KR20200010450A

KR20200010450A - 장내 세균 불균형의 치료에 사용하기 위한 포도 껍질

Info

Publication number: KR20200010450A
Application number: KR1020197037875A
Authority: KR
Inventors: 만테 하비에르 알드구에르; 리브라도 예수 가르시아-길; 페이지 마리오나 세라
Original assignee: 굿것 에스.엘.
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2020-01-30
Also published as: AU2018278276A1; EP3630146A1; CN111246870A; CN115919952A; JP2021130717A; JP7360420B2; CN111246870B; AU2018278276B2; IL270978A; JP6898674B2; WO2018220237A1; IL270978B; JP2020521801A; US20230149497A1

Abstract

본 발명은 대상에서 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii), F. 프로스니치 필로그룹( prausnitzii phylogroup) I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹(prausnitzii phylogroup) II (PHGII), 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레(Subdoligranulum variabile)와 같은, 부티레이트-생성 세균의 장내 수준 및/또는 활성을 증가시키기 위한 프리바이오틱으로서 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균 수준 및/또는 활성 감소를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 감소된 활성을 가지는 대상에서 염증성 또는 비-염증성 장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

장내 세균 불균형의 치료에 사용하기 위한 포도 껍질

본 발명은 치료제(therapeutics) 및 약효식품(nutraceuticals) 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상에서 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii), F. 프로스니치 필로그룹(prausnitzii phylogroup) I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹(prausnitzii phylogroup) II (PHGII), 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis) 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레(Subdoligranulum variabile)과 같은, 부티레이트-생성 세균의 장내 수준 및/또는 활성을 증가시키기 위한 프리바이오틱(prebiotic)으로서 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균 수준 및/또는 활성 감소를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 감소된 활성을 가지는 대상에서 염증성 또는 비-염증성 장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

장내 세균 불균형은 장내 및 장외 질환 모두의 발병과 관련되는 상태라는 많은 증거가 있다 (Carding et al., Microb Ecol Health Dis. 2015; 26: 10.3402; Lopetuso et al., Gut Pathogens 2013, 5:23). 장 질환은 염증성 장 질환, 과민성 대장증후군 및 만성 소화 장애증을 포함할 수 있는 반면, 장외 질환은 예를 들어 알레르기, 천식, 대사 증후군, 심혈관 질환 및 비만을 포함할 수 있다.

크론병, 궤양성 대장염 또는 대장암과 같은 장 질환에서 페칼리박테리움 프로스니치의 감소된 존재가 많은 저자에 의하여 보고되었다 (Miquel S. et al., Current Opinion in Microbiology 2013, 16: 1-7; Sartor R.B, The 111th Abbott Nutrition Research Conference 2010, p23-29; Lopez-Siles et al., Appl. Environ Microbiol. 2015, 81: 7582-7592; Lopez-Siles et al. Inflamm Bowel Dis 2016, 22: 28-41; and Lopez-Siles et al., The ISME Journal 2017, 11: 841-852). 특히, 염증성 장 질환(IBD) 환자는 F. 프로스니치의 감소된 장내 수준을 종종 나타낸다. 예를 들어, Miquel S. et al. (Current Opinion in Microbiology 2013, 16: 1-7)은 다양한 연구에서 RT-qPCR, FISH 등과 같은 상이한 정량화 기술을 이용하여 점막 및 대변 샘플 모두에서 IBD 환자 내 F. 프로스니치의 감소된 수준이 보고되어 왔음을 제공한다 (Miquel S. et al.의 표 1 참조). 다른 부티레이트-생성 종인 로제부리아 호미니스 또한 궤양성 대장염 환자에서 감소되는 것으로 보고되었다 (Machiels et al., Gut. 2014, 63(8):1275-83).

프리바이오틱 전략을 통하여, F. 프로스니치의 장내 수준을 증가시키기 위하여 그 장내 존재를 조절하기 위한 노력이 있어 왔다. 그럼에도 불구하고, 어떠한 요인이 F. 프로스니치의 장내 존재 및 그 영향 정도를 조절하는지 여전히 알려져 있지 않다(Lopez-Siles et al., The ISME Journal 2017, 11: 841-852). 특히, 이눌린(Ramirez-Farias C. et al., British Journal of Nutrition. 2019, 101: 541-550); 리보플라빈 (WO 2014/070014 A1), 및 폴리덱스트로스 및 가용성 옥수수 섬유(WO 2013/067146 A1)와 같은 다양한 프리바이오틱 물질의 F. 프로스니치에 의한 이용이 보고되어 왔다.

포도 껍질 섬유의 주된 발효 성분은 펙틴인 것으로 기재되었다 (Bravo L. and Saura-Calixto F., "Characterization of Dietary Fiber and the In Vitro Indigestible Fraction of Grape Pomace", Am. J. Enol. Vitic., 1998, 49: 135-141). Lopez-Siles M. et al. (Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(2): 420)은 F. 프로스니치가 기질로서 사과 펙틴을 이용하는 것으로 밝혀졌음을 개시하나, 시험된 F. 프로스니치 균주들 중 어떠한 것도 시트러스 펙틴 내에서 성장할 수 없었다 (제 424 면의 표 2의 범례 참조). 이는 F. 프로스니치가 (시트러스) 펙틴을 이용하지 못하였다고 보고하는 Salyers A. et al. "Fermentation of Mucins and Plant Polysaccharides by Anaerobic Bacteria from the Human Colon", Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34: 529-533)의 발견과 일치하는 것이다.

또한, Benus R. et al. ("Association between Faecalibacterium prausnitzii and dietary fibre in colonic fermentation in healthy human subjects", British Journal of Nutrition. 2010, 104: 693-70)은 모든 펙틴이 F. 프로스니치에 의하여 동등하게 이용가능한 것은 아니라고 교시한다. 특히, 상기 저자들은 F. 프로스니치 및 로제부리아 인테스티날리스 군의 감소가 완두콩 섬유-보충 식이 처치된 건강한 인간 대상에서 관찰되었음을 보고하였으며, 이는 상기 저자들에 의하여 사용된 섬유가 이들 세균 종의 증식을 지지하지 못하였음을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 완두콩 펙틴 내 우론산과 자일로스 간의 강한 결합에 의하여 설명되었다.

그 외에도, Bralley E. et al., ("Anti-inflammatory effects of muscadine skin extract in experimentally-induced ulcerative colitis in rats", from the thesis Nutraceutical properties of the muscadine grape (Vitis rotundifolia), Sorghum Bicolor, and Polygonum cuspidatum, 1998, Georgia University)는 쥐(rat)에서 TNBS(2,4,6-트리니로벤젠 술폰산)-유도 대장염 모델에서 탈수된 무스카딘(비티스 로툰디폴리아(Vitis rotundifolia)) 껍질의 항염증 효과를 기재한다. 상기 문헌은 대장염을 겪는 대상에서 장내 세균 불균형 치료에 관한 것이 아니라, 염증성 장 질환의 염증 특징을 치료하기 위한 것으로, 무스카딘 포도 내 존재하는 항산화 특성을 가지는 피토케미컬(예를 들어, 퀘르세틴 및 레스베라트롤)을 항염증성 효과를 얻기 위한 포도 껍질 내 성분으로서 가리킨다.

따라서, F. 프로스니치 및 기타 부티레이트-생성 세균은 장내 미생물군의 일부이며, 장 건강에서 보호적인 역할을 한다. 최근 수년간 행하여진 노력에도 불구하고, 특히 F. 프로스니치 및 기타 부티레이트-생성 세균과 같은 이로운 세균의 장내 수준을 증가시키기 위하여, 대상에서 장내 미생물 불균형을 치료하기 위한 전략을 발견할 필요가 여전히 있다.

발명의 개요

본 발명의 제 1 측면은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질, 바람직하게 분리된 포도 껍질로서, 상기 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 그 활성 감소(예를 들어, 낮거나 감소된 수준의 단쇄 지방산(SCFA) 생산을 가지는 부티레이트-생성 세균)를 특징으로 하고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I(PHGI), 및 F. 프로스니치 필로그룹 II(PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질, 바람직하게 분리된 포도 껍질로서, 상기 대상은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 그 활성 감소(예를 들어, 낮거나 감소된 수준의 단쇄 지방산(SCFA) 생산을 가지는 부티레이트-생성 세균)를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가지고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I(PHGI), 및 F. 프로스니치 필로그룹 II(PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 대상에서 장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질, 바람직하게 분리된 포도 껍질에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 포도 껍질과 프리바이오틱, 단일 종의 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 종들의 군, 세균의 2차 생성물, 세균/숙주 상호작용의 분자 경로 조절제 및 좁은 범위 항생제로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물의 상승적 조합에 관한 것이다. 본 발명은 나아가, 장내 세균 불균형 치료에서 상승 효과를 제공하는 포도 껍질 및 상기 정의한 화합물을 포함하는 조성물, 및 장내 세균 불균형 치료, 바람직하게 부티레이트-생성 세균 불균형 치료에서 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 부티레이트-생성 세균의 장내 수준 및/또는 활성을 증가시키기 위한 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

도 1a. 크론병(CD) 환자 샘플 내 Fpra 수준/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 1b. 궤양성 대장염(UC) 환자 샘플 내 Fpra/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 1c. 건강한 (H) 대상 샘플 내 Fpra/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 2a. CD 환자 샘플 내 PHG-I/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 2b. UC 환자 샘플 내 PHG-I/EUB l Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 2c. H 대상 샘플 내 PHG-I/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 3a. CD 환자 샘플 내 PHG-II/EUB Ct 값 (실험 3); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 3b. UC 환자 샘플 내 PHG-II/EUB l Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 3c. H 대상 샘플 내 PHG-II/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 4a. CD 환자 샘플 내 Eco/EUB l Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 4b. UC 환자 샘플 내 Eco/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 4c. H 대상 샘플 내 Eco/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 5a. CD 환자 샘플 내 B46/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 5b. UC 환자 샘플 내 B46/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 5c. H 대상 샘플 내 B46/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 6a. CD 환자 샘플 내 Ros/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 6b. UC 샘플 내 Ros/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 6c. H 대상 샘플 내 Ros/EUB Ct 값; 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 7a. CD 환자 샘플 내 부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 7b. UC 환자 샘플 내 부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 7c. H 대상 샘플 내 부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 8a. CD 환자 샘플 내 아세트산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 8b. UC 환자 샘플 내 아세트산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 8c. H 대상 샘플 내 아세트산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 9a. CD 환자 샘플 내 프로피온산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 9b. UC 환자 샘플 내 프로피온산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 9c. H 대상 샘플 내 프로피온산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 10a. CD 환자 샘플 내 헥산산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 10b. UC 환자 샘플 내 헥산산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 10c. H 대상 샘플 내 헥산산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 11a. CD 환자 샘플 내 발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 11b. UC 환자 샘플 내 발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 11c. H 대상 샘플 내 발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 12a. CD 환자 샘플 내 이소발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 12b. UC 환자 샘플 내 이소발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 12c. H 대상 샘플 내 이소발레르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 13a. CD 환자 샘플 내 이소부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 13b. UC 환자 샘플 내 이소부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 13c. H 대상 샘플 내 이소부티르산 수준(mg/L); 1= 음성 대조군(기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 600mg Previpect, 4=200mg Previpect + 200mg Pectin, 5= 200mg Pectin. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 14a. 과민성대장증후군(IBS) 환자 샘플 내 EUB Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 14b. 건강한 대상 샘플 내 EUB Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 15a. IBS 환자 샘플 내 Fpra Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 15b, 건강한 대상 샘플 내 Fpra Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 16a. IBS 환자 샘플 내 PhGI Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 16b. 건강한 대상 샘플 내 PhGI Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 17a. IBS 환자 샘플 내 PhGII Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 17b. 건강한 대상 샘플 내 PhGII Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 18a. IBS 환자 샘플 내 Eco Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 18b. 건강한 대상 샘플 내 Eco Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 19a. IBS 환자 샘플 내 Ros Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 19b. 건강한 대상 샘플 내 Ros Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 20a. IBS 환자 샘플 내 B46 Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 20b. 건강한 대상 샘플 내 B46 Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 21a. IBS 환자 샘플 내 Akk Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 21b. 건강한 대상 샘플 내 Akk Ct 값; 1=음성 대조군 (기질 없음), 2= 200mg Previpect, 3= 200mg Plantago ovata. 유의한 값 차이는 별표로 표시된다(p≤0.05일 때 *; p≤0.01일 때 **; 및 p≤0.001일 때 ***).
도 22. 공기-순환 오븐 내에서 60-62℃에서 5일의 기간 동안(0 내지 5일) 탈수된 포도 샘플의 습도(%) 및 수분 활성도를 예시하는 그래프.

발명의 상세한 설명

정의

용어 "대상" 또는 "개체"는 본원에서 포유류로 분류되는 모든 동물들을 의미하기 위하여 상호교환가능하게 사용되고, 이에 제한되지 않으나, 가축, 영장류 및 인간, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류를 포함한다. 바람직하게, 상기 대상은 임의의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성 인간이다.

용어 "치료"는 예방학적 및 치료학적 치료 모두를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "치료학적 치료" 또는 "테라피"는 신체를 병적 상태 또는 질환으로부터 정상적인 건강한 상태로 돌려놓는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "예방학적 치료"는 병적 상태를 예방하는 것을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "치료적으로 효과적인 양"은 본원에 정의되는 질환, 장애 또는 병적 상태의 예방학적 또는 치료학적 치료에서 대상(인간 환자와 같은)에 1회 또는 다회 투여시 효과적인 양을 의미한다.

용어 "프리바이오틱"은 1995에 Gibson and Roberfroid (The journal of nutrition, 125, 1401-1412)에 의하여 제안되었으며, "대장 내 하나 또는 제한된 수의 세균의 성장 및/또는 활성을 선택적으로 자극함으로써 숙주에 유리하게 영향을 미쳐 건강을 증진시키는 비-소화성 식품 성분"을 의미한다. 프리바이오틱을 이용하여 장내 미생물의 불균형으로서 정의될 수 있는 장내 세균 불균형을 치료 또는 예방할 수 있다. 프리바이오틱은 두 가지 주요 메커니즘에 의하여 장 기능에 긍정적 영향을 발휘하는 것으로 알려져 있다: 1) 장내 체류하는 이로운 토착 세균(전형적으로, 비피도박테리아 및 락토바실리)의 성장 및/또는 활성을 자극; 및 2) 단쇄 지방산(SCFAs)의 생산을 증가. 식이 섬유의 모든 구성 성분들이 프리바이오틱은 아님을 주목하여야 한다. 소화되지 않은 기질의 프리바이오틱 특징은 토착 장 미생물군의 이로운 성분들이 이를 기질로서 선택적으로 사용할 것인지 여부에 따른다 (Galvez et al., "Prebiotics and Probiotics in Experimental Models of Rodent Colitis: Lessons in Treatment or Prevention of Inflammatory Bowel Diseases", Chapter 35 (p.601-610) of the book Bioactive Foods in promoting health, Ed: R. R. Watson and V.R. Preedy, 2010, Academic Press; Manning T.S. and Gibson G.R. "Prebiotics", Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 2004, 18(2): 287-298).

본원에 사용되는 용어 "프로브"는 표적 핵산 서열에 대하여 소정의 조건 하에서 특정 및 우선적 혼성화를 허용하는 특정 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 임의로 검출을 위한 또는 분석 성능을 증진시키기 위한 부위를 함유하는 10 내지 285 염기쌍 길이의, 합성적으로 또는 생물학적으로 생산된 핵산을 의미한다. 통계적으로 특이성을 얻고 안정한 혼성화 생성물을 형성하기 위하여 최소 10 뉴클레오티드가 일반적으로 필요하고, 최대 285 뉴클레오티드가 일반적으로 반응 파라미터가 용이하게 조정되어 미스매칭된 서열 및 우선적 혼성화를 결정할 수 있는 길이에 대한 상한을 나타낸다. 프로브는 임의로 특정 분석 조건 하에 그들의 적절한 또는 최적의 기능에 기여하는 특정 구성 성분들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 프로브를 변형하여 (예를 들어, 말단 캐핑에 의하여) 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 증진시키거나, 검출 리간드(예를 들어, 플루오로세인)를 운반하거나 또는 고체 지지체(예를 들어, 폴리-디옥시아데노신 "테일") 상으로 그들의 포획을 촉진시킬 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위하여 중합효소 연쇄 반응("PCR")과 같은 증폭법에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 특정 표적 서열의 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 하나의 특이적 16S rDNA 서열을 기초로 하여 설계된다. 프라이머 및 프로브의 설계 및 확인은 당업계에 잘 알려져 있다. 정량적 실시간 PCR 법에 대하여, 예를 들어 Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275:31-56)를 참조한다.

본원에 사용되는 용어 "특이적"은 분석 조건, 일반적으로 엄격한 조건 하에 뉴클레오티드 서열이 소정의 표적 서열에 혼성화/이를 증폭시킬 것이고, 비-표적 서열에 실질적으로 혼성화되지/이를 증폭시키지 않을 것임을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 소정의 반응 조건 하에, 두 개의 부분적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥들이 역평행 방식으로 합쳐지도록 허용되어, 어떠한 핵산 염기들이 서로 페어링할 수 있는 지에 관한 분명한 규칙에 따라, 특이적이고 안정한 수소 결합을 가지는 이중 가닥 핵산을 형성하는 과정을 의미한다.

용어 "실질적 혼성화"는 관찰되는 혼성화의 양이 그 결과의 관찰자가 양성 및 음성 대조군 내 혼성화 데이터에 대하여 그 결과를 긍적적으로 간주할 정도임을 의미한다. "백그라운드 노이즈"로 간주되는 데이터는 실질적 혼성화가 아니다.

용어 "엄격한 혼성화 조건"은 대략 0.9 몰 NaCl의 염 용액 내 대략 35 내지 65℃를 의미한다. 엄격성은 또한 혼성화 용액 내 존재하는 이온 종의 농도 및 유형과 같은 반응 파라미터에 의하여 좌우될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 조건이 더 엄격해질수록, 안정한 하이브리드를 형성하고자 한다면 더 긴 프로브가 바람직하다. 대체로, 혼성화가 일어나는 조건의 엄격성은 사용되는 바람직한 프로브의 특정한 특징을 나타낼 것이다.

본원에 사용되는 용어 "동일성(identity)"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다. 2 이상의 서열들(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)을 그들의 "백분율 동일성"을 결정함으로써 비교할 수 있다. 두 서열들의 "백분율 동일성"은, 핵산 또는 아미노산 서열이든, 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 두 정렬된 서열들 간의 정확한 매치의 수이다. 서열들 간의 백분율 동일성 또는 유사성은 예를 들어 디폴트 파라미터와 사용되는, NCBI BLAST 프로그램과 같이 당업계에 잘 알려져 있다(http://www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST).

상세한 설명

제 1 측면에서, 본 발명은 부티레이트-생성 세균의 장내 수준을 증가시키기 위한 프리바이오틱으로서 포도 껍질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

부티레이트 생산자는 부티릴 CoA: 아세테이트 CoA 전이효소 활성을 나타낸다 (Duncan et al., Appl Environ Microbiol. 2002, 68: 5186-5190). 이러한 활성은 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum) 군(Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol 2002, 52, 2141-2146)으로도 알려진 클로스트리디움 클러스터 IV, 및 클로스트리디움 코코이데스(Clostridium coccoides) 군(Hold et al., Appl Environ Microbiol 2003, 69, 4320-4324; Barcenilla et al., Appl Environ Microbiol 2000, 66, 1654-166)으로도 알려진 클러스터 XIVa의 멤버와 같은 클로스트리디움 서브필럼(Clostridial subphylum)에 속하는 혐기성 세균 중에 대체적으로 존재한다. F. 프로스니치는 상기 클로스트리디움 클러스터 IV에 속하는 대표적인 부티레이트 생산자이며, 로제부리아 세시콜라(Roseburia cecicola), 로제부리아 인테스티날리스(Roseburia intestinalis) 및 로제부리아 호미니스(Roseburia hominis)와 같은 로제부리아 속의 다양한 종들은 클로스트리디움 클러스터 XIVa로 분류되는 부티레이트 생산자이다.

보다 구체적으로, 제 1 측면에서 본 발명은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질로서, 상기 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균 수준 감소 및/또는 부티레이트-생성 세균 활성 감소(본원에서 "부티레이트-생성 세균 불균형"으로도 언급됨)를 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 부티레이트-생성 세균은 그의 필로그룹 (예를 들어, PHGI 및/또는 PHGII)을 포함하는 F. 프로스니치, 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택된다.

연관된 측면에서, 본 발명은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균 수준 감소 LAC/또는 부티레이트-생성 세균 활성 감소(예를 들어, 낮거나 감소된 수준의 단쇄 지방산(SCFA) 생산을 가지는 부티레이트-생성 세균)를 특징으로 하고, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 치료 효과적인 양의 본원에 기재된 포도 껍질을 투여하는 단계를 포함한다.

바람직하게, 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 상기 방법은 예방적 방법이다, 즉 상기 대상은 부티레이트-생성 세균의 낮거나 감소된 수준 및/또는 활성을 나타내지 않는다.

미생물군의 조성 및 다양성은 질환에서 변화되는 것으로 보고되어 왔다. 용어 "세균 불균형(dysbiosis)"은 보호적 및 유해한 세균 간 신체 상 또는 신체 내 미생물 불균형을 가지는 상태를 의미한다. 용어 "장내 세균 불균형(intestinal dysbiosis)"은 장 미생물군의 불리한 변화에 관한 것이다. 예를 들어, 몇몇 저자들은 염증성 장 질환에서 미생물 조성믈 연구하여, 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)의 특징인 세균 불균형 사인을 정의하였다. 특히, Joosens et al. (Gut 2011, 60:631-7)은 CD에서 다섯 개의 세균 종들이 세균 불균형의 특징이라고 보고하였다, 즉 F. 프로스니치, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bidobacterium adolescentis), 디알리스터 인비수스(Dialister invisus) 및 클로스트리디움 클러스터 XIVa의 규명되지 않은 종들의 감소, 및 루미노코커스 그나부스(Ruminococcus gnavus) 증가; 이러한 세균 사인은 질환의 발병에서 부티레이트-생성 세균의 결여를 가리킨다. 더 최근에, 로제부리아 호미니스 및 F. 프로스니치 감소가 UC 세균 불균형의 특징인 것으로 기재되었다(Machiels et al. Gut. 2014, 63(8):1275-83).

특정 구현예에서, 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균의 낮은 수준 또는 감소를 특징으로 하며, 바람직하게 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I(PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II(PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택된다.

부티레이트-생성 세균의 낮은 수준 또는 감소는 다음 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정될 수 있으며:

a. 상기 대상의 장 샘플 내 부티레이트-생성 세균의 수준을 결정하는 단계; 및

b. 상기 대상 샘플 내 부티레이트-생성 세균 수준을 표준 샘플 내 수준과 비교하는 단계;

상기 대상 샘플 내 수준이 상기 표준 샘플 내 수준 아래일 때 부티레이트-생성 세균의 감소가 있다. 장 샘플 내 세균 종 수준을 정량하는 방법은 후술한다.

장 샘플은 예를 들어 회장, 결장 및/또는 직장의 점막 조직으로부터 생검일 수 있다. 바람직하게, 상기 장 샘플은 대변 샘플이다. 이러한 유형의 샘플들은 임상 실습에 통상적으로 사용되며, 당업자는 그들의 수득 및 보존을 위한 가장 적절한 수단을 확인하는 방법을 알고 있을 것이다. 일단 샘플이 수득되면, 이는 그대로 사용되거나, 적절한 수단을 사용하여 동결, 동결 건조 또는 보존될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "표준값(reference value)"은 대상으로부터 수집된 샘플들로부터 얻어진 값 또는 데이터를 평가하기 위한 표준으로서 사용되는 소정의 기준에 관한 것이다. 상기 표준 값 또는 표준 수준은 절대값, 상대값, 상한 또는 하한을 가지는 값, 값들의 범위, 평균값(average value), 중간값, 평균값(mean value) 또는 특정 대조 또는 기준값과 비교한 값일 수 있다. 표준값은 각각의 샘플 값에 근거하거나, 또는 생활 연령 매칭된 군의 대상들의 집단으로부터와 같이 다수의 샘플들에 근거하거나, 또는 시험되는 샘플들을 포함 또는 배제한 샘플들의 풀에 근거할 수 있다.

상기 표준값은 장 질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는 대상 또는 대상들의 군으로부터, 장 질환을 가지지 않은 대상 또는 대상들의 군으로부터, 또는 동일한 건강한 대상 또는 장 질환을 가진 것으로 진단되었으나 초기인 대상으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게, 상기 표준 샘플은 장 질환을 가지지 않은 대상 또는 대상들의 군의 샘플이다.

샘플 내 마커 수준이 그 표준값보다 낮을 때, 마커 수준은 "감소된" 것으로 간주된다. 마커 수준이 그 표준값보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 낮을 때 마커 수준이 그 표준값보다 낮은 것으로 간주된다. 바람직하게, 장내 세균 불균형을 확립하기 위한 표준값에 대한 대상 샘플 내 하나 이상의 세균 마커의 존재 수준의 감소는 통계적으로 유의하다.

마찬가지로, 샘플 내 마커 수준이 그 표준값보다 높을 때 상기 마커 수준은 "증가된" 것으로 간주된다. 상기 마커 수준이 그 표준값보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 높을 때 상기 마커 수준은 그 표준값보다 더 높은 것으로 간주된다.

대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기재되는 표준값보다 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20배 수준 편차(즉, 증가 또는 감소)를 가지는 대상은 장내 세균 불균형을 가지는 것으로 확인될 수 있다.

통계적으로 유의한 양은 상이한 통계학적 분석을 이용하여 당업자에 의하여 확립될 수 있다; 상기 통계학적 분석의 예시적 비제한적 예는 신뢰 구간 결정, p-값 결정, Chi-Square 시험 구별 함수 등을 포함한다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%이다. 상기 p-값은 바람직하게 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.001 미만이다. 전형적으로 적합한 통계학적 분석은 연구 중인 변수가 정규 분포를 가지는지 여부에 기초하여, 예를 들어 Kolmogorov-Smirnov의 시험을 사용하여, 및 예를 들어 Levene 시험으로 결정되는 등분산성이 있는지 여부에 기초하여 결정된다. 바람직하게, 정규 분포 및 등분산성이 있는 경우, t-테스트 또는 ANOVA 테스트와 같은 매개변수 모형이 사용되고; 정규성이 달성되지 않는 경우, Mann-Whitney U 테스트 또는 Kruskal-Wallis 테스트와 같은 비-매개변수 모형이 일반적으로 사용된다.

대안적으로, 부티레이트-생성 세균의 감소는 특정 대상 내 다른 세균 종들 또는 종들의 군에 대한 상기 대상 내에서 하나 이상의 부티레이트-생성 세균 종 또는 종들의 군의 존재 수준의 비를 결정함으로써 정의될 수 있으며, 예를 들어,

- 페칼리박테리움 프로스니치/에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 수준들의 비(예를 들어, 중간 log₁₀ 16S rRNA 유전자 복사본/백만 세균 16S rRNA 유전자 복사본)가 2.5 미만이거나; 또는

- 유박테리아(Eubacteria)/로제부리아 호미니스 수준들의 비가 12.5 보다 높은 때, 부티레이트-생성 세균 감소가 발견될 수 있다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재되거나 후술할 하나 이상의 구현예 또는 특징들과 조합하여, 부티레이트-생성 세균의 감소는 특정 대상에서 다른 세균 종들 또는 종들의 군에 대한 상기 대상에서 하나 이상의 부티레이트-생성 세균 종들 또는 종들의 군의 존재 수준의 비를 결정함으로써 정의되고, 이에 제한되지 않으나, 다음을 포함하는 정규화된 지수로서 표현된다:

- 페칼리박테리움 프로스니치 / 에스케리치아 콜라이 비 (FE 지수): 이 값이 더 낮을수록 대상의 세균 불균형 정도가 더 높다; 및/또는

- 부티레이트 생성 세균 / 염증전(pro-inflammatory) 세균 비 (BP 지수): 이 값이 더 낮을수록, 대상의 세균 불균형 정도가 더 높다; 예를 들어, 부티레이트 생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치 (임의로, 부가적으로 또는 대안적으로 페칼리박테리움 프로스니치 PHGI, 및 페칼리박테리움 프로스니치 PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레의 총 존재의 합으로 계산되며, 상기 염증전 세균은 에스케리치아 콜라이의 총 존재이다.

또한, 대상에서 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균 활성 감소, 예를 들어, 낮거나 감소된 수준의 SCFA 생산을 가지는 부티레이트-생성 세균을 더욱 특징으로 할 수 있다. 이는 부티레이트/부티레이트 생성 세균 비(BB 지수)에 의하여 결정될 수 있고: 부티레이트 생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치 (임의로, 부가적으로 또는 대안적으로 페칼리박테리움 프로스니치 PHGI, 및 페칼리박테리움 프로스니치 PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레의 총 존재의 합으로 계산되며, 부티레이트는 발효관 내 얻어지는 부티레이트의 농도이다. 상기 값이 낮을수록, 부티레이트 생성 세균의 활성이 더 낮다. 감소되거나 낮은 수준의 부티레이트 생산은 예를 들어 대상 내 BB 지수가 표준 또는 대조 샘플 내에서보다 낮은 경우이다.

본원에 사용되는 용어 "존재", "수준" 또는 "부하"는 생물학적 샘플 내 표적 미생물의 양의 측정이다. 세균 정량은 일반적으로 분자생물학적 방법에 의하여, 전형적으로, 예를 들어 형광동소혼성화(FISH), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 또는 PCR/파이로시퀀싱에 의하여 상기 표적 미생물의 16S rRNA 유전자 복사본의 수를 결정함으로써 수행된다. 생물학적 샘플 내 표적 핵산 서열의 존재의 정량은 절대적 또는 상대적일 수 있다 "상대 정량"은 일반적으로, 보편적 프라이머를 사용하고 표적 핵산 서열의 존재를 총 세균 16S rRNA 유전자 복사본의 백분율로서 표시하거나 E. coli 16S rRNA 유전자 복사본에 의하여 정규화되는 총 세균의 결정과 같은, 하나 이상의 내부 표준 유전자, 즉 표준 균주로부터 16S rRNA를 기초로 한다. "절대 정량"은 DNA 표준과 비교함으로써 또는 DNA 농도에 의하여 정규화함으로써 표적 분자의 정확한 수를 제공한다.

정량 수준은 농도(부피 단위 당 DNA 양), 세포 수 당 DNA 양 또는 유전자 복사본 수, 사이클 역치(Ct 값), 또는 유전자 복사본의 수의 log10과 같은 이들의 임의의 수학적 변형으로서 표시될 수 있다. Ct 값은 샘플 내 표적 핵산 농도의 log10에 반비례한다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 본원에 기재되는 부티레이트-생성 종들은 qPCR에 의하여 정량된다. 바람직하게, 정량은 qPCR에 의하여 수행되었고, 정량 수준은 사이클 역치(Ct 값)으로서 표시되며, 이 경우, 부티레이트-생성 세균의 존재 수준의 감소가 Ct 값 증가로서 보여진다.

실시간 PCR로도 알려진 정량적 PCR(qPCR)은 당업계에 잘 알려져 있다. Applied Biosystems로부터 ABI Prism 7700 SDS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS; Bio-Rad로부터 iCycler iQ; Cepheid로부터 Smart Cycler; Corbett Research로부터 Rotor-Gene; Roche Molecular Biochemicals로부터 LightCycler 및 Stratagene로부터 Mx4000 Multiplex와 같은, 다양한 기구들이 이용가능하다. 상기 qPCR 과정은 반응의 대수증식기 매우 초기에 PCR 생성물 축적을 측정하여, 종료점 PCR에서 일어나는 PCR 증폭 효율과 관련되는 정량 편향을 감소시킴으로써 실시간으로 PCR 생성물의 정확한 정량을 가능케 한다. qPCR에 대한 기술 개요 및 프로토콜은 예를 들어 앞서 언급한 공급업체, 예를 들어, http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html 또는 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html로부터 이용가능하다. qPCR 방법의 검토에 대하여, Smith CJ and Osborn AM., FEMS Microbiol Ecol., 2009;67(1):6-20 및 Giulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 정량 방법은 예를 들어 단일 qPCR 반응으로 F. 프로스니치 필로그룹 I 및 필로그룹 II의 수준을 정량할 때 멀티플렉스 qPCR을 포함한다.

몇몇 유전자들을 세균 정량을 목적으로 사용할 수 있다. 전형적으로, 특정 표적 세균이 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭에 의하여 정량된다. 16S rRNA는 거의 모든 세균 종들에 있어서 다르다. 세균 종은 정의하기 어려우나, 조작분류단위(OTU)로 정의되는, 적어도 97% 동일성을 가지는 16S rRNA 유전자 서열을 가지는 유기체로서 간주된다. 약 1.5 kilobases의 16S rRNA 유전자 서열은 세균 분류군을 구별하는 9 개의 짧은 초가변 영역을 가지며; 이들 영역 중 하나 이상의 서열이 공통성 조사에서 표적화된다(Weinstock B.M, Nature 2012, 489,250-256).

단백질 암호화 유전자, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 또한 사용할 수 있다. Roux et al. (FEMS Microbiol Ecol 78 (2011) 617-628)는 생태학적 연구를 위한 분류학상 마커로서, 다섯 개의 단백질 마커 유전자(rplB, pyrG, fusA, leuS and rpoB)의 사용을 기재하며, 이를 위한 프라이머 세트들이 이용가능하다. 특정 표적 세균 정량을 위한 뉴클레오티딜 전이효소 유전자 및 부티릴-CoA 전이효소 유전자의 사용이 또한 기재되었다(Jia et al. FEMS Microbiol Lett. 2010; 310:138-144).

상이한 검출 화학이 qPCR에 이용가능하다. 이들 모두 앞서 언급한 qPCR 기구와 이용될 수 있다. 용어 "검출 화학"은 실시간 PCR에서 특정 PCR 생성물의 증폭을 보고하는 방법을 의미하며, 가수분해 또는 TaqMan® 프로브; 분자 키톤(molecular beacons); 스콜피온(scorpions); 혼성화 프로브 및 SYBR® Green I과 같은 DNA-결합 염료를 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어 Giulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401에 상세히 기재된다.

바람직하게, 본원에 기재되는 부티레이트-생성 종의 정량은 16S rRNA 유전자 정량에 의하여 수행된다. 바람직한 구현에에서, 본원에 기재된 부티레이트-생성 종의 정량을 위한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 프라이머 및 프로브)는 실시예에 개시된 것들 또는 이와 적어도 85%, 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 약 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드들이다.

바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 10 내지 30 개, 더 바람직하게 15 내지 26 개, 더욱 바람직하게 18 내지 22 개, 더욱 바람직하게 약 20 개의 뉴클레오티드를 가진다. 특정 구현예에서, 상기 프라이머 및/또는 프로브는 분석 성능을 증진시키기 위하여 또는 검출을 위하여 변형된 것이다.

특정 구현예에서, 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되고, 각각의 존재 수준은 다음 중 하나 이상의 사용을 포함하는 방법에 의하여 결정된다:

- F. 프로스니치 수준 결정을 위한, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드;

- PHGI 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5와, 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 서열번호 6으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드;

- PHGII 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5와, 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 서열번호 7로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드;

- 로제부리아 호미니스 수준 결정을 위한, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드; 및

- 서브돌리그라눌럼 바리아빌레의 수준 결정을 위한, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.

페칼리박테리움은 Duncan et al. (Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol. 2002; 52, 2141-2146)에 의하여 만들어진 새로운 속이다. 상기 비-포자-형성, 비-운동성 그램 양성, 엄격히 혐기성인 생물은 부티레이트, d-락테이트를 생산하고, 아세테이트를 이용한다. 게놈 DNA G-C 함량은 47±57 몰%이다 (열 변성에 의하여 결정). 그 특징이 Cato et al. (1974)에 의하여 보고된 상기 유형 균주는 페칼리박테리움 프로스니치 ATCC 27768T (NCIMB 13872T)이다. 그러나, 지난 수십년간 이러한 종에 대하여 수행된 최근의 연구들 대부분은 Duncan et al. (Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol. 2002; 52, 2141-2146)에 의해서도 기재된 균주 A2-165 (DSM 17677)이다. 오늘날, F. 프로스니치 종들은 퍼미큐티스(Firmicutes) 문, 클로스트리디움 강, 루미노코카세아에(Ruminococcaceae) 과의 주요 대표이다 (Miquel S. et al., Current Opinion in Microbiology 2013, 16: 1-7).

F. 프로스니치의 두 필로그룹들이 이전에 기재되었다 (Lopez-Siles et al., Appl Environ Microbiol. 2012;78:420-428). 이 연구는 16S rRNA 유전자 서열에 기초하여 분리 F. 프로스니치의 클로스트리디움 클러스터 IV의 다른 멤버들에 대한 계통발생적 관계를 분석하고, 최초로 F. 프로스니치 종들 내 두 개의 필로그룹들을 정의하며 (Lopez-Siles et al. 2012의 도 1), 구체적으로, 루미노코카세아에 과 내 >97% 서열 동일성을 가지는 두 브랜치들을 정의한다. 이들은 분리 M21/2, ATCC 27766, 및 ATCC 27768 (PHGI에 속함) 및 A2-165 및 L2-6 (PHGII에 속함)에 대하여 이전에 보고된 다섯 개의 서열들을 포함한다.

WO2017/025617은 F. 프로스니치의 16S rRNA 유전자에 대한 종-특이적 프라이머들 및 각각의 F. 프로스니치 필로그룹을 표적화하는 두 개의 가수분해 프로브의 특유의 쌍의 이용을 포함하는, F. 프로스니치 필로그룹들 모두를 동시에 정량하기 위한 qPCR 분석을 기재한다. 상기 분석에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 WO2017/025617의 표 15에 기재되며, 상기 내용은 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용되는 표현 "페칼리박테리움 프로스니치 불균형"은 총 F. 프로스니치(Fpra), F. 프로스니치 필로그룹 I(PHGI), 및/또는 F. 프로스니치 필로그룹 II(PHGII)의 감소를 의미한다.

로제부리아 호미니스는 Duncan et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2006, 56, 2437-2441)에 의하여 최초로 기재되었다. 이는 그램-가변성 또는 그램-음성, 엄격히 혐기성, 약간 굽은 막대이고, 계통발생적으로 R. 인테스티날리스와 관련되나 기존의 종들 내 포함되기에 충분히 관련되지 않는다. 상기 유형 균주는 A2-183이다. R. 호미니스는 글리세롤 상에서 성장할 수 있으나, 이눌린, 자일란 및 아밀로펙틴과 같은 복합 기질 상에서 성장하지 못하였다(표 1 참조), 부티레이트 및 포르메이트가 R. 호미니스 대사의 주요 생성물이다(표 2 참조).

서브돌리그라눌럼 바리아빌레는 Holmstrom et al. (Anaerobe 2004, 10, 197-203)에 의하여 최초로 기재되었다. 이는 다소 가변적 구균 모양의 형태를 나타내는 엄격히 혐기성, 비-포자-형성, 그램-음성 염색 유기체이다. 비교 1Y6S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 연구는 이것이 계통발생적으로 클로스트리디움 렙텀 상위분류 rRNA 클러스터의 멤버임을 보였다. 상기 유형 균주 S. 바리아빌레는 BI 114T이다. 글루코스 발효의 주요 생성물은 부티르산 및 락트산이다.

상기 대상은 장 질환의 증상을 나타내지 않는 대상일 수 있다. 과연, 대상은 장 질환을 가지지 전에, 예를 들어 염증성 장질환의 경우 염증 징후 및/또는 증상이 나타나기 전에, F. 프로스니치 및/또는 기타 부티레이트-생성 세균의 감소를 특징으로 하는 세균 불균형과 같은 장내 세균 불균형을 경험할 수 있다. 실시예 2의 시험관 내 발효 실험에서, 건강한 대상으로부터의 대변 샘플 내에 로제부리아 호미니스, F. 프로스니치 필로그룹 II 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레 존재의 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되며, 여기서 Previpect^TM이 음성 대조군에 대한 기질로서 사용된다. 이러한 증가는 유박테리아에 대한 이들 마커의 상대 수준이 결정될 때 로제부리아 호미니스 및 F. 프로스니치 필로그룹 II에 대하여 유지된다 (표 1 및 2 참조). 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 장 질환의 증상을 나타내지 않으며, PHGII, 서브돌리그라눌럼 바리아빌레 및/또는 로제부리아 호미니스의 불균형을 가진다.

대안적으로, 상기 대상은 장 질환을 가질 수 있다. 상기 장 질환은 염증성 장 질환, 예를 들어 "inflammatory bowel disease (IBD)", 또는 비-염증성 장 질환일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "염증성 장 질환(IBD)은 특발성 만성 염증성 장 상태의 군을 의미한다. 상기 용어가 포함하는 두가지 주된 질환 카테고리는 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)이며, 이들은 중복되고 구분되는 임상적 및 병적 특징들을 모두 가진다. IBD의 진단은 포괄적 물리적 검사 및 환자 이력의 검토를 요한다. 혈액 테스트, 대변검사, 내시경 검사, 생체 검사 및 영상 연구를 포함하는 다양한 테스트들이 다른 요인들을 배제하는 것을 보조하며 진단을 확인한다 (World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, Inflammatory bowel disease: a global perspective, June 2009; and Silverberg et al., Can J Gastroenterol. 2005, 19 Suppl A:5-36). IBD의 역학 및 유전학에 대한 이해 증가와 함께, UC 및 CD는 실제 IBD의 몇몇 형태를 나타낼 수 있음이 임상학자에 분명해졌다. 따라서, 본원에 사용되는 용어 "IBD"는 그 표현형을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "IBD"는 CD, UC, 불확정 대장염, 분류불능형 염증성장질환(IBDU), 낭염, 미세장염, 직장염, 게실염과 같은 질환 또는 장애를 포함한다 (Mowat et al., Gut 2011, 1-37; Geboes et al., J Clin Pathol 2005;58:1133-1134; Regueiro M, J Clin Gastroenterol. 2004, 38(9): 733-740;Cheifetz A, 및 Itzkowitz S., J Clin Gastroenterol. 2004 May-Jun;38(5 Suppl 1):S44-50). 이는 또한 IBD 질환 또는 장애 내 하위유형들을 포함한다. CD 하위유형은 예를 들어 Montreal 분류에 의하여 정의되는 것들이고, 여기서 CD는 진단시 연령, 위치 및/또는 행동에 따라 분류된다. UC 하위유형들 또한 Montreal 분류에 의하여 정의되는 것들이며, 여기서 UC는 질환 규모 및 질환 심각성에 따라 분류된다 (World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, Inflammatory bowel disease: a global perspective, June 2009; 및 Silverberg et al., Can J Gastroenterol. 2005, 19 Suppl A:5-36).

본원에 사용되는 용어 "불확정 대장염(IC)"은 결정절제술 피검물 내 UC 또는 CD의 특징적 특징이 없는 만성 IBD의 경우를 의미하는데에 사용된다(Silverberg et al., Can J Gastroenterol. 2005, 19 Suppl A:5-36; Satsangi et al., Gut 2006; 55, 749-753).

본원에 사용되는 용어 "분류불능형 염증성장질환(IBDU)"은 소장이 수반되지 않고 결장에 영향을 미치는 만성 염증성장질환에 대한 임상적 및 내시경적 근거의 증거가 있고, CD 또는 UC를 확립하는 조직학적 또는 기타 증거가 없는 경우를 의미하는데에 사용되며, 감염이 배제된다(Satsangi et al., Gut 2006; 55, 749-753).

특정 구현예서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 IBD를 가진다. 바람직하게, 상기 대상은 UC를 가진다. UC 환자는 감소된 수준의 PHGII를 특징으로 하는 것으로 이전에 보고된 바 있다(WO2017/025617).

실시예 2의 시험관 내 발효 실험에서, UC 환자로부터의 대변 샘플 내 F. 프로스니치 필로그룹 II 존재의 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되며, 여기서 Previpect^TM이 유박테리아에 대한 상대 수준 결정시에도 음성 대조군에 대한 기질로서 사용된다 (표 4 및 5 참조). 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 궤양성 대장염 및 PHGII 불균형을 가진다.

다른 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 비-염증성 장 질환을 가진다. 비-염증성 장질환의 예시적 비제한적 예는 과민성대장증후군 및 대장암이다(Miquel S. et al., Current Opinion in Microbiology 2013, 16: 1-7). 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 장질환은 비-염증성 장질환이나, 대장암이 아니다. 다른 특정 구현예에서, 상기 비-염증성 장질환은 과민성대장증후군이다. 실시예 3은 IBS 환자 및 건강한 대상 내 대변 샘플을 Previpect^TM 200, 사과 펙틴 및 Plantago ovata로 배양할 때 얻어지는 실험 결과를 제공한다. 표 12에 나타내는 바와 같이, IBS 환자의 대변 샘플을 음성 대조군에 대하여 Previpect^TM 200으로 배양할 때 총 F. 프로스니치, 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레 존재의 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 IBS 및 F. 프로스니치, 로제부리아 호미니스 및/또는 서브돌리그라눌럼 바리아빌레 불균형을 가진다.

추가적 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 대상은 인간 대상이다.

제 2 측면에서, 본 발명은 대상 내 장질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 포도 껍질, 바람직하게 분리된 포도 껍질에 관한 것으로, 상기 대상은 부티레이트-생성 세균 감소를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가지고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F.프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한, 대상에서 장질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 대상은 부티레이트-생성 세균 감소를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가지고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F.프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 본원에 기재되는 포도 껍질을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 장질환의 치료 방법은 예방적 방법이고, 상기 대상은 장질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 장질환의 치료 방법은 치료적 방법이고, 상기 대상은 장질환을 가진다, 즉 장질환의 징후 및/또는 증상을 나타낸다. 이러한 측면의 특정 구현예 및 바람직한 특징들은 앞서 기재한 바와 같다.

추가적 측면에서, 본 발명은 대상에서 장질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 포도 껍질, 바람직하게 분리된 포도 껍질에 관한 것이다. 관련된 측면에서, 본 발명은 대상에서 장질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 본원에 정의되는 포도 껍질을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기한 것들 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 상기 장질환은 궤양성 대장염 이외의 것이고, 바람직하게 상기 궤양성 대장염 이외의 질환은 CD 또는 IBS이다. 이러한 측면의 특정 구현예 및 바람직한 특징들은 앞서 기재한 바와 같다.

본원에서 언급되는 포도 껍질은 바람직하게 "분리된 포도 껍질"이다. 본원에 사용되는 용어 "분리된 포도 껍질"은 과육, 씨앗 및 줄기로부터 분리된 포도 껍질을 의미한다. 포도 껍질을 과육 및 기타 찌꺼기로부터 제거하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 포도 껍질은 수동으로 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 포도 전체가 탈수된 다음, 포도 껍질이 나머지(예를 들어, 씨앗 및 줄기)로부터 분리된다.

상기 포도는 임의의 포도종으로부터, 백포도 또는 적포도 품종으로부터, 바람직하게 백포도 품종으로부터일 수 있다. 포도박의 펙틴 함량은 적포도 및 백포도 품종 간에 유의한 차이를 나타내며, 백포도 품종으로부터의 포도박 내에 더 높은 것으로 보고되었다(Gonzalez-Centeno MR, et al. Food sci technol. 2010; 43: 1580-1586). 백포도 품종의 예시적 비제한적 예는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera), 비티스 라브루스카(Vitis labrusca), 비티스 리파리아(Vitis riparia), V.비니훼라 하이브리드(V. vinifera hybrids) 및 비-V. 비니훼라 하이브리드(non-V. vinifera hybrids)를 포함한다.

바람직하게, 상기 포도 껍질은 비티스 로툰디폴리아(Vitis rotundifolia) 이외의 포도 종으로부터이다. 무스카딘 포도(비티스 로툰디폴리아) 와인의 화학적 조성은 Basha et al. (African Journal of Biotechnology 2004, Vol. 3 (10), 523-528)에 번치 포도(비티스 비니훼라) 와인의 것과 특히 항산화 화합물 내 조성에 있어서 다른 것으로 기재되어 있다. 무스카딘 포도는 고농도의 특정 페놀 화합물의 존재를 특징으로 하며 무스카딘 이외의 포도종에서 대개 발견되지 않는 엘라그산을 함유하는 것으로 보고되었다(Olien et al. Hortsci. 199025, 732-739; Lin and Vine J. Food Sci. 1990, 55, 1607-1613).

바람직한 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 포도는 포도종 비티스 비니훼라로부터이다. 비티스 비니훼라 종의 백포도 품종의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이에 제한되지 않으나, 화이트 그르나슈(white Grenache), 피노블랑(pinot blanc), 샤도네이(chardonnay) 및 쏘비뇽 블랑(sauvignon blanc)을 포함한다. 바람직하게, 이러한 포도는 포도종 비티스 비니훼라로부터 및 화이트 그르나슈 품종으로부터이다.

분리된 포도 껍질은 탈수(동결건조를 포함) 또는 분쇄와 같은 물리적 변형 공정에 놓여질 수 있다. 특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 포도 껍질은 약 18%와 같은 20% 이하의 수분 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 탈수된 포도 껍질이다. 바람직하게, 상기 포도 껍질은 5 내지 15%, 더 바람직하게 약 11%와 같은 10 내지 12%의 수분 함량을 가지는 것과 같이, 15% 이하의 수분 함량을 가지는 탈수된 포도 껍질이다.

추가적 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 포도 껍질은

a) 전체 포도를 건조하는 단계; 및

b) 포도 껍질을 분리하는 단계;

c) 임의로, b)에서 얻어진 생성물을 분쇄하는 단계; 및

d) 임의로, c)에서 얻어진 생성물을 체분리하는 단계

를 포함하는 방법에 의하여 수득되거나 수득가능하다.

바람직하게, 단계 a)에서 포도는 공기 순환식 오븐 내에서 60-62℃에서 적어도 2 일 동안 건조된다. 예를 들어, 이는 2 내지 5일, 더 바람직하게 2 일 동안 건조될 수 있다.

분쇄 생성물은 그 입자 크기에 의하여 특히 제한되지 않는다. 단계 c) 후 얻어지는 분쇄 생성물의 입자 크기는 예를 들어 0.001mm 내지 5 mm일 수 있다. 전형적으로, 이는 2 mm 미만, 바람직하게 1 mm 미만, 더 바람직하게 0.1 mm 미만의 입자 크기를 가진다. 특정 구현예에서, 상기 분쇄 생성물은 미분화된다.

본원에 사용되는 용어 "미분화(micronization)"는 고체 물질 입자의 평균 직경을 감소시키는 공정을 의미한다. 대개, 용어 미분화는 입자가 단지 수 마이크로미터(전형적으로 100 ㎛ 미만)로부터 나노미터 직경 범위로 생산될 때 사용된다. 전통적 미분화 기술은 마찰을 이용하여 입자 크기를 감소시키는 것에 기초한다. 본원에 사용되는 용어 "분쇄(grinding)"는 넓게 밀링 및 그라인딩과 같은 입자 크기 감소를 위한 임의의 기법을 포함하는 것으로 사용된다.

바람직한 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 본 발명은 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 포도 껍질 및 적어도 하나의 약학적으로, 수의학적으로 또는 영양항적으로 허용가능한 부형제 또는 베히클을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 장내 세균 불균형은 본원에 기재되는 부티레이트-생성 세균 감소를 특징으로 한다. 본 발명은 또한, 대상에서 장질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로, 상기 대상은 본원에 기재되는 부티레이트-생성 세균 감소를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가진다.

용어 "약학적으로, 수의학적으로 또는 영양학적으로 허용가능한 부형제 또는 베히클"은 상기 조성물 제조를 위한 약학적, 수의학적 또는 식품 기술에서 사용하기에 적합한 부형제 또는 베히클을 의미한다. 이들 성분들 부형제 또는 담체는 상기 조성물의 다른 성분들과 혼화성이어야 한다. 이는 또한 타당한 이득/모험 비로 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 면역원성 문제 또는 합병증없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉시 그 사용에 적합하여야 한다. 이들은 약학적 제형 내 존재하는 농도에서 약리학적 활성을 결여하는 물질이다. 상기 부형제 또는 베히클은 하나 이상의 활성 성분들의 안정성, 생체이용률, 허용가능성 및 투여 용이성을 보증하는 약학적 또는 수의학적 제형 특징을 제공하기 위하여 사용된다. 부형제가 활성 성분 방출에 영향을 미치는 정도와 관련하여, 이들은 그 생체이용률 변화에 의하여 약품의 규모 및 그 약리 활성의 시간 프로필을 변화시킬 수 있을 것이다. 상기 부형제는 또한 적합한 형태 또는 점조도를 가지는 제제를 제공하기 위하여 사용된다. 부형제의 예는 가용화제, 붕괴제, 붕해제, 유화제, 염료, 항료, 바인더, 항산화제, 윤활제, 방부제, 증점제 등이다. Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 또는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22^nd edition, Pharmaceutical press (2012), ISBN-13: 9780857110626에 기재된 것들과 같은, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는, 약학적 조성물의 원하는 특징에 악영향을 미치지 않는 한, 본원에 기재되는 약학적 조성물 내에도 포함될 수 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학적 조성물이다. 임의의 투여 경로가 적합하나, 경구 또는 직장 투여가 바람직할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 바람직하게 경구 또는 직장 투여용으로 제제화된다. 경구 조성물은 예를 들어 알약, 정제, 파스티유, 캡슐, 분말, 웨이퍼, 비등산(effervescent powder) 또는 정제, 용액, 현탁액, 시럽 또는 과립 형태일 수 있다. 고체 약학적 조성물에 대하여, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함하는 전형적인 비독성 고체 담체를 이용할 수 있다. 직장 조성물은 무엇보다도 좌약, 관장제 또는 특수 카테테르 형태일 수 있다.

다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물이다. 상기 식품 조성물은 액체 조성물 또는 음료, 고체 조성물 또는 영양 보조제 또는 보충제(식이 또는 식품 보조제 또는 보충제로도 언급됨)일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 용어 "식품 조성물"은 분리된 포도 껍질뿐아니라 분리된 포도 껍질을 함유하는 영양 보조제 또는 보충제로 강화된 임의의 고체 또는 액체 식품을 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물은 액체 조성물, 즉 사회에서 가장 일반적으로 사용되는 용어에 따라 음료일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 그러한 액체 조성물은 이에 제한되지 않으나, 동물 또는 식물성 우유, 및 예를 들어 밀크쉐이크, 요거트, 케피어 등과 같은 이의 파생 식품; 과일 및/또는 야채 주스; 정수(still water) 또는 소다수(sparkling water), 또는 맛이 첨가되거나 당분을 가미한 (영양 감미료(수크로스, 프럭토스...) 또는 인공 감미료에 의하여) 물 또는 음료; 예를 들어 살사, 드레싱, 케첩, 오일, 식초 또는 식초 제제와 같은 양념; 임의의 유형의 알콜 음료; 차, 커피; 및 모든 형태의 청량음료 또는 소프트 드링크, 또는 에너지 음료로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 음료를 포함한다.

상기 식품 조성물은 또한 고체 조성물일 수 있다. 이러한 고체 조성물은 예를 들어 이에 제한되지 않으나, 치즈, 버터, 마가린 및 두부와 같은 동물 또는 식물성 우유 파생 식품; 신선한, 포장되거나 냉동된 빵, 슬라이싱된 빵, 통밀빵, 양념한 빵, 당분 가미된 빵, 염분 가미된 빵 등을 포함하는 임의의 유형의 빵; 휘트 또는 세몰리나분과 같은 임의의 곡물분으로부터 제조된 파스타(마카로니, 스파게티, 누들 등); 케이크, 쿠키, 머핀, 도넛 등을 포함하는 베이킹된 제품; 음료 제조를 위한, 대량 또는 1회분 봉지 내 인퓨젼, 차 또는 커피; 젤리, "소프트 프룻 캔디"로 더 알려진 거미 캔디를 포함하는 캔디; 및 임의의 유형의 고체 양념, 예를 들어, 오레가노, 고슴, 코리앤더, 파슬리, 바질 등, 또는 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

마지막으로, 상기 식품 조성물은 영양, 식이 또는 식품 보조제 또는 보충제일 수 있으며, 이들 용어들은 본 발명의 문맥상 균등한 방식으로 사용된다. 이들 용어들은 대개, 식이 보충을 위한 성분, 본 발명의 경우 분리된 포도 껍질을 함유하는, 입을 통해 소비되는 조성물에 사용된다. 이는 전형적인 식품을 대체할 수 없거나 또는 식사의 유일한 성분일 수 없다. 이는 파스티유, 알약, 정제, 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐, 젤라틴 캡슐, 웨이퍼, 비등 정제, 액체(용액, 현탁액, 시럽), 과립 및 분말과 같은 상이한 외관으로 발견될 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위 내의 특정 구현예로서 포함된다. 식이상 또는 약학적으로 허용가능한 부형제는 앞서 기재한 외관들 중 임의의 것을 얻기 위하여 당업자에게 명백하며, 이들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재되거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 분리된 포도 껍질 조성물은 지연분비 또는 장용 경구 제형으로서 제제화된다. 지연분비 경구 제형 내에 외표면 또는 내용물은 위액의 작용에 견디나 장액의 존재 하에 활성 성분(들)을 분비한다. 이러한 지연분비 경구 제형은 이에 제한되지 않으나, 과립, 정제 및 경질 또는 연질 캡슐, 및 이의 조합을 포함한다.

상기 지연분비 경구 제형은 적어도 하나의 위내성(gastr-resistant) 층 또는 코팅을 포함하고, 상기 위내성 층 또는 코팅은 적어도 하나의 위장관 폴리머를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "코팅"은 예를 들어, 캡슐 쉘에 또는 활성 성분을 포함하는 코어에 표면 전체에 층의 적용을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 지연분비 제형은 2, 3 또는 그 이상의 위-저항 층 또는 코팅을 포함할 수 있다.

위내성 폴리머는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 폴리머들은 일반적으로 5.5 이상의 pH에서 용해되고, 이들이 코팅하는 물질 또는 조성물을 위 환경으로부터 보호할 수 있게 한다. 위내성 폴리머 및 폴리머 코팅의 예시적 비제한적 예는 셀룰로오스 아세테이트, 상표명 EUDRAGIT ®, 주로 EUDRAGIT ® L 및 EUDRAGIT ®S로 알려진 메타크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 상이한 비의 코폴리머, 폴리비닐아세토프탈레이트 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트이다. 또한, 상기 위내성 층 또는 코팅은 디에틸프탈레이트, 디부틸프탈레이트, 트리아세틴, 폴리에틸렌글리콜 및 아세틸화 모노글리세라이드와 같은 가소제를 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 가소제는 코팅제 양에 대하여 5 내지 15 중량%의 양으로 포함된다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 조성물은 프리바이오틱, 단일 종의 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 종들의 군 (천연 또는 유전자 변형된 미생물을 포함), 세균의 2차 생성물(예를 들어, 부티레이트), 세균/숙주 상호작용의 분자 경로 조절제 및 좁은 범위 항생제로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 추가로 포함한다. 프리바이오틱 및 프로바이오틱 화합물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다(즉, 신바이오틱 적용), 예를 들어 Handbook of Prebiotics and Probiotics Ingredients; Health benefits and food applications (Ed. Ungsoo Cho S. and Finocchiaro T., CRC press, 2009)를 참조한다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 조성물은 프리바이오틱 화합물을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 포도 껍질과 조합하여 사용될 수 있는 프리바이오틱 화합물의 예시적 비제한적 에는 다른 포도 파생물(예를 들어, 포도씨 또는 포도씨 프로안토시아니딘 추출물 (GSPE, see Liu W. et al., Mol. Nutr. Food Res 61, 9, 2017)), 발아 보리 식품(GBF), 프럭토-올리고사카라이드(FOS), 이눌린, 사과 펙틴, 및 이스파귤라 껍질(Plantago ovata로도 언급됨), 씨앗 및/또는 꽂잎 및/또는 상기 식물의 다른 부분을 포함하고 이로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 상기 프리바이오틱 화합물은 사과 펙틴이다.

요거트 및 기타 유제픔에 존재하는 것들을 포함하는 많은 프로바이오틱 종들이 기재되었다. 프로바이오틱 종들의 예시적 비제한적 예는 락토바실리(예를 들어, 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리(Lactobacillus bulgarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)), 비피도박테리아(예를 들어, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 사카로마이세스 불라르디, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 E.coli의 비-병원성 종들을 포함한다.

특정 구현예에서, 임의로 앞서 기재하거나 후술하는 하나 이상의 구현예들과 조합하여, 상기 조성물은 부티레이트-생성 세균, 락토바실리, 비피도박테리아, 스트렙토코커스 서모필러스, 사카로마이세스 불라르디, 바실러스 서브틸리스 및 E. coli의 비병원성 종들로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일 종의 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 종들의 군을 추가로 포함하며, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 F. 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I, F. 프로스니치 필로그룹 II, R. 호미니스, 및 S. 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택된다.

상기 조성물은 동결건조, 액체 또는 분무 형태와 같은 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어 동결건조된 세균이 조성물 제조에 사용된다면, 원하는 총 농도(CFU/ml)를 가지는 최종 조성물이 얻어질 수 있도록, 동결건조된 세균의 예비 조성물이 예를 들어 무균 등장 생리식염수로 재수화될 수 있다.

용이한 사용을 제공하기 위하여, 상기 조성물은 제형일 수 있다. 예를 들어, 각각의 투여는 10⁷ 이상, 10⁸ 이상, 10⁹ 이상, 10¹⁰ 이상, 10¹¹ 이상의 집락 형성 단위(CFU)의 세균(10⁹ 이상 이 바람직할 것이다)을 포함할 수 있다. 투여량은 0.1 내지 100 ml, 바람직하게 0.2 내지 50 ml, 더 바람직하게 0.5 내지 20 ml, 더 바람직하게 1.0 내지 10 ml, 더 바람직하게 1.5 내지 5 ml 범위의 체적을 가질 수 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포도 껍질과 프리바이오틱, 단일 종의 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 종들의 군, 세균의 이차 생성물, 세균/숙주 상호작용의 분자 경로의 조절자 및 좁은 범위 항생제로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물의 상승적 조합에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 장내 세균 불균형 치료에서 상승효과를 제공하는 포도 껍질 및 상기 정의한 화합물을 포함하는 조성물, 및 장내 세균 불균형 치료, 바람직하게 부티레이트-생성 세균 불균형 치료에서 그 용도에 관한 것이다. 특정 구현예 및 바람직한 특징들이 본원에 기재된다.

본원에 기재되는 특징들은 임의로 의학적 용도, 조성물, 약학적 조성물, 치료 방법, 조성물 제조 방법 및/또는 본 발명의 병용 요법 중 임의의 구현예와 조합될 수 있고; 본원 명세서에 논의되는 임의의 구현예는 이들 중 임의의 것에 대하여 실행될 수 있는 것으로 간주된다. 본원에 기재되는 특정 구현예들은 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징들은 본 발명의 범위로부터 이탈됨이 없이 다양한 구현예들에서 사용될 수 있다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 통하여, 본원에 기재된 특정 절차들에 대한 무수한 균등물들을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주되고 청구항들의 대상이다.

모든 문헌들 및 특허 출원들은 각각의 문헌 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

단수 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나보다 많은"의 의미와도 일치한다. 용어 "다른"의 사용은 또한 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 의미하는 것으로 분명히 표시되거나 대안들이 서로 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데에 사용된다.

본원 명세서 및 청구항(들)에 사용되는 단어 "포함하는" (및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "가지는"(및 "가지다"와 같은 가지는의 임의의 형태), "또는 "함유하는"(및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)는 포괄적이거나 제한을 두지 않으며, 추가적인 인용되지 되지 않은 요소들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 용어 "포함하다"는 또한 "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"을 포함하고 분명히 개시한다. 본원에 사용되는 문구 "필수적으로 구성되는"은 청구항의 범위를 명시된 물질 또는 단계들 및 청구되는 발명의 근본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본원에 사용되는 문구 "구성되는"은 예를 들어, 그 요소와 정상적으로 관련되는 불순물 또는 제한을 제외하고, 청구항에 명시되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 배제한다.

본원에 사용되는 용어 "또는 그의 조합"은 그 용어에 선행하는 열거된 항목들 중 모든 순열 및 조합을 의미한다. 예를 들어, "A, B, C 또는 그 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도되며, 특정 문맥에서 순서가 중요하다면, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 예로 계속하면, BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복들을 함유하는 조합들이 분명히 포함된다. 당업자는 문맥상 반대임이 분명하지 않는 한, 임의의 조합에서 항목들 또는 용어들의 수에 대한 제한이 전형적으로 없음을 이해할 것이다.

제한없이 "약", "대략"과 같은 본원에 사용되는 근사치 단어는 그와 같이 한정될 때 반드시 절대적이거나 완전할 필요는 없는 것으로 이해되나 당업자에게 그 조건이 존재하는 것으로 나타내는 보증에 충분히 가까운 것으로 간주될 조건을 의미한다. 기재가 변할 수 있는 정도는 얼마나 큰 변화가 성립될 수 있는지에 따를 것이며, 여전히 당업자로 하여금 한정된 특징이 비한정된 특징의 요구되는 특징 및 능력을 가지게 할 것이다. 일반적으로, 그러나 선행하는 논의에 따라, "약"과 같은 근사치 단어에 의하여 한정되는 본원의 수치는 기재된 값으로부터 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15% 변할 수 있다. 따라서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 그 값의 5%, 바람직하게 지정된 값 ± 그 값의 2%를 의미할 수 있고, 가장 바람직하게 용어 "약"은 정확히 지정된 값(±0%)을 의미한다.

본 발명의 사항들

1. 대상에서 장내 세균 불균형을 치료하는 방법에 사용하기 위한 분리된 포도 껍질로서, 상기 장내 세균 불균형은 부티르산-생성 세균의 감소를 특징으로 하고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

2. 사항 1에 있어서, 상기 대상은 장 질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

3. 사항 1에 있어서, 상기 대상은 장 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

4. 대상에서 장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 분리된 포도 껍질로서, 상기 대상은 부티레이트-생성 세균 감소를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가지고, 바람직하게 부티레이스-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

5. 사항 4에 있어서, 상기 방법은 예방적 방법이고, 상기 대상은 장 질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

6. 사항 5에 있어서, 상기 방법은 치료적 방법이고, 상기 대상은 장 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

7. 사항 3 내지 6 중 하나에 있어서, 상기 장 질환은 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

8. 사항 3 내지 7 중 하나에 있어서, 상기 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론병인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

9. 사항 3 내지 6 중 하나에 있어서, 상기 장질환은 과민성 대장 증후군인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

10. 사항 1 내지 9 중 하나에 있어서, 상기 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

11. 사항 1 내지 10 중 하나에 있어서, 부티레이트-생성 세균의 감소는 다음 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정되고,

a. 상기 대상의 장 샘플, 바람직하게 대변 샘플 내 부티레이트-생성 세균의 수준을 결정하는 단계; 및

b. 상기 대상 샘플 내 부티레이트-생성 세균 수준을 표준 샘플 내 수준과 비교하는 단계 - 바람직하게 상기 표준 샘플은 장 질환을 가지지 않은 대상 또는 대상들의 군의 샘플임;

상기 대상 샘플 내 수준이 상기 표준 샘플 내 수준 아래일 때 부티레이트-생성 세균의 감소가 있는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

12. 사항 11에 있어서, 부티레이트-생성 세균의 수준은 정량적 PCR에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

13. 사항 11 또는 12에 있어서, 상기 부티레이트-생성 세균은 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII), 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되고, 부티레이트-생성 세균 각각의 수준은 다음 중 하나 이상의 사용을 포함하는 방법에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질:

- PHGI 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5와, 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 서열번호 6로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드;

- 로제부리아 호미니스 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드; 및

- 서브돌리그라눌럼 바리아빌레 수준 결정을 위한, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.

14. 사항 1 내지 13 중 하나에 있어서, 상기 포도 껍질은 비티스 로툰디폴리아 이외의 포도종으로부터인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

15, 사항 1 내지 14 중 하나에 있어서, 상기 포도 껍질은 포도종 비티스 비니훼라, 바람직하게 백포도 품종으로부터인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

16. 사항 1 내지 14 중 하나에 있어서, 상기 포도 껍질은 20% 이하의 수분 함량을 가짐을 특징으로 하는 탈수된 포도 껍질인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

17. 사항 1 내지 14 중 하나에 있어서,

a) 전체 포도를 건조하는 단계; 및

b) 포도 껍질을 분리하는 단계;

c) 임의로 b)에서 수득된 생성물을 분쇄하는 단계; 및

d) 임의로 c)에서 수득된 생성물을 체분리하여, 바람직하게 1 mm 이하의 입자 크기를 가지는 생성물을 수득하는 단계

를 포함하는 방법에 의하여 수득되거나 수득가능한 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

18. 사항 17에 있어서, 단계 a)에서 전체 포도가 공기-순환식 오븐 내에서 60-62℃에서 적어도 2 일 동안 건조되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.

19. 사항 1 내지 18 중 하나에 따른 용도를 위한, 사항 1 내지 18 중 하나에서 정의되는 분리된 포도 껍질을 포함하는 조성물.

20. 사항 19에 있어서, 상기 조성물은 상기 조성물은 프리바이오틱, 단일 프로바이오틱 종 또는 프로바이오틱 종들의 군, 세균의 이차 생성물, 세균/숙주 상호작용의 분자 경로의 조절자 및 좁은 범위 항생제로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

21. 사항 19 또는 20에 있어서, 상기 조성물은 발아 보리 식품(GBF), 프럭토-올리고사카라이드(FOS), 이눌린, 사과 펙틴, 및 이스파귤라 껍질 씨앗 및/또는 꽃잎 및/또는 상기 식물의 다른 부분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 프리바이오틱을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

22. 사항 19 내지 21 중 하나에 있어서, 상기 조성물은 부티레이트-생성 세균, 락토바실리, 비피도박테리아, 스트렙토코커스 서모필러스, 사카로마이세스 불라르디, 바실러스 서브틸리스 및 E.coli의 비병원성 종들로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일 종의 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 종들의 군을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 부티레이트-생성 세균은 F.프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I, F. 프로스니치 필로그룹 II, R. 호미니스 및 S. 바리아빌레로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

23. 사항 1 내지 22 중 하나에 있어서, 상기 조성물은 경구 또는 직장 투여용으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.

다음 실시예들은 본 발명을 예시할 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.

실시예

실시예 1 - 분석된 탈수 포도 껍질 조성물의 특징

포도종 비티스 비니훼라의 백포도 품종(즉, 화이트 그르나슈 (Alt Emporda, Catalonia, Spain))으로부터의 포도 껍질 전체를 공기-순환식 오븐 내에서 60-62℃에서 2 일 동안 건조한 다음, 이를 분쇄하고 1 mm 체를 이용하여 체분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 탈수된 포도 껍질 조성물을 수득하였다. 1 mm 이하의 입자 크기를 가지는 결과 형성되는 조성물을 본원에서 "Previpect^TM"이라 한다.

이하 표는 이러한 포도 껍질 조성물의 화학적 조성 분석 결과를 제공하며, 여기서 예를 들어, 가용성 및 불용성 섬유, 및 중성 당의 함량이 명시된다:

화학적 조성 분석:

결과:

총 당(글루코스로 표시) % (p/p)s.s.m 53.24

방법: Lurff-Schoorl 부피법 (Regulation (EC) n⁰ 152/2009)

당 크로마토그램

방법: HPLC-굴절률(RI)

프럭토스 % (p/p) s.s.n 25.8

글루코스 % (p/p) s.s.n 6.1

수크로스 % (p/p) s.s.n <0.5

말토스 % (p/p) s.s.n <0.5

락토스 모노하이드레이트 % (p/p) s.s.n <0.5

가용성 및 불용성 식이섬유 % (p/p) s.s.n

방법: 중량 분석 (AOAC 공식법 993. 19 1(1996) 16^th.Edition)

총 식이 섬유 % (p/p) s.s.n 32.16

가용성 식이 섬유 % (p/p) s.s.n 3.30

불용성 식이 섬유 % (p/p) s.s.n 28.86

습도 및 휘발성 물질 (103℃) % (p/p) s.s.n 6.30

방법: 중량 분석 (Regulation (EC) n⁰ 152/2009)

나트륨 (Na) mg/Kg s.s.n 78

방법: 불꽃 원자 흡수 분광법 (A.A.S)

니트레이트 (NO₃Na) mg/Kg s.s.n 26

방법: HPLC-UV (DAD)

탈수 시험

60-62℃에서 5 일 동안 공기-순환식 오븐 내에서 건조 후, 비티스 비니훼라 종(화이트 그르나슈 품종)의 포도 껍질 샘플의 수분 함량 측정을 위하여 열천칭을 사용하였다. 결과는 2 일 후 습도 백분율이 20% 아래이고, 3 일 후 11% 주위로 안정화됨을 보인다. 결과를 아래 나타내고 도 22에 도시한다.

실시예 2 - IBD 환자 및 건강한 대상으로부터 대변 샘플과 Previpect ^TM 의 시험관내 배양

재료 및 방법

1. 환자, 임상 데이터 및 샘플링

대변 샘플을 13 명의 건강한 대상(H) 및 11 명의 염증성장질환(IBD) 진단받은 환자(5 명은 크론병(CD) 진단되고 6 명은 궤양성 대장염(UC) 진단됨)로부터 얻었다. 이들 지원자들은 Hospital Universitari Dr. Josep Trueta (Girona, Spain)의 Gastroenterology Service에 의하여 모집하였다.

IBD 환자로서 모집된 대상들은 표준 임상, 병리 및 내시경적 기준에 따라 진단되었으며, 모두 염증 반응 측면에서(칼프로텍틴 수준 250 ㎍/G 이상 또는 단백질 C 반응성 (PCR) 수분 0.5 ㎍/C 이상) 활동성 질환 상태였다. 대조군은 알려진 위장환 장애없는 건강한 대상들로 구성되었으며, 임상 표준에 따라 모집되었다.

2. 샘플 수집, 보존 및 저장

각각의 대상은 하나의 대변 샘플을 기증하였다. 이들을 Hospital Universitari Dr. Josep Trueta의 Gastroenterology Service에서 수집하였다. 간략히, 상기 샘플들을 무균 소변통(Sarstedt, Numbrecht, Germany) 내에 수집하고, 실온에서 보존하고, 4 시간 이내에 그대로 사용하였다. 모든 대상으로부터의 샘플들은 균질화되고 실험을 위하여 즉시 사용되었다.

3. 대변 배양

대변 발효를 상기한 바와 같이 IBD 및 건강한 대상들로부터 얻는 인간 대변 그대로를 이용하여 수행하였다. 실험실에서, 대변 샘플을 스토마커 무균 플라스틱 백으로 옮기고, 5:1의 발효 완충액(0.1M KH₂PO₄, 0.05 mM NaOH; pH 7.0)의 첨가후, 상기 백을 조심스럽게 쥐어짜 내용물을 혼합하였다. 상기 혼합물 또는 대변 슬러리를 Stomacher 400 (Seward, Worthing, UK) 내에서 230 rpm에서 3 분 동안 교반하였다. 이 현탁액 10 밀리미터를 페놀 캡을 가지는 붕규산염 유리관 내로 옮겼다. 다음 화합물 각각이 미리 첨가되었다:

- 음성 대조군: 10 ml의 발효 완충액;

- Previpect^TM 200: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 200 mg의 Previpect^TM;

- Previpect^TM 600: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 600 mg의 Previpect^TM;

- 펙틴 200: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 사과 펙틴(Solgar, Madrid, Spain) 200 mg;

- Previpect^TM + 펙틴 200: 10 ml의 발효 완충액 내 모두 희석된 사과 펙틴 200 mg 및 Previpect^TM 200 mg.

상기 기질들을 함유하는 관은 100℃에서 10 분 동안 미리 오토클레이브처리되어 탈기되었다. 상기 발효관들을 꼭 닫고 37℃에서 가볍게 교반하면서 배양하였다.

72 시간 후, 상기 관들을 무균 플라스틱관으로 옮긴 다음 4℃에서 30 분 동안 4500 xg에서 원심분리하였다. 상층액을 다른 관으로 옮기고 4℃에서 15 분 동안 4500 xg에서 원심분리하였다. 마지막으로, 상층액을 20℃에서 밀폐된 바이얼 내 저장하였다.

실험을 위한 내부 대조군으로서 취하여진 한 명의 건강한 대상을 제외하고 각각의 지원자로부터 하나의 고유 대변 샘플을 사용하였다. 그러나, 이 실험에서 보고된 변화로 인하여, 상기 대상은 각각의 실험에서 상이한 대상들로서 간주되었다.

4. DNA 추출

원심분리 전에, NucleoSpin^® Soil Kit (Macherey-Nagel GmbH &Co., Duren, German)를 이용하여, 발효관으로부터 DNA를 추출하였다. 간략히, 250 ㎕의 샘플을 뉴클레오스핀 비드-관 내에 놓았다. DNA 회수를 증진시키기 위하여, 700 ㎕의 SL1 및 150 ㎕의 인핸서(SX)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 그 후, 제조업자로부터의 지시에 따라 DNA를 추출하고 정제하였다. 게놈 DNA를 100 ㎕의 용출 완충액으로 용출하고, 사용시까지 -20℃에서 저장하였다. 추출물의 DNA 농도를 Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit를 이용하여 Qubit 형광측정계Invitrogen detection Technologies, USA)를 이용하여 결정하였다. qPCR 분석 전에, DNA 농도를 자유 DNA 수로 8 ng/㎕로 조정하였다

5. 단쇄 지방산(SCFAs)의 분석

대변 배양으로부터의 상층액 2 밀리미터를 0.22㎕ 무균 필터를 통하여 새로운 관 내로 넣었다. 85 밀리미터의 크로톤산(10000 ppm)을 내부 표준으로서 첨가하고, 100㎕의 85% 인산을 첨가하여 각각의 1.5 ml 샘플에 대하여 비이온화 샘플로 변형시켰다. 바이얼을 GC-FID 시스템 (Agilent, CA, US) 내 DB-FFAP 컬럼 (Agilent, CA, US) 내에 놓았다. 측정된 단쇄 지방산은 다음과 같았다: 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 발레르산, 이소발레르산 및 헥산산.

6. 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 정량적 실시간 PCR(qPCR)

대변 배양으로부터 DNA를 정량적 실시간 PCR에 의하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 총 페칼리박테리움 프로스니치(Fpra), 페칼리박테리움 프로스니치 필로그룹 I(PhGI), 페칼리박테리움 프로스니치 필로그룹 II (PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco), 로제부리아 호미니스(ROS), B46(서브돌리그라눌럼 바리아빌레) 및 진정세균(EUB)의 양을 평가하였다. Fpra, PGhI, PGhII 및 Eco 세균 서열을 Taqman^TM 프로브 기반 분석에 의하여 정량적 실시간 PCR을 이용하여 정량하였으며, ROS, B46 및 EUB를 SYBR® Green 분석에 의하여 정량하였다. 프라이머 및 qPCR 조건들은 이하 기재하는 바와 같았다:

표 A: qPCR 분석에 사용된 프라이머 및 프로브

샘플들을 동일 플레이트 내에서 2회 시험하였다. 데이터 분석을 위하여, 2회 정량의 평균을 이용하였다. 각각의 샘플의 세균 존재를 총 DNA 농도에 대하여 정규화된 Ct로서 표시하였으며, 여기서 Ct(사이클 역치) 값은 형광 시그널이 역치를 넘는데 요구되는 q-PCR 사이클의 수로서 정의된다. Ct 수준은 샘플 내 표적 핵산 농도의 로그에 반비례한다. 실시간 분석은 40 사이클의 증폭을 거쳤다.

모든 정량적 PCR은 AriaMx PCR 시스템(Stratagene by Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 수행되었고, AriaMx Software version1.2 (Stratagene by Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석되었다.

7. 통계분석 방법

데이터의 통계적 정규 분포를 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 통하여 분석하였다. 데이터의 통계적 정규 분포가 있는지 없는지에 따라, 다음 군들을 비교하기 위하여 적절한 통계 테스트를 이용하였다. 정규 분포된 군들을 비교하기 위하여 정규 t-테스트를 이용하였으며, 정규 분포가 없는 군들을 비교하기 위하여 Mann-Whitney 비-매개변수 테스트를 이용하였다.

결과

Previpect^TM 첨가에 의하여 야기되는 장내 미생물군에 대한 잠재적 개선을 결정하기 위하여, 다섯 개의 상이한 기질로 배양 후, 환자들의 진정세균(Eubacteria), B46, 로제부리아 호미니스, F. 프로스니치, 필로그룹 I 및 필로그룹 II 및 E.coli 존재를 연구하였다. 세균종 정량 결과를 포 1a 내지 6c에 나타낸다. Previpect^TM 첨가후 SCFA를 생산할 수 있는 미생물군의 대사 활성에 있어서 예상되는 증가를 평가하기 위하여, 부티르산, 헥산산, 이소부티르산, 이소발레르산, 프로피온산, 발레르산 및 아세트산과 같은 단쇄 지방산(SCFA)의 농도를 또한 정량하였다. SCFA 정량 결과를 도 7a 내지 13c에 나타낸다.

세 개의 상이한 샘플군에서 5회 처리간의 통계적 비교를 수행하였다: 건강한(H) 대상, 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC) 환자. 데이터는 정규 분포를 나타내지 않았으며, 따라서, Mann-Whitney 비-매개변수 테스트를 이용하여 처리를 비교하였다.

통계적 비교 결과

건강한(H) 대상

표 1. 상이한 기질들로 배양된 건강한 대상으로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB), B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 총 존재의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

음성 대조군(기질없음)을 Previpect^TM 200 mg and Previpect^TM 및 600 mg과 바교하면 B46, 로제부리아 호미니스, F. 프로스니치, 특히 F. 프로스니치 필로그룹 II와 같은 부티레이트 생성 세균의 일반적 증가가 관찰된다. 또한, Previpect^TM 600 mg을 펙틴 200 mg(즉, 사과 펙틴)과 비교하면 로제부리아 호미니스 존재의 증가가 관찰된다.

표 2. 건강한 대상으로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB)로 표시되는 총 세균에 대한 B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 상대 수준의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

유박테리아에 대한 상대 수준 측정시, Previpect^TM 200 mg and Previpect^TM 600 mg에 대하여 로제부리아 호미니스 및 필로그룹 II 존재의 관찰된 통계학적으로 유의한 증가가 유지된다. 유사하게, 유박테리아에 대한 상대 수준 측정시, Previpect^TM 600 mg을 Previpect^TM 200 mg과 비교할 때 로제부리아 호미니스 존재의 관찰된 증가 또한 유지된다.

표 3. 건강한 대상으로부터 대변 샘플 내 유기 단쇄 지방산(SCFA): 부티르산, 헥산산, 이소부티르산, 이소발레르산, 프로피온산, 발레르산 및 아세트산의 농도 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 SCFA의 존재에 있어서 통계학적으로 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM은 대사적으로 풍부한 것으로 발견되었다. 특히, Previpect^TM 200 mg 및 Previpect^TM 600 mg을 음성 대조군과 비교시 부티르산 및 아세트산의 증가가 관찰되었다. 또한, Previpect^TM 600 mg을 펙틴 200 mg(즉, 사과 펙틴)과 비교시 부티르산 및 아세트산 생산에 있어서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다.

부티르산 농도 증가는 대장세포(colonocytes)를 위한 더 나은 환경을 제공하는 것으로 Benus R. et al에 의하여 기재되었다 ("Association between Faecalibacterium prausnitzii and dietary fibre in colonic fermentation in healthy human subjects", British Journal of Nutrition. 2010, 104: 693-70). 마찬가지로, 아세트산 농도 증가 또한, 클로스트리디움 군 XIV과 같은 장내 미생물군에서 발견되는 기타 클로스트리디움 종을 위한 더 높은 영양분 농도를 초래하므로 유익하다. 클로스트리디움 군 XIV는 장내 미생물군 내 총 세균의 상당 부분(10-40%)을 나타내는 것으로 보고되었다. 클로스트리디움은 다른 체류 미생물 군집과 상호작용할 뿐아니라 특이적이고 필수적인 기능을 제공함으로써 장내 항상성에 있어서 결정적 역할을 한다 (Lopetuso et al., "Commensal Clostridia: leading players in the maintenance of gut homeostasis" Gut Pathogen 2013, 5:23).

궤양성 대장염(UC) 환자

표 4. 궤양성 대장염 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB), B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 총 존재의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM 200 mg을 음성 대조군과 비교시, UC 환자에서 결핍되는 것으로 기재되었던 B46, F. 프로스니치, 및 특히 F. 프로스니치 필로그룹 II와 같은 특정 지표를 포함하는 미생물군 존재의 증가가 관찰된다.

표 5. 궤양성 대장염 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB)로 표시되는 총 세균에 대한 B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 상대 수준의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

음성 대조군과 비교한 Previpect^TM 600 mg에 대한 존재 값을 유박테리아 존재에 대하여 표시할 때, 필로그룹 II의 통계학적으로 유의한 증가가 유지된다.

표 6. 궤양성 대장염 환자로부터 대변 샘플 내 유기 단쇄 지방산(SCFA): 부티르산, 헥산산, 이소부티르산, 이소발레르산, 프로피온산, 발레르산 및 아세트산의 농도 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 SCFA의 존재에 있어서 통계학적으로 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM은 대사적으로 풍부한 것으로 발견되었다. 특히, Previpect^TM 200 mg 및 Previpect^TM 600 mg을 음성 대조군과 비교시 부티르산 및 아세트산의 증가가 관찰되었다. 또한, Previpect^TM 600 mg을 펙틴 200 mg과 비교시 아세트산 생산 증가가 관찰되었다.

크론병(CD) 환자

표 7. 크론병 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB), B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 총 존재의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM 200 mg을 음성 대조군과 비교시 로제부리아 및 F. 프로스니치와 같은 특정 종들의 증가가 관찰된다.

표 8. 크론병 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB)로 표시되는 총 세균에 대한 B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS)의 상대 수준의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

존재 수준을 유박테리아 존재에 대하여 표시할 때, 상이한 기질들 간에 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

표 9. 크론병 환자부터 대변 샘플 내 유기 단쇄 지방산(SCFA): 부티르산, 헥산산, 이소부티르산, 이소발레르산, 프로피온산, 발레르산 및 아세트산의 농도 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 SCFA의 존재에 있어서 통계학적으로 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM은 대사적으로 풍부한 것으로 발견되었다. 특히, Previpect^TM 200 mg 및 Previpect^TM 600 mg을 음성 대조군과 비교시 부티르산 및 아세트산의 증가가 관찰되었다.

실시예 3- IBS 환자 및 건강한 대상으로부터 대변 샘플로 Previpect ^TM 의 시험관내 배양

재료 및 방법

1. 환자, 임상 데이터 및 샘플링

대변 샘플을 세 명의 건강한 대상(H) 및 세 명의 과민성대장증후군(IBS) 진단받은 환자들로부터 얻었다. 이들 지원자들은 Hospital Universitari Dr. Josep Trueta (Girona, Spain)의 Gastroenterology Service에 의하여 모집되었다.

IBS 환자로서 모집된 대상들은 IBS에 대한 Rome IV 기준에 따라 진단되었다: 다음 중 두 개 이상과 관련되는 지난 3 개월 동안 평균적으로 일주일에 적어도 1일 재발되는 복통:

1. 배변 관련

2. 배변 빈도 변화와 관련

3. 대변 형태(점조도) 변화와 관련; 및

증상들은 적어도 6 개월 전에 시작되었어야 한다 (Lacy et al., Gastroenterology 2016, 150(6), 1393-1407).

대조군은 알려진 위장관 장애가 없는 건강한 대상들로 구성되었으며, 임상 표준에 따라 모집되었다.

2. 샘플 수집, 보존 및 저장

3. 대변 배양

대변 발효를 상기한 바와 같이 IBD 및 건강한 대상들로부터 얻은 인간 대변 그대로를 이용하여 수행하였다. 실험실에서, 대변 샘플을 스토마커 무균 플라스틱 백으로 옮기고, 5:1의 발효 완충액(0.1M KH₂PO₄, 0.05 mM NaOH; pH 7.0)의 첨가 후, 상기 백을 조심스럽게 쥐어짜 내용물을 혼합하였다. 상기 혼합물 또는 대변 슬러리를 Stomacher 400 (Seward, Worthing, UK) 내에서 230 rpm에서 3 분 동안 교반하였다. 이 현탁액 10 밀리미터를 페놀 캡을 가지는 붕규산염 유리관 내로 옮겼다. 다음 화합물 각각이 미리 첨가되었다:

- 음성 대조군: 10 ml의 발효 완충액;

- Plantago ovate 200: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 Plantago ovate(Cinfa, Spain) 200 mg;

- Pectin 200: 충분한 샘플이 제공될 때, 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 사과 펙틴(Solgar, Madrid, Spain) 200 mg.

각각의 환자로부터 하나의 고유 대변 샘플을 사용하였다. 건강한 대상으로부터의 모든 샘플들은 동일한 사람에 의하여 제공되었다. 그러나, 이 실험에서 보고된 변화로 인하여, 상기 대상은 각각의 실험에서 상이한 대상들로서 간주되었다.

4. DNA 추출

원심분리 전에, NucleoSpin^® Soil Kit (Macherey-Nagel GmbH &Co., Duren, German)를 이용하여, 발효관으로부터 DNA를 추출하였다. 간략히, 250 ㎕의 샘플을 뉴클레오스핀 비드-관 내에 놓았다. DNA 회수를 증진시키기 위하여, 700 ㎕의 SL1 및 150 ㎕의 인핸서(SX)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 그 후, 제조업자로부터의 지시에 따라 DNA를 추출하고 정제하였다. 게놈 DNA를 100 ㎕의 용출 완충액으로 용출하고, 사용시까지 -20℃에서 저장하였다. 추출물의 DNA 농도를 Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit를 이용하여 Qubit 형광측정계 Invitrogen detection Technologies, USA)를 이용하여 결정하였다. qPCR 분석 전에, DNA 농도를 자유 DNA 수로 8 ng/㎕로 조정하였다

5. 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 정량적 실시간 PCR(qPCR)

대변 배양으로부터 DNA를 정량적 실시간 PCR에 의하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 총 페칼리박테리움 프로스니치(Fpra), 페칼리박테리움 프로스니치 필로그룹 I(PhGI), 페칼리박테리움 프로스니치 필로그룹 II (PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco), 로제부리아 호미니스(ROS), B46(서브돌리그라눌럼 바리아빌레), 아케르만시아 뮤시니필라(AKK) 및 유박테리아(EUB)의 양을 평가하였다. Fpra, PGhI, PGhII 및 Eco 세균 서열을 Taqman^TM 프로브 기반 분석에 의하여 정량적 실시간 PCR을 이용하여 정량하였으며, ROS, B46 및 EUB를 SYBR® Green 분석에 의하여 정량하였다. 프라이머 및 qPCR 조건들은 이하 기재하는 바와 같았다:

표 B: qPCR 분석에 사용된 프라이머 및 프로브

6. 통계분석 방법

데이터의 통계적 정규 분포를 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 통하여 분석하였다. 데이터의 통계적 정규 분포가 있는지 없는지에 따라, 다음 군들을 비교하기 위하여 적절한 통계 테스트를 이용하였다. 정규 t-테스트를 이용하여 정규 분포된 군들을 비교하였으며, Mann-Whitney 비-매개변수 테스트를 이용하여 정규 분포가 없는 군들을 비교하였다.

결과

Previpect^TM 첨가에 의하여 야기되는 장내 미생물군에 대한 잠재적 개선을 결정하기 위하여, 다섯 개의 상이한 기질로 배양 후, 환자들의 유박테리아, B46, 로제부리아 호미니스, A. 뮤시니필라, F. 프로스니치, 필로그룹 I 및 필로그룹 II 및 E.coli 존재를 연구하였다. 세균종 정량 결과를 도 14a 내지 21b에 나타낸다. 아케르만시아 뮤시니필라는 뮤신 폴리머를 분해하는 것으로 기재된 뮤코뉴트리브(muconutritive) 세균이다(Derrien et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1469-1476).

건강한(H) 대상, 과민성대장증후군(IBS) 환자의 두 개의 상이한 샘플군에서 4회 처리간의 통계적 비교를 수행하였다. 데이터는 정규 분포를 나타내지 않았으며, 따라서, Mann-Whitney 비-매개변수 테스트를 이용하여 처리를 비교하였다.

통계적 비교 결과

건강한(H) 대상

표 10. 상이한 기질들로 배양된 건강한 대상으로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB), B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS) 및 아케르만시아 뮤시니필라(AKK)의 총 존재의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

음성 대조군(기질없음)을 Previpect^TM 200 mg 및 Plantago ovata 200mg과 비교하면 부티레이트 생성 종인 로제부리아 호미니스 증가가 관찰된다. Previpect^TM 200 mg을 펙틴 200 mg과 비교하면 로제부리아 호미니스 감소가 관찰된다. 또한, 음성 대조군(기질없음)을 Previpect^TM 200 mg, Plantago ovata 200mg 및 펙틴 200 mg(즉, 사과 펙틴)과 비교하면 아케르만시아 뮤시니필라 존재의 감소가 관찰된다.

표 11. 건강한 대상으로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB)로 표시되는 총 세균에 대한 B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco), 로제부리아 호미니스(ROS), 및 아케르만시아 sp.의 상대 수준의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

유박테리아에 대한 상대 수준 측정시, Previpect^TM 200 mg(음성 대조군에 대하여)에 대한 로제부리아 호미니스 존재의 관찰된 통계학적으로 유의한 증가, 및 펙틴 200 mg에 대한 R. 호미니스 존재의 유의한 감소가 유지된다. 유사하게, 유박테리아에 대한 상대 수준 측정시, 음성 대조군을 Previpect^TM 200 mg, Plantago ovate 200 mg 및 펙틴 200 mg과 비교할 때 아케르만시아 뮤시니필라 존재의 관찰된 증가 또한 유지된다. 또한, 유박테리아에 대한 상대 수준 측정시, 음성 대조군을 Previpect^TM 200 mg과 비교할 때 E.coli가 감소된다.

과민성 대장증후군(IBS) 환자

표 12. 과민성 대장증후군 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB), B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco) 및 로제부리아 호미니스(ROS) 및 아케르만시아 sp.의 총 존재의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 통계학적으로 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

Previpect^TM 200 mg, Plantago ovata 200mg 및 펙틴 200 mg을 음성 대조군과 비교하면 B46, F. 프로스니치, 및 R. 호미니스와 같은 부티레이트 생산자를 포함하는 미생물군 존재의 증가가 관찰된다. Previpect^TM 200 mg을 Plantago ovata 200 mg과 비교하면 A. 뮤시니필라 감소가 관찰된다.

표 13. 과민성 대장증후군 환자로부터 대변 샘플 내 유박테리아(EUB)로 표시되는 총 세균에 대한 B46, F.프로스니치(Fpra), 필로그룹 I(PhGI), 필로그룹 II(PhGII), 에스케리치아 콜라이(Eco), 로제부리아 호미니스(ROS), 및 아케르만시아 sp.의 상대 수준의 비교. 표 안의 수치는 p-값을 나타내고, <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 대변 샘플이 첫번째 기질(첫번째 좌측 컬럼)과 비교하여 두번째 기질(두번째 좌측 컬럼)로 배양될 때 각각의 종의 존재에 있어서 유의한 증가가 "회색"으로 강조된 반면, 통계적으로 유의한 감소는 굵게 표시되었다.

음성 대조군과 비교한 어떠한 처리에 대해서도, 존재 값을 유박테리아 존재에 대하여 표시할 때, 관찰된 통계학적으로 유의한 증가가 유지되지 않는다. 유박 테리아에 대한 상대 수준 측정시, Plantago ovata 200 mg 및 펙틴 200 mg을 음성 대조군과 비교할 때 A. 뮤시니필라 존재 감소가 관찰된다. Previpect^TM 200 mg을 음성 대조군과 비교할 때 A. 뮤시니필라 존재의 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되지 않는다. 또한, Previpect^TM 200 mg을 Plantago ovata 200 mg에 비교할 때 A. 뮤시니필라의 감소가 관찰된다.

실시예 4 - 대변 샘플과 Previpect ^TM 의 시험관 내 배양 - 상이한 분석 대상의 세균 불균형 지수

재료 및 방법

두가지 상이한 실험을 수행하여 건강한 대상 및 장 질환 환자의 결장 내 존재하는 미생물군에 대한 Previpect^TM의 영향을 조사하였다. 사용된 재료 및 방법은 두 실험에 대하여 동일하였다. 분석된 대상들의 초기 세균 불균형, 및 샘플 배양 후 상이한 기질의 영향을 관찰하기 위하여, 세 개의 상이한 지수를 계산하였다.

환자, 임상 데이터 및 샘플링

대변 샘플을 16 명의 건강한 대상(H) 및 14 명의 장질환 진단받은 환자로부터 얻었다. 11 명의 환자는 염증성 장질환(IBD): 다섯 명은 크론병(CD) 및 여섯 명은 궤양성 대장염으로 진단되었고; 세 명의 환자들은 과민성 대장증후군(IBS)으로 진단되었다. 이들 지원자들은 Hospital Universitari Dr. Josep Trueta (Girona, Spain)의 Gastroenterology Service에 의하여 모집하였다.

IBD 환자로서 모집된 대상들은 표준 임상, 병리 및 내시경적 기준에 따라 진단되었으며, 모두 염증 반응 측면에서(칼프로텍틴 수준 250 ㎍/G 이상 또는 단백질 C 반응성 (PCR) 수분 0.5 ㎍/C 이상) 활동성 질환 상태였다. 대조군은 알려진 위장환 장애가 없는 건강한 대상들로 구성되었으며, 임상 표준에 따라 모집되었다.

IBS 환자로 모집된 대상들은 IBS에 대한 Rome IV 기준에 따라 진단되었다: “다음 중 두 개 이상과 관련되는, 지난 3 개월 동안 평균적으로 일주일에 적어도 1일 재발하는 복통:

1. 배변 관련

2. 배변 주기 변화와 관련

3. 배변 형태(점조도) 변화와 관련.

증상들은 적어도 6 개월 전에 시작한 것이어야 한다”

대조군은 알려진 위장 장애가 없는 건강한 환자들로 구성되었으며, 임상 표준에 따라 모집되었다.

지수 계산

세 개의 지수를 계산하였다:

- 페칼리박테리움 프로스니치 / 에스케리치아 콜라이 비 (FE 지수): 이 값이 낮을수록, 대상의 세균 불균형 정도가 높다.

- 부티레이트 생성 세균 / 염증전 세균 비 (BP 지수): 부티레이트 생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, 페칼리박테리움 프로스니치 PHGI, 페칼리박테리움 프로스니치 PHGII, 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레의 총 존재의 합으로 계산되고, 염증전 세균은 에스케리치아 콜라이의 총 존재이다. 이 값이 낮을수록, 대상의 세균 불균형 정도가 높다.

- 부티레이트 / 부티레이트 생성 세균 비 (BB 지수): 부티레이트 생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, 페칼리박테리움 프로스니치 PHGI, 페칼리박테리움 프로스니치 PHGII, 로제부리아 호미니스 및 서브돌리그라눌럼 바리아빌레의 총 존재의 합으로 계산되고, 부티레이트는 발효관 내 수득되는 부티레이트의 농도이다. 이 값이 낮을수록, 부티레이트 생성 세균 활성이 더 낮다.

세 개의 지수들은 높은 값을 가지는 것이 바람직하다.

샘플 수집, 보존 및 저장에 대한 프로토콜: 대변 배양, DNA 추출, 단쇄 지방산(SCFAs) 분석, 및 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다.

결과

실험 4.1: 건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자로부터 대변 샘플과 Previpect ^TM 의 시험관내 배양

궤양성 대장염 및 크론병 환자들로부터 대변 샘플 내 Previpect^TM를 비교하는데에 사용된 화합물들은 다음과 같았다:

- 초기 샘플: 배양 처리없는 샘플의 초기 상태;

- 음성 대조군: 10 ml의 발효 완충액;

- Pectin 200: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 사과 펙틴(Solgar, Madrid, Spain) 200 mg;

- Previpect^TM + Pectin 200: 10 ml의 발효 완충액 내 모두 희석된 사과 펙틴 200 mg 및 Previpect^TM 200 mg.

표 14. FE 지수의 계산. 이 값은 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대하여 배양 후 계산되었다. 건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자에 대한 평균값을 보인다.

FE 지수가 건강한 대상 및 궤양성 대장염에서 임의의 기질의 배양 중 증가하는 것으로 관찰되며, 이는 세균 불균형 정도가 교정됨을 의미한다. 그러나, 크론병 환자에서, FE 지수는 모든 기질로 배양후 감소하였다. 사용된 기질들 간의 유의한 차이를 관찰하기 위하여 Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 건강한 대상에서, FE 지수 분석시(p=0.035) 유의한 차이가 발견되었으나, 궤양성 대장염 또는 크론병 환자에서 관찰된 차이는 유의하지 않았다(p=0.110 및 p=0.597).

표 15. Mann-Whitney 시험에 의하여 분석된 각각의 처리에 대하여 지수 FE를 하나씩 비교하여 얻어진 통계적 결과. 0.05 미만의 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

음성 대조군과 비교하여 대변 샘플 배양을 위하여 펙틴 및 Previpect와 펙틴의 조합을 사용할 때, 건강한 대상에 대하여 유의한 차이가 발견되었다. 또한, 궤양성 대장염 환자에 대해서도 유의한 차이가 발견되었다. 펙틴 배양은 음성 대조군 및 Previpect^TM200과 비교하여 더 나은 결과를 나타냈다. Previpect^TM으로 배양된 샘플을 나머지와 비교할 때 크론병 환자에 대하여 유의한 차이가 발견되지 않았다.

표 16. 부티레이트 생성 세균 vs. 염증전 세균 비의 계산. 이 값은 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대하여 배양후 계산되었다. 건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자에 대한 평균값을 나타낸다.

건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자에서 임의의 기질의 배양중 BP 지수가 증가한 것으로 관찰될 수 있다. 건강한 대상에서, Previpect는 최고값을 나타내는, 세균 불균형 정도를 교정하는 능력을 더 많이 가지는 기질이었다. 궤양성 대장염에 대하여, Previpect 및 펙틴은 세균 불균형 정도의 교정에 대한 유사한 능력을 나타냈다. 그러나, 크론병 환자에서, Previpect 배양에 의하여 얻어진 BP 지수는 가장 낮았다. 사용된 기질들 간의 유의한 차이를 관찰하기 위하여, Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 건강한 대상에서, BP 지수를 분석할 때 유의한 차이가 발견되었으나(p = 0.006), 궤양성 대장염 또는 크론병 환자에서 관찰된 차이는 유의하지 않았다((각각 p=0.277 및 p=0.837.

표 17. Mann-Whitney 시험에 의하여 분석된 각각의 처리에 대한 지수 BP를 하나씩 비교하여 얻어진 통계적 결과. 0.05 보다 낮은 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

음성 대조군과 비교하여, 대변 샘플을 Previpect, 펙틴과 조합된 Previpect 및 펙틴과 배양하였을 때 건강한 대상에 대하여 유의한 차이가 발견되었다. 또한, Previpect는 Previpect 및 펙틴 조합 배양과 비교하여 더 나은 결과를 나타내는 것으로 관찰되었다. Previpect^TM으로 배양된 샘플을 나머지와 비교하였을 때 크론병 환자에 대하여 유의한 차이가 발견되지 않았다.

표 18. 부티레이트 vs 부티레이트 생성 세균 비의 계산. 이 값을 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대하여 배양 후 계산하였다. 건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자에 대한 평균값을 나타낸다.

건강한 대상, 궤양성 대장염(펙틴 제외) 및 크론병 환자 내에서 임의의 기질의 배양 중 BB 지수가 증가한 것으로 볼 수 있으며, 이는 샘플 내 부티레이트 생성 세균의 생산성이 기질에 의하여 증진되었음은 의미한다. 모든 대상(건강한 대상, 궤양성 대장염 및 크론병 환자)에서, BB 지수 최고값이 Previpect 배양후 발견되었다. 사용된 기질들 간의 유의한 차이를 관찰하기 위하여 Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 궤양성 대장염 환자에서, BB 지수를 분석할 때 유의한 차이가 발견되었으나(p=0.023), 건강한 대상 또는 크론병 환자에서 관찰된 차이는 유의하지 않았다(각각 p= 0.253 및 p=0.630).

표 19. Mann-Whitney 시험으로 분석된 각각의 처리에 대하여 BB 지수를 하나씩 비교하여 얻어진 통계적 결과. 0.05 보다 낮은 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

Previpect를 대변 샘플 내 배양하고 음성 대조군과 비교시 건강한 대상에서 유의한 차이가 발견되었다. 또한, 대변 샘플을 Previpect로 배양하고 펙틴 및 음성 대조군과 비교시 궤양성 대장염 환자에서도 유의한 차이가 발견되었다. Previpect 배양으로 더 높은 결과가 얻어졌다.

결론: Previpect는 건강한 대상 및 궤양성 대장염 환자의 세균 불균형 정도(지수 BP)를 감소시킬 수 있다. 또한, Previpect는 결장 내에서 부티레이트 생산을 증진시키는 BB 지수를 증가시키는 더 큰 능력을 가지는 분석된 기질이다.

실험 4.2: 건강한 대상 및 과민성 대장증후군 환자로부터 대변 샘플과 Previpect ^TM 의 시험관내 배양

과민성 대장증후군 환자로부터의 대변 샘플 내 Previpect^TM을 비교하는데 사용된 화합물들은 다음과 같았다:

- 음성 대조군: 10 ml의 발효 완충액;

- Plantago ovata 200: 10 ml의 발효 완충액 내 희석된 Plantago ovata (Cinfa, Spain) 200 mg;

표 20. 페칼리박테리움 프로스니치 vs 에스케리치아 콜라이 지수의 계산. 이 값을 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대하여 배양후 계산하였다. 건강한 대상 및 과민성 대장증후군 환자에 대한 평균값을 나타낸다.

건강한 대상에서 임의의 기질의 배양 동안 FE 지수가 증가하였으며, Previpect 배양후 최고값을 나타낸 것으로 관찰된다. 과민성 대장증후군 환자에서, Plantago ovata 배양에 대해서만 FE 지수값만이 더 높았다. 사용된 기질들 간의 유의한 차이를 관찰하기 위하여 Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 그러나, 건강한 대상에 대해서도 과민성 대장증후군 환자에 대해서도 FE 지수 분석시 유의한차이는 발견되지 않았으며(각각 p=0.492 및 p=0.282), 건강한 대상 또는 크론병 환자에서 관찰된 차이는 유의하지 않았다(p>0.05).

표 21. Mann-Whitney 시험에 의하여 분석된 각각의 처리에 대하여 지수 EF를 하나씩 비교하여 얻어진 통계 결과. 0.05 보다 낮은 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

대변 샘플을 Previpect로 배양하고 Pectin과 비교할 때 과민성 대장증후군 환자에 대하여 유의한 차이가 발견되었다. Pectin 배양으로 더 높은 결과가 얻어졌다.

표 22. 부티레이트 생성 세균 vs 염증전 세균 비의 계산. 이 값은 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대한 배양후 계산되었다. 건강한 대상 및 과민성 대장증후군 환자에 대한 평균값을 나타낸다.

건강한 대상에서 임의의 기질 및 과민성 대장증후군 환자에서 거의 모든 기질 배양 동안 BP 지수가 증가한 것으로 관찰된다. 모든 처리중, 건강한 대상에서 Previpect 처리가 최고 BP 지수값을 나타냈다. 그러나, 과민성 대장증후군 환자에서, Previpect는 가장 낮은 BP 지수값을 나타냈다. 사용된 기질들 간에 유의한 차이를 관찰하기 위하여 Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 건강한 대상에 대해서도 과민성 대장증후군 환자에 대해서도 BP 지수 분석시 유의한 차이가 발견되지않았다(각각 p=0.587 및 p=0.576).

표 23. Mann-Whitney 시험으로 분석된 각각의 처리에 대하여 지수 BP를 하나씩 비교하여 얻어진 통계 결과. 0.05 보다 낮은 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

대변 샘플을 Previpect로 배양할 때 건강한 대상에 대해서도 과민성 대장증후군 환자에 대해서도 유의한 차이가 발견되지 않았다.

표 24. 부티레이트 vs 부티레이트 생성 세균 비의 계산. 이 값은 각각의 대상에 대하여 각각의 기질에 대한 배양후 계산되었다. 건강한 대상 및 과민성 대장증후군 환자에 대한 평균값을 나타낸다.

건강한 대상에 대하여 Previpect 및 Plantago ovata 배양 동안 BB 지수가 증가한 것으로 관찰되며, 이는 샘플 내 부티레이트 생성 세균의 생산성이 증진됨을 의미한다. 또한, 펙틴은 부티레이트 생산성을 증가시키는 능력을 가지지 않은 것으로 보였다. 과민성 대장증후군 환자에 대하여, Plantago ovata는 부티레이트 생산을 증가시키는 능력을 가지는 유일한 기질이었다. 사용된 기질들 간에 유의한 차이를 관찰하기 위하여 Kruskall-Wallis 통계 시험을 행하였다. 건강한 대상에서 유의한 차이가 발견되었으나(p=0.002), 과민성 대장증후군 환자에 대하여 BB 지수를 분석할 때 유의한 차이는 발견되지 않았다(p=0.120).

표 25. Mann-Whitney 시험에 의하여 분석된 각각의 처리에 대하여 지수 BB를 하나씩 비교하여 얻어진 통계 결과. 0.05 보다 낮은 p-값은 첫번째 컬럼에 기재된 처리들 간에 통계학적으로 유의한 결과를 나타냈다.

대변 샘플을 Previpect로 배양하고 Plantago ovata와 비교시 건강한 대상에 대하여 유의한 차이가 발견되었다. 그러나, Plantago ovata 배양으로 더 높은 결과가 얻어졌다.

결론: 펙틴뿐아니라 Previpect 또한 건강한 대상에서 부티레이트 생성 세균 및 그 생산성을 선택적으로 증가시킬 수 있다. 과민성 대장증후군 환자에서, 생산성에 관해서는 Previpect가 Pectin과 유사한 효과를 나타냈으나, 이는 지수의 현저한 변화를 나타내지 않았다.

SEQUENCE LISTING <110> GOODGUT S.L. <120> GRAPE SKIN FOR USE IN THE TREATMENT OF DYSBIOSIS <130> 903 228 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fpra428F; Faecalibacterium prausnitzii forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <400> 1 tgtaaactcc tgttgttgag gaagataa 28 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fpra583R; Faecalibacterium prausnitzii reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <400> 2 gcgctccctt tacaccca 18 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fpra493PR; Faecalibacterium prausnitzii probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <400> 3 caaggaagtg acggctaact acgtgccag 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fpra(PHG)136F; Faecalibacterium prausnitzii PHG Forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <400> 4 ctcaaagagg gggacaacag tt 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fpra(PHG)232R; Faecalibacterium prausnitzii PHG reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 5 gccatctcaa agcggattg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHG1180PR; Faecalibacterium prausnitzii PhGI probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <400> 6 taagcccacg acccggcatc g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHG2180PR; Faecalibacterium prausnitzii PhGII probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 7 taagcccacr gctcggcatc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eco395F; Escherichia coli forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 8 catgccgcgt gtatgaagaa 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eco490R; Escherichia coli reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <400> 9 cgggtaacgt caatgagcaa a 21 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eco437PR; Escherichia coli probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <400> 10 tattaacttt actcccttcc tccccgctga a 31 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VROS2F; Roseburia hominis forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 11 tactgcattg gaaactgtcg 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VROS2R; Roseburia hominis reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <400> 12 cggcaccgaa gagcaat 17 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B46F; Subdoligranulum variabile (B46) forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 13 tccacgtaag tcacaagcg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B46R; Subdoligranulum variabile (B46) reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 14 cgcctacctg tgcactactc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EubF; Eubacteria forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <400> 15 actcctacgg gaggcagcag t 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EubR; Eubacteria reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <400> 16 gtattaccgc ggctgctggc ac 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VAKK_F; A. muciniphila forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 17 cagcacgtga aggtggggac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VAKK_R; A. muciniphila reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 18 ccttgcggtt ggcttcagat 20

Claims

대상에서 장내 세균 불균형을 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하는 방법에 사용하기 위한 분리된 포도 껍질로서, 상기 장내 세균 불균형은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 그 활성 감소를 특징으로 하고, 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii), F. 프로스니치 필로그룹(prausnitzii phylogroup) I (PHGI), 및 F. 프로스니치 필로그룹(prausnitzii phylogroup) II (PHGII)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항에 있어서,
상기 방법은 장내 세균 불균형의 예방학적 치료 방법인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 대상은 장 질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 대상은 궤양성 대장염, 크론병 또는 과민성 대장증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
대상에서 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 대장증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장 질환을 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하는 방법에 사용하기 위한 분리된 포도 껍질로서, 상기 대상은 부티레이트-생성 세균의 감소된 수준 및/또는 그 활성 감소를 특징으로 하는 장내 세균 불균형을 가지고, 상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), 및 F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제5항에 있어서,
상기 방법은 예방학적 방법이고, 상기 대상은 장 질환의 징후 및/또는 증상을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제5항에 있어서,
상기 장 질환은 궤양성 대장염 또는 크론병인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제5항에 있어서,
상기 장 질환은 과민성 대장증후군인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
부티레이트-생성 세균 감소는 다음 단계를 포함하는 방법에 의하여 결정되고,
a. 상기 대상의 장 샘플, 바람직하게 대변 샘플 내 부티레이트-생성 세균의 수준을 결정하는 단계; 및
b. 상기 대상 샘플 내 부티레이트-생성 세균 수준을 표준 샘플 내 수준과 비교하는 단계 - 바람직하게 상기 표준 샘플은 장 질환을 가지지 않은 대상 또는 대상들의 군의 샘플임;
상기 대상 샘플 내 수준이 상기 표준 샘플 내 수준 아래일 때 부티레이트-생성 세균의 감소가 있고;
바람직하게, 부티레이트-생성 세균 수준은 정량적 PCR에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제10항에 있어서,
상기 부티레이트-생성 세균은 페칼리박테리움 프로스니치, F. 프로스니치 필로그룹 I (PHGI), 및 F. 프로스니치 필로그룹 II (PHGII)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 부티레이트-생성 세균 각각의 수준은 다음 중 하나 이상의 사용을 포함하는 방법에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질:
- F. 프로스니치 수준 결정을 위한, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드, 및 ;
- PHGI 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5와, 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 서열번호 6으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드;
- PHGII 수준 결정을 위한, 임의로, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5와, 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 서열번호 7로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 85% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포도 껍질은 포도종 비티스 비니훼라(Vitis vinifera), 바람직하게 백포도 품종으로부터인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포도 껍질은 20% 이하의 수분 함량을 가지는 탈수된 포도 껍질인 것을 특징으로 하는 분리된 포도 껍질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 정의된 분리된 포도 껍질을 포함하는 조성물.
제14항에 있어서,
상기 조성물은 프리바이오틱, 단일 프로바이오틱 종 및 프로바이오틱 종들의 군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 조성물은 경구 또는 직장 투여용으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 지연 분비 경구 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.