KR20200032092A - 주사용 유중수 에멀젼 및 이의 용도 - Google Patents

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바어 티에리 드
람브로스 첼리카스
토마 이소에아르도
니콜라 후앙
로헝스 모안
니콜라 차피스
일리아스 파탈
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유니베르시떼 파리-싸끌레
쌍뜨르 나시오날 드 라 르셰르쉬 시앙띠피끄
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Abstract

본 발명은 연속 유상 및 점적의 형태로 분산된 수상을 포함하는 유중수 에멀젼에 관한 것으로, 상기 수상은 폴리에스테르계 나노입자 및 하나 이상의 치료제를 포함한다.

Description

주사용 유중수 에멀젼 및 이의 용도
본 발명의 목적은 안정하고 주사용 (injectable)인 유중수 (water-in-oil) 치료학적 에멀젼에 관한 것이다. 또한 특히 암 치료를 위한 상기 에멀젼의 용도에 관한 것이다.
간 동맥 화학-색전술 (chemo-embolisation)은 수술불가능한 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma) 및 과혈관성 전이암 (hypervascular metastases)과 같은 특정 간 종양에 대한 표준 치료이다. 상기 치료는 화학요법 약품 (일반적으로 독소루비신)의 주사를 직접적으로 종양 동맥에 허혈성 동맥 색전술과 병행하는 것으로 구성된다. 화학요법 약품을 미리 "로딩한 (loaded)" 벡터를 사용하여 종양 동맥에서 느리고 지속적인 방식으로 방출된다. 상기 벡터는 이상적으로 진단적 특성 (이미지화의 가시성 (visibility))뿐만 아니라 치료적 특성 (화학요법 약품의 제어 및 지속 방출)을 가져야 한다. 그러나, 현재 사용되는 벡터 (리피오돌® (Lipiodol®) 또는 로딩된 비드 (bead)) 중 어느 것도 상기 치료진단적 (theranostic) 특성 (진단 및 치료)을 갖지 않는다. 로딩된 비드는 화학요법 약물과 함께 로딩 (이온 교환 메커니즘)될 수 있고 70 내지 700 μm의 상이한 크기로 이용가능한 폴리비닐 알코올계(polyvinyl alcohol based) 마이크로스피어 (microspheres)이다. 상기 비드는 이미 종양 화학요법 약물에 대한 노출의 유의한 증가와 전신 독성의 감소를 입증하였지만, 이들은 조영제 (contrast agents)를 함유하지 않는다. 따라서, 과정 동안 화학요법 약품의 투여를 임의의 정밀도 (precision)로 관측하고, 과정 후 종양에서 화학요법 약품의 농도를 정량화하는 것은 불가능하다. 또한, 현재까지는 비드를 독소루비신 및 이리노테칸로 로딩하는 것만이 가능하다.
리피오돌은 X-선 형광투시법 (fluoroscopy) 하에서 가시적인 소수성 (오일) 방사선-비투과 (radio-opaque) 조영제 특성 및 종양 동맥에 대한 선택성을 위해 사용된다. 따라서 리피오돌을 이용한 화학요법 에멀젼을 생산하는 것은 간 종양에 화학요법 약품의 선택적이고 가시적인 전달에 대한 희망을 기대하게 한다. 그러나, 이들 리피오돌화 (lipiodolated) 에멀젼의 치료진단적 특성은 그의 낮은 안정성 때문에 한계가 있다: 화학요법 약물 및 리피오돌의 상분리 (phase separation)가 수 분 내에 일어난다. 매우 신속하게, 에멀젼의 두 상이 서로 분리되고 물에 용해되는 화학요법 약물은 거의 완전히 종양으로부터 사라진다. 또한, 3-방향 스톱콕 (stopcock)에 의해 2 개의 주사기 (syringe) (화학요법 약품 1 개 및 리피오돌 1 개)를 반복적으로 펌핑함으로써 에멀젼화가 수득되므로, 이 기술은 한 작업자로부터 다른 작업자에게 재현될 수 없다. 이러한 열악한 안정성은 종양 조직에서 화학요법 약물의 무작위 농도를 초래한다. 상기 에멀젼의 안정성 및 재현성 (reproducibility)을 개선하기 위해, 다양한 기술 (믹서, 초음파, 유화제) 및 다양한 유형의 리피오돌 에멀젼 (수중유와는 달리 유중수, 리피오돌 및 화학요법 약품의 상이한 비율)이 전임상 연구에서 사용되었지만, 이들 중 어느 것도 성공하지 못하였다.
현재까지, 약학적 에멀젼을 안정화시키기 위해 합성 계면활성제가 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 유형의 유화제는 독성 및 환경 관련 문제를 직접 또는 간접적으로 발생시킨다. 특히, 비경구 (parenteral) 투여 동안, 이들 제제의 특정 세포독성 및 용혈 (hemolytic) 거동이 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 경시적으로, 특히 24 시간 이상 동안 안정한 신규의 치료학적 유중수 에멀젼을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 바람직하게는 치료진단적 특성을 갖는 신규의 안정한 에멀젼을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 하나 이상의 항암제를 포함하고 통상적인 에멀젼보다 더 큰 정도의 종양 선택성을 갖는 신규의 안정한 에멀젼을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 다양한 치료제를 로딩할 수 있고 잠재적으로 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging: MRI)에 의해 관측할 수 있는 신규한 에멀젼을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 합성 계면활성제 또는 미네랄 입자로 안정화된 일반적인 에멀젼보다 독성이 적거나 자극이 적은 신규한 생분해성 (biodegradable), 생체적합성 (biocompatible) 에멀젼을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 연속 유상 (oily phase) 및 점적 (drops) 형태로 분산된 수상 (aqueous phase)을 포함하는 유중수 에멀젼으로서, 상기 수상은 폴리에스테르계 (polyester-based) 나노입자 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 에멀젼에 관한 것이다.
　
유상
본 발명에 따른 에멀젼은 연속 유상 (또는 지방상 (fatty phase))을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 유상은 하나 이상의 오일을 포함한다. 상기 유상은 하나의 단일 오일 또는 복수의 상이한 오일의 혼합물을 포함할 수 있다.
유상을 구성 (constituted)하기 위해 임의의 오일 또는 임의의 적합한 약학적 오일이 사용될 수 있다.
용어 "오일 (oil)"은 물과 비혼화성이며 주위 온도 (25 ℃) 및 대기압 (760 mmHg)에서 액체인 비수성 (non-aqueous) 화합물을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 적합한 오일 중에서는, 특히 지방산, 지방산 에스테르, 및 미네랄 오일 (특히 스쿠알렌 (squalene))이 언급될 수 있다.
해양 오일 (marine oils), 특히 피쉬 오일 (fish oils), 및 특히 연어 오일 (salmon oil)이 언급될 수도 있다. 예를 들어, 피쉬 오일에 함유된 다중 불포화 (polyunsaturated) 지방산 중 하나인 에틸 이코사펜테이트 (ethyl icosapentate)를 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 유상은 바람직하게는 주사용 오일, 바람직하게는 주사용 식물 오일 (plant oil)을 포함한다.
주사용 오일 중에서, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 것들이 언급될 수 있으며, 특히 Hippamgaonkar et al. (2010) AAPS Pharm Sci Tech, 11 (4), p.1526-1540의 문헌에 기재된 바와 같은 것들이 있다..
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 유상은 장쇄 트리글리세리드 (long chain triglycerides: LCT) 및/또는 중쇄 트리글리세리드 (medium chain triglycerides: MCT)를 포함한다. LCT 중에서, 트리올레인 (triolein), 대두유 (soybean oil), 홍화유 (safflower oil), 참기름 (sesame oil) 및 피마자유 (castor oil)가 언급될 수 있다. MCT 중에는 실제로 카프릴산/카프르산 (caprylic　/　capric acids)의 트리글리세리드(예: 제품 MIGLYOL 810® 또는 812®, Neobee® M-5 또는 Captex® 300)와 같은 분획화 (fractionated) 코코넛유가 언급될 수 있다.
카프릴산/카프르산/리놀레산의 트리글리세리드 (MIGLYOL 818®), 카프릴산/카프르산/숙신산의 트리글리세리드 (MIGLYOL 829®) 또는 심지어 MIGLYOL 840® (국제 화장품 성분 명칭 (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients: INCI))의 명명: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트)도 언급될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유상은 하나 이상의 식물성 오일, 특히 피마자유, 참기름, 양귀비 종자유 (poppy seed oil), 올리브유, 대두유 (soybean oil), 코코넛유, 트리올레인 (triolein) 및 이의 혼합물을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 유상은 방사선 비투과성이도록 요오드 (iodine)로 변형된 하나 이상의 오일을 포함한다. 이들 오일 중에는 양귀비 종자유, 아마인유 (J Pharm Sci, 102: 4150, 2013 참조), Labrafac WL1349 (Attia et al., Macromol Biosci, 2017), 피마자유 (ACS Nano, 8 (10), 10537, 2014) 또는 심지어 비타민 E가 언급될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 유상은 양귀비 종자유로부터의 요오드화된 지방산의 에틸 에스테르를 포함하고, 특히 리피오돌을 포함한다.
리피오돌은 양귀비 종자유 유래 요오드화 지방산의 에틸 에스테르로 구성 (constituted)된다. 이는 43 내지 53 %의 요오드를 함유한다. 이는 양귀비 종자유의 비누화 (saponification), 그 비누화에 의해 비누의 형태로 지방산을 방출하고, 그런 다음 그 지방산을 요오드 클로라이드로 요오드화하고, 최종적으로 에탄올에 의해 에스테르화하여 제조된다. 양귀비 종자유는 검은 양귀비 종자 (Papaver somniferum)으로부터 추출된다. 상기 오일에 포함된 주요 지방산은 리놀레산 (linoleic acid) 및 리놀렌산 (linolenic acid)이다. 리피오돌은 방사선 조사 시 조영제로도 사용된다.
일 구체예에 따르면, 유상은 특히 8 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 중쇄 길이를 갖는 트리글리세리드, 또는 스쿠알렌을 주로 포함하는 미네랄 오일을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼의 유상은 추가적으로 화합물을 포함하며, 여기서 100 %의 질량은 하기를 포함하는 10 내지 95 %의 미네랄 오일을 포함한다:
-16 개 미만의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 체인 0.05 내지 10 %;
-28 개 초과의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 체인 0.05 % 내지 5 %;
-및 파라핀계 (paraffinic) (유형) 탄화수소 체인의 질량 (mass quantity) 대 나프텐계 (naphthenic) (유형) 탄화수소 체인의 질량 비율에 해당하는 P/N 비율이 2 내지 6이다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼의 유상은 특허 출원 FR 2 955 776에 기재된 것과 같은 SEPPIC이 판매하는 MONTANIDE 제품으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 에멀젼의 유상은 또한 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 유상의 부피 및 수상의 부피 간의 비율은 4:1 내지 3:3이다. 바람직하게는, 상기 비율은 4:1, 3:1, 2:1, 3:2 또는 3:3이며, 바람직하게는 3:1이다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼은 상기 에멀젼의 총 중량에 대하여 40 내지 80 중량 %, 바람직하게는 60 내지 80 중량 %의 유상을 포함한다.
수상
본 발명에 따른 에멀젼은 분산된 수상을 포함한다.
본 발명에 따른 수상은 적어도 물을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼은 상기 에멀젼의 총 중량에 대하여 20 내지 60 중량 %, 바람직하게는 20 내지 40 중량 %의 수상을 포함한다.
본 발명에 따른 수상은 1 미크론 (micron)보다 큰 크기의 액적 (droplets) 형태이다.
일 구체예에 따르면, 수상의 액적의 크기는 10 내지 100 μm, 바람직하게는 20 내지 50 μm이다.
나노입자
본 발명의 수상은 하나 이상의 폴리에스테르계 나노입자를 포함한다.
에멀젼의 제제에서 고체 입자의 사용은 합성 계면활성제의 사용을 감소시키거나 심지어 피할 수 있게 하며, 매우 안정한 계면 (interfaces)이 수득된다. 고체 입자에 의해 안정화된 이러한 에멀젼을 피커링 (Pickering) 에멀젼이라고 부른다. 피커링 에멀젼은 통상적인 에멀젼이 대부분의 적용에서 피커링 에멀젼으로 대체될 수 있는 방식으로, 계면활성제에 의해 안정화되는 통상적인 에멀젼의 기본 특성을 보유한다. 이들의 "계면활성제-비함유 (surfactant-free)" 성질로 인해 특히 화학-색전술과 같은 생의학적 (biomedical) 적용이 매우 매력적이다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 생분해성이다.
에멀젼에서 물/오일 계면을 안정화시키기 위해, 고체 입자로서 생분해성 폴리에스테르계 나노입자가 사용된다. 이들 나노입자는 독성이 낮으며, 이들 나노입자의 존재 하에서는 제한된 염증 반응이 관찰된다. 따라서, 본 발명에 따른 에멀젼은 생분해성이고, 생체적합성이며, 합성 계면활성제 또는 미네랄 입자로 안정화된 일반적인 에멀젼보다 잠재적으로 독성이 적거나 자극이 적다는 이점을 나타낸다.
본 발명에 따른 나노입자는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 중합체성 (polymeric) 나노입자이다.
본 발명에 따르면, 이들 나노입자는 2 차원 이상의 1 ㎛ 미만인 고체 입자이다. 바람직하게는, 이들 나노입자는 (광 산란에 의해 측정될 경우) 평균 크기가 1 ㎛ 미만인 매트릭스 코어를 갖는 나노스피어 (nanospheres)이다.
바람직하게는, 나노입자는 평균 크기가 200 nm이다. 이들은 일반적으로 50 nm 내지 400 nm이고 보다 정확하게는 100 nm 및 300 nm이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "크기 (size)"는 직경을 지칭한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 에멀젼은 본원에 상기 정의된 바와 같은 5 내지 25 mg/ml, 바람직하게는 15 mg/ml의 나노입자를 포함한다.
본 발명에 따른 나노입자는 폴리에스테르계이다. 본원에 상기에 언급된 바와 같이, 이들은 바람직하게는 고체이므로 하나 이상의 폴리에스테르를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리에스테르계 나노입자는 폴리락트산 (폴리락티드 (polylactide)), 폴리글리콜산 (폴리글리콜리드 (polyglycolide)), 락티드-글리콜리드 공중합체 (상이한 락티드/글리콜 (glycolic) 비율을 갖음), 락티드-글리콜리드-코-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (lactide-glycolide-co-polyethylene glycol copolymers), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리무수물 (polyanhydrides), 폴리부틸아세톤 (polybutylacetone), 폴리발레로락톤 (polyvalerolactone), 폴리말산 (poly malic acid), 폴리락톤 (polylactones), 및 이들의 혼합물에 기초한 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에 따르면, 폴리에스테르계 나노입자는 추가적으로 바람직하게는 5 내지 30 nm, 우선적으로는 10 nm의 크기를 갖는 산화철 (iron oxide) 입자를 포함한다.
주사를 위해 피커링 에멀젼을 사용하는 이점은 벡터의 유성 성질로 인해 및/또는 산화철 입자의 혼입 (incorporation)으로 인해 MRI에 의해 검출될 수 있다는 가능성이다. 현재, MRI는 CT 스캔과 비교하여 간세포 암종의 검출에서 유의하게 더 높은 정확성 및 민감도 (sensitivity)로 인해 진단과 관련하여 환자에게 점점 더 많이 사용되고 있다. 따라서, 영상화제 (imaging agent)가 본 발명에 따라 사용되는 안정화 나노입자에 도입되었다. 산화철 입자는 효과적인 T2 조영제인 것으로 여겨진다. 결과적으로, 일 구체예에 따르면, 치료제는 물 액적의 내부에 캡슐화되고, 산화철 입자는 이러한 물 액적을 안정화시키는 나노입자에 혼입된다. 치료제를 산화철 나노입자와 함께 단일 주사용 형태로 하면 투여 후 약물 요법이 어떻게 되는지 모니터링 하는 것을 가능하게 한다.
치료제
본 발명에 따른 에멀젼은 하나 이상의 치료제를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 치료제는 수상의 액적 내에 캡슐화된다.
이러한 캡슐화는 특정 유형의 치료제, 특히 모노클로날 항체 (monoclonal antibodie)와 같은 취약한 (fragile) 분자를 보호하므로, 안정화시키는 수단을 제공한다는 점에서 유리하다.
이들의 단백질 구조로 인해 모노클로날 항체는 특정 금속 및 오일/유기 용매의 존재 하에 열, 빛, pH 또는 강한 교반에 노출되는 경우 분해될 수 있다. 이들은 취약한 분자이므로 이의 취급 (handling) 시 응집 (aggregation) 또는 심지어 변성 (denaturation)의 위험이 나타날 수 있다. 보호 시스템을 제공하지 않는다면 이들이 벡터에 혼입되는 동안 변하거나 (altered) 변성될 위험이 있다. 현재 이용 가능한 에멀젼은 이들 활성 성분의 수송 및 이의 제어 방출을 가능하게 하지 못한다. 치료제를 함유하는 물 액적 및 오일 사이에 안정화 나노입자를 통한 물리적 장벽을 도입함으로써, 항체는 안정하게 유지된다.
일 구체예에 따르면, 상기 치료제는 면역조절제 (immunomodulators), 항암 의약품 (anticancer medicinal products), 항혈관신생 의약품 (anti-angiogenic medicinal products), 항감염 의약품 (anti-infectious medicinal products), 항염증 의약품 (anti-inflammatory medicinal products), 조영제 (imaging contrast agents), 방사성 제제 (radioactive agents) 및 감염체 (infectious agents) 중에서 선택된다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역조절제 (immunomodulator)"는 면역 반응을 조절할 수 있는 화합물을 지칭한다.
치료제 중에서, 종양 항원을 표적으로 하는 항체가 또한 언급될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "종양 항원 (tumour antigen)"은 세포 표면에 특이적으로 존재하는 분자 (예: 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelium growth factor), CTLA-4, PD1 또는 PDL-1)를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "항혈관신생 의약품 (anti-angiogenic medicinal product)"은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 과정(신혈관화 (neovascularisation))을 억제하도록 설계된 약제(medicament)(예: 베바시주맙 (Bevacizumab), 수니티닙 (Sunitinib) 또는 소라페닙 (Sorafenib))를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "항감염 의약품 (anti-infectious medicinal products)"은 미생물 기원의 감염을 치료하도록 의도된 약제 (예: 항생제 (antibiotics), 항바이러스 약품 (anti-viral medicines) 또는 항진균 약품(anti-fungal medicines))를 지칭한다. 항생제 중에서, 예를 들어 아목시실린 (amoxicillin) 또는 세파졸린 (cefazolin)이 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "항염증 의약품 (anti-inflammatory medicinal product)"은 염증을 치료하도록 의도된 약제 (스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증 약품)를 지칭한다. 예를 들어, 메틸프레드니솔론 (methylprednisolone) 또는 케토프로펜 (ketoprofen)이 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "조영제 (imaging contrast agent)"는 대조 (contrast)를 인공적으로 증가시켜 해부학적 구조 또는 자연적으로 다소 대조되는 또는 대조되지 않는 구조를 관측할 수 있도록 하는 물질을 지칭한다. 보다 구체적으로 요오드화된 조영 매체 (contrast media), MRI 조영 매체 및 제품 또는 방사성 원소 (radio-elements)가 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "방사성 원소 (radio-element)"는 종종 고 에너지 광자 (photons)의 방출을 동반하는 α, β- 또는 γ 방사선을 방출하는 화학 원소를 지칭한다. 이들 원소는 암을 치료하기 위해 핵의학에서 진단 목적으로 저용량, 및 치료 목적으로 고용량으로 사용된다 (예: 테크네튬-99m (Technetium-99m), 플루오린-18 (Fluorine-18), 요오드-123 (Iodine-123), 이트륨-90 (Yttrium-90), 요오드-131 (Iodine-131) 또는 홀뮴-166 (Holmium-166)).
본 발명에 따르면, 용어 "감염체 (infectious agent)"는 감염성 질환 (예: 박테리아, 바이러스, 프리온, 효모 및 기생충)을 유발하는 생물학적 제제를 지칭한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼은 치료제로 하나 이상의 항암 의약품을 포함한다.
바람직하게는, 상기 항암 의약품은 알킬화제 (alkylating agents), 백금 유도체 (platinum derivatives), 세포독성 항생제 (cytotoxic antibiotic agents), 항미세소관제 (antimicrotubule agents), 안트라사이클린 (anthracyclines), 토포이소머라제 유형 I 및 Ⅱ 억제제 (topoisomerase type I and II inhibitors), 플루오로피리미딘 (fluoropyrimidines), 시티딘 유사체 (cytidine analogues), 아데노신 유사체 (adenosine analogues), 메토트렉세이트 (methotrexate), 폴리닌산 (folinic acid), 효소, 항혈관제 (antivascular agents), 항혈관신생제 (anti-angiogenic agents), 항유사분열제(antimitotic agents) (특히 방추체 독성제제 (spindle poison agents)), 키나제 억제제 (kinase inhibitors), 호르몬, 모노클로날 항체 (monoclonal antibodies), 방사성원소 (radioelements), 암살상 바이러스 (oncolytic viruses), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 알킬화제 중에서, 예를 들어 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 이포스파미드 (ifosfamide), 클로람부실 (chlorambucil), 부술판 (busulfan), 티오테파 (thiotepa), 프레드니무스틴 (prednimustine), 카무스틴 (carmustine), 로무스틴 (lomustine), 세무스틴 (semustine), 스트렙토조토신 (steptozotocin), 데카바진 (decarbazine), 테모졸로미드 (temozolomide), 프로카바진 (procarbazine) 및 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine)이 언급될 수 있다.
상기 백금 유도체 중에서, 특히 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin) 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin)이 언급될 수 있다.
상기 세포독성 항생제 중에서, 예를 들어 블레오마이신 (bleomycin), 미토마이신 (mitomycin) 및 닥티노마이신 (dactinomycin)이 언급될 수 있다.
상기 항미세소관제 중에서, 특히 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine) 및 탁소이드 (taxoids) (파클리탁셀 (paclitaxel) 및 도세탁셀 (docetaxel))가 언급될 수 있다.
상기 안트라사이클린 중에서, 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 에피루비신 (epirubicin), 미토산트론 (mitoxantrone) 및 로소산트론 (losoxantrone)이 언급될 수 있다.
상기 토포이소머라제 유형 I 및 II 억제제 중에서, 예를 들어 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 암사크린 (amsacrine), 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan) 및 토무덱스 (tomudex)가 언급될 수 있다.
항대사제 (antimetabolites) 중에서, 메토트렉세이트 (metothrexate) 또는 히드록시우레아 (hydroxyurea)가 언급될 수 있다.
상기 플루오로피리미딘 중에서, 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), UFT 또는 플륵스우리딘(floxuridine)이 언급될 수 있다.
상기 시티딘 유사체 중에서, 5-아자시티딘 (5-azacytidine), 시타라빈 (cytarabine), 젬시타빈 (gemcitabine), 6-머캅토무린 (6-mercaptomurine) 및 6-티오구아닌 (6-thioguanine)이 언급될 수 있다.
상기 아데노신 유사체 중에서, 예를 들어 펜토스타틴 (pentostatin), 시타라빈 (cytarabine) 또는 플루다라빈 포스페이트 (fludarabine phosphate)가 언급될 수 있다.
다양한 상기 효소 및 화합물 중에서, L-아스파라기나제 (L-asparaginase), 히드록시우레아 (hydroxyurea), 트랜스-레티노산 (trans-retinoic acid), 수라민 (suramin), 덱스라조산 (dexrazoxane), 아미포스틴 (amifostine), 허셉틴 (herceptin)뿐만 아니라 에스트로겐성 및 안드로겐성 호르몬이 언급될 수도 있다.
상기 항혈관제 중에서, 콤브레타스타틴 (combretastatin) 유도체, 예를 들어 CA4P, 칼콘 (chalcones) 또는 콜키친 (colchicine)(예: ZD6126) 및 이들의 프로드러그가 언급될 수 있다.
상기 항-혈관신생제 중에서, 베바시주맙 (bevacizumab), 소라페닙 (sorafenib) 또는 수니티닙 말레이트 (sunitinib malate)가 언급될 수 있다.
티로신 키나제 억제제 (tyrosine kinase inhibitor) 치료제 중에서, 이마티닙 (imatinib), 게피티닙 (gefitinib), 수니티닙 (sunitinib), 소라페닙 (sorafenib), 반데타닙 (vandetanib) 및 에를로티닙 (erlotinib)이 언급될 수 있다.
상기 방추체 독성제제 중에서, 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 탁솔 (taxol) 및 탁소테레 (taxotere)가 언급될 수 있다.
상기 방사성 원소 중에서 테크네튬-99m, 플루오린-18, 요오드-123, 인-32 (Phosphorus-32), 스트론튬-89 (Strontium-89), 이트륨-90, 요오드-131, 홀뮴-166, 레늄-186 (Rhenium-186) 및 에르븀-169 (Erbium-169)가 언급될 수 있다.
상기 암살상 바이러스 중에서, T-VEC가 언급될 수 있다.
바람직하게는, 상기 치료제는 독소루비신, 이리노테칸, 옥살리플라틴 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 항암 의약품이다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼은 치료제로 하나 이상의 항원 표적화 항체 (antigen targeting antibody), 및 보다 특히 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 항-혈관신생 모노클로날 항체, 항-CTLA-4 모노클로날 항체, 항-PD-1 모노클로날 항체, 항-PD-L1 모노클로날 항체, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원-표적화 항체이다.
상기 항-혈관신생 모노클로날 항체 중에서, 특히 베바시주맙이 언급될 수 있다.
상기 항-CTLA-4 모노클로날 항체 중에서, 특히 이필리무맙 (ipilimumab) 및 트레멜리무맙 (tremelimumab)이 언급될 수 있다.
상기 항-PD-1 모노클로날 항체 중에서, 특히 니볼루맙 (nivolumab) 및 펨브롤리주맙 (pembrolizumab)이 언급될 수 있다.
상기 항-PD-L1 모노클로날 항체 중에서, 특히 아테졸리주맙 (Atezolizumab) 및 아벨루맙 (Avelumab)이 언급될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 에멀젼은 5 내지 25 mg/ml의 치료제를 포함한다.
바람직하게는, 에멀젼이 치료제로서 독소루비신을 포함하는 경우, 치료제의 농도는 10 내지 25 mg/ml이고, 바람직하게는 20 mg/ml이다.
바람직하게는, 에멀젼이 치료제로서 이리노테칸을 포함하는 경우, 치료제의 농도는 20 mg/ml이다.
바람직하게는, 에멀젼이 치료제로서 옥살리플라틴을 포함하는 경우, 치료제의 농도는 5 mg/ml이다.
바람직하게는, 에멀젼이 치료제로서 이필리무맙을 포함하는 경우, 치료제의 농도는 5 mg/ml이다.
본 발명은 또한 본원에 상기 정의된 바와 같은 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 상기 정의된 바와 같은 에멀젼뿐만 아니라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
이들 약학적 조성물은 유효한 용량의 본 발명에 따른 하나 이상의 에멀젼 (하나 이상의 치료제 함유)뿐만 아니라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한다.
상기 부형제는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 일반적인 부형제로부터 약학적 형태 및 원하는 투여 방식에 따라 선택된다.
경구, 설하 (sublingual), 피하 (subcutaneous), 근육내 (intramuscular), 정맥내 (intravenous), 동맥내 (intra-arterial), 국소 (topical), 국소 (local), 기관내 (intratracheal), 비강내 (intranasal), 경피 (transdermal) 또는 직장 (rectal) 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 에멀젼은 상기 장애 또는 질환의 치료를 위해 동물 및 인간에 단일 단위 투여 형태로, 통상적인 약학적 부형제와의 혼합물로 투여될 수 있다.
일반적인 관행에 따라, 각 환자에 대한 적절한 투여량 (dosage)은 투여 방식, 상기 환자의 체중 및 반응성에 기초하여 의사에 의해 결정된다.
본 발명은 또한 의약품으로 이를 사용하기 위한 본원에 상기 정의된 바와 같은 에멀젼에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암 치료에 이를 사용하기 위한 본원에 상기 정의된 바와 같은 에멀젼에 관한 것이다.
또 다른 이의 일 양상에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유효한 용량의 에멀젼을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 상이한 농도의 폴리(락트-코-글리콜산) (Poly (lactic-co-glycolic acid): PLGA) 나노입자에서 수득된 에멀젼의 광학 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2는 상이한 리피오돌/생리식염수 용액 비율에서 수득된 에멀젼의 광학 현미경 이미지를 나타낸다.
도 3은 Turbiscan을 사용하여 24 시간에 걸쳐 15 mg/mL의 나노입자로 안정화된 3/1 에멀젼의 크리밍 (creaming)을 모니터링 한 것을 나타낸다.
도 4는 Turbiscan을 사용하여 15 분에 걸쳐 나노입자 (에멀젼 전 및 모니터링 15 분 후)에 의해 안정화되지 않은 3/1 에멀젼의 상분리 (phase separation)를 모니터링 한 것을 나타낸다.
도 5는 에멀젼의 주사능 (injectability)에 관한 것이다. 도 5A는 2 mm/s의 속도로 상이한 비율인 에멀젼의 Progreat 2.4F 카테터를 통한 주사능에 관한 것이다 (곡선 'a'는 오일/물 비율이 8:3인 에멀젼에 해당하고; 곡선 'b'는 오일/물 비율이 3:1인 에멀젼에 해당하며; 곡선'c'는 오일/물 비율이 6:1인 에멀젼에 해당하고; 및 곡선 'd'는 리피오돌 단독 (alone)에 해당한다). 도 5B는 상이한 주사 속도 (a: 6mm/s; b: 4mm/s; c: 2mm/s; 및 d: 1mm/s)에서 3/1 에멀젼의 주사능에 관한 것이다. 도 5C는 2 mm/s의 속도로 상이한 비율인 에멀젼의 18G 니들을 통한 주사능에 관한 것이다 (a: 리피오돌 단독; b: 3:2 비율; c: 6:1 비율, 및 d: 8:3 비율).
도 6은 Turbiscan을 사용하여 24 시간에 걸쳐 20 mg/ml 독소루비신의 농도에서 15 mg/mL의 나노입자로 안정화된 3/1 에멀젼의 크리밍의 모니터링을 나타낸다.
도 7은 Turbiscan을 사용하여 4 시간에 걸쳐 20 mg/ml 독소루비신의 농도에서 나노입자에 의해 안정화되지 않은 4/1 에멀젼의 상분리의 모니터링을 나타낸다.
도 8은 20 mg/ml 농도의 독소루비신이 나노입자 없이 (다이아몬드 모양 형태를 갖는 곡선) 및 15 mg/ml 농도의 나노입자와 함께 (삼각형을 갖는 곡선) 로딩된 3/1 비율을 갖는 리피오돌화 에멀젼 및 로딩된 비드 (사각형을 갖는 곡선)로부터 독소루비신의 인 비트로 방출에 관한 것이다.
도 9는 20 mg/mL 농도 이리노테칸 및 3/1 비율을 갖는 나노입자 (NP) 안정화 에멀젼을, 비안정화 에멀젼 (삼각형), 이리노테칸으로 로딩된 비드 (다이아몬드 모양 형태) 및 이리노테칸이 없는 비드와 비교한 이리노테칸의 인 비트로 방출에 관한 것이다.
도 10은 15 mg/mL의 농도 및 3/1 (삼각형), 3/2 (사각형) 및 1/1 (다이아몬드 모양 형태)의 비율을 갖는, NP 안정화 에멀젼의 이리노테칸 인 비트로 방출에 관한 것이다.
도 11은 안정화 나노입자와 함께 또는 없이, 상이한 비율의 리피오돌 및 옥살리플라틴을 갖도록 제조된 에멀젼의 백금 인 비트로 방출의 백분율을 나타낸다. 다이아몬드 모양 형태의 곡선은 나노입자 없는 3/1 비율에 해당하고, 사각형을 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 3/1 비율에 해당하고, 삼각형을 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 2/1 비율에 해당하며 크로스 (crosses)를 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 1/1 비율에 해당한다.
도 12는 안정화 나노입자와 함께 또는 없이, 상이한 리피오돌 및 옥살리플라틴 비율을 갖도록 생성된 에멀젼의 인 비트로 방출된 백금의 양을 나타낸다. 다이아몬드 모양 형태의 곡선은 나노입자 없는 3/1 비율에 해당하고, 사각형을 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 3/1 비율에 해당하고, 삼각형을 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 2/1 비율에 해당하며 크로스를 갖는 곡선은 나노입자를 갖는 1/1 비율에 해당한다.
도 13은 15 mg/mL 농도를 갖는 NP에 의해 안정화된 3/1 비율을 갖는 리피오돌화 에멀젼으로부터 이필리무맙의 인 비트로 방출에 관한 것이다.
도 14는 좌측 간동맥 (left hepatic arterie)에서 피커링 리피오돌화 에멀젼 (점선) 또는 통상적인 리피오돌화 에멀젼 (실선)을 주사한 후의 옥살리플라틴 혈장 약동학 (pharmacokinetics)에 관한 것이다.
실시예
실시예 1: 생분해성 PLGA 나노입자의 제조
PLGA 나노입자를 문헌 (Astete, C E　; Sabliov, C M Synthesis and Characterisation of PLGA Nanoparticles. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006, 17(3), 247-289)에 이미 개시된 에멀젼-증발 방법에 따라 제조하였다. 100 mg의 PLGA를 5 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 2.5 mg/ml의 PVA를 함유하는 20 ml의 수용액으로 1 분 동안 40 % 파워 (power)의 초음파 처리(sonication) (VibraCell sonicator, Fisher Scientific, France)에 의해 에멀젼화시켰다. 그런 다음 유기 용매를 2 시간 동안 자기 교반 (magnetic stirring)하면서 주위 온도에서 증발시켰다. 증발 후, NP를 1 시간 동안 4℃, 37,000 g에서 초원심분리 (ultracentrifugation) (LE-80K Ultracentrifuge Beckman Coulter OptimaTM)하여 정제하였다. 상등액 (supernatant)을 제거한 후, NP를 다시 한 번 50 mg/ml의 트레할로오스 (trehalose) (동결보호제 (cryoprotectant))를 함유하는 수용액에 넣어 현탁액으로 하였다. 이어서, NP의 현탁액을 동결건조 (lyophilised)시켰다. 사용하기 전에, 동결건조된 NP를 원하는 농도로 MilliQ 물에 재분산시켰다.
실시예 2: 상이한 농도의 PLGA 나노입자에 의해 안정화된 생리식염수 용액의 유중수 에멀젼 수득
70 초 동안 3-방향 스톱콕을 통해 2 개의 10 ml 주사기를 반복적으로 펌핑 (70 푸시-풀 사이클)하여 3/1 (v/v)의 리피오돌 (Guerbet, France)/생리식염수 용액 비율을 갖는 에멀젼을 제제화하였다. 제1 주사기는 리피오돌을 함유하고, 제2 주사기는 빈 상태이고, 제3 주사기에 배치된 생리식염수 용액을 주사기 펌프를 통해 상기 시스템에 1 mL/분의 유속으로 점진적으로 도입한다. 상기 수상은 생리식염수 용액 중의 상이한 농도의 나노입자 현탁액이다 (도 1 참조).
실시예 3 : 상이한 오일/물 비율로 PLGA 나노입자에 의해 안정화된 생리식염수 용액의 유중수 에멀젼 수득
다양한 리피오돌/생리식염수 용액 비율을 갖는 15 mg/ml 나노입자의 농도의 에멀젼을 실시예 1에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다 (도 2 참조).
실시예 4: "드롭 테스트 (drop test)"에 의한 에멀젼의 배향 (orientation) 결정
각각의 에멀젼에 대해, 에멀젼의 유형 (유중수 또는 수중유)을 하나는 리피오돌 (사전에 수단 레드로 착색됨)을 함유하고 다른 하나는 생리식염수 용액 (사전에 메틸렌 블루로 착색됨)을 포함하는, 2 가지 용액을 사용한 비색 테스트 (colorimetric test)로 결정하였다. 용액 중 하나의 작은 액적을 테스트되는 에멀젼의 점적에 첨가하였다. 에멀젼 점적과 용액 액적의 가능한 최종적인 혼화성 (miscibility)을 관찰함으로써 에멀젼의 연속상이 밝혀졌다. 에멀젼화 직후에 테스트를 수행하였다.
수상에 또는 리피오돌 상에 염료를 첨가함으로써 15 mg/ml의 나노입자와 함께 3/1 비율을 갖는 에멀젼의 비색 분석은 수득된 에멀젼이 유중수 유형임을 입증하는 수단으로서 작용하였다. 실제로, 에멀젼 점적의 연속상은 물이 아닌 리피오돌에 의해 착색된다.
실시예 5: 나노입자에 안정화 에멀젼 vs. 비안정화 (non - stabilised) 에멀젼의 안정성 연구
Turbiscan® MA 2000 (Formulation, L'Union, France)을 사용하여 에멀젼을 분석하였다. 에멀젼을 함유한 튜브는 장치에서 제거하지 않았으며 시스템의 임의의 방해를 피하기 위해 측정이 끝날 때까지 접촉조차 하지 않았다. 시스템의 진행 (evolution)에 따라 미리 결정된 시간에 측정을 수행하였다. 이러한 모니터링은 강도의 변화가 무시될 정도일 때까지 수행되었다. Turbiscan 장치는 희석 없이 샘플에서 가역적 (크리밍 및 침전 (sedimentation)) 및 비가역적 (합일 (coalescence) 및 분리 (segregation))인 불안정 현상을 측정할 수 있도록 한다 (도 3 및 4).
실시예 6: 나노입자에 의해 안정화된 유중수 에멀젼의 주사능 연구
에멀젼의 주사능을 텍스처 분석기 (TA-XT2, Texture Technologies)로 연구하였다. 혈관 미세 카테터 (직경: 2.4 F) 또는 18 게이지 (gauge) 니들에 연결된 1 ml "Medallion" 주사기 (Merit®)로 측정을 수행하였다. 상이한 오일/물 비율 (8/3, 3/1 및 6/1)을 2 mm/s의 속도로 연구하였고, 3/1 비율에 대해 상이한 주입 속도를 테스트하였다. 오일 단독 (Lipiodol)을 대조군으로 사용하였다 (도 5).
실시예 7: 독소루비신이 로딩된, 나노입자 안정화 리피오돌화 유중수 에멀젼 수득
에멀젼을 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 수상은 에멀젼의 제제화를 위해 식염수 용액 중 10 또는 20 mg/ml의 농도로 재구성된 (reconstituted) 독소루비신 히드로클로리드 (Adriblastine, Pfizer, USA)를 포함한다. 상이한 리피오돌/독소루비신 비율, 상이한 농도의 독소루비신 및 상이한 농도의 나노입자를 사용하여 에멀젼을 생성하였다 (하기 표 1 참조).
Figure pct00001
수득된 모든 치료학적 에멀젼은 유중수 배향, 즉 사용된 조건에 관계없이 역 배향 (reverse orientation)이었다.
실시예 8: 나노입자에 의해 안정화된 독소루비신이 로딩된 유중수 리피오돌화 에멀젼의 안정성
실시예 5에 사용된 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다. 다양한 에멀젼의 크리밍을 Turbiscan으로 신속하게 관찰하였으나 24 시간에 걸친 모니터링 시 상분리는 없었다 (도 6).
대조적으로, PLGA 나노입자 없이 생성된 독소루비신의 치료학적 에멀젼은 매우 신속하고 완전한 상분리를 나타내었다 (<5 시간) (도 7).
실시예 9: 나노입자에 의해 안정화된 모노클로날 항체가 로딩된 유중수 리피오돌화 에멀젼 수득
실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 에멀젼을 제제화하였다. 수상은 항체 (5 mg　/　ml의 이필리무맙, Yervoy, Bristol Myers Squibb)를 포함하였다. 15 mg/ml의 나노입자 농도로 3/1 비율의 리피오돌/이필리무맙을 갖는 에멀젼을 생성하였다.
수득된 에멀젼은 유중수 배향이었고 수 주에 걸쳐 안정하였다. 나노입자 없이 제조된 에멀젼과 달리, 항체의 응집은 관찰되지 않았다.
변성 조건에서 웨스턴 블롯 방법에 의해 항체의 완전성 (integrity)을 확인하고 검증하였다. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 이동을 진행하고 샘플을 2 % 소듐 도데실 술페이트 (SDS) (당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법)로 제조하였다. 전기영동 (electrophoresis)을 90 분 동안 120 V에서 수행하였고 45 분 동안 100 V에서 막으로 옮겼다. 막을 에탄올로 세척하였고 항체의 노출 (revelation)을 폰세우 레드 (Ponceau red)로 진행하였다.
나노입자는 실제로 본 실시예에서 치료제인 이필리무맙의 완전성을 보존하는 데 있어서 그 효과를 입증하였다.
실시예 10: 나노입자 안정화 리피오돌화 에멀젼으로부터 독소루비신의 인 비트로 방출 연구
3/1 비율을 갖고 및 20 mg/ml의 농도로 독소루비신이 로딩된 리피오돌화 에멀젼 (2 유형: 나노입자가 없음, 15 mg/ml 농도로 나노입자가 있음)으로부터 또는 25 mg/ml의 농도로 독소루비신이 로딩된 비드 (DC 비드, 생체적합성 크기 300-500 μm)로부터 독소루비신의 인 비트로 방출을 평가하였다. GeBAflex 튜브 (컷오프: 12-14 kDa; Gene Bio-Application Ltd)에 0.8 mL의 에멀젼 (4 mg의 독소루비신에 해당) 또는 0.16 mL의 로딩된 비드를 도입하였다. 이들 튜브를 40 ml의 완충 식염수 용액 (TRIS, pH 7.4)에 침지 (immersed)시키고 37 ℃에서 150 rpm의 속도인 인큐베이터에 넣었다. 미리 결정된 시간에, 알리코트 (aliquots) (80 μL)를 수집하고 동등한 부피의 TRIS로 교체하였다.
방출된 독소루비신의 양을 96-웰 마이크로플레이트에서 492 nm로 광학 밀도 (optical density)를 측정하여 정량화하였다 (도 8).
실시예 11: 나노입자에 의해 안정화된 리피오돌화 에멀젼으로부터의 이리노테칸의 인 비트로 방출 연구
에멀젼을 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 수상은 이리노테칸 (이리노테칸 히드로클로리드 트리히드레이트, 20 mg/mL; Campto®, Pfizer)를 포함하였다.
리피오돌화 에멀젼 (4 유형: 3/1 비율이며 나노입자가 없음; 15 mg/mL 농도로 나노입자를 갖고 3/1; 3/2; 1/1의 비율을 가짐) 또는 20 mg/ml 농도로 이리노테칸이 로딩된 비드 (DC 비드, 생체적합성 크기 300-500 μm)로부터 이리노테칸의 인 비트로 방출을 평가하였다. 0.8 mL의 에멀젼 (각각 3/1; 3/2; 및 1/1의 비율을 갖는 에멀젼의 경우 4 mg, 6.4 mg 및 8 mg의 이리노테칸에 해당) 또는 0.08 mL의 로딩된 비드를 GeBAflex 튜브에 도입하었다 (컷-오프: 12-14 kDa; Gene Bio-Application Ltd). 이들 튜브를 40 mL의 완충 식염수 용액 (PBS, pH 7.4)에 침지시키고 37 ℃에서 150 rpm의 속도인 인큐베이터에 넣었다. 미리 결정된 시간에, 알리코트 (0.5 mL)를 수집하고 동등한 부피의 PBS로 교체하였다.
방출된 이리노테칸의 양을 370 nm에서 UV 분광법 (spectroscopy)에 의해 정량화하였다 (도 9 및 10).
실시예 12: 나노입자 안정화 리피오돌화 에멀젼으로부터 옥살리플라틴의 인 비트로 방출 연구
에멀젼을 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 수상은 옥살리플라틴 (Eloxatin®, 5 mg　/　mL, Sanofi-Aventis)을 포함한다.
리피오돌화 에멀젼 (4 유형: 3/1의 비율이며 나노입자가 없음; 15 mg/mL 농도로 나노입자를 가지며 및 3/1; 3/2; 1/1의 비율을 가짐)으로부터 옥살리플라틴의 인 비트로 방출을 평가하였다. 0.8 ml의 에멀젼 (각각 3/1; 3/2; 및 1/1의 비율을 갖는 에멀젼의 경우 1 mg, 1.33 mg 및 2 mg의 옥살리플라틴에 해당). 이들 튜브를 40 ml의 완충 식염수 용액 (25 mM 아세테이트, pH 6.8)에 침지시키고 37 ℃에서 150 rpm의 속도인 인큐베이터에 넣었다. 미리 결정된 시간에, 알리코트 (0.1 mL)를 수집하였다.
방출된 백금의 양을 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (Inductively coupled plasma mass spectrometry: ICP-MS)에 의해 정량화하였다 (도 11 및 12).
실시예 13: 상이한 오일을 기초로 하여 제제화된 나노입자에 의해 안정화된 유중수 에멀젼
에멀젼을 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 3/1 비율로 제제화하였다. 수상은 생리식염수 용액 또는 20 mg/mL 농도의 독소루비신을 포함하였다. 유상은 올리브유, 참기름, 피마자유, 양귀비 종자유 또는 미글리올 (miglyol)을 포함하였다. 모든 에멀젼을 15 mg/ml의 농도를 갖는 나노입자로 제제화하였다.
상기 에멀젼은 비색 테스트에 따라 유중수 유형이었으며 일주일 이상에 걸쳐 안정하였다.
실시예 14: 생분해성 PLGA-FeO 나노입자의 제조
폴리(락트-코-글리콜산)-산화철 [PLGA-FeO] 나노입자를 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법에 따라 제조하였다. 올레산으로 갖춰진 Fe3O4 나노입자의 용액 500 μL (25 mg mL-1, 크기 10 nm, Ocean, USA)를 5 mL의 디클로로메탄에 미리 용해된 100 mg의 PLGA에 첨가하고 2.5 mg/ml의 PVA를 함유하는 수용액 20 mL로 1 분 동안 40 % 파워의 초음파 처리 (VibraCell sonicator, Fisher Scientific, France)를 하여 에멀젼화시켰다. 그런 다음 유기 용매를 2 시간 동안 자기 교반하면서 주위 온도에서 증발시켰다. 증발 후, 현탁액을 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠렛을 탈이온수 (deionised water)로 헹구었다. 원심분리 과정을 2 회 반복하였다. 이어서, NP를 4 ℃, 37,000 g에서 1 시간 동안 초원심분리 (LE-80K Ultracentrifuge Beckman Coulter OptimaTM)에 의해 정제하였다. 상등액을 제거한 후, NP를 다시 한 번 50 mg/ml의 트레할로오스 (동결보호제)를 함유하는 수용액에 넣어 현탁액으로 하였다. 이어서, NP의 현탁액을 동결건조시켰다. 사용하기 전에, 동결건조된 NP를 원하는 농도로 MilliQ 물에 재분산시켰다.
실시예 15: 상이한 농도의 PLGA-FeO 나노입자에 의해 안정화된 생리식염수 용액의 리피오돌화 유중수 에멀젼 수득
상이한 농도의 PLGA-FeO 나노입자 (20, 15 또는 10 mg/mL)로 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 에멀젼을 제제화하였다. 에멀젼은 비색 테스트에 따라 유중수 유형이었다.
실시예 16: PLGA-FeO 나노입자에 의해 안정화된 독소루비신의 리피오돌화 유중수 에멀젼 수득
에멀젼을 20 mg/ml의 독소루비신 및 15 g/mL의 PLGA-FeO 나노입자 농도로 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 유중수 에멀젼을 수득하였다.
실시예 17: 에멀젼의 미세구조 (Microstructure)
에멀젼의 미세한 구조를 WLL 레이저 (488 및 563 nm의 여기 파장 (excitation waves)) 및 CS2 63x/1.40 침지 대물 렌즈 (immersion objective lens)가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Leica TCS SP8-STED, Germany)에 의해 관찰하였다. 에멀젼 액적의 변형 (deformation)을 방지하기 위해, 샘플을 곡면 유리 슬라이드 상에 놓았다. PLGA-FeO 나노입자를 사용하여 에멀젼을 투과하여 관측할 수 있도록 에멀젼을 제제화하였다 (독소루비신의 방출 (emission) 스펙트럼과의 간섭 (interference) 효과를 피함). 독소루비신의 형광 (fluorescence)을 590 nm의 레이저 조명 (illumination) 하에 600-710 nm 필터로 관찰하였다. 적색 형광 방출을 순차적 방식 (sequential mode)으로 수집하였다.
실시예 18: 에멀젼의 MRI 정량 평가
본 영상화 양태 (modality)가 종양 팬텀 (phantom)에 함유된 오일의 비율을 정량화하는 목적에 효과적으로 작용한다는 것을 확인하기 위해 MRI로 에멀젼을 평가하였다.
이를 위해, 9 개의 종양 팬텀이 만들었으며, 각각을 다양한 백분율의 리피오돌을 함유하는 에멀젼으로 채웠다. 그런 다음 연구자는 리피오돌의 튜브가 존재하는 각 팬텀에 대해 3T MRI를 수행하였다 (acquisition IP-OP 및 Ideal IQ). 마지막으로, 연구자는 리피오돌 = 100 % (본원 하기 표 2 참조)를 기준으로 하여 각 팬텀 내 지방 백분율을 계산하였다.
Figure pct00002
표 2: 리피오돌의 수준이 감소하는 에멀젼에서 리피오돌 백분율의 MRI에 의한 정량.
실시예 19: 활성 성분이 로딩된 리피오돌화 유중수 에멀젼 수득
에멀젼을 실시예 2에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 수상은 공급업체가 권장하는 치료 농도로 미리 재구성된 활성 성분으로 구성되거나, 상업적으로 이용가능한 형태의 농도의 활성성분 수용액으로 직접적으로 구성된다. 에멀젼을 15 mg/ml의 나노입자 농도를 갖고 3/1 용액 비율인 리피오돌/활성 성분을 기초로 하여 생성하였다.
수상은 젬시타빈 (40 mg/mL), 플루다라빈 (fludarabine) (25 mg/mL), 클라목실 (clamoxyl) (200 mg/mL), 세파졸린 (330 mg/mL), 수니티닙 (0.5 mg/mL), 메틸프레드니솔론 (10 mg/mL) 또는 케토프로펜 (25 mg/mL)를 포함한다.
수득된 모든 치료학적 에멀젼은 비색 테스트에 따라 유중수 배향이었다.
실시예 20: 점적의 크기:
점적 크기의 측정을 이미지 분석 기술 (Flowcell FC200S + HR, Occhio, Belgium)을 이용하여 입자 계수기 (particle counter)와 함께 수행하였다. 에멀젼을 먼저 오일에 20 배 희석한 다음, 0.5 mL의 희석된 에멀젼을 분석을 위해 400 μm 스페이서 (spacer)를 통해 도입한다. 생리식염수 용액 및 이필리무맙을 함유하는 샘플에 대해 각 샘플을 (Day) D7 및 상이한 일자 (D0, D7, D35)에서 4 회 이상 측정하였다. 계산을 적어도 500 점적에 대해 행하였다.
Figure pct00003
표 3: 15 mg/mL의 나노입자를 갖는 용액에서 리피오돌/활성 성분의 에멀젼 점적의 크기
실시예 21: 나노입자에 의해 안정화된 리피오돌화 에멀젼으로부터 이필리무맙의 인 비트로 방출 연구
에멀젼을 실시예 9에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다. 리피오돌화 에멀젼 (3/1 비율, 나노입자의 농도 15 mg/mL)으로부터 이필리무맙의 인 비트로 방출을 평가하였다. 1 mg의 이필리무맙에 해당하는 0.8 mL의 에멀젼을 20 mL의 완충 식염수 용액 (PBS, pH 7.4)을 함유하는 튜브에 넣고 37 ℃에서 150 rpm의 속도인 인큐베이터에 넣었다. 미리 결정된 시간에, 알리코트 (300 μL)를 수집하고 동등한 부피의 PBS로 교체하였다. 방출된 이필리무맙의 양을 BCA (비신코닌산 (Bicinchoninic Acid)) 단백질 분석 방법: 비신코닌산 (bicinchonic acid)에 기초한 비색 단백질 분석에 의해 정량화하였다 (도 13).
실시예 22: 인 비보 연구: 옥살리플라틴이 로딩된 유중수 리피오돌화 에멀젼으로부터 간의 화학색전술
본 연구를 위한 에멀젼을 실시예 12에서와 동일한 프로토콜에 따라 제제화하였다.
본 연구에 대한 실험 프로토콜을 동물 실험 윤리위원회에 의해 검증받았다. 간의 VX2 종양을 전신 마취 (general anesthesia) 하에 백색 뉴질랜드 토끼 (New Zealand rabbits)에 경피적으로 이식하였다 (케타민 (Ketamine) 20-40 mg/kg 및 자일라진 (xylazine) 3-5 mg/kg 근육내 주사, 유도를 위해 이소플루란 (isoflurane) 3-5 % 및 수술을 위해 1 L　/　min O2와 혼합된 1.5-3 %).
VX2 종양 세포의 이식 2 주 후, 간내 동맥 (hepatic intra　-　arterial) 주사를 중재 방사선 전문의 (interventional radiologist)가 수행하였다. 이를 X-선 혈관조영술 (angiography) 테이블이 장착된 방에서 전신 마취 및 형광투시 가이드 (fluoroscopic guidance) 하에 행하였다. 우선, 대퇴부 동맥 (femoral artery)을 외과적으로 노출시키고 4F 혈관 혈관조영술 카테터를 삽입하였다. 이어서, 2.4F 마이크로 카테터를 사용하여 간 동맥의 좌측 분지에 선택적 카테터화를 하고 0.5 mL의 에멀젼 (즉, 0.625 mg의 옥살리플라틴)을 주사하였다.
옥살리플라틴의 혈장 농도를 결정하기 위해 정맥혈 (2 mL) 샘플을 채취하였고 주사 후 5, 10, 20, 30 및 60 분에 취하였다.
4 그룹의 토끼를 제조하였다:
그룹 1: 나노입자에 의해 안정화되지 않은 통상적인 옥살리플라틴 에멀젼 안락사 (euthanise). 이 그룹은 주사 1 시간 후 안락사되었다 (n = 4).
그룹 2: 나노입자에 의해 안정화된 옥살리플라틴 에멀젼을 투여한 토끼. 이 그룹은 주사 1 시간 후 안락사하였다 (n = 5).
그룹 3: 나노입자에 의해 안정화되지 않은 종래 옥살리플라틴의 에멀젼을 투여한 토끼. 이 그룹은 주사 24 시간 후 안락사하였다 (n = 4).
그룹 4: 나노입자에 의해 안정화된 옥살리플라틴의 에멀젼을 투여한 토끼. 이 그룹은 주사 24 시간 후 안락사하였다 (n = 5).
안락사 직후, 종양을 측정하고 계수하기 위해 MRI를 수행하였다. 간을 제거하고, 종양뿐만 아니라 좌우 간엽 (liver lobe)으로부터의 조직 샘플을 개별적으로 절제하고 (dissected) 백금의 정량화를 위해 믹서로 균질화시켰다. 백금을 혈장 질량 분석법 (ICP-MS)에 의해 분석하였다.
옥살리플라틴의 약동학 (Pharmacokinetics):
두 가지 유형의 에멀젼 주사 후 옥살리플라틴의 약동학을 하기 표 4 및 도 14에 요약하였다. 옥살리플라틴 (Cmax)의 혈장 피크는 종래 에멀젼과 비교하여 피커링 에멀젼의 주사 후 유의하게 낮아졌다 (0.49 ± 0.14 ng/mL 대 1.08 ± 0.41 ng/mL, p <0.01). 1 시간에 곡선하면적 (area under the curve: AUC)은 피커링 에멀젼에 대해 유의하게 낮아졌다 (19.8 ± 5.9 대 31.8 ± 14.9, p = 0.03).
Figure pct00004
* 유의한 차이
표 4: 주사된 에멀젼의 유형 및 안락사 시간에 따른 간 조직에서의 옥살리플라틴의 평균 농도 (ng/mg).
간 및 조직에서 옥살리플라틴의 농도:
조직 내 옥살리플라틴의 농도를 하기 표 4 & 5에 나타내었다. 24 시간에, 종양/좌엽 비율은 통상적인 에멀젼과 비교하여 피커링 에멀젼에서 유의하게 더 높았다 (43.4 ± 42.9 vs 14.5 ± 6.6, p = 0.04).
Figure pct00005
* 유의한 차이
표 5: 주사된 에멀젼의 유형 및 안락사 시간에 따른 간 종양에서의 옥살리플라틴의 평균 농도 (ng/mg).
1 시간에 종래 에멀젼을 갖는 종양 및 좌엽에서 유의하게 높은 옥살리플라틴의 농도는 옥살리플라틴의 신속한 방출을 유도하는 에멀젼의 낮은 안정성 수준과 일치하였다. 반대로, 피커링 에멀젼으로부터의 옥살리플라틴의 느린 방출로 인해, 1 시간에서 비표적 기관 (우엽)의 더 적은 전신 노출 및 24시간에서 보다 더 큰 종양 노출이 유도되었다.

Claims (14)

  1. 연속 유상 (oily phase) 및 액적 (droplets)의 형태로 분산된 수상 (aqueous phase)을 포함하는 유중수 (water-in-oil) 에멀젼으로서, 상기 수상은 폴리에스테르계 (polyester-based) 나노입자, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 것인 에멀젼.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유상은 특히 지방산, 지방산 에스테르 및 미네랄 오일 (mineral oils)로부터 선택된, 하나 이상의 오일을 포함하는 것인 에멀젼.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 유상은 하나 이상의 식물 오일 (plant oil), 특히 피마자유 (castor oil), 참기름 (sesame oil), 양귀비 종자유 (poppy seed oil), 올리브유, 대두유 (soybean oil), 코코넛유, 트리올레인 (triolein), 및 이의 혼합물을 포함하는 것인 에멀젼.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유상은 양귀비 종자유로부터 요오드화된 지방산의 에틸 에스테르, 8 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 중쇄 길이를 갖는 트리글리세리드, 또는 주로 스쿠알렌 (squalene)으로 구성되는 미네랄 오일을 포함하는 것인 에멀젼.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수상의 액적의 크기는 10 μm 내지 100 μm인 것인 에멀젼.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에스테르계 나노입자는 폴리락트산 (폴리락티드 (polylactide)), 폴리글리콜산 (폴리글리콜리드 (polyglycolide)), 락티드-글리콜리드 공중합체, 락티드-글리콜리드-코-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (lactide-glycolide-co-polyethylene glycol copolymers), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리무수물 (polyanhydrides), 폴리부틸아세톤 (polybutylacetone), 폴리발레로락톤 (polyvalerolactone), 폴리말산 (poly malic acid), 폴리락톤 (polylactones), 및 이들의 혼합물에 기반한 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된 것인 에멀젼.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 면역조절제 (immunomodulators), 항암 의약품 (anticancer medicinal products), 항혈관신생 의약품 (anti-angiogenic medicinal products), 항감염 의약품 (anti-infectious medicinal products), 항염증 의약품 (anti-inflammatory medicinal products), 조영제 (imaging contrast agents), 방사성 제제 (radioactive agents) 및 감염체 (infectious agents) 중에서 선택된 것인 에멀젼.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 항암 의약품은 알킬화제 (alkylating agents), 백금 유도체 (platinum derivatives), 세포독성 항생제 (cytotoxic antibiotic agents), 항미세소관제 (antimicrotubule agents), 안트라사이클린 (anthracyclines), 토포이소머라제 타입 I 및 Ⅱ 억제제 (topoisomerase type I and II inhibitors), 플루오로피리미딘 (fluoropyrimidines), 시티딘 유사체 (cytidine analogues), 아데노신 유사체 (adenosine analogues), 메토트렉세이트 (methotrexate), 폴리닌산 (folinic acid), 효소, 항혈관제 (antivascular agents), 항혈관신생제 (anti-angiogenic agents), 항유사분열제(antimitotic agents), 키나제 억제제 (kinase inhibitors), 호르몬, 모노클로날 항체 (monoclonal antibodies), 방사성원소 (radioelements), 암살상 바이러스 (oncolytic viruses), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 에멀젼.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 독소루비신 (doxorubicin), 이리노테칸 (irinotecan), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 항암 의약품인 것인 에멀젼.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 치료제는 항혈관신생 모노클로날 항체, 항-CTLA-4 모노클로날 항체, 항-PD-1 모노클로날 항체, 항-PD-L1 모노클로날 항체, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 에멀젼.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에스테르계 나노입자는 산화철 (iron oxide) 입자를 추가로 포함하는 것인 에멀젼.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 에멀젼뿐만 아니라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 (excipient)를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 암의 치료에 사용하기 위한 청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 따른 에멀젼.
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