KR20200031187A - 미?리아닌 또는 연잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미?리아닌(miquelianin) 또는 이를 함유하는 연잎(lotus leaf) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물은 세포내 활성산소 및 래디칼을 제거하는 항산화 활성을 가질 뿐만 아니라, 대식세포의 NO 생성을 저해하고 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하는 항염증 활성을 가진다. 따라서, 이들을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약학, 식품 또는 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미?리아닌 또는 연잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물{Composition for anti-inflammation comprising miquelianin or lotus leaf extract}

본 발명은 항염증 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 미?리아닌(miquelianin) 또는 이를 함유하는 연잎(lotus leaf) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.

염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 박테리아, 곰팡이, 바이러스에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 국소적인 생체의 방어 반응이다. 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개 인자에 의하여 촉발된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.

최근 분자생물학의 발달로 분자적 수준에서 염증 반응에 대한 많은 연구가 이루어져 있다. 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 여러 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ito T., et al., Curr Drug Traget Inflamm Allergy, 2(3):257-265, 2003). 산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 어떤 자극에 의하여 그 발현이 유도되는 iNOS(induced

NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여한다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236:658-671, 2011; Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94, 1999;Stamleret al., Science, 258:1898-1902, 1992).

한편 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG2와 PGH2를 합성하며, 이들 화합물로 PGE2, PGF2, PGD2, 프로스타시클린 및 트롬복산A2(thromboxane A2, TxA2)를 생성하는데, COX에도 2종류의 이소 형태가 존재한다. COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되어 세포 보호 작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 데 반하여, COX-2는 염증 반응 시 신속히 그 발현이 유도되어 PGE2 등을 생성함으로써 염증 반응을 일으키는 데 중요한 역할을 수행한다(Weisz A., Biochem. J., 316:209-215, 1996;(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4:387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35:27-28, 1996).

NO와 PGs의 과다 생성을 유도하는 iNOS 및 COX-2의 발현은 핵전사인자인 NF-κB에 의해 조절된다. NF-κB는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서, 세포질에서는 I-κB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, 어떤 요인에 의하여 I-κB 키나제(kinase)가 활성화되면 인산화 과정을 통해 I-κB가 떨어져 나가게 됨으로써 활성화된다. p50과 p65의 헤테로이량체(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화된 후, 핵으로 이동하여 염증 반응을 유도하는 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현을 유도한다(Oh, G. T. et al., Atherosclerosis, 159(1):17-26, 2001).

LPS(lipopolysaccharide) 등의 세균 내독소는 TLR4(toll-like receptor 4)와의 결합함으로써 전사인자인 NF-κB를 활성화시키며, iNOS 및 COX-2의 발현을 유도하여 NO, 염증성 사이토카인, PGE2 등 여러 염증 조절 물질을 분비하게 한다(Chen YC, et al, Biochem. Pharmacol., 61:1417-1427, 2001; Dobrovolskaia MA, et al., J Immunol., 170:508-19, 2003; Ji Y, et al., Cell Physiol Biochem., 25:631-640, 2010). NO, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인, PGE2 등은 관절염(Jang C. H. et al., Rheumatology, 2006, 45(6):703-710), 섬유근통(Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 2010, 3(1):156), 쇼그렌 증후군(Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 2009, 38(5):386-389) 등에서 염증 반응의 유도하는 중요한 인자로 보고되어 있다(Jang C. H. et al., Rheumatology, 45(6):703-710, 2006; Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 3(1):156, 2010; Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 38(5):386-389, 2009).

이러한 연구 결과는 NO 생성을 억제하거나 TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 약물, iNOS나 COX-2의 발현을 억제하는 약물은 유효한 항염증제로서의 가능성을 가짐을 시사한다(Karin M. et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, pp1-14, 2009).

현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010). 따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 새로운 약물의 개발이 여전히 필요하다고 할 수 있다.

한편, 연잎(lotus leaf)은 미나리아재비목 수련과의 여러해살이 수초로서 연(Nelumbo nucifera)이라고도 한다. 비타민 C와 비타민 B12 및 아스파라긴, 아르기닌, 티로신 같은 아미노산이 함유되어 있어 피로회복 및 피부미용 개선작용 등에 효과가 있음은 물론 로에메린(roemerine)과 누시페린(nuciferine) 성분의 진통 진정작용이 있어 신경과민이나 스트레스 등에 효과가 있고 민간에서는 기관지천식, 임질, 강장, 소화불량뿐만 아니라 뱀과 독벌레에 물렸을 때 사용하는 것으로 알려져 왔다. 특히 연잎 (Lotus leaf, Nelumbo nucifera)에는 다수의 플라보노이드가 발견되고 특히 miquelianin, astragalin (kaempferol 3-glucoside), isoquercetin (Hirsutrin, quercetin 3-glucoside), hyperin (quercetin 3-galactoside), gallic acid, quercetin, rutin, isorhamnetin등이 주요 성분으로 보고되고 있다.

이에, 본 발명자는 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 연구한 결과, 미?리아닌(miquelianin) 또는 이를 함유하는 연잎(lotus leaf) 추출물이 활성산소 및 래디칼을 제거하는 항산화 활성을 나타낼 뿐만 아니라, LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 세포)에서 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보이고 또한 COX-2 및 iNOS의 생성 억제 활성을 보임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 천연물질인 연잎(lotus leaf) 추출물 또는 이로부터 유래된 미?리아닌(miquelianin)을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1의 미?리아닌(miquelianin) 또는 이를 함유하는 연잎(lotus leaf) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin)은 다양한 식물에서 소량으로 발견되고 있으며, 특히 마디풀, 물여뀌, 땅콩, 고추나물, 소엽물싸리 등의 식물에서 보고되고 있다. 본 발명에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin)은 바람직하게는 연잎 (Lotus leaf, Nelumbo nucifera) 추출물에서 분리된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는, 연잎 추출물의 플라보노이드를 분석하여, 미?리아닌(miquelianin)이 main compound인 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물은 항산화 활성도 겸용으로 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공한다. 본 발명의 실험예에서는 상기 미?리아닌 또는 연잎 추출물이 세포내 활성산소 및 래디칼을 제거하는 항산화 활성을 가지며, 대식세포의 NO 생성을 저해하고 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하는 항염증 활성을 가지는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 연잎 추출물은 종래에 천연식물을 추출하기 위하여 이용된 열수추출, 용매추출, 증류추출, 초임계 추출 등 어떠한 추출방법으로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 한다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 예컨대 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 및 부탄올 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 열수가 사용될 수 있다(실시예 1 참조).

본 발명에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물은 조성물 총 중량대비 0.0001 내지 100중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 분말, 정제, 과립제, 환제, 캡슐제, 액상형, 젤리, 껌 또는 티백으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 구강 섭취용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 수분 크림, 스팟, 젤, 로션, 연고, 파스 또는 에어로졸로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 피부 외용제용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항염증을 필요로 하는 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 예컨대 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물, 의약외품, 또는 화장료 조성물 등으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다. 또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유종, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 또는 희석제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘스테아레이트, 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 정맥, 근육, 또는 피하 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

발명에 따른 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적 하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에서, 바람직한 미?리아닌 투여량은 0.01μg/kg/일 내지 20,OOOμg/kg/일, 보다 구체적으로는 1μg/kg/일 내지 10,000μg/kg/일이고, 연잎 추출물의 투여량은 1일 1 mg/kg 내지 1,OOO mg/kg/일이다.

이상 설명한 바와 같이, 본원 발명의 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물을 함유하는 조성물은 세포내 활성산소 및 래디칼을 제거하는 항산화 활성을 가질 뿐만 아니라, 대식세포의 NO 생성을 저해하고 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하는 항염증 활성을 가진다. 따라서 본 발명의 조성물은 약학, 식품 또는 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 연잎 추출물 및 미?리아닌 (miquelianin)의 크로마토그램이다.
도 2는 연잎 추출물의 세포내 활성산소 제거효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 연잎 추출물 및 미?리아닌 (miquelianin)의 ABTS 래디칼 소거효과를 나타내느 그래프이다.
도 4는 연잎 추출물 및 미?리아닌 (miquelianin)의 DPPH 래디칼 소거효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 연잎 추출물 및 미?리아닌 (miquelianin)의 NO생성 억제효능를 나타내는 그래프이다.
도 6은 연잎 추출물 및 미?리아닌 (miquelianin)의 iNOS 발현 억제 효능을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 연잎(lotus leaf) 추출물 제조

본 발명을 위하여 사용된 연잎은 전라도 해남 지역의 연잎을 채취하여 건조한 연잎을 사용하였다. 연잎 15g을 300ml 물에 3시간 동안 1반복으로 환류추출 하였다. 열수 추출(100℃)하여 얻어진 추출물을 감압농축 (rotary evaporatior)을 통하여 농축한 후 이를 동결건조하여 분말화 하였다. 농축 후 2.42g의 분말을 얻었다.

실시예 2: 연잎(lotus leaf) 추출물으로 부터 미?리아닌(miquelianin)의 분리 동정

실시예 1의 연잎 추출물의 성분을 분석하기 위하여, 연잎 추출물 20mg을 취한 후 메탄올에 용해하여 20 mg/mL로 조제 후, 초음파 진탕기로 40분간 녹인 후 0.45μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다. 상기 시험용액을 가지고 아래 표1과 같은 조건으로 고속액체크로마토그래프(HPLC)를 실시하였다. 그 결과의 크로마토그램을 도 1a에 도시하였다. 각종 플라보노이드 표준품과 비교한 결과 연잎 추출물의 주성분은 미?리아닌(miquelianin)으로 나타났으며, 그 외에 rutin, astragalin, isoquercetin, myricetin, quercetin 등이 미량 검출되었다.

구체적으로, 연잎 추출물의 주성분 피크가 미?리아닌(miquelianin)인지를 확인하기 위하여 미?리아닌 표준품 (miquelianin, sigma) 1 mg을 메탄올 1 mL에 용해하여, 초음파 진탕기로 20분간 녹인 후 0.45μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 표준용액(STD)으로 사용하였으며, 아래 표1과 같은 조건으로 고속액체크로마토그래프 (HPLC)를 실시하였다. 그 결과의 크로마토그램을 도 1b에 도시하였다. 도 1a와 도 1b에서, 연잎 추출물과 표준품과의 RT (retention time) 비교를 통하여 연잎 추출물의 주성분 피크가 미?리아닌(miquelianin)임을 확인하였다. 이후 실험예에서는 표준품 (miquelianin, sigma)을 미?리아닌으로 사용하였다.

항목	고속액체크로마토그래프 조건
기기	Agilent 1260 Infinity II Quat Pump, CA, USA DAD WR detector, CA, USA
칼럼	INNO C18 column (25 cm x 4.6 mm, 5 μm)
주입량	10 μL
이동상	Gradient 조건 [A 물(0.5% 아세트산) : B 아세토니트릴]
유속	1.0 mL/분
검출기 파장	UV 350 nm

실험예 1: 연잎 추출물 또는 미?리아닌(miquelianin)의 항산화 활성

1) 실험방법

ㅇ Intracellular Reactive Oxygen Species (ROS) 측정

배양된 세포를 24 well에 2.0 × 105 cell 수준으로 접종하여 24시간 후 시료 추출물을 농도별로 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 세포내 산화는 H2O2 3시간 처리로 유도하였으며 생성된 ROS의 양을 측정하기 위하여 DCF-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)를 첨가하여 37℃에서 추가로 배양하고, florescence plate reader를 이용하여 485/535 nm에서 형광 측정하였다.

ㅇ DPPH radical scavenging activity

연잎 추출물을 농도별로 희석한 용액과 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy (DPPH: Sigma chemical, USA)을 에탄올에 희석한 용액을 1:1로 혼합하고 상온에서 30분간 방치 후, 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ㅇ ABTS radical scavenging activity

2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)를 potassium phosphate buffer (pH 7.4) 용액에 녹여 1:1로 혼합하고 상온에서 12시간 방치해 ABTS·+ 양이온을 형성시켜 734 nm에서 흡광도 값이 1.00 ± 0.02가 되도록 조절하였다. 이 용액 일정량에 농도별로 희석한 추출액 일정량을 가하여 37℃에서 2시간 반응시킨 후에 734 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

2) 실험결과

ㅇ연잎 추출물의 세포내 활성산소 제거능

연잎 추출물의 세포 내 활성산소 제거 효과를 측정하기 위해 C2C12 세포에 H2O2로 산화를 유도하며 연잎 추출물을 처리한 결과 농도 의존적으로 세포내 활성산소 억제능이 증가하는 것으로 나타났다. 그 실험결과를 도 2에 도시하였다.

ㅇ ABTS radical scavenging activity

연잎 추출물 (1, 2.5, 5, 10, 25, 50 ug/ml)과 miquelianin (1, 2.5, 5, 10 uM)을 DMSO에 녹인 뒤 농도별 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과 대조군으로 이용한 trolox, 연잎 추출물, miquelianin 모두 농도 의존적으로 항산화활성이 증가하는 것으로 나타났다. 그 실험결과를 도 3에 도시하였다.

ㅇ DPPH radical scavenging activity

연잎 추출물 (10, 25, 50, 100 ug/ml)과 miquelianin (5, 10, 25, 50, 100 uM)를 DMSO에 녹인 뒤 농도별 DPPH 소거능을 측정한 결과 대조군으로 이용한 trolox, 연잎추출물, miquelianin 모두 농도 의존적으로 항산화활성이 증가하는 것을 확인했다. 그 실험결과를 도 4에 도시하였다.

실험예 2: 연잎 추출물 또는 미?리아닌(miquelianin)의 항염증 활성

1) 실험 방법

ㅇ RAW 264.7 세포의 배양 및 NO량의 측정

생쥐 대식세포 RAW 264.7 (KCLB)의 배양은 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지 (2mM glutamine, 1% penicillin/streptomycin)로 5% CO2 ,37℃로 조정된 incubator에서 배양하였다. 배양액내의 nitrite(NO2-) 함량은 Griess assay를 통해 측정하였음. Kit의 well에 시료와 동량의 Griess 용액(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid와 0.1% α-naphtylethylene diamine)을 가해 실온에서 반응시킨 후 ELISA reader로 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ㅇ iNOS 발현 측정

RAW 264.7 세포에서 추출한 단백질을 8% polyacrylamide-gel에 로딩하여 전기영동을 수행하였다. 그 후 젤 내의 단백질을 PVDF membrane으로 transfer 하고 5% skim milk가 포함된 TBS-T buffer로 blocking하였다. Blocking이 끝난 PVDF membrane은 1차 antibody, 2차 antibody를 차례로 붙인 후 ECL advanced 키트를 이용하여 반응 시키고 chemidoc으로 이미지를 획득하였다.

2) 실험결과

ㅇ 연잎의 NO 생성 저해 효능

Raw264.7 세포에서 LPS (lipopolysaccharide)를 처리하여 염증반응을 유도하고 Griess assay를 통해 NO 생성을 측정하여 연잎 추출물의 항염증 효능을 평가하였다. 연잎물추출물 100, 200, 400 μg/ml에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 유의적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 miquelianin 50, 100, 200 μM에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 유의적으로 저해하는 것을 확인하였다. 그 실험결과를 도 5에 도시하였다.

ㅇ 연잎의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 효능

Raw264.7 세포에서 LPS로 iNOS 및 COX-2의 발현을 유도하고 연잎추출물과 miquelianin의 억제 효능을 평가한 결과, 연잎 추출물 400μg/ml과 miquelianin 50, 100, 200 μM에서 LPS로 유도된 iNOS의 발현을 저해하는 것을 확인하였다. 그 실험결과를 도 6에 도시하였다.

제형예 1: 정제의 제조

상기 실시예 1 또는 실시예 2에 대하여 통상의 정제 제조방법에 따라서 하기 표 2 또는 표 3의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

원료명	단위중량 (mg)
실시예 1	50
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산	2

원료명	단위중량 (mg)
실시예 2	10
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산	2

제형예 2: 캡슐제의 제조

상기 실시예 1 또는 실시예 2에 대하여 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 하기 표 4 또는 표 5의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질캡슐제를 제조한다.

원료명	단위중량 (mg)
실시예 1	50
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산	2

원료명	단위중량 (mg)
실시예 2	2
비타민 E	2.25
비타민 C	2.25
팜유	0.5
식물성 경화유	2
황납	1
레시틴	2.25
연질캡슐충진액	387.75

제형예 3: 액제의 제조

상기 실시예 1 또는 실시예 2에 대하여 기호에 적합한 음료 제조방법에 따라서 하기 표 6 또는 표 7의 성분을 혼합하고 과병 또는 파우치에 충전하여 액제를 제조한다.

원료명	단위중량 (g)
실시예 1	2.5050
산탄검	0.0075
프락토올리고당액	0.7500
코코넛꽃진액분말	1.0500
쌍화농축액	1.5000
홍삼향	0.0450
정제수	9.1425

원료명	단위중량 (g)
실시예 2	0.0205
산탄검	0.0075
프락토올리고당액	0.7500
코코넛꽃진액분말	1.0500
쌍화농축액	1.5000
홍삼향	0.0450
정제수	20.1425

제형예 4 : 영양크림의 제조

상기 실시예 1 또는 실시예 2에 대하여 영양크림을 통상의 방법에 따라서 하기 표 8 또는 표 9의 조성으로 제조하였다.

원 료	함 량 (%)
실시예 1	1.0
시토 스테롤	4.0
폴리글리세릴 2-올레이트 3.0	3.0
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라우어오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

원 료	함 량 (%)
실시예 2	0.01
시토 스테롤	4.0
폴리글리세릴 2-올레이트 3.0	3.0
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라우어오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

상기의 조성비는 일반적으로 적합한 성분을 혼합하여 제형예로 조성하였지만, 필요에 따라서 그 배합비 및 원료를 임의로 변경 실시하여도 무방하다.

본 발명의 추출물은 모든 제형예 시험 조건에서 안정하므로 제형의 안정성에는 문제가 없었다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 미?리아닌(miquelianin) 또는 이를 함유하는 연잎(lotus leaf) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물은 항산화 활성도 겸용으로 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 연잎 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 미?리아닌(miquelianin) 또는 연잎(lotus leaf) 추출물은 조성물 총 중량대비 0.0001 내지 100중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 정제, 과립제, 환제, 캡슐제, 액상형, 젤리, 껌 또는 티백으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 구강 섭취용 인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 수분 크림, 스팟, 젤, 로션, 연고, 파스 또는 에어로졸로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 피부 외용제용인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 의약품, 식품, 의약외품 또는 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.

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