KR20200018795A - 쇼그렌 증후군 진단을 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ATG5와 LC3B-II를 바이오마커로 이용하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안 진단용 조성물, 이의 진단 방법 및 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 ATG5와 LC3B-II를 바이오마커로 이용 시, 건성안에서 비-쇼그렌 증후군을 제외한 쇼그렌 증후군만을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하여, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

쇼그렌 증후군 진단을 위한 조성물{COMPOSITION FOR DIAGNOSIS OF SJOGREN'S SYNDROME}
본 발명은 바이오마커를 이용하여 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안을 진단하는 진단용 조성물, 키트, 진단 방법 및 스크리닝 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오마커로서 ATG5 또는 LC3B-II를 이용하여, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안만을 효과적으로 진단할 수 있다.
쇼그렌 증후군은 외분비선의 전신성 자가면역 질환으로서, 일차 질병으로서 또는 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경피증 및 다발성 근염과 같은 널리 알려진 다른 자가면역 질환에 대한 이차 질병으로서 존재할 수 있다. 이는 건성안 뿐만 아니라 구갈을 야기하는 외분비선 및 점막 상피의 림프구성 침윤을 특징으로 한다. 쇼그렌 증후군의 병리 메커니즘은 비-쇼그렌 증후군 건성안에 비해 심각한 건성안 징후를 이끌어낸다.
구체적으로, 건성안(dry eye syndrome)은 안구 표면에 잠재적인 손상을 줄 수 있는 불편함, 시각 방해 및 눈물막 불안정 증상을 야기하는 눈물 및 안구 표면의 다인자성 질환이다. 이는 눈물막의 증가된 삼투압몰농도 및 안구 표면의 염증을 수반한다. 상기 건성안의 원인은 일반적인 건성안 즉, 비-쇼그렌 증후군과 쇼그렌 증후군으로 나뉠 수 있으며, 비-쇼그렌 증후군의 경우 눈물샘질환과 눈물관의 폐쇄, 반사눈물의 감소를 일으키는 질환을 포함한다.
이의 공통점은 눈을 보호하는 "기초 눈물(basal tear)"이 부족하다는 것이 특징이다. 상기 비-쇼그렌 증후군은 눈이 건조한 경우나(basal tear의 부족) 외부 환경에 의해 눈이 자극되어 "반사 눈물(reflex tear)"이 발생하여 눈을 보호한다. 즉, "기초 눈물(basal tear)"이 부족하지만, 이로 인한 안구 손상의 발생 시 "반사 눈물(reflex tear)"이 보충 역할을 하게 된다. 반면, 쇼그렌 증후군의 경우, 각막의 "기초 눈물(basal tear)"이 부족할뿐더러, 외부 환경에 의해 눈이 자극되어도 "반사 눈물(reflex tear)" 또한 분비되지 않아, 비-쇼그렌 증후군보다 안구 표면의 손상이 매우 심하게 발생한다.
최근 연구에서는 향상된 자가소화작용 및 세포자멸이 침샘의 분비 상피 세포에서 Ro/SAA 및 La/SSB 재분배와 관련됨이 보고되었다. 세포 수준에서, 자가항체의 국소 생산 및 분비 후 세포 표면으로 자가항원의 재국소화가 뒤따르게 된다. 자가소화작용은 세포질 성분 및 세포소기관의 분해 및 재사용을 통해 세포 항상성을 유지하는 리소좀-매개 이화 작용이다. 세포 스트레스에 대한 반응에서의 전통적인 이의 역할 이외에, 자가소화작용은 자가면역 질환의 발병과 연관되어 있다. 면역계에서, 자가소화작용은 항원 흡수 및 제시, 병원균의 제거, 단기- 및 장기-생존 면역 세포의 생존 및 사이토카인-의존 염증과 같은 공정을 조절한다. 최근 연구는 자가소화작용-관련 유전자에서의 다형성이 전신성 홍반성 루푸스 및 크론병에 대한 민감성에 연관되어 있음을 보였다.
이에 본 발명자는 건성안에서 비-쇼그렌 증후군과 쇼그렌 증후군을 정확하게 진단하기 위하여 연구한 결과, 자가소화작용 마커로서 사용되었던 ATG5와 LC3B-II를 바이오마커로 이용 시, 건성안에서 비-쇼그렌 증후군을 제외한 쇼그렌 증후군만을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
1. Han JW, Zheng HF, Cui Y, et al. Genome-wide association study in a Chinese Han population identifies nine new susceptibility loci for systemic lupus erythematosus. Nature genetics 2009;41:1234-7. 2. Scharl M, Wojtal KA, Becker HM, et al. Protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 2 regulates autophagosome formation in human intestinal cells. Inflammatory bowel diseases 2012;18:1287-302.
본 발명은 ATG5 또는 LC3B-II를 바이오마커로 사용하여 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안을 효과적으로 진단하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료로부터 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득한 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질이 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 상기 유전자의 발현 수준을 감소시킨 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 자가소화작용이 쇼그렌 증후군의 증상 중 하나인 건성안의 발병에 연루됨을 최초로 규명하고, 이에 따라 자가소화작용 마커로서 사용되었던 ATG5와 LC3B-II의 쇼그렌 증후군의 진단을 위한 바이오마커 용도를 제공할 수 있다. 본 발명은 눈물, 결막 상피 세포 등과 같이 비교적 입수하기 쉬운 생물학적 시료로부터 용이하면서도, 건성안에서 비-쇼그렌 증후군 건성안을 제외한 쇼그렌 증후군 건성안을 효과적으로 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서의 피검자의 수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 눈물에서의 ATG5 단백질 발현과 LC3B-II/I의 전환 비율을 나타낸 (a) 웨스턴 블롯 결과 및 (b) 상대적인 농도측정 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 결막 상피 세포에서의 ATG5 및 LC3B-II mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 ATG5 및 LC3B-II 면역염색된 결막의 공조첨 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 쇼그렌 증후군 동물 모델 (a) NOD/LtJ 및 (b) IκB-ζ 결핍 마우스의 눈물샘에서의 ATG5 및 LC3B-II의 면역형광 염색 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 코르티코스테로이드 치료 전후의 눈물의 ATG5 및 LC3B-II 단백질 발현을 나타낸 (a) 웨스턴 블롯 결과 및 (b) 상대적인 농도측정 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 코르티코스테로이드 치료 전후의 결막 상피 세포에서의 ATG5 및 LC3B-II mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서 코르티코스테로이드 치료 전후의 결막의 ATG5 및 LC3B-II 면역염색 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서 ATG5에 대한 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경 또는 변형되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 ATG5(Autophagy related gene 5)는 자가소화작용 막의 성숙을 위해 필요한 자가소화작용 단백질로, ATG12와 접합을 형성한다.
본 발명에서 용어 LC3B-II은 LC3-포스파티딜에탄올아민 접합체로서, 초기 LC3의 사이토솔 형태인 LC3-I이 유비퀴틴화-유사 효소 작용을 통해 포스파티딜에탄올아민과 접합하여 LC3-II을 형성하며, 자가포식소체 멤버를 소집하는 역할을 한다.
본 발명에서 용어 자가소화작용은 자가소화작용은 세포질 성분 및 세포소기관의 분해 및 재사용을 통해 세포 항상성을 유지하는 리소좀-매개 이화 작용을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안 진단 시, 컷-오프(cut-off)값이 4.002023 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 비-쇼그렌 증후군 건성안과 쇼그렌 증후군 건성안 환자의 눈물에서 추출한 단백질내 자가소화작용 마커의 ROC 곡선 분석한 결과, AUC는 0.98이고, 컷-오프(cut-off)값은 4.002023임을 확인하여, ATG5는 건성안의 원인이 되는 비-쇼그렌 증후군을 제외한 쇼그렌 증후군의 진단을 위한 바이오 마커로서 매우 유용함을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, ATG5 또는 LC3B-II에 특이적인 항체, 프라이머, 프로브 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 전사하는 mRNA 또는 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 코딩하는 단백질의 양을 측정하거나 LC3B-II/LC3B-I 전환 비율을 측정하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득할 수 있는 생물학적 시료에서 측정할 수 있으며, 예를 들어 눈물, 결막 상피 세포, 눈물샘 시료, 타액 또는 침샘 상피 세포에서 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다. 또한, *?**?*본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 건성안에서 비-쇼그렌 증후군 건성안을 제외한 쇼그렌 증후군 건성안만을 진단하는 것으로, 생물학적 시료에서 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준이 증가하는 바, 이를 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안 진단에 활용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 유전자는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커"란 진단하고자 하는 질환을 갖는 피검자의 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 판정할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 질환을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명에서 사용한 "ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질"이란 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 확인함으로써 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 mRNA 양 또는 단백질 수준 또는 LC3B-II/I 전환 비율을 검출할 수 있는 물질 또는 분자를 의미하고, 예를 들어 ATG5 또는 LC3B-II에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용해 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부 및 그 수준의 측정을 통해 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자 발현 정도를 판별할 수 있다. 상기 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 *?**?*키트*?**?*는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트는 항체 생산 세포주의 선별에 필요한 모든 생물학적 또는 화학적 시약, PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소, 안내서를 포함할 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료로부터 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 전사하는 mRNA 또는 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 코딩하는 단백질의 양을 측정하거나 LC3B-II/LC3B-I 전환 비율을 측정하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득할 수 있는 생물학적 시료라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 눈물, 결막 상피 세포, 눈물샘 시료, 타액 또는 침샘 상피 세포에서 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득한 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질이 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 상기 유전자의 발현 수준을 감소시킨 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설 명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
본 실시예의 전향적 단면 대조-조절 연구는 가톨릭대 서울 성모 병원의 안과에서 구성하였다. 이 연구 프로토콜은 헬싱키 선언의 가이드라인에 따라 결정되었으며 서울 성모 병원 생명 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 모든 피검자로부터 동의를 받아 시료를 수득하였다.
모든 기술된 데이터는 평균 및 SD로 나타냈다. 데이터는 SPSS software (version 15.0, SPSS Inc, Chicago, IL) 및 GraphPadPrism(version5.0,GraphPadInc.LaJolla,CA)로 분석하였다. Shapiro-Wilk 테스트는 데이터의 정상 상태를 평가하기 위해 사용하였다. 그룹은 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 T-test로 비교하였다. 자가소화작용 마커의 발현 수준 및 임상 변수 사이의 관계를 평가하기 위해 자가소화작용 마커 및 임상 파라미터 사이의 Pearson 상관 계수를 계산하였다. Two-sided p 수치 < 0.05는 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
실시예 1. 임상 평가
피검자 선별
본 실시예에서는 82명의 여성 피검자를 대상으로 하였다(도 1): 40명의 쇼그렌 증후군 건성안(SS DE) 환자 (78개 안구), 24명의 비- 쇼그렌 증후군 건성안(non-SS DE) 환자 (48개 안구), 및 대조군으로 16명의 정상적인 건강한 피검자 (25개 안구). 40명의 쇼그렌 증후군 건성안 환자 중 16명은 국소 코르티코스테로이드 치료(1달 동안 매일 4회, 플루오로메토론 0.1%, Sam-Il Pharmaceutics Co. Seoul, Korea)를 받았다. 모든 건성안 환자는 International Dry Eye WorkShop (DEWS) severity grading scheme에 의해 분류되는 기준에 의해 2등급 이상의 심각도를 가졌다. 모든 쇼그렌 증후군 건성안 환자는 2012 Sjogren's International Collaborative Clinical Alliance (SICCA) classification criteria에 따라 루마티스 전문의에 의해 일차 쇼그렌 증후군으로 진단되었다. disease-modifying 치료를 받았던 쇼그렌 증후군 환자 또는 피검자는 연구에서 제외하였다. 쇼그렌 증후군에서 발견되는 독특한 여성과 남성의 유병률(F:M = 9:1) 때문에, 데이터의 오역을 방지하기 위해 여성 환자만을 대상으로 하였다. 배제 기준은 임산부 또는 간호직, 콘텍트렌즈 착용자, 눈물점폐쇄 환자, 6개월 이내에 안과 수술을 받은 사람, 건성안 이외에 급성 또는 만성 안구 질환을 가진 사람, 수반 알러지, 눈꺼풀 이상, 및 2등급 이상의 마이봄성 기능장애를 갖는 사람이다. 피검자 또한 지난 3달 이내에 인공 눈물 이외에 전신 치료를 받거나 다른 국소 치료를 받은 사람을 제외하였다.
임상 평가
상기 82명의 피검자에게 하기 안구 표면 검사를 실시하였다; 쉬르머 I 테스트, TBUT(tear film breakup time), OSS(ocular surface 염색) 스코어 및 OSDI(ocular surface disease index) 설문.
쉬르머 I 테스트는 눈에 약물을 주입시키기 전에 마취 없이 실시하였다. 표준 쉬르머 스트립을 아래눈꺼풀의 측면 1/3 부분에 위치시키고, 5분 후 스트립의 젖은 정도를 각 스트립(Eagle Vision, Memphis, TN)의 밀리미터 눈금으로 측정하였다. 눈물 스트립을 가로로 컷팅하고 cryovial 안에 넣어 추가 분석을 위해 냉동하여 보관하였다. TBUT을 평가하기 위해, 무방부제 식염수 한 방울을 플루오레세인 스트립(Haag-Streit, Koeniz, Switzerland)에 추가하고, 아래 눈꺼풀 결막에 적용시켰다. 환자에게 몇 초간 3~4회 깜박거리게 하여 염료와 충분히 혼합되게 한 후, 코발트 블루 광을 갖는 세극등을 사용하여 검사하였다. 염색된 눈물막에 결점이 나타날 때까지의 시간을 측정하고 이를 TBUT로서 기록하였다. TBUT를 3회 측정하고 스코어를 평균냈다. 각각 결막 및 각막 염색 스코어를 포함하는 OSS 스코어를 SICCA registry ocular examination protocol에 따라 평가하였다. 우선, 2% 멸균 플루오레세인 한 방울을 결막낭에 떨어뜨려 스며들게 하고 1분 후에 세극등 코발트 블루 필터를 사용해 플루오레세인 염색을 평가하여 각막 염색 스코어를 평가하였다. 플루오레세인으로 염색되는 각막 점상 상피 미란(punctate epithelial erosions, PEE)을 계수하고 스코어를 냈다. PEE가 없는 경우, 스코어는 0이다. 1-5개 PEE가 보일 경우, 각막 스코어는 1이고; 6-30개 PEE가 보일 경우 스코어는 2이고; 30개 초과 PEE가 보일 경우 스코어는 3이다. 하나 이상의 융합된 염색 부분들이 있거나 각막의 동공 부위에 염색이 되거나 각막 상의 어느 부분이던지 하나 이상의 필라멘트가 있는 경우 추가 포인트를 더했다. 각 각막에 대해 가능한 최대 스코어는 6이다. 결막 염색 스코어를 측정하기 위해, 플루오레세인을 무방부제 식염수로 세척한 후 양쪽 눈의 하부 결막 원개에 1% 리사민 그린 염료(Leiter's Pharmacy San Jose, CA) 1방울을 떨어뜨려 적용하였다. 몇 차례 깜박거린 후, 결막 염색 스코어를 비측 및 이측 구결막에서 각각 평가하였다; 스코어 0은 0 내지 9개의 리사민 그린 염색 점들로 규정되고; 스코어 1은 10 내지 32개 점의 존재로 규정되며; 스코어 2는 33 내지 100개 점이고; 스코어 3은 100개 초과의 점이다. 결막(비측과 이측 구결막 합산)에서 가능한 최대 스코어는 6이다. 각 눈에 대한 전체 OSS 스코어는 각막에 대한 플루오레세인 스코어와 비측 및 이측 구결막에 대한 리사민 그린 스코어의 합이다. 그러므로, 각 눈에 대하여 가능한 최대 스코어는 12이다.
82명의 피검자의 임상 평가 결과를 표 1에 나타냈다. 비-쇼그렌 증후군 건성안 환자에 비해 쇼그렌 증후군 건성안 환자에서 쉬르머 I 수치 및 TBUT는 상당히 더 낮았으며, 결막 염색 스코어 및 OSS는 상당히 더 높았다. 쇼그렌 증후군 건성안 및 비-쇼그렌 증후군 건성안 환자 중에서 연령, OSDI, 및 각막 염색 스코어에서의 유의차는 없었다(각각 P = 0.3602, 0.0938, 0.0579).
Figure pat00001
실시예 2. 눈물 및 결막 상피 세포에서의 자가소화작용 마커 발현
눈물 수집 및 웨스턴 블롯 분석
실시예 1에서와 같이 누액(tear fluid)을 흡수한 쉬르머 스트립으로부터 눈물을 수집하였다. 눈물의 추출을 위해, 쉬르머 스트립을 각각 추출 버퍼(NaCl 0.5 M, Tween20 0.5% in PBS)가 들어 있는 튜브에 넣었다. 1시간 후, 캐뉼라로 바닥에 뚫린 0.5 ml 튜브로 스트립을 옮겼다. 이 튜브를 더 큰(1.5 ml) 튜브에 집어 넣고 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 원심력에 의해 스트립으로부터 루액이 끌어당겨져 작은 튜브 바닥의 중앙 구멍을 통해 외부의 1.5 ml 튜브로 모아졌다. 루액을 시료-로딩 버퍼와 혼합하고 10분간 가열한 후 원심분리하고 투명한 분리물에서의 단백질 농도를 BCA 단백질 Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 이용하여 결정하였다. 동량의 단백질을 환원 조건 하에서 15% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA)으로 전기-이동시켰다. PVDF 막을 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 내의 5% 스킴밀크로 차단하고, 일차 토끼 폴리클로날 Ab 표적 LC3B-I 및 II(Cell Signaling Technology, Boston, MA) 또는 ATG5(Novus Biologicals, Littleton, CO)와 함께 4℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, 막을 항-토끼 호스래디쉬 퍼옥사다아제-접합 이차 Ab(Thermo Fisher Scientific)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 막을 3회 세척하고 단백질 밴드를 개선된 화학발광 시약(ECL; Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하여 검출하였다. 모든 막을 분해하고 마우스 모노클로날 항-β-액틴 Ab(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)로 재프로브화하여 표준화 참조를 제공하였다. 각 실험은 이미지 분석에 의해 발현의 상대적 수준을 표준화하기 위해 사용되는 β-액틴에 대한 착색제를 포함한다. 실험은 4-6회 실시하였다.
IC(Impression Cytology)
폴리에테르술폰 필터(Suopor 200 membrane, Pall Corporation, Port Washington, NY)를 사용하여 마지막 염색 점안액이 스며든 후 15분째에 IC를 실시하였다. 필터 페이퍼를 반으로 잘라(13 x 6.5 mm) 각 면을 상부-이측 및 상부-비 비 구결막에 흡착시켰다. 상부-이측 결막으로부터의 필터를 면역 염색을 위해 0.05% 파라포름알데히드(PFA)와 함께 2 ml PBS를 담고 있는 튜브 내로 옮기고, 상부-비측 결막으로부터의 페이퍼는 RNA 추출을 위해 3시간 내로 필터 페이퍼로부터 수집되었다.
면역형광 염색
분리된 상피 세포를 갖는 IC 필터 페이퍼를 실란 코팅 슬라이드(Muto Pure Chemicals co.,ltd. Tokyo, Japan)에 대고 확실히 눌러서 상피 세포를 슬라이드로 옮기고 이를 Baudouins protocol에 따라 면역형광 염색에 사용하였다. 세포를 냉 메탄올로 고정시키고, 0.1 % Triton X-100로 투과시키고, 10% 염소 혈청과 함께 1시간 동안 인큐베이션하여 비특이 반응을 차단하였다. 그런 다음 세포를 항-LC3B-I, II 또는 ATG5 항체와 함께 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척한 후 Alexa Flour 488접합 항-토끼 IgG Ab와 함께 인큐베이션하였다. 착색을 공초점 현미경 (LSM 510 Meta (Carl Zeiss Meditec Inc. Dublin, CA)으로 캡쳐하고 포토샵(Adobe systems, Santa Clara, CA)으로 옮겼다.
RNA 분리 및 실시간 PCR
변경된 프로토콜(Barabino S et al., Immune response in the conjunctival epithelium of patients with dry eye. Experimental eye research 2010;91:524-9)에 따라 TRIzol 시약(Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 IC로부터 RNA를 분리하였다. 상보적 DNA(cDNA)의 1차 가닥을 SuperScript IIITMreversetranscriptase(Invitrogen)를 사용하여 무작위 헥사머로 합성하였다. SYBR Green I 실시간 PCR 방법을 사용하였으며 반응에 따른 진실성(integrity) 및 총 RNA의 양을 교정하기 위해 GAPDH에 대한 평균 Ct(threshold cycle) 수치를 내부 측정에 사용하였다. 상대 정량을 위해 2ΔΔCt방법을 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 프라이머는 LC3B-II (Forward: 5-CTT TGG GTG CGA CTT GAC G-3, Reverse: 5-GTC GAC CCC GCT CCT TTT-3), ATG5 (Forward: 5-AGG AGA GCC TGT ACC TAT GGA-3, Reverse: 5-TTC TCT GTT GCG CTT TTC TGA-3)이다.
눈물의 웨스턴 블롯 분석은 비-쇼그렌 증후군 건성안 및 대조군에 비해 쇼그렌 증후군 건성안에서의 ATG5 단백질 및 LC3BII/I 전환 비율이 통계학적으로 유의미하게 증가함을 나타냈다. 상대적인 농도 측정 결과는 눈물에서의 ATG5 단백질 (vs β-액틴) 및 LC3B-II/I 단백질 비율이 비-쇼그렌 증후군 건성안(1.44 ± 0.46 및 1.67 ± 0.40) 및 대조군(1.00 ± 0.35 및 1.00 ± 0.35) (P <0.05)에 비해 쇼그렌 증후군 건성안(5.06 ± 1.31 및 3.37 ± 1.08)에서 더 높음을 보였다(도 2)
결막 IC 표본으로부터, 결막에서 ATG5 및 LC3B-II를 코딩하는 mRNA 수준 또한 비-쇼그렌 증후군 건성안(0.80 ± 0.17 및 2.21 ± 0.61 배수 변화) 및 대조군(1.00 ± 0.25 및 1.00 ± 0.24 배수 변화)에 비해 쇼그렌 증후군 건성안(8.15 ± 1.38 및 6.14 ± 1.51 배수 변화)에서 상향조절되었다(도 3, 모두 P < 0.05). 비-쇼그렌 증후군 건성안 및 대조군 사이의 눈물 및 결막 IC 표본으로부터의 자가소화작용 마커 발현에서 유의차는 없었다. 결막 IC 표본의 면역형광 염색은 자가소화작용을 나타내는 ATG5의 점상 세포질 염색 패턴이 쇼그렌 증후군 건성안에서 관찰되는 반면, ATG5는 비-쇼그렌 증후군 건성안 및 대조군에서는 확산되어 염색됨을 확인시켰다(도 4). 또한 LC3B-II 단백질의 점상 염색 초점은 비-쇼그렌 증후군 건성안 및 대조군과 달리 쇼그렌 증후군 건성안에서 현저하게 증가하였다(도 4). 종합적으로, 자가소화작용 마커 발현은 쇼그렌 증후군 건성안 환자의 눈물 및 결막에서 상향조절되며, 이는 자가소화작용의 쇼그렌 증후군 건성안의 발병에 관련됨을 제안하는 것이다.
실시예 3. 동물 모델의 눈물샘에서의 자가소화작용 마커 발현
동물 모델
인간 눈물샘 생체 검사가 상대적으로 침습성 과정이기 때문에 쇼그렌 증후군 동물 모델의 눈물샘을 연구하였다. 눈물샘에서의 ATG5 및 LC3B-II 단백질의 발현을 쇼그렌 증후군 건성안 유사 특징을 나타내는 것으로 알려진 NOD/LtJ 마우스 및 IκB-ζ KO 마우스의 면역염색 분석을 통해 평가하였다. NOD/LtJ 마우스 및 IκB-ζ KO 마우스의 눈물샘의 파라핀 섹션을 가톨릭대학교(대한민국 서울) 조미라 교수 및 울산대 아산 서울병원(대한미국 서울) 권미나 교수에게 제공받았다. NOD/LtJ 마우스는 Charles River Laboratory (Wilmington, MA)로부터 구입하였으며 IκB-ζ KO 마우스는 오사카 대학의 Shizuo Akira 교수(일본 오사카)에게 제공받았다. 8 주 및 16주령 NOD/LtJ 마우스 및 5주령 IκB-ζ 마우스 (-/-, +/-)로부터 눈물샘을 제거하였다. 동물 실험의 모든 공정은 Ophthalmic and Vision Research의 Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals의 기준에 따라 실시하였다. 동물 모델의 눈물샘에서의 ATG5 및 LC3B-II의 단백질 양 및 mRNA 발현은 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석 및 실시간 PCR 방법을 통해 실시하였다
NOD/LtJ 마우스의 눈물샘에서, ATG5 및 LC3B-II 단백질의 점상 세포질 염색 패턴이 8주령에서 관찰되었으며 16주령 재태 기간에 우세하게 발달하였다(도 5A). 5주령 IκB-ζ KO 마우스 또한 증가된 백그라운드 강도를 갖는 ATG5의 별개의 점들을 보였으며, 대조 마우스(IκB-ζ +/-)에 비해 선포 세포 전체에 LC3B-II의 두드러진 반점들을 보였다(도 5B). 이러한 발견들로부터, 자가소화작용이 쇼그렌 증후군 건성안 환자의 눈물샘에서 유도될 수 있음을 추측하였다.
실시예 4. 쇼그렌 증후군 건성안에서 자가소화작용 마커 및 임상 파라미터 사이의 상관관계
자가소화작용 마커가 비-쇼그렌 증후군 건성안이 아니라 쇼그렌 증후군 건성안에서 상당히 상향조절되므로, 쇼그렌 증후군 건성안에서 자가소화작용 마커와 임상 파라미터 사이의 상관관계를 조사하였다(표 2). LC3B-II/I 단백질 비율이 자가소화작용 마커를 나타내며 두 마커 모두가 쇼그렌 증후군 건성안에서 증가하므로, 쇼그렌 증후군 건성안에서 눈물에서의 LC3B-II/I 단백질 비율 및ATG5 단백질 발현과 결막 상피에서의 LC3B-II 및 ATG5 유전자 코딩 수준과 임상 파라터와의 상관관계를 조사하였다. ATG5 발현은 쇼그렌 증후군 건성안에서 각막 염색, 결막 염색, 및 OSS 스코어와 강한 연관성을 가지며, 이는 쇼그렌 증후군 건성안에서의 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure pat00002
실시예 5. 쇼그렌 증후군 건성안 환자에서 임상 지표 및 자가소화작용 마커의 수준에서의 국소 코르티코스테로이드 치료의 효과
쇼그렌 증후군 건성안 환자에게 국소 코르티코스테로이드를 적용한 후, 자가소화작용 마커 발현뿐만 아니라 임상 지표에서의 변화를 평가하였다. 인공 눈물과 함께 1달-국소 코르티코스테로이드 치료한 후, 실시예 1에서와 같이 OSDI 스코어, 쉬르머 I 수치, TBUT, 각막 염색, 결막 염색, 및 OSS 스코어를 측정하였다. 또한, 실시예 2 및 3에서와 같이 웨스턴 블롯 및 실시간 PCR을 실시하였다.
코르티코스테로이드 치료 후 쇼그렌 증후군 건성안에서 OSDI 스코어 감소, 쉬르머 I 수치 증가, TBUT 증가, 각막 염색 점수 스코어 감소, 결막 염색 스코어 감소, 및 OSS 스코어를 감소시켜서 임상 지표의 향상을 보여주었다(표 3).
Figure pat00003
임상 개선에 따라, 대표적인 웨스턴 블롯 이미지는 코르티코스테로이드 치료 후 LC3B-II/I 단백질 전환 및 ATG5 단백질 발현의 감소를 증명한다(도 6). 상대적인 농도 측정 결과는 눈물에서의 ATG5 단백질 (vs β-액틴) 및 LC3B-II/I 단백질 비율이 코르티코스테로이드 처리 전 수준 (5.06 ± 0.31 및 1.87 ± 0.10)에 비해 각각 대략 0.88 ± 0.07 및 1.27 ± 0.08 배수 변화로 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 6). ATG5 및 LC3B-II의 유전자 코딩 수준은 코르티코스테로이드 처리 전 수준(13.16 ± 4.36 및 12.93 ± 4.44 배수 변화)에 비해 각각 대략 1.23 ± 0.27 및 2.57 ± 0.48 배수 변화로 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 7). 게다가, 대표적인 면역염색 이미지는 결막에서의 자가소화작용 마커의 점상 염색 패턴 또한 코르티코스테로이드 처리 후 쇼그렌 증후군 건성안에서 정상화되었음을 입증하였다(도 8).
실시예 6. 비-쇼그렌 증후군 건성안과 쇼그렌 증후군 건성안 환자의 눈물에서 추출한 단백질내 자가소화작용 마커의 ROC 곡선 분석 및 컷-오프(cut-off)값 도출
비-쇼그렌 증후군 건성안 환자에서 얻은 눈물과 쇼그렌 증후군 건성안 환자의 눈물에서 추출한 단백질에서 ATG5 마커가 비-쇼그렌 증후군을 제외하고 쇼그렌 증후군을 효과적으로 진단하기 위한 진단용 바이오마커로서 사용할 수 있는지를 검증하기 위하여, ROC 곡선 분석 및 컷-오프(cut-off)값을 도출하였다. 구체적으로, 비-쇼그렌 증후군 건성안 31명의 환자를 대조군으로 0으로 입력하고, 쇼그렌 증후군 건성안 환자 55명을 1로 입력한 뒤 각 ATG5 단백질의 반응율을 구하였다. 그 후, 민감도 및 특이도의 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)값을 구하면서 컷-오프(cut-off) 값을 조절하면서 ROC 곡선을 나타낸 결과, ROC curve 의 아랫부분의 면적, 즉 AUC(area under curve)를 구하였다. 하기 표 4, 5 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 컷-오프 값이 4.002일 때, 민감도는 94.6이고, 특이도는 93.6임을 확인하였다. 또한, AUC는 0.98임을 확인하여 0.90 이상 1.00 내에 포함되어 매우 유용함을 확인하였다. 따라서, 자가소화작용 마커 ATG5는 건성안의 원인이 되는 비-쇼그렌 증후군 건성안을 제외한 쇼그렌 증후군 건성안의 진단을 위한 바이오 마커로서 매우 유용함을 확인하였다.
　 Sensitivity Specificity
≥0.3014 100.0(93.5-100.0) 0.0(0.0-11.2)
>0.3014 100.0(93.5-100.0) 3.2(0.08-16.7)
>0.6552 100.0(93.5-100.0) 6.5(0.8-21.4)
>0.7912 100.0(93.5-100.0) 9.7(2.0-25.8)
>0.8117 100.0(93.5-100.0) 12.9(3.6-29.8)
>1.0212 100.0(93.5-100.0) 16.1(5.5-33.7)
>1.2195 100.0(93.5-100.0) 19.4(7.5-37.5)
>1.404 100.0(93.5-100.0) 22.6(9.6-41.1)
>1.5442 100.0(93.5-100.0) 25.8(11.9-44.6)
>1.6213 100.0(93.5-100.0) 29.0(14.2-48.0)
>1.662 100.0(93.5-100.0) 32.3(16.7-51.4)
>1.8111 100.0(93.5-100.0) 35.5(19.2-54.6)
>2.0261 100.0(93.5-100.0) 38.7(21.8-57.8)
>2.0955 100.0(93.5-100.0) 41.9(24.5-60.9)
>2.2473 100.0(93.5-100.0) 45.2(27.3-64.0)
>2.45 100.0(93.5-100.0) 48.4(30.2-66.9)
>2.5826 100.0(93.5-100.0) 51.6(33.1-69.8)
>2.7155 100.0(93.5-100.0) 54.8(36.0-72.7)
>2.7766 100.0(93.5-100.0) 58.1(39.1-75.5)
>2.8462 100.0(93.5-100.0) 61.3(42.2-78.2)
>2.8918 100.0(93.5-100.0) 64.5(45.4-80.8)
>2.9394 100.0(93.5-100.0) 67.7(48.6-83.3)
>2.9437 100.0(93.5-100.0) 71.0(52.0-85.8)
>3.0726 100.0(93.5-100.0) 74.2(55.4-88.1)
>3.1284 100.0(93.5-100.0) 77.4(58.9-90.4)
>3.3796 100.0(93.5-100.0) 80.7(62.5-92.5)
>3.4718 98.2(90.3-100.0) 80.7(62.5-92.5)
>3.5823 98.2(90.3-100.0) 83.9(66.3-94.5)
>3.6506 96.4(87.5-99.6) 83.9(66.3-94.5)
>3.7019 94.6(84.9-98.9) 83.9(66.3-94.5)
>3.8284 94.6(84.9-98.9) 87.1(70.2-96.4)
>3.9155 94.6(84.9-98.9) 90.3(74.2-98.0)
>4.002 94.6(84.9-98.9) 93.6(78.6-99.2)
>4.0815 92.7(82.4-98.0) 93.6(78.6-99.2)
>4.4506 90.9(80.0-97.0) 93.6(78.6-99.2)
>4.5083 89.1(77.8-95.9) 93.6(78.6-99.2)
>4.5517 87.3(75.5-94.7) 93.6(78.6-99.2)
>5.0517 85.5(73.3-93.5) 93.6(78.6-99.2)
>5.1423 85.5(73.3-93.5) 96.8(83.3-99.9)
>5.1562 83.6(71.2-92.2) 96.8(83.3-99.9)
>5.327 83.6(71.2-92.2) 100.0(88.8-100.0)
>5.456 81.8(69.1-90.9) 100.0(88.8-100.0)
>5.5228 80.0(67.0-89.6) 100.0(88.8-100.0)
>6.0666 78.2(65.0-88.2) 100.0(88.8-100.0)
>6.2092 76.4(63.0-86.8) 100.0(88.8-100.0)
>6.4716 74.6(61.0-85.3) 100.0(88.8-100.0)
>6.6813 72.7(59.0-83.9) 100.0(88.8-100.0)
>6.7303 70.9(57.1-82.4) 100.0(88.8-100.0)
>7.6353 69.1(55.2-80.9) 100.0(88.8-100.0)
>7.6689 67.3(53.3-79.3) 100.0(88.8-100.0)
>7.7241 65.5(51.4-77.8) 100.0(88.8-100.0)
>7.8333 63.6(49.6-76.2) 100.0(88.8-100.0)
>7.8339 61.8(47.7-74.6) 100.0(88.8-100.0)
>8.1689 60.0(45.9-73.0) 100.0(88.8-100.0)
>8.6772 58.2(44.1-71.3) 100.0(88.8-100.0)
>8.7232 56.4(42.3-69.7) 100.0(88.8-100.0)
>9.0836 54.6(40.6-68.0) 100.0(88.8-100.0)
>9.1086 52.7(38.8-66.3) 100.0(88.8-100.0)
>9.4822 50.9(37.1-64.6) 100.0(88.8-100.0)
>9.6362 49.1(35.4-62.9) 100.0(88.8-100.0)
>9.684 47.3(33.7-61.2) 100.0(88.8-100.0)
>10.0798 45.5(32.0-59.4) 100.0(88.8-100.0)
>10.3296 43.6(30.3-57.7) 100.0(88.8-100.0)
>10.4174 41.8(28.7-55.9) 100.0(88.8-100.0)
>10.563 40.0(27.0-54.1) 100.0(88.8-100.0)
>10.9716 38.2(25.4-52.3) 100.0(88.8-100.0)
>11.0733 36.4(23.8-50.4) 100.0(88.8-100.0)
>12.1292 34.6(22.2-48.6) 100.0(88.8-100.0)
>12.5415 32.7(20.7-46.7) 100.0(88.8-100.0)
>13.5315 30.9(19.1-44.8) 100.0(88.8-100.0)
>13.5537 29.1(17.6-42.9) 100.0(88.8-100.0)
>14.0947 27.3(16.1-41.0) 100.0(88.8-100.0)
>14.9991 25.5(14.7-39.0) 100.0(88.8-100.0)
>15.2186 23.6(13.2-37.0) 100.0(88.8-100.0)
>15.5085 21.8(11.8-35.0) 100.0(88.8-100.0)
>16.1146 20.0(10.4-33.0) 100.0(88.8-100.0)
>16.982 18.2(9.1-30.9) 100.0(88.8-100.0)
>17.2568 16.4(7.8-28.8) 100.0(88.8-100.0)
>17.7788 14.6(6.5-26.7) 100.0(88.8-100.0)
>19.0558 12.7(5.3-24.5) 100.0(88.8-100.0)
>19.4384 10.9(4.1-22.2) 100.0(88.8-100.0)
>22.197 9.1(3.0-20.0) 100.0(88.8-100.0)
>22.732 7.3(2.0-17.6) 100.0(88.8-100.0)
>23.6702 5.5(1.1-15.1) 100.0(88.8-100.0)
>23.8518 3.6(0.4-12.5) 100.0(88.8-100.0)
>24.0428 1.8(0.05-9.7) 100.0(88.8-100.0)
>25.3023 0.0(0.0-6.5) 100.0(88.8-100.0)
Figure pat00004
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. ATG5(Autophagy protein 5) 유전자 또는 LC3B-II(light chain 3B-II)유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 양을 측정하는 것인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 LC3B-II mRNA 또는 LC3B-II 단백질의 양 또는 LC3B-II/LC3B-I 전환 비율을 측정하는 것인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행되는 것인 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 포함하는 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안의 진단용 키트.
  6. 생물학적 시료로부터 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 건성안에서 쇼그렌 증후군 건성안을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행되는 것인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 전사하는 mRNA 또는 ATG5 유전자 또는 LC3B-II 유전자가 코딩하는 단백질의 양을 측정하거나 LC3B-II/LC3B-I 전환 비율을 측정하는 것인 방법.
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