KR20200014311A - 면역요법을 위한 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 예측하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 특히 종양 관련 신생 항원이 면역요법, 예컨대 백신 접종에 유용한 에피토프, 특히 종양 관련 네오-에피토프를 포함하는지의 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히, 환자의 종양에 특이적인 백신을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 그에 따라 개인화된 암 백신과 관련하여 사용될 수 있다.

Description

면역요법을 위한 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 예측하는 방법
본 발명은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 특히 종양 관련 신생 항원이 면역요법, 예컨대 백신 접종에 유용한 에피토프, 특히 종양 관련 네오-에피토프를 포함하는지의 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히, 환자의 종양에 특이적인 백신을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 그에 따라 개인화된 암 백신과 관련하여 사용될 수 있다.
면역 체계의 진화는 두 가지 유형의 방어, 즉 선천 및 적응 면역에 근거하여 고도로 효과적인 네트워크 내에 있는 척추 동물을 초래하였다. 병원체와 연관된 공통 분자 패턴을 인식하는 불변 수용체에 의존하는 진화하는 고대 선천 면역 체계와는 달리, 적응 면역은 B 세포 (B 림프구) 및 T 세포 (T 림프구) 및 클로날 선택에 대한 고도로 특이적인 항원 수용체에 근거한다. B 세포는 항체의 분비에 의해 체액성 면역 반응을 일으키지만, T 세포는 세포성 면역 반응을 매개하여, 인식된 세포의 파괴를 초래한다.
T 세포는 인간 및 동물에서 세포 매개 면역에 있어서 중추적인 역할을 한다. 특별한 항원의 인식 및 결합은 T 세포의 표면 상에 발현되는 T 세포 수용체에 의해 매개된다. T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자와 결합되고 표적 세포의 표면 상에 제시된 면역원성 펩티드 (에피토프)와 상호 작용할 수 있다. TCR의 특이적 결합은 T 세포 내부의 시그널 캐스케이드를 촉발시켜, 성숙된 이펙터 T 세포로의 증식 및 분화를 유발한다. 광범위한 항원을 표적으로 할 수 있으려면, T 세포 수용체가 매우 다양할 필요가 있다.
항원 특이적 면역요법은 감염성 또는 악성 질환을 제어하기 위해 환자에게서 특이적 면역 반응을 증강시키거나 또는 유도하는 것을 목표로 한다. 점점 더 많은 수의 병원체 관련 항원과 종양 관련 항원이 확인됨에 따라, 면역요법에 적합한 광범위한 표적 컬렉션이 발견되었다. 이들 항원으로부터 유래된 면역원성 펩티드 (에피토프)를 제시하는 세포는 능동 또는 수동 면역화 전략에 의해 특이적으로 표적화될 수 있다. 능동 면역화는 환자에서 항원-특이적 T 세포를 유도 및 확장시키는 경향이 있으며, 이는 이환된 세포를 특이적으로 인식하고 사멸시킬 수 있다. 대조적으로, 수동 면역화는 시험관내에서 확장되고 임의로 유전적으로 조작된 T 세포의 입양 전달에 의존한다 (입양 T 세포 요법; ACT).
종양 백신은 능동 면역화에 의해 내인성 종양 특이적 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 한다. 이환된 전체 세포, 단백질, 펩티드 또는 면역화 벡터, 예컨대 RNA, DNA 또는 바이러스 벡터를 포함한 종양 백신 접종을 위해 상이한 항원 포맷이 사용될 수 있으며, 이는 환자 내로의 전달 후 수지상 세포 (DC)의 펄싱에 의해 생체내 또는 시험관내에서 직접적으로 적용될 수 있다.
암 내에서의 체세포 돌연변이는 치료용 백신 접근법에 대한 이상적인 표적이다 (Castle, J. C. et al. Cancer Res. 72, 1081-1091 (2012); Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Science 348, 69-74 (2015); Tuereci, O. et al. Clin. Cancer Res. 22, 1885-1896 (2016)). 이는 펩티드로 프로세싱될 수 있고, 종양 세포의 표면 상에 제시될 수 있으며, T 세포에 의해 네오-에피토프로서 인식될 수 있다. 네오-에피토프는 중심 면역 관용이 면제되고 건강한 조직이 없기 때문에, 잠재적으로 강한 면역원성이 더 낮은 자가 면역 가능성과 조합된 것이다. 최근에 만들어진 데이터는 임상 면역요법, 예컨대 체크포인트 차단 (문헌 [Rizvi, N. A. et al. Science 348, 124-128 (2015); Snyder, A. et al. N. Engl. J. Med. 371, 2189-2199 (2014); Van Allen, E. M. et al. Science 350, 207-211 (2015); Le, D. T. et al. N. Engl. J. Med. 372, 2509-2520 (2015); Mcgranahan, N. et al. Science 351, 1463-1469 (2016)]) 및 입양 T-세포 요법 (문헌 [Tran, E. et al. Science 344, 641-645 (2014); Robbins, P. F. et al. Nat. Med. 19, 747-752 (2013); Tran, E. et al. N. Engl. J. Med. 375, 2255-2262 (2016)])의 유리한 임상 성과가 네오-에피토프 면역 인식과 연관이 있다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 마우스 종양 모델에서, 돌연변이체 (즉, 차세대 시퀀싱에 의해 확인된 체세포 돌연변이의 전체)의 실질적인 분율이 면역원성이라는 것과, 이들 네오-에피토프가 바람직하게 CD4+ T 세포에 의해 인식된다는 것을 입증하였다. 돌연변이체 데이터로부터 인 실리코 예측된 네오-에피토프로 구성된 백신은 강력한 항종양 활성을 보였으며, 확립되고 공격적으로 성장하는 마우스 종양의 완전한 거부를 유도하였다 (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)). 마찬가지로, 마우스 종양 모델에서 엑솜 및 전사체 분석에 의해 단독으로 또는 질량 분광분석법과 조합하여 확인된 MHC 클래스 I 네오-에피토프가, 적합한 백신 표적 및 종양 거부 항원인 것으로 여겨진다 (Yadav, M. et al. Nature 515, 572-576 (2014); Gubin, M. M. et al. Nature 515, 577-581 (2014)). 전체적으로, 이들 연구는 네오-에피토프 백신에 대한 열정을 불러 일으켰다 (Carreno, B. M. et al. Science 348, 803-808 (2015); Bobisse, S., Foukas, P. G., Coukos, G. & Harari, A. Ann. Transl. Med. 4, 262 (2016); Katsnelson, A. Nat. Med. 22, 122-124 (2016); Delamarre, L., Mellman, I. & Yadav, M. Science 348, 760-1 (2015)).
인간 암에서, 대다수의 암 돌연변이는 개별 환자마다 고유하므로, 개인화된 치료 전략이 요구된다. 각각의 환자에 대해, 개인 암 돌연변이 프로파일은 필요에 따라 제조될 개별적으로 맞춤화된 백신의 조성을 알리기 위해 심층 시퀀싱에 의해 결정될 필요가 있다.
본원에서, 본 발명자들은 병기 III 및 IV 흑색종 환자에서 이러한 개인화된 면역요법의 인간 최초의 적용을 보고한다. 본 발명자들은 일상적인 종양 생검으로부터 개별 돌연변이의 포괄적인 확인을 위한 차세대 시퀀싱, 잠재적으로 관련이 있는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 네오-에피토프의 컴퓨터를 이용한 예측뿐만 아니라 각각의 환자마다 고유한 폴리-네오-에피토프 RNA 백신의 설계 및 제작을 포함하는, 임상 개발 지침을 준수하는 프로세스를 설정하였다. 적격한 환자는 그의 개인화된 RNA 백신이 출시될 때까지 NY-ESO-1 및 티로시나제 RNA로 구성된 공유 종양 항원 백신으로 시작하였다. 총 13명의 환자가 치료를 마쳤으며, 이는 실현 가능하고 안전하며 널리 관용되고 있는 것으로 밝혀졌다. 면역원성 비율은 놀랍게도 높았다. 네오-에피토프의 60%가 백신-유도된 T 세포에 의해 특이적으로 인식되었다. 각각의 환자는 10개의 개별 신생 항원 중 적어도 3개에 반응했으며, 광범위하고 다양한 TCR 레퍼토리가 동원되었다. 백신 접종 시작 후 2주 내지 4주에 혈액 중의 네오-에피토프 특이적 T 세포의 빈도는 시험관내 확장이 검출되어야 하는 낮은 숫자에서부터 높은 한 자릿수 백분율까지의 범위였다. 백신-유도된 네오-에피토프 반응성 T 세포 및 자가 종양 세포의 네오-에피토프 특이적 사멸을 수반한 활발한 침윤이, 백신 접종 후 절제된 흑색종 전이를 동반한 2명의 환자에게서 나타났다.
모든 환자에서 누적 재발성 전이성 현상의 임상 평가 결과, 환자의 이전 병력과 비교해서 네오-에피토프 RNA 백신 접종시 상당히 유의미한 감소가 나타나서, 질환 진행이 없는 생존을 지속하면서 매우 유리한 임상 성과를 일으킨 것으로 밝혀졌다. 신속한 종양 진행으로 인해 네오-에피토프 백신으로 단시간에 치료된 다발성 전이를 동반한 1명의 환자는 후속 PD-1 차단에 거의 즉각적으로 반응하였고, 완전한 반응을 경험하였다. 직접적인 네오-에피토프 백신 치료 관련 객관적 종양 퇴행이 2명의 환자에게서 확인되었다. 이들 환자 중 1명은 진행성 전이에 대한 완전한 반응을 보였으며 26개월 동안 지속적인 질환 제어를 유지하였다. 두 번째 환자는 객관적인 종양 반응을 경험하였지만, 폴리-특이적이고, 완전하게 기능적인 신생 항원 반응성 T 세포의 존재에도 불구하고 늦게 재발하였다.
면역요법에 적합한 에피토프의 정의는 여전히 도전 과제이다. 따라서, 에피토프, 특히 네오-에피토프가 면역요법에 유용할 것인지의 여부를 예측하기 위한 모델이 필요하다.
네오-에피토프 특이적 반응의 하위 유형 분류는 본 발명자들의 면역원성 네오-에피토프의 높은 빈도의 CD4+ T-세포 매개된 인식의 이전 발견을 확증시켜 주었을 뿐만 아니라 (문헌 [Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)]), 백신에 사용된 네오-에피토프의 4분의 1에 대항한 CD8+ T-세포 반응을 보여주었다. 돌연변이에 대항한 CD4+ 반응의 우세는 펩티드 리간드의 조성 및 길이와 관련하여 HLA 클래스 II 분자의 높은 무차별성에 의해 설명될 수 있는 반면, 고도로 특이적인 HLA 클래스 I 분자는 협소한 길이 분포의 제한된 세트의 펩티드와 결합한다 (Arnold, P. Y. et al. J. Immunol. 169, 739-49 (2002)). 상기 관찰된 CTL 반응의 약 3분의 2는 각각의 네오-에피토프의 상이한 위치에 대항하여 반응하는 CD4+ T 세포에 의해 부수적으로 인식된 돌연변이에 대항하여 유도되었다. 백신 내로 포함된 모든 네오-에피토프의 50%가 CD4+ T-세포 반응을 나타냈기 때문에, 상기 관찰된 연결은 CD4+ 및 CD8 네오-에피토프 면역 반응의 순수한 동시 발생이 아닐 가능성이 높다. 헬퍼 에피토프에 공유적으로 연결되는 CTL 에피토프는 더 면역원성인 것으로 공지되어 있다 (Shirai, M. et al. J. Immunol. 152, 549-556 (1994)). HLA 클래스 I 뿐만 아니라 클래스 II 네오-에피토프를 보유하는 돌연변이는, CD4+ T 세포가 CD8+ T 세포 네오-에피토프를 교차 제시하는 DC 상의 그의 리간드를 인식하고 CD40L 매개된 DC 활성화에 의한 동족 T 세포 도움을 제공하기 때문에 CTL 프라이밍에 대해 기계적으로 유리한 조건을 제공한다 (Schoenberger, S. P., Toes, R. E., van der Voort, E. I., Offringa, R. & Melief, C. J. Nature 393, 480-3 (1998)). 연관된 맥락에서, 본 발명자들은 또한, 하나의 동일한 돌연변이가 상이한 HLA 클래스 I 제한 요소 상에 제시되고 독립적인 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 네오-에피토프를 유발시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다 (도 3b). 마찬가지로, 본 발명자들은 하나의 동일한 에피토프/제한 요소 복합체가 상이한 TCR 클로노타입을 가진 네오-에피토프 특이적 T 세포에 의해 인식된다는 것을 밝혀내었다. 이러한 발견은 돌연변이 특이적 T 세포의 예상치 못하게 넓은 레퍼토리가 네오-에피토프 백신 접종에 의해 동원될 수 있고 각각의 단일 돌연변이가 다양한 T-세포 특이성을 활용한다는 것을 예시한다.
요약하면, 본원에 제시된 발견은 적합한 개인화된 네오-에피토프 백신, 특히 개인화된 RNA 네오-에피토프 백신의 정의가 암 환자에서 광범위한 신생 항원 특이 적 T-세포 레퍼토리를 펼칠 수 있어서 그들의 돌연변이체의 유효한 표적화를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
본 발명의 한 측면은 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자, 바람직하게 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상이한 T 세포 수용체는 상이한 클로노타입의 것이다. 한 실시양태에서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자는 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포는 상이한 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자, 바람직하게 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계,
(ii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및/또는
(iii) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계.
한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 상이한 T 세포 수용체는 상이한 클로노타입의 것이다. 한 실시양태에서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자는 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포는 상이한 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자, 바람직하게 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계.
한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계.
한 실시양태에서, 상이한 T 세포 수용체는 상이한 클로노타입의 것이다. 한 실시양태에서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계.
한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자는 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포는 상이한 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 하기:
(1) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자, 바람직하게 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계,
(2) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및/또는
(3) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계
중 하나 이상을 확인하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계.
한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 상이한 T 세포 수용체는 상이한 클로노타입의 것이다. 한 실시양태에서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자는 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포는 상이한 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성은, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타낸다.
한 실시양태에서, 단계 (ii)에서 시험된 상이한 아미노산 변형은 동일하고/하거나 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드에 존재한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ii)에서 시험된 상이한 아미노산 변형에 대해 수득된 스코어를 비교하는 것을 포함한다.
본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 질환 특이적 아미노산 변형(들)은 질환 특이적 체세포 돌연변이(들)에 기인한다. 본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 질환은 암이고, 면역요법은 항암 면역요법이다. 본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 면역요법은 하기 중 하나 이상의 투여를 포함한다:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 펩티드 또는 폴리펩티드,
(ii) (i) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 단편이 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및
(iii) (i) 또는 (ii) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산. 본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 백신을 제공하는 데 유용하다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 백신을 제공하는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 확인하는 단계, 및
(ii) 하기:
(1) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인 펩티드 또는 폴리펩티드,
(2) (i) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 단편이 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및
(3) (i) 또는 (ii) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
중 하나 이상을 포함하는 백신을 제공하는 단계.
본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 상기 단편은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드이거나, 또는 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드를 제공하도록 프로세싱될 수 있다 (예를 들어, MHC 결합 예측은 상기 단편이 MHC와 결합할 것이라는 것을 나타낸다).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 따라 생산된 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제공된 백신은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 하나 이상의 아주반트, 안정화제 등을 임의로 포함할 수 있다. 백신은 치료용 또는 예방용 백신의 형태일 수 있다.
본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 면역요법을 위한 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성의 표시는, 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 (임의로, 코딩 핵산의 포맷으로) 투여 시 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 에피토프 또는 백신 서열이 면역 반응을 유도할 것이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 아미노산 변형은 하나 이상의 코딩 영역 내의 비-동의 돌연변이를 확인함으로써 확인된다. 한 실시양태에서, 아미노산 변형은 하나 이상의 세포, 예컨대 하나 이상의 암 세포 및 임의로 하나 이상의 비-암성 세포의 게놈 또는 전사체를 부분적으로 또는 완전히 시퀀싱하고, 하나 이상의 코딩 영역 내의 돌연변이를 확인함으로써 확인된다. 한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 체세포 돌연변이이다. 한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 암 돌연변이이다.
본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 특히 환자, 예컨대 암 환자에 대한 개인화된 백신을 제공하기 위해, 상기 변형(들)은 상기 환자에 존재하고, 본 발명의 방법은 상기 환자에 대해 수행된다.
본 발명의 또 다른 측면은 특정 환자에게 본 발명에 따라 제공된 백신을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은:
(a) 본 발명에 따른 방법을 사용하여 백신을 제공하는 단계; 및
(b) 이러한 백신을 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 환자는 암 환자이고, 백신은 항암 백신, 예컨대 그의 투여가 암 특이적 네오-에피토프를 제공하는 백신이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한, 특히 암을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 백신을 제공한다.
본원에 기재된 암의 치료는 외과적 절제 및/또는 방사선 및/또는 전통적 화학 요법과 조합될 수 있다.
본 발명은 또한, 하기에 관한 것이다:
1. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
2. 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자인, 항목 1의 방법.
3. 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 1 또는 2의 방법.
4. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.
5. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
6. 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 항목 4 또는 5의 방법.
7. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와의 T 세포 반응성이 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 4 내지 6 중 어느 하나의 방법.
8. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
9. 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인, 항목 8의 방법.
10. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편에 대한 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 8 또는 9의 방법.
11. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
12. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 11의 방법.
13. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 11 또는 12의 방법.
14. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 11 내지 13 중 어느 하나의 방법.
15. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
16. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 14 또는 15의 방법.
17. 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인, 항목 14 내지 16 중 어느 하나의 방법.
18. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 14 내지 17 중 어느 하나의 방법.
19. 하기 단계:
(i) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계,
(ii) MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계,
(iii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계,
(iv) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계, 및
(v) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계
중 하나 이상을 포함하는, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 방법.
20. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고, MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 항목 19의 방법.
21. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 항목 19 또는 20의 방법.
22. 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자인, 항목 19 내지 21 중 어느 하나의 방법.
23. 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 항목 19 내지 22 중 어느 하나의 방법.
24. 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 19 내지 23 중 어느 하나의 방법.
25. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 19 내지 24 중 어느 하나의 방법.
26. 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인, 항목 19 내지 25 중 어느 하나의 방법.
27. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편에 대한 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 19 내지 26 중 어느 하나의 방법.
28. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 19 내지 27 중 어느 하나의 방법.
29. 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인, 항목 19 내지 28 중 어느 하나의 방법.
30. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 19 내지 29 중 어느 하나의 방법.
31. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 19 내지 30 중 어느 하나의 방법.
32. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
33. 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자인, 항목 32의 방법.
34. 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 32 또는 33의 방법.
35. 단계 (ii)가, MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인, 항목 32 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
37. 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 항목 35 또는 36의 방법.
38. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 35 내지 37 중 어느 하나의 방법.
39. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
40. 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인, 항목 39의 방법.
41. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편에 대한 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 39 또는 40의 방법.
42. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
43. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 42의 방법.
44. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 42 또는 43의 방법.
45. 단계 (ii)가, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인, 항목 42 내지 44 중 어느 하나의 방법.
46. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
47. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 46의 방법.
48. 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인, 항목 45 내지 47 중 어느 하나의 방법.
49. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 45 내지 48 중 어느 하나의 방법.
50. 하기 단계:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) 하기 단계:
(1) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계,
(2) MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계,
(3) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계,
(4) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되는지의 여부를 결정하는 단계, 및
(5) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 단계
중 하나 이상을 포함하는 단계, 및
(iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
51. 단계 (ii)가, 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고, MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인, 항목 50의 방법.
52. 단계 (ii)가, 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인, 항목 50 또는 51의 방법.
53. 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자인, 항목 50 내지 52 중 어느 하나의 방법.
54. 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 항목 50 내지 53 중 어느 하나의 방법.
55. 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 50 내지 54 중 어느 하나의 방법.
56. MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 방법.
57. 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인, 항목 50 내지 56 중 어느 하나의 방법.
58. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편에 대한 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 50 내지 57 중 어느 하나의 방법.
59. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자인, 항목 50 내지 58 중 어느 하나의 방법.
60. 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인, 항목 50 내지 59 중 어느 하나의 방법.
61. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시가, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 50 내지 60 중 어느 하나의 방법.
62. 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편에 대한 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와의 T 세포 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인, 항목 50 내지 61 중 어느 하나의 방법.
63. 단계 (ii)에서 시험된 아미노산 변형이 동일한 폴리펩티드에 존재하는 것인, 항목 32 내지 62 중 어느 하나의 방법.
64. 단계 (ii)에서 시험된 아미노산 변형이 상이한 폴리펩티드에 존재하는 것인, 항목 32 내지 63 중 어느 하나의 방법.
65. 단계 (ii)에서 시험된 상이한 아미노산 변형에 대하여 수득된 스코어를 비교하는 것을 포함하는, 항목 32 내지 64 중 어느 하나의 방법.
66. 질환 특이적 아미노산 변형(들)이 질환 특이적 체세포 돌연변이(들)에 기인하는 것인, 항목 1 내지 65 중 어느 하나의 방법.
67. 질환이 암이고, 면역요법이 항암 면역요법인, 항목 1 내지 66 중 어느 하나의 방법.
68. 면역요법이 하기:
(i) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드이며, 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 폴리펩티드,
(ii) (i) 하의 폴리펩티드의 단편을 포함하는 폴리펩티드이며, 단편이 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인, 폴리펩티드, 및
(iii) (i) 또는 (ii) 하의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
중 하나 이상의 투여를 포함하는 것인, 항목 1 내지 67 중 어느 하나의 방법.
69. 백신을 제공하는 데 유용한, 항목 1 내지 68 중 어느 하나의 방법.
70. (i) 항목 1 내지 69 중 어느 하나의 방법에 의해 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 확인하는 단계, 및
(ii) 하기:
(1) 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드이며, 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인 폴리펩티드,
(2) (i) 하의 폴리펩티드의 단편을 포함하는 폴리펩티드이며, 단편이 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 폴리펩티드, 및
(3) (i) 또는 (ii) 하의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
중 하나 이상을 포함하는 백신을 제공하는 단계
를 포함하는, 백신을 제공하는 방법.
71. 단편이 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드이거나, 또는 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드를 제공하도록 프로세싱될 수 있는 것인, 항목 1 내지 70 중 어느 하나의 방법.
72. 항목 69 내지 71 중 어느 하나의 방법에 따라 생산된 백신.
73. 항목 1 내지 68 중 어느 하나의 방법에 따라 확인된 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
74. 상기 면역원성 조성물이 백신인, 항목 73의 방법.
본 발명의 다른 특색 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명이 이하에서 상세하게 설명되지만, 본 발명은 본원에 기재된 특별한 방법론, 프로토콜 및 시약이 변할 수 있기 때문에, 이에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특별한 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니라는 것을 이해해야 하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
하기에서, 본 발명의 요소가 기재될 것이다. 이들 요소는 구체적 실시양태와 함께 열거되지만, 부가의 실시양태를 창출하기 위해 임의의 방식으로 및 임의의 수로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 명시적으로 기재된 실시양태로만 제한하도록 해석되서는 안된다. 본 설명은 명시적으로 기재된 실시양태를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 조합하는 실시양태를 지원하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에서 기재된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게, 본원에 사용된 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기재된 바와 같이 정의된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 관련 분야의 문헌에 설명되는 통상적인 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술 방법을 이용할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기 청구범위에 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다", 및 변형, 예컨대 "포함하는"은 언급된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하지만, 일부 실시양태에서 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군을 배제할 수 있긴 하지만 (즉, 그 주제가 언급된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 포함으로 이루어진다), 이러한 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하지 않는다는 것으로 이해될 것이다. 본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 청구범위의 맥락에서) 사용된 단수 용어 및 유사한 언급 대상은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수와 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 나열은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 제공되도록 의도된다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 마치 본원에서 개별적으로 나열된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되서는 안된다.
본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 몇 가지 문서가 인용되어 있다. 본원에 인용된 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 설명서 등 포함)은 위에 기재되든지 아니면 아래에 기재되든지 간에, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해서 상기 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명은 이환된 세포에 존재하는 단백질 또는 단백질 단편을, 이환된 세포에 대한 표지로서 활용하고 이환된 세포를 표적화하는 것으로 활용함으로써, 질환, 특히 암 질환의 면역요법을 계획한다. 특히, 이환된 세포는 MHC의 맥락에서 이환된 세포의 표면 상에 제시된 단백질의 단편을 표적화함으로써 표적화될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 질환 특이적 아미노산 변형을 규정하는 것을 목표로 하며, 그러한 변형은 면역요법에 적합한 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편 내에 위치한다. 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 상기 단편은 면역요법에 적합하고, 특히 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 발현하는 이환된 세포에 대항하여 효율적인 세포성 면역 반응을 유도하기에 적합한 네오-에피토프이거나 또는 이를 포함한다. 일단 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 적합한 단편이 확인되면, 이러한 단편 (임의로 더 큰 폴리펩티드의 부분으로서) 또는 이러한 단편을 코딩하는 핵산 (임의로 더 큰 폴리펩티드의 부분으로서)이, 특히 적절한 이펙터 세포, 예컨대 MHC의 맥락에서 제시될 때 상기 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 인식하는 T 세포를 유도하고/하거나 활성화시킴으로써, 그로부터 단편이 유래되는 상기 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대항하여 면역 반응을 증강 또는 유도시키기 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하고 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드가 또한, 본원에서 "신생 항원"으로 일컬어지기도 한다. 더욱이, 본 발명에 따르면, 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하고, 면역 체계에 의해 인식되며, 예를 들어, 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 T 세포에 의해 인식되고, 바람직하게 면역요법에 유용할 것으로 본 발명의 방법에 의해 결정된 신생 항원의 단편 (임의로 더 큰 폴리펩티드의 부분으로서, 예를 들어 신생 항원 또는 인공 펩티드 또는 폴리펩티드의 부분으로서, 예를 들어, 면역요법에 유용할 것으로 본 발명의 방법에 의해 결정된 네오-에피토프 중, 예를 들어, 2개 이상을 포함하는 다중-에피토프 폴리펩티드의 부분으로서)이 본원에서 "네오-에피토프"로 일컬어지기도 한다.
본 발명에 따르면, 질환 특이적 아미노산 변형은 바람직하게, 하나 이상의 질환 특이적 체세포 돌연변이에 기인한다. 하나의 특히 바람직한 실시양태에서, 질환 특이적 아미노산 변형은 암 특이적 아미노산 변형이고, 질환 특이적 체세포 돌연변이는 암 특이적 체세포 돌연변이이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 백신은 바람직하게, 환자의 질환 특이적 아미노산 변형/질환 특이적 체세포 돌연변이를 특색으로 하고, 바람직하게 투여 시 하나 이상의 돌연변이 기반 네오-에피토프를 제공한다. 따라서, 백신은 하나 이상의 돌연변이 기반 네오-에피토프를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 질환 특이적 아미노산 변형은 질환 특이적 체세포 돌연변이를 확인함으로써, 예를 들어 이환된 조직 또는 하나 이상의 이환된 세포의 게놈 DNA 및/또는 RNA를 시퀀싱함으로써 확인된다.
본 발명에 따르면, 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2개 이상, 바람직하게 3개 이상, 바람직하게 4개 이상, 바람직하게 6개 이상, 바람직하게 8개 이상, 바람직하게 10개 이상, 바람직하게 13개 이상, 바람직하게 16개 이상, 바람직하게 21개 이상 및 바람직하게 8, 10, 20, 30, 40 또는 50개 이하, 특히 100개 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게 100개 초과의 아미노산 잔기를 수반한 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동의어이고, 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "질환 특이적 아미노산 변형"은 이환된 세포의 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에는 존재하지만, 상응하는 정상, 즉 이환되지 않은 세포의 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에는 부재하는 아미노산 변형을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양 특이적 아미노산 변형" 또는 "암 특이적 아미노산 변형"은 종양 또는 암 세포의 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에는 존재하지만, 상응하는 정상, 즉 비-종양성 또는 비-암성 세포의 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에는 부재하는 아미노산 변형을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 용어 "변형"은 모 서열, 예컨대 야생형 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열과 비교해서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 있어서의 서열 변화를 지칭한다. 상기 용어는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및 아미노산 치환 변이체, 바람직하게 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 이들 모든 서열 변화는 잠재적으로, 새로운 에피토프를 창출할 수 있다.
아미노산 삽입 변이체는 특별한 아미노산 서열 내의 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.
아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개, 또는 그 초과의 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개, 또는 그 초과의 아미노산의 제거를 특징으로 한다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 위치에 또 다른 잔기가 삽입되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 질환 특이적 아미노산 변형, 또는 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 단편, 예컨대 에피토프 또는 백신 서열은 이러한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다.
용어 "유래된"은 본 발명에 따라, 특별한 실체, 예컨대 특별한 아미노산 서열이, 그것이 유래된 대상에 존재한다는 것을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특별한 서열 영역의 경우, 특히 "유래된"은 관련 아미노산 서열이 존재하는 아미노산 서열로부터 그러한 관련 아미노산 서열이 유래된다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형은 펩티드 또는 폴리펩티드의 에피토프 또는 잠재적 에피토프 내에 위치한다. 따라서, 본원에 기재된 바람직한 펩티드 또는 폴리펩티드는, 바람직하게 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 신생 항원이다. 유사하게, 본원에 기재된 바람직한 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이며, 여기서 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형이 상기 단편 내에 위치한다. 따라서, 본원에 기재된 바람직한 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 네오-에피토프이다.
본 발명에 따르면, 용어 "질환 특이적 돌연변이"는 이환된 세포의 핵산에는 존재하지만, 상응하는 정상, 즉 이환되지 않은 세포의 핵산에는 부재하는 체세포 돌연변이에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양 특이적 돌연변이" 또는 "암 특이적 돌연변이"는 종양 또는 암 세포의 핵산에는 존재하지만, 상응하는 정상, 즉 비-종양성 또는 비-암성 세포의 핵산에는 부재하는 체세포 돌연변이에 관한 것이다. 용어 "종양 특이적 돌연변이" 및 "종양 돌연변이" 및 용어 "암 특이적 돌연변이" 및 "암 돌연변이"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
용어 "면역 반응"은 면역 체계의 반응에 관한 것이다. 용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응 및 적응 면역 반응을 포함한다. 바람직하게, 면역 반응은 면역 세포의 활성화와 관계가 있고, 더 바람직하게, 세포성 면역 반응과 관계가 있다.
본원에 기재된 조성물에 의해 유도된 면역 반응이 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포 및/또는 대식 세포의 활성화 단계, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 그의 단편의 제시 단계 및 이러한 제시에 기인한 세포 독성 T 세포의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
"면역 반응을 유도하는 것"은 유도 전에는 면역 반응이 없었다는 것을 의미할 수 있지만, 유도 전 및 유도 후 상기 면역 반응이 증강된 특정 수준의 면역 반응이 있었다는 것을 의미할 수도 있다. 따라서, "면역 반응을 유도하는 것"은 또한, "면역 반응을 증강시키는 것"을 포함한다. 바람직하게는, 대상체에서 면역 반응을 유도한 후, 상기 대상체는 질환, 예컨대 암 질환의 발생으로부터 보호되거나, 또는 질환 상태가 면역 반응을 유도함으로써 완화된다. 예를 들어, 종양-발현된 항원에 대항한 면역 반응은 암 질환이 있는 환자 또는 암 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에서 유도될 수 있다. 이러한 경우에 면역 반응을 유도한다는 것은 대상체의 질환 상태가 완화되거나, 대상체에게 전이가 발생하지 않거나, 또는 암 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 암 질환이 발생하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "세포성 면역 반응" 및 "세포성 반응" 또는 유사한 용어는 "헬퍼" 또는 "킬러"로서 작용하는 T 세포 또는 T-림프구를 수반한 클래스 I 또는 클래스 II MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 면역 반응을 지칭한다. 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로 일컬어지기도 함)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 하며 킬러 세포 (세포 독성 T 세포, 세포 용해 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로 일컬어지기도 함)는 이환된 세포, 예컨대 암 세포를 사멸시켜, 더 많은 이환된 세포의 생산을 방지한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 질환 관련 항원을 발현하고 바람직하게 이러한 질환 관련 항원을 클래스 I MHC로 제시하는 이환된 세포에 대항한 항-질환 CTL 반응, 특히 하나 이상의 종양-발현된 항원을 발현하고 바람직하게 이러한 종양-발현된 항원을 클래스 I MHC로 제시하는 종양 세포에 대항한 항-종양 CTL 반응의 자극을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 면역 반응의 표적이고/이거나 면역 반응을 이끌어낼 것인 임의의 물질, 바람직하게 펩티드 또는 폴리펩티드를 포괄한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구 (T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 용어 "항원"은 적어도 하나의 에피토프, 예컨대 T 세포 에피토프를 포함하는 분자를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 항원은 임의로 프로세싱 후 면역 반응을 유도하는 분자이며, 바람직하게 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포에 특이적이다. 본 발명의 실시양태의 맥락에서, 항원은 바람직하게, 세포, 바람직하게 MHC 분자의 맥락에서 항원 제시 세포에 의해 제시되며, 이는 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포에 대항한 면역 반응을 초래한다.
용어 "질환 관련 항원"은 질환과 연관된 임의의 항원을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 한 실시양태에서, 질환 관련 항원은 숙주의 면역 체계를 자극하여 이환된 세포에 대항한 세포성 면역 반응을 일으키는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서, 질환 관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질환 관련 항원은 암, 전형적으로 종양과 연관될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "신생 항원"은 모 펩티드 또는 폴리펩티드와 비교해서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 신생 항원은 종양 관련 신생 항원일 수 있으며, 여기서 용어 "종양 관련 신생 항원"은 종양 특이적 돌연변이에 기인한 아미노산 변형을 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉 면역 체계에 의해 인식되는, 예를 들어, 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 T 세포에 의해 인식되는 항원의 부분 또는 단편을 지칭한다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 에피토프는 바람직하게, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 바람직하게 5 내지 100개, 바람직하게 5 내지 50개, 더 바람직하게 8 내지 30개, 가장 바람직하게 10 내지 25개 아미노산 길이이며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 한 실시양태에서, 에피토프는 MHC 분자, 예컨대 세포의 표면 상의 MHC 분자와 결합할 수 있고, 임의로 T 세포 수용체, 예컨대 T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체에 의해 인식될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 에피토프는 "MHC 결합 펩티드"이고, 더 바람직하게 "T 세포 에피토프"이다.
용어 "주요 조직 적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고 모든 척추 동물에 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 이환된 세포 간의 시그널링에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드와 결합하여 T 세포 수용체에 의해 인식되도록 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포의 표면 상에 발현되고, 자기 항원 (세포 자체로부터의 펩티드 단편)과 비-자기 항원 (예를 들어, 침입 미생물의 단편) 둘 다를 T 세포에 디스플레이한다.
MHC 영역은 3가지 하위 군, 즉 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III으로 나누어진다. MHC 클래스 I 단백질은 α-쇄 및 β2-마이크로 글로불린 (염색체 15에 의해 코딩된 MHC의 부분이 아님)을 함유한다. 이들은 세포 독성 T 세포에 항원 단편을 제시한다. 대부분의 면역 체계 세포, 구체적으로 항원-제시 세포 상에서, MHC 클래스 II 단백질은 α- 및 β-쇄를 함유하며, T-헬퍼 세포에 항원 단편을 제시한다. MHC 클래스 III 영역은 다른 면역 성분, 예컨대 보체 성분 및 시토카인을 코딩하는 일부 성분을 코딩한다.
MHC는 다유전자성 (여러 개의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 유전자가 있음) 및 다형성 (각각의 유전자의 다수의 대립 유전자가 있음) 둘 다이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "일배체형"은 하나의 염색체에서 발견된 MHC 대립 유전자 및 이에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. 일배체형은 또한, MHC 내의 어느 하나의 유전자 자리에 존재하는 대립 유전자를 지칭할 수 있다. MHC의 각각의 클래스는 여러 유전자 자리로써 나타낸다: 예를 들어, 클래스 I의 경우에는 HLA-A (인간 백혈구 항원-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P 및 HLA-V로써 나타내고, 클래스 II의 경우에는 HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 , HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로써 나타낸다. 용어 "HLA 대립 유전자" 및 "MHC 대립 유전자"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
MHC는 극도의 다형성을 나타낸다: 인간 집단 내에, 각각의 유전적 유전자 자리에는 별개의 대립 유전자를 포함하는 다수의 일배체형이 존재한다. 클래스 I과 클래스 II 둘 다의 상이한 다형성 MHC 대립 유전자는 상이한 펩티드 특이성을 갖는다: 각각의 대립 유전자는 특별한 서열 패턴을 나타내는 펩티드와 결합하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 모든 측면의 하나의 바람직한 실시양태에서, MHC 분자는 HLA 분자이다.
본원에 사용된 바와 같은, 펩티드 또는 에피토프가 MHC 분자와 결합하는 경우, 이러한 펩티드 또는 에피토프는 "MHC 분자의 맥락에서 제시된다"고 한다. 이러한 결합은 관련 기술분야에 공지된 임의의 검정을 사용하여 검출될 수 있다. 용어 "MHC 결합 펩티드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자와 결합하는 펩티드에 관한 것이다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 8 내지 10개 아미노산 길이이지만, 더 길거나 더 짧은 펩티드가 유효할 수 있다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 10 내지 25개 아미노산 길이이고, 특히 13 내지 18개 아미노산 길이인 반면, 더 길고 더 짧은 펩티드가 유효할 수 있다. 본 발명의 모든 측면의 하나의 바람직한 실시양태에서, MHC 분자는 HLA 분자이다.
펩티드 또는 에피토프가 부가의 서열을 포함하는 더 큰 실체, 예를 들어 백신 서열 또는 폴리펩티드의 부분이고, 프로세싱 후, 특히 절단 후에 제시되어야 하는 경우, 프로세싱에 의해 생산된 펩티드 또는 에피토프는 MHC 분자와 결합하기에 적합한 길이를 갖는다. 바람직하게, 프로세싱 후에 제시되어야 하는 펩티드 또는 에피토프의 서열은, 백신 접종을 위해 사용되는 항원 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 유래되는데, 즉 그의 서열은 상기 항원 또는 폴리펩티드의 단편과 실질적으로 상응하고 바람직하게는 완전히 동일하다.
따라서, MHC 결합 펩티드는 한 실시양태에서, 항원의 단편과 실질적으로 상응하고 바람직하게는 완전히 동일한 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "네오-에피토프"는 참조, 예컨대 이환되지 않은 정상적인 (예를 들어, 비-암성) 세포 또는 생식세포 계열 세포에는 존재하지 않지만, 이환된 세포 (예를 들어, 암 세포)에서 발견되는 에피토프를 포함한다. 이는 특히, 이환되지 않은 정상적인 세포 또는 생식세포 계열 세포에서 상응하는 에피토프가 발견되는 상황을 포함하지만, 이환된 세포에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해, 에피토프의 서열이 변화되어 네오-에피토프를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포 에피토프"는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 입체 배치로 MHC 분자와 결합하는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, T 세포 에피토프는 항원 제시 세포의 표면 상에 존재한다. 본 발명에 따른 T 세포 에피토프는 바람직하게, 면역 반응, 바람직하게 항원 또는 이러한 항원의 발현 및 바람직하게 항원의 제시를 특징으로 하는 세포, 예컨대 이환된 세포, 특히 암 세포에 대항한 세포성 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부분 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게, T 세포 에피토프는 클래스 I MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대항한 세포성 반응을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원-감응성 세포 독성 T-림프구 (CTL)를 자극할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 표적 유기체의 백신 접종에 적합한 하나 이상의 네오-에피토프를 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 면역 생물학 및 백신 접종의 원리 중 하나가, 치료하고자 하는 질환에 대하여 면역학적으로 관련이 있는 백신으로 유기체를 면역화함으로써 질환에 대한 면역 보호 반응이 야기된다는 사실에 근거한다는 것을 알 것이다. 본 발명에 따르면, 항원은 바람직하게 자기 항원이다.
용어 "면역원성"은, 바람직하게 치료적 처치, 예컨대 암에 대항한 처치와 연관되는 면역 반응을 유도하기 위한 상대적 효과에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역원성의"는 면역원성을 갖는 특성에 관한 것이다. 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때 용어 "면역원성의 변형"은 상기 변형에 의해 유발되고/되거나 상기 변형에 대항하여 유도되는 면역 반응을 유도하기 위한 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효과에 관한 것이다. 바람직하게, 비-변형된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 면역 반응을 유도하지 않거나, 상이한 면역 반응을 유도하거나, 또는 상이한 수준, 바람직하게 더 낮은 수준의 면역 반응을 유도한다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역원성" 또는 "면역원성의"는 바람직하게, 생물학적으로 관련된 면역 반응, 특히 백신 접종에 유용한 면역 반응을 유도하기 위한 상대적 효과에 관한 것이다. 따라서, 하나의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드는 대상체에서 표적 변형에 대항한 면역 반응을 유도하는 경우에 면역원성이며, 이러한 면역 반응은 치료 또는 예방 목적에 유리할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역요법을 위한 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 것" 또는 "질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용한지의 여부를 예측하는 것"은 질환 특이적 아미노산 변형, 특히 이러한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원 또는 상기 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원의 단편, 예컨대 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 에피토프, 특히 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원의 단편이, 면역 반응을 유도하거나 또는 면역 반응을 표적으로 하는 데 유용할 것인지의 여부를 예측하는 것을 지칭한다. 용어 "면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형" 또는 유사한 용어는 질환 특이적 아미노산 변형, 특히 이러한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원 또는 상기 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원의 단편, 예컨대 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 에피토프, 특히 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원의 단편이, 면역 반응을 유도하거나 또는 면역 반응을 표적으로 하는 데 유용한 것으로 예측되었다는 사실을 지칭한다. 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 경우, 예를 들어, 이러한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원 또는 상기 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 항원의 단편, 예컨대 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 에피토프, 특히 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원의 단편이 백신 접종에 사용되거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신을 설계하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 에피토프, 예컨대 T 세포 에피토프는 더 큰 실체의 부분으로서, 예컨대 2개 이상의 에피토프를 포함하는 백신 서열 및/또는 폴리펩티드로서 백신에 존재할 수 있다. 이와 같이 제시된 펩티드 또는 에피토프는 적합한 프로세싱 후에 생산된다. 또한, 에피토프는 MHC와의 결합 또는 TCR 인식에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 변형될 수 있다. 이러한 변형된 에피토프는 면역학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게, MHC에 의해 제시되고 T 세포 수용체에 의해 인식될 때 에피토프는 적절한 공동 자극 시그널의 존재하에, 펩티드/MHC-복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 운반하는 T 세포의 클로날 확장을 유도할 수 있다. 바람직하게, 에피토프는 항원의 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 항원의 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이다.
"항원 프로세싱" 또는 "프로세싱"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 분해하여 프로세션(procession) 산물 (이는 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단편이다)로 만드는 것 (예를 들어, 폴리펩티드가 펩티드로 분해되는 것) 및 세포, 바람직하게 항원 제시 세포에 의한 특이적 T 세포에의 제시를 위해 이들 단편 중 하나 이상을 MHC 분자와 연합시키는 것 (예를 들어, 결합을 통함)을 지칭한다.
"항원 제시 세포" (APC)는 세포 표면 상에 MHC 분자와 연합하여 단백질 항원의 펩티드 단편을 제시하는 세포이다. 일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
전문적인 항원 제시 세포는 식균 작용 또는 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 항원을 내재화한 다음, 그의 막에 클래스 II MHC 분자와 결합된 항원의 단편을 디스플레이하는 데 매우 효율적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막에서 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고 이와 상호 작용한다. 이어서, 항원 제시 세포에 의해 부가의 공동 자극 시그널이 생성되어 T 세포의 활성화로 이어진다. 공동 자극 분자의 발현은 전문적인 항원 제시 세포의 정의적 세부 특징이다.
전문적인 항원 제시 세포의 주요 유형은 수지상 세포이며, 이는 가장 광범위한 항원 제시를 가지며 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포, 대식 세포, B-세포 및 특정의 활성화된 상피 세포이다. 수지상 세포 (DC)는 말초 조직에서 포획된 항원을 MHC 클래스 II와 I 항원 제시 경로 둘 다를 통해 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포는 면역 반응의 강력한 유도인자이며, 이들 세포의 활성화는 항종양 면역의 유도에 중요한 단계인 것으로 널리 공지되어 있다. 수지상 세포는 편리하게, "미숙한" 세포 및 "성숙한" 세포로서 분류되며, 이는 널리 규명된 2가지 표현형을 구별하기 위한 간단한 방식으로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 명명법이 가능한 모든 분화의 중간 단계를 배제하도록 해석되서는 안된다. 미숙한 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관이 있는 항원 흡수 및 프로세싱을 위한 높은 용량을 갖는 항원 제시 세포로서 그 특징이 규명된다. 성숙한 표현형은 전형적으로, 이들 마커의 더 낮은 발현을 특징으로 하지만, T 세포 활성화에 책임이 있는 세포 표면 분자, 예컨대 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접착 분자 (예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동 자극 분자 (예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)의 높은 발현을 나타낸다. 수지상 세포 성숙은 이러한 항원 제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍을 야기하는 수지상 세포 활성화의 상태로서 지칭되는 반면, 미숙한 수지상 세포에 의한 제시는 면역 관용을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 주로, 선천성 수용체 (박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 염증 유발성 시토카인 (TNF, IL-1, IFN), CD40L에 의한 수지상 세포 표면 상에서의 CD40의 라이게이션, 및 스트레스가 많은 세포 사멸을 겪고 있는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출된 미생물 특징을 수반한 생체 분자에 의해 유발된다. 수지상 세포는 시토카인, 예컨대 과립구-대식 세포 집락 자극 인자 (GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 함께 시험관내에서 골수 세포를 배양함으로써 유래될 수 있다.
비-전문적인 항원 제시 세포는 나이브(naive) T 세포와의 상호 작용에 필요한 MHC 클래스 II 단백질을 구성적으로 발현하지 않으며; 이들은 특정 시토카인, 예컨대 IFNγ에 의해 비-전문적인 항원 제시 세포의 자극 시에만 발현된다.
"항원의 제시를 특징으로 하는 세포" 또는 "항원을 제시하는 세포" 또는 유사한 표현은 세포, 예컨대 이환된 세포, 예를 들어 암 세포, 또는 예를 들어, MHC 분자, 특히 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서, 항원의 프로세싱에 의해, 항원 또는 이러한 항원으로부터 유래된 단편을 제시하는 항원 제시 세포를 의미한다. 유사하게, 용어 "항원의 제시를 특징으로 하는 질환"은 특히 클래스 I MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포와 관련된 질환을 의미한다. 세포에 의한 항원의 제시는 세포를, 항원을 코딩하는 핵산, 예컨대 RNA로 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다.
"제시되는 항원의 단편" 또는 유사한 표현은, 그러한 단편이, 예를 들어 항원 제시 세포에 직접적으로 부가될 때 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 바람직하게는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 단편은 항원을 발현하는 세포에 의해 자연적으로 제시되는 단편이다.
"표적 세포"는 면역 반응, 예컨대 세포성 면역 반응에 대한 표적인 세포를 의미한다. 표적 세포는 항원, 즉 항원으로부터 유래된 펩티드 단편을 제시하는 세포를 포함하고, 임의의 바람직하지 않은 세포, 예컨대 암 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 본원에 기재된 바와 같은 항원을 발현하고, 바람직하게는 클래스 I MHC로 상기 항원을 제시하는 세포이다.
용어 "일부분"은 분획을 지칭한다. 특별한 구조, 예컨대 아미노산 서열 또는 단백질과 관련하여, 용어 그의 "일부분"은 상기 구조의 연속 또는 불연속 분획을 나타낼 수 있다. 바람직하게, 아미노산 서열의 일부분은 이러한 아미노산 서열의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 바람직하게 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 더 바람직하게 적어도 60%, 더 바람직하게 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 80%, 및 가장 바람직하게 적어도 90%의 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 상기 일부분이 불연속 분획인 경우, 상기 불연속 분획은 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 초과의 부분으로 구성되며, 각각의 부분은 구조의 연속 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속 분획은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 초과, 바람직하게 4개 이하의 부분으로 구성될 수 있으며, 여기서 각각의 부분은 바람직하게, 아미노산 서열의 적어도 5개의 연속 아미노산, 적어도 10개의 연속 아미노산, 바람직하게 적어도 20개의 연속 아미노산, 바람직하게 적어도 30개의 연속 아미노산을 포함한다.
용어 "부분" 및 "단편"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며 연속 요소를 지칭한다. 예를 들어, 구조, 예컨대 아미노산 서열 또는 단백질의 부분은 상기 구조의 연속 요소를 지칭한다. 구조의 일부분, 부분 또는 단편은 바람직하게, 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성을 포함한다. 예를 들어, 에피토프, 펩티드 또는 단백질의 일부분, 부분 또는 단편은 바람직하게, 그것이 유래되는 에피토프, 펩티드 또는 단백질과 면역학적으로 동등하다. 본 발명의 맥락에서, 구조, 예컨대 아미노산 서열의 "부분"은 바람직하게, 전체 구조 또는 아미노산 서열의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%를 포함하고, 바람직하게 이로 이루어진다.
본 발명의 맥락에서 용어 "이펙터 세포", "면역 이펙터 세포" 또는 "면역 반응성 세포"는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포에 관한 것이다. "면역 반응성 세포"는 바람직하게, 항원과 결합할 수 있거나 또는 항원 또는 그의 펩티드 단편 (예를 들어, T 세포 에피토프)의 제시를 특징으로 하는 세포와 결합할 수 있고 면역 반응을 매개할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포는 시토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 항체를 분비하며, 암성 세포를 인식하고, 임의로 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포 (세포 독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서, 면역 반응성 세포는 T 세포, 바람직하게 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다.
바람직하게, "면역 반응성 세포"는 특히 항원 제시 세포 또는 이환된 세포, 예컨대 암 세포의 표면 상에서와 같은 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 경우, 어느 정도의 특이성을 갖는 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식한다. 바람직하게, 상기 인식은 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식하는 세포가 감응성 또는 반응성이 될 수 있도록 한다. 세포가 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식하는 수용체를 보유하는 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)인 경우, 이러한 감응성 또는 반응성은 시토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 수반할 수 있다. 세포가 CTL인 경우, 이러한 감응성 또는 반응성은 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 제시된 세포, 즉 예를 들어, 아폽토시스 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통한 클래스 I MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 제거를 수반할 수 있다. 본 발명에 따르면, CTL 감응성은 지속적인 칼슘 플럭스, 세포 분열, 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및 TNF-α의 생산, 활성화 마커, 예컨대 CD44 및 CD69의 상향 조절, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포 용해 사멸을 포함할 수 있다. CTL 감응성은 또한, CTL 감응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 결정될 수 있다. 항원 또는 항원 단편을 인식하고 감응성 또는 반응성인 이러한 CTL은 또한 본원에서 "항원-감응성 CTL"로 일컬어진다. 세포가 B 세포인 경우, 이러한 감응성은 이뮤노글로불린의 방출을 수반할 수 있다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며 세포 용해 T 세포를 포함하는 세포 독성 T 세포 (CTL, CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포)를 포함한다.
T 세포는 림프구로서 공지된 백혈구 군에 속하며, 세포 매개 면역에서 중추적인 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)라 불리는 그의 세포 표면 상의 특수 수용체의 존재에 의해 다른 림프구 유형, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포와 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙에 대해 책임이 있는 주요 기관이다. T 세포의 몇 가지 상이한 서브 세트가 밝혀졌는데, 각각은 별개의 기능을 갖는다.
T 헬퍼 세포는 다른 기능들 중에서도, B 세포의 형질 세포로의 성숙 및 세포 독성 T 세포 및 대식 세포의 활성화를 포함한 면역학적 프로세스에서 다른 백혈구를 보조한다. 이들 세포는 그의 표면 상에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로서 공지되기도 한다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원이 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 그들은 신속하게 분열하여, 능동 면역 반응을 조절하거나 또는 도와주는 시토카인이라 불리는 작은 단백질을 분비한다.
세포 독성 T 세포는 바이러스에 의해 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 그의 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로서 공지되기도 한다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 회합된 항원과 결합함으로써 그들의 표적을 인식한다.
대부분의 T 세포는 여러 단백질의 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생산되고 α- 및 β-TCR 쇄로 불리는 2개의 별도의 펩티드 쇄로 구성된다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 그들의 표면 상에 별개의 T 세포 수용체 (TCR)를 보유하는 T 세포의 작은 서브 세트를 나타낸다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 하나의 γ-쇄 및 하나의 δ-쇄로 구성된다. 이러한 T 세포 군은 αβ T 세포보다 훨씬 덜 통상적이다 (전체 T 세포의 2%).
T 세포의 활성화에 있어서의 첫 번째 시그널은 T 세포 수용체를 또 다른 세포 상의 MHC에 의해 제시된 짧은 펩티드와 결합시킴으로써 제공된다. 이것은 그 펩티드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포 만이 활성화되도록 보장한다. B 세포 및 대식 세포가 중요한 APC일 수 있지만, 파트너 세포는 통상적으로, 항원 제시 세포, 예컨대 전문적인 항원 제시 세포, 통상적으로 나이브 반응의 경우에 수지상 세포이다.
본 발명에 따르면, 분자는 미리 결정된 표적에 대해 상당한 친화도를 가지며 표준 검정에서 미리 결정된 표적과 결합하는 경우에, 이러한 표적과 결합할 수 있다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 종종, 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정된다. 분자가 표적에 대해 상당한 친화도가 없고 표준 검정에서 표적과 유의미하게 결합하지 않으면, 이러한 표적과 (실질적으로) 결합할 수 없다.
세포 독성 T 림프구는 생체내에서 항원 제시 세포 내로 항원 또는 그의 펩티드 단편을 혼입함으로써 생체내에서 생성될 수 있다. 항원 또는 그의 펩티드 단편은 단백질로서, DNA (예를 들어, 벡터 내)로서 또는 RNA로서 나타낼 수 있다. 항원은 MHC 분자에 대한 펩티드 파트너를 생산하도록 프로세싱될 수 있는 반면, 그의 단편은 추가 프로세싱할 필요 없이 제시될 수 있다. MHC 분자와 결합할 수 있는 경우에는, 후자가 특히 그렇다. 일반적으로, 피내 주사에 의해 환자에게 투여하는 것이 가능하다. 그러나, 주사는 또한, 림프절 내로 결절 내로 수행될 수 있다 (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). 이로써 생성된 세포는 관심 복합체를 제시하며, 이어서 증식하는 자가 세포 독성 T 림프구에 의해 인식된다.
CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 방법은 T 세포의 증식, 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 예컨대 IFNγ)의 생산, 또는 세포 용해 활성을 검출하는 것을 포함한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하기 위한 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하기 위한 바람직한 방법은 세포 용해 활성의 생성을 검출하는 것이다. 특히, 세포내 시토카인 염색 또는 ELISPOT은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용함으로써 CD4+ T-세포와 CD8+ T-세포 둘 다에 의해 생산된 시토카인의 검출을 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, ELISPOT 검정에서, 막의 표면은 검정되는 시토카인의 특이적 에피토프와 결합하는 포획 항체로 코팅된다. 세포가 활성화됨에 따라, 이들은 고정화된 항체에 의해 막 표면 상에 직접적으로 포획되는 시토카인을 방출한다. 따라서 시토카인은 분비 세포를 직접 둘러싸는 영역에서 "포획"된다. 후속 검출 단계는 고정화된 시토카인을 "이뮤노스폿(immunospot)"으로서 시각화하는데, 이는 본질적으로 활성화된 세포의 분비 발자국이다. 따라서 ELISPOT 검정 기술은 특이적 항원 자극에 반응하여 주어진 시토카인 (예를 들어, IFNγ)을 생산하는 T 세포의 수 및/또는 빈도를 추정할 수 있게 한다. 스폿 계수는 복제물로부터 수득된 중앙 값으로서 표현될 수 있고, 음성 대조군 (예를 들어, 자극되지 않은 세포)과 비교될 수 있다. 특정 수의 세포 당 최소 수의 스폿이 관찰되고/되거나 스폿 수가 음성 대조군과 비교해서 특정 수준을 초과하는 경우, 반응은 양성으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 1 x 103개의 세포, 1 x 104개의 세포, 또는 1 x 105개의 세포 당 최소 5개의 스폿이 존재하고/하거나 스폿 계수가 각각의 음성 대조군보다 2x, 3x, 4x, 5x 초과하여 높거나, 또는 훨씬 더 높은 경우에, 반응은 양성으로서 정의될 수 있다.
용어 "면역학적으로 동등한" 것은 면역학적으로 동등한 분자, 예컨대 면역학적으로 동등한 아미노산 서열이 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고/내거나, 예를 들어, 면역학적 효과, 예컨대 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유도, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 지속 시간, 또는 유도된 면역 반응의 특이성의 유형과 관련하여, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면역학적으로 동등한" 것은 면역화를 위해 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 대상체의 면역 체계에 노출될 때 특정 아미노산 서열이 참조 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 갖는 면역 반응을 유도하는 경우에, 상기 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 면역학적으로 동등하다.
본 발명의 맥락에서 용어 "면역 이펙터 기능"은, 예를 들어, 종양 세포의 사멸, 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함한 종양 발생의 억제를 초래하는 면역 체계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개된 이펙터 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)의 경우에는, T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 항원 또는 항원 단편의 인식, 시토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우에는, T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 항원 또는 항원 단편의 인식, MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 제시된 세포, 즉 예를 들어, 아폽토시스 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통한 부류 I MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 제거, 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및 TNF-α의 생산, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포 용해 사멸을 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따르면, 질환 특이적 아미노산 변형 및 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편 (이러한 단편은 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다)은 면역요법에서의 그의 유용성에 대하여 평가된다. 면역요법에 대한 유용성이 예측되는 하나 이상의 단편은, 예를 들어, 그로부터 하나 이상의 단편이 유래되는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 펩티드 단편, 특히 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 (잠재적) MHC 결합 펩티드를 포함하는 백신을 제공하는 데 사용될 수 있다. 백신은 또한, 그로부터 하나 이상의 단편이 유래되는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 펩티드 단편, 특히 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 (잠재적) MHC 결합 펩티드를 코딩하는 핵산, 예컨대 RNA를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "스코어"는, 예를 들어, MHC 분자 상의 폴리펩티드 단편의 제시를 측정하는 검정 또는 MHC 분자 상의 폴리펩티드 단편에 대한 T 세포 반응성을 측정하는 검정을 포함한 시험 또는 검정의 결과로, 통상적으로 수치적으로 표현된 결과에 관한 것이다. "더 나은 스코어"와 같은 용어는 시험 또는 검정의 더 나은 결과 또는 최상의 결과에 관한 것이다.
폴리펩티드 제시 및 T 세포 반응성의 수준은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 펩티드 제시는, 예를 들어, 실험 방법뿐만 아니라 널리 공지된 예측 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, MHC-펩티드 친화도를 결정하기 위해 다수의 생화학적 검정이 개발되었다. 전통적인 방법은 통상적으로 방사성으로 표지된 참조 펩티드가 MHC와 결합되는 경쟁 검정이다. MHC 펩티드 결합을 결정하기 위해 T 세포 반응성 검정이 또한 사용될 수 있다. T 세포 반응성은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 검정 (ELISPOT) 또는 시토카인 분비 검정 (CSA)을 포함한 면역학적 검정에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에 따르면, 질환 특이적 아미노산 변형은 (1) 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응할 수 있고/있거나, (2) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응할 수 있고/있거나, (3) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 수 있고/있거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응할 수 있는, 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 예측 능력에 따라서 스코어링될 수 있다. 일반적으로, 질환 특이적 아미노산 변형 또는 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프가 실현되는 파라미터 (1) 내지 (3)이 더 많을수록, 질환 특이적 아미노산 변형을 스코어링하는 것이 더 나아진다.
"예측하다", "예측하는" 또는 "예측"과 같은 용어는 가능성의 결정, 예를 들어, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 결정에 관한 것이다. 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형은, 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편 (이들 단편은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다)이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 경우, 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인 경우, 또는 둘 다인 경우에, 면역요법에 유용한 것으로서 확인된다. 또 다른 한편으로 또는 부가적으로, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형은, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인 경우에, 면역요법에 유용한 것으로서 확인된다. 또 다른 한편으로 또는 부가적으로, 이환된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형은, 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편 (이들 단편은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다)이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 경우, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인 경우, 또는 둘 다인 경우에, 면역요법에 유용한 것으로서 확인된다.
MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편의 제시는, 예를 들어, 임의의 펩티드:MHC 결합 예측 툴을 사용하고/하거나 MHC 분자에 대한 상기 단편의 결합을 실험적으로 결정함으로써 확인할 수 있다.
MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과 T 세포의 반응성은, 예를 들어, 실험적으로 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 질환 특이적 아미노산 변형을 갖는 환자에서 발견된 MHC 분자 및/또는 T 세포에 대항하여 통상적으로 평가가 이루어진다. 따라서, 본 발명은 또한, 환자의 MHC 및/또는 T 세포 레퍼토리를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 단편"은 한 실시양태에서, 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 펩티드에 관한 것이며, 상기 상이한 단편은 펩티드 또는 폴리펩티드에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하지만, 이러한 변형(들)의 길이 및/또는 위치에 있어서는 상이하다. 펩티드 또는 폴리펩티드가 위치 x에서 변형을 갖는 경우, 상기 위치 x를 커버하는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 서열 창을 각각 포함하는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 2개 이상의 단편이, 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 단편인 것으로 간주된다.
용어 "상이한 아미노산 변형"은 동일하고/하거나 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 중 하나의 상이한 아미노산 변형에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따르면, "질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편"은 MHC 결합을 위한 적절한 길이를 갖는다.
그의 면역요법에 대한 유용성이 본 발명에 따라 평가되거나 또는 본 발명에 따른 면역요법에서의 유용성을 알아보기 위해 선택되고/되거나 순위가 매겨지는 아미노산 변형은 바람직하게, 환자의 세포, 예컨대 이환된 세포, 특히 암 또는 종양 세포의 핵산 내의 돌연변이로부터 비롯된다. 이러한 돌연변이는 공지된 시퀀싱 기술에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자 특이적 백신, 예컨대 항암 백신을 제공하기 위해 환자, 예컨대 암 환자에 대해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 돌연변이는 암 환자의 종양 표본에서의 암 특이적 체세포 돌연변이이며, 이는 종양 표본의 게놈, 엑솜 및/또는 전사체와 비-종양형성 표본의 게놈, 엑솜 및/또는 전사체 간의 서열 차이를 확인함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양 표본은 종양 또는 암 세포를 함유하거나 또는 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 유래된 임의의 샘플, 예컨대 신체 샘플에 관한 것이다. 신체 샘플은 임의의 조직 샘플, 예컨대 혈액, 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 수득된 조직 샘플, 또는 종양 또는 암 세포를 함유하는 임의의 다른 샘플일 수 있다. 바람직하게, 신체 샘플은 혈액이고, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 혈액 내에 함유된 하나 이상의 순환 종양 세포 (CTC)에서 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 종양 표본은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포, 예컨대 순환 종양 세포 (CTC), 또는 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포, 예컨대 순환 종양 세포 (CTC)를 함유하는 샘플에 관한 것이다.
비-종양형성 표본은 환자 또는 바람직하게 환자와 동일한 종의 또 다른 개체, 바람직하게 종양 또는 암 세포를 함유하지 않거나 또는 함유하지 않을 것으로 예상되는 건강한 개체로부터 유래된 임의의 샘플, 예컨대 신체 샘플에 관한 것이다. 신체 샘플은 임의의 조직 샘플, 예컨대 혈액 또는 비-종양형성 조직으로부터의 샘플일 수 있다.
본 발명은 환자의 암 돌연변이 시그너처의 결정을 수반할 수 있다. 용어 "암 돌연변이 시그너처"는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 돌연변이를 지칭할 수 있거나 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 돌연변이의 일부분만을 지칭할 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 특이적 돌연변이의 확인을 수반할 수 있거나, 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 특이적 돌연변이의 일부분 만의 확인을 수반할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 이러한 본 발명의 방법에 포함될 충분한 수의 변형 또는 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공하는 다수의 돌연변이의 확인을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에 따라 확인된 돌연변이는 비-동의 돌연변이, 바람직하게 종양 또는 암 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 비-동의 돌연변이이다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 게놈, 바람직하게 전체 게놈에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 암 세포의 게놈, 바람직하게 전체 게놈의 암 돌연변이 시그너처를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 암 환자의 종양 표본 내의 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하는 단계는 게놈 규모에서의 암 돌연변이 프로파일을 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 엑솜, 바람직하게 전체 엑솜에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 암 세포의 엑솜, 바람직하게 전체 엑솜의 암 돌연변이 시그너처를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 암 환자의 종양 표본 내의 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하는 단계는 엑솜 규모에서의 암 돌연변이 프로파일을 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 전사체, 바람직하게 전체 전사체에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 암 세포의 전사체, 바람직하게 전체 전사체의 암 돌연변이 시그너처를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 암 환자의 종양 표본 내의 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하는 단계는 전사체 규모에서의 암 돌연변이 프로파일을 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하거나 또는 서열 차이를 확인하는 단계는 하나 이상, 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 심지어 그 초과의 암 세포의 단일 세포 시퀀싱을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 하나 이상의 암 세포의 암 돌연변이 시그너처를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 암 세포는 순환 종양 세포이다. 암 세포, 예컨대 순환 종양 세포는 단일 세포 시퀀싱 이전에 단리될 수 있다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하거나 또는 서열 차이를 확인하는 단계는 차세대 시퀀싱 (NGS)을 사용하는 것을 수반한다.
한 실시양태에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 확인하거나 또는 서열 차이를 확인하는 단계는 종양 표본의 게놈 DNA 및/또는 RNA를 시퀀싱하는 것을 포함한다.
암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 밝히기 위해, 종양 표본으로부터 수득된 서열 정보를 바람직하게 참조, 예컨대 환자 또는 상이한 개체로부터 수득될 수 있는 정상적인 비-암성 세포, 예컨대 생식세포 계열 세포의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA를 시퀀싱한 것으로부터 수득된 서열 정보와 비교한다. 한 실시양태에서, 정상적인 게놈 생식세포 계열 DNA는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 수득된다.
용어 "게놈"은 유기체 또는 세포의 염색체 내의 유전 정보의 총 량에 관한 것이다.
용어 "엑솜"은 발현된 유전자의 일부분을 코딩하는 엑손에 의해 형성된 유기체의 게놈의 부분을 지칭한다. 엑솜은 단백질 및 다른 기능적 유전자 산물의 합성에 사용되는 유전적 청사진을 제공한다. 이는 게놈에서 기능적으로 가장 관련성이 높은 부분이므로, 유기체의 표현형에 기여할 가능성이 높다. 인간 게놈의 엑솜은 전체 게놈의 1.5%를 구성하는 것으로 추정된다 (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008).
용어 "전사체"는 mRNA, rRNA, tRNA 및 하나의 세포 또는 세포 집단에서 생산된 다른 비-코딩 RNA를 포함한 모든 RNA 분자 세트에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 전사체는 특정 시점에서 하나의 세포, 세포 집단, 바람직하게 암 세포 집단, 또는 주어진 개체의 모든 세포에서 생산된 모든 RNA 분자 세트를 의미한다.
"핵산"은 본 발명에 따라 바람직하게, 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 더 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 핵산은 본 발명에 따라 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 원형으로 닫힌 분자로서 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면 핵산은 단리될 수 있다. 용어 "단리된 핵산"은 본 발명에 따르면, 핵산이 (i) 시험관내에서, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예를 들어, 절단에 의해 및 겔 전기영동에 의한 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었다는 것을 의미한다. 핵산은 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는, 특히 RNA의 형태로 세포 내로의 도입, 즉 세포의 형질감염에 이용될 수 있다. 더욱이, RNA는 서열 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 적용하기 전에 변형될 수 있다.
용어 "유전 물질"은 단리된 핵산, DNA 또는 RNA, 이중 나선 절편, 염색체 절편, 또는 유기체 또는 세포의 전체 게놈, 특히 그의 엑솜 또는 전사체를 지칭한다.
용어 "돌연변이"는 참조와 비교하여 핵산 서열에 있어서의 변화 또는 차이 (뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실)를 지칭한다. "체세포 돌연변이"는 생식 세포 (정자 및 난자)를 제외한 신체의 세포 중의 임의의 것에서 발생할 수 있으므로, 아이들에게는 전달되지 않는다. 이러한 변경은 암 또는 다른 질환을 유발시킬 수 있지만 항상 그런 것은 아니다. 바람직하게 돌연변이는 비-동의 돌연변이이다. 용어 "비-동의 돌연변이"는 아미노산 변화를 초래하는 돌연변이, 바람직하게 뉴클레오티드 치환, 예컨대 번역 산물에서의 아미노산 치환을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "돌연변이"는 점 돌연변이, 삽입-결실 (Indel), 융합, 크로모트립시스(chromothripsis) 및 RNA 편집을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "삽입-결실"은 공동 국재화된 삽입 및 결실 및 뉴클레오티드에서의 순 이득 또는 손실을 초래하는 돌연변이로서 정의된 특수 돌연변이 클래스를 설명한다. 게놈의 코딩 영역에서, 삽입-결실의 길이가 3의 배수가 아닌 한, 그들은 프레임 시프트 돌연변이를 초래한다. 삽입-결실은 점 돌연변이와 대조 될 수 있으며; 삽입-결실이 서열로부터 뉴클레오티드를 삽입하고 결실하는 경우, 점 돌연변이는 뉴클레오티드 중 하나를 대체하는 치환의 형태이다.
융합은 2개의 이전에 별도의 유전자로부터 형성된 혼성체 유전자를 생성할 수 있다. 이는 전위, 간질성 결실 또는 염색체 역위의 결과로 발생할 수 있다. 종종, 융합 유전자는 종양 유전자이다. 발암성 융합 유전자는 두 융합 파트너와는 상이하거나 새로운 기능을 가진 유전자 산물로 이어질 수 있다. 또 다른 한편으로, 원 종양 유전자는 강력한 프로모터에 융합되고, 이에 의해 발암성 기능은 상류 융합 파트너의 강력한 프로모터에 의해 야기된 상향 조절에 의해 기능하도록 설정된다. 발암성 융합 전사체는 또한, 트랜스-스플라이싱 또는 연속 판독 이벤트에 의해 야기될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "크로모트립시스"는 게놈의 특이적 영역이 산산이 부서지고, 이어서 단일 파괴 이벤트를 통해 함께 스티칭되는 유전적 현상을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA 편집하다" 또는 "RNA 편집"은 염기 구성에 있어서의 화학적 변화를 통해 RNA 분자 내의 정보 함량이 변경되는 분자 프로세스를 지칭한다. RNA 편집은 뉴클레오시드 변형, 예컨대 시티딘 (C)에서 우리딘 (U)으로 및 아데노신 (A)에서 이노신 (I)으로의 탈아민화뿐만 아니라 비-템플릿화된 뉴클레오티드 부가 및 삽입을 포함한다. mRNA에서의 RNA 편집은 게놈 DNA 서열에 의해 예측된 것과 상이하도록, 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변경시킨다.
용어 "암 돌연변이 시그너처"는 비-암성 참조 세포와 비교할 때 암 세포에 존재하는 돌연변이 세트를 지칭한다.
본 발명에 따르면, "참조"는 종양 표본으로부터의 결과를 상관시키고 비교하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 "참조"는 환자 또는 하나 이상의 상이한 개체, 바람직하게 건강한 개체, 특히 동일한 종의 개체로부터 수득된 하나 이상의 정상 표본, 특히 암 질환에 의해 영향을 받지 않는 표본에 기초하여 수득될 수 있다. "참조"는 충분히 많은 수의 정상 표본을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
돌연변이를 결정하기 위해 본 발명에 따라 임의의 적합한 시퀀싱 방법을 사용할 수 있으며, 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이 바람직하다. 3세대 시퀀싱 방법은 향후 NGS 기술을 대체하여 상기 방법의 시퀀싱 단계의 속도를 높일 수 있다. 명확하게 하기 위해: 본 발명의 맥락에서 용어 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는 생어(Sanger) 화학으로서 공지된 "종래의" 시퀀싱 방법론과는 달리, 전체 게놈을 작은 조각으로 쪼개서 전체 게놈을 따라 병렬로 핵산 주형을 무작위로 판독하는 모든 신규 고 처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술 (대규모 병렬 시퀀싱 기술로서 공지되기도 함)은 전체 게놈, 엑솜, 전사체 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬 (게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 짧은 기간, 예를 들어, 1 내지 2주 이내에, 바람직하게 1 내지 7일 이내에 또는 가장 바람직하게 24시간 미만 내에 전달할 수 있고, 원칙적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 허용한다. 상업적으로 이용 가능하거나 또는 문헌에 언급된 다수의 NGS 플랫폼, 예를 들어, 문헌 [Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; or in Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658]에 상세히 언급된 것이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 이러한 NGS 기술/플랫폼의 비-제한적인 예는 다음과 같다:
1) 문헌 [Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365]에 최초로 보고된, 예를 들어 로슈(Roche) 관련 회사 454 라이프 사이언시스(Life Sciences) (미국 코네티컷주 브랜포드)의 GS-FLX 454 게놈 시퀀서™로 시행된 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로서 공지된 합성에 의한 시퀀싱 기술. 이러한 기술은 에멀션 PCR 증폭을 위해 오일로 둘러싸인 PCR 반응물을 함유하는 수성 미셀로 격렬하게 와동시킴으로써 단일 가닥 DNA 결합 비드를 캡슐화시키는 에멀션 PCR을 사용한다. 파이로시퀀싱 프로세스 동안, 뉴클레오티드 혼입 동안 포스페이트 분자로부터 방출된 빛은 폴리머라제가 DNA 가닥을 합성할 때 기록된다.
2) 가역적 염료-종결제에 근거하여 솔렉사(Solexa) [현재 일루미나 인크. (Illumina Inc.; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)의 일부]에 의해 개발되고, 예를 들어 일루미나/솔렉사 게놈 분석기™ 및 일루미나 HiSeq 2000 게놈 분석기™로 시행된, 합성에 의한 시퀀싱 접근법. 이러한 기술에서는, 4개의 모든 뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제와 함께 플로우 셀 채널의 올리고-프라임된 클러스터 단편에 동시에 부가한다. 브릿지 증폭은 시퀀싱을 위해 4개의 모든 형광 표지된 뉴클레오티드로 클러스터 가닥을 연장시킨다.
3) 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) [현재 라이프 테크놀로지스 코포레이션 (Life Technologies Corporation; 미국 캘리포니아주 칼스배드)]의 솔리드(SOLid™) 플랫폼으로 시행된 라이게이션에 의한 시퀀싱 접근법. 이러한 기술에서는, 고정 길이의 모든 가능한 올리고뉴클레오티드의 풀을, 시퀀싱된 위치에 따라 표지시킨다. 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고 라이게이션하며; 서열을 매치시키기 위한 DNA 라이가제에 의한 우선적 라이게이션은 그 위치에서 뉴클레오티드를 알려주는 시그널을 발생시킨다. 시퀀싱 전에, DNA를 에멀션 PCR에 의해 증폭시킨다. 각각 동일한 DNA 분자의 카피만을 함유하는, 상기와 같이 생성된 비드를 유리 슬라이드 상에 침착시킨다. 두 번째 예로서, 도버 시스템즈 (Dover Systems; 미국 뉴햄프셔주 살렘)의 폴로네이터(Polonator™) G.007 플랫폼은 병렬 시퀀싱을 위하여 DNA 단편을 증폭시키기 위해 무작위로 어레이된 비드 기반의 에멀션 PCR을 사용함으로써 라이게이션에 의한 시퀀싱 접근법을 이용하기도 한다.
4) 예컨대 예를 들어, 파시픽 바이오사이언시스 (Pacific Biosciences; 미국 캘리포니아주 멘로 파크)의 팩바이오(PacBio) RS 시스템 또는 헬리코스 바이오사이언시스 (Helicos Biosciences; 미국 매사추세츠주 케임브리즈)의 헬리스코프(HeliScope™) 플랫폼으로 시행된 단일 분자 시퀀싱 기술. 이러한 기술의 독특한 특징은 단일 분자 실시간 (SMRT) DNA 시퀀싱으로서 정의된, 증폭 없이 단일 DNA 또는 RNA 분자를 시퀀싱할 수 있는 능력이다. 예를 들어, 헬리스코프는 고도로 민감한 형광 검출 시스템을 사용하여, 그것이 합성될 때 각각의 뉴클레오티드를 직접적으로 검출한다. 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 근거한 유사한 접근법이 비시겐 바이오테크놀로지 (Visigen Biotechnology; 미국 텍사스주 휴스턴)로부터 개발되었다. 다른 형광 기반 단일 분자 기술은 미국 게노믹스(U.S. Genomics) [진엔진(GeneEngine™)] 및 제노복스(Genovoxx) [애니진(AnyGene™)]로부터의 것이다.
5) 예를 들어, 복제 동안 단일 가닥 상에서 폴리머라제 분자의 움직임을 모니터링하기 위해 칩 상에 배열되는 다양한 나노 구조가 사용되는 단일 분자 시퀀싱을 위한 나노 기술. 나노 기술에 근거한 접근법에 대한 비-제한적인 예는 옥스포드 나노포어 테크놀로지스 (Oxford Nanopore Technologies; 영국 옥스포드)의 그리드온(GridON™) 플랫폼, 납시스 (Nabsys; 미국 로드 아일랜드주 프로비던스)에 의해 개발된 혼성화 지원 나노 포어 시퀀싱 (HANS™) 플랫폼, 및 조합 프로브-앵커 라이게이션 (cPAL™)으로 지칭되는 DNA 나노 볼 (DNB) 기술을 사용한 독점 라이가제 기반 DNA 시퀀싱 플랫폼이다.
6) 단일 분자 시퀀싱을 위한 전자 현미경 기반 기술, 예를 들어 라이트스피드 게노믹스 (LightSpeed Genomics; 미국 캘리포니아주 서니베일) 및 할시온 몰레쿨라 (Halcyon Molecular; 미국 캘리포니아주 레드우드 시티)에 의해 개발된 것.
7) DNA의 중합 동안 방출되는 수소 이온의 검출에 근거하는 이온 반도체 시퀀싱. 예를 들어, 이온 토렌트 시스템즈 (Ion Torrent Systems; 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)는 이러한 생화학적 프로세스를 대규모 병렬 방식으로 수행하기 위해 고밀도 어레이의 미세 가공 웰을 사용한다. 각각의 웰에는 상이한 DNA 주형이 있다. 웰 아래에는 이온 감지 층이 있으며, 그 아래에는 독점 이온 센서가 있다.
바람직하게, DNA 및 RNA 제제는 NGS에 대한 출발 물질로서 작용한다. 이러한 핵산은, 예를 들어 신선하거나, 급속 냉동되거나 또는 포르말린-고정된 파라핀 포매된 종양 조직 (FFPE)으로부터 또는 새로이 단리된 세포로부터 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTC로부터의 샘플, 예컨대 생물학적 물질로부터 용이하게 수득될 수 있다. 정상적인 비-돌연변이된 게놈 DNA 또는 RNA는 정상적인 체세포 조직으로부터 추출될 수 있지만, 생식세포 계열 세포가 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 생식세포 계열 DNA 또는 RNA는 비-혈액학적 악성 종양이 있는 환자 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 추출될 수 있다. FFPE 조직 또는 새로이 단리된 단일 세포로부터 추출된 핵산이 고도로 단편화되어 있지만, 이들은 NGS 적용에 적합하다.
엑솜 시퀀싱을 위한 여러 표적화된 NGS 방법이 문헌 (고찰을 위해, 예를 들어, 문헌 [Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51] 참조)에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본 발명과 연계해서 사용될 수 있다. 이들 방법 중 많은 것 (예를 들어, 게놈 포획, 게놈 분할, 게놈 강화 등으로서 기재됨)은 혼성화 기술을 사용하고 어레이 기반 (예를 들어, 문헌 [Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527]) 및 액체 기반 (예를 들어, 문헌 [Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101]) 혼성화 접근법을 포함한다. DNA 샘플 준비 및 후속 엑솜 포획을 위한 상용 키트가 또한 이용 가능하다: 예를 들어, 일루미나 인크. (미국 캘리포니아주 샌디에이고)는 TruSeq™ DNA 샘플 준비 키트 및 엑솜 강화 키트 TruSeq™ 엑솜 강화 키트를 제공한다.
예를 들어, 종양 샘플의 서열을 참조 샘플의 서열, 예컨대 생식세포 계열 샘플의 서열과 비교할 때 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 검출하는 데 있어서 거짓 양성 발견의 수를 줄이기 위해서는, 이들 샘플 유형 중 하나 또는 둘 다의 복제물에서 서열을 결정하는 것이 바람직하다. 따라서, 참조 샘플의 서열, 예컨대 생식세포 계열 샘플의 서열이 2회, 3회 또는 그 초과로 결정되는 것이 바람직하다. 또 다른 한편으로 또는 부가적으로, 종양 샘플의 서열은 2회, 3회 또는 그 초과로 결정된다. 게놈 DNA 내의 서열을 적어도 한 번 결정하고 참조 샘플 및/또는 종양 샘플의 RNA 내의 서열을 적어도 한 번 결정함으로써 참조 샘플의 서열, 예컨대 생식세포 계열 샘플의 서열 및/또는 종양 샘플의 서열을 1회 초과 결정하는 것이 가능할 수도 있다. 예를 들어, 참조 샘플, 예컨대 생식세포 계열 샘플의 복제물 간의 변이를 결정함으로써, 통계량으로서의 거짓 양성 (FDR) 체세포 돌연변이의 예상 속도가 추정될 수 있다. 샘플의 기술적 반복은 동일한 결과를 생성해야 하며 이러한 "동일한 대 동일한 비교"에서 검출된 임의의 돌연변이는 거짓 양성이다. 특히, 참조 샘플과 비교하여 종양 샘플에서 체세포 돌연변이 검출에 대한 거짓 발견 비율을 결정하기 위해, 참조 샘플의 기술적 반복이 거짓 양성물의 수를 추정하기 위한 참조로서 사용될 수 있다. 더욱이, 다양한 품질 관련 측정 기준 (예를 들어, 적용 범위 또는 SNP 품질)은 기계 학습 접근법을 사용하여 단일 품질 스코어로 조합될 수 있다. 주어진 체세포 변이에 대하여, 품질 스코어를 초과하는 다른 모든 변이가 계수될 수 있으며, 이는 데이터세트에서 모든 변이의 순위 매김을 가능하게 한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기로 전체적으로 또는 실질적으로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은, 예컨대 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함할 수 있다. RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한, 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연적으로 발생하는 RNA의 유사체로서 지칭될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 "mRNA"를 포함하고 바람직하게 이에 관한 것이다. 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하고 DNA 주형을 사용함으로써 생성되고 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 "전사체"에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR 및 임의로 폴리(A) 미부를 포함한다. mRNA는 세포 및 시험관내에서 제한된 반감기만을 보유한다. 본 발명의 맥락에서, mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 다양한 시험관내 전사 키트가 있다.
본 발명에 따르면, RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화 효과 및/또는 RNA의 번역 효율을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 RNA가 안정화되고 그의 번역이 증가될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 PCT/EP2006/009448에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현을 증가시키기 위해서는, 이를 코딩 영역 내에서, 즉 발현된 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고서도 변형시킬 수 있어, GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하고, 이에 따라 세포에서의 번역을 증강시킨다.
본 발명에 사용된 RNA의 맥락에서의 용어 "변형"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA는 그의 안정성을 증가시키고/시키거나 세포 독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 시티딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 대체한다. 또 다른 한편으로 또는 부가적으로, 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 슈도우리딘은 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 대체한다.
한 실시양태에서, 용어 "변형"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며, 일반적으로 특이한 5'에서 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 이루어진다. 한 실시양태에서, 이러한 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "종래의 5'-캡"은 자연적으로 발생하는 RNA 5'-캡, 바람직하게 7-메틸구아노신 캡 (m7G)을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고, 바람직하게 생체내 및/또는 세포에서, 이에 부착된 경우, RNA를 안정화시킬 수 있고/있거나 RNA의 번역을 증강시킬 수 있는 능력을 보유하도록 변형되는 5'-캡 유사체를 포함한다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에서 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공동-전사적으로 혼입되거나, 또는 RNA가, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어, 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후에 RNA에 부착될 수 있다.
RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용된 RNA의 추가 변형은 자연적으로 발생하는 폴리(A) 미부의 연장 또는 말단절단 또는 5'- 또는 3'-비번역된 영역 (UTR)의 변경, 예컨대 상기 RNA의 코딩 영역과 관련이 없는 UTR의 도입, 예를 들어, 기존의 3'-UTR을, 글로빈 유전자, 예컨대 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게 베타-글로빈, 더 바람직하게 인간 베타-글로빈으로부터 유래된 3'-UTR의 하나 이상, 바람직하게 2개의 카피로 교환하거나 또는 이를 삽입하는 것일 수 있다.
마스킹되지 않은 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된 폴리-A 서열을 갖는 RNA보다 더 효율적으로 번역된다. 용어 "폴리(A) 미부" 또는 "폴리-A 서열"은, 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐 (A) 잔기의 서열에 관한 것이며, "마스킹되지 않은 폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3' 말단에 있는 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 종결되고, 폴리-A 서열의 3' 말단에, 즉 하류에 위치한 A 이외의 뉴클레오티드가 뒤따르지 않는다는 것을 의미한다. 더욱이, 약 120개 염기쌍의 긴 폴리-A 서열이 RNA의 최적의 전사체 안정성 및 번역 효율을 초래한다.
따라서, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해서는, 바람직하게 10 내지 500개, 더 바람직하게 30 내지 300개, 훨씬 더 바람직하게 65 내지 200개, 및 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기의 길이를 갖는 폴리-A 서열과 연계해서 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리-A 서열은 대략 120개의 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 추가로 증가시키기 위해서는, 폴리-A 서열이 마스킹되지 않을 수 있다.
용어 RNA의 "안정성"은 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 기간에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현의 지속 기간"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA가 연장된 기간 동안 발현될 것으로 예상될 수 있다.
물론, 본 발명에 따라 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것이 요망되는 경우에는, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 전술한 바와 같은 요소의 기능을 방해하도록 RNA를 변형시키는 것이 가능하다.
용어 "발현"은 본 발명에 따라 가장 일반적인 의미로 사용되며, 예를 들어, 전사 및/또는 번역에 의한, RNA 및/또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 또한, 이는 핵산의 부분 발현을 포함한다. 더욱이, 발현은 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열 내의 유전 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관한 것이다. 연속적으로, RNA는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 바람직하게, 클로닝 벡터가 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로, 전사 벡터로서 지명되고, 본 발명에 따라 용어 "벡터"로써 포괄된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 사용된 RNA는 바람직하게, 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제의 특별한 예는 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 제어된다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝 및 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로의 도입에 의해 수득될 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "번역"은 메신저 RNA의 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 만드는, 세포의 리보솜에서의 프로세스에 관한 것이다.
본 발명에 따라 핵산과 기능적으로 연결될 수 있는 발현 제어 서열 또는 조절 서열은 핵산에 대해 상동 또는 이종일 수 있다. 코딩 서열 및 조절 서열은 이들이 공유적으로 함께 결합되는 경우에 "기능적으로" 함께 연결되어, 코딩 서열의 전사 또는 번역이 조절 서열의 제어 하에 또는 그의 영향 하에 있다. 코딩 서열이 조절 서열과 코딩 서열의 기능적 연결로 기능적 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되어야 하는 경우, 조절 서열의 유도는, 코딩 서열에서의 리딩 프레임 시프트를 유발하지 않으면서 또는 코딩 서열이 원하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 없게 하지 않으면서, 코딩 서열의 전사를 초래한다.
용어 "발현 제어 서열" 또는 "조절 서열"은 본 발명에 따라 핵산의 전사 또는 유래된 RNA의 번역을 제어하는 프로모터, 리보솜 결합 서열 및 다른 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조절 서열이 제어될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종에 따라 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 전사 또는 번역의 개시에 관여하는, 5'-비전사된 서열 및 5'- 및 3'-비번역된 서열, 예컨대 TATA-박스, 캡핑-서열, CAAT-서열 등을 포함한다. 특히, 5'-비전사된 조절 서열은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 조절 서열은 또한, 인핸서 서열 또는 상류 활성화제 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따르면, 세포에서 발현될 RNA가 상기 세포 내로 도입된다. 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 세포 내로 도입되어야 하는 RNA는 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득된다.
본 발명에 따르면, 용어 "발현할 수 있는 RNA" 및 "코딩하는 RNA"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 특별한 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여, 적절한 환경에, 바람직하게 세포 내에 존재하는 경우에는, 상기 RNA가 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산하도록 발현될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 RNA는 세포성 번역 기구와 상호 작용하여 그것이 발현할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
"전달", "도입" 또는 "형질감염"과 같은 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 핵산, 특히 외인성 또는 이종 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포는 기관, 조직 및/또는 유기체의 부분을 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산의 투여는 있는 그대로의 핵산으로서 또는 투여 시약과 조합하여 달성된다. 바람직하게, 핵산의 투여는 있는 그대로의 핵산의 형태이다. 바람직하게, RNA는 안정화 물질, 예컨대 RNase 억제제와 조합하여 투여된다. 본 발명은 또한, 핵산을 세포 내로 반복적으로 도입하여 연장된 기간 동안 지속적인 발현을 허용하는 것을 구상한다.
세포는, 예를 들어, RNA와 복합체를 형성하거나 또는 RNA가 봉입되거나 또는 캡슐화되는 소포를 형성함으로써, RNA와 연합될 수 있는 임의의 담체로 형질감염시켜, 있는 그대로의 RNA와 비교하여 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 담체는, 예를 들어, 지질-함유 담체, 예컨대 양이온성 지질, 리포솜, 특히 양이온성 리포솜 및 미셀 및 나노 입자를 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 임의의 양이온성 지질이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
바람직하게, 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 세포, 특히 생체내에 존재하는 세포 내로 도입하면, 이러한 세포에서 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현이 초래된다. 특별한 실시양태에서, 특별한 세포에 대한 핵산의 표적화가 바람직하다. 이러한 실시양태에서, 핵산을 세포 (예를 들어, 레트로바이러스 또는 리포솜)에 투여하기 위해 적용되는 담체는 표적화 분자를 나타낸다. 예를 들어, 분자, 예컨대 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드가 핵산 담체 내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 결합될 수 있다. 핵산이 리포솜에 의해 투여되는 경우, 세포내 이입과 연관되는 표면 막 단백질과 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위해 리포솜 제형 내로 혼입될 수 있다. 이러한 단백질은 특별한 세포 유형에 특이적인 그의 단편의 캡시드 단백질, 내재화되는 단백질에 대항한 항체, 세포 내 위치를 표적으로 하는 단백질 등을 포괄한다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 바람직하게, 무손상 세포, 즉 그의 정상적인 세포내 성분, 예컨대 효소, 세포 소기관 또는 유전 물질을 방출하지 않는 무손상 막을 갖는 세포이다. 무손상 세포는 바람직하게, 생존 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게 상기 용어는 본 발명에 따라, 외인성 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 용어 "세포"는 본 발명에 따라 원핵 세포 [예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)] 또는 진핵 세포 (예를 들어, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 외인성 핵산은 (i) 그 자체로서 자유롭게 분산되거나, (ii) 재조합 벡터에 혼입되거나, 또는 (iii) 숙주 세포 게놈 또는 미토콘드리아 DNA에 통합된 세포 내부에서 발견될 수 있다. 포유 동물 세포, 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류로부터의 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있고, 1차 세포 및 세포주를 포함한다. 구체적인 예는 각질 세포, 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함한다. 추가 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식 세포이다.
핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게, 핵산에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현한다.
용어 "클로날 확장"은 특이적 실체가 크게 증가되는 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 용어는 바람직하게, 림프구가 항원에 의해 자극되고, 증식하며, 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는 면역학적 반응의 맥락에서 사용된다. 바람직하게, 클로날 확장은 림프구의 분화로 이어진다.
"감소" 또는 "억제"와 같은 용어는 수준에 있어서, 바람직하게 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더 바람직하게 50% 이상, 가장 바람직하게 75% 이상의 전반적인 감소를 야기할 수 있는 능력에 관한 것이다. 용어 "억제" 또는 유사한 문구는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가", "증강", "촉진" 또는 "연장"과 같은 용어는 바람직하게, 약 적어도 10%, 바람직하게 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30%, 바람직하게 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 바람직하게 적어도 80%, 바람직하게 적어도 100%, 바람직하게 적어도 200% 및 특히 적어도 300% 만큼의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관한 것이다. 이들 용어는 또한, 0 또는 측정 불가능하거나 또는 검출 불가능한 수준에서 0 초과의 수준 또는 측정 가능하거나 또는 검출 가능한 수준으로의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 면역요법에 유용한 것으로서 예측되는 아미노산 변형을 확인하는 방법을 제공한다. 아미노산 변형은 환자의 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드에 존재한다. 용어 "환자의 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드"는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현이 실험적으로 시험되었다는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 오히려, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 환자의 이환된 세포 내에 존재하므로, 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드가 환자의 이환된 세포에서 발현될 가능성이 있다는 것을 의미하는 것이다.
면역요법에 유용한 것으로서 예측되는 아미노산 변형이 백신을 설계하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 백신은 이환된 세포에 의해 발현되고 본 발명의 방법에 의해 면역요법에 유용한 것으로서 예측되는 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예컨대 RNA를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으로 또는 부가적으로, 백신은 이환된 세포에 의해 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 포함하는 백신 펩티드 또는 폴리펩티드 (여기서, 상기 단편은 본 발명의 방법에 의해 면역요법에 유용한 것으로서 예측되는 아미노산 변형을 포함한다), 또는 상기 백신 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예컨대 RNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법이, 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이 (1) 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성이고/이거나, (2) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성이고/이거나, (3) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성이라는 것을 나타내는 경우, 상기 백신 펩티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게 적어도, 상기 단편을 커버하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열 또는 더 긴 서열, 즉 백신 서열을 포함한다.
본 발명의 방법이, 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 단편이 (1) 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성이고/이거나, (2) 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성이라는 것을 나타내는 경우, 상기 백신 펩티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게 적어도, 상기 단편을 커버하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열 또는 더 긴 서열, 즉 백신 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "백신"은 투여 시 면역 반응, 특히 세포성 면역 반응을 유도하여 병원체 또는 이환된 세포, 예컨대 암 세포를 인식하고 공격하는 제약 제제 (제약 조성물) 또는 산물에 관한 것이다. 백신은 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 용어 "개인화된 암 백신" 또는 "개별화된 암 백신"은 특별한 암 환자에 관한 것이며, 암 백신을 개별 암 환자의 필요 또는 특수한 환경에 적응시킨다는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 백신은 본 발명의 방법에 의해 면역요법에 유용한 것으로서 예측되는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형된 펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함할 수 있다.
환자에게 투여될 때 본 발명에 따라 제공된 암 백신은 바람직하게, 환자의 이환된 세포, 예컨대 환자의 종양에 특이적인 T 세포를 자극, 프라이밍 및/또는 확장하는 데 적합한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제공한다. T 세포는 바람직하게, T 세포 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대항하여 유도된다. 본원에 기재된 백신은 바람직하게, 클래스 I MHC로의 하나 이상의 종양 관련 신생 항원의 제시를 특징으로 하는 암 질환에 대항한 세포성 반응, 바람직하게 세포 독성 T 세포 활성을 유도 또는 촉진할 수 있다. 암 특이적 돌연변이를 표적으로 하는 백신은 환자의 종양에 특이적일 것이다.
본 발명에 따라 제공되는 백신은 환자에게 투여될 때 바람직하게, 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예컨대 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상 및 바람직하게 60개 이하, 55개 이하, 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 T 세포 에피토프를 제공하여, 본 발명의 방법에 의해 면역원성인 것으로서 예측되는 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드를 혼입시킨 백신에 관한 것이다. 이러한 T 세포 에피토프는 본원에서 "네오-에피토프"로 일컬어지기도 한다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이들 에피토프의 제시는 바람직하게, MHC와 결합될 때 에피토프를 표적화하는 T 세포를 초래하므로, 그러한 T 세포 에피토프가 유래되는 항원을 발현하고 종양 세포의 표면 상에 동일한 에피토프를 제시하는 환자의 종양, 바람직하게 원발성 종양뿐만 아니라 종양 전이를 표적화하는 T 세포를 초래한다.
본 발명의 방법은 암 백신 접종을 위해 확인된 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드의 유용성을 결정하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 따라서 추가 단계는 하기 중 하나 이상을 수반할 수 있다: (i) 상기 변형이 공지되거나 또는 예측된 MHC 제시된 에피토프에 위치하는지의 여부를 평가하는 것, (ii) 상기 변형이 MHC 제시된 에피토프에 위치하는지의 여부를 시험관내 및/또는 인 실리코 시험하는 것, 예를 들어, 상기 변형이 MHC 제시된 에피토프로 프로세싱되고/되거나 이러한 에피토프로서 제시되는 펩티드 서열의 일부인지의 여부를 시험하는 것, 및 (iii) 예상되는 변형된 에피토프가, 특히 그의 자연 서열 맥락에서 존재할 때, 예를 들어 자연적으로 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드에서 상기 에피토프를 또한 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹될 때, 및 항원 제시 세포에서 발현될 때, T 세포, 예컨대 원하는 특이성을 갖는 환자의 T 세포를 자극할 수 있는지의 여부를 시험관내 시험하는 것. 이러한 플랭킹 서열 각각은 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상 및 바람직하게 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 에피토프 서열을 N-말단적으로 및/또는 C-말단적으로 플랭킹할 수 있다.
본 발명에 따라 결정된 변형된 펩티드는 암 백신 접종을 위한 에피토프로서의 유용성에 대하여 순위가 매겨질 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 확인된 변형된 펩티드가, 제공될 각각의 백신에서의 유용성을 알아보기 위해 분석되고 선택되는 수동 또는 컴퓨터 기반 분석 프로세스를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 분석 프로세스는 컴퓨터를 이용한 알고리즘 기반 프로세스이다. 바람직하게, 상기 분석 프로세스는 면역원성 능력의 예측에 따라 에피토프를 결정하고/하거나 순위를 매기는 것을 포함한다.
본 발명에 따라 확인되고 본 발명의 백신에 의해 제공되는 네오-에피토프는 바람직하게, 상기 네오-에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 폴리에피토프성 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 특히 RNA의 형태로 존재한다. 더욱이, 네오-에피토프는 백신 서열의 형태로 폴리펩티드에 존재할 수 있으며, 즉 예를 들어, 자연적으로 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드에서 상기 에피토프를 또한 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹된, 그의 자연 서열 맥락에서 존재할 수 있다. 이러한 플랭킹 서열은 각각, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상 및 바람직하게 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 에피토프 서열을 N-말단적으로 및/또는 C-말단적으로 플랭킹할 수 있다. 따라서, 백신 서열은 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상 및 바람직하게 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 네오-에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩티드 두부 대 미부로 정렬되어 있다.
한 실시양태에서, 네오-에피토프 및/또는 백신 서열은 링커, 특히 중성 링커에 의해 이격된다. 본 발명에 따른 용어 "링커"는 2개의 펩티드 도메인 사이에 부가된 펩티드, 예컨대 상기 펩티드 도메인을 연결하기 위한 에피토프 또는 백신 서열에 관한 것이다. 링커 서열에 관한 특별한 제한은 없다. 그러나, 링커 서열이 2개의 펩티드 도메인 간의 입체 장애를 감소시키고, 잘 번역되며, 에피토프의 프로세싱을 지지하거나 또는 허용하는 것이 바람직하다. 더욱이, 링커는 면역원성 서열 요소가 없거나 또는 거의 없어야 한다. 링커는 바람직하게, 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수도 있는 인접한 네오-에피토프 간의 접합 봉합으로부터 생성된 것과 같은 비-내인성 네오-에피토프를 창출해서는 안된다. 따라서, 폴리에피토프성 백신은 바람직하게, 원치 않는 MHC 결합 접합 에피토프의 수를 감소시킬 수 있는 링커 서열을 함유해야 한다. 문헌 [Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) and Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004)]에는 글리신 풍부 서열이 프로테아솜 프로세싱을 손상시키고, 따라서 글리신 풍부 링커 서열의 사용이 프로테아솜에 의해 프로세싱될 수 있는 링커-함유 펩티드의 수를 최소화하는 작용을 하는 것으로 나타났다. 더욱이, 글리신은 MHC 결합 그루브 위치에서 강한 결합을 억제하는 것으로 관찰되었다 (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). 문헌 [Schlessinger et al. (Proteins, 61 (1), 115-26, 2005)]에서는 아미노산 서열에 포함된 아미노산 글리신 및 세린이, 프로테아솜에 의해 보다 효율적으로 번역되고 프로세싱되는 보다 유연한 단백질을 초래하여, 상기와 같이 코딩된 네오-에피토프에 대한 더 나은 접근을 가능하게 한다는 것이 밝혀졌다. 링커는 각각, 3개 이상, 6개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상 및 바람직하게 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게 링커에는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부하다. 바람직하게, 링커의 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 글리신 및/또는 세린이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 링커는 아미노산 글리신 및 세린으로 실질적으로 구성된다. 한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e을 포함하며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택된 수이고, a + b + c + d + e는 0과 다르며, 바람직하게 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 한 실시양태에서, 링커는 본 실시예에 기재된 링커 서열, 예컨대 서열 GGSGGGGSG을 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 본 발명에 따른 폴리에피토프성 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드를 생산하기 위해 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에서 발현될 수 있는 핵산, 바람직하게 RNA, 예컨대 시험관내 전사된 또는 합성 RNA의 형태로 환자에게 투여된다. 본 발명은 또한, 본 발명의 목적을 위해 바람직하게, 하나 이상의 폴리펩티드를 생산하기 위해 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에서 발현될 수 있는 핵산, 바람직하게 RNA, 예컨대 시험관내 전사된 또는 합성 RNA의 형태의, 용어 "폴리에피토프성 폴리펩티드"로써 포함되는 하나 이상의 다중 에피토프성 폴리펩티드의 투여를 구상한다. 2개 이상의 다중 에피토프성 폴리펩티드를 투여하는 경우, 상이한 다중 에피토프성 폴리펩티드에 의해 제공되는 네오-에피토프는 상이하거나 또는 부분적으로 중복될 수 있다. 일단 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에 존재하면, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 따라 확인된 네오-에피토프를 생산하도록 프로세싱된다. 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는 바람직하게, MHC 제시된 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대항하여 CD8+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 I-제시된 에피토프를 제공한다. 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는 또한, MHC 제시된 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대항하여 CD4+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 II-제시된 에피토프를 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는 하나 이상의 네오-에피토프 (공지된 네오-에피토프 및 본 발명에 따라 확인된 네오-에피토프 포함)뿐만 아니라 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않지만 암 세포에 의해 발현되고 바람직하게 암 세포에 대항한 면역 반응, 바람직하게 암 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프를 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 제공된 백신은 재조합 백신일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전 공학을 통해 만들어진"을 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 "재조합 실체", 예컨대 재조합 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않으며, 바람직하게 자연에서는 조합되지 않는 실체, 예컨대 아미노산 또는 핵산 서열의 조합의 결과이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 재조합 폴리펩티드는, 예를 들어 펩티드 결합 또는 적절한 링커에 의해 함께 융합된 동일한 단백질의 상이한 부분 또는 상이한 단백질로부터 유래된 네오-에피토프 또는 백신 서열과 같은 몇 가지 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자연적으로 발생하는"은 연구 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체 (바이러스 포함)에 존재하고 자연에서 특정 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연적으로 발생한 것이다.
본원에 기재된 작용제 및 조성물은 질환, 예를 들어, 항원을 발현하고 그의 단편을 제시하는 이환된 세포의 존재를 특징으로 하는 질환이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환이다. 본원에 기재된 작용제 및 조성물은 또한, 본원에 기재된 질환을 예방하기 위한 면역화 또는 백신 접종을 위해 사용될 수 있다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종, 특이적 증상 및 징후와 연관된 의학적 병태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같이 원래 외부 공급원으로부터의 요인에 의해 유발되거나, 또는 자가 면역 질환과 같이 내부 기능 장애에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 종종, 고통받는 개인에게 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제, 또는 사망을 일으키거나, 또는 이러한 개인과 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 야기하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 보다 광범위하게 사용된다. 이러한 보다 광범위한 의미에서, 이는 때때로, 손상, 무능, 장애, 증후군, 감염, 고립된 증상, 변형된 행동, 및 구조 및 기능의 비정형 변이를 포함하는 반면, 다른 맥락 및 다른 목적에서는 이들이 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질환은 통상적으로, 개인에게 신체적으로 뿐만 아니라 정서적으로도 영향을 미치는데, 이는 많은 질환에 걸려 생활하게 되면 삶에 대한 관점과 성격이 바뀔 수 있기 때문이다.
용어 "정상"은 건강한 상태 또는 건강한 대상체 또는 조직의 상태, 즉 비-병리학적 상태를 지칭하며, 여기서 "건강한"은 바람직하게 비-암성을 의미한다.
용어 "항원과 연관된 질환" 또는 "항원을 수반하는 질환"은 항원이 연루된 임의의 질환, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현하는 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 항원을 수반하는 질환은 암 질환 또는 단순히 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 질환 관련 항원, 예컨대 종양 관련 항원일 수 있다.
"항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환"은 본 발명에 따라, 이환된 조직 또는 기관의 세포에서의 항원의 발현이 검출된다는 것을 의미한다. 이환된 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태와 비교해서 증가될 수 있다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 훨씬 초과 만큼의 증가를 지칭한다. 한 실시양태에서, 발현은 이환된 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원을 발현하는 세포를 수반하거나 또는 이러한 세포와 연관되는 질환은 암 질환을 포함한다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 특히, 이러한 암의 예는, 뼈암, 혈액 암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨병(Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신의 암, 연질 조직의 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반의 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 또한, 암 전이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 바람직하게 팽윤 또는 병변을 형성하는 세포 (신생물 세포, 종양형성 세포 또는 종양 세포로 지칭됨)의 비정상적인 성장을 지칭한다. "종양 세포"는 신속하고 비-제어되는 세포성 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 구성 및 기능적 조정의 부분적 또는 완전한 결여를 나타내고, 일반적으로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는, 조직의 뚜렷이 구별되는 덩어리를 형성한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "암" 및 "암 질환"은 용어 "종양" 및 "종양 질환"과 상호 교환 가능하게 사용된다.
"전이"는 그의 원래의 부위에서 신체의 또 다른 부분으로 암 세포가 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 프로세스이며, 원발성 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포외 매트릭스의 침입, 체강 및 혈관으로의 내피 기저막의 침투, 및 이어서, 혈액에 의해 수송된 후에 표적 기관의 침윤에 좌우된다. 최종적으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉 이차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관 형성에 의존한다. 종양 전이는 종양 세포 또는 성분이 잔존하여 전이 가능성을 일으킬 수 있기 때문에, 원발성 종양을 제거한 후에도 종종 발생한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원위 전이"에 관한 것이다.
이차 또는 전이성 종양 세포는 원래의 종양 세포와 같다. 이는, 예를 들어, 난소암이 간으로 전이되면, 이차 종양은 비정상적인 간 세포가 아닌 비정상적인 난소 세포로 구성된다. 이때, 간에서의 종양을 간암이 아닌 전이성 난소암이라고 한다.
용어 "순환 종양 세포" 또는 "CTC"은 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 분리되어 혈류에서 순환되는 세포에 관한 것이다. CTC는 상이한 조직에서 부가의 종양 (전이)의 후속 성장을 위한 시드를 구성할 수 있다. 순환 종양 세포는 전이성 질환이 있는 환자에서 전혈 1 mL 당 대략 1 내지 10개의 CTC의 빈도로 발견된다. CTC를 단리하기 위한 연구 방법이 개발되었다. CTC를 단리하기 위한 여러 연구 방법, 예를 들어 상피 세포가 흔히, 정상적인 혈액 세포에는 없는 세포 부착 단백질 EpCAM을 발현한다는 사실을 이용하는 기술이 관련 기술분야에 보고되었다. 면역 자성 비드-기반 포획은 자성 입자와 접합된 EpCAM에 대한 항체로 혈액 표본을 처리한 후, 자기장에서 태그부착된 세포를 분리하는 것을 포함한다. 그 후, 단리된 세포는 통상의 백혈구 마커 CD45뿐만 아니라 또 다른 상피 마커, 시토케라틴에 대한 항체로 염색하여, 희귀한 CTC가 백혈구 오염과 구별되도록 한다. 이러한 강력하고 반자동화된 접근법은 평균 수율이 대략 1개 CTC/mL이고 순도가 0.1%인 CTC를 확인시켜 준다 (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). CTC를 단리하는 두 번째 방법은 EpCAM에 대한 항체로 코팅하여 기능적이 되도록 한 80,000 마이크로 포스트가 내장된 챔버를 통해 전혈을 유동시키는 것을 수반하는 미세 유체 기반 CTC 캡처 장치를 사용한다. 이어서, CTC를 시토케라틴 또는 조직 특이적 마커, 예컨대 전립선 암에서의 PSA 또는 유방암에서의 HER2에 대항한 2차 항체로 염색하고, 3차원 좌표를 따라 다중 평면에서 마이크로 포스트의 자동화 스캐닝에 의해 시각화한다. CTC-칩은 50개 세포/ml의 중앙값 수율 및 1 내지 80% 범위의 순도를 갖는 환자에서 시토케라틴-양성 순환 종양 세포를 확인할 수 있다 (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). CTC를 단리할 수 있는 또 다른 가능성은 혈액 튜브에서 CTC를 포획, 확인 및 계수하는, 베리덱스, LLC (Veridex, LLC; 미국 뉴저지주 래리턴)의 셀서치(CellSearch™) 순환 종양 세포 (CTC) 시험을 사용하는 것이다. 이러한 셀서치™ 시스템은 면역 자기 표지화와 자동화 디지털 현미경의 조합을 근거로 하는 전혈 내 CTC의 열거를 위한 미국 식품 의약국 (FDA) 승인된 방법론이다. 문헌에 기재된 CTC를 단리하는 다른 방법 모두가 본 발명과 연계해서 사용될 수 있다.
악화 또는 재발은 사람이 과거에 영향을 받은 병태에 의해 다시 영향을 받을 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓고 있고, 상기 질환의 성공적인 치료를 받았으며 상기 질환이 다시 발생하는 경우, 이와 같이 새로이 발생된 질환은 악화 또는 재발로서 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 종양 질환의 악화 또는 재발은 원래의 종양 질환의 부위에서 발생할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓고 있고 성공적인 치료를 받은 경우, 악화 또는 재발은 난소 종양의 발생 또는 난소와 상이한 부위에서의 종양의 발생일 수 있다. 종양의 악화 또는 재발은 또한, 종양이 원래의 종양 부위뿐만 아니라 원래의 종양 부위와 상이한 부위에서 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고, 원래의 종양 부위와 상이한 부위에서의 종양은 이차 또는 전이성 종양이다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도, 증강 또는 억제함으로써 질환 또는 병태를 치료하는 것에 관한 것이다. 면역 반응을 이끌어내거나 또는 증폭시키도록 설계된 면역요법은 활성화 면역요법으로서 분류되는 반면, 면역 반응을 감소시키거나 또는 억제하는 면역요법은 억제 면역요법으로서 분류된다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신 접종, 또는 종양 면역화 또는 종양 백신 접종을 포함한다. 용어 "면역요법"은 또한, 자가 면역 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증의 맥락에서 부적절한 면역 반응이 보다 적합한 것으로 조정되도록 면역 반응을 조작하는 것에 관한 것이다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은, 예를 들어, 치료 또는 예방상의 이유로 면역 반응을 유도할 목적으로 개체에게 항원을 투여하는 프로세스를 설명한다.
용어 "치료적 처치" 또는 단순히 "치료"는 개체의 건강 상태를 개선시키고/시키거나 수명을 연장 (증가)시키는 임의의 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 개체에서 질환을 제거하고/하거나, 개체에서 질환의 발생을 저지 또는 느리게 하고/하거나, 개체에서 질환의 발생을 억제 또는 느리게 하고/하거나, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 현재 질환이 있거나 또는 이전에 질환이 있었던 개체에서의 재발을 감소시킬 수 있다.
용어 "예방적 처치" 또는 "예방 처치"는 질환이 개체에서 발생하는 것을 방지하기 위한 임의의 처치에 관한 것이다. 용어 "예방적 처치" 또는 "예방 처치"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
용어 "보호하다", "예방하다", "예방적", "예방" 또는 "보호적"은 개체에서 질환, 예를 들어, 종양의 발생 및/또는 전파의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것에 의한, 예를 들어, 면역요법의 예방적 투여는, 이를 수용하는 개체를 종양의 발생으로부터 보호할 수 있게 해준다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것에 의한, 예를 들어, 면역요법의 치료적 투여는 질환의 발생을 중지시킬 수 있으며, 예를 들어 종양의 진행/성장의 억제로 이어진다. 이는 종양의 진행/성장의 감속, 특히 종양의 진행의 중단을 포함하며, 이는 바람직하게 종양의 제거로 이어진다. 면역요법의 치료적 투여는, 예를 들어 기존 종양의 전파 또는 전이로부터 개체를 보호할 수 있게 해준다.
용어 "개체" 또는 "대상체"는 척추 동물, 특히 포유 동물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 포유 동물은 인간, 비-인간 영장류, 가축용 포유 동물, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험실 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 등뿐만 아니라 사육장의 동물, 예컨대 동물원의 동물이다. 용어 "대상체"는 또한, 비-포유류 척추 동물, 예컨대 조류 (특히 길들여진 조류, 예컨대 닭, 오리, 거위, 칠면조) 및 어류 (특히 양식 어류, 예를 들어 연어 또는 메기)에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동물"은 또한 인간을 포함한다. 바람직하게, 용어 "환자"는 이환된 개인에 관한 것이다.
본원에 기재된 작용제는 임의의 적합한 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 용어 "제약 조성물"은 치료상 유효한 작용제 또는 그의 염을, 바람직하게는 제약 부형제, 예컨대 완충제, 보존제 및 등장성 개질제와 함께 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 제약 조성물은 이러한 제약 조성물을 개체에게 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 치료, 예방 또는 감소시키는 데 유용하다. 제약 조성물은 또한, 관련 기술분야에서 제약 제형으로서 공지되어 있다. 제약 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다.
용어 "전신 투여"는 작용제가 개체의 체내에 상당한 양으로 광범위하게 분포되어 생물학적 효과를 나타내도록 하는 치료상 유효한 작용제의 투여를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 투여는 비경구 투여인 것이 바람직하다.
용어 "비경구 투여"는 작용제가 장을 통과하지 않도록 하는 치료상 유효한 작용제의 투여를 지칭한다. 용어 "비경구 투여"는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 동맥내 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
하나의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 근육 조직, 예컨대 골격근에 투여된다. 따라서 근육내 투여, 예컨대 근육내 주사가 바람직한 투여 경로이다.
투여는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 주사에 의해 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 주사는 바늘을 통한 것이다. 바늘 없는 주사가 대안으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 적어도 하나의 아주반트를 포함할 수 있다. 용어 "아주반트"는 항원 또는 항원 펩티드와 조합하여 개체에게 투여될 때, 면역 반응을 연장 또는 증강 또는 가속화시키는 화합물에 관한 것이다. 아주반트는 항원의 표면의 증가, 체내에서 항원의 보유 연장, 항원 방출의 지연, 대식 세포에 대한 항원의 표적화, 항원의 흡수 증가, 항원 프로세싱의 증강, 시토카인 방출의 자극, 면역 세포, 예컨대 B 세포, 대식 세포, 수지상 세포, T 세포의 자극 및 활성화, 및 면역 세포의 비특이적 활성화를 포함한, 하나 이상의 메커니즘에 의해 그의 생물학적 활성을 발휘하는 것으로 가정된다. 아주반트는 이질적 화합물 군, 예컨대 오일 에멀션 (예를 들어, 프로인트 아주반트), 미네랄 화합물 (예컨대 명반), 박테리아 산물 [예컨대, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 독소], 또는 면역 자극 복합체를 포함한다. 아주반트의 예는 사포닌, 불완전 프로인트 아주반트, 완전한 프로인트 아주반트, 토코페롤 또는 명반을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 일반적으로, "제약상 유효량" 및 "제약상 허용되는 제제"로 적용된다.
용어 "제약상 유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 용량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특별한 질환의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게, 질환 과정의 억제에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 특히 질환의 진행을 중단 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한, 상기 질환 또는 상기 병태의 발병 지연 또는 발병의 방지일 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 유효량은 치료될 병태; 질환의 중증도; 연령, 생리학적 상태, 크기 및 체중을 포함한 환자의 개별 파라미터; 치료 지속 기간; 동반되는 요법 (존재하는 경우)의 유형; 특이적 투여 경로 및 유사한 요인에 좌우될 것이다. 따라서, 본원에 기재된 조성물의 투여 용량은 다양한 이러한 파라미터에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량 (또는 상이한, 더 국재된 투여 경로에 의해 달성된 유효하게 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.
용어 "제약상 허용되는"은 제약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 는 물질의 비-독성을 지칭한다.
본 발명의 제약 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 임의로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "부형제"는 활성 성분이 아닌 제약 조성물 내의 모든 물질, 예컨대 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 향미제 또는 착색제를 나타내는 것으로 의도된다.
용어 "희석제"는 희석제 및/또는 시닝제에 관한 것이다. 더욱이, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나 이상을 포함한다.
용어 "담체"는 인간에게 투여하기에 적합한, 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제에 관한 것이다. 용어 "담체"는 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 자연 또는 합성 유기 또는 무기 성분에 관한 것이다. 바람직하게, 담체 성분은 멸균 액체, 예컨대 미네랄 오일, 동물 또는 식물로부터 유래되는 것을 포함한, 물 또는 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 참깨 오일, 해바라기 오일 등이다. 염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액은 또한, 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.
치료 용도를 위한 제약상 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 분야에 널리 공지되 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예는, 예를 들어, 탄산 마그네슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저 융점 왁스, 코코아 버터 등을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.
제약 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실무와 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)로서 또는 이에 덧붙여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 또는 코팅제(들) 및/또는 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예는 전분, 젤라틴, 자연 당, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유 유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 자연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 소듐 알지네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 예는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향미제가 제약 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 벤조산 나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제가 또한 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 임의로, 용질, 예를 들어 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 동결 건조된 조성물의 형태이다. 동결 건조된 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결 건조함으로써 수득될 수 있다.
본원에 제공된 작용제 및 조성물은 단독으로 또는 다른 치료 요법, 예컨대 수술, 방사선 조사, 화학 요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동종, 동종이계 또는 비-관련)과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상세하게 설명되고 도면 및 실시예에 의해 예시되며, 이는 예시의 목적으로만 사용되며 제한하려는 것이 아니다. 상세한 설명 및 실시예로 인해, 본 발명에 또한 포함되는 추가 실시양태는 통상의 기술자에게 접근 가능하다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. 네오-에피토프에 대항한 순수한 CD4 + 또는 이중 CD4 + /CD8 + T-세포 반응의 유도에 대한 예시적인 경우. a, 환자의 펜타토프 RNA로 자극된 환자 P19의 백신 접종 이전 및 이후의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 강화 배양물을, ST5 (종양원성 5의 억제제) 단백질 내의 돌연변이된 네오-에피토프를 커버하는 OLP가 부하된 자가 DC에 대항하여 판독하였다. b-c, 환자-특이적 펜타토프 RNA로 자극된 환자 P19의 백신 접종 이전 및 이후의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 강화 배양물을, UTP6 (작은 서브유닛 프로세스솜 성분) 단백질 내의 돌연변이된 네오-에피토프를 커버하는 OLP가 부하된 자가 DC에 대항하여 IFNγ-ELISpot으로 판독하였다. c, CD4+ 및 CD8+ T 세포 배양물은 유동 세포계수법에 의해 순도에 대한 자극 후 품질 관리되었다.
도 2. 환자 P01의 CD8 + T 세포로부터 클로닝된 NARFL-E62K-특이적 TCR의 특이성. NARFL (핵 프리라민 A 인식 인자 유사) 단백질 내의 돌연변이에 대항하여 유도된 TCR #1, #5, #7 또는 #9로 형질감염된 CD8+ T 세포를, HLA-A*3101로 형질감염된 K562 세포의 인식을 위해 IFNg-ELISpot에 의해 시험하였고, 돌연변이된 서열 또는 야생형 서열 중 하나를 커버하는 개별 15량체 펩티드로 펄싱하였다.
도 3. 네오-에피토프 RNA 백신 접종 하에 악화 위험이 높은 흑색종 환자에서의 질환 관리. a, 단일 TIL로부터 클로닝된 TCR#8의 TCR-α/β 쇄를 코딩하는 RNA를, 건강한 공여자 유래 CD8+ T 세포 내로 형질감염시키고, RETSAT-P546S OLP로 펄싱된 환자의 HLA 클래스 I 분자 중 2개를 발현하는 K562 세포 상에서 시험하였다. b, 2개의 HLA-대립 유전자 상에서의 근원적인 네오-에피토프 제시의 묘사. 돌연변이는 밑줄로 표시된다 (도 4 참조).
도 4. 동일한 돌연변이에 의해 생성된 2개의 상이한 HLA-제한된 T 세포 에피토프에 대항한 CD8 + T-세포 반응의 유도. a, 개별 P17-RETSAT-P546S OLP가 부하된 자가 DC에 대한 P17의 백신 접종 후 CD8+ T 세포의 IFNγELISpot 검정 시험. b, 다량체 염색에 의해 환자 P17로부터 백신 접종 후 TIL에서 P17-RETSAT-P546 (OLP 3 및 4에 의해 코딩됨) 내의 가장 우수하게 예측된 HLA A*6801-제한된 최소 에피토프인 HSCVMASLR을 인식하는 CD8+ T 세포의 검출. c, OLP 1 및 2를 인식하는 환자 P17의 TIL로부터 수득된 2개의 HLA B*3701-제한된 RETSAT-P546S-TCR의 특이성.
도 5: 네오-에피토프에 대항한 CD4 + T-세포와 CD8 + T-세포 둘 다에 의해 매개된 기존의 면역 반응
a, OLP 풀로 자극되고 표적 001_107을 커버하는 OLP 풀이 부하된 자가 DC에 대항한 IFNγ-ELISpot에서 판독된, 환자 P01의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 강화 배양물. 표적 001_107은 백신 접종하지 않았다. b, CD4+ 및 CD8+ T-세포 배양물 (IVS)은 유동 세포계수법에 의해 순도에 대해 자극 후 품질 관리되었다. c, OLP 풀로 자극되고 표적 006_003을 커버하는 OLP 풀이 부하된 자가 DC에 대항한 IFNγ-ELISpot에서 판독된, 환자 P06의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 강화 배양물. 표적 006_003은 백신 접종하지 않았다. d, CD4+ 및 CD8+ T-세포 배양물은 유동 세포계수법에 의해 순도에 대해 자극 후 품질 관리되었다.
실시예
본원에 사용된 기술 및 방법은 본원에 기재되거나 또는 그 자체로 공지되고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]에 기재된 바와 같은 방식으로 수행된다. 키트 및 시약 사용을 포함한 모든 방법은 구체적으로 나타내지 않는 한 제조업체의 정보에 따라 수행된다.
실시예 1: 재료 및 방법
연구 설계
본 다기관 공동 I 상 연구 (NCT02035956)의 주요 목표는 백신의 안전성 및 백신-유도된 항원 특이적 면역 반응을 평가하는 것이었다.
본 연구는 헬싱키 선언 및 우수 임상 실무 지침에 따라 그리고 각각의 참여 사이트의 기관 검토 위원회 또는 독립적인 윤리위원회와 유능한 규제 당국에 의한 승인에 따라 수행되었다. 모든 환자는 서면 동의서를 제공하였다.
적격 환자는 18세 이상이고, 치료의 임의의 단계에서 완전 완화, 부분 완화 또는 안정적 질환에서 악성 흑색종 병기 IIIA-C 또는 IV (AJCC 2009 흑색종 분류)를 가졌다. 전이를 동반한 환자는 자신의 개별화된 백신을 입수할 수 있을 때까지 활성 화합물로 치료할 수 있는 경우에 자격이 있었다. 환자는 적절한 혈액학적 및 말초 기관 기능을 가져야 했다. 주요 배제 기준은 임상적으로 관련된 자가 면역 질환, HIV, HBV, HCV 및 급성 EBV 또는 CMV 감염 및 뇌 전이였다. 정기적인 치료는 43일 이내에 8회 주사하는 것이고; 지속적인 치료는 조사자의 재량에 맡겨졌다. RNA 펜타토프를 1.0 mg/mL 링거 용액 [로텍스메디카(Rotexmedica) 또는 BAG 헬스케어(Healthcare)]에 희석하고 별도의 서혜부 림프절 내로 주사하였다. 2개의 상이한 용량 범위를 조사하기 위해 10명의 환자에게는 치료 당 500 μg을 투여하였고, 3명의 환자에게는 1000 μg을 투여하였다.
주요 연구 평가
면역원성 시험을 위한 백혈구 성분 채집술은 첫 번째 주사에 앞서 (방문 12; '백신 접종 이전'으로서 지칭됨) 및 8번째 백신 주사 후 (방문 20; '백신 접종 이후'로서 지칭됨)에 수행되었다.
CT 스캔 및 MRI에 의한 흉부, 복부, 뇌의 영상화는 국소 영상화 지침 및 RECIST 버전 1.1 및 면역 관련 반응 기준 (irRC) 지침에 따라 기준선 (방문 1), 백신 접종 이전 (방문 12), 제90일 (방문 21) 및 지속적인 치료 종료시 (방문 26)에 수행되었다 (Wolchok, J. D. et al. Clin. Cancer Res. 15, 7412-20 (2009)). 안전성은 등급 1에서 등급 5까지 CTCAE v4.03에 따라 그 특징이 규명되었다.
여기에 제시된 데이터는 2016년 11월의 데이터 마감 날짜를 사용한 탐색적 중간 분석에 근거한 것이다.
환자 물질
포르말린 고정된 및 파라핀 포매된 (FFPE) 또는 신선한 냉동 종양 조직을 일상적인 진단 절제술에서 획득하였고, 종양 함량을 H&E 염색된 절편에서 평가하였다.
종양 침윤 림프구 (TIL) 및 원발성 종양 세포주의 제조를 위해 신선한 종양 샘플을 사용하였다.
TIL은 이전에 공개된 바와 같이, 2% 인간 혈청 알부민 [CSL-베링(CSL-Behring)] 및 6000 U/mL IL-2 [프로류킨(Proleukin) S, 노바르티스(Novartis)]와 함께 X-비보(Vivo) 15 배지 [론자(Lonza)]에서 배양된 작은 조각의 신선한 종양 조직으로부터 2주 동안 성장시켰다 (Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J. & Rosenberg, S. A. J. Immunother. 26, 332-42). 그 후, 30 ng/mL 항-CD3 IgG2a [클론 OKT3, 이바이오사이언시스(eBiosciences)] 및 300 U/mL IL-2 (프로류킨 S, 노바르티스)의 존재하에 공급자 세포로서 방사선 조사된 동종이계 PBMC를 사용하여 TIL을 2주 동안 확장시켰다.
환자 유래 흑색종 세포주의 생성을 위해, 신선한 종양 조직 단편을 15% FCS [바이오크롬 AG(Biochrome AG)]가 보충된 RPMI1640 배지 [라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]에서 배양하였다.
면역 모니터링을 위해 수득되거나 또는 제조 프로세스를 위한 출발 물질로서 수득된 PBMC를, 건강한 공여자의 연막으로부터 또는 흑색종 환자의 말초 혈액 샘플로부터 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) [아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)] 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리하였다. 미숙한 DC (DC)는 이전에 보고된 바와 같이 생성되었다 (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)).
차세대 시퀀싱
퀴아젠(Qiagen)의 QIAamp DNA FFPE 조직 키트의 변형된 버전을 사용하여 3개의 10 μm-컬 FFPE 종양 조직으로부터 DNA를 삼중으로 추출하였다. FFPE 종양 컬로부터의 RNA 추출은 퀴아젠의 RNeasy FFPE 키트를 사용하여 이중으로 수행하였다. 신선한 냉동 종양 샘플 또는 세포로부터의 DNA 및 RNA 추출을 위해, 퀴아젠의 DNeasy 혈액 및 조직 키트 및 RNeasy 미니 키트를 각각 사용하였다.
추출된 핵산을 다양한 라이브러리의 생성에 사용하였다. RNA-Seq 라이브러리는 일루미나의 TruSeq RNA 샘플 프렙 키트 V2 및 1 μg 전체 RNA를 입력으로서 사용하여 FFPE 종양 또는 세포주 RNA로부터 이중으로 제조되었다. DNA 엑솜 포획 라이브러리는 애질런트(Agilent)의 슈어셀렉트(SureSelect) XT V4 휴먼 올 엑손(Human All Exon)을 사용하여 1 내지 3 μg의 FFPE 종양 DNA 및 매칭 PBMC DNA로부터 이중으로 구축되었다.
MZ-GaBa-018의 전체 게놈 시퀀싱 (WGS) 및 매칭 PBMC에 대한 NGS 라이브러리는 마이크로TUBE-15 [코바리스 리미티드(Covaris Ltd)]를 사용하여 15 μL의 총 용적 중의 게놈 DNA 100 ng을 단편화하여 대략 160 bp의 평균 단편 길이가 되도록 함으로써 제조하였다. 라이브러리는 25 ng의 단편화된 gDNA를 입력으로서 사용하여 일루미나®의 경우 NEB의 NEBNext® 울트라™ DNA 라이브러리 프렙 키트로 준비되었다.
차세대 시퀀싱 (NGS)을 위해, 라이브러리를 2 nM 또는 10 nM로 희석하고 일루미나 TruSeq PE 클러스터 키트 v3-cBot-HS를 사용하여 10 pM에서 클러스터링했다. 각각의 엑솜 포획 라이브러리는 하나의 레인에서 별도로 시퀀싱된 반면, RNA 라이브러리 복제물은 하나의 레인에서 2-플렉스로서 시퀀싱되었다. 모든 라이브러리는 일루미나의 TruSeq SBS 키트 v3-HS 50 사이클 중 2가지를 사용하여 일루미나 HiSeq 2500 플랫폼 상에서 페어드 엔드(paired-end) 50 nt를 시퀀싱하였다. MZ-GaBa-018 세포주 및 매칭 PBMC WGS 라이브러리를, 각각 4개 레인에 걸쳐 확산시키고, 일루미나의 TruSeq SBS 키트 v3-HS 200 사이클을 사용하여 동일한 플랫폼 상에서 페어드 엔드 100 nt를 시퀀싱하였다.
생물 정보학 및 돌연변이 발견
단일 환자에 대한 모든 돌연변이체 관련 데이터 분석 단계는 피톤(Python) 프로그래밍 언어로 구현된 소프트웨어 파이프라인에 의해 조정되었다. DNA 라이브러리의 경우에는, 최소 150 x 106개의 페어드 엔드 50 nt 판독치가 필요하고, RNA 라이브러리의 경우에는, 최소 75 x 106개의 페어드 엔드 50 nt 판독치가 필요하였다.
돌연변이 검출을 위해, DNA 판독치를 bwa를 사용하여 참조 게놈 hg19에 정렬시켰다 (Li, H. & Durbin, R. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)). 종양 및 매치된 정상 샘플로부터의 중복 엑솜을 단일 뉴클레오티드 변이체에 대하여 분석하였다. 정상 샘플에서 추정상의 동형 접합성 유전자형을 갖는 유전자 자리를 확인하고 필터링하여 단일 뉴클레오티드 변이체에 대한 높은 신뢰도 요구를 유지하였다. 추정상의 동형 접합성 또는 이형 접합성 돌연변이 이벤트에 대해 나머지 부위를 추가로 검사하였다. 의심되는 부위를 필터링하여 잠재적 거짓 양성물을 제거하였다. 복제물의 합을 시험하고 복제물을 별도로 시험함으로써 복제물을 혼입시켰다. 단일 뉴클레오티드 변이체의 최종 목록은 정상 샘플에서의 높은 신뢰도 동형 접합성 부위 및 종양 샘플에서의 높은 신뢰도 이형 접합성 또는 동형 접합성 돌연변이 이벤트로 구성되었다. 변이체를 유전자, 전사체, 잠재적 아미노산 서열 변화 및 RNA-Seq 유래 발현 값과 연관시키기 위해, 확인된 변이체의 게놈 좌표를 UCSC 공지된 유전자 전사체 좌표와 비교하였다.
RNA-Seq의 경우, RNA 판독치를 보타이(bowtie)를 사용하여 hg19 참조 게놈 및 전사체에 정렬시켰고 (문헌 [Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S. L. Genome Biol. 10, R25 (2009)]), UCSC 공지된 유전자 전사체 및 엑손 좌표와 비교한 다음, RPKM 유닛으로 정규화함으로써 유전자 발현을 결정하였다 (Mortazavi, A. et al. Nat. Methods 5, 1-8 (2008)).
네오-에피토프 우선 순위 지정 및 선택
상기 확인된 단일 뉴클레오티드 변이체로부터, 46개 이하의 예측된 변이체가 진화되는 절차에 의해 선택되었다: a) 넌센스 변이체의 제거 및 0이 아닌 엑손 및 전사체 발현에 의한 필터링; 이어서, 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 46개 이하의 변이체 (P01-P04)를 선택하여 먼저 엑손 발현에 의해 분류한 다음, HLA 클래스 I 결합 예측 스코어에 의해 분류하며; b) RNA-Seq 데이터에서 넌센스 변이체의 제거 및 0이 아닌 엑손 및 전사체 발현 및 0이 아닌 변이체 빈도에 의한 필터링; 이어서, 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 23개 이하의 표적 펩티드 서열을 선택하여 먼저 엑손 발현에 의해 분류한 다음, HLA 클래스 I 결합 예측 스코어에 의해 분류한 다음; 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 23개 이하의 부가의 표적 펩티드 서열을 선택하여, 나머지 표적 펩티드 서열을 먼저 HLA 클래스 I 결합 예측 스코어에 의해 분류한 다음 엑손 발현에 의해 분류하며; 선택 단계 둘 다가 46개 초과의 선택된 변이체 (P05-P07, P09-P12)를 생성하지 않도록 하였으며; c) RNA-Seq 데이터에서 넌센스 변이체의 제거 및 0이 아닌 엑손 및 전사체 발현 및 0이 아닌 변이체 빈도에 의한 필터링; 이어서, 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 유전자 발현 ≥ 10 RPKM을 수반한 20개 이하의 표적 펩티드 서열을 선택하여 먼저 엑손 발현에 의해 분류한 다음, HLA 클래스 II 결합 예측 스코어에 의해 분류한 다음; 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 20개 이하의 부가의 표적 펩티드 서열을 선택하여, 나머지 표적 펩티드 서열을 먼저 발현에 의해 분류한 다음, HLA 클래스 I 결합 예측 스코어에 의해 분류한 다음; 안정적인 분류 알고리즘을 사용하고 46개 이하의 선택된 변이체 (P17, P19)를 충진시켜, 나머지 표적 펩티드 서열을 먼저 HLA 클래스 I 결합 예측 스코어에 의해 분류한 다음 엑손 발현에 의해 분류한다. 환자 당 10개 이하의 돌연변이된 표적 펩티드의 최종 선택은 MHC I 및 MHC II 결합 예측, 유전자 발현 및 변이체 대립 유전자 빈도에 근거하여 표적 펩티드를 평가하는 표적 선택 보드의 결정을 필요로 하였다.
HLA 결합 친화도는, HLA-A/B 결합 추정치에 대해서는 모든 변이체-함유 8 내지 11량체를 사용하고 HLA-DRB/DQB 결합 추정치에 대해서는 15량체를 사용하여, IEDB T-세포 예측 툴 (문헌 [Kim, Y. et al. Nucleic Acids Res. 40, W525-30 (2012)]) (버전 2.5)의 IEDB 권장 모드를 통해 예측되었다. 단일 변이체에 대한 모든 예측 중에서, 최상의 합의 스코어는 각각의 변이체와 연관이 있었다.
이러한 데이터에 근거하여, 생어 시퀀싱에 의해 확증하기 위해 단일 뉴클레오티드 변이체의 짧은 목록을 선택하였다.
확증적 생어 시퀀싱
프라이머 설계를 위해, 돌연변이 부위를 플랭킹하는 게놈 서열을 참조 게놈으로부터 추출하고, 프라이머3 소프트웨어에 대한 입력으로서 사용하였다 (Untergasser, A. et al. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012); Koressaar, T. & Remm, M. Bioinformatics 23, 1289-91 (2007)). 출력 프라이머 쌍을 blast를 사용하여 참조 게놈에 정렬시켰다 (Kent, W. J. Genome Res. 12, 656-64 (2002)). 표적을 벗어난 유전자 자리에 대한 정렬을 갖는 프라이머 쌍을 제거하고, 나머지 최적 프라이머 쌍을 각각의 입력 부위에 대해 돌려보냈다.
생어 시퀀싱은 PCR에 의해 종양 조직 및 PBMC DNA로부터 선택된 각각의 돌연변이된 유전자 자리를 증폭시킴으로써 수행되었다 (초기 활성화를 위해 95℃에서 15분, 이어서 변성을 위해 94℃에서 30초, 어닐링을 위해 60℃에서 30초, 연장을 위해 72℃에서 30초, 및 최종 연장을 위해 72℃에서 6분의 35주기). 각각의 PCR 산물을 QIAxcel (퀴아젠) 장치를 사용하여 품질 관리하였고, ExoI/AP 처리 또는 MinElute PCR 정제 키트 (퀴아젠®)를 통해 정제하였다. 생어 시퀀싱은 유로핀스(Eurofins)/MWG (독일 에베르스베르크)에 의해 수행되었다.
시험관내 전사된 RNA의 제조
GMP (우수 제조 관리 기준) 지침에 따라 제조를 수행하였다. 5개의 추정상의 네오-에피토프를 코딩하는 합성 DNA 단편을, 개선된 RNA 안정성 및 번역 효율을 위한 HLA 클래스 I 및 II 경로 및 골격 서열 요소에 대한 최적화된 경로 지정을 위해 sec- 및 MITD-도메인 (문헌 [Kreiter, S. et al. J. Immunol. 180, 309-318 (2008)])을 함유하는 출발 벡터 내로 클로닝하였다 (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)). DNA를 선형화하고, 분광광도계로 정량화하며, 클린 룸 환경에서 7.5 mM ATP, CTP, UTP, GTP 및 3 mM 베타-S-ACA(D1) 캡 유사체 (문헌 [Kuhn, A. N. et al. Gene Ther. 17, 961-971 (2010)])의 존재하에 이전에 보고된 바와 같이 (문헌 [Grudzien-Nogalska, E. et al. Methods Mol. Biol. 969, 55-72 (2013)]) T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사시켰다. RNA를 자성 입자를 사용하여 정제하고 (문헌 [Berensmeier, S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 495-504 (2006)]), 겔 전기 영동 및 미세 유체 모세관 전기 영동 [엑스페리온(Experion), 바이오래드(Biorad)]에 의해 완전성을 평가하였다. 추가 분석은 농도, 외관, pH, 삼투질 농도, 역가, 내독소 수준 및 무균의 결정을 포함하였다.
PBMC의 시험관내 자극
CD4+ 및 CD8+ T 세포를, 마이크로 비드 [밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec)]를 사용하여 냉동 보존된 PBMC로부터 단리하였다. T 세포, CD4- 또는 CD8-고갈된 PBMC를 밤새 방치하였다. CD4- 또는 CD8-고갈된 PBMC를 환자-특이적 돌연변이된 표적, eGFP, 인플루엔자 매트릭스 단백질 1 (M1) 또는 파상풍 p2/p16 서열 (양성 대조군)을 코딩하는 RNA로 전기천공하고, 37℃에서 3시간 동안 방치하고, 15 Gy 하에 방사선 조사하였다. 이어서, CD4+/CD8+ T 세포 및 전기천공되고 방사선 조사된 항원 제시 세포를 2:1의 이펙터 대 표적 비로 조합하였다. 하루가 지난 후, 10 U/mL IL-2 (프로류킨 S, 노바르티스) 및 5 ng/mL IL-15 [페프로테크(Peprotech)]를 함유하는 신선한 배양 배지를 부가하였다. 배양물을 설정한 지 7일 후에 IL-2를 보충하였다. 자극 11일 후, 세포를 유동 세포계수법을 통해 분석하고 ELISpot 검정에 사용하였다.
ELISpot
IFNγ에 특이적인 항체 [맵테크(Mabtech)]로 미리 코팅된 멀티 스크린 필터 플레이트 [머크 밀리포어(Merck Millipore)]를 PBS로 세척하고, 2% 인간 혈청 알부민 (CSL-베링)을 함유하는 X-비보 15 (론자)로 1 내지 5시간 동안 차단하였다. RNA로 전기천공되거나 또는 펩티드가 부하된 자가 DC, 흑색종 세포주 또는 HLA 클래스 I 또는 II 형질감염된 K562 세포를 사용하여, 0.5 내지 3 x 105개의 이펙터 세포/웰을 16 내지 20시간 (TIL의 경우 40시간) 동안 자극시켰다. 생체외 T-세포 반응의 분석을 위해, 냉동 보존된 PBMC를 37℃에서 2 내지 5시간의 휴지 기간 후에 ELISpot에 적용하였다. 모든 시험은 이중 또는 삼중으로 수행되었으며, 검정 양성 대조군 [스타필로코쿠스 장독소(Staphyloccocus Enterotoxin) B (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))]뿐만 아니라 공지된 반응성을 갖는 참조 공여자로부터의 세포를 포함하였다. 스폿을 비오틴-접합된 항-IFNγ 항체 (맵테크)로 시각화한 다음, 엑스트라비딘-알칼린 포스파타제 (시그마 알드리치) 및 BCIP/NBT 기질 (시그마 알드리치)과 함께 인큐베이션하였다. CTL의 이뮤노스폿(ImmunoSpot®) 시리즈 S 5 베르사 ELISpot 분석기 (S5Versa-02-9038)를 사용하여 플레이트를 스캔하고 이뮤노캡처(ImmunoCapture) V6.3 소프트웨어에 의해 분석하였다. 스폿 계수는 3회 반복실험 각각에 대한 중앙값으로서 요약되었다. 돌연변이된 RNA 또는 펩티드에 의해 자극된 T-세포 반응을 대조군 RNA (루시페라제) 전기천공된 표적 세포 또는 비-부하된 표적 세포 각각과 비교하였다. 생체외 환경에서 1 x 105개의 세포 당 최소 5개의 스폿 또는 IVS 이후 환경에서 5 x 104개의 세포 당 25개의 스폿뿐만 아니라 각각의 대조군보다 2배 초과하여 높은 스폿 계수를 갖는 반응이 양성으로서 정의되었다.
다량체 염색 및 데이터 분석
돌연변이 특이적 CD8+ T 세포는 면역원성 돌연변이로부터 9개 또는 10개의 아미노산 길이의 에피토프를 운반하는 덱스트라머 [이뮤덱스(Immudex)]를 사용하여 확인되었다. 세포 표면 마커 [CD28 CD28.8, CD197 150503, CD45RA HI100, CD3 UCHT1, CD16 3G8, CD14, MΦP9, CD19 SJ25C1, CD27 L128, CD279 EH12, CD8 RPA-T8 (모두 BD 및 CD4 OKT4 바이오레전드(Biolegend))]의 염색 및 생사(live-dead) 염색 (DAPI BD)을 수행한 후, 세포를 먼저 다량체로 염색하였다. 이어서, 이와 같이 염색된 세포를 BD LSR 포르테사(Fortessa) SORP에서 획득하였다. 단일선의 살아있는 다량체 양성 이벤트가 CD3 (또는 CD8) 양성, CD4/CD14/CD16/CD19 음성 또는 CD3 (또는 CD8) 양성/CD4 음성 이벤트 내에서 확인되었다. 환자-특이적 네오-에피토프에 대한 HLA-A*0201 덱스트라머의 특이성은 HLA-A*0201+ 혈액 공여자의 염색 결여로써 입증된다.
세포내 시토카인 염색
단일 네오-에피토프를 코딩하는 RNA로 전기천공된 자가 DC를 10:1 E:T 비로 부가하고, 브레펠딘(Brefeldin) A 및 모넨신(Monensin)의 존재하에 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 생육력 [고정 생육력 염료 이플루오르(eFluor)506, 이바이오사이언스(eBioscience)]에 대하여 세포를 염색한 후, 표면 마커 (CD8 SK1 BD, CD4 OKT4, 바이오레전드)에 대하여 염색하였다. 투과화 후, 세포내 시토카인 염색 [IL-2 MQ1-17H12, IFNγ B27 (모두 BD 및 TNFα Mab11 바이오레전드)]을 수행하고 샘플을 BD FACS 칸토(Canto) II [벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)]에서 획득하였다.
단일 세포 분류
PBMC, 정제된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 또는 TIL의 11일의 항원 특이적 확장 후 단일 항원 특이적 T 세포의 분류를 수행하였다. 분류하기 전에, 2 x 106개의 확장된 T 세포를, 각각의 신생 항원 또는 대조군 항원을 코딩하는 IVT RNA로 형질감염된 2 x 105개의 자가 DC로 재자극시켰다. 16 내지 20시간 후, 세포를 수거하고, IFNγ 분비 검정 키트 (밀테니이 바이오테크)를 사용하여 IFNγ 뿐만 아니라 CD14, CD19, CD3, CD8, CD4, CD137, CD134 [모두 BD 바이오사이언시스(Biosciences)로부터 구입함]에 대항하여 유도된 플루오로크롬-접합된 항체로 처리하였다. 단일 신생 항원 특이적 T 세포의 분류를 BD FACS 아리아(Aria) 유동 세포계수기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 시행하였다. 웰당 하나의 이중 양성 세포 (IFNγ/CD8, CD137/CD8, IFNγ/CD4 또는 CD134/CD4)를, 3T3-L1 담체 세포를 함유하는 96-웰 V-바닥 플레이트 [그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One)]에서 수거하고, 원심분리하며, -65℃ 내지 -85℃에서 저장하였다.
네오-에피토프-특이적 TCR의 클로닝
단일 T 세포로부터 TCR 유전자의 클로닝을 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)). 간단히 말해서, 마이크로 RNeasy 키트 (퀴아젠)로 추출된 전체 RNA는 리버트에이트(RevertAid) H-역전사효소 [써모 피셔(Thermo Fisher)]를 사용한 템플릿-스위치 cDNA 합성에 사용되었고, 그 후 푸울트라 핫스타트(PfuUltra Hotstart) DNA 폴리머라제 (애질런트)를 사용하여 사전 증폭시켰다. 이로써 생성된 cDNA의 분취량을 Vα-/Vβ 유전자-특이적 멀티플렉스 PCR에 사용하였다. 모세관 전기 영동 시스템 (퀴아젠) 상에서 산물을 분석하였다. 430 내지 470 bp의 밴드를 갖는 샘플을 아가로스 겔 상에서 크기 분획화하고, 겔 추출 키트 (퀴아젠)를 사용하여 밴드를 절제 및 정제하였다. 정제된 단편을 시퀀싱하고 각각의 V(D)J 접합을, IMGT/V-Quest 툴을 사용하여 분석하였다 (Brochet, X., Lefranc, M.-P. & Giudicelli, V. Nucleic Acids Res. 36, W503-8 (2008)). 신규하고 생산적으로 재배열된 상응하는 TCR 쇄의 DNA를 NotI-소화시키고, 완전한 TCR-α/β 쇄의 시험관내 전사를 위한 적절한 골격을 함유하는 pST1 벡터 내로 클로닝하였다 (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)).
TCR-α/β 심층 시퀀싱은 TCR-Typer 키트 [바이오앤테크 다이아그노스틱스(BioNTech Diagnostics)]를 사용하여 PBMC로부터의 전체 RNA로 수행되었다. 이로써 생성된 DNA 라이브러리를 2 x 300 bp 페어드 엔드 화학을 사용하여 일루미나 MiSeq 서열분석기 상에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 데이터는 타이퍼(Typer) 툴박스 소프트웨어로 분석되었다. 샘플 당 총 TCR 판독 수는 1.1 x 106 내지 1.5 x 106의 범위였다.
qRT-PCR
RNA 및 cDNA는 익스프레스아트(ExpressArt) FFPE 클리어 RNAready 키트 [앰프테크(AmpTec)] 및 gDNA 이레이저가 장착된 프라임스크립트(PrimeScript™) RT 시약 키트 [다카라 바이오 인크.(Takara Bio Inc.)]로 각각 생성되었다. qRT-PCR은 바이오마크(BioMark™) HD 시스템 [플루이다임(Fluidigm®)] 또는 96-웰 어플라이드 바이오시스템즈 7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행되었다. 바이오마크™ 또는 "바이오마크™ HD 시스템 플루이다임® 진보된 개발 프로토콜 28" 상에서 정량적 SYBR® 그린 실시간 PCR 또는 TaqMan® 유전자 발현 검정을 사용하여 FFPE 유래 RNA로부터 "신속 유전자 발현 분석"에 따라 샘플 및 검정을 준비하고 분석하였다. 96.96 유전자 발현 동적 어레이 IFC를, IFC 컨트롤러 HX를 사용하여 부하하였다.
면역 조직 화학
3 내지 4 μm FFPE 절편의 탈파라핀화 후, 슬라이드를 120℃에서 10분 동안 0.05% 트윈-20 (pH 6.0)이 보충된 10 mM 시트르산에서 비등시킴으로써 항원 검색을 수행하고, 이어서 켄칭 (0.3% H2O2; 15분)하며, PBS 중 10% 염소 혈청으로 실온에서 차단하였다 (30분).
슬라이드를 차단 완충액 중의 0.2 μg/mL 항-인간 CD3 [F7.2.38; 다코(Dako)], 0.2 μg/mL 항-인간 CD8 (C8/144B; 다코), 1 μg/mL 항-인간 FoxP3 [236A/E7; 압캠(Abcam)], 1:200 항-PD-L1 [13684; 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies)] 또는 1:2500 항-베타-2-마이크로글로불린 (D8P1H; 셀 시그널링 테크놀로지스)과 함께 2 내지 8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 레드 기질-색소원 용액 [벡터레드(VectorRed); 벡터 랩스(Vector Labs)]과 함께 서양고추냉이-퍼옥시다제 표지된 2차 항체 [브라이트비젼 HRP, 이뮤노로직(BrightVision HRP, Immunologic)]로 항체 결합을 시각화하였다. 종양 세포를 1 μg/mL의 멜란(Melan)-A 특이적 항체 (A103, 다코)로 염색하였다.
연속해서, 절편을 메이어(Mayer)의 헤마톡실린 [칼 로스 GmbH(Carl Roth GmbH)]으로 대조 염색하고, 컴퓨터 기반 분석 [디피니언즈 디벨로퍼(Definiens Developer)]에 의해 평가하였다.
분석을 위해, 슬라이드를 스캔하고 [악시오.스캔(Axio.Scan); 차이스(Zeiss)], 수동으로 미리 정의된 종양, 정상 조직 및 괴사 영역을 컴퓨터화된 영상 분석 소프트웨어 (디벨로퍼, 디피니언즈)를 통해 정량화하였다. CD3, CD8 및 FoxP3 TIL의 수는 종양 조직으로서 분류된 영역에서 결정되었다.
HLA 항원의 클로닝
HLA 항원은 각각의 고해상도 HLA 유형 분류 결과에 따라 서비스 제공자 [유로핀스 게노믹스(Eurofins Genomics)]에 의해 합성되었다. HLA-DQA 서열은 DQA1_s (PHO-GCC ACC ATG ATC CTA AAC AAA GCT CTG MTG C) 및 DQA1_as (TAT GCG ATC GCT CAC AAK GGC CCY TGG TGT CTG) 프라이머를 사용하여 2.5 U Pfu 폴리머라제로 공여자 특이적 cDNA로부터 증폭되었다. HLA 항원을 적절하게 소화된 IVT 벡터 내로 클로닝하였다 (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)).
세포 내로의 RNA 전달
RNA를 미리 냉각된 4 mm 갭 멸균 전기 천공 큐벳 [바이오-래드(Bio-Rad)]에서 X-비보 15 배지 (론자)에 현탁된 세포에 부가하였다. BTX ECM 830 구형파 전기 천공 시스템 (T 세포: 500 V / 3 ms / 1 펄스; iDC: 300 V / 12 ms / 1 펄스; 벌크 PBMC: 400 V / 6 ms / 1 펄스; MZ-GaBa-018: 225 V / 3 ms / 2 펄스; K562: 200 V / 8 ms / 3 펄스)을 사용하여 전기 천공을 수행하였다.
펩티드
중복 펩티드 풀 (OLP)로서 지칭된, 27량체 신생 항원 서열 (신생 항원 당 4개의 OLP) 또는 대조군 항원 (HIV-gag, TPTE)을 커버하는 11개 아미노산 중복을 갖는 합성 15량체 펩티드, 또는 8 내지 11량체 에피토프로가 사용되었다. 모든 합성 펩티드는 JPT 펩티드 테크놀로지스 GmbH (JPT Peptide Technologies GmbH)로부터 구입하였고, 10% DMSO를 수반한 아쿠아데스트(AquaDest) [아쿠아 비. 브라운(Aqua B. Braun), 브라운 멜순젠(BRAUN Melsungen)]에 용해시켜 최종 농도 3 mM가 되게 하였다.
유동 세포계수 분석
형질감염된 TCR 유전자의 세포 표면 발현은 적절한 가변 영역 패밀리 또는 TCR-β 쇄 [베크만 코울터(Beckman Coulter)]의 불변 영역에 대항한 PE- 또는 FITC-접합된 항-TCR 항체, 및 FITC- 또는 APC-표지된 항-CD8/-CD4+ 항체 (BD 바이오사이언시스)를 사용하여 유동 세포계수법에 의해 분석되었다. TCR-형질감염된 T 세포의 기능을 평가하기 위해 사용된 항원 제시 세포의 HLA 항원은 FITC-표지된 HLA 클래스 II-특이적 (베크만 코울터) 및 PE-표지된 HLA 클래스 I-특이적 항체 (BD 바이오사이언시스)로 염색함으로써 검출되었다. BD FACS칸토™ II 분석 유동 세포계수기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 유동 세포계수 분석을 수행하였다. 획득한 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 버전 10 [트리 스타(Tree Star)]을 사용하여 분석되었다.
세포 독성 검정
루시페라제 기반 세포 독성 검정은 이전에 보고된 바와 같이 수행되었다 (Omokoko, T. A. et al. J. Immunol. Res. 2016, 9540975 (2016)). 루시페라제 RNA 단독으로 또는 B2M RNA와 조합하여 형질감염된 1 x 104개의 표적 세포를, 돌연변이 특이적 이펙터 T 세포 (OKT3-활성화된 TCR-형질감염된 CD8+ T 세포 또는 CD4+/CD8+ IVS T 세포)와 함께 19 내지 25시간 동안 공동 배양하였다. D-루시페린 (BD 바이오사이언시스; 최종 농도 1.2 mg/mL)을 함유하는 반응 혼합물을 부가하였다. 1시간 후, 테칸 인피니트(Tecan Infinite) M200 판독기 (테칸)를 사용하여 발광을 측정하였다. 총 루시페라제 활성의 감소를 측정함으로써 세포 사멸을 계산하였다. 루시페린의 루시페라제-매개된 산화에 의해 생존 세포를 측정하였다. 특이적 사멸은 하기 방정식에 따라 계산되었다:
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아폽토시스 검정
카스파제 3/7 활성화 아폽토시스 검정 [인큐시테(IncuCyte)]을 위해, 웰 당 1 x 104개의 흑색종 세포 및 20 x 104개의 이펙터 T 세포를, 96-웰 코닝 플레이트에서 24시간 동안 플레이팅하였다. 카스파제 3/7 시약을 5 mM 원액 [에센 바이오사이언스(Essen Bioscience)]의 1:1000 희석액으로 부가하였는데, 각각의 조건을 삼중으로 수행하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 하에 인큐시테 줌 라이브-컨텐트 영상화 시스템 (에센 바이오사이언스)에서 10배 배율로 영상화하였다. 24시간 동안 매시간마다 4개의 영상/웰을 획득하였다. 그린 (아폽토시스) 세포/영상을 검출하고 정량화하기 위해 인큐시테 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 각각의 시점에서 SD를 사용한 평균 그린 물체 계수는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 플롯되었다.
실시예 2: 네오-에피토프를 이용한 개인화된 RNA 백신 접종의 임상적 실행 가능성 및 유리한 안전성
이전에, 본 발명자들은 종양 돌연변이의 포괄적 맵핑으로부터 출발하여 개별 백신 조성물의 제조 및 방출에 이르기까지 다수의 체세포 돌연변이를 코딩하는 RNA 백신 (이후 '네오-에피토프 RNA 백신')의 설계 및 생산을 위한 개인화 관련 절차를 보고하였다 (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015); Vormehr, M. et al. J. Immunol. Res. 2015, 6 (2015); Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)). 이러한 절차는 규제 지침을 준수하는 표준화된 프로세스로 추가 개발되었다.
병기 III 및 IV 흑색종 환자의 발현된 비-동의 돌연변이는 일상적인 동결 또는 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 (FFPE) 종양 생검으로부터 및 건강한 조직 DNA의 공급원으로서의 혈액 세포로부터 핵산의 엑솜 및 RNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 돌연변이의 순위를 매기기 위해 2가지 독립적인 원칙이 적용되었다. 하나는 높은 발현 수준의 돌연변이 코딩 RNA와 조합된 환자의 HLA 클래스 II 분자에 대한 높은 친화도 결합 예측을 사용하였다. 다른 하나는 예측된 HLA 클래스 I 결합에 근거하였다. 돌연변이된 대립 유전자 빈도 및 상대적 전사 값은 유사한 예측된 HLA 결합 친화도로 돌연변이에 우선 순위를 매기기 위한 추가의 미분기로서 제공되었다. 우선 순위를 매긴 종양 특이적 체세포 돌연변이는 생어 시퀀싱에 의해 확증되었다.
환자 당 10개의 돌연변이를 선택하고 (환자 P09의 경우에만 5개), 돌연변이 중 하나를 나타내는 5개의 27량체 펩티드를 각각 코딩하는 2개의 합성 RNA (펜타토프 RNA)로 조작하였다. 우수 제조 관리 기준 (GMP) 등급 프로세스에 따라 성공률이 100%인 매우 순수한 RNA를 생산하였다. RNA 백신에 대한 중앙 미가공 제조 시간은 68일 (49일 내지 102일의 범위)이었다. 인간 최초 사용 및 조사 단계에 대한 규제 요건으로 인해, 각각의 제조된 개인화된 백신은 돌연변이의 선택에서부터 백신 출시까지 총 중앙 시간을 103일 (89일 내지 160일의 범위)로 연장하는 광범위한 분석 시험을 거쳤다.
NY-ESO-1 및/또는 티로시나제 양성 흑색종 환자에게, 그들의 네오-에피토프 RNA 백신이 출시될 때까지의 간격을 메우기 위해 이들 2개의 종양 관련 공유 자기 항원 (TAA)을 코딩하는 RNA 백신을 제공하였다. 8회 용량의 개별 RNA 백신을 초음파 제어하에 림프절 내로 경피 주사하였다. 그 후, 면역원성 시험을 위하여 백신 접종 후 혈액 샘플을 채취하였다. 조사자의 재량에 따라 네오-에피토프 백신 접종을 계속하였다.
20명의 환자가 임상 시험에 참여하도록 선별되었으며, 그 중 16명은 시험 대상 환자 기준 및 시험 제외 환자 기준에 따라 적격한 것으로 밝혀져 본 연구에 참여하였다. 2명의 환자가 동의를 철회했으며, 1명의 환자는 새롭게 진단되고 빠르게 진행되는 뇌 전이로 인해 본 연구 치료를 시작할 수 없었다. 따라서, 총 13명의 환자가 네오-에피토프 RNA 백신을 투여받았으며, 9명의 환자에게서 브리징 TAA RNA 백신이 선행되었다.
모든 환자는 20회 이하의 네오-에피토프 RNA 백신 용량을 투여받는 치료를 성공적으로 완료하였다. 환자 당 검출된 돌연변이의 수 (범위 69 내지 1440)는 흑색종에 대한 예상 범위에 있었다 (Lawrence, M. S. et al. Nature 499, 214-8 (2013); Vormehr, M. et al. Curr. Opin. Immunol. 39, 14-22 (2016)). 10명의 환자는 BRAF 또는 HRAS/NRAS 유전자에서 가장 흔한 흑색종 드라이버 돌연변이를 가졌다 (Hodis, E. et al. Cell 150, 251-263 (2012)). 돌연변이 프로파일은 UV-유도된 흑색종에 전형적인 시토신에서 티민으로의 전이 (C>T)가 다수를 차지하였다 (Pleasance, E. D. et al. Nature 463, 191-196 (2009)).
전반적으로, 모든 환자는 본 치료를 잘 견뎌냈다. 보고된 18건의 심각한 유해 사례 (SAE) 중, 2명의 환자에서의 4건의 SAE는 네오-에피토프 백신 치료 중에 발생한 것이었지만, 연구 약물과는 관련이 없었다. 네오-에피토프 백신 치료 중에 발생한 유해 사례 (AE)는 대부분 1 또는 2 등급이었다. 4 또는 5 등급의 AE는 없었다. 약물 관련 AE는 어떠한 시스템 기관 클래스에도 클러스터링되지 않았다. 임상 안전성 및 성과 데이터는 다른 곳에 상세하게 보고될 것이다.
실시예 3: 네오-에피토프 RNA 백신 접종에 의한 폴리 특이적 T-세포 면역의 유도
본 연구에서 개별적으로 투여된 125개의 네오-에피토프 각각의 면역원성을 측정하기 위해, 본 발명자들은 백신 접종 이전 및 이후 혈액 샘플로부터 고도로 강화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분석하였다. 돌연변이를 중심으로 단일 27개 아미노산 (aa) 서열을 코딩하는 RNA 또는 각각의 서열을 커버하는 15량체 중복 펩티드 (OLP)가 부하된 DC로 형질감염된 자가 수지상 세포 (DC)에 대항하여 IFNγ ELISpot에 의해 면역원성을 판독하였다. 두 면역원성 판독 모두가 매우 일치하는 결과를 생성하였다.
전반적으로, 네오-에피토프의 60%가 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 백신 접종을 받은 각각의 환자는 개별 네오-에피토프 중 적어도 3가지에 반응하였다. 면역원성 네오-에피토프의 3분의 1에 대항하여, 기존의 T 세포가 존재하였고, 이는 백신 접종 시 추가로 확장되었다. 네오-에피토프의 거의 70%에 대항한 반응은 백신 접종 이전에는 검출될 수 없었으며 새로이 유도되었다.
네오-에피토프의 대부분은 CD4+에 의해 독점적으로 인식되었고 CD8+ T 세포에 의해서만 더 작은 분획이 인식되었다. 면역원성 네오-에피토프의 약 4분의 1은 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다와 이중-반응성이었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 교차 오염은 실험적으로 배제될 수 있다 (도 1c). 15량체 OLP에 의한 반응의 상세한 특징 규명 결과, CD4+ 및 CD8+ T 세포가 네오-에피토프의 약간 상이한 부분을 인식하는 것으로 밝혀졌다 (도 1a, b). 폴리-네오-에피토프 포맷의 적합성을 뒷받침해주는 펜타토프 RNA의 5개 위치 전반에 걸쳐 면역원성 네오-에피토프가 균등하게 분포되었다.
네오-에피토프 유도된 T 세포가 비-돌연변이된 대응물을 인식하는지의 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 ELISpot에 의해 야생형 또는 돌연변이된 에피토프를 나타내는 RNA 또는 OLP로 펄싱된 DC를 시험하였다. 대부분의 네오-에피토프 RNA 백신-유도된 반응에 대해, 각각의 야생형 에피토프에 대항한 반응성이 검출되지 않았거나 또는 더 낮은 수준에 있었다. 반응의 약 4분의 1은 ELISpot 분석에 의해 배경 위의 야생형 에피토프와의 반응성을 보여주었다. 점 돌연변이의 13개 aa WT 서열 연장물 N- 및 C-말단이 HLA-클래스 I 및 HLA-클래스 II 분자 상에 제시되어, 야생형 에피토프 반응성 T 세포를 초래할 수 있는 것으로 널리 생각될 수 있다. 그러나, 자가 반응성 T 세포의 강한 확장은 중심 면역 관용 메커니즘에 의해 억제될 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명자들은 야생형 RNA DC의 유의미한 인식을 보다 상세하게 나타내는 백신 표적 (P04-C7-E258K, P09-MAN1A2-E323D, P05-FAM135-A479S)에 대항한 T-세포 반응의 특징을 규명하였다. P04-C7-E258K의 경우, 야생형 에피토프 반응성은, OLP가 부하된 DC를 시험함으로써 확증되지 않았다. P09-MAN1A2-E323D의 경우, 본 발명자들은 27량체의 aa 9개 내지 23개에 걸쳐있는 펩티드에 대하여 야생형 에피토프뿐만 아니라 돌연변이된 에피토프 둘 다의 인식을 관찰한 반면, aa 5개 내지 19개에 걸쳐있는 펩티드에 대해서는 오직 돌연변이된 버전만 인식되었다. 이는 교차 반응성 면역 반응이 돌연변이된 에피토프를 독점적으로 인식하는 T 세포를 함유할 수 있으며, 이는 종양 제어를 발휘할 수 있다는 것을 의미한다. 모든 경우에, 본 발명자들은 각각의 야생형 유전자를 내생적으로 발현함에도 불구하고, 자가 DC가 비-돌연변이된 유전자 산물의 생물학적으로 중요한 인식을 배제한 각각의 T 세포에 의해 인식되지 않았다는 것을 발견하였다.
실시예 4: 백신 접종에 의해 중심 및 이펙터 기억 표현형을 수반한 네오-에피토프 특이적 T 세포의 신속하고 효율적인 확장
본 연구에서 면역원성 네오-에피토프의 약 5분의 1은 매우 높은 반응을 이끌어 냈다. 이들 T 세포는 선행 시험관내 자극 없이 혈액 샘플의 생체외 시험에 의해 검출될 수 있었다. 네오-에피토프 및 공유 TAA로 백신 접종된 환자에서, 네오-에피토프에 대항한 T-세포 반응이 더 강력하였다. 분자 수준에서 T-세포 인식을 연구하기 위해, 본 발명자들은 선택된 환자의 백신 접종 이후 T-세포 배양물로부터 네오-에피토프 특이적 T-세포 수용체 (TCR)를 클로닝하였다. 단일 네오-에피토프 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유동 세포계수법에 의해 분류하고, RT-PCR-기반 TCR 시퀀싱을 수행하였다 (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)). 클로닝된 TCR 알파 및 베타 쇄를 RNA로 시험관내 전사하고 T 세포로 공동 형질감염시켜 신생 항원 특이성 및 HLA 제한에 관하여 시험하였다.
환자 P01에서, 본 발명자들은 4개의 TCR을 확인하였으며, 모두 상이한 TCR 알파/베타 클로노타입으로 구성되었다 (표 1).
<표 1>
흑색종 환자 P01 및 P02의 단일 T 세포로부터 클로닝된 네오-에피토프 특이적 TCR-알파/베타 쇄
Figure pct00002
TCR (V(D)J 유전자는 IMGT 명명법으로 표시된다. V; 가변; D: 다양성; J: 결합; C: 불변. OLP, 중복 펩티드; t.b.d., 수행할; NARFL, 핵 프리라민 A 인식 인자-유사 (NARFL), mRNA; HPN, 헵신; PPFIA4, 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형, f 폴리펩티드 (PTPRF), 상호 작용하는 단백질 (리프린), 알파 4.
4개의 TCR 모두는 HLA A*3101 상의 핵 프리라민 A 인식 인자-유사 유전자로부터 유래된 면역 우성 NARFL-E62K 네오-에피토프를 인식했지만, 비-돌연변이된 에피토프는 그렇지 않았다 (도 2).
환자 P02는 리프린 알파 4 유전자로부터 유래된 네오-에피토프인 PPFIA4-S709N을 인식하는 2개의 HLA B*3906-제한된 TCR, 및 돌연변이체 헵신 HPN-G71R 네오-에피토프의 HLA DRB1*0401-제한된 인식을 수반한 2개의 TCR을 갖는데, 이들은 그의 야생형 교차 반응성과 관련하여 상이하였다.
이들 TCR의 TCR-β 서열은 백신 접종 이전 (방문 V1, V12) 및 백신 접종 이후 (방문 V20) 환자의 말초 혈액 세포로부터 생성된 TCR 심층 시퀀싱 데이터에서 추적되었다. 각각의 TCR 베타 클로노타입은 백신 접종 이전에는 검출 가능하지 않았지만, 백신 접종 이후에는 혈액 샘플에 고도로 풍부하였다.
생체외 MHC 다량체 분석에 의해 몇 명 환자의 네오-에피토프 반응을 조사한 결과, 네오-에피토프 백신 접종을 시작한 후 2 내지 4주 이내에 순환 CD8+ T 세포가 높은 한 자릿수 백분율로 신속하게 확장된 것으로 밝혀졌다. 네오-에피토프 특이적 CD8+ T 세포는 약한 PD-1 양성 기억 표현형 하위 집단을 함유하였다. 일부 네오-에피토프 반응은 중심 기억이 다수를 차지하였고, 다른 것은 이펙터 기억 T 세포가 다수를 차지하였다. 네오-에피토프 부하된 DC로의 자극시, CD8+ T 세포는 IFNγ 및 TNFα의 동반 발현을 수반하는 전형적인 세포 독성 시토카인 패턴을 나타냈다.
실시예 5: 개인화된 네오-에피토프 RNA 백신 접종에 의한 악화 위험이 높은 흑색종 환자에서의 질환 관리
13명의 연구 환자 대부분은 최근 재발 질환의 병력이 있었으며 모두 악화 위험이 높았다. 네오-에피토프 RNA 백신 접종 이전 및 이후에 모든 환자에서 기록된 흑색종 재발을 비교한 결과, 종적 누적 재발성 전이성 이벤트가 고도로 유의미하게 감소된 것으로 밝혀졌는데 (p<0.0001), 이는 이러한 고 위험 환자 집단에서 질환 진행이 없는 생존율이 현저하게 높다는 것으로 번역된다. 네오-에피토프 백신 접종을 시작할 때 환자 중 8명에게 측정 가능한 병변이 없었다. 8명의 환자 모두는 백신 네오-에피토프에 대항한 강력한 면역 반응을 시작하였고, 데이터가 차단될 때까지 전체 추적 기간 (12 내지 23개월 범위) 내에서 재발 없이 유지되었다. 면역 반응의 동역학 및 효능은 다양하였고; 백신 접종의 처음 3 내지 4주 이내에 많은 것들이 진화하였다. 다른 5명의 환자는 시험 참여 후 종양 진행을 경험하였고, 백신 적용 전에 표준 치료를 받았다. 5명의 환자 모두는 개인화된 백신이 입수 가능해질 당시에 측정 가능한 질환이 있었다. 네오-에피토프 백신 접종 하에서의 그들의 질환 진행 과정은 하기과 같이 발전하였다:
환자 P02는 시험 참여 시에 몇 가지 측정 가능한 내장 및 림프절 전이를 갖고 있었고, BRAF 억제제로 치료받았으며, 그 동안에는 상기 질환이 느리게 진행되었다. 네오-에피토프 백신 접종을 개시하였을 때 BRAF 억제제 치료는 계속되었다. P02는 10개의 백신 네오-에피토프 중 6개에 대항하여 CD4+ T-세포 반응을 시작하였고, 림프절 전이의 수축, 안정적인 내장 전이, 진행성 흉부 병변 및 새로운 측정 가능한 전이성 병변과 혼합된 반응을 경험하였다. 방사선 요법 및 진행 및 새로운 병변의 절제 후, 환자는 추가 의학적 치료를 거부하였고 마지막 방문 후 12개월에 사망하였다.
환자 P03의 네오-에피토프 백신 접종은 시험 참여 직후에 여러 개의 새로운 폐문 림프절 및 신장 전이를 동반한 질환 재발로 인해 연기되었다. 국소 방사선 요법 및 항-CTLA-4 치료는 실패하였다. 신장 전이는 빠르게 진행되었으며 절제되었다. 그 후, 네오-에피토프 RNA 백신 접종이 시작되었고, 3개의 네오-에피토프에 대항한 T-세포 반응이 발생하였으며, 이들 중 2개는 CD8+ T 세포에 의해 인식되었고, 1개는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 인식되었다. 백신 접종 이전에 진행되는 폐문 림프절 전이는 자기 공명 영상화 (MRI)에 의해 결정된 바와 같이 후속 12개월 내에 완전히 해소되었다. 환자는 총 18회의 백신 주사로 치료를 완료하였고, 어떠한 추가 치료도 없이 26개월 동안 악화 없는 상태로 유지되었다.
환자 P17은 연구에 참여하기로 한 후에 겨드랑이 림프절 전이가 있는 것으로 진단되었으며, 이는 안정적으로 유지되었고 4회의 네오-에피토프 RNA 백신 주사 후에 절제되었으며, 종양 침윤 림프구 (TIL) 및 자가 흑색종 세포주 (MZ-I-017)를 생성하는 데 사용되었다. 환자는 또 다른 14회 주사에 대해 지속적으로 백신 접종을 받았다. 특히, 백신의 10개 네오-에피토프 모두에 대항한 반응성 T 세포가 P17의 PBMC에서 검출되었다. 네오-에피토프 특이적 T 세포는 또한, 종양 침윤 림프구 내에서 검출되었다. 반응성은 구아닐레이트 결합 단백질 (GBP1-P86F) 및 레티놀 포화효소 (RETSAT-P546S)의 돌연변이된 에피토프에 대항하여 특히 높았다. RETSAT-P546S 네오-에피토프 내에서, 본 발명자들은 HLA-A*6801 제한된 최소 에피토프 (HSCVMASLR)를 확인하였고, HLA-다량체 염색에 의해 TIL에서 이러한 에피토프에 대항한 CD8+ T 세포의 존재를 검증하였다.
본 발명자들은 자가 RETSAT-P546S RNA-형질감염된 DC로 TIL을 자극하였고 각각의 TCR을 클로닝하였다. 단일 세포 클로닝에 의해 확인된 RETSAT-P546S-특이적 TCR#8로 형질감염된 T 세포는 자가 흑색종 세포주 MZ-I-017을 효율적으로 사멸시켰지만, 자가 APC는 그렇지 않았다. 이는 종양 세포에 의한 네오-에피토프의 발현, 프로세싱 및 제시를 확증시켜 주었을 뿐만 아니라 백신-유도된 세포 독성 T 세포에 의한 종양 세포에서의 그의 유효한 인식을 확증시켜 주었다. 놀랍게도, TCR#8을 추가로 특징 규명한 결과, 네오-에피토프의 HLA-B*3701 (HLA-A*6801이 아니라) 제한된 인식이 밝혀졌으며, 이는 원래 결정된 최소 에피토프와 상이하였다 (도 3a, b, 도 4). 이것은 동일한 환자에서 단일 돌연변이가 상이한 펩티드/HLA 복합체에 대항하여 CD8+ T 세포-반응을 동시에 촉발시킬 수 있다는 것을 입증해준다 (도 3b).
환자 P07은 네오-에피토프 RNA 백신 접종의 개시 시 일련의 재발 및 진행성 피부 및 내장 전이를 가졌다. P07은 6개의 신생 항원에 대항하여 강력한 T-세포 반응을 나타냈으며, 그 중 5 개는 생체 외에서 측정 가능하였다. 첫 번째 영상화에서 지속적인 질환 진행이 기록됨에 따라, 네오-에피토프 백신 접종은 중단되었다. P07은 특별 배려에 의해 항-PD-1 [펨브롤리주맙(pembrolizumab)] 프로그램에 등록되었다. 환자는 모든 흑색종 병변의 빠른 퇴행, 2개월 이내에 표적 병변의 80% 크기 감소, 및 지속적인 PD-1 차단 하에서 결국 완전한 반응을 경험하였다. 백신-유도된 T 세포는 백신 접종 종료 후 9개월 이하 동안 고주파에서 항-PD-1 치료 하에 유지되었다.
실시예 6: 네오-에피토프에 대항한 CD4 + 및 CD8 + T-세포 둘 다에 의해 매개되는 기존의 면역 반응
환자 물질
면역원성 시험을 위해 수득된 PBMC를 말초 혈액 샘플로부터의 피콜-하이파크 (아머샴 바이오사이언시스) 밀도 구배 원심분리 또는 흑색종 환자의 백혈구 성분 채집술에 의해 단리하였다. NCT02035956으로부터의 과량의 물질이 대규모 면역원성 시험에 사용되었다. 연구 설계는 80 페이지 (번역문 [0405]-[0408])에 기재되어 있다.
네오-에피토프 선택
차세대 시퀀싱 프로세스는 81 페이지 (번역문 [0419]-[0423])에 상세히 기재되어 있다. 대규모 면역원성 시험을 위해, 몇 가지 특징, 예컨대 결합 예측 및 표적 발현 수준을 다루기 위해 편견없는 접근법을 사용하여 100개 이하의 네오-에피토프를 선택하였다.
CD4 및 CD8 T 세포의 시험관내 자극
제0일에, 단핵구를 마이크로 비드 (밀테니이 바이오테크)를 사용하여 냉동 보존된 PBMC로부터 단리하고, IL-4/GM-CSF 및 IL-6/IL-1β/TNFα/PGE2를 함유하는 시토카인 칵테일을 부가함으로써 신속한 수지상 세포 (fDC)로 분화시켰다. 2일 후, CD4+ 및 CD8+ T-세포를, 마이크로 비드 (밀테니이 바이오테크)를 사용하여 냉동 보존된 PBMC로부터 단리하였다. 시험관내 자극을 위해, CD4+ T-세포 및 중복 펩티드 (OLP) 풀 부하된 fDC를 10:1의 이펙터 대 표적 비로 조합한 반면, CD8+ T-세포 및 OLP 풀 부하된 CD4-고갈된 PBMC를 1:10의 이펙터 대 표적 비로 조합하였다. 하루가 지난 후, 10 U/mL IL-2 (프로류킨 S, 노바르티스) 및 5 ng/mL IL-15 (페프로테크)를 함유하는 신선한 배지를 부가하였다. 배양물을 설정한 지 7일 후에 IL-2를 보충하였다. 시험관내 배양 11일 후, 세포를 유동 세포계수법을 통해 분석하고 IFNγ ELISpot 검정에서 이펙터 세포로서 사용하였다.
IFNγ ELIspot
미숙한 수지상 세포 (iDC)를 IFNγ ELIspot 검정에 대한 표적으로서 사용하였다. 단핵구를, 마이크로 비드 (밀테니이 바이오테크)를 사용하여 냉동 보존된 PBMC로부터 단리하고 IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에서 미숙한 수지상 세포 (iDC)로 분화시켰다.
IFNγ에 특이적인 항체 (맵테크)로 미리 코팅된 멀티스크린 필터 플레이트 (머크 밀리포어)를, 2% 인간 혈청 알부민 (CSL 베링)을 함유하는 X-비보 15 (론자)로 1 내지 5시간 동안 차단시켰다. CD4+ T-세포의 경우에는, 0.5 x 105개의 이펙터 세포/웰을 18 내지 20시간 동안 이펙터 대 표적 비 10:1에서 OLP 부하된 자가 iDC로 재자극시켰다. CD8+ T 세포의 경우에는, 1 x 105개의 이펙터 세포/웰을 18 내지 20시간 동안 이펙터 대 표적 비 10:1에서 OLP 부하된 자가 iDC로 재자극시켰다. 모든 시험은 삼중으로 수행되었고, 검정 양성 대조군 [스타필로코쿠스 장독소 B (시그마 알드리치)]을 포함하였다. 대조군 OLP 풀 부하된 iDC 및 이펙터는 단지 음성 대조군으로서 사용되었다. 스폿은 비오틴-접합된 항-IFNγ 항체 (맵테크)로 시각화한 다음, 엑스트라-아비딘-알칼린 포스파타제 (시그마 알드리치) 및 BCIP/NBT 기질 (시그마 알드리치)과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 CTL의 이뮤노스폿® S6Core ELISpot 분석기를 사용하여 스캔하고, 이뮤노캡처™ v6.6 소프트웨어에 의해 분석하였다. 돌연변이된 펩티드에 의해 자극된 T-세포 반응을 대조 펩티드 (무관한 펩티드 풀)와 비교하였다. 평균 스폿 계수가 각각의 대조군과 비교하여 적어도 2배 더 높을 때 반응은 양성으로서 정의되었다.
펩티드
시험관내 자극을 위해, 27량체 신생 항원 서열을 커버하는 11개 아미노산 중복을 갖는 합성 15량체 펩티드 (조악한 산물)가 사용되었다 (중복 펩티드 (OLP)로서 지칭됨). 모든 합성 펩티드는 JPT 펩티드 테크놀로지스 GmbH에 의해 구입되고 미리 풀링되었으모, DMSO [어플리켐(AppliChem)]에 OLP 당 5 mg/mL의 스톡 농도로 용해되었다. 시험관내 자극의 경우, ELISpot 판독정보 3.5 μg/mL에 대하여 OLP 당 2.5 μg/mL의 최종 농도를 사용하였다. 상이한 신생 항원의 풀 (신생 항원당 4개의 OLP)을 매트릭스 접근법을 사용한 ELISpot 판독정보를 위해서 뿐만 아니라 시험관내 자극을 위해서 사용하였다.
유동 세포계수 분석
CD4 및 CD8 T 세포 배양물의 순도는 유동 세포계수법 (CD25 PE, CD56 PE CY7, CD8 APC, 이플루오르780 FVD, CD3 BV421, CD4 FITC)에 의해 평가되었다. BD FACSVerse™ (BD 바이오사이언시스) 상에서 유동 세포계수 분석을 수행하였다. 획득한 데이터는 플로우조 소프트웨어 (트리 스타)의 버전 10을 사용하여 분석하였다.
결과
지금까지 7명의 환자를 분석하였고 CD4+ 및 CD8+ T-세포 둘 다에 의해 매개되는 총 26개의 반응성이 검출되었다.
SEQUENCE LISTING <110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH <120> METHODS FOR PREDICTING THE USEFULNESS OF DISEASE SPECIFIC AMINO ACID MODIFICATIONS FOR IMMUNOTHERAPY <130> 674-187 PCT2 <150> PCT/EP2017/064140 <151> 2017-06-09 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(9) <223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(12) <223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (13)..(15) <223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Ser Gln Arg Glu Phe Val Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Met Asn Gln Gly Val Cys Cys 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Phe Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Thr Lys Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp Asp Cys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Arg Leu Ser Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met Ala Ala Lys Trp 1 5 10 15 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala Gln <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg 1 5 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Cys Tyr Gly Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln Ser Pro Ile Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 gccaccatga tcctaaacaa agctctgmtg c 31 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 tatgcgatcg ctcacaakgg cccytggtgt ctg 33 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Leu 1 5 10 15 Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu 20 25 <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Pro Arg Ser Glu Ser Tyr Cys Phe Pro Gly Val Thr Leu Ala Ser 1 5 10 15 Thr Pro

Claims (41)

  1. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  4. 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  7. 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  10. 하기 확인 단계:
    (i) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계,
    (ii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및/또는
    (iii) 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계
    중 하나 이상을 포함하는, 면역요법을 위한 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드 내에서의 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 평가하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  17. 하기 단계:
    (i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
    (ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
    (iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  20. 하기 단계:
    (i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
    (ii) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
    (iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  23. 하기 단계:
    (i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
    (ii) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및
    (iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  26. 하기 단계:
    (i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 확인하는 단계이며, 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
    (ii) 하기:
    (1) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계,
    (2) 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계, 및/또는
    (3) 동일한 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편이, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시되고/되거나 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포와 반응성인지의 여부를 확인하는 단계
    중 하나 이상을 확인하는 단계, 및
    (iii) (i) 하에 확인된 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형에 대해 단계 (ii)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 질환 특이적 아미노산 변형을 면역요법에서의 그의 유용성에 대해 선택하고/하거나 순위를 매기는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자이고/이거나 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상이한 클래스의 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 상이한 MHC 클래스로 제한된 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 T 세포 수용체가 상이한 클로노타입의 것인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편과, 상이한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자가 상이한 MHC 클래스 I 분자이고/이거나 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포가 상이한 CD8+ T 세포인 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편의 제시 및/또는 동일한 클래스의 상이한 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일하거나 상이한 단편과, 동일한 MHC 클래스로 제한된 상이한 T 세포의 반응성이, 그러한 질환 특이적 아미노산 변형이 면역요법에 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  33. 제17항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 시험된 상이한 아미노산 변형이 동일하고/하거나 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드에 존재하는 것인 방법.
  34. 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 시험된 상이한 아미노산 변형에 대해 수득된 스코어를 비교하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 특이적 아미노산 변형(들)이 질환 특이적 체세포 돌연변이(들)에 기인하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암이고, 면역요법이 항암 면역요법인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법이 하기:
    (i) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 펩티드 또는 폴리펩티드,
    (ii) (i) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 단편이 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및
    (iii) (i) 또는 (ii) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
    중 하나 이상의 투여를 포함하는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 백신을 제공하는 데 유용한 방법.
  39. 하기 단계:
    (i) 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 의해 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 확인하는 단계, 및
    (ii) 하기:
    (1) 이환된 세포에서 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인 펩티드 또는 폴리펩티드,
    (2) (i) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 단편이 면역요법에 유용할 것으로 예측되는 질환 특이적 아미노산 변형 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및
    (3) (i) 또는 (ii) 하의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
    중 하나 이상을 포함하는 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는, 백신을 제공하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단편이 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드이거나, 또는 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드를 제공하도록 프로세싱될 수 있는 것인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 백신.
KR1020197035862A 2017-06-09 2018-06-01 면역요법을 위한 질환 특이적 아미노산 변형의 유용성을 예측하는 방법 KR102560750B1 (ko)

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