KR20200028835A

KR20200028835A - 신규 면역독소 제조방법

Info

Publication number: KR20200028835A
Application number: KR1020190098950A
Authority: KR
Inventors: 유태현; 이유미; 이병성
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2020-03-17
Also published as: KR102353086B1; WO2020050628A1

Abstract

본 발명은 면역독소 제조방법 및 이를 이용한 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 시스테인으로 치환된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산이 도입된 PE24를 위치-특이적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 면역독소 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 면역독소 및 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 위치-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 이용하여 반응성 시스테인을 단일클론 항체에 도입하는 기술 및 비천연 아미노산을 단백질에 도입하는 방법에 의하여, 항체의 항원 결합 및 독소의 촉매 활성과 같은 생화학적 특성에 영향을 미치지 않으며, 암 세포주에 대한 세포독성이 있는 동종성 면역독소를 제조할 수 있으므로, 다양한 항체-단백질 접합체를 제조하고 암 치료제로도 응용될 수 있다.

Description

신규 면역독소 제조방법{Novel Method for Preparing Immunotoxin}

본 발명은 면역독소 제조방법 및 이를 이용한 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 시스테인으로 치환된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산이 도입된 PE24를 위치-특이적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 면역독소 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 면역독소 및 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

항체(antibody)는 인체의 방어 시스템의 필수적인 부분이다. B-림프구(B-lymphocyte) 표면에 존재하는 항체는 바이러스, 박테리아, 곰팡이와 같은 유해 물질을 확인하고 공격한다. 이들은 항원-특이적이며 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 중쇄와 경쇄 모두 가변영역(variable region) 및 불변영역(constant region)을 갖는다. 가변영역(V_H, V_L)이라 불리는 N-말단이 항원 특이성을 담당하고, 불변영역은 중쇄의 3개의 도메인(C_H1, C_H2, C_H3)과 경쇄의 1개의 도메인(C_L)을 포함한다. 항원 결합 단편(Fab) 및 불변 단편(Fc)의 두 가지 구조 부분이 있다(도 1). Fab은 V_H 및 V_L을 포함하며, 항원을 인식하고 병원체를 중화할 수 있고, Fc 영역은 2개의 CH₂와 2개의 CH₃ 도메인으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄는 이황화(-S-S-) 결합에 의해 연결되고 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된다. 면역글로불린(immunoglobulins)에는 IgG, IgA, IgD, IgM 및 IgE의 5가지 종류가 있으며, 특정 기능에 적합한 특유의 성질을 갖게 하는 구조적 차이가 있다. 이 중 IgG는 치료제에 주로 적용된다. 항체는 항원을 단독으로 파괴할 수는 없지만, 보체, 식세포 또는 NK 세포와 같은 면역계를 통해 표적 항원을 차단하거나 세포를 사멸시킬 수 있다(Wang, W., et al ., Journal of pharmaceutical sciences, 2007. 96(1): p. 1-26).

1975년 하이브리도마 세포로부터 단일클론 항체를 만드는 기술이 개발되었다(Kohler, G. and C. Milstein, Nature, 1975. 256(5517): p. 495-497.). 하이브리도마 세포는 B 세포와 악성 종양 세포를 화학적 화합물과 융합시켜 만들 수 있으며, 이러한 하이브리도마 세포는 영구적으로 배양되어 특정 항체만을 만들 수 있다. 이 기술로 높은 특이성과 친화도를 갖는 고순도 항체를 생산할 수 있지만, 마우스 단일클론 항체의 임상적 성공은 제한적이었다. 비인간 종(마우스 또는 래트)에서 유래되어 높은 면역원성(immunogenicity)의 문제가 있기 때문이다. 비인간 항체와 관련된 문제를 극복하기 위해, 키메릭(chimeric), 인간화(humanized) 및 인간(human) 항체에 관한 유전공학이 발달하였다. 키메릭 항체는 쥐 가변영역 및 인간 불변영역으로 구성되어있다(Morrison, S.L., et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1984. 81(21): p. 6851-6855). 인간화된 항체는 마우스 상보성 결정영역(complementarity-determining regions; CDRs)을 인간 가변 및 불변 영역에 이식함으로써 생성된다(Jones, P.T., et al ., Nature, 1986. 321(6069): p. 522-525). 완전 인간 항체는 파지 디스플레이 기술과 형질전환 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 파지 디스플레이(phage display)는 단백질을 연결하기 위해 박테리오파지를 사용하는 in vitro 스크리닝 기술이다(Gram, H., et al ., Journal of immunological methods, 1993. 161(2): p. 169-176). 현재 많은 단일클론 항체가 치료 약물로 승인되었으며, 단일클론 항체에 기초한 치료제가 높은 특이성, 선택성 및 긴 반감기를 갖지만, 많은 암은 단일클론 항체 단독으로 치료하는 것에 내성이 있다(Villamor, N., E. Montserrat, and D. Colomer. Seminars in oncology. 2003 Aug;30(4):424-33). 또한, 단백질의 크기가 커서 고형종양에 침투하기 어렵다. 이러한 한계를 극복하기 위해서 다양한 전략, 예를 들어, 숙주 반응의 변형, 종양 세포를 직접 표적, 세포독성 물질을 전달하는 등의 다양한 전략이 개발되어왔다(Ray, P. and R.R. White, Pharmaceuticals, 2010. 3(6): p. 1761-1778).

항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugates; ADC)는 정상 세포는 남겨두고 암세포만 죽일 수 있는 이상적인 표적 치료법 중 하나로, 항체가 세포독성 약물과 결합하여 암세포로 전달된다(Alley, S.C., N.M. Okeley, and P.D. Senter, Current opinion in chemical biology, 2010. 14(4): p. 529-537). ADC의 개발이 계속되어 왔으나, ADC 분자의 동종성(homogeneity) 문제가 있다. 이전에 연구된 ADC들은 0 내지 8의 약물 대 항체(DAR) 비율을 가지고 있어, 약물동태(pharmacokinetics)와 in vivo 성능이 서로 달랐다(Hamblett, K.J., et al ., Clinical cancer research, 2004. 10(20): p. 7063-7070). ADC를 생산하기 위한 통상적인 결합 방법은 용매가 접근 가능한 라이신(lysine) 또는 사슬 간 이황화 결합이 감소된 시스테인(cysteine)을 사용한다. 약 100개의 라이신 잔기를 포함하는 인간 IgG 때문에, 라이신 화학 결합은 항체 당 0 내지 8개의 접합된 분자를 발생시킨다. 따라서, 다수의 상이한 ADC 종들이 생성 될 수 있다(Wang, L., et al ., Protein science, 2005. 14(9): p. 2436-2446). 시스테인 화학적 결합은 4개의 사슬 간 이황화 결합의 환원을 통해 이루어지므로, 8개의 자유 티올(thiol) 기를 링커-약물의 부착 위치로 만든다. 따라서 두 가지 방법으로 생성된 각 접합체는 모두 비접합(unconjugated) 및 과결합(overloaded) 형태로 구성된다. 항원 결합에서 약물-결합 종은 비접합 항체에 의해 방해를 받아 치료 활성이 감소한다. 반면 약물-과결합 종(DAR> 4)은 항체 응집, 낮은 안정성, 빠른 신장 청소율을 가진다(Sun, M.M., et al ., Bioconjugate chemistry, 2005. 16(5): p. 1282-1290).

가장 일반적인 생물학적 과정 중 하나인 단백질 합성을 표적으로 할 수 있기 때문에 독소(toxin)는 항체와 같은 타겟-특이적 결합 분자에 접합되거나 융합되어 개발되었다. 초기에 타겟-결합 도메인이 없는 독소 또는 그 변이체는 lysine chemistry를 이용하여 IgG에 화학적으로 결합되었지만, 생성물은 이질적(heterogeneous)이었고, 이는 치료제로서 개발하는 데 심각한 장애물이었다. 한계를 극복하기 위해, 독소 변이체는 E. coli에서 항체 단편에 융합되어 발현되었다. 그러나, 이는 크기가 작고 Fc 도메인이 없기 때문에 짧은 반감기와 같은 단점을 가지고 있었다.

1980년대 초, 많은 연구자들이 면역독소(immunotoxin) 생성을 위해 다양한 식물 및 리신(ricin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin)와 같은 여러 박테리아로부터 단백질 독소에 대한 연구를 수행했다. 면역독소는 표적 특이성을 위한 단일클론 항체 또는 리간드 및 세포 살상 효과를 위한 강력한 독소를 포함한다. 일반적으로 세포 내부에서 세포독성을 유발하는 효소가 독소로서 면역독소에 사용된다(Blythman, H.E., et al ., Nature, 1981. 290(5802): p. 145-146). 대부분의 경우 독소의 본래 세포 결합 도메인이 단일클론 항체의 scFv 또는 Fab으로 대체되어 정상 세포와의 비특이적 결합을 감소시킨다. 재조합 DNA 기술이 유전학적으로 융합된 면역독소를 제공하며, 이는 유사한 세포독성 및 개선된 동종성 생성물을 보여준다(Pastan, I., et al ., Nature Reviews Cancer, 2006. 6(7): p. 559-565; Alewine, C., R. Hassan, and I. Pastan, The oncologist, 2015. 20(2): p. 176-185). 1981년 최초의 성공적인 in vivo 면역독소 연구 이래로 면역독소에 대한 여러 임상 연구가 수행되었다. 그러나 혈관 누출 증후군(vascular leak syndrome), 면역원성(immunogenicity) 및 간 독성(hepatotoxicity)과 같은 부작용이 있으며(Kreitman, R.J., et al ., Journal of Clinical Oncology, 2012. 30(15): p. 1822-1828), 이러한 한계를 극복하기 위한 노력이 시도되고 있다.

표적 암 치료를 위해 면역독소들이 개발되었다. 암세포 표면 수용체에 결합하는 단일클론 항체 또는 리간드의 표적화 부분(targeting moiety) 및 박테리아, 식물 유래 독소와 같은 강력한 단백질로 구성된 이들 키메릭 단백질은 암세포를 죽이는 강력한 능력을 보여주었다. 화학적 결합(conjugation) 또는 융합(fusion) 단백질 방법은 면역독소를 수득하는 수단으로서 연구되었으나, 대부분의 화학적 결합 방법은 이질적(heterogeneous) 생산물을 만들어 내고, 면역독소의 융합된 형태는 전장(full-length) 항체보다 항체 단편(fragment)에 대해서만 보고되었다.

이에, 본 발명자들은 암 치료에 효과적인 면역독소 개발을 위하여, 전장 항체 및 독소가 위치-특이적으로 결합된 면역독소를 개발하고자 예의 노력한 결과, 면역글로불린(immunoglobulin)과 위치-특이적 돌연변이 유발을 이용하여 반응성 시스테인을 단일클론항체에 도입함으로써 생성되는 동종성 ADC를 생산하는 기술(THIOMAB 기술) 및 비천연 아미노산을 Pseudomonas exotoxin A로부터 유래된 단백질에 도입하는 방법을 이용하여 결합시켜 생성된 접합체가 동종(homogeneous) 생성물이며, 항원 특이성을 유지하고, 암 세포주에 대한 세포독성 활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 면역글로불린 및 독소가 위치-특이적으로 결합된 면역독소의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 면역독소 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체를 환원 및 재산화시킨 후 링커(linker)와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24를 접합시켜 면역독소를 생성하는 단계를 포함하는 면역독소(immunotoxin)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체가 링커를 매개로 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24과 접합된 면역독소(immunotoxin)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 면역독소를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 위치-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 이용하여 반응성 시스테인을 단일클론 항체에 도입하는 기술 및 비천연 아미노산을 단백질에 도입하는 방법에 의하여, 항체의 항원 결합 및 독소의 촉매 활성과 같은 생화학적 특성에 영향을 미치지 않으며, 암 세포주에 대한 세포독성이 있는 동종성 면역독소를 제조할 수 있으므로, 다양한 항체-단백질 접합체를 제조하고 암 치료제로도 응용될 수 있다.

도 1은 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린 변이체와, 비천연 아미노산을 포함한 PE24를 링커를 이용해 위치-특이적인 결합에 대한 모식도이다.
도 2는 시스테인으로 치환된 면역글로불린 변이체 screening의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것으로, 모든 데이터는 환원 및 재산화 과정 후에 관찰되었다. Lane 1은 Intact Trastuzumab이며, Q416C, N418C 등은 실시예에 기재된 변이체에 상응한다.
도 3은 변형된 Pseudomonas Exotoxin A(PE24) 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 PE24 발현 테스트에 대한 SDS-PAGE 및 Western blot 분석을 나타낸 것이다. W.C는 1% SDS 처리 및 95℃ boiling 후 전체 cell lysates을, Sol은 B-PER 처리 soluble fraction을, Ins는 soluble fraction pellets으로부터의 Insoluble fraction을 나타내며, Peri는 periplasmic fraction, Sph는 spheroplast(periplasmic fraction 상층액을 제거한 후 1 % SDS 이용 및 95℃ boiling에 의해 얻은 lysed pellets)를 의미한다.
도 5는 정제된 PE24의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 도 5A는 periplasmic fraction을 통해 배양된 E. coli에서 정제된 PE24이며, 도 5B는 트롬빈 처리 후 재정제된 PE24이다. Lane 1 내지 5는 elution fraction을 나타낸다(Lane 1*: PE24 after thrombin treatment. Lane 2*: column flow through fraction from Lane 3* to Lane 5* was eluted with lysis buffer).
도 6은 항체-단백질 접합 과정의 개요를 나타낸 것이다.
도 7은 Trastuzumab-PE24 결합의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 비환원 및 환원 조건에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(Lane 1: intact Trastuzumab N418C variant, Lane 2: fold TECP를 이용한 환원된 항체, Lane 3: dhAA를 이용한 재산화된 항체, Lane 4: intact PE24, Lane 5: Trastuzumab N418C 및 PE24 접합체 혼합물, Lane 6, 7, 8: 각각 Lane 1, 4, 5의 환원 조건).
도 8은 Trastuzumab 변이체와 PE24-AzF의 접합을 나타낸 SDS-PAGE 결과이다. SDS-PAGE의 분석은 환원, 재산화 및 PE24 접합 트라스투주맙에 대한 비환원 조건에서 수행되었다.
도 9는 정제된 Trastuzumab-PE24 접합체의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 도 9a는 크기 배제 크로마토그래피 결과로, 21 내지 25분획은 추가적으로 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제되었으며(좌측), 각 분획은 SDS-PAGE를 통해 분석되었다(우측). 도 9b는 음이온 교환 크로마토그래피 결과로, 크기 배제 크로마토그래피의 21 내지 25분획을 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하고(좌측), 각 피크의 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다(우측).
도 10은 간접 ELISA에 의한 Her2/neu 결합 친화도 평가를 나타낸 그래프이다. 96 well plate를 Her2/neu 항원으로 코팅하고, 검출 항체 단백질 L-HRP 접합체를 1:500 비율로 사용하였다. TMB 용액 처리 후 플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도 신호를 측정하였다.
도 11은 Her2 양성 세포에 대한 트라스투주맙(a) 및 트라스투주맙-PE24(b)의 결합 및 흡수를 나타낸 것이다. MDA-MB-231(Her2 음성) 또는 MDA-MB-453(Her2 양성) 세포를 4℃에서 30분 동안 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-PE24와 함께 배양하였다. 세포 endocytosis 경로를 유도하기 위해, MDA-MB-453 세포는 37℃에서 4시간 더 배양되었다(최하단). 세포를 항-인간 항체-Alexa 488 및 Hoechst로 염색하고 공초점 형광 현미경을 이용하여 이미지를 얻었다.
도 12는 ELISA에 의해 측정된 하기의 Fc 수용체에 대한 트라스투주맙-PE24 접합체의 결합을 나타낸 것이다: (a) hC1q, (b) FcRn at pH 6.0, (c) FcRn at pH 7.4, (d) FcrRI, (e) FcrRIIa(H), (f) FcrRIIa(R), (g) FcrRIIb, (h) FcrRIIIa(F), (i) FcrRIIIa(V). hC1q는 보체 성분 1q; FcRn은 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor); FcrRI는 Fc 감마 수용체I(Fc gamma receptor I); FcrRIIa(H)는 Fc 감마 수용체 IIa(H134); FcrRIIa(R)는 Fc 감마 수용체 IIa(R134); FcrRIIb: Fc 감마 수용체 IIb; FcrRIIIa(F)는 Fc 감마 수용체 IIIa(F158); FcrRIIIa(V)는 Fc 감마 수용체 IIIa(V158)이다.
도 13은 ADP-ribosylation assay의 scheme을 나타낸 것이다.
도 14는 각 농도의 접합체에서의 ADP-ribosylation 활성에 대한 Western blot 분석을 나타낸 것이다(Lane 1: PE24 없이 NAD-biotin을 함유하는 밀 배아 추출물, 각 농도의 Lane 2: NAD-biotin 및 PE24를 함유하는 밀 배아 추출물, 각 농도의 Lane 3: NAD-biotin 및 Trastuzumab-PE24 접합체를 함유하는 밀 배아 추출물. 모든 western blot 데이터는 streptavidin-HRP에 의해 측정되었다).
도 15는 유방암 세포주의 세포 생존력을 나타낸 그래프이다. a 및 b는 Her2/neu 양성 세포주이고, c는 Her2/neu 음성 세포주이다. 세포독성은 제조사의 지침에 따라 WST-8 분석법으로 측정하였다.
도 16은 BONCAT의 도식 구조를 나타낸 것이다.
도 17은 Trastuzumab-PE24 접합체의 단백질 억제에 대한 Western blot 분석을 나타낸 것으로, HCC1954는 Her2/neu 양성 세포주이고, MDA-MB-231는 Her2/neu 음성 세포주이다(Lane 1: 단백질 미처리된 4mM AHA, Lane 2: 단백질 미처리된 4mM AHA 및 100μg/ml cycloheximide, Lane 3: 0.1nM intact Trastuzumab 및 4mM AHA, Lane 4: 0.1nM intact PE24 및 4mM AHA, Lane 5: 0.1nM Trastuzumab-PE24 접합체 및 4mM AHA. 모든 western blot 데이터는 streptavidin-HRP에 의해 측정되었다). 데이터에 사용된 단백질 loading 양을 확인하기 위해, GAPDH에 대한 western blot 결과를 이용하였다.
도 18은 Cetuximab-HC-N418C와 PE24-AzF의 접합과 정제를 나타낸 것이다. Trastuzumab을 이용한 접합 및 정제 방법대로 진행하였다. 도 18a는 cetuximab의 환원과 산화 결과에 대한 SDS-PAGE 분석으로 비환원 조건에서 수행되었다. 도 18b는 접합 및 크기 배제 크로마토그래피 결과로(좌측), 14 내지 23 분획은 SDS-PAGE를 통해 분석되었다(우측). 도 18c는 음이온 교환 크로마토그리피 결과로, 크기 배제 크로마토그래피의 15 내지 19 분획은 추가적으로 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였고(좌측), 이를 SDS-PAGE를 통해 분석하였다(우측). 이 중에서, 6 내지 16 분획은 cetuximab 항체에 단일 PE24가 접합된 형태로 분리된다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

항체-약물 접합체(ADC)는 수십 년 동안 개발되었지만 이질적 생성물을 생성했다. 이질성(heterogeneity)은 ADC의 치료제로서의 사용을 제한했다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 결합 화학 방법이 개발되었다. 동종(homogeneous) ADC를 생성하려는 시도는 항체의 중쇄 또는 경쇄에 조작된 시스테인을 도입함으로써 고정된 화학양론(stoichiometry)을 갖는 ADC를 생산하는 THIOMAB 기술을 만들어 냈다.

면역독소는 리간드의 항체 및 세포독성 독소 단백질과 같은 표적화 부분으로 구성된 또 다른 항암 전략이다. 1 세대 및 2 세대 면역독소는 통제할 수 없는 화학적 결합으로 인해 이질적 생성물을 만들어내므로 치료제로의 사용이 제한되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 3 세대 면역독소는 대장균에서 융합 단백질 방식을 통해 개발되었다. 생성물은 이전의 방법보다 덜 이질성을 보였으나, 융합된 전장 IgG와 PE의 발현이 성공적이지 못했다. 결과적으로 작은 크기의 항체 단편이 융합된 PE만이 발현되었으며, 짧은 반감기를 나타냈다.

본 발명의 목적은 전장 IgG와 단백질에 대한 위치-특이적 결합 방법을 개발하는 데 있다. THIOMAB 기술과 단백질에 비천연 아미노산을 도입하는 방법을 기초로 한 항체와 단백질의 접합 전략이 제안되었다. 그리고 다양한 암 세포주에서 생화학적 특성과 세포독성을 평가하였다. 그 결과 다양한 항체-단백질 접합체를 제조하는 데 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있음을 보여준다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체를 환원 및 재산화시킨 후 링커(linker)와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24를 접합시켜 면역독소를 생성하는 단계를 포함하는 면역독소(immunotoxin)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산이 도입된 단백질 PE24가 클릭 반응(Click reaction)에 의해 위치-특이적(site-specific)으로 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 시스테인 변이를 포함하는 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 비천연 아미노산을 포함하는 PE24를 maleimide-PEG-DBCO Linker를 통해 위치-특이적으로 결합시킨 접합체를 제조하였다. 상기 링커에 포함된 알킨(Alkyne)기와 비천연 아미노산에 포함된 아자이드(Azide)기가 통상적인 클릭 반응 시스템(화학식 1) 하에서 반응하여 위치-특이적으로 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 PE24가 접합된다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시예에서, 접합체는 각각 Trastuzumab 및 PE24와 유사한 항원 결합 친화도 및 ADP-ribosylation 활성을 나타내었으며, 이는 IgG의 시스테인 조작, 비천연 아미노산의 PE로의 결합 및 결합을 위한 화학 반응으로 구성된 결합 방법이 접합된 분자의 특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “면역글로불린(immunoglobulins)”이란 항체를 포함한 혈장 단백으로서, immunoglobulin(Ig)M, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε으로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체 기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 isotype이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 다르다.

IgG는 중쇄(heavy chain, 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있으며, 중쇄 불변영역에는 C_H1, H(hinge), C_H2, C_H3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-sheet로 구성되어 있고 이들 사이에 intramolecular disulfide bond가 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성되며, 이 부위는 Y자 모양의 양 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 hinge region으로 연결되어 있다.

상기 “항체”는 항원(antigen)과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)를 모두 포함하는 개념으로, 바람직하게는 단일클론 항체이며, 온전한 전체 항체(whole antibody) 형태를 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역글로불린 변이체는 전장(full-length) 단일클론 IgG인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 IgG 타입의 단일클론항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 면역독소의 제조방법은 면역글로불린(immunoglobulin)의 아미노산 잔기 일부를 시스테인(cysteine)으로 치환하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 면역글로불린 변이체는 서열번호 18로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 273번째, 303번째, 305번째 아미노산; 서열번호 22로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 272번째, 302번째, 304번째 아미노산; 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 불변영역 아미노산 서열의 91번째, 93번째 아미노산;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 면역글로불린 변이체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

면역글로불린의 아미노산 서열

면역글로불린	아미노산 서열	서열번호
Trastuzumab
중쇄 (Heavy chain)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	17
중쇄 불변영역 (HC; Heavy chain-constant region)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	18
경쇄 (Light chain)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	19
경쇄 불변영역 (LC; Light chain-constant region)	KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	20
Cetuximab
중쇄 (Heavy chain)	QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	21
중쇄 불변영역 (HC; Heavy chain-constant region)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	22
경쇄 (Light chain)	DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	23
경쇄 불변영역 (LC; Light chain-constant region)	KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	20

상기 표 1에서 굵은 글씨로 표시한 아미노산은 시스테인으로 치환될 수 있는 잔기에 해당하며, 밑줄로 표시한 부분은 hinge region을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 18로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 273번째, 303번째, 305번째 아미노산 또는 서열번호 22로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 272번째, 302번째, 304번째 아미노산 잔기는 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)으로 나타내면, 각각 HC-G174, HC-N204, HC-N386, Q416, HC-N418에 해당하며, 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 불변영역 아미노산 서열의 91번째, 93번째 아미노산 잔기는 LC-T197, LC-Q199에 해당한다.

본 발명의 일 실시예에서, 트라스트주맙 또는 세툭시맙 변이체는 HC(Heavy chain; 중쇄)-Q416, HC-N418, HC-N386, HC-N204, HC-G174, LC(Light chain; 경쇄)-T197 및 LC-Q199로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환되었다. 상기 트라스트주맙 또는 세툭시맙 변이체의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른다(Kabat et al ., in “of Proteins of Immunological Interest”5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호).

본 발명의 일 실시예에서, 시스테인 치환은 위치-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 이용하여 반응성 시스테인을 단일클론 항체에 도입함으로써 동종성 ADC를 생산하는 THIOMAB 기술을 이용하여 도입시켰다(Junutula, J.R., et al ., Nature biotechnology, 2008. 26(8): p. 925-932).

상기 THIOMAB 기술은 이질성(heterogeneity) 문제에 대한 해결책으로 제안되었다. 조작된 시스테인 잔기는 발효 과정 중에 형성된 다른 천연 시스테인 또는 글루타티온(glutathione)과 쌍을 이룰 수 있어, 활성을 감소시킬 수 있다. 이를 위해 PHESELECTOR라 불리는 파지 디스플레이 기반 ELISA가 개발되었다. 모델 시스템으로 trastuzumab-Fab(hu4D5Fab)을 사용하여 항원 결합을 방해하지 않는 높은 활성을 갖는 unpaired된 시스테인 잔기를 제작하였으며, 항원 결합과 상호작용할 수 없다. 전장 항체에 이 시스템을 적용시키기 위해, 중쇄의 알라닌 잔기가 시스테인 잔기로 치환된(HC-A114C) 항-MUC16 THIOMAB-약물 접합체를 사용하여 원래의 항-MUC16 항체와 항원 결합을 비교하였다. 항-MUC16 mAb와 vcMMAE를 포함한 THIOMAB은 사슬 간 이황화 결합의 환원과 재산화에 의해 생성되었으며, 이 과정은 결합을 위해 두 개의 자유 티올 그룹을 만들었다. 이어서, 이들 자유 티올과 링커의 maleimide 기와의 반응이 수행되었다. 이 방법은 기존의 항-MUC16 항체(DAR ~3.5)와 비교하여 위치-특이적으로 결합된 ADC(DAR ~2)를 만들었고, in vitro 및 in vivo 연구에서 유사한 항 종양 활성을 보였다. Rat와 cynomolgus monkey에서 수행된 동물 모델 연구에서 THIOMAB-drug conjugates(TDCs)는 기존 ADC보다 더 큰 치료 지수를 보였다. 이러한 결과는 THIOMAB 기술이 기존 ADC에 비해 향상된 치료 지수 및 약력(pharmacodynamics)을 갖춘 동종 접합체를 생성하는 데 사용될 수 있음을 의미한다(Junutula, J.R., et al ., Nature biotechnology, 2008. 26(8): p. 925-932; Junutula, J.R., et al ., Clinical Cancer Research, 2010. 16(19): p. 4769-4778).

본 발명에 있어서, 상기 시스테인 치환은 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 일어나는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 면역독소의 제조방법은 시스테인으로 치환된 면역글로불린을 환원 및 재산화시킨 후 링커(linker)와 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 환원은 환원제로서 트리스(2-카복시에틸)포스핀(Tris(2-carboxyethyl)phosphine; TCEP)을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 재산화는 산화제로서 디하이드로아스코르빈산(Dehydroascorbic acid; dhAA)을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 링커는 말레이미드(maleimide)-PEG-DBCO 링커인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, maleimide 및 DBCO 기를 함유하는 이차 작용성 링커(bi-functional linker)인 maleimide-PEG-DBCO를 이용하여, N418C 돌연변이를 갖는 Trastuzumab 또는 Cetuximab 변이체와 azide group을 갖는 PE24 단백질을 위치-특이적으로 결합시켰다.

본 발명에 따른 면역독소의 제조방법은 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24를 접합시켜 면역독소를 생성하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 PE24는 탈면역화된(deimmunized) 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A인 것을 특징으로 할 수 있다.

디프테리아 독소(diphtheria toxin), 젤로닌(gelonin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin(PE))와 같은 다양한 독소가 면역독소를 생산하기 위해 연구되었다. 그 중 하나인 Pseudomonas exotoxin A에 기초한 면역독소가 항암제 개발을 위해 활발히 연구되었다. Pseudomonas exotoxin A 기반의 면역독소는 부작용으로 경미한 혈관 누출 증후군(VLS)만 보고되었기 때문에, PE-기반 면역독소는 ricin과 같은 다른 면역독소와 달리 임상 개발에 유리하다.

Pseudomonas aeruginosa는 그람 음성균으로, 인간 병원균으로 널리 퍼져있다. Pseudomonas Exotoxin A는 ADP-ribosylation을 통한 진핵세포 신장 인자 2(eukaryotic elongation factor 2; eEF-2)의 불활성화를 촉매하는 가장 독성이 강한 단백질이다(Domenighini, M. and R. Rappuoli, Molecular microbiology, 1996. 21(4): p. 667-674). eEF-2는 단백질 합성 과정에 필수적인 물질이다. 따라서, Pseudomonas Exotoxin A는 단백질 합성 저해를 통한 세포 사멸을 유도한다(Hafkemeyer, P., et al ., Human gene therapy, 1999. 10(6): p. 923-934).

본 발명에 있어서, 상기 PE24는 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A에서 도메인 Ⅰa가 결실되고, 퓨린 절단 부위(furin-cleavable motif)를 제외한 도메인 Ⅱ가 결실되며, 7개의 돌연변이(R427A, R456A, D463A, R467A, R490A, R505A 및 R538A)를 포함하는 독소의 도메인 Ⅲ를 포함하고, 추가로 His 6 tags 및 트롬빈(Thrombin) 절단 부위가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.

PE는 단일 638개의 아미노산(69 kDa) 폴리펩티드로 발현되며, 분비 과정에서 N-말단 25개의 아미노산을 제거함으로써 613개의 아미노산(66 kDa)으로 된다. X-선 결정학(X-ray crystallography) 연구에 따르면, PE는 3개의 주요 구조 도메인을 갖고 있다(Wedekind, J.E., et al ., Journal of molecular biology, 2001. 314(4): p. 823-837). 또한, PE는 수용체 결합 도메인(B subunit)과 세포독성 활성 도메인(A subunit)으로 구성된 AB 독소 계열에 속한다(Odumosu, O., et al ., Toxins, 2010. 2(7): p. 1612-1645). 도메인 Ⅰa(aa 1-252)는 수용체 결합을 담당하는 B subunit이다. 6개의 연속 α-나선을 갖는 도메인 Ⅱ(aa 253-364)는 세포막을 통한 전좌(translocation)에 관여한다. 도메인 Ⅲ는 ADP-ribosyltransferase 활성에서 중요한 역할을 하는 촉매 subunit이다. 도메인 Ⅰb(aa 365-404)의 기능은 알려져 있지 않지만, 도메인 Ⅰb의 일부(aa 395-404)는 도메인 Ⅲ의 촉매 활성에 필요하다(Kihara, A. and I. Pastan, Bioconjugate chemistry, 1994. 5(6): p. 532-538).

PE가 분비되면, 독소의 C-말단 라이신(aa 613)은 숙주의 carboxypeptidase에 의해 절단되어 골지체의 KDEL 수용체에 결합할 수 있는 REDL 서열을 생성한다. 독소의 도메인 Ⅰa가 세포 표면 수용체인 LRP1에 결합한 후, PE는 clathrin-coated pits를 통해 내재화된다. PE 분자는 도메인 Ⅱ의 furin-cleavable motif(aa 274-280인 RHRQPRG가 furin 절단 부위에 해당함)에서 단백질 분해 과정을 거친다(Ref ogata et al, 1992). 분해에 의해 2개의 PE 단편, 28 kDa(B subunit) N-말단 단편과 37 kDa C-말단 단편(A subunit)을 생성한다(Ogata, M., et al ., Journal of Biological Chemistry, 1992. 267(35): p. 25396-25401). furin 절단이 일어난 후에도 furin 절단 부위를 둘러싼 C-265와 C-287의 이황화 결합으로 인해 두 개의 단편이 연결된다. 단백질 이황화 이성질화 효소(Protein disulfide isomerase; PDI)는 이황화 결합을 감소시켜, KDEL 수용체에 결합하고 역행 방식으로 ER에 수송되는 REDL 서열(aa 609-612)을 함유한 37 kDa PE 단편을 생성한다. 최종적으로, 37 kDa 단편은 ER-관련 단백질 분해 경로(ERAD)를 통해 세포질에 도달하고, 단백질 합성 저해 및 궁극적으로는 세포 사멸을 유도하는 eEF-2에 대한 ADP ribosylation을 촉매한다(Michalska, M. and P. Wolf, Frontiers in microbiology, 2015. 6).

천연 exotoxin A와 달리 면역독소로 개발된 exotoxin A는 항체 또는 리간드에 결합하므로 표적 특이적 결합이 가능하다. 여러 종류의 면역독소가 개발되었으나, 모두 천연 독소와 유사한 작용 메커니즘을 통해 암세포를 죽인다. 따라서 다양한 암 치료에 사용될 수 있다.

자연 그대로의 PE가 전장 항체 또는 수용체 리간드에 화학적으로 결합된 초기 연구(1 세대 면역독소라고도 함)는 정상 세포에 대한 비특이적인 살상의 한계에 도달했다. 독소로부터 세포 결합 도메인을 제거함으로써 독소의 도메인 Ⅰa가 항체의 가변 단편(Fv)으로 대체된 2 세대 면역독소는 동물에 더 잘 적용되는 것으로 나타났다. 그러나, 이들은 또한 첫 번째 면역독소와 같이 화학적 결합에 의해 생산되기 때문에 이질적 생성물이 생성되어 치료적 응용이 제한된다. 재조합 DNA 기술은 3 세대 면역독소를 생산하기 위해 도입되었다. 독소의 세포 인식 도메인은 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)가 펩티드 링커로 연결되거나 이황화 결합된 Fv에 의해 안정화되는 항체의 가변 단편으로 대체된다(Shapira, A. and I. Benhar, Toxins, 2010. 2(11): p. 2519-2583).

한편, 도메인 Ⅰa가 제거된 PE40(aa 253-613)(Kondo, T., et al ., Journal of Biological Chemistry, 1988. 263(19): p. 9470-9475) 및 추가적으로 도메인 Ⅰb 부분(365-380)이 제거된 PE38(aa 253-334 및 381-613)(Theuer, C.P., et al ., Cancer research, 1993. 53(2): p. 340-347)은 면역독소 구축을 위해 개발되었다. 특히 PE38 기반 면역독소는 다양한 종류가 있으며, 그 중 일부는 임상 연구가 진행 중이다(Mazor, R., M. Onda, and I. Pastan, Immunological reviews, 2016. 270(1): p. 152-164). 그러나 혈관 누출 증후군과 같은 용량-제한 독성 및 부작용으로 인해 치료 효과가 제한된다(Kreitman, R.J., et al., Journal of Clinical Oncology, 2000. 18(8): p. 1622-1636). 세포질에 도달하는 과정에서 일어날 수 있는 리소좀 분해를 피하기 위해서, 독소의 활성에 중요한 furin 절단 서열 RHRQPRGWEQ를 제외한 대부분의 도메인 Ⅱ를 제거한 결과, 손상되지 않은 PE38과 유사한 세포독성을 보였다(Weldon, J.E., et al ., Blood, 2009. 113(16): p. 3792-3800). 임상 연구에 따르면 PE가 박테리아 유래 독소이기 때문에 PE38 기반 면역독소로 치료받은 환자의 92%가 첫 번째 사이클 후 중화 항체를 생성했다(Powell, D.J., et al ., The Journal of Immunology, 2007. 179(7): p. 4919-4928). 최근 Roche와 미국 국립 보건원(NIH)은 RG7787이라는 항-mesothelin 면역독소를 개발했다(Hollevoet, K., et al ., Molecular cancer therapeutics, 2014. 13(8): p. 2040-2049.). 탈면역화된 면역독소는 인간화된 Fab과 B 세포 및 T 세포 에피토프가 제거된 독소로 구성되며, 동물 모델에서 항 종양 활성이 입증되었다. RG7787은 현재 LMB-100으로 불리며, 악성중피종(malignant mesothelioma)의 치료를 위해 1 상 연구가 진행되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 파라아지도페닐알라닌(p-azidophenylalanine)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

자연계에는 20개의 아미노산이 있으며, 생물학적 과정에 필요한 단백질 빌딩 블록으로 기능한다. 반대로, 측쇄에 검출 프로브 또는 화학 반응성과 같은 특별한 특성을 갖는 비천연 아미노산(Unnatural acid; UAA)이 있다(Liu, C.C. and P.G. Schultz, Annual review of biochemistry, 2010. 79: p. 413-444). 예를 들면, azide 또는 알킬기를 포함하는 단백질은 click reaction을 통해 다른 분자와 결합될 수 있고(Jewett, J.C. and C.R. Bertozzi, Chemical Society Reviews, 2010. 39(4): p. 1272-1279), 벤조페논기를 포함하는 단백질은 다른 분자와의 광-교차 결합에 사용될 수 있다(Hino, N., et al ., Nature methods, 2005. 2(3): p. 201-206). 수많은 비천연 아미노산이 개발되었으며, 50개 이상의 UAA가 여러 분야에서 단백질에 도입되었다(Wals, K. and H. Ovaa, Frontiers in chemistry, 2014. 2). 다른 물질에 접합될 수 있는 기능은 ADC에 적용될 수 있으며(Axup, J.Y., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012. 109(40): p. 16101-16106), 프로브 특성을 갖는 비천연 아미노산은 바이오센서용 진단 시약에 적용될 수 있다(Lee, H.S., et al ., Journal of the American Chemical Society, 2009. 131(7): p. 2481-2483). 또한, 비천연 아미노산의 도입을 통해 단백질의 안정성이 증가될 수 있다(Kwik, W., K. Ang, and G. Chen, Journal of Inorganic and Nuclear Chemistry, 1980. 42(2): p. 303-313).

비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위해 E. coli, 효모 및 포유류 세포주를 통한 생산 시스템이 개발되었다. 비천연 아미노산을 단백질에 위치-특이적으로 결합시키기 위해서는 두 가지 인자가 필요하다. 독특한 코돈은 정지 또는 quadruplet 코돈이며(Anderson, J.C., et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(20): p. 7566-7571), 보통 천연 아미노산을 코딩하지 않는다(Chen, G.-F.T. and M. Inouye, Nucleic acids research, 1990. 18(6): p. 1465-1473). UAG, UGA, UAA 및 AGGA 코돈은 각각 정지 코돈 및 quadruplet 코돈에 속한다(O'donoghue, P., et al ., FEBS letters, 2012. 586(21): p. 3931-3937). 또 다른 요소는 숙주 생물에서 endogenous tRNA, aminoacyl tRNA synthetase 및 아미노산과의 혼선을 피하기 위해 다른 종으로부터 유래된 orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase(aaRS)/tRNA 쌍이다. Methanococcus jannaschil(Mj)에서 유래된

쌍은 대장균에서 TAG 정지 코돈에 비천연 아미노산을 도입하기 위해 사용되었다(Wang, L. and P.G. Schultz, Chemistry & biology, 2001. 8(9): p. 883-890). 다양한 비천연 아미노산은 이 기술을 통해 위치-특이적으로 결합될 수 있으며, 이는 ADC와 같은 다양한 분야에 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역글로불린은 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 세툭시맙(Cetuximab)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 허셉틴(Herceptin)은 HER2/neu 수용체를 타겟으로 하고 유방암 치료에 사용되는 단일클론 항체인 “트라스투주맙(Trastuzumab)”의 브랜드명으로, 본 발명에서 허셉틴과 트라스투주맙은 동일한 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 트라스투주맙은 단독으로 또는 다른 화학 요법 약물과 함께 사용될 수 있다.

본 발명에서 “세툭시맙(Cetuximab)”은 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 억제제로, 전이성 대장암, 전이성 비소세포폐암 및 두경부암의 치료에 사용되는 키메릭(mouse/human) 단일클론 항체이다.

본 발명은 다른 관점에서, 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체가 링커를 매개로 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24과 접합되어 있는 면역독소(immunotoxin)에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 트라스트주맙 또는 세툭시맙 변이체는 HC(Heavy chain; 중쇄)-Q416, HC-N418, HC-N386, HC-N204, HC-G174, LC(Light chain; 경쇄)-T197 및 LC-Q199로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환되었다.

본 발명에 있어서, 상기 링커는 말레이미드(maleimide)-PEG-DBCO 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 PE24는 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A에서 도메인 Ⅰa가 결실되고, 퓨린 절단 부위(furin-cleavable motif)를 제외한 도메인 Ⅱ가 결실되며, 7개의 돌연변이(R427A, R456A, D463A, R467A, R490A, R505A 및 R538A)를 포함하는 독소의 도메인 Ⅲ를 포함하고, 추가로 His 6 tags 및 트롬빈(Thrombin) 절단 부위가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역글로불린은 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 세툭시맙(Cetuximab)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 면역독소를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 암은 예컨대 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 비소세포폐암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 유방암, 대장암, 비소세포폐암 또는 두경부암일 수 있다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, “약학적으로 허용 가능한 담체”란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 암 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용 성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 의사의 처방에 따라, 또는 당 분야에 널리 알려진 공지의 방법에 따라 환자의 생체내로 주입될 수 있으며, 1회 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 결정될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포주( Cell lines ) 준비

10% FBS, 2mM Ｌ-glutamine, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin을 포함하는 RPMI-1640(Hyclone, Europe Ltd.)에서 유방암 세포주인 HCC1954, MDA-MB-453 및 MDA-MB-231(생물자원센터 Korean Collection for Type Cultures, KCTC)를 배양하였다. 세포들을 37℃에서 5% CO₂를 포함한 humidified atmosphere에서 성장시켰다. 항체 생산을 위해 HEK293F cells을 37℃에서 8% CO₂를 포함한 humidified atmosphere에서 유지시키고, Gibco FreeStyle™ 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific)에서 성장시켰다.

실시예 2: 시스테인 변이체 (아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린 변이체 ) 제작

실시예 2-1: 시스테인 변이체 제작

항체 중쇄의 돌연변이는 two-step overlap PCR 방법을 이용하여 도입되었으며, Trastuzumab 유전자를 포함하는 pcDNA 3.1(+)을 주형으로 사용하였다. 시스테인 변이체 제작에 사용된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 표 2에 나타내었다(Primer A-f: Trastuzumab 유전자 5’-end 부분의 프라이머 / Primer B-r: Trastuzumab 유전자 3’-end 부분의 프라이머 / Primer 1~7: cysteine 치환을 위한 프라이머). 사용된 제한효소 부위는 NotI 및 BamHI이다. 프라이머 A와 B는 일반적으로 모든 생산에 사용되며, 다른 것들은 표 2에 기재된 바와 같이 시스테인 변이체(cysteine variants)를 만드는 데 사용되었다. 예를 들어, 중쇄 Asparagine 418을 시스테인으로 변경하는 방법은 다음과 같다: 먼저 프라이머 A-f, 프라이머 1-r, 프라이머 B-r 및 프라이머 1-f를 사용하여 PCR 반응을 수행하였으며, 단편 1 및 2를 생성시켰다. 2개의 단편을 어닐링시키고 프라이머 A-f 및 B-r과 함께 PCR 증폭에 직접 사용하였다. 시스테인 돌연변이를 포함하는 조립된 산물을 NotI 및 BamHI를 사용하여 pcDNA 3.1(+)에 클로닝 하였다. 다른 시스테인 변이체는 상기 기재된 바와 같이 생산된다.

시스테인 변이체 생성을 위해 사용된 프라이머

Trastuzumab constructs	Oligonucleotide	Sequence (5′-3′)	서열번호
-	Primer A-f	GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCC	1
-	Primer B-r	GGGAAGCAATAGCATGATACAAAGG	2
HC-N418C	Primer 1-f	TGGCAGCAGGGGTGCGTCTTCTCATGC	3
HC-N418C	Primer 1-r	GCATGAGAAGACGCACCCCTGCTGCCA	4
HC-Q416C	Primer 2-f	AGCAGGTGGCAGTGCGGGAACGTCTTC	5
HC-Q416C	Primer 2-r	GAAGACGTTCCCGCACTGCCACCTGCT	6
HC-N386C	Primer 3-f	TGGGCAGCCGGAGTGCAACTACAAGACCA	7
HC-N386C	Primer 3-r	TGGTCTTGTAGTTGCACTCCGGCTGCCCA	8
HC-N204C	Primer 4-f	TCACAAGCCCAGCTGCACCAAGGTGGACA	9
HC-N204C	Primer 4-r	TGTCCACCTTGGTGCAGCTGGGCTTGTGA	10
HC-G174C	Primer 5-f	ACAGTCCTCATGCCTCTACTCCC	11
HC-G174C	Primer 5-r	GGGAGTAGAGGCATGAGGACTGT	12
LC-T197C	Primer 6-f	GCCTGCGAAGTCTGCCATCAGGGCCTG	13
LC-T197C	Primer 6-r	CAGGCCCTGATGGCAGACTTCGCAGGC	14
LC-Q199C	Primer 7-f	GAAGTCACCCATTGCGGCCTGAGCTCG	15
LC-Q199C	Primer 7-r	CGAGCTCAGGCCGCAATGGGTGACTTC	16

본 명세서에서 항체의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른다(Kabat et al ., in “of Proteins of Immunological Interest”5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호).

실시예 2-2: Trastuzumab 시스테인 변이체의 생산 및 정제

HEK293F 세포에서 발현 벡터의 일시적인 형질주입(transfection)에 의해 항체를 생성하였다. HEK293F 세포를 Gibco FreeStyle™ 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하여 1x10⁶ cell/ml로 준비하였다. 플라스미드 DNA를 OptiPro-SFM(Thermo Fisher Scientific)에서 7.5μg/ml 폴리에틸렌 이민과 함께 중쇄 및 경쇄 각각의 최종 농도가 1.25μg/ml가 되도록 혼합하였다. 15분 배양 후 배양된 세포에 혼합물을 첨가하고, 7일 간 세포를 배양하였다. 불순물 제거를 위해 원심분리 및 여과를 이용하여 상등액을 수득하였다. 제조사에서 권장하는 대로 항체를 protein A agarose resin(Repligen)으로 정제하고 PD-10 desalting column을 통해 PBS(pH 7.4)로 투석하였다(GE healthcare).

조작된 Cys 잔기를 통해 ADC를 개발하기 위해 개발된 THIOMAB 기술은 위치-특이적 방식으로 IgG와 단백질을 결합시키는 데 사용된다. US 2015059771에 기초하여, Cys 잔기 도입을 위한 Trastuzumab의 7개 위치(중쇄의 Q416, N418, N386, N204 G174 및 경쇄의 T197, Q199)를 선택하였고, 인간 배아 신장 세포(Human embryonic kidney cells) 293 Freestyle(HEK293F)를 이용하여 7개의 조작된 Trastuzumab constructs(HC 및 LC의 HC-Q416C, HC-N418C, HC-N386C, HC-N204C, HC-G174C, LC-T197C, LC-Q199C)를 발현시켰다. 가장 높은 생산 수율을 갖는 것은 HC-N418C(60mg/L)이었다(표 3).

시스테인 변이체의 생산 수율

Variants	Trastzumab	HC-Q416C	HC-N418C	HC-N386C	HC-N204C	HC-G174C	LC-T197C	LC-Q199C
Production Yield (mg/L)	96	45	60	21	56	40	54	58

실시예 2-3: Trastuzumab에 도입된 시스테인( cysteine ) 위치 스크리닝

도입된 IgG의 Cys 잔기는 시스테인 또는 글루타티온(glutathione)에 의해 변형되는 것으로 알려져 있다. 변형된 Cys 잔기의 blocking groups을 제거하고 접합 반응을 위한 thiol group을 생성하기 위해, TCEP를 사용하여 각 항체를 부분적으로 환원시킨 다음, dehydro-ascorbic acid(dhAA)를 사용하여 재산화시켰다. HC-Q416C, N418C 및 N386C는 야생형 Trastuzumab과 유사한 재산화 수율을 나타내었고(도 2), 항체 당 thiol group의 수는 이상적 값인 2에 가까웠다(표 4). 나머지 4개의 Trastuzumab 변이체(HC-N204C, HC-G174C, LC-197C, 및 LC-Q199C)는 덜 효율적으로 재산화되었으며, 이는 이전에 보고된 결과와 다르다(Junutula, J.R., et al ., Nature biotechnology, 2008. 26(8): p. 925-932) HC-N418C는 HC-Q416C 및 HC-386C보다 생산 수율이 높았으며, HC-N418C 변이체를 PE24와의 접합체로 선택하였다.

반응성 시스테인의 양

Variants	HC-Q416C	HC-N418C	HC-N386C	HC-N204C	HC-G174C	LC-T197C	LC-Q199C
Thiol Quantitative values	2.25	2.15	2.13	2.47	2.65	2.74	2.54

실시예 3: 탈면역화된 Pseudomonas Exotoxin A(PE24) 발현용 플라스미드 제작

탈면역화된(deimmunized) Pseudomonas exotoxin A의 경우, 도메인 Ⅱ furin 절단 부위(aa 274-284)를 제외하고 원래의 PE 도메인 I 및 도메인 Ⅱ가 결실되었다. 7개의 돌연변이(R427, R456, D463, R467, R490, R505, R538)를 포함하는 독소의 도메인 Ⅲ는 NIH에 의해 개발되었다(2014, DOI: 10.1158/1535-7163). Ni-NTA를 사용하는 affinity chromatography를 위한 His 6 tag과 His 6 tag 제거를 위한 Thrombin 절단 부위가 구성물에 도입된다(도 3). 탈면역화된 exotoxin 24kDa(PE24) 유전자를 합성하고(bioneer Inc.), 변형된 PE 발현을 위해 pET21a의 NdeI 및 NotI 부위에 PE24를 클로닝하였다. 결과적으로 변형된 PE 코딩 DNA가 구성물의 N-말단에서 periplasmic fraction을 위한 OmpA 분비 시그널 서열을 갖는 플라스미드를 생성하였다.

실시예 4: PE24의 발현 및 정제

아지도 그룹(azido group)을 포함하는 PE24 도메인은 Methanococcus jannaschii로부터 유래된 tRNA(CUA)및 tyrosyl-tRNA synthetase의 orthogonal pair를 사용하여 앰버 코돈(amber codon, TAG)에 반응하여, 아지도페닐알라닌(AzF)을 도입함으로써 제조되었다. PE24의 C-말단 서열은 endocytosis 후, 소포체(endoplasmic reticulum)로 독소를 유도함으로써, PE24의 세포질로의 전이에 있어 중요하다. 따라서, 반응 부분(reactive moiety)은 유연한 링커를 지닌 N-말단에 설치되었다. 니켈 고정화 수지를 사용하여 페리플라즘 분획의 재조합 단백질을 정제하고 트롬빈 반응으로 His6 정제 태그를 제거하였다. 생성된 단백질을 PE24-AzF로 명명하였다.

변형된 PE24 단백질은 MjAzidophenylalanyl-tRNA synthetase (AzFRs)-MjtRNA 직교 쌍, EcProRS, PE24 단백질 발현을 위한 3개의 플라스미드로 형질 전환된 BL21 cells에서 발현된다. 세포를 37℃ 2XYT 배지에서 O.D ₆₀₀이 0.5가 될 때까지 성장시킨 후, 0.2% L-arabinose 및 50nM anhydrotetracycline을 각각 첨가하여 MjAzFRS와 EcProRS의 발현을 유도 하였다. O.D ₆₀₀ 1.0에서,0.2mM IPTG 및 1mM p-azidophenylalanine을 첨가하여 PE24 단백질을 발현시킨 후 하룻밤 동안 25℃에서 배양하였다. 정제를 위해 9,300 ×g 4℃에서 15분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포 펠릿을 0.75M sucrose/0.1M Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 재현탁시키고, 리소자임(50mg/ml) 10㎕를 첨가한 후 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 1mM EDTA와 함께 15분간 배양 후, 0.5M MgCl₂를 첨가하고 10분 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 원심분리(9300g, 15min, 4℃)하여 회수하고, 상등액을 2x 용해 완충액(50mM sodium phosphate, 300mM sodium chloride, 20mM imidazole, pH 7.4)으로 희석시켰다. 1시간 동안 Ni-NTA resin(Qiagen)으로 배양한 후, 상등액을 gravity-flow column에 로딩하고, 컬럼을 세척 완충액(50mM sodium phosphate, 300mM sodium chloride, 40mM imidazole, pH 7.4)으로 세척하고, 용출 완충액(50mM sodium phosphate, 300mM sodium chloride, 300mM imidazole, pH 7.4)으로 용출시킨 다음, his-tags를 제거하기 위해 트롬빈(thrombin) 처리를 수행하였다. 최종 단백질은 Ni-NTA affinity chromatography를 사용하여 용해 완충액으로 용출되었다.

E. coli에서 변형된 PE24의 발현 테스트는 periplasm에서 단백질이 발현되었는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. SDS-PAGE와 Western blot 결과는 변형된 PE24가 periplasm에서 거의 발현되었음을 나타낸다(도 4). 배양된 E. coli pellets으로부터 PE24의 첫 번째 정제는 Ni-NTA affinity chromatography를 사용하여 수행되었으며, 생산 수율 6mg/L의 가용성 단백질을 보여 주었다. 트롬빈 처리를 통해 His 6 tags를 제거하는 두 번째 정제는 수율 4.8mg/L로 80% 수율에 해당한다(도 5).

실시예 5: Trastuzumab 시스테인 변이체와 PE24의 접합

모든 단계는 Amicon® Ultra-4 10K Centrifugal Filter device(Millipore)와 버퍼 교환을 포함한다. 도 6에 Trastuzumab-N418C와 PE24의 결합을 위한 도식을 나타내었다. 25℃ 3시간 동안 환원 완충액(2mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 7.5)에서 100배(2750μM) 몰 초과의 환원제 tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)로 항체를 제거하고, 이어서 정용여과(diafiltration)에 의해 과량의 TCEP를 제거한다. 항체의 사슬 간 이황화 결합을 회복시키기 위해 재산화 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)에서 25℃에서 3시간 동안 Dehydroascorbic acid(dhAA) (Sigma-Aldrich)와 같은 25배(172.5μM) 산화제를 첨가하여 재산화를 수행하였다. 비환원성 SDS-PAGE를 통해 사슬 간 이황화 결합을 검출하였고, 4-PDS 분석을 통해 free thiol group의 반응성을 결정하였다. 40배 초과의 maleimide-PEG-DBCO linker(1100μM)(Click chemistry Tools)는 2시간 동안 25℃ PBS(pH 7.4)에서 반응성 시스테인을 함유하는 재산화된 항체와 반응하였다. 4℃에서 4시간 동안 반응시켜 항체(5mg/ml)와 PE24(항체 농도의 4배 초과)를 접합시켰다. 재산화된 HC-N418C를 DBCO-PEG4-maleimide linker와 반응시킨 후, DBCO와 azide group 간의 strain-promoted click reaction을 통해 PE24와 결합시켰다.

HC-N418가 2개의 결합 부위를 가지고 있음에도 불구하고 주로 단일 결합체가 형성되었으며, 보다 적은 양의 이중 결합체가 관찰되었다(도 7의 Lane 5). IgG의 PE24와의 결합은 N418C 변형이 위치한 중쇄에서만 검출되었으며, 이는 결합의 위치-특이성을 의미한다(도 7의 Lane 8).

참고로, HC-Q416C, HC-N418C, HC-N386C, LCT197C 또는 LC-Q199C 트라스투주맙 변이체와 PE24-AzF의 접합 효율을 평가했다. HC-Q416C 및 HC-N418C 변이체는 다른 변이체보다 높은 접합 수율을 보였다(도 8).

실시예 6: Trastuzumab -PE24 접합체의 정제

트라스투주맙 HC-N418C는 수율을 향상시키기 위해 2개의 단백질 분자 사이의 반응에 대한 연장된 시간(4시간에서 16시간)의 약간의 변형으로 상기 실시예 5에 기재한 방법에 따라 PE24-AzF에 접합하였다. 트라스투주맙-PE24 접합체를 분리하기 위해 크기 배제 및 음이온 교환 크로마토그래피(size exclusion and anion exchange chromatography)로 구성된 2-스텝 정제방법을 사용하였다. 접합되지 않은 PE24와 고분자량 응집체를 크기 배제 크로마토그래피로 제거하고 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 복합체의 PE의 수에 따라 트라스투주맙-PE24를 분리하였다(도 9).

구체적으로, 트라스투주맙-PE24 접합체를 Superdex 200 컬럼 및 Mono-Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. Superdex 200 컬럼을 러닝 버퍼(10mM phosphate, 1M NaCl, pH 7.4)로 평형화시켰다. 트라스투주맙-PE24 접합체를 상기 컬럼에 주입하고 러닝 버퍼로 용출하여 미반응 PE24-AzF를 제거하였다. 트라스투주맙-PE24 접합체 및 미접합 트라스투주맙을 50ml 희석 버퍼(10mM phosphate, pH 7.4)로 희석하고 버퍼 A(20mM phosphate, pH 7.0)로 평형화된 Mono-Q 컬럼에 로딩하였다. 트라스투주맙-PE24는 버퍼 A 및 버퍼 B(20mM phosphate, 1M NaCl, pH 7.0)의 구배로 용출하였다; 단일 PE24가 접합된 트라스투주맙에 대해 10% 내지 15%의 버퍼 B; 2개의 PE24가 접합된 트라스투주맙에 대해 15% 내지 20%의 버퍼 B; 3개의 PE24가 접합된 트라스투주맙에 대해 20% 내지 25%의 버퍼 B.

하기와 같은 이유에 따라, 추가적으로 특성화하기 위해 단일 접합 형태(monoconjugated form)를 사용하였다: 1) 단일 접합 형태는 이중 접합 형태보다 더 높은 수율을 보임, 2) PE의 높은 세포독성으로 인해 항체당 독소 1분자로도 충분히 면역독소(immunotoxin)를 개발할 수 있음. 그러나, 접합 반응에 대한 PE 대 IgG의 비율을 증가시키면, 이중 접합 형태의 수율이 높아질 수 있을 것으로 예상되었다. 환원 조건에서 단일 접합 형태의 SDS-PAGE 결과는 PE24의 분자량만큼 HC 밴드만이 이동한 것으로 나타났으며(도 9b), 이는 PE24-AzF가 위치 특이적인 방법으로 HC-N418C 부위에 접합하였다는 것을 의미한다.

실시예 7: ELISA를 이용한 Trastuzumab -PE24 접합체의 ErbB2에 대한 항원 결합 친화도( antigen binding affinity ) 평가

Trastuzumab과 Trastuzumab-PE24의 ErbB2에 대한 결합을 ELISA 방법을 이용하여 비교하였다. 트라스투주맙야생형(Trastuzumab wildtype), HER N418C-PE24(1), HER N418C-PE24(2)에 의한 ErbB2 결합을 간접적 ELISA로 평가하였다.

Microtiter plates는 4℃, 코팅 완충액(PBS pH 7.4, 0.02% sodium azide)에서 밤새 ErbB2 항원으로 코팅되었다. 세척 후, 플레이트를 블로킹 완충액(4% skim milk in PBS, pH 7.4)에서 1시간 동안 배양하고 웰 당 100㎕ 희석된 샘플로 대체 하였다. 트라스투주맙 야생형, HER N418C-PE24(1) 및 HER N418C-PE24(2)의 농도 범위는 0-100nM이었다. 1시간 동안 샘플과의 1차 배양 후, 반응하지 않은 항체를 제거하고 100㎕ 세척 완충액(Tris buffed saline with 0.1% Tween 20)으로 3회 세척 하였다. 최종 완충액을 블로킹 완충액에서 1/500으로 희석한 L-HRP 접합체 단백질로 웰 당 100㎕로 대체하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 100㎕ 세척 완충액으로 3회 세척 하였다. HRP 활성은 제조사의 지시에 따라 TMB 기질 키트로 검출하였다. 간단히 결합된 TMB 기질 및 H2O2 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 90초 동안 배양하였다. 반응을 멈추기 위해 20㎕ H₂SO₄를 첨가하고, 각 웰의 흡광도를 450nm에서 측정하였다.

Trastuzumab-PE24의 겉보기 결합 친화도는 Trastuzumab과 유사하였는데(도 10 및 표 5), 이는 PE24와의 결합이 항체의 항원 결합성에 최소한으로 영향을 미친다는 것을 나타낸다. CH3 도메인에 위치한 N418 위치는 항원 결합 부위로부터 멀리 떨어져 있으므로, 쉽게 항원 결합을 방해하지 못할 것으로 예상된다. 따라서, Trastuzumab-PE24의 유지된 결합 친화도는 본 발명에서 사용된 결합 전략이 Trastuzumab의 구조를 교란시키지 않는다는 것을 시사한다.

실시예 8: 접합체의 수용체 매개 엔도사이토시스 ( endocytosis ) 확인

24-웰 플레이트에서 커버슬립(Marienfeld) 위의 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지에 MDA-MB-231 또는 MDM-MB-453 세포(4×10⁴)를 접종하고, 5% CO₂ 대기의 37℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포에 결합시키기 위해 세포에 200mM의 트라스투주맙 또는 Trastuzumab-PE24를 4℃에서 30분 동안 처리하거나, 세포의 엔도사이토시스 경로를 유도하기 위해 37℃에서 4시간 동안 추가적으로 배양되었다. 세포를 PBS로 세척하고, 4% p-포름알데히드로 10분간 고정시키고, PBS로 세척하고, 0.1%(w/v) 사포닌(saponin), 0.1%(w/v) 소듐 아자이드(sodium azide) 및 1%(w/v) bovine serum albumin(BSA)을 함유하는 PBS로 10분간 투과화(permeabilized)시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 1%(w/v) BSA로 1시간 동안 차단한 다음, 항-인간 IgG 항체-Alexa 488(Thermo Fisher Scientific)에 1시간 동안 노출시켰다. 세포 핵을 Hoechst(Thermo Fisher Scientific)로 10분 동안 염색하였다. 배양 및 염색은 상온에서 수행되었다. 상기 염색된 세포를 63x objective(Carl Zeiss)가 장착된 LSM710 공초점 현미경을 통해 검사하였다. 이미지는 ZEN 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하여 분석하였다.

분석 결과, 트라스투주맙에의 PE24의 접합은 PE 기반 면역 독소가 표적 세포에 작용하는 첫 번째 단계인 수용체 매개 엔도사이토시스에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 11). Trastuzumab-PE24 접합체는 트라스투주맙과 동일한 Her2-양성 MDA-MB-453 세포에만 결합하였다(도 11의 2번째 열). 37℃에서의 세포의 추가적인 배양은 트라스투주맙 및 Trastuzumab-PE24를 모두 내재화 시킨다(도 11의 3열).

실시예 9: Fc 수용체와의 상호작용에의 영향 확인

Fc 관련 수용체 결합 분석을 위해, 4μg/ml의 트라스투주맙 또는 Trastuzumab-PE24를 0.05M의 Na₂CO₃ pH 9.6에서 사용하여 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트의 웰을 코팅하였다. 코팅된 웰을 PBSB로 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. C1q 및 FcrRI-His6은 각각 Abcam 및 R&D Systems에서 구매하였다. 이전에 알려진 바와 같은 방법으로, FcRn-GST, FcrIIa(H)-GST, FcrIIa(V)-GST, FcrIIb-GST, FcrIIIa(F)-GST 및 FcrIIIa(V)-GST를 제조하였다. 웰을 PBST로 3회 세척한 후, 항-His-HRP 접합체(Sigma-Aldrich)를 FcrRI-His6의 웰에 첨가하고, 항-GST-HRP 접합체(GE Healthcare)를 FcRn-GST, FcrIIa(H)-GST, FcrIIa(V)-GST, FcrIIb-GST, FcrIIIa(F)-GST 및 FcrIIIa(V)-GST에 첨가하고, 항-C1q-HRP 접합체(Sigma-Aldrich)를 C1q에 첨가하였다. 상기 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 PBST로 3회 세척한 후, TMB 기질을 각 웰에 첨가하고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

분석 결과, Trastuzumab-PE24 접합체는 트라스투주맙과 유사하게 Fc 수용체와 상호작용하는 것으로 나타났다(도 12 및 표 5). 상기 상호작용은 혈청의 IgG 농도 및 병원균에 대한 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 따라서, 항체 단편을 가진 재조합 면역독소와 비교하여 전장 IgG에 기초한 면역독소에 추가적인 생물학적 기능을 제공할 수 있다. HC-N418C의 접합 위치는 항원 및 Fc 수용체와의 상호작용 위치로부터 떨어진 중쇄의 C-말단 근처에 위치한다. 이러한 결과는 IgG 및 PE24를 접합시키는데 사용된 접합 위치의 부위 특이적 변형 및 선택이 본래의 기능을 방해하지 않음을 나타낸다.

PRISM 소프트웨어를 이용하여 계산한 상기 ELISA의 결과(Kd 값)

	K _d ( nM )
	Trastuzumab	Trastuzumab -PE24
Her-2 antigen	0.165 ± 0.018	0.213 ± 0.041
C1q	1.445 ± 0.076	1.121 ± 0.055
FcRn (pH 6.0)	0.850 ± 0.095	0.974 ± 0.069
FcRn (pH 7.4)	171.4 ± 36.39	255.0 ± 85.33
FcrRI	0.722 ± 0.055	0.688 ± 0.057
FcrRIIa(H)	0.259 ± 0.029	0.227 ± 0.022
FcrRIIa(R)	0.630 ± 0.121	0.849 ± 0.134
FcrRIIb	2.482 ± 0.130	2.124 ± 0.149
FcrRIIIa(F)	0.913 ± 0.099	2.624 ± 0.235
FcrRIIIa(V)	0.266 ± 0.025	0.289 ± 0.024

상기 K_d는 하기 식을 이용하여 계산되었다:

Y = B_max х X/(K_d + X)

Y: 흡광도 OD450

X: antigen 또는 receptors의 농도

B_max: 포화시의 흡광도 OD450

실시예 10: ADP- ribosylation assay

PE24의 세포독성은 EF2의 ADP-ribosylation에 기초하였으며(도 13), PE24 및 Trastuzumab-PE24의 효소 활성을 비교하였다. EF2가 풍부한 밀 배아 추출물과 다양한 농도(0.01nM, 0.1nM, 1nM, 10nM 및 50nM)의 PE24 또는 Trastuzumab-PE24를 Biotinylated NAD+와 함께 배양하고, 반응 혼합물을 Western blot 방법으로 분석하였다(도 14).

결합체의 ADP-ribosylation 활성은 Zhang and Snyder의 방법에 의해 Biotinylated NAD+에서 EF-2로의 ADP-ribose의 이동을 측정함으로써 결정되었다. PE24와 면역독소를 20mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA, 1mM DTT에서 지시된 농도로 희석시키고, 37℃ 1시간 동안 50nM biotinylated NAD+의 존재 하에 밀 배아 추출물과 함께 배양하였다. 5x sodium dodecyl sulfate(SDS) gel loading buffer로 반응을 종결시켰다. 단백질은 SDS- 12%(w/v) polyacrylamide gel에서 분리된다. Biotinylated EF-2는 streptavidin-horseradish peroxidase(HRP) conjugate를 사용하여 Western blotting으로 검출하였다. ChemiDoc XRS system을 이용하여 웨스턴 블랏 이미지를 분석하였다.

Trastuzumab-PE24 접합체는 PE24와 유사한 활성을 나타냈으며(도 14); EF2의 분자량은 95 kDa이다. 이러한 결과는 Trastuzumab과의 결합이 PE24의 기능에 최소한으로 영향을 미친다는 것을 시사한다. 항원 결합(도 10) 및 EF2의 ADP-ribosylation(도 14)에 관한 결과는 본 발명에서 개발된 결합 전략이 결합된 분자, Trastuzumab 및 PE24의 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 11: 다양한 유방암 세포주에서 in vitro 세포 생존력

3개의 유방암 세포주(HCC1954, MDA-MB-453, MDA-MB-231)에서 Trastuzumab-PE24의 세포독성을 평가하였다. Cell Counting Kit-8 WST-8 assay(Dojindo Molecular Technologies Inc.,)를 사용하여 접합체의 세포독성 활성을 평가하였다. 세포독성 분석을 위해 유방암 세포주를 96-well plates에 5.0 x 10³ cells/well로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 접합체로 처리한 후 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. WST-8 분석 시약을 첨가하고 96-well plates를 37℃에서 배양하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

HCC1954 및 MDA-MB-453은 Her2/neu 양성 세포주이며, MDA-MB-231은 Her2/neu 음성 세포주이다. 각각의 유방암 세포주를 6.4pM 내지 100nM의 농도 범위의 Trastuzumab, PE24 또는 Trastuzumab-PE24 접합체로 72시간 동안 처리하고, 세포 생존력을 측정하였다. 2개의 Her2/neu 양성 세포주(HCC1954 및 MDA-MB-453)에서는 6.4pM 내지 100nM 사이에서 Trastuzumab-PE24의 세포독성이 명확하게 관찰되었으며(도 15(a) 및 도 15(b)), 이는 RG7787을 이용하여 측정된 기존에 보고된 값과 유사하다. 반면, Her2/neu 음성 세포주(MDA-MB-231)에서는 Trastuzumab-PE24에 대해 최대 100nM까지 민감도를 나타내지 않았다(도 15(c)). 이는 접합체가 Her2/neu 음성 세포 생존력에 영향을 미치지 않으며, Trastuzumab의 특이성이 접합체에서 유지되는 것을 의미한다.

실시예 12: 단백질 합성 저해 분석

PE24의 세포독성 작용 기작은 EF2의 ADP-ribosylation에 의한 단백질 합성 억제이다. Trastuzumab-PE24에 의한 단백질 합성 저해를 분석하기 위해, 합성 단백질의 메티오닌 위치에 azidohomoalanine(AHA)을 도입하고 azide와 alkyne group 사이의 orthogonal reaction을 이용하는 단백질의 태깅을 포함하는 bio-orthogonal noncanonical amino acid tagging(BONCAT) 방법을 사용하였다(Dieterich, D.C., et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006. 103(25): p. 9482-9487)(도 16).

HCC1954 및 MDA-MB-231 세포를 24-well plates에 5 x 10⁴cells/well로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 1nM 농도의 Trastuzumab, PE24 및 Trastuzumab-PE24 접합체를 37℃에서 20시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하고 methionine이 없는 RPMI 1640 배지에서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 새로 합성된 단백질을 표지하기 위해, 4mM azidohomoalanine(AHA) (click chemistry tools)와 cycloheximide (Sigma Aldrich)를 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. membrane integrity을 보호하기 위해 냉각 PBS-MC(1mM Magnesium chloride 및 0.1mM calcium chloride)에서 세포를 세척하였다. 원심분리(2000g, 4℃, 10분)에 의해 cell pellets을 수득하고, 1%(w/v) SDS in PBS를 첨가 후 vortexing하여 용해시켰다. 샘플을 95℃에서 10분간 boiling한 후 원심분리(14000RPM, 4℃, 10분)하여 상층액을 수득하였다. 단백질 합성 억제를 검출하기 위해, 암실에서 1시간 동안 click reaction을 수행하였다. Biotinylated cell lysates는 streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) conjugate를 사용하여 Western blotting으로 검출하였다. AHA가 있는 단백질은 Biotin-alkyne으로 표지되었으며, ChemiDoc XRS system을 사용하여 웨스턴 블랏 이미지를 분석하였다.

음성 대조군(도 17의 Lane 3 및 4)과 cycloheximide의 단백질 합성 저해제를 사용한 양성 대조군(도 17의 Lane 2)은 HCC1954 및 MDA-MB-231 세포주에서 기존에 보고된 바와 같은 방법으로 수행된 결과이다(Hollevoet, K., et al ., Molecular cancer therapeutics, 2014. 13(8): p. 2040-2049; Dieterich, D.C., et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006. 103(25): p. 9482-9487).

Trastuzumab-PE24 접합체는 Her2/neu 양성 세포주에서 단백질 합성을 억제하였지만(도 17 HCC1954의 Lane 5), 활성은 Her2/neu 음성 세포주에서 현저히 낮았다(도 17 MDA-MB-231의 Lane 5). 세포 생존력 데이터와 함께 고려할 때, 이러한 결과는 Trastuzumab-PE24가 단백질 합성을 억제하고 세포 사멸을 초래한다는 것을 의미한다.

실시예 13: Cetuximab -PE24 접합 및 접합체의 정제

Trastuzumab 외에도 다른 항체를 이용하여 같은 방법으로 PE24를 접합할 수 있음을 확인하기 위해, cetuximab-HC-N418를 제작하고 PE24와 접합 후 정제하였다. 상기 실시예 6에 기재된 접합 및 2-스텝 정제 방법을 사용하였다. 환원 후 산화 과정을 거쳐 cetuximab의 내제된 disulfide bond가 회복됨을 확인하였다(도 18a). PE24와 접합 후, 크기 배제 크로마토그래피를 통해 15 내지 19 분획의 접합체만을 정제하였고(도 18b), 이를 다시 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하여 접합된 PE24의 수에 따라 분리 정제하였다(도 18c). Cetuximab 항체를 이용하였을 때에도 trastuzumab과 마찬가지로, 단일 PE24가 접합된 6 내지 16 분획의 접합체를 정제할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel Method for Preparing Immunotoxin <130> P19-B169 <150> KR 10-2018-0107079 <151> 2018-09-07 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer A-f <400> 1 gataggcacc tattggtctt actgacatcc 30 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B-r <400> 2 gggaagcaat agcatgatac aaagg 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1-f <400> 3 tggcagcagg ggtgcgtctt ctcatgc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1-r <400> 4 gcatgagaag acgcacccct gctgcca 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2-f <400> 5 agcaggtggc agtgcgggaa cgtcttc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2-r <400> 6 gaagacgttc ccgcactgcc acctgct 27 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3-f <400> 7 tgggcagccg gagtgcaact acaagacca 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3-r <400> 8 tggtcttgta gttgcactcc ggctgccca 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4-f <400> 9 tcacaagccc agctgcacca aggtggaca 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4-r <400> 10 tgtccacctt ggtgcagctg ggcttgtga 29 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5-f <400> 11 acagtcctca tgcctctact ccc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5-r <400> 12 gggagtagag gcatgaggac tgt 23 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6-f <400> 13 gcctgcgaag tctgccatca gggcctg 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6-r <400> 14 caggccctga tggcagactt cgcaggc 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7-f <400> 15 gaagtcaccc attgcggcct gagctcg 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA 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Leu Phe Pro 115 120 125 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 130 135 140 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 165 170 175 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 180 185 190 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 195 200 205 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 210 215 220 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 245 250 255 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 260 265 270 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 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40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain-constant region <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 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Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

다음 단계를 포함하는 면역독소(immunotoxin)의 제조방법:
(a) 아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체를 환원 및 재산화시킨 후 링커(linker)와 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24를 접합시켜 면역독소를 생성하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 링커가 결합된 면역글로불린 변이체와 비천연 아미노산이 도입된 단백질 PE24가 클릭 반응(Click reaction)에 의해 위치-특이적(site-specific)으로 결합되는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 변이체는 전장(full-length) 단일클론 IgG인 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 변이체는 서열번호 18로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 273번째, 303번째, 305번째 아미노산; 서열번호 22로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 272번째, 302번째, 304번째 아미노산; 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 불변영역 아미노산 서열의 91번째, 93번째 아미노산;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 치환은 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 환원은 트리스(2-카복시에틸)포스핀(Tris(2-carboxyethyl)phosphine; TCEP)을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 재산화는 디하이드로아스코르빈산(Dehydroascorbic acid; dhAA)을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 링커는 말레이미드(maleimide)-PEG-DBCO 링커인 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 PE24는 탈면역화된(deimmunized) 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A인 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 PE24는 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A에서 도메인 Ⅰa가 결실되고, 퓨린 절단 부위(furin-cleavable motif)를 제외한 도메인 Ⅱ가 결실되며, 7개의 돌연변이(R427A, R456A, D463A, R467A, R490A, R505A 및 R538A)를 포함하는 독소의 도메인 Ⅲ를 포함하고, 추가로 His 6 tags 및 트롬빈(Thrombin) 절단 부위가 도입된 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 파라아지도페닐알라닌(p-azidophenylalanine)인 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 면역글로불린은 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 세툭시맙(Cetuximab)인 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
아미노산 잔기 일부가 시스테인으로 치환된 면역글로불린(immunoglobulin) 변이체가 링커를 매개로 비천연 아미노산(unnatural amino acid)이 도입된 단백질 PE24과 접합되어 있는 면역독소(immunotoxin).
제14항에 있어서, 상기 면역글로불린 변이체는 서열번호 18로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 273번째, 303번째, 305번째 아미노산; 서열번호 22로 표시되는 중쇄 불변영역 아미노산 서열의 61번째, 91번째, 272번째, 302번째, 304번째 아미노산; 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 불변영역 아미노산 서열의 91번째, 93번째 아미노산;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 하는 면역독소.
제14항에 있어서, 상기 링커는 말레이미드(maleimide)-PEG-DBCO 링커인 것을 특징으로 하는 면역독소.
제14항에 있어서, 상기 PE24는 탈면역화된(deimmunized) 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A인 것을 특징으로 하는 면역독소.
제17항에 있어서, 상기 PE24는 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin) A에서 도메인 Ⅰa가 결실되고, 퓨린 절단 부위(furin-cleavable motif)를 제외한 도메인 Ⅱ가 결실되며, 7개의 돌연변이(R427A, R456A, D463A, R467A, R490A, R505A 및 R538A)를 포함하는 독소의 도메인 Ⅲ를 포함하고, 추가로 His 6 tags 및 트롬빈(Thrombin) 절단 부위가 도입된 것을 특징으로 하는 면역독소.
제14항에 있어서, 상기 면역글로불린은 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 세툭시맙(Cetuximab)인 것을 특징으로 하는 면역독소.
제14항 내지 제19항에 따른 면역독소를 포함하는 암 치료용 조성물.
제20항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 비소세포폐암 또는 두경부암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.