KR20200017076A - 항산화 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

항산화 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우수한 항산화 활성을 갖는 기능성 펩타이드로, 종래 항산화 활성이 미약하다는 한계를 극복하기 위하여, 생체 적합성이 뛰어나면서도 종래 GSH 보다 현저히 우수한 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것으로, 본 발명의 펩타이드는 산화적 스트레스에 의해 유발된 활성산소에 의한 생체 조직이나 세포 손상을 효과적으로 회복시키거나, 항산화 활성을 촉진시킬 수 있다. 따라서 이러한 항산화 활성을 지닌 펩타이드는 산화적 스트레스로 인한 세포 손상에 효과적으로 작용하여 세포 손상을 예방 및 회복시키는데 활용될 수 있다.

Description

항산화 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물{Peptide having antioxidant activity and composition comprising thereof}
본 발명은 항산화 활성을 갖는 생체 적합성 펩타이드 소재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라디칼 소거능을 비롯하여, 항산화 전사인자인 Nrf2 발현과, 항산화 효소인 SOD2 발현을 촉진하는 기능을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 세포는 크게 생물학적 과정에 따라 나타나는 내인적 요인(호흡, 체내 에너지 대사 등)과 외부 환경에 의한 외인적 요인(오염물질, 독성물질, 자외선, 병원균 침입 등)으로 인한 스트레스로, 세포 내에서 활성산소종(reactive oxygen species(ROS)) 또는 자유라디칼(free radical)와 같은 유해 산소를 생성한다.
정상적인 세포는 대사 과정을 통해, 상기 유해 산소들을 항산화 효소로 제거한다. 그러나 스트레스가 지속되거나 심할 경우에는, 세포 내에서 유해 산소가 제거되지 못하고 침척되어, 오히려 염증 반응이나 세포 손상이 야기되고, 이는 다양한 질환으로 발전하는 원인이 된다.
나아가, 상기 유해 산소에 의해 세포의 DNA 손상, 단백질 변성, 효소 불활성화 등이 야기될 수 있고, 세포 내로 확산되거나 혈류를 통해 이동된 지질 과산화물은 새로운 활성산소 생성을 촉진시켜 다양한 조직에서 동맥견화, 암, 심근경색, 뇌졸증, 심장질환, 류마티스성 관절염, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis)이나 파킨스씨 병(Parkinsion's disease, PD)과 같은 퇴행성 뇌신경질환(chronic neurodegenerative disease), 당뇨병, 간염, 신장염, 아토피, 자기면역질환, 염증반응, 노화 등의 진행과정을 촉진하게 된다(Alam, M. N. et al. Saudi Pharm J. 2013; Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996).
게다가, 이러한 세포 내에서 야기된 스트레스는 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차결합을 일으키므로 주름형성, 아토피성 피부염, 여드름 또는 피부암과 같은 피부 관련 질병을 일으키는 주요 원인이라고 알려져 있다.
이에 대해 우리의 신체는 지속적으로 발생하는 활성산소를 제거하고, 손상된 세포를 치유할 수 있는 항산화 체계를 갖추고 있다. 일예로 3개의 아미노산(L-glutamic acid, L-cysteine, L-glycine)이 결합된 글루타치온(Glutathione(GSH))이 있다. 글루타치온은 글루타민 시스테인 리가제(glutamate cysteine ligase(GCL))와 글루타치온 합성 효소(glutathione synthesis(GS))에 의해서 합성되며, 항산화 효소계로서 글루타치온 페록시다제(glutathione peroxidase(GPx)), 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase(GR)), 글루타치온 에스-트랜스퍼라제(glutathione S-trasferase(GST)), 퀴이논 옥시도리덕타제(NADPH: quinone oxidoreductase 1(NQO1))와 같은 효소들의 작용으로 산화-환원 반응을 반복적으로 수행하여 항산화 효능 나타내거나 독성물질을 제거하는 것으로 알려져 있다(Mates, J. M. et al. Clinical biochemistry. 1999; Vrankovic, J. et al. Turkish Journal of Biology. 2012).
이외에 산화적 스트레스에 대한 생체 내 주요 방어 기전으로는, 세포내에 존재하는 Nrf2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)-ARE(Antioxidant response element) 신호 경로에 의한 것인데, 상기 Nrf2-ARE 신호 경로는 글루타치온(glutathione) 합성과 항산화 효소계의 합성을 촉진한다. 상기 Nrf2는 전사 인자로서 산화적 스트레스 상황에서 GPx, GR, GST, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라제(catalase), NQO1, 헴 옥시게나제(Heme oxygenase-1(HO-1))와 같은 항산화 효소를 합성하여 활성산소종을 제거하거나, 항산화제인 글루타치온을 합성하는 GCL, GS 등과 같은 효소들의 발현을 조절하여 세포내에 글루타치온의 양을 증가시키는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이를 통해 활성산소종을 제거하거나 공격성 없는 물질로 전환시킨다(Lee, J. M. et al. J Biochem Mol Biol. 2004).
또한, Nrf2는 다양한 조직에서 활성 산소로부터의 세포 생존율을 높여준다, 따라서, 다양한 조직 내에서 Nrf2 발현이 촉진될 경우, 항산화를 기반으로 한 세포 보호 효능을 갖는다고 여길 수 있다(Baird, L. et al. Arch Toxicol. 2011).
우리 인체내에서 항산화 방어기전을 효율적으로 유지시키기 위해서는 가장 강력한 활성산소인 슈퍼옥사이드 애니언 라디칼(superoxide anion radical)을 일차적으로 중화시켜주는 SOD효소의 생선과 반응속도를 정상화 시켜 주는 것이 가장 중요한 기능 중의 하나이다 그러나 사람은 나이가 들어가면서 SOD효소의 생성과 반응속도가 떨어지기 때문에 이를 보완해 주는 식품의 섭취가 중요하다. 항산화 효소 중에서 SOD는 세포의 에너지 대사과정에서 정상적으로 발생하는 활성산소를 감소시키는 효소로 서 세포의 항산화 방어체계에서 중요한 역할을 하고 있다. 포유동물에서 SOD2는 mitochondrial Mn-SOD이라고도 불린다.
공해나 자외선 등의 환경적 스트레스 또는 생물학적 스트레스를 포함하는 여러 원인, 노화 및 퇴행성 질환과 같은 노화와 관련된 질병, 경제성장 및 식생활의 변화 등에 따라 대사증후군이나 성인병 등에 의해서 점차적으로 인체의 항산화체계는 정상 작동을 하지 못하게 되며, 이러한 경우 항산화 물질을 공급하여 방어할 수 있도록, Nrf2 전자인자를 활성화시켜 활성산소종을 제거할 수 있는 물질 즉, 항산화제의 체내 공급이 요구되고 있다. 항산화제의 체내 공급 요구에 따라 항산화제 또는 항산화 효과를 갖는 식품, 의약 등을 섭취하여 상기 질병을 예방 또는 치료하거나 노화를 지연시키고자 하는 노력이 다방면으로 이루어지고 있으나, 아직까지 이러한 모든 조건을 만족하는 항산화 물질은 개발되지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 항산화 효과를 나타내면서 부작용이 없는 식품원료를 찾고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 펩타이드들이 항산화 전사인자인 Nrf2 발현을 촉진하여 활성산소종을 제거하는 기능, 항산화 효소인 SOD2 발현을 촉진하여 활성산소종을 제거하는 기능, Nrf2와 SOD2 발현을 동시에 촉진하여 활성산소종을 제거하는 기능을 함으로써, 강한 항산화 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되면서, 뛰어난 항산화 활성을 나타냄으로써, 적용시 라디칼 소거능, Nrf2, SOD2 발현을 촉진하여, 항산화 활성을 증진시키도록 하는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 항산화 활성을 지닌 펩타이드는 생체 조직 또는 이의 세포에 효과적으로 작용하여 산화적 스트레스에 대한 항산화 활성을 갖는, 세포의 산화적 손상과 관련된 질환 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명은 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ALA-GLY, γ-GLU-GLU-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-VAL-VAL, γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY, γ-GLU-Abu-GLY 및 γ-GLU-LEU-GLY로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드는 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP 및 γ-GLU-TYR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 트리펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-GLY, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드는 세포 내에서 발생하는 활성산소를 저해하거나, Nrf2 mRNA와 SOD2 mRNA의 발현을 각각 또는 동시에 촉진하는 것일 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드 분획물의 제조방법을 제공한다.
a) 효모 현탁액에 효소를 첨가하여 가수분해 시키는 단계 및
b) 가수분해 후 얻어진 효모 가수분해물로부터 500 Da 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물을 회수하는 단계.
상기 a) 단계는 a-1) 상기 효모 현탁액의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 알칼라아제를 첨가하고, 3 내지 5 시간 동안 1차 가수분해시키는 단계;
a-2) 상기 1차 가수분해물의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 플라보자임을 첨가하고, 5 내지 15 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계; 및
a-3) 상기 2차 가수분해물의 고형분 대비 0.1~0.5 중량% 알칼라아제와 플라보자임을 첨가하고, 20 내지 30 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 하는 항산화 조성물, 세포의 산화적 손상치료용 약학 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물, 화장료 조성물을 제공한다.
상기 세포의 산화적 손상은 자유 라디칼 또는 반응성 산소종(ROS)의 생성에 의한 것일 수 있다.
본 발명은 우수한 항산화 활성을 갖는 기능성 펩타이드로, 종래 항산화 활성이 미약하다는 한계를 극복하기 위하여, 생체 적합성이 뛰어나면서도 종래 GSH 보다 현저히 우수한 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것으로, 본 발명의 펩타이드는 산화적 스트레스에 의해 유발된 활성산소에 의한 생체 조직이나 세포 손상을 효과적으로 회복시키거나, 항산화 활성을 촉진시킬 수 있다. 따라서 이러한 항산화 활성을 지닌 펩타이드는 산화적 스트레스로 인한 세포 손상에 효과적으로 작용하여 세포 손상을 예방 및 회복시키는데 활용될 수 있다.
도 1은 각각의 효모 가수분해물(A4, AF10, AF24)에 대한 DPPH 소거능(a)과 환원력(b)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Control은 아무 효소도 처리하지 않은 것이고, A2는 Alcalase로 2시간동안 분해된 효모 가수분해물, A4는 alcalase로 4시간동안 분해된 효모 가수분해물, AF10는 Alcalase로 4시간동안 분해한 후, flavourzyme로 10시간동안 분해한 효모 가수분해물, AF24는 Alcalase로 4시간동안 분해한 후, flavourzyme로 10시간 분해한 후, 24시간동안 추가 분해한 효모 가수분해물이다.
도 2는 각각의 효모 가수분해물의 분획물(제조예 1 내지 4)에 대한 DPPH 소거능(a)과 환원력(b)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Control은 아무 효소도 처리하지 않은 효모 가수분해물이고, 10 kDa 이상은 제조예 1의 효모 가수분해물의 분획물이며, 10~5 kDa는 제조예 2의 효모 가수분해물의 분획물이며, 5~1 kDa는 제조예 3의 효모 가수분해물의 분획물이며, 1 kDa 이하는 제조예 4의 효모 가수분해물의 분획물이다.
도 3은 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 실험예 2로부터 선정된 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액을 high performance liquid chromatography(HPLC)로 분자량 분포를 확인하고, 분자량에 따라 2차 분획물(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)을 표기한 그래프이다.
도 4는 효모 가수분해물로부터 항산화 활성이 가장 우수한 2차 분획물 Ⅱ로부터 동정된 대표적인 펩타이드의 MS/MS spectrum 및 예상 구조를 나타낸 그래프이다. 'a'는 γ-Glu-Cys-Gly(GSH)이고, 'b'는 γ-Glu-Val-Gly이며, 'c'는 γ-Glu-Cys이고, 'd'는 γ-Glu-Val이다.
도 5는 효모 가수분해물로부터 확인된 100종의 펩타이드에 대한 Nrf2 mRNA 발현량을 Real-time PCR을 통해 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 효모 가수분해물로부터 확인된 100종의 펩타이드에 대한 SOD2 mRNA 발현량을 Real-time PCR을 통해 분석하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K)과 같다.
본 발명에서, 펩타이드란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 명세서에서 사용된 항산화 활성이라는 용어는, 환경적 스트레스 또는 생물학적 스트레스로 인한 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "항산화 조성물"은 조성물의 총 중량 대비 항산화 펩타이드를 20 내지 50 중량%, 바람직하게는 30 내지 40 중량%로 포함하는 조성물을 의미하며, 상기 조성물을 약학적으로 허용 가능한, 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 널리 알려져 있는 기술적 내용에 해당한다.
본 발명의 일 측면은 다음 일반식 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다:
[일반식 1]
γ-Glu-Xaa1
[일반식 2]
γ-Glu-Xaa2-Xaa3
상기 식에서,
Xaa1 및 Xaa2는 서로 동일하거나 서로 상이하고, 각각 독립적으로 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 티로신(Y), 오르니틴(ORN), 티올기의 수소가 산소로 치환된 메티오닌(M(O)), 티올기의 수소가 메틸기로 치환된 시스테인(C(S-Me)) 및 2-아미노부티르산(Abu) 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이며,
Xaa3은 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 발린(V) 및 오르니틴(ORN) 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.
본 발명에서 상기 일반식은 본 발명의 펩타이드 구조를 표현하기 위하여 기재된 것으로, 이의 변형도 본 발명에 속한다는 것은 당업자에게 자명하게 인식될 수 있다.
본 발명에서 'γ-'는 당업계에 공지된 감마 결합을 의미하는 것으로, 구체적으로 'γ-'이 표기된 아미노산의 감마 탄소에 연결된 R기에 위치한 카복실기와 이와 연결되는 임의의 아미노산의 아민기 간에 아마이드 결합을 형성한 것으로 인식될 수 있다. 보다 구체적으로 Glu(글루탐산)이 임의의 아미노산(Xaa1 또는 Xaa2)과 연결되는 경우, 상기 글루탐산(Glu)의 감마(γ) 탄소에 연결된 R기에 위치한 카복실기와 다른 아미노산의 아민기 간에 아마이드 결합이 형성된 것으로 인식될 수 있다. 본 발명에서 상기 감마 결합을 포함하여 형성된 디 또는 트리 펩타이드는 '감마 펩타이드'라고도 할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형될 수 있다. 상기 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선시키는 작용을 할 수 있다. 여기서, 상기 용어 "안정성"은 in vivo 안정성 및 저장 안정성(예: 상온 저장 안정성)을 의미한다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명에 따른 펩타이드를 보호하는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 항산화 활성을 갖는 펩타이드는 순차적인 효소 분해 단계를 통해 효모 가수분해물을 얻고, 이로부터 1차, 2차 분리 정제하여 펩타이드를 분리한 후, 상기 펩타이드들의 Nrf2, SOD2 mRNA 촉진효과를 비교하여 얻어진 것으로, 상기 펩타이드는 천연 GSH 펩타이드에 비해 Nrf2 mRNA, SOD2 mRNA 촉진 활성이 더 높으며, 짧은 서열(2~3개의 아미노산 잔기로 이루어짐)의 펩타이드 만으로도, 현저히 우수한 항산화 효과(DPPH 소거능, 환원력, Nrf2 mRNA 발현 촉진, SOD2 mRNA 발현 촉진)를 가지고 있어, 항산화 활성을 갖는 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 항산화 활성을 갖는 펩타이드는 활성산소를 제거하고, 세포, 조직 또는 기관의 산화적 스트레스에 의해 유발되는 활성 산소에 의한 산화적 손상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 형태로 제공될 수 있다. 또한, 상기 항산화 조성물은 활성 산소에 대한 세포 손상을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 사료, 사료 첨가제 또는 식품 첨가제로서 제공될 수 있다.
본 발명의 일반식 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 의 감마 사슬에 아미노산 잔기가 순차적으로 결합하여 2~3개의 짧은 서열을 갖는 것이다.
구체적으로, 상기 일반식 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 항산화 활성을 갖는 것으로, γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ALA-GLY, γ-GLU-GLU-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-VAL-VAL, γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY, γ-GLU-Abu-GLY 및 γ-GLU-LEU-GLY로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 일반식 1의 펩타이드는 바람직하게 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드이고, 이는 항산화 효과와 더불어 Nrf2 mRNA 및 SOD2 mRNA 발현 촉진 효과를 가지고 있으며, 종래 항산화 효과를 갖는 GSH보다 더 짧은 서열임에도, 동등하거나 더 우수한 효과를 가지고 있으므로, 합성, 제조 및 보관에 있어서 훨씬 유용하다는 장점이 있다.
상기 일반식 1의 펩타이드는 더욱 바람직하게 항산화 효과를 갖는 것으로 널리 알려진 GSH 보다 현저히 유의한 Nrf2 발현 및 SOD2 발현 촉진 효과를 동시에 갖고 있는, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP 및 γ-GLU-TYR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드일 수 있다.
상기 일반식 2의 펩타이드는 바람직하게, GSH보다 현저히 유의한 수준의 Nrf2 발현 및 SOD2 발현 촉진 효과를 갖는 γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 트리펩타이드일 수 있다.
즉, 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드는, GSH 보다 현저히 유의한 Nrf2 발현 및 SOD2 발현 촉진 효과를 동시에 갖고 있는 것으로, γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-GLY, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데 이는 항산화 효과(환원력과 DPPH 소거능, Nrf2 mRNA 활성)를 가지면서 양성 대조군인 GSH에 비해 약 2~3배 이상의 Nrf2 mRNA, SOD2 mRNA 발현량 촉진효과를 갖는다.
한편 γ-GLU-HIS는 GSH에 비하여 2~8배 이상 Nrf2, SOD2 mRNA 발현양 촉진효과를 나타내는 현저한 효과를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 다음 단계를 포함하는 펩타이드 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
a) 효모 현탁액에 효소를 첨가하여 가수분해 시키는 단계; 및
b) 가수분해 후 얻어진 효모 가수분해물을 여과 또는 정제하여 500 Da 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물을 회수하는 단계.
상기 a) 단계는 바람직하게 a-1) 상기 효모 현탁액의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 알칼라아제를 첨가하고, 3 내지 5 시간 동안 1차 가수분해시키는 단계;
a-2) 상기 1차 가수분해물의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 플라보자임을 첨가하고, 5 내지 15 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계; 및
a-3) 상기 2차 가수분해물의 고형분 대비 0.1~0.5 중량% 알칼라아제와 플라보자임을 첨가하고, 20 내지 30 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계;를 통해 수행되는 것일 수 있다. 상기 방법을 통해 효모 가수분해물을 제조할 경우, 항산화 효과가가 우수한 펩타이드를 다량 포함하는 분획물을 얻을 수 있게 된다.
상기 가수분해 단계는 40 내지 70 ℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하며, 40 ℃ 이하면 가수분해가 잘 진행되지 않고, 물리적 스트레스에 따른 항산화 대사물질의 분비를 충분히 유도할 수 없어, 충분한 펩타이드를 얻을 수 없다. 상기 온도범위가 70 ℃를 초과하면 세포의 사멸이 진행되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 가수분해 단계의 pH 조건은 6 내지 7인 것이 바람직하다.
상기 b) 단계는 구체적으로 가수분해 후 얻어진 효모 가수분해물을 분자량에 따라 분획하여, 500 Da 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물을 회수하는 것이다.
상기 (b) 단계를 수행하기 전에 상기 효모 가수분해물로부터 잔여물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있고,. 잔여물 제거 방법은 원심분리, filtration 등 공지의 혼합물로부터 고형분을 제거하는 방법에 의할 수 있다. 바람직하게는 원심분리에 의할 수 있다.
본 발명의 (b) 단계 전에 상기 효모 가수분해물에 포함된 효소를 불활성화 처리 단계를 더 포함할 수 있다. 이 단계는 상기 잔여물 제거 단계의 전 후에 수행되며, 바람직하게는 (b) 단계 전에 상기 효모 가수분해물에 포함된 효소를 불활성화 처리하고, 원심분리 방법에 의해 잔여물을 제거하고 상등액을 분리하여 수득하는 방법에 의할 수 있다. 상기 불활성화 처리 방법은 바람직하게는 열처리에 의한 것으로, 가수분해물을 100℃ 내지 120℃의 온도로 10 내지 30분간 유지하는 방법에 의할 수 있다.
상기 (b) 단계는 500 Da 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물을 수득하는 단계로, 분획물 수득 방법은 물질을 분자량에 따라 분리하는 공지의 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 제거할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 분획물 수득 방법은 투석막을 이용한 투석 방법에 의해 목적 분자량 이상 또는 이하의 물질을 제거하는 방법 일 수 있다.
상기 수득되는 분획물은 1000 Da 이하의 분자량을 가지는 분획이며, 바람직하게는 100 Da ~ 700 Da 이하의 분자량을 가지는 분획물이다. 더욱 바람직하게는 500 Da 이하의 분자량을 가지는 분획물일 수 있다.
또한, 상기 수득되는 분획물의 전체 대비 항산화 활성을 갖는 펩타이드는 70 내지 85 중량%일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 하는 항산화 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 항산화 조성물은 약학 조성물, 건강식품 조성물, 사료, 사료 첨가제, 화장료 조성물 등으로도 활용될 수 있다.
본 발명에서 항산화 활성은, 환경적 스트레스 또는 생물학적 스트레스로 인한 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다. 이에 대한 효과는 in vitro 실험을 통해 검증하였다.
상기 항산화 조성물은 조성물 총 중량 대비 항산화 펩타이드를 20 내지 50 중량%, 바람직하게는 30 내지 40 중량%로 포함하는 조성물을 의미하며, 상기 조성물을 약학적으로 허용 가능한, 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 널리 알려져 있는 기술적 내용에 해당한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 하는 세포의 산화적 손상치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "세포의 산화적 손상"이란 표현은 환경적 스트레스 또는 생물학적 스트레스로 인한 세포 내 대사 또는 자외선과 같은 외인성 원인으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)이 유발되고, 이로 인해 세포가 손상되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 펩타이드가 세포의 산화적 손상을 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 '예방'이란 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 세포의 산화적 손상의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 '치료'란 본 발명에 따른 조성물을 세포의 산화적 손상 의심 개체에 투여하여 세포의 산화적 손상에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 세포의 산화적 손상에 의한 질환의 종류는 제한되지 않으며, 바람직하게는 내인성 또는 외인성 원인에 의해 세포 내 대사 또는 자외선과 같은 외인성 원인으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)이 유발되고, 이로 인해 세포가 손상된 것으로부터 유도되는 질환일 수 있다.
상기 세포의 산화적 손상과 연관된 질환은 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증 및 근위축증으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 또는 색소성 망막증, 황반 변성 및 백내장과 같은 안구 질환; 또는 심근경색, 뇌경색, 허혈성 질환; 또는 관절염, 혈관염, 사구체신염 및 홍반성 루푸스로부터 선택되는 염증성 질환; 및 아테롬성 동맥경화증 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서의 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드는 tBHP(직접 작용 산화 응력 유도 작용제(direct-acting oxidative stress-inducing agent)를 처리하여, 산화 스트레스를 유도한 세포로부터 항산화 방어기전인 Nrf2 mRNA와 SOD2 mRNA의 발현을 촉진 및 상승시키고 있음을 확인하였다. 이와 함께, tBHP에 의해 저하된 세포 생존율을 현저히 증가시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물을 첨가할 경우, 항산화 효소 활성의 증가가 발견되었는데, 이는 항산화제, 기본적으로는 효소의 발현을 유도하여, 세포의 적응을 시사한다.
본 발명의 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드는 세포성 항산화 활성을 증가시키고, 내인성 또는 외인성 원인에 의한 산화적 스트레스에 따른 세포 손상을 억제하며, 투여된 용량에서 세포독성이 없고 안정하다는 점에서 상당한 이점을 가지고 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥시드, 인산수소칼슘, 락토오스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이(opary), 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1-90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 액상파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 펩타이드의 양을 기준으로 0.0001-100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001-10 ㎎/㎏이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적용 방법으로서는 특별히 제한되지 않고, 경구투여 또는 주사 등을 이용한 모든 침습적 또는 비침습적 투여가 이용 가능하고, 좌약 투여 또는 경피 투여를 채용해도 좋다. 유효 성분을 경구, 주사 등의 투여 방법에 적합한 고체 또는 액체의 의약용 담체와 함께, 관용의 의약제제 형태로 투여할 수 있다. 이러한 제제로서는 예를 들면, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 고형제의 형태, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제의 형태, 동결 건조제 등의 형태를 들 수 있다. 이들의 제제는 제제상의 상투 수단에 의해 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에는 의약적, 생리학적으로 허용되는 모든 고체 또는 액체의 담체, 첨가물 등을 임의로 첨가해도 좋다.
상기 담체로서는 예를 들면, 글루코스, 락토스, 수크로스, 전분, 만니톨, 덱스트린, 지방산 글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 하이드록시에틸전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 젤라틴, 알부민, 아미노산, 물, 생리식염수 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 본 발명의 의약 조성물에, 안정화제, 습윤제,유화제, 결합제, 등장화제 등의 관용 첨가제를 적절하게 첨가할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 식품 조성물이란, 상기 펩타이드를 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 식품 조성물에 있어서 상기 펩타이드의 첨가량은, 대상인 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.
상기 식품 조성물은 유효성분으로서 상기 펩타이드 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 펩타이드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 인간용 식품, 음료, 동물용 사료 및 사료첨가제를 포함한다.
나아가, 본 발명에 의해 얻어진 상기 펩타이드를 활성성분으로 포함하는 동물용 사료첨가제에 있어, 상기 펩타이드는 다당체로 구성되고, 분말 형태로 제작하여 동물 사료에 추가로 포함하는 동물용 사료첨가제를 제조할 수 있다. 이때 동물용 사료로는 동물용 분말사료, 송아지 대용유 또는 자돈의 입질 사료 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 상기 펩타이드의 건조중량 대비 함량은 사료 1 kg당 1-2 g(0.1% 수준) 범위내이면 충분하다.
본 발명의 식품 및 건강식품 조성물은 본 발명의 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 항산화용 화장료 조성물은 피부외용 연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 마스크팩, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험예 1. 효모의 가수분해물로부터 항산화 활성을 갖는 저분자 펩타이드의 스크리닝.
1. 효모의 가수분해물 제조
효모(Saccharomyces cerevisiae) 균체를 pH 7.0으로 조절하여 60℃에 도달하도록 가열한 후, endopeptidase(Alcalase),를 고형분 대비 1% 투입한 후 2시간 또는 4시간 동안 효소분해를 실시하였다('A2' 또는 'A4' 시료). Alcalase로 분해된 시료(A4)에 exopeptidase(Flavourzyme)을 고형분 대비 1%, 투입한 후 10시간 동안 효소분해를 진행하였다('AF10' 시료). 총 10시간 분해 후, 55℃ 에서 alcalase과 flavourzyme을 고형분 대비 0.125% 투입한 후 24시간 동안 효소분해를 진행하였다('AF24' 시료). 분해된 상등액을 85℃ 에서 30분동안 실활시킨 후, 한외여과 공정을 통해, 분자량 10 kDa 미만의 펩타이드를 분리하였다. 이때, 상기 Alcalase와 Flavourzyme은 노보자임으로부터 구입하였다.
상기 각각의 효모 가수분해물(A4, AF10, AF24)에서의 항산화 효능(DPPH)와 환원력(reducing power)를 측정하였다.
2, DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate) assay 방법
효모 가수분해물의 DPPH 소거능에 의한 항산화력은 최창섭 등(2003)과 Shekhar 등(2014)의 방법을 이용하여 측정하였다. 증류수에 녹인 샘플 시료(1-5000 ㎍/㎖) 20 ㎕을 DPPH(0.111 mM)가 함유된 에탄올 용액 180 ㎕에 첨가하였다. 이를 25 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선 작성을 위하여 Ascorbic acid가 사용되었으며, DPPH 소거능(%)은 [(무첨가 흡광도-샘플 시료 흡광도) /무첨가 흡광도] × 100의 수식으로 계산하여 표시하였다.
3. Reducing power assay 방법
효모 가수분해물의 환원능력은 Oyaizu(1986)의 방법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 증류수에 녹인 샘플 시료(1-5000 ㎍/㎖, 60 ㎕)을 phosphate buffer(150 ㎕, 0.2M, pH6.6), potassium ferricyanide(K3Fe(CN)6, 150 ㎕, 1%)와 혼합한 후, 50 ℃에서 20분 동안 반응시켰다. 추가로 Trichloracetic acid(10%) 150 ㎕ 을 넣어준 다음, 2000 g에서 10 분 동안 원심분리 하였다. 샘플 시료가 포함된 상등액 150 ㎕ 을 D.W 150 ㎕, FeCl3(30 ㎕, 0.1%)에 첨가하였다. 이를 25 ℃에서 10분 동안 반응 시킨 후, 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
4. 결론
도 1은 각각의 효모 가수분해물(A4, AF10, AF24)에 대한 DPPH 소거능(a)과 환원력(b)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Control은 아무 효소도 처리하지 않은 것이고, A2는 Alcalase로 2시간동안 분해된 효모 가수분해물, A4는 alcalase로 4시간동안 분해된 효모 가수분해물, AF10는 Alcalase로 4시간동안 분해한 후, flavourzyme로 10시간동안 분해한 효모 가수분해물, AF24는 Alcalase로 4시간동안 분해한 후, flavourzyme로 10시간 분해한 후, 24시간동안 추가 분해한 효모 가수분해물이다.
도 1에 나타난 바와 같이, alcalase와 flavourzyme를 순차적으로 처리하여 다단으로 분해한 AF24의 시료에서 가장 높은 DPPH 소거능과 환원력이 나타남을 확인하였다. 즉, 동일한 효모 가수분해물에서도 효소와 시간에 따라 상이한 DPPH 소거능(도 1a)과 환원력(도 1b)을 가지고 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 항산화 효과를 갖는 펩타이드의 스크리닝을 위해 AF24 시료를 사용하였다.
실험예 2. 효모 가수분해물의 분자량에 따라 1차 분리 및 각 분획물의 항산화 활성 분석
상기 효모 가수분해물 중에서 항산화 활성이 가장 우수한 AF24 시료로부터 항산화 활성이 우수한 펩타이드를 분리 및 선정하기 위하여, 상기 AF24 효모 가수분해물을 분자량(크기)별로 분획물을 제조하고, 이에 대한 산화 효능(DPPH)와 환원력(reducing power)를 측정하여 비교하였다.
1. 효모 가수분해물의 분획물 제조
구체적으로 상기 AF24 효모 가수분해물을 한외여과막 크기 10 kDa, 5 kDa, 1 kDa로 각각 여과하고, 분획별 여과액을 105 ℃에서 48 시간 수분을 제거한 후, 건조중량을 측정하여 다음 표 1에서와 같이 함량을 구하였다. 표 1에 따르면, 효모 가수분해물의 분획물 대부분은 1 kDa 이하의 크기를 갖는 물질인 것을 알 수 있다.
구분 효모 분획물의 분자량(Dalton) 함량(%)
제조예 1 10,000 이상 0.3
제조예 2 10,000~5,000 1.2
제조예 3 5,000~1,000 15.2
제조예 4 1,000 이하 83.3
2. 효모 가수분해물 분자량(크기)별 분획물의 항산화 활성 실험
각각의 효모 가수분해물의 분획물(제조예 1 내지 4)에 대하여 실험예 1의 DPPH 소거능과 환원력 측정 방법으로, DPPH 소거능과 환원력을 측정하였다.
도 2는 각각의 효모 가수분해물의 분획물(제조예 1 내지 4)에 대한 DPPH 소거능(a)과 환원력(b)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Control은 아무 효소도 처리하지 않은 효모 가수분해물이고, 10 kDa 이상은 제조예 1의 효모 가수분해물의 분획물이며, 10~5 kDa는 제조예 2의 효모 가수분해물의 분획물이며, 5~1 kDa는 제조예 3의 효모 가수분해물의 분획물이며, 1 kDa 이하는 제조예 4의 효모 가수분해물의 분획물이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 5kDa 이하에서 6% 이상의 DPPH 소거능을 보였으며, 1 kDa 이하의 분획물(제조예 4)에서 3~8 배 이상의 가장 높은 항산화 활성을 나타남을 확인하였다. 환원력 역시, DPPH 소거능과 마찬가지로 1kDa 이하의 분획물(제조예 4)에서 4 배 이상의 현저히 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 본 발명에서는 항산화 효과를 갖는 펩타이드의 스크리닝을 위해 1 kDa 이하의 효모 가수분해물 여과액을 선정하였다.
실험예 3. 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액을 분자량에 따라 2차 분리
상기 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액에서 분자량에 따라 2차 분리한 후, 항산화 활성을 측정하여, 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 스크리닝 하기 위한 최종 시료를 선정하고자 하였다.
1. HPLC 분석
상기 실험예 2로부터 선정된 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액을, 분자량 분포도를 확인하고, 분자량 분포에 따라 2차 분리하고자 하였다. 이를 위해 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액을 High performance liquid chromatography(HPLC, Agilent 1200 series) 기기 및 GPC method system 소프트웨어를 사용하여, 분자량 분포도를 확인하였다. 이때, HPLC 조건은 하기 표 2와 같다.
HPCL는 구체적으로 Agilent PL aquagel-OH 20 컬럼에 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액 10 ㎕를 주입하여 분당 1 ㎖의 유속으로 총 20분간 분리하였다. 이동상은 물과 아세토나이트릴, 트리플루오로아세트산을 각각 50, 50, 0.1의 비율로 혼합하여 사용하였고, 시료는 220 ㎚의 파장으로 검출하였다.
Column Agilent PL aquagel-OH 20
(5μm, 7.5mm ID x 300mm L)
Mobile phase water : CH3CN:TFA=50:50:0.1
Injection volume 10 ㎕
Flow rate 1.0 ㎖/min
Wavelength 220 ㎚
2. 결론
도 3은 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 실험예 2로부터 선정된 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액을 high performance liquid chromatography(HPLC)로 분자량 분포를 확인하고, 분자량에 따라 2차 분획물(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)을 표기한 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 실험예 2로부터 선정된 1 kDa 이하 효모 가수분해물 여과액은 전체 분자량이 1 kDa(1,000 dalton) 이하였다. 이는 분자량 500 dalton 이상인 펩타이드가 15.1%(2차 분획물 I), 분자량 500 dalton 이하인 펩타이드가 81.9%(2차 분획물 II), 아미노산이 3.0%(2차 분획물 III)으로 이루어져 있음을 확인하였다. 따라서, 항산화 활성을 갖는 펩타이드의 스크리닝을 위해, 가장 항산화 활성이 우수한 2차 분획물 Ⅱ를 최종 선정하였고, 2차 분획물 Ⅱ로부터 펩타이드를 동정하였다.
실험예 4. 2차 분획물 Ⅱ로부터 항산화 활성을 갖는 100 종의 펩타이드 동정
최종 선정된 2차 분획물 II로부터 항산화 기능성 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 2차 분획물 Ⅱ에 존재하는 펩타이드를 동정하고, 항산화 활성을 비교하고자 하였다.
1. 펩타이드 동정
펩타이드의 아미노산서열 분석을 위하여 질량분석기 LC MS/MS system(Waters, USA)을 사용하였고, 이의 조건 및 방법은 표 3에 나타내었다.
구체적으로 최종 선정된 2차 분획물 II 5 ㎕를 LC MS/MS 시스템에 주입하여, BEH C4 column으로 분리하였다. 이동상은 분당 0.2 ㎖ 유속으로 1분간 100%의 용매 A를 흘려 보낸 후, 9분간 용매 A가 100%에서 99%가 되도록 하였다. 그 후, 0.5 분간 용매 A가 99%에서 0%가 되도록 감소시켰고, 마지막 4.5 분간은 용매 A가 다시 100%가 되도록 하였다. 질량 스펙트럼은 50~1200m/z 범위 내에서 파지티브 모드에서 전자분사 이온화를 사용하여 분석하였다. 그 작동 계수는 다음과 같다: 이온 소스 온도, 120 ℃; 디솔베이션 온도, 400 ℃; 시료 분석은 MassLynx 4.1 software(Waters, USA)를 이용하였다.
Column BEH C4 (100×2.1 mm, 1.7 μm)
Solvent A: 0.1% formic acid in water
B: 0.1% formic acid in acetonitrile
Gradient conditions Time(min) A (%) B (%)
Initial 100 0
1.0 100 0
10.0 99 1
10,5 0 100
15.0 100 0
Column flow rate 0.2 ml/min
Ionization mode ESI positive mode
Source Temperature 120℃
Desolvation
Temperature		 400℃
2. 결론
도 4는 효모 가수분해물로부터 항산화 활성이 가장 우수한 2차 분획물 Ⅱ로부터 동정된 대표적인 펩타이드의 MS/MS spectrum 및 예상 구조를 나타낸 그래프이다. 'a'는 γ-Glu-Cys-Gly(GSH)이고, 'b'는 γ-Glu-Val-Gly이며, 'c'는 γ-Glu-Cys이고, 'd'는 γ-Glu-Val이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 그 결과 효모 가수분해물로부터 항산화 활성이 가장 우수한 2차 분획물 Ⅱ에서, 총 100종의 펩타이드를 확인하였다.
실험예 5. 100종의 펩타이드에 대한 Nrf2 mRNA 발현양 비교
1. 100종의 펩타이드 합성
상기 확인된 100종의 펩타이드를 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조하고, 질량분석기 LC-MS/MS system(Waters, USA)를 사용하여 분석하였다. 이후, 합성된 펩타이드와 동정하여 설계된 각 펩타이드가 동일한 구조인지를 확인하기 위해, 펩타이드 지표물질의 mono-isotope값(1.0 ppm 이하)을 기준으로 XIC 모드에서 분자량 값으로 추출하여 정확히 확인하였으며, MS/MS상에서 2개 이상의 product ion이 일치함을 확인하였다. 모든 시료 및 지표물질은 full scan, positive mode에서 측정하였다.
2. 100종의 펩타이드에 대한 항산화 활성( Nrf2 mRNA 발현량) 분석
본 발명은 100종의 펩타이드에 대하여 항산화 활성을 비교하고, 최종 펩타이드를 선정하기 위하여 PCR을 통해 Nrf2 mRNA 발현 변화를 측정하였다.
(1) 세포 배양 및 100종의 펩타이드 처리
신장세포인 HEK293 세포주를 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에 6-well plate의 well 당 6.6×105 개씩 분주하여 37 ℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이튿날 무혈청, 무아미노산 배지(serum and amino acid free media)로 갈아준 다음, 20 시간 이상 추가 배양하였다. Tert-BHP(300 uM)와 100종의 펩타이드를 500 uM 농도로 각각 처리하여 18시간 동안 배양하였다.
(2) RNA 추출
상기 (1) 100 종의 펩타이드가 각각 처리된 세포로부터 RNA를 추출하기 위하여, TRizol(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 RNA를 추출하였다. RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해, GoScript™ Reverse Transcription System(Promega, Wisconsin, USA)를 사용하였다. RNA 1 ㎍, primer oligo dt 0.5 ㎍, Random primer 0.5 ㎍, RT-PCR pre-mixture를 넣어 25℃에서 5분 annealing, 42℃에서 60분 extension, 70℃에서 15분 inactivation 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다.
(3) cDNA 합성 및 PCR
PCR은 Maxime™ PCR PreMix(i-StarTaq)(Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 실시하였다. Real-time PCR은 SsoAdvanced™ Universal SYBR® GreenSupermix(Biorad, USA)를 사용하였다. PCR plate well에 cDNA 100 ng, 2 μM(pmole/㎕) primers, 2X SsoAdvanced™ Universal SYBR® GreenSupermix 10 ㎕과 D.W를 첨가하였다. 다음, 95 ℃에서 3 분, 95 ℃에서 10 초, 58 ℃에서 40 초, 총 40 사이클(cycle)로 수행하였다. CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 PCR 반응을 진행하였으며, 매 사이클(cycle)이 끝날 때마다, 형광 강도를 측정하였다. Nrf2 발현을 확인하기 위한 PCR 분석에 사용한 primer sequence은 표 4에 나타내었다.
Gene Sequence
Nrf2 Forward : 5-ATTCCTTCAGCAGCATCC-3
Reverse : 5-GTGTTGACTGTGGCATCT-3
18S Forward : 5-GAGCCTGAGAAACGGCTAC-3
Reverse : 5-CCCATTATTCCTAGCTGCG-3
3. 결론
도 5는 효모 가수분해물로부터 확인된 100종의 펩타이드에 대한 Nrf2 mRNA 발현량을 Real-time PCR을 통해 분석하여 나타낸 그래프이다. 도 5에는 대조군(control), 음성 대조군인 tBHP(직접 작용 산화 응력 유도 작용제(direct-acting oxidative stress-inducing agent)만 처리한 것, 양성 대조군 tBHP 처리 후, GSH 펩타이드를 처리한 것 및 해당되는 100종 펩타이드 이름(표 5와 표6 참조)이 기재되어 있다.
앞서 실험예 4로부터 총 100 종의 펩타이드를 확인하였다. 이들에 대해 Nrf2 mRNA 발현양을 비교한 결과, Nrf2 mRNA 발현량에서 증가 수치를 나타내는 총 48 종의 펩타이드를 선정하였고, 이에 대하여 정량적인 Nrf2 mRNA 발현량을 측정하여 도 5에 나타내었으며, 선정된 48종과 선정되지 않은 나머지 펩타이드의 화학식과 구조식을 하기 표 5와 표 6에 나타내었다.
선정된 48종의 펩타이드
서열번호 이름 아미노산 서열 화학구조 분자량
([M+H]+(m/z))
양성 대조군 ECG-reduced GSH-reduced C10H17N3O6S 308.0916
1 EA γ-GLU-ALA C8H14N2O5 219.0981
2 EC γ-GLU-CYS C8H14N2O5S 251.0702
3 EC(S-Me) γ-GLU-CYS(S-Me) C9H16N2O5S 265.0858
4 EC(S-Me)(O2) γ-GLU-CYS(S-Me)(O2) C9H16N2O7S 297.0756
5 ED γ-GLU-ASP C9H14N2O7 263.0879
6 EE γ-GLU-GLU C10H16N2O7 277.1036
7 EF γ-GLU-PHE C14H18N2O5 295.1294
8 EG γ-GLU-GLY C7H12N2O5 205.0824
9 EH γ-GLU-HIS C11H16N4O5 285.1199
10 EI γ-GLU-ILE C11H20N2O5 261.1450
11 EL γ-GLU-LEU C11H20N2O5 261.1450
12 EM(O) γ-GLU-MET(O) C10H18N2O6S 295.0964
13 EN γ-GLU-ASN C9H15N3O6 262.1039
14 E-ORN γ-GLU-ORN C10H19N3O5 262.1403
15 EP γ-GLU-PRO C10H16N2O5 245.1137
16 EQ γ-GLU-GLN C10H17N3O6 276.1196
17 ER γ-GLU-ARG C11H21N5O5 304.1621
18 ET γ-GLU-THR C9H16N2O6 249.1087
19 EV γ-GLU-VAL C10H18N2O5 247.1294
20 EV-NH2 γ-GLU-VAL-NH2 C10H19N3O4 246.1454
21 EW γ-GLU-TRP C16H19N3O5 334.1403
22 EY γ-GLU-TYR C14H18N2O6 311.1243
23 EV-ol γ-GLU-VAL-ol C10H18N2O3 215.1396
24 EQE γ-GLU-GLN-GLU C15H24N4O9 405.1622
25 EAG γ-GLU-ALA-GLY C10H17N3O6 276.1196
26 EEE γ-GLU-GLU-GLU C15H23N3O10 406.1462
27 EIG γ-GLU-ILE-GLY C13H23N3O6 318.1665
28 EPG γ-GLU-PRO-GLY C12H19N3O6 302.1352
29 EQQ γ-GLU-GLN-GLN C15H25N5O8 404.1781
30 ESG γ-GLU-SER-GLY C10H17N3O7 292.1145
31 ETG γ-GLU-THR-GLY C11H19N3O7 306.1301
32 EVG γ-GLU-VAL-GLY C12H21N3O6 304.1509
33 EVA γ-GLU-VAL-ALA C13H23N3O6 318.1665
34 EVC γ-GLU-VAL-CYS C13H23N3O6S 350.1386
35 EVD γ-GLU-VAL-ASP C14H23N3O8 362.1563
36 EVE γ-GLU-VAL-GLU C15H25N3O8 376.1720
37 EVF γ-GLU-VAL-PHE C19H27N3O6 394.1978
38 EVH γ-GLU-VAL-HIS C16H25N5O6 384.1883
39 EVK γ-GLU-VAL-LYS C16H30N4O6 375.2244
40 EVM γ-GLU-VAL-MET C15H27N3O6S 378.1699
41 EVN γ-GLU-VAL-ASN C14H24N4O7 361.1723
42 EV-ORN γ-GLU-VAL-ORN C15H28N4O6 361.2087
43 EVP γ-GLU-VAL-PRO C15H25N3O6 344.1822
44 EVR γ-GLU-VAL-ARG C16H30N6O6 403.2305
45 EVV γ-GLU-VAL-VAL C15H27N3O6 346.1978
46 EC(S-Me)G γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY C11H19N3O6S 322.1073
47 EAbuG γ-GLU-Abu-GLY C11H19N3O6 290.1352
48 ELG γ-GLU-LEU-GLY C13H23N3O6 318.1665
선정되지 못한 펩타이드
서열번호 이름 아미노산 서열 화학구조 분자량
([M+H]+(m/z))
49 E-Abu GLU-Abu C9H16N2O5 233.1059
50 EH α-GLU-HIS C11H16N4O5 285.1199
51 EH β-GLU-HIS C11H16N4O5 285.1199
52 EK γ-GLU-LYS C11H21N3O5 276.1559
53 EM γ-GLU-MET C10H18N2O5S 279.1015
54 E-Nle γ-GLU-Nle C11H20N2O5 261.1372
55 E-Nva γ-GLU-Nva C10H18N2O5 247.1294
56 ES γ-GLU-SER C8H14N2O6 235.0930
57 EtL γ-GLU-tLEU C11H20N2O6 261.1450
58 E-Abu-L γ-GLU-Abu-LEU C15H27N3O6 346.1900
59 E-Abu-P γ-GLU-Abu-PRO C14H23N3O6 330.3489
60 EAF γ-GLU-ALA-PHE C17H23N3O6 366.1665
61 EAI γ-GLU-ALA-ILE C14H25N3O6 332.1822
62 EAL γ-GLU-ALA-LEU C14H25N3O6 332.1822
63 EAP γ-GLU-ALA-PRO C13H21N3O6 316.1509
64 EAW γ-GLU-ALA-TRP C19H24N4O6 405.1774
65 EAY γ-GLU-ALA-TYR C17H23N3O6 382.1614
66 EC-A γ-GLU-CYS-ALA C11H19N3O6 322.1073
67 EDF γ-GLU-ASP-PHE C18H23N3O8 410.1563
68 EDM γ-GLU-ASP-MET C14H23N3O8S 394.1284
69 EEF γ-GLU-GLU-PHE C19H25N3O8 424.1720
70 EEQ γ-GLU-GLU-GLN C15H24N4O9 405.1622
71 EFA γ-GLU-PHE-ALA C17H23N3O6 366.1665
72 EFV γ-GLU-PHE-VAL C19H27N3O6 394.1978
73 EGA γ-GLU-GLY-ALA C10H17N3O6 276.1196
74 EGG γ-GLU-GLY-GLY C9H15N3O6 262.0961
75 EGW γ-GLU-GLY-TRP C18H22N4O6 391.1618
76 EGY γ-GLU-GLY-TYR C16H21N3O7 368.1458
77 EIA γ-GLU-ILE-ALA C14H25N3O6 332.1822
78 EIF γ-GLU-ILE-PHE C20H29N3O6 408.2135
79 EIS γ-GLU-ILE-SER C14H25N3O7 348.1771
80 EIT γ-GLU-ILE-THR C15H27N3O7 362.1927
81 EIV γ-GLU-ILE-VAL C16H29N3O6 360.2135
82 ELN γ-GLU-LEU-ASN C15H26N4O7 375.1880
83 ELS γ-GLU_LEU-SER C14H25N3O7 348.1771
84 ELV γ-GLU-LEU-VAL C16H29N3O6 360.2135
85 ENvaG γ-GLU-Nva-GLY C12H21N3O6 304.3116
86 EPD γ-GLU-PRO-ASP C14H21N3O8 360.1407
87 ERY γ-GLU-ARG-TYR C20H30N6O7 467.2254
88 ESY γ-GLU-SER-TYR C17H23N3O8 398.1563
89 ETC γ-GLU-THR-CYS C12H21N3O7S 352.1178
90 ETD γ-GLU-THR-ASP C13H21N3O9 364.1356
91 ETH γ-GLU-THR-HIS C15H23N5O7 386.1676
92 ETQ γ-GLU-THR-GLN C14H24N4O8 377.1672
93 ETR γ-GLU-THR-ARG C15H28N6O7 405.2098
94 ETS γ-GLU-THE-SER C12H21N3O8 336.1407
95 EVQ γ-GLU-VAL-GLN C15H26N4O7 375.1880
96 EVS γ-GLUVAL-SER C13H23N3O7 334.1614
97 EVT γ-GLU-VAL-THR C14H25N3O7 348.1771
98 EWA γ-GLU-TRP-ALA C19H24N4O6 405.1774
99 EWC γ-GLU-TRP-CYS C19H24N4O6S 437.1495
100 EWE γ-GLU-TRP-GLU C21H26N4O8 463.1829
즉, 효모 가수분해물로부터 총 100종의 펩타이드가 확인되었으나, Nrf2 mRNA 발현을 촉진하는 '항산화 활성'을 나타내는 펩타이드는 총 48종에 달하는 것을 확인하였다.
정상 세포는 산화제인 tBHP 처리시 산화 스트레스에 의해 성장 저해를 받는다. tBHP가 처리된 세포에, 항산화 효능을 가지는 펩타이드(peptide)를 처리하면, tBHP에 의한 세포의 산화 및 성장이 억제되고, 세포의 성장이 회복된다.
도 5에 나타난 바와 같이, 48종의 펩타이드(γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ALA-GLY, γ-GLU-GLU-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-VAL-VAL, γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY, γ-GLU-Abu-GLY 및 γ-GLU-LEU-GLY)은 Nrf2 mRNA 발현을 증가시키는 역할을 하고 있음을 확인하였다.
또한, 48 종의 펩타이드들 중에서 양성 대조군인 GSH와 동일하거나 우수한 Nrf2 mRNA 발현 증가효과를 갖는 디펩타이드는 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol로 확인되며, 이는 GSH보다 짧은 서열임에도 동등하거나 우수한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 48종의 펩타이들 중에서 양성 대조군인 GSH보다 유의적으로 우수한 Nrf2 mRNA 발현양을 나타내는 트리펩타이드는 γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG으로 확인되며, 보다 바람직하게 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2) 또는 γ-GLU-HIS는 동일한 농도에서 양성 대조군인 GSH보다 4배 이상 Nrf2 mRNA의 발현량을 증가시키고 있음을 알 수 있다(정상 수준으로 Nrf2 mRNA의 발현량이 회복되었음). 특히, γ-GLU-HIS에 비해 α-GLU-HIS β-GLU-HIS는 효과가 없었다.
실험예 6. 100종의 펩타이드에 대한 SOD2 mRNA 발현량 분석
또 다른 항산화 인자인 SOD2 mRNA 발현을 검토하였다. 상기 실험예 5와 모두 동일하게 하여, 세포주를 배양하고, RNA 추출, cDNA 합성 및 PCR 실험을 진행하였다. 구체적으로 다음과 같다.
1. 실험예 5에서의 100종의 펩타이드에 대한 항산화 활성( SOD2 mRNA 발현량) 분석
(1) 세포 배양 및 100종의 펩타이드 처리
신장세포인 HEK293 세포주를 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에 6-well plate의 well 당 6.6×105 개씩 분주하여 37 ℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이튿날 무혈청, 무아미노산 배지(serum and amino acid free media)로 갈아준 다음, 20 시간 이상 추가 배양하였다. Tert-BHP(300 uM)와 100종의 펩타이드를 500 μM 농도로 각각 처리하여 18시간 동안 배양하였다.
(2) RNA 추출
상기 (1) 100 종의 펩타이드가 각각 처리된 세포로부터 RNA를 추출하기 위하여, TRizol(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 RNA를 추출하였다. RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해, GoScript™ Reverse Transcription System(Promega, Wisconsin, USA)를 사용하였다. RNA 1 ㎍, primer oligo dt 0.5 ㎍, Random primer 0.5 ㎍, RT-PCR pre-mixture를 넣어 25 ℃에서 5분 annealing, 42 ℃에서 60분 extension, 70 ℃에서 15분 inactivation 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다.
(3) cDNA 합성 및 PCR
PCR은 Maxime™ PCR PreMix(i-StarTaq)(Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 실시하였다. Real-time PCR은 SsoAdvanced™ Universal SYBR® GreenSupermix(Biorad, USA)를 사용하였다. PCR plate well에 cDNA 100 ng, 2 μM(pmole/㎕) primers, 2X SsoAdvanced™ Universal SYBR® GreenSupermix 10 ㎕과 D.W를 첨가하였다. 다음, 95 ℃에서 3 분, 95 ℃에서 10 초, 58 ℃에서 40 초, 총 40 사이클(cycle)로 수행하였다. CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 PCR 반응을 진행하였으며, 매 사이클(cycle)이 끝날 때마다, 형광 강도를 측정하였다. SOD2 mRNA 발현을 확인하기 위한 PCR 분석에 사용한 primer sequence은 표 7에 나타내었다.
Gene Sequence
SOD2 Forward : 5-GCACATTAACGCGCAGATCA -3
Reverse : 5-AGCCTCCAGCAACTCTCCTT-3
GAPDH Forward : 5-GTATGACAACAGCCTCAAGAT-3
Reverse : 5-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3
2. 결론
도 6은 효모 가수분해물로부터 확인된 100종의 펩타이드에 대한 SOD2 mRNA 발현량을 Real-time PCR을 통해 분석하여 나타낸 그래프이다. 도 6에는 대조군(control), 양성 대조군 tBHP 처리 후, GSH 펩타이드를 처리한 것 및 표 5에서의 48종 펩타이드 이름이 기재되어 있다.
도 6에 나타낸 것과 같이, 산화적 스트레스에 의해 발현되는 SOD2 mRNA의 상대적인 발현량을 측정하여, 각각의 펩타이드별 항산화 효능을 비교하였다. 효모 가수분해물로부터 취득한 총 100종의 펩타이드들을 대상으로 RT-PCR을 수행한 결과, SOD2 mRNA 발현이 증가된 것은 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-GLY, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LYS, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-Abu-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-VAL의 39종의 펩타이드가 확인되었다. 이를 제외한 나머지 펩타이드에서는 SOD2 mRNA 발현 증가 효과가 거의 관찰되지 않았다.
상기 39 종의 펩타이드에서의 SOD2 mRNA 발현량을 정량적으로 분석한 결과, 양성 대조군인 GSH와 동등하거나 보다 높은 SOD2 mRNA 발현량을 나타내는 디펩타이드는 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LYS, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol로 확인되며, 이는 GSH보다 짧은 서열임에도 동등하거나 우수한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 양성 대조군인 GSH보다 유의적으로 우수한 SOD2 mRNA 발현양을 나타내는 트리펩타이드는 γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-Abu-GLY, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG으로 확인되었다.
바람직하게 약 2~3배 이상의 SOD2 mRNA 발현량 촉진효과를 갖는 것은 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS이였다(정상 수준(control)의 SOD2 mRNA의 발현량 보다 현저히 높음).
실험결과를 종합하면, 효모(Saccharomyces cerevisiae) 균체를 60 ℃로 가열하고, alcalase를 4 시간동안 처리하여 분해한 후, 여기에 flavourzyme를 첨가하여 10시간 동안 효소분해하고, alcalase과 flavourzyme를 투입하여 24시간 효소 분해시킨 다음, 상등액을 얻어 효모 가수분해물을 제조하였다. 상기 제조된 효모 가수분해물을 한외여과막을 통해 1 kDa 이하의 분자량을 갖는 1차 분리하고, HPLC를 통해 219.0981~406.1462의 분자량([M+H]+(m/z))을 갖는 분획물을 2차 분리하여, 총 100종의 펩타이드를 동정하였다.
상기 100종의 펩타이드에 대하여 항산화 활성(Nrf2, SOD2 mRNA)를 분석한 결과, 총 48종의 펩타이드(γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ALA-GLY, γ-GLU-GLU-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-VAL-VAL, γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY, γ-GLU-Abu-GLY 및 γ-GLU-LEU-GLY)가 항산화 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
양성 대조군인 GSH에 비해 서열길이가 더 짧은 디펩타이드 중에서 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol는 GSH와 동등하거나 그 이상의 현저히 우수한 Nrf2, SOD2 발현 촉진 활성을 모두 갖는 것을 확인하였다. 이중에서도 GSH에 비해 통계적으로 현저히 우수한 Nrf2, SOD2 발현 촉진 활성을 갖는 디펩타이드는 γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP 및 γ-GLU-TYR이다.
또한, 양성 대조군인 GSH와 서열길이가 동일한 트리펩타이드 중에서, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG는 GSH에 비해 통계적으로 유의한 정도 이상의 현저한 Nrf2, SOD2 발현 촉진 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
즉, 종래 항산화 효과를 갖는 것으로 널리 알려진 GSH 보다 우수한 Nrf2 발현 및 SOD2 발현 촉진 효과를 갖는 총 21종의 펩타이드(γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-GLY, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG)를 확인할 수 있었다.
이들 중에서도 항산화 효과(GSH와 동등하거나 우수한 환원력과 DPPH 소거능, Nrf2 mRNA 활성)를 가지면서 양성 대조군인 GSH에 비해 약 2~3배 이상의 SOD2 mRNA 발현량 촉진효과를 갖는 것은 총 6 종의 펩타이드(γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS)가 확인되었고, GSH에 비하여 2~8배 이상 Nrf2, SOD2 mRNA 발현양 촉진효과를 나타내는 것은 γ-GLU-HIS인 것으로 확인되었다.

Claims (14)

  1. γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-ASP, γ-GLU-GLU, γ-GLU-PHE, γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-MET(O), γ-GLU-ASN, γ-GLU-ORN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-ARG, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-VAL-ol, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ALA-GLY, γ-GLU-GLU-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-GLN-GLN, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-GLY, γ-GLU-VAL-ALA, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-HIS, γ-GLU-VAL-LYS, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN, γ-GLU-VAL-ORN, γ-GLU-VAL-PRO, γ-GLU-VAL-ARG, γ-GLU-VAL-VAL, γ-GLU-CYS(S-Me)-GLY, γ-GLU-Abu-GLY 및 γ-GLU-LEU-GLY로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 γ-GLU-ALA, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-LEU, γ-GLU-ASN, γ-GLU-PRO, γ-GLU-GLN, γ-GLU-THR, γ-GLU-VAL-NH2, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR 및 γ-GLU-VAL-ol로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-GLY, γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP 및 γ-GLU-TYR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 디펩타이드인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 트리펩타이드인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-CYS, γ-GLU-CYS(S-Me), γ-GLU-GLY, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN, γ-GLU-TRP, γ-GLU-TYR, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-ILE-GLY, γ-GLU-PRO-GLY, γ-GLU-SER-GLY, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS, γ-GLU-VAL-ASP, γ-GLU-VAL-GLU, γ-GLU-VAL-PHE, γ-GLU-VAL-MET, γ-GLU-VAL-ASN 및 γ-GLU-VAL-ARG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 γ-GLU-CYS(S-Me)(O2), γ-GLU-HIS, γ-GLU-ILE, γ-GLU-GLN-GLU, γ-GLU-THR-GLY, γ-GLU-VAL-CYS로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드.
  7. a) 효모 현탁액에 효소를 첨가하여 가수분해 시키는 단계; 및
    b) 가수분해 후 얻어진 효모 가수분해물로부터 500 Da 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드 분획물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 a) 단계는
    a-1) 상기 효모 현탁액의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 알칼라아제를 첨가하고, 3 내지 5 시간 동안 1차 가수분해시키는 단계;
    a-2) 상기 1차 가수분해물의 고형분 대비 0.5~1.5 중량% 플라보자임을 첨가하고, 5 내지 15 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계; 및
    a-3) 상기 2차 가수분해물의 고형분 대비 0.1~0.5 중량% 알칼라아제와 플라보자임을 첨가하고, 20 내지 30 시간 동안 2차 가수분해시키는 단계;를 포함하는 항산화 활성을 갖는 펩타이드 분획물의 제조방법.
  9. 청구항 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 항산화 조성물.
  10. 청구항 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 세포의 산화적 손상치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포의 산화적 손상은 자유 라디칼 또는 반응성 산소종(ROS)의 생성에 의한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 사료 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230009189A (ko) * 2021-07-08 2023-01-17 경북대학교 산학협력단 감마-글루타밀티로신을 포함하는 암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2768475C1 (ru) * 2021-07-08 2022-03-24 Общество с ограниченной ответственностью "ТЕРРАНОВА КАПИТАЛ" Пептид, обладающий нейростимулирующей активностью и восстанавливающий способность к обучению и формированию памяти, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011129462A2 (en) * 2010-04-12 2011-10-20 Ajinomoto Co., Inc. A YEAST EXTRACT CONTAINING γ-Glu-X OR γ-Glu-X-Gly AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME
KR20160116600A (ko) * 2015-03-30 2016-10-10 대한민국(농촌진흥청장) 항산화 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4273689B2 (ja) 2001-11-26 2009-06-03 味の素株式会社 γ−グルタミルシステイン産生酵母
WO2007055388A2 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Calcium receptor activator
CA2686805C (en) * 2007-05-08 2015-11-24 Ajinomoto Co., Inc. A sweetener comprising a calcium receptor
EP2735569A4 (en) * 2011-06-28 2015-02-25 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PREPARING A LANTHIONINE DERIVATIVE
CN102286591A (zh) * 2011-09-15 2011-12-21 华南理工大学 一种酵母来源活性多肽的制备方法
WO2014017485A1 (ja) 2012-07-25 2014-01-30 味の素株式会社 果汁含有飲食品
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011129462A2 (en) * 2010-04-12 2011-10-20 Ajinomoto Co., Inc. A YEAST EXTRACT CONTAINING γ-Glu-X OR γ-Glu-X-Gly AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME
KR20160116600A (ko) * 2015-03-30 2016-10-10 대한민국(농촌진흥청장) 항산화 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GU L,등, FOOD CHEM TOXICOL. 50(11):4085_91 (2012.08.21.) *
M. Mirzaei 등, Journal of Functional Foods, Vol.19, p.259-268 (2015)* *
PubChem CID 5489007 (2005.08.08.)* *
Y. AMINO 등, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, Vol.64, p.1181-1189 (2016) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230009189A (ko) * 2021-07-08 2023-01-17 경북대학교 산학협력단 감마-글루타밀티로신을 포함하는 암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물

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