少なくとも3回行った。
データは、Excel 2016(Microsoft)、GraphPad Prism 5(GraphPad Software)、およびDr Fit(Dr Fitソフトウェア)で処理された(12)。データを使用して用量反応曲線を作成し、20%、25%、または40%の成長阻害(それぞれIC20、IC25、およびIC40)を示す薬物濃度をさらに分析するために決定した。
アイソボログラム分析
組み合わせて投与された薬物は、個々の効能から予測される効果よりも大きいまたは小さい効果を発揮することがある。薬物の組み合わせの効果を評価するために、薬物ペア間の相乗効果、相加性、または拮抗作用を検出するアイソボログラム分析を実施した(26)。一般に、薬物ペアが各薬物単独の場合と比較して阻害効力を改善する場合、その組み合わせは相乗的とみなされる。効力が変わらない場合、効果は相加的とみなされる。また、効力が低下した場合、その効果は拮抗的とみなされる。トラメチニブとレゴラフェニブの用量依存的相互作用を説明するために、癌細胞増殖の効果レベル20%、25%、40%の阻害のアイソボログラムを作成した。これらのそれぞれにおいて、相加性は、その単一の使用(IC20、IC25、およびIC40)からの組み合わせで各薬物の用量要件を推定することにより決定された。相加性の線の上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。
組み合わせて投与された薬物は、個々の効能から予測される効果よりも大きいまたは小さい効果を発揮することがある。薬物の組み合わせの効果を評価するために、薬物ペア間の相乗効果、相加性、または拮抗作用を検出するアイソボログラム分析を実施した(26)。一般に、薬物ペアが各薬物単独の場合と比較して阻害効力を改善する場合、その組み合わせは相乗的とみなされる。効力が変わらない場合、効果は相加的とみなされる。また、効力が低下した場合、その効果は拮抗的とみなされる。トラメチニブとレゴラフェニブの用量依存的相互作用を説明するために、癌細胞増殖の効果レベル20%、25%、40%の阻害のアイソボログラムを作成した。これらのそれぞれにおいて、相加性は、その単一の使用(IC20、IC25、およびIC40)からの組み合わせで各薬物の用量要件を推定することにより決定された。相加性の線の上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。
イソボログラムは、y軸にトラメチニブの濃度を、x軸にレゴラフェニブの濃度をプロットすることによって作成した。相加性のアイソボールは、各薬物(単剤療法で使用する場合)のIC20(またはIC25、IC40)をそれぞれの軸にプロットし、それらを対角線で結ぶことによって生成した。異なる用量比でのトラメチニブとレゴラフェニブの組み合わせの効果は、このXYグラフにそれぞれのIC20(またはIC25、IC40)をプロットすることにより決定した。
統計分析
すべての値は、平均+/−SDとして報告された。スチューデントのt検定を使用して、治療間の違いを評価した。0.05以下のp値は、すべての結果の有意性とみなされた。
すべての値は、平均+/−SDとして報告された。スチューデントのt検定を使用して、治療間の違いを評価した。0.05以下のp値は、すべての結果の有意性とみなされた。
結果
細胞株の選択。
選択した薬物レジメンの有効性を試験する細胞株は、約1,000個の細胞株の分子注釈を含むデータベースから選択された(Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE、Novartis/Broad Institute)(24)。多数の基準(例えば、変異の数と種類、変異の病原性と作用性)を使用して、目的の細胞株のリストを18の可能な選択肢に減らした(表1)。
細胞株の選択。
選択した薬物レジメンの有効性を試験する細胞株は、約1,000個の細胞株の分子注釈を含むデータベースから選択された(Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE、Novartis/Broad Institute)(24)。多数の基準(例えば、変異の数と種類、変異の病原性と作用性)を使用して、目的の細胞株のリストを18の可能な選択肢に減らした(表1)。
このリストから、56歳の白人男性の膵管腺癌(PDAC)に由来する上皮細胞株であるCAPAN2(23)が分析のために選択された。最適な培養条件では、細胞は約96時間の倍加時間を示す(9)。CCLEによると、CAPAN2細胞は約8個のミスセンス変異を有しており、そのうち3個(KRAS p.G12V;ABL1 p.G1060D;FANCC p.E521K)が作用可能な標的であることが判明した(表1)。しかし、FANCC p.E521Kはヘテロ接合性の変異であり、その機能的意義は不明であるため(27)、他の2つの作用可能な変異に注目した。
KRAS
小さなGTPaseであるKRASは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路への関与を通じて、細胞の成長と増殖の調節に機能する(図6)。通常の条件下では、成長因子(例えば、EGF、VEGF、PDGF)が対応する受容体チロシンキナーゼ(例えば、EGFR、VEGFR、PDGFR)に結合するとKRASが活性化される。KRASのこの誘導性の活性化は、その後、下流の分子であるRAF(ARAF、BRAFおよびCRAF)を刺激し、続いて下流のマイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼキナーゼ、MEK1およびMEK2、ERK1およびERK2をリン酸化および活性化する(図6)。最終的に、ERK1/2は核に移行し、細胞増殖に必要な遺伝子の転写を増強する。成長因子の刺激がない場合、KRASは通常、GTPのGDPへの脱リン酸化によって不活性化されたままになる。しかし、変異型では、KRASはGTPをGDPに切断する能力を失い、したがって(成長因子が結合していない場合でも)構成的に活性を維持し、制御されない連続的な細胞増殖と成長をもたらす。
表2.CAPAN2細胞で見つかった遺伝子異常のリスト。変更された遺伝子がリストされ、それらのゲノム配列(既知の場合)および結果のタンパク質配列が表示される。タンパク質の機能に対する変異の影響、および異常が作用するかどうか(すなわち、変異効果を直接または間接的に治療する薬剤があるか)も示されている。
小さなGTPaseであるKRASは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路への関与を通じて、細胞の成長と増殖の調節に機能する(図6)。通常の条件下では、成長因子(例えば、EGF、VEGF、PDGF)が対応する受容体チロシンキナーゼ(例えば、EGFR、VEGFR、PDGFR)に結合するとKRASが活性化される。KRASのこの誘導性の活性化は、その後、下流の分子であるRAF(ARAF、BRAFおよびCRAF)を刺激し、続いて下流のマイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼキナーゼ、MEK1およびMEK2、ERK1およびERK2をリン酸化および活性化する(図6)。最終的に、ERK1/2は核に移行し、細胞増殖に必要な遺伝子の転写を増強する。成長因子の刺激がない場合、KRASは通常、GTPのGDPへの脱リン酸化によって不活性化されたままになる。しかし、変異型では、KRASはGTPをGDPに切断する能力を失い、したがって(成長因子が結合していない場合でも)構成的に活性を維持し、制御されない連続的な細胞増殖と成長をもたらす。
表2.CAPAN2細胞で見つかった遺伝子異常のリスト。変更された遺伝子がリストされ、それらのゲノム配列(既知の場合)および結果のタンパク質配列が表示される。タンパク質の機能に対する変異の影響、および異常が作用するかどうか(すなわち、変異効果を直接または間接的に治療する薬剤があるか)も示されている。
すべてのPDACの約90%がKRASの活性化変異を示し、PDACで最も頻繁に変異する腫瘍性タンパク質になる(15)。さらに、置換p.G12Vなどのコドン12の変異は、PDACのすべてのKRAS変異の約98%を占める(16)。p.G12V変異は、キナーゼの構成的活性化を引き起こし(17)、結腸直腸および非小細胞肺腺癌などの追加の腫瘍タイプで観察される。
ABL1
ABL1癌原遺伝子は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着、ストレス応答に関与する非受容体型チロシンキナーゼをコードする(31)(図7)。ABL1は一般的な細胞内局在を示し、核、細胞質で見られ、アクチン細胞骨格に結合する(32)。核では、ABL1は細胞周期依存性およびDNA損傷誘導性の転写の制御に機能する(33)。細胞質では、この非受容体型チロシンキナーゼは遊離しており、糸状アクチンに結合する。遊離分子として、ABL1はいくつかの潜在的な調節シグナルの下流にあり、細胞の侵入と成長に関与する多くの下流タンパク質の活性を調節し、アクチン細胞骨格に結合している間、このキナーゼ活性はオフになる(33)(図7)。
ABL1癌原遺伝子は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着、ストレス応答に関与する非受容体型チロシンキナーゼをコードする(31)(図7)。ABL1は一般的な細胞内局在を示し、核、細胞質で見られ、アクチン細胞骨格に結合する(32)。核では、ABL1は細胞周期依存性およびDNA損傷誘導性の転写の制御に機能する(33)。細胞質では、この非受容体型チロシンキナーゼは遊離しており、糸状アクチンに結合する。遊離分子として、ABL1はいくつかの潜在的な調節シグナルの下流にあり、細胞の侵入と成長に関与する多くの下流タンパク質の活性を調節し、アクチン細胞骨格に結合している間、このキナーゼ活性はオフになる(33)(図7)。
チロシンキナーゼの構成的発現とさらなる過活動につながる慢性骨髄性白血病の特徴である(34)、発癌性融合タンパク質BCR−ABL1の十分に確立された役割とは対照的に、固形腫瘍の点変異により変異した場合のABL1のその役割についてはあまり知られていない(31)。ただし、この非受容体型チロシンキナーゼを活性化して細胞の形質転換を引き起こすことがわかっているABL1のチロシンキナーゼドメイン内にある多くの点変異とは異なり(35)、これらの細胞で見られるABL1のp.G1060D変異はキナーゼのアクチン結合ドメインで発生する。機能的に特徴付けられていないが、このドメインはアクチン細胞骨格へのキナーゼの細胞内局在の主要な決定因子であるため(AB1キナーゼ活性をブロックする)、これまでに特定されたABL1変異の形質転換は、細胞質の蓄積のみをもたらすキナーゼ(33,34)−タンパク質がF−アクチンに結合するとABL1のキナーゼ活性が阻害されるため、この変化はその細胞質レベルの増加とさらなる活性化をもたらすと推定される(32、35)。
薬物治療
ゲムシタビン単剤療法。
ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))単独療法は、数十年間膵臓癌の標準治療であり、この疾患の治療に使用される最も一般的な細胞毒性薬である(23)。このピリミジン類似体は細胞内でリン酸化され、DNA合成を阻害するDNAに組み込まれるため(37)、すべての増殖性細胞を標的とし(腫瘍細胞に制限されない)、したがって重要な副作用(好中球減少症による重度の骨髄抑制、および出血、脱毛症、吐き気と嘔吐、疲労など)をもたらす。ゲムシタビン治療は、最良の支持療法と比較して全生存期間に関してわずかな改善しかもたらさないという事実にもかかわらず(3ヶ月と比較して5〜6ヶ月)、2017年の時点で、ゲムシタビンは進行膵臓癌の標準治療のままである。(38)。
ゲムシタビン単剤療法。
ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))単独療法は、数十年間膵臓癌の標準治療であり、この疾患の治療に使用される最も一般的な細胞毒性薬である(23)。このピリミジン類似体は細胞内でリン酸化され、DNA合成を阻害するDNAに組み込まれるため(37)、すべての増殖性細胞を標的とし(腫瘍細胞に制限されない)、したがって重要な副作用(好中球減少症による重度の骨髄抑制、および出血、脱毛症、吐き気と嘔吐、疲労など)をもたらす。ゲムシタビン治療は、最良の支持療法と比較して全生存期間に関してわずかな改善しかもたらさないという事実にもかかわらず(3ヶ月と比較して5〜6ヶ月)、2017年の時点で、ゲムシタビンは進行膵臓癌の標準治療のままである。(38)。
この研究では、CAPAN2細胞を2nMから1mMの範囲の濃度のゲムシタビンの2倍連続希釈液で48〜72時間処理した。これらの培養条件下で、ゲムシタビンは細胞の生存にほとんど影響を与えないことがわかった(図1A)(IC20=111μM、1mMの濃度で約30%の細胞生存率の低下のみを達成)(p≦0.001)。
トラメチニブ単剤療法。
CAPAN2細胞では、KRASのp.G12V変異により、MAPKシグナル伝達経路のKRASの下流にある構成的に活性なマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)が生じる(図6)。MEKの選択的阻害剤としてのトラメチニブ(MEKINIST(登録商標))は、この構成的に活性化される経路の下流阻害剤である(39)。ゲムシタビンによる治療とは対照的に、48〜72時間にわたって100μM〜0.2nMの範囲の濃度のトラメチニブの単独療法で治療されたCAPAN2細胞は、細胞生存率を有意に低下させ、IC20は4nM(p≦0.05)およびIC50 28nM(p≦0.05)(図1B)であった。
CAPAN2細胞では、KRASのp.G12V変異により、MAPKシグナル伝達経路のKRASの下流にある構成的に活性なマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)が生じる(図6)。MEKの選択的阻害剤としてのトラメチニブ(MEKINIST(登録商標))は、この構成的に活性化される経路の下流阻害剤である(39)。ゲムシタビンによる治療とは対照的に、48〜72時間にわたって100μM〜0.2nMの範囲の濃度のトラメチニブの単独療法で治療されたCAPAN2細胞は、細胞生存率を有意に低下させ、IC20は4nM(p≦0.05)およびIC50 28nM(p≦0.05)(図1B)であった。
レゴラフェニブ単剤療法。
上記のように、ABL1のp.G1060D変異は、この非受容体型チロシンキナーゼの細胞質濃度の増加につながる活性化変異である可能性が高い(図7)。レゴラフェニブ(STIVARGA(登録商標))は、RET、VEGFR1−3、FGFR1−2、TIE2、およびABL1をはじめとする受容体および非受容体型チロシンキナーゼを標的とするマルチキナーゼ阻害剤である(40)。したがって、活性化された経路を阻害するはずである。レゴラフェニブ単独の2倍連続希釈(つまり、2nMから1mMの範囲の濃度)でCAPAN2細胞を処理すると、細胞生存率が大幅に低下し、IC20は約2μM(p≦0.05)(図1C)および7.1μMのIC50(p≦0.05)であった。
上記のように、ABL1のp.G1060D変異は、この非受容体型チロシンキナーゼの細胞質濃度の増加につながる活性化変異である可能性が高い(図7)。レゴラフェニブ(STIVARGA(登録商標))は、RET、VEGFR1−3、FGFR1−2、TIE2、およびABL1をはじめとする受容体および非受容体型チロシンキナーゼを標的とするマルチキナーゼ阻害剤である(40)。したがって、活性化された経路を阻害するはずである。レゴラフェニブ単独の2倍連続希釈(つまり、2nMから1mMの範囲の濃度)でCAPAN2細胞を処理すると、細胞生存率が大幅に低下し、IC20は約2μM(p≦0.05)(図1C)および7.1μMのIC50(p≦0.05)であった。
パルボシクリブ単剤療法。
膵管腺癌は、p16ink4aタンパク質(サイクリン依存性キナーゼ4および6(CDK4/6)の阻害剤)をコードする腫瘍抑制遺伝子であるCDKN2Aの喪失またはサイレンシングを含む、一連の遺伝的変化を示すことがわかっている(41)。CDKN2Aの機能変異の喪失は、CDK4およびCDK6を介した細胞周期の調節解除をもたらし、細胞増殖を増強する。CAPAN2細胞のCDKN2Aの状態は不明のままであるが、一部のグループはp16タンパク質の発現を実証しており、他のグループはこれらの細胞でCDKN2Aが不活性化されていることを示す(42)。細胞を、CDK4/6阻害剤の2倍連続希釈、125μM〜2nMの範囲の濃度のパルボシクリブで48〜72時間処理した。Palbociclibは、この研究で使用したCAPAN2細胞の生存に有意な影響を及ぼさないことがわかった(図1D)(IC20=15mM)。この発見は、p16機能活性の持続性を実証し、少なくともこの特定のCAPAN2細胞株では、増殖がCDK4および/またはCDK6に依存しないことを示す。さらに、この結果により、パルボシクリブは、比類のない単独療法として、陰性対照としても機能する。
膵管腺癌は、p16ink4aタンパク質(サイクリン依存性キナーゼ4および6(CDK4/6)の阻害剤)をコードする腫瘍抑制遺伝子であるCDKN2Aの喪失またはサイレンシングを含む、一連の遺伝的変化を示すことがわかっている(41)。CDKN2Aの機能変異の喪失は、CDK4およびCDK6を介した細胞周期の調節解除をもたらし、細胞増殖を増強する。CAPAN2細胞のCDKN2Aの状態は不明のままであるが、一部のグループはp16タンパク質の発現を実証しており、他のグループはこれらの細胞でCDKN2Aが不活性化されていることを示す(42)。細胞を、CDK4/6阻害剤の2倍連続希釈、125μM〜2nMの範囲の濃度のパルボシクリブで48〜72時間処理した。Palbociclibは、この研究で使用したCAPAN2細胞の生存に有意な影響を及ぼさないことがわかった(図1D)(IC20=15mM)。この発見は、p16機能活性の持続性を実証し、少なくともこの特定のCAPAN2細胞株では、増殖がCDK4および/またはCDK6に依存しないことを示す。さらに、この結果により、パルボシクリブは、比類のない単独療法として、陰性対照としても機能する。
トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法。
次に、トラメチニブとレゴラフェニブによるCAPAN2細胞の同時治療を使用して、CAPAN2細胞の生存に対する適合した併用療法の効果を調査した。これら2つの阻害剤を1:1の濃度で共投与すると、IC20が2nMのいずれかの薬物単独治療(単剤療法)と比較して、細胞死が大幅に増加した(図2)。
次に、トラメチニブとレゴラフェニブによるCAPAN2細胞の同時治療を使用して、CAPAN2細胞の生存に対する適合した併用療法の効果を調査した。これら2つの阻害剤を1:1の濃度で共投与すると、IC20が2nMのいずれかの薬物単独治療(単剤療法)と比較して、細胞死が大幅に増加した(図2)。
興味深いことに、これらの薬物のこの1:1の組み合わせの細胞生存率の用量反応曲線は、15nMから1μMの間で効率の損失を伴う、2相性のUが反転した形状を示す(図2)。それにもかかわらず、この効果の直前と直後に位置する濃度の2つの領域を調べると、レゴラフェニブとトラメチニブ単独では−2%、−10%と比較して、統計的に有意な細胞死の増加が示されており(図2B〜2C)(1:1の組み合わせで、300nMで−55%)(p≦0.05))、このことは細胞増殖に対する薬物の組み合わせの潜在的な相乗的阻害効果を示す。
両方の薬物の存在が各薬物単独の個々の効果を増強するかどうかを調査するために、「固定比率モデル」が採用された(43〜45)。このモデルでは、Loeweの(43〜45)の概念に基づいて、各用量反応曲線(薬物単独または併用)の勾配とICX値に基づいて組み合わせ指数(CI)値が計算され、薬物間相互作用は、相乗的(CI<1)、相加的(CI=1)、または拮抗的(CI>1)(Fi.4)である。これに続いて、細胞生存率の20%の減少をもたらす組み合わせ指数(CI)は0.345に等しく、細胞生存率の25%は0.320に等しく、一方、40%の生存率は1よりも大きいことがわかった。これは、ED80とED75の場合、両方の薬物を同じ濃度で使用すると、CAPAN2細胞の増殖に対する薬物の組み合わせの相乗効果があることを示す。(33)。
しかし、トラメチニブに対するレゴラフェニブの2:1濃度での薬物の同時投与は多少異なっていた(図3)。上記のように、二相性の用量反応曲線が見られ、細胞死の増加の2つの領域は、濃度0.78〜0.39μMから6.25/3.125μMの、明らかに増加した細胞生存の小さな領域に隣接する(図4B、4C)。それにもかかわらず、両方の場合(例えば、1:1、2:1濃度)、細胞生存の全体的なレベルはレゴラフェニブ単独で見られるものよりも著しく低く(図2〜3)、薬物の組み合わせは相乗的である(CI20%=0.568、CI25%=0.546、CI40%=0.471の場合、比率2:1を使用し、CI50%は1を超えていた)(図4)。同様の実験を、トラメチニブに対するレゴラフェニブの5:1および10:1の濃度で実施したが、これらの濃度比で細胞死の有意な差は見られなかった(データは非表示)。
トラメチニブとレゴラフェニブの細胞毒性は、膵管腺癌の癌細胞で相乗作用する。
次に相乗効果の読み取り値として、アイソボログラムを作成し、20%、25%、40%の癌細胞死における各薬物の用量要件を決定した。図5に示すように、レゴラフェニブ:トラメチニブノ1:1と2:1の組み合わせのアイソボールは、各相乗効果を示す効果レベル毎に追加のアイソボールを下回った。5:1および10:1のレゴラフェニブ:トラメチニブの組み合わせでのアイソボールは、各効果レベルで付加的なアイソボールに非常に近く、組み合わせの僅かな付加的な効果を示す(データ非表示)。
次に相乗効果の読み取り値として、アイソボログラムを作成し、20%、25%、40%の癌細胞死における各薬物の用量要件を決定した。図5に示すように、レゴラフェニブ:トラメチニブノ1:1と2:1の組み合わせのアイソボールは、各相乗効果を示す効果レベル毎に追加のアイソボールを下回った。5:1および10:1のレゴラフェニブ:トラメチニブの組み合わせでのアイソボールは、各効果レベルで付加的なアイソボールに非常に近く、組み合わせの僅かな付加的な効果を示す(データ非表示)。
討論
膵臓癌の80%以上は腺管腺癌(PDAC)であり(47)、癌関連死の4番目に多い原因として、最も致命的な固形悪性腫瘍の1つである(48)。ゲムシタビンは10年超にわたって高度PDACの唯一の有効な標準レジメンだったが、この疾患の5年生存率は過去40年間で大幅に改善されていない(38)。
膵臓癌の80%以上は腺管腺癌(PDAC)であり(47)、癌関連死の4番目に多い原因として、最も致命的な固形悪性腫瘍の1つである(48)。ゲムシタビンは10年超にわたって高度PDACの唯一の有効な標準レジメンだったが、この疾患の5年生存率は過去40年間で大幅に改善されていない(38)。
すべてのPDACの約90%が、PDACで最も頻繁に変異する癌遺伝子/タンパク質であるKirstenラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(KRAS)に変異を示す(28)。さらに、p.G12V(この研究で使用されたCAPAN2細胞に見られる)などのコドン12の変異は、PDACのすべてのKRAS変異の約98%を占める(29)。p.G12V変異は、このプロテインキナーゼの構成的活性化を引き起こし、細胞増殖、運動性、接着、浸潤、アポトーシスの遮断、化学療法に対する耐性の制御されない増加を媒介する一連の下流シグナル伝達イベントをもたらす(30)。それにもかかわらず、特定のRAS阻害剤は特定されておらず、このプロテインキナーゼは「ドラッグ不可能」であると広く認識されている(49)。
それにもかかわらず、少なくとも間接的に、その下流のエフェクターの阻害を通じてKRAS機能をブロックできる治療薬の開発と商業化が開発された。例えば、MEKの選択的阻害剤であるトラメチニブ(MEKINIST(登録商標))は、KRAS p.G12V変異によって構成的に活性化されるMAPキナーゼシグナル伝達経路の下流阻害剤であり(49)、そのようなMAPキナーゼ阻害剤はRASを標的とする重要な治療法であることが証明されている(40)。
非受容体型チロシンキナーゼであるABL1は、細胞の成長、生存、侵入、接着、移動を制御する細胞プロセスの多様なセットを制御する(31)。これらのCAPAN2細胞に見られるABL1のp.G1060D変異は、キナーゼのアクチン結合ドメインで発生し、機能的に特徴付けられていないが、これは活性化変異であると考えられている。ABLの細胞質レベル、したがってそのキナーゼ活性は、線維状アクチン細胞骨格への結合によってブロックされる(33、34)。マルチキナーゼ阻害剤レゴラフェニブは、ABL1を含む非受容体型チロシンキナーゼを標的とすることが示される(40)。
本研究では、トラメチニブとレゴラフェニブの両方(個別および組み合わせ)が、KRASおよびABL1の活性化変異をもつCAPAN2細胞の細胞増殖を阻害することを示す。実際、これらの2つの阻害剤の組み合わせは、単独の薬物のいずれよりもはるかに低い濃度で細胞死の増加につながることがわかった(図1〜3)。観察された薬物間相互作用の正確なタイプを評価するために、アイソボログラム分析が適用された。この方法は、作用機序に関係なく、活性剤の組み合わせの有効性の評価を可能にする(38、39)。レゴラフェニブとトラメチニブの1:1の組み合わせと2:1の組み合わせの両方が、EC80とEC75で細胞死に相乗効果をもたらし、一方、これら2つの薬剤の2:1の組み合わせは、EC60での細胞死に対して相乗効果があることがわかった(図5)。
細胞をトラメチニブとレゴラフェニブの組み合わせで処理した場合に観察された二相性応答は、いずれかの適合単剤療法での処理後、どの濃度でも見られなかった(図1〜3)。この二相性の反応は、様々な化学物質で処理された多くのヒト腫瘍細胞株で報告されているホルム効果を連想させる(53)。この効果の正確な原因は不明であるが、ホルミシスは、少なくとも部分的には、ストレスに対する細胞の反応が原因であると考えられている(53)。上記のように、どちらかの薬物単独での治療ではそのような効果が示されなかったことは興味深い。両方の薬物を組み合わせて使用した場合にのみ現れ、まだ決定されていないが、いくつかの濃度でのキナーゼの組み合わせ阻害がいずれかの薬物単独よりも細胞に対しておそらくよりストレスがかかる可能性を高める。
全体として、この研究は、ゲノムの変化に適合する単剤療法および抗癌剤の組み合わせの体系的分析を報告し、次の概念をサポートしている:1)作用可能な変化を標的とする適合単剤療法は、標準治療に比べて細胞死の顕著な増加を与える、2)さらに重要なことは、適合併用療法は、適合単剤療法または標準治療よりも効果的な治療を提供する可能性があることである。癌腫瘍のゲノミクス分析、および薬剤の設計と開発における最近の進歩と合わせて考えると、研究者と臨床医が癌を個人の病気として治療する機会と手段を持っていることは明らかである。
その他の実施形態
上記の詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を支援するために提供される。しかし、本明細書に記載および請求される本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。同等の実施形態は、本発明の範囲内にあるものとする。実際、本明細書に示し説明したものに加えて、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない前述の説明から、本発明の様々な修正が当業者には明らかになるであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
上記の詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を支援するために提供される。しかし、本明細書に記載および請求される本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。同等の実施形態は、本発明の範囲内にあるものとする。実際、本明細書に示し説明したものに加えて、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない前述の説明から、本発明の様々な修正が当業者には明らかになるであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
引用文献
本出願で引用されたすべての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、すべての目的のためにその全体が参照により、個々の出版物、特許、特許出願または他の参考文献が具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術であることの承認として解釈されるべきではない。
本出願で引用されたすべての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、すべての目的のためにその全体が参照により、個々の出版物、特許、特許出願または他の参考文献が具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術であることの承認として解釈されるべきではない。
本発明の範囲内にあることが特に意図され、その全体が参照により本明細書に組み込まれるのは、以下の刊行物である。
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Claims (57)
- 癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、(a)それぞれが病原性かつ作用可能な(actionable)変異を有する癌細胞中の2つ以上の標的遺伝子を特定することと、(b)遺伝子−原薬相互作用のリストを使用することと、(c)(a)で特定された前記2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的とする1つ以上の物質を前記患者に投与することと、を含む方法。
- 前記特定することが、NGS配列決定の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 併用療法が相乗的治療効果を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 試料が癌細胞または癌DNAを含む無細胞試料を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記2つ以上の標的遺伝子のそれぞれが異なる経路にマッピングされる、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が膵管腺癌であり、前記2つ以上の標的遺伝子がKRASおよびABL1である、請求項1に記載の方法。
- KRASが病原性変化を含む、請求項7に記載の方法。
- ABL1が病原性変化を含む、請求項7に記載の方法。
- KRASおよびABL1の両方が病原性変化を含む、請求項7に記載の方法。
- ABL1がFANCC ABL1である、請求項7に記載の方法。
- KRASのG12が、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項7に記載の方法。
- ABL1のG1060が、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項7に記載の方法。
- KRASのG12は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに/または
ABL1のG1060は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項7に記載の方法。 - KRASのG12は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに/または
ABL1のG1060は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびW;からなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに/または
FANCCのE521は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項7に記載の方法。 - 前記KRAS遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)の阻害剤である、請求項7に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がトラメチニブである、請求項16に記載の方法。
- 前記ABL1遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項7に記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項18記載の方法。
- トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法が前記患者に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記トラメチニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤が順次投与される、請求項20に記載の方法。
- 前記トラメチニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤が同時に投与される、請求項20に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項20に記載の方法。
- 前記レゴラフェニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤が順次投与される、請求項20に記載の方法。
- 前記レゴラフェニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤が同時に投与される、請求項20に記載の方法。
- 癌細胞増殖を阻害する方法であって、癌細胞を、少なくとも1つの追加の抗癌剤と組み合わせてトラメチニブに曝露することを含み、前記組み合わせは、トラメチニブ単独および/または単独で投与された少なくとも1つの追加の抗癌剤の効果と比べて、増強された抗癌効果を提供する、方法。
- 癌を有する患者の治療を特定するための方法であって、(a)癌細胞を含む試料を前記患者から取得することと、(b)前記試料のNGS配列決定の結果を取得することと、(c)それぞれが作用可能な変異を有する前記癌細胞中の2つ以上の標的遺伝子を特定することと、(d)(c)で特定された前記2つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的とする1つ以上の物質の存在下で前記癌細胞を培養することと、(e)前記1つ以上の物質の存在下で癌細胞生存率を測定することと、(f)前記1つ以上の物質の存在下で前記細胞の生存率が、(i)前記2つ以上の物質の非存在下での生存率よりも低く、(ii)1つ以上の標準治療の非標的化物質の存在下での生存率より低く、(iii)標的化されているが適合しない物質(陰性対照)の存在下での生存率よりも低い場合に、前記治療が前記患者において有効であり得ると結論付けることと、を含む方法。
- 前記2つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれが異なる経路にマッピングされる、請求項27に記載の方法。
- 前記癌が膵管腺癌であり、前記2つ以上の特定された標的遺伝子がKRASおよびABL1である、請求項27に記載の方法。
- KRASが病原性変化を含む、請求項29に記載の方法。12B。ABL1が病原性変化を含む、請求項12に記載の方法。12C。KRASおよびABL1の両方が病原性変化を含む、請求項12に記載の方法
- KRAS、ABL1、およびFANCCが病原性変化を含む、請求項29に記載の方法
- KRASのG12が、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項29に記載の方法。
- ABL1のG1060が、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項12に記載の方法。
- KRASのG12は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ/または
ABL1のG1060は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項29に記載の方法。 - KRASのG12は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ/または
ABL1のG1060は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ/または
FANCCのE521は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、およびWからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項29に記載の方法。 - 前記KRAS遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)の阻害剤である、請求項29に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がトラメチニブである、請求項36に記載の方法。
- 前記ABL1遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項29に記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項38に記載の方法。
- トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法が、癌を有する患者の治療方法として特定される、請求項10に記載の方法。
- 癌を治療するための組成物であって、有効量のトラメチニブからなる第1の成分と、有効量の少なくとも1つの追加の抗癌剤を含む第2の成分とを含む、組成物。
- トラメチニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤の総量が相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項41に記載の組成物。
- トラメチニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤の総量が、増強された治療的抗癌効果を提供する、請求項41に記載の組成物。
- トラメチニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤の総量が相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項41に記載の組成物。
- 前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項41に記載の組成物。
- 前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される固形腫瘍である、請求項41に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの追加の抗癌剤が化学療法剤である、請求項41に記載の組成物。
- 癌を治療するための組成物であって、有効量のレゴラフェニブからなる第1の成分と、有効量の少なくとも1つの追加の抗癌剤を含む第2の成分とを含む、組成物。
- レゴラフェニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤の総量が、増強された治療的抗癌効果を提供する、請求項48に記載の組成物。
- レゴラフェニブおよび少なくとも1つの追加の抗癌剤の総量が、相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項48に記載の組成物。
- 前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項48に記載の組成物。
- 癌を有する患者の治療方法を特定するためのキットであって、(a)(NGS配列決定法または他の方法を用いた)それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞中の2つ以上の標的遺伝子のデータと、(b)遺伝子−原薬相互作用のリストと、(c)(a)で特定された前記2つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的化する1つ以上の物質と、(d)前記(c)における1つ以上の物質のそれぞれの存在下で前記患者由来の癌細胞を培養するための、1つ以上の容器にパッケージされた培地と、を含む、キット。
- 前記癌が膵管腺癌であり、前記2つ以上の特定された標的遺伝子がKRASおよびABL1である、請求項52に記載のキット。
- 前記KRAS遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がマイトジェン/細胞外シグナル関連キナーゼ(MEK)の阻害剤である、請求項53に記載のキット。
- 前記MEK阻害剤がトラメチニブである、請求項54に記載のキット。
- 前記ABL1遺伝子を標的とする前記1つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項53に記載のキット。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項56に記載のキット。
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