KR20200006995A - 조직 가공 및 바이오프린팅 시 사용하기 위한 겔을 형성할 수 있는 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 겔을 형성할 수 있는 펩타이드 및 조직 가공 및 바이오프린팅에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 겔, 이러한 겔의 제조 방법 및 이러한 겔의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 이러한 겔은 하이드로겔이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 겔을 포함하는 상처 드레싱 또는 상처 치유제 및 본 발명에 따른 겔에 의해 형성된 펩타이드 스캐폴드를 포함하는 외과용 임플란트 또는 스텐트에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약제학적 및/또는 화장용 조성물, 생체의학 장치 또는 전자 장치에 관한 것이다.

Description

조직 가공 및 바이오프린팅 시 사용하기 위한 겔을 형성할 수 있는 펩타이드
본 발명은 겔을 형성할 수 있는 펩타이드 및 예컨대, 조직 가공 및 바이오프린팅(bioprinting) 시 이의 용도(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 겔, 이러한 겔을 제조하는 방법 및 이러한 겔의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 이러한 겔은 하이드로겔이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 겔을 포함하는 상처 드레싱 또는 상처 치유제 및 본 발명에 따른 겔에 의해 형성된 펩타이드 스캐폴드(peptide scaffold)를 포함하는 외과용 임플란트(surgical implant) 또는 스텐트(stent)에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드(들)을 포함하는 약제학적 및/또는 화장 조성물, 생물의학 장치 또는 전자 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 함유하는 제1 용기(first container), 및 수성 또는 유기 용액을 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 겔을 사용한 조직 재생 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드(들) 및/또는 겔(들)을 사용하는 프린팅 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 겔 및/또는 펩타이드(들)의 사용을 포함하는 상처의 치료 및/또는 상처 치유 방법에 관한 것이다.
배경
3D 프린팅 기술을 적용시켜 예컨대, 의약 및 조직 가공의 분야에서 조직-유사 구조를 구축할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 3D 바이오프린팅으로 지칭된다. 전형적으로, 프린팅 잉크는 합성, 예컨대, 중합체, 또는 천연인 것을 사용한다. 또한 식물로부터의 물질, 예를 들면, 알기네이트를 사용할 수 있다. 특히, 천연 물질을 사용하여 바이오-프린트된 3D 구조의 재현성 및 지속능에 있어 영향을 갖는 유의적인 뱃치-대-뱃치 변화(batch-to-batch variation)가 존재할 수 있다.
3D 바이오프린팅에서, 일반적으로 예비-중합체 점성 용액을 사용하여 3D에서 프린트할 수 있으며, 프린팅 후, 개시인자 또는 (UV 또는 가시)광을 3D 구조물의 중합에 사용한다. 대안적으로, 중합체 또는 다른 거대분자 구조는 자가-조립에 의해 형성될 수 있다. 바이오프틴팅에 사용된 용액(들)은 또한 "바이오잉크"로서 지칭된다. 수개의 인자가 바이오잉크가 3D 바이오프링팅에 적합하도록 하기게 중요하다. 이는 취급 용이성, 생체적합성, 생체모방 구조(biomimetic structure), 생체분해능, 다공성 및 기계적 강도를 포함한다. 바이오잉크는 용이하게 제조되고 공간 및 시간적으로 목적한 지점에서 거대분자 구조를 형성할 필요가 있다. 따라서, 프린팅 및 조직 가공 방법에서 사용될 수 있는 유용한 바이오잉크에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.
겔은 많은 생체의학 적용, 예를 들면, 고약(salve), 연고, 상처 드레싱 등을 위해 사용된다. 많은 예에서, 이들은 천연적으로 유래된 화합물, 예를 들면, 젤라틴 또는 알기네이트 또는 카라기난에 의해 형성되므로, 품질 및 조성에 있어서 천연적으로 고유한 변화에 속한다. 따라서, 겔을 형성할 수 있는 신규한 물질에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 적합한 바이오잉크를 제조하기 위한 수단을 제공하기 위한 것이다. 또한 본 발명의 목적은 조직 가공에 사용되기에 적합한 수단을 제공하기 위한 것이다. 또한 본 발명의 목적은 합성하기 용이하고 천연의 변화에 적용되지 않는 겔을 형성할 수 있는 물질을 제공하기 위한 것이다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 자가-조립에 의해 겔을 형성할 수 있는 펩타이드에 관한 것이며, 상기 펩타이드는 다음으로부터 선택된 화학식을 갖는다:
a) Zo-XnBXmW-Z'p, 및
b) Zo-WXmBXn-Z'p,
여기서 Z는 N-말단 보호 그룹이고 Z'는 C-말단 보호 그룹이고, o 및 p는 0 및 1로부터 독립적으로 선택되며;
여기서 X는, 각각 존재시 독립적으로, 이소루이신, 노르루이신, 루이신, 발린, 알라닌, 글리신, 호모알릴글리신 및 호모프로파르길글리신으로부터 선택된 지방족 아미노산이고, n 및 m은 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택되며, 단 m+n은 ≤2이며,
여기서 B는 페닐알라닌 및 트립토판으로부터 선택된 방향족 아미노산이거나, 상기 방향족 아미노산의 지방족 대응부이며, 상기 지방족 대응부는 사이클로헥실알라닌, 4-하이드록시-사이클로헥실알라닌, 3,4-디하이드록시사이클로헥실알라닌으로부터 선택되고,
여기서 W는 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 5-N-에틸-글루타민(테아닌), 시트룰린, 티오-시트룰린, 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌, 에티오닌, 셀레노메티오닌, 텔루로메티오닌, 트레오닌, 알로트레오닌, 세린, 호모세린, 타이로신, 히스티딘, 아르기닌, 호모아르기닌, 오르니틴, 라이신, N(6)-카복시메틸라이신, 히스티딘, 2,4-디아미노부티르산(Dab), 2,3-디아미노프로피온산(Dap), 및 N(6)-카복시메틸라이신으로부터 선택된 극성 아미노산이며,
여기서 상기 극성 아미노산은 바람직하게는 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 오르니틴(Orn), 2,4-디아미노부티르산(Dab), 및 2,3-디아미노프로피온산(Dap)으로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택된다.
일 구현예에서, o 및 p는 각각 1이다.
일 구현예에서, Z는 화학식 -C(O)-R을 가지며, 여기서 R은 H, 비치환되거나 치환된 알킬, 및 비치환되거나 치환된 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
여기서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 및 이소부틸로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택되며,
여기서 Z'는 -NR1R2이고, R1 및 R2는 H 및 C1-C10 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 따라서 상기 -NR1R2는 상기 펩타이드의 C-말단에서 아미드 그룹을 형성하며,
여기서 바람직하게는 Z은 아세틸 그룹이고, 여기서 바람직하게는 Z'는 NH2이다.
일 구현예에서, 상기 펩타이드내 상기 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산이다.
일 구현예에서, 각각의 친수성 아미노산은 하이드록실, 에테르, 카복실, 이미도, 아미도, 에스테르, 아미노, 구아니딘, 티오, 티오에테르, 셀레노 및 텔루로 그룹으로부터 독립적으로 선택된 극성 그룹을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 겔은 하이드로겔 또는 오가노겔이다.
일 구현예에서, 펩타이드는
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(Orn)IVF (서열 번호: 127)
(Orn)IVO (서열 번호: 128)로부터 선택되며,
여기서 I는 이소루이신이고, L은 루이신이며, V는 발린이고, F는 페닐알라닌이며, K는 라이신이고, D는 아스파르트산이며, O는 사이클로헥실알라닌이고, (Dab)는 2,4-디아미노부티르산이고, (Dap)는 2,3-디아미노프로피온산이며, (Orn)은 오르니틴이고;
여기서 각각의 서열은 N-말단에서 보호되거나 보호되지 않을 수 있고, 바람직하게는 아세틸화되거나 비-아세틸화되며, C-말단에서 아미드화되거나 비-아미드화될 수 있으며, 여기서, 바람직하게는, 상기 서열은
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여기서 Ac는 아세틸이고 N-말단을 아세틸화하며, NH2은 아민이므로, C-말단을 아미드화하고, -COOH는 보호되지 않은 C-말단이다.
일 구현예에서, 상기 N-말단 보호 그룹 Z는 펩티도미메틱(peptidomimetic) 분자, 예를 들면, 천연 및 합성 아미노산 유도체이며, 여기서 상기 펩티도미메틱 분자의 N-말단은 카복실산, 아미드, 알코올, 알데하이드, 아민, 이민, 니트릴, 우레아 유사체, 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트, 말레이미드, 비닐 설폰, 아지드, 알킨, 알켄, 알킨, 알켄, 탄수화물, 이미드, 퍼옥사이드, 에스테르, 아릴, 케톤, 설파이트, 니트라이트, 포스포네이트, 및 실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용 그룹으로 변형될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 C-말단 그룹 Z'는 소 분자, 작용 그룹 및 링커의 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 C-말단 그룹 Z'는
- 작용 그룹, 예를 들면, 극성 또는 비-극성 그룹, 예를 들면(이에 한정되지 않는)
-COOH, -COOR, -COR, -CONHR 또는 -CONRR'(여기서 R 및 R'는 H, 비치환되거나 치환된 알킬, 및 비치환되거나 치환된 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된다),
-NH2, -OH, -SH, -CHO, 말레이미드, 이미도에스테르, 카보디이미드 에스테르, 이소시아네이트;
- 소 분자,
예를 들면(이에 한정되지 않는) 당, 알코올, 하이드록시산, 아미노산, 비타민, 바이오틴;
- 극성 작용 그룹에서 종결시키는 링커,
예를 들면(이에 한정되지 않는) 에틸렌디아민, PEG, 카보디이미드 에스테르, 이미도에스테르;
- 소 분자 또는 비타민에 커플링된 링커,
예를 들면, 바이오틴, 당, 하이드록시산으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 C-말단 그룹 Z'는 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 화학적 접합 또는 커플링에 사용되기에 적합하다:
생활성 분자 또는 모이어티,
예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 지질, 세포 수용체 리간드, 호르몬, 전구약물, 약물, 비타민, 항원, 항체, 항체 단편, 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 제한없이, DNA, 전령 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭(small interfering) RNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산, 압타머(aptamer)), 사카라이드;
표지(들), 염료(들),
예를 들면, 형광성 또는 방사활성 표지(들), 영상 대조제(image contrast agent);
병원체,
예를 들면, 바이러스, 세균 및 기생충;
마이크로- 및 나노입자
또는 이의 조합물;
여기서 상기 화학적 접합은 펩타이드의 자가-조립 전 또는 후에 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 펩타이드의 C-말단은 예를 들면, 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 화학적 접합 또는 커플링에 의해 기능화된다:
생체활성 분자 또는 모이어티,
예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 지질, 세포 수용체 리간드, 호르몬, 전구약물, 약물, 비타민, 항원, 항체, 항체 단편, 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 제한없이, DNA, 전령 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산, 압타머), 사카라이드;
표지(들), 염료(들),
예를 들면, 형광성 또는 방사활성 표지(들), 영상 대조제;
병원체,
예를 들면, 바이러스, 세균 및 기생충;
마이크로- 및 나노입자
또는 이의 조합물;
여기서 상기 화학적 접합은 펩타이드 및/또는 펩티도미메틱의 자가-조립 전 또는 후에 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 C-말단 그룹 Z'는 펩티도미메틱 분자, 예를 들면, 천연 및 합성 아미노산 유도체이고, 여기서 상기 펩티도미메틱 분자의 C-말단은 카복실산, 아미드, 알코올, 알데하이드, 아민, 이민, 니트릴, 우레아 유사체, 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트, 말레이미드, 비닐 설폰, 아지드, 알킨, 알켄, 탄수화물, 이미드, 퍼옥사이드, 에스테르, 아릴, 케톤, 설파이트, 니트라이트, 포스포네이트, 및 실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용 그룹으로 변형될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 수용액 속에서 생리학적 조건 속에서 주위 온도에서 1일 내지 적어도 6개월의 범위의 기간 동안, 바람직하게는 적어도 8개월 까지, 보다 바람직하게는 적어도 12개월 동안 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 90℃까지의 온도에서 적어도 1시간 동안 생리학적 조건에서 수용액 속에서 안정하다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은, 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 하이드로겔 또는 오가노겔에 관한 것이다.
일 구현예에서, 하이드로겔은 주위 온도에서 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 2 내지 4개월, 보다 바람직하게는 적어도 6 내지 12개월 동안 수용액 속에서 안정하다.
일 구현예에서, 하이드로겔은 2 내지 5보다 큰 저장 모듈러스(storage modulus) G' 대 손실 모듈러스(loss modulus) G'' 비에 의해 특징화된다.
일 구현예에서, 하이드로겔 또는 오가노겔은 0.1 Hz 내지 100 Hz의 범위의 주파수에서 500Pa 내지 200,000 Pa의 저장 모듈러스 G'에 의해 특징화된다.
일 구현예에서, 하이드로겔 또는 오가노겔은 콜라겐 또는 이의 가수분해된 형태(젤라틴)보다 더 높은 기계적 강도를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔은 상기 정의된 바와 같은, 본 발명에 따른 펩타이드의 섬유를 포함하며, 상기 섬유는 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드(peptoid), 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 마이크로- 또는 나노입자, 작은 유기 분자 또는 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나를 엔트랩핑할(entrapping) 수 있는 네트워크를 정의한다.
일 구현예에서, 하이드로겔은 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드, 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 소 유기 분자, 마이크로- 또는 나노입자, 또는 섬유의 네트워크에 의해 엔트랩핑된(entrapped) 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나를 포함한다.
일 구현예에서, 섬유는 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드, 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 작은 유기 분자, 마이크로- 또는 나노입자, 또는 섬유의 네트워크에 의해 트래핑된 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나와 커플링된다.
일 구현예에서, 하이드로겔 또는 오가노겔은 연료 전지, 태양 전지, 전자 전지, 바이오센싱 장치, 의학 장치, 임플란트, 약제학적 조성물 및 화장 조성물 중 적어도 하나에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔은 주사가능하다.
추가의 양태에서, 본 발명은 다음 중 적어도 하나 속에서 상기 정의한 바와 같은, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 하이드로겔 또는 오가노겔의 용도에 관한 것이다:
의학 도구 키트,
연료 전지,
태양 전지,
전자 전지,
재생 의약 및 조직 재생,
이식가능한 스캐폴드
질환 모델,
상처 치유,
2D 및 3D 합성 세포 배양 기질,
줄기 세포 치료요법,
주사가능한 치료요법,
바이오센서 개발,
고-처리량 스크리닝(high-throughput screening),
생체기능화된 표면,
프린팅
생체제작, 예를 들면, 바이오-프린팅, 및
유전자 치료요법.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 하이드로겔 또는 오가노겔을 제조하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 펩타이드를 수용액 또는 유기 용액 각각에 용해시킴을 포함한다.
일 구현예에서, 수용액 또는 유기 용액 속의 용해된 펩타이드는 온도에 추가로 노출시키며, 여기서 온도는 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 70℃의 범위이다.
일 구현예에서, 펩타이드는 0.01 μg/ml 내지 100 mg/ml의 농도에서, 바람직하게는 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도에서, 보다 바람직하게는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도에서 용해된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 세포 또는 조직 이식체 또는 장치에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 상처 드레싱 또는 상처 치유제에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 수술용 임플란트, 또는 스텐트(stent)에 관한 것이며, 이러한 수술용 임플란트 또는 스텐트는 펩타이드 스캐폴드를 포함하고, 여기서 펩타이드 스캐폴드는 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔에 의해 형성된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 생체의학 장치 및/또는 전자 장치 및/또는 용액에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 생체의학 장치, 및/또는 전자 장치 및/또는 용액은 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 용액은 국소 겔 또는 크림, 스프레이, 분말, 또는 시트(sheet), 패치(patch) 또는 막의 형태로 제공되거나,
여기서 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 용액은 주사가능한 용액의 형태로 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 용액은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 부품의 키트(kit of parts)에 관한 것이며, 이러한 키트는 본 발명에 따른 펩타이드를 지닌 제1 용기 및 수용액 또는 유기 용액을 지닌 제2 용기를 포함한다.
일 구현예에서, 제2 용기의 수용액 또는 유기 용액은 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함하고/하거나
여기서 펩타이드를 지닌 제1 용기는 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 조직 재생의 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 정의한 바와 같은 하이드로겔을 제공하는 단계,
(b) 재생된 조직을 형성하기 위해 세포에 상기 하이드로겔 또는 오가노겔을 노출시키는 단계,
(c) 상기 세포가 상기 하이드로겔 또는 오가노겔 위에서 성장하도록 하는 단계.
일 구현예에서, 방법은 생체내에서 수행되며, 여기서 단계 a)에서, 상기 하이드로겔은 조직 재생이 의도된 체내 부위에 제공되며,
여기서 상기 단계 a)는 바람직하게는 조직 재생이 의도되는 신체내 부위에 상기 하이드로겔을 주사함으로써 수행된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 상처의 치료 및 상처 치유 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
유효량의 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 상처에 적용하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 시험관내 및/또는 생체내 용도를 위한, 바람직하게는 경구 적용을 위한, 주사를 위한 및/또는 국소 적용을 위한 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 생체영상화 장치에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 2D 또는 3D 세포 배양 기질에 관한 것이다.
본 발명은 놀랍게도 용액, 특히 수용액 속에서 초겔화제(supergelator)의 형성을 가능하도록 하는 선형 펩타이드의 최소의 서열을 발명하였으며, 따라서 펩타이드는 생물학적 및 생체의학적 적용에 특히 유용하다. 이는 합리적으로 설계되고 시험된 2 내지 4개의 아미노산의 아미노산 조성을 지닌 초단(ultrashort) 펩타이드이다. 이러한 초단 펩타이드는 이들이 합성하기 매우 쉽고 경제적이라는 추가의 장점을 갖는다.
본 발명자들은 특정의 양친매성 펩타이드 서열이 실제 슈퍼겔화 특성(supergelating property)을 나타냄으로써 용매, 예컨대, 물 또는 다른 수용액, 예를 들면, 99 중량% 이상의 생리학적 완충액을 엔트랩핑화함으로써 저 분자량 겔(LMWG)을 형성함을 발견하였다. 흥미롭게도, 이러한 양친매성 펩타이드는 하이드로겔 형태의 3차원(3D) 섬유상 네트워크(fibrous network)로 자가-조립하는 고유 경향을 갖는다. 이러한 겔은 또한 겔의 섬유 네트워크의 단일 섬유의 직경이 나노미터 직경을 가지므로, 나노겔로 명명될 수 있다. 이러한 펩타이드 화합물은 비-공유결합성 상호작용에 의해 자가-구동되어 연질 고체 물질을 형성한다. 일반적으로 천연 아미노산으로 구성된, 관련된 펩타이드의 특성을 기반으로 하여, 이러한 연질 물질은 생물의학적 적용, 특히 조직 가공을 위해 용이하게 사용될 수 있다.
자가-조립 공정의 특성은 서열 정보에만 의존하므로, 본 발명자들은 지방족 및 방향족 아미노산과 적어도 하나의 방향족 아미노산의 혼합물을 포함하는 양친매성 펩타이드가, 비-극성 방향족 잔기가 비-방향족 역 잔기(counter residue)에 의해 교환되는 경우, 즉, 페닐알라닌이 사이클로헥실알라닌으로 교환되는 경우, 보다 강력한 자가-조립 경향을 나타냄을 관찰하였다. 임의의 이론 또는 메카니즘에 얽매일 필요없이, 본 발명자들은 소수성 방향족 잔기가 비-방향족 잔기에 대해 증진된 자가-조립 공정에 의해 교환되는 펩타이드에 대한 이러한 증진된 겔화 특성의 이러한 영향을 설명한다. 다시, 임의의 메카니즘 또는 이론에 얽매이려는 의도없이, 조립 메카니즘은 랜덤 구조로부터 나선형 중간체까지 출발하여, 베타-시이트에 이어서 베터-턴(beta-turn) 또는 교차-베타 말단 구조(cross-beta end structure)의 상이한 구조 전이 단계를 포함하는 단계식 공정으로 발생하는 것으로 보인다. 이러한 이행에서, 보다 강직성인 방향족 구조는 굴곡성을 거의 제공하지 않으므로 스캐폴드 형성 동안 제2 구조의 요구되는 변화를 방해한다.
본 발명자들은 섬유 및 조립된 네트워크의 표면형태(topography)가 세포외 매트릭스(ECM)와 매우 유사함을 나타낼 수 있었다. 양친매성 펩타이드 구조의 일부인 극성 아미노산 모이어티의 특성에 의존하여, 나노겔이 반응계내에서 형성될 수 있다. 겔의 반응계내 형성은 치료학적 관련 분자, 예를 들면, 치료제, 세포, 나노입자, 소 분자, 핵산, 및 기타의 것의 비경구 적용을 허용한다. 아미노산 측쇄의 특성에 따라서, 부위-특이적인 생체기능화를 펩타이드 구조내로 도입할 수 있으나, 이는 초분자 구조의 겔화 및 형성이 가능하지 않은 전제하에서 이루어져야만 한다.
따라서, 작용 그룹, 예를 들면, 글리칸, 즉, 글리코실화되는 경우, 알데하이드 또는 케토 그룹, 포스포릴화, 황화(sulfuration), 나노입자-작용화, 친화성 앵커(affinity anchor), 예를 들면, 다른 것들 외에 스트렙타비딘에 대한 바이오틴-작용화, 생물활성 서열, 예를 들면, RGD 부착성-촉진 모티프(motif), 가교-결합 모티프 등의 첨가.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 본원에서 또한 때때로 "잉크" 또는 "바이오잉크"로 지칭되는 수성 또는 다른 용매 조성물을 제형화하는데 특히 유용하며, 이는 프린팅 구조, 특히 3-차원("3D") 구조에 사용될 수 있다. 이러한 프린트된 구조는 본 발명에 따른 펩타이드의 겔화 특성을 사용하도록 하며 자체적으로 다른 실체, 예를 들면, 세포, 화합물, 입자, 특히 나노입자 등에 대한 스캐폴드로서 작용할 수 있다.
본 발명의 구현예의 기술적 특징을 보다 명확하게 추가로 설명하기 위하여, 다양한 구현예를 설명하기 위해 제공된 첨부되는 도면을 다음에서 간략하게 도입한다. 이들은 본 발명의 단순한 예시적인 구현예이며 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 구현예에서의 변형은 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않고 가능하다.
도 1a는 초단 펩타이드 IVZK 및 IVFK가 거대분자 나노섬유성 하이드로겔로 자가-조립함을 나타낸다.
도 1b는 초단 펩타이드 IVZK 및 IVFK 및 상응하는 하이드로겔 뿐만 아니라 고 해상도 투과 전자 현미경(TEM) 영상의 화학 구조도 나타낸다.
IVFK 펩타이드의 평균 섬유 직경은 13개의 TEM 영상으로부터 수집된 데이타를 사용하여 분포 곡선을 플롯팅함으로써 계산하였다. 평균 직경은 10.3 nm(좌측 하부 패널)이다.
IVZK TEM은 3개의 상이한 유형의 평균 직경(4.0 nm, 8.6 nm 및 15.5 nm)(우측 하부 패널)을 나타낸다. 평균 직경을 계산하는데 사용된 영상의 수는 10이었다. 8.6nm의 섬유 직경은 다른 섬유 직경과 비교하여 가장 풍부한 것이었다. 단일 단량체 섬유는 평균 직경이 4.0 nm이다.
도 2는 상이한 배율을 나타내는 FESEM에 의한 자가-조립하는 펩타이드 IVFK 및 IVZK 하이드로겔의 형태학적 특성을 나타낸다.
도 3은 높은 기계적 강도가 펩타이드 하이드로겔에 대해 입증되었음을 나타낸다. 25℃에서 0.1% 변형률(strain) 하에서의 각 주파수(angular frequency)의 함수로서 상이한 하이드로겔(20 mg/mL)의 저장 모듈러스(G'), 주파수 스위프(Frequency sweep)는 0.1% 변형률에서 수행하였다.
도 4는 펩타이드 하이드로겔에서 3D 세포 배양에 사용된 HeLa 세포, HEK 293T 세포, 및 사람 피부 섬유아세포의 세포 형태를 나타낸다.
도 5는 IVFK 펩타이드를 사용한 HeLa의 MTT 생체적합성 검정의 그래프적 표시를 나타낸다.
도 6은 IVFK 펩타이드로 처리된 HeLa 세포의 생/사멸 염색(Live/Dead staining)을 나타낸다.
도 7은 IVZK 펩타이드를 사용한 HeLa의 MTT 생체적합성 검정(bioavailability assay)의 그래프적 표시를 나타낸다.
도 8은 IVZK 펩타이드를 사용하여 처리된 HeLa 세포의 생/사멸 영상을 나타낸다.
도 9는 IVFK 펩타이드를 사용한 HEK 293 T의 MTT 생체적합성 검정의 그래프적 표시를 나타낸다.
도 10은 바이오프린트된 작제물의 3D 세포 생존능 검정을 나타낸다. IVFK 펩타이드로 처리한 HEK 293 T 세포의 생/사멸 염색.
도 11은 바이오프린트된 작제물의 3D 세포 생존능 검정을 나타낸다. IVFK 펩타이드로 처리된 HEK 293 T 세포의 생/사멸 염색.
도 12는 IVZK 펩타이드를 사용한 HEK 293 T의 MTT 생체적합성 검정의 그래프적 표시를 나타낸다.
도 13은 바이오프린트된 작제물의 3D 세포 생존능 검정을 나타낸다. IVZK 펩타이드를 사용하여 처리된 HEK 293 T 세포의 생/사멸 염색.
도 14는 바이오프린트된 작제물의 3D 세포 생존능 검정을 나타낸다. IVZK 펩타이드로 처리된 HEK 293 T 세포의 생/사멸 염색.
도 15는 1주 동안 사람 근원세포와 함께 배양한 펩타이드 하이드로겔을 나타낸다.
도 16은 바이오잉크로서 IVZK 펩타이드 용액을 사용한 사람 피부 섬유아세포의 3D 바이오프린팅을 나타낸다(사람 피부 섬유아세포 - 4 백만/ml; 펩타이드 - 10 mg/ml).
도 17은 사람 피부 섬유아세포 포매된 IVZK 펩타이드 하이드로겔(사람 피부 섬유아세포 - 4 백만/ml; 펩타이드 - 10 mg/ml)의 형광성 영상을 나타낸다. 팔로이딘을 사용하여 녹색으로 염색된 액틴 세포골격, DAPI를 사용하여 청색으로 염색된 핵.
도 18은 3D 사람 피부 섬유아세포 포매된 IVZK 펩타이드 하이드로겔(사람 피부 섬유아세포 - 4 백만/ml; 펩타이드 - 10 mg/ml)의 형광성 영상을 나타낸다. 팔로이딘을 사용하여 녹색으로 염색된 액틴 세포골격, DAPI를 사용하여 청색으로 염색된 핵.
도 19는 세포 배양의 상이한 날에 IVZK 바이오잉크를 사용하여 3D 바이오프린트된 사람 골수-유래된 간엽 줄기 세포(BM-MSC) 세포의 형광성 공초점 현미경 영상을 나타낸다(핵은 청색으로 나타나며, F-액틴은 적색으로 나타나고 빈쿨린은 녹색으로 나타난다).
또한, 본 발명의 구현예는 이제 설명하기 위해 제공되나, 본 발명을 제한하지 않는 다음의 실시예를 참고로 이제 추가로 기술된다.
실시예
펩타이드 합성
펩타이드를 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 수동으로 합성하고 HPLC를 통해 95% 이상으로 정제하였다. 아미노산 및 펩타이드 함량 분석을 수행하였다. 펩타이드 분자는 MBHA 링크 아미드 수지 상에서 표준 고체 펩타이드 합성을 사용하여 수동으로 합성하였다. DCM를 사용하여 수지를 반응 용기 내부에서 30분 동안 팽윤시켰다. 이후에, 용매는 진공을 용기에 적용함으로써 제거하였다. 수지 상의 Fmoc-보호된 그룹은 수지를 10 mL의 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액을 20분 동안 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 DCM을 후속적으로 사용하여 각각의 반응 후 수지를 세정함으로써 용기로부터 과도한 물질을 제거하였다. 이후에, 각각 1 당량 mol의 수지에 대해 3 당량의 N-보호된 아미노산, 2.9 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIPEA를 함유하는 아미노산 잔사 용액을 붓고 적어도 2시간 동안 교반하였다. 카이저 시험(Kaiser Test)을 각각의 커플링 후 수행하여 펩타이드 커플링의 성공을 실험하였다. N-말단 펩타이드 서열의 Fmoc 보호된 그룹을 10 mL의 20%(v/v) 피페리딘/DMF를 가하고 20분 동안 교반함으로써 제거하였다. 아미노산 커플링, 세척, 카이저 시험, 및 Fmoc 절단인 이러한 순차적인 단계를 아미노산의 마지막 서열까지 반복하였다. 아세틸화는 아세트산 무수물, DIPEA, 및 DMF의 혼합된 용액을 용기에 부어서 펩타이드 서열을 캡핑(capping)함으로써 수행하였다. 이후에 펩타이드 서열을 95% TFA, 2.5% 물, 및 2.5% 트리이소프로필실란을 함유한 산성 용액과 2시간 동안 혼합함으로써 수지로부터 절단시켰다. 이후에, 수지를 DCM으로만 세정하고 환저 플라스크 내로 수집하였다. 수집된 펩타이드 용액으로부터 과량의 TFA 및 DCM의 제거를 회전 증발을 사용하여 수행하였다. 디에틸 에테르를 플라스크에 가하여 펩타이드를 분산시키고 밤새 유지시켰다. 이후에, 이러한 용액을 원심분리하여 디에틸 에테르로부터 고체 형의 펩타이드를 분리하였다. 수집된 백색 고체를 물 속에 후속적으로 용해하고 동결-건조시켜 펩타이드의 플러피 형태(fluffy form)를 수득하였다. 최종적으로, 펩타이드를 사용 전에 예비-HPLC를 사용하여 정제하였다.
9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호된 아미노산, 링크 아미드 MBHA 수지, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU) 및 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 GL Biochem으로부터 구입하였다. N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 디에틸 에테르, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 피페리딘, 및 트리이소프로필실란을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 아세트산 무수물, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토니트릴을 Fisher Scientific으로부터 구입하였다. 트리플루오로아세트산(TFA)은 Acros로부터 구입하였다. 화학물질은 임의의 정제없이 수령된 상태로 사용하였다.
펩타이드 하이드로겔 제조
동결건조된 펩타이드를 milliQ 물 속에 용해하고 와동시켜 균질한 용액을 수득하였다. 후속적으로, 10X 포스페이트 완충된 염수를 1X의 최종 농도에서 펩타이드 용액에 가하고 짧게 와동시켰다. 겔화는 수초 내지 수분 또는 수기간 내에 펩타이드 서열에 의존하여 발생하였다.
유동학 분석
펩타이드 하이드로겔의 기계적 강도를 22℃에서 8 mm 평행 플레이트 기하학적 구조를 갖는 ARES-G2 유량계(TA 장치)를 사용하여 측정하였다. 150 μL의 하이드로겔을 9.6 mm 직경의 폴리프로필렌 환 내부에서 제조하였으며, 여기서 각각의 환 캐스트(ring cast)의 상단 및 하단은 파라필름(parafilm)으로 덮고 밀봉된 조직 배양 디쉬 내부를 밤새 유지시켰다. 유량계의 필티어 플레이트(peltier plate) 상에 하이드로겔을 로딩(loading)한 후, 물을 주변 영역에 점적시켜 하이드로겔의 증발을 억제하였다. 갭 측정을 1.6 내지 1.9 mm로 조절하였다. 시간 스위프 측정(Time sweep measurement)을 주파수 스위프(frequency sweep) 및 진폭 스위프(amplitude sweep) 전에 900초 동안 각각 0.1% 및 1 rad/s의 고정 변형률 및 각 주파수를 사용하여 수행하였다. 시간 스위프 분석의 말기에 모듈러스 값을 각각의 하이드로겔에 대한 표준 평형 모듈러스로서 사용하였다. 진동 주파수-스위프 분석(oscillatory frequency-sweep analysis)을 0.1 내지 100 rad/s의 범위에 대해 1% 변형률을 사용하여 수행하였다. 진동-주파수-스위프 측정을 0.1 내지 100% 변형률의 1 rad/s의 고정 각 주파수를 사용하여 수행하였다.
투과 전자 현미경분석(TEM) 연구
TEM 연구를 2개의 상이한 장치 상에서 수행하였다; 120 kV의 가속화되는 전압을 사용한 Tecnai G2 Spirit Twin 및 300kV 방사 건(emission gun)을 사용한 FEI Titan G2 80-300 CT. 냉(Cryo) TEM 영상 분석을 300 kV에서 작동하는 FEI's Titan Krios를 사용함으로써 저 용량 방식으로 수행하였다. 펩타이드 나노섬유에 대한 TEM 샘플을 수중 희석된 펩타이드 하이드로겔로부터 제조하였다. 이어서 당해 용액 1 방울을 사용 전에 글로 방전 플라즈마(glow discharge plasma)로 처리한 탄소 코팅된 탄소 격자 상에 도입하였다. 이후에 점적을 10분 동안 유지시킨 후 필터 페이퍼를 사용하여 블롯팅(blotting)하였다. 보다 우수한 대비를 수득하기 위해, 격자를 1분 동안 2% 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색한 후 영상화 전 적어도 1일 동안 건조시켰다. IVFK 및 IVZK 펩타이드 나노섬유의 직경을 각각 13 및 10 TEM 영상으로부터 영상-분석 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 측정하였다. 각각의 펩타이드 나노섬유에 대한 크기 분포 막대그래프를 Origin에서 생성시켜 펩타이드 둘 다의 평균 직경을 계산하였다. 예컨대, 도 1b를 참고한다.
FESEM 분석
펩타이드 하이드로겔을 액체 질소 속에서 급속 동결시키고 -80℃에서 밤새 즉시 저장하였다. 이후에, 샘플을 동결 건조기(Labconco, USA) 속에서 2 내지 3일 동안 진공 건조시켰다. 후속적으로, 동결건조된 하이드로겔 샘플을 전도성 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 샘플 홀더(holder) 상에 고정시키고 스퍼터 코팅기(sputter coater) 속에서 백금으로 스퍼터링(sputtering)하였다. 3개의 둥근 코팅을 상이한 각에서 수행하여 완전한 코팅을 보증하였다. 목적한 표면을 이후에 필드-방사 주사 전자 현미경(field-emission scanning electron microscope)(FEI Nova Nano630 SEM, 미국 오레곤주)으로 5 내지 10 kV의 가속화된 전압을 사용하여 실험하거나 FEI Quanta 200 FEG SEM을 사용하여 2 내지 3 kV의 가속화된 전압으로 가시화하였다. 동결-건조된 샘플을 3 nm의 백금으로 코팅된 SEM 스텁(stub) 및 스퍼터(sputter) 상에서 탄소 전도성 테이프에 부착시켰다.
세포 배양
세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 106(Thermo Fisher Scientific, USA) 속에서 배양하였다. 세포를 T175 또는 T75 세포 배양 플라스크(Corning, USA) 속에서 37℃에서 95% 공기 및 5% CO2를 사용하여 습윤화된 항온처리기 속에서 유지시켰다. 세포를 대략 80% 합치율(confluence)에서 트립신처리에 의해 아배양(subculturing)하였다. 배양 배지를 48시간마다 보충하였다.
MTT 검정
생체적합성 연구를 96-웰 플레이트(Corning, USA)에서 수행하였다. HDFn 세포(10,000개의 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고 200 μL의 완전 성장 배지 속에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후, 웰 속의 배지를 교환하였다. 펩타이드를 칭량하고 milliQ 물에 용해하였다. 상용성(compatibility)을 시험하기 위하여, 5 mg/mL, 4 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL 및 0.5 mg/mL와 같은 상이한 농도에서 펩타이드를 웰에 가하였다. 처리되지 않은 웰(well)을 양성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 24시간 동안 항온처리하였다. 세포 생존능은 비색 미세배양 검정(Vybrant MTT 세포 증식 검정 키트, Thermo Fisher Scientific, USA)의 수단으로 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 요약하면, 플레이트를 취하고, 배지를 조심스럽게 제거하고 10% MTT 시약을 함유하는 신선한 혈청 유리 배지를 가하였다. 37℃에서 2시간 항온처리한 후, 상층액 배지를 제거하고 200 μL의 DMSO를 각각의 웰에 가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 최종적으로, 개개 웰의 흡수는 플레이트 판독기(PHERAstar FS, Germany)를 사용하여 540 nm에서 판독하였다.
생/사멸 염색
세포를 씨딩하고 상술한 프로토콜에 따라 펩타이드로 처리하였다. 24시간 항온처리한 후, 소비한 배지를 제거하고 대략 2 mM 칼세인 AM 및 4 mM 에티디움 단독이량체-1(LIVE/DEAD 생존능/세포독성 키트, Life TechnologiesTM)을 함유하는 DPBS 용액으로 대체시키고 암실 속에서 40분 동안 항온처리하였다. 영상화 전, 염색 용액을 제거하고 신선한 DPBS를 가하였다. 염색된 세포를 역 공초점 현미경(Zeiss LSM 710 Inverted Confocal Microscope, 독일) 하에서 영상화하였다.
세포(25,000개의 세포/플레이트)를 유리계 공초점 디쉬 속에서 하이드로겔을 사용하여 3D 배양물 속에 포매(embedding)시키고 24시간 동안 대조군으로서 처리되지 않은 세포를 사용하여 항온처리하였다. 24시간 후, 배지를 대략 2 μM 칼세인 및 4 μM 에티디움 단독이량체-1(LIVE/DEAD 생존능/세포독성 키트, Molecular Probe, L3224)을 함유하는 PBS(1X) 용액으로 대체하고 30분 동안 항온처리하였다. 생 세포를 녹색 채널내에서 및 사멸한 세포를 적색 채널내에서 ZEISS 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다. 수득된 사진을 도 8에 나타낸 바와 같이 ImageJ를 사용하여 겹쳐놓았다.
세포골격 염색
면역염색을 배양 24시간 후 수행하였다. 요약하면, 세포를 3.7% 파라포름알데하이드 용액으로 30분 동안 고정시키고 냉 세포골격 완충액(PBS 용액 중 3 mM MgCl2, 300 mM 슈크로즈 및 0.5% 트리톤 X-100)을 10분 동안 항온처리하여 세포 막을 투과시켰다. 투과된 세포를 차단 완충액 용액(PBS 중 5% FBS, 0.1% 트윈-20, 및 0.02% 나트륨 아지드) 속에서 30분 동안 37℃에서 항온처리한 후, 항빈쿨린(1:100) 속에서 1시간 동안 37℃에서 및 후속적으로 항-마우스 IgG(전체 분자)-FITC 및 로다민-팔로이딘(1:200)과 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 또한, 세포를 DAPI 속에서 1시간 동안 37℃에서 항온처리하여 핵을 역염색하였다. 이러한 형광성 염료 처리된 세포를 관찰하고 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Zeiss LSM 710 역 공초점 현미경, 독일)을 사용하여 영상화하였다.
펩타이드 하이드로겔 중 세포의 3D 배양
세포를 24 웰 조직 배양 플레이트 속에서 펩타이드 하이드로겔 속에서 캡슐화하였다. 펩타이드 용액을 플레이트에 웰당 200 μL에서 가하였다. 3X PBS 속에 재현탁된 세포를 각각의 웰에 100,000개의 세포/웰에서 가하고 온화하게 혼합하였다. 펩타이드 하이드로겔의 최종 농도는 세포를 함유하는 3X PBS 첨가 후 1X이었다. 겔화는 3 내지 5분내에 발생하였으며, 후속적으로, 배양 배지를 웰에 가하였다. 예비-측정된 시점에서, 3D 세포 생존능 검정, 생/사멸 검정 및 세포골격 염색을 수행하였다.
3D 세포 배양을 플레이트의 바닥에서 염기를 제조함으로써 수행하여 세포가 3D 구조물(construct) 내에서 성장시키고, 염기는 펩타이드 용액(물을 지닌 펩타이드)을 총촛점 플레이트내로 피펫팅함으로써 제조하고 (PBS)와 혼합하였다. 겔 형성 후, 펩타이드 용액을 이러한 염기의 상단에 가하였다. 배양된 사람 피부 섬유아세포를 트립신처리하고, 원심분리하고, PBS(2X)를 사용하여 재현탁시키고 염기의 상단 위에 둔 펩타이드 용액과 혼합하였다. 일단 겔이 형성되면, DMEM을 도 5에 나타낸 바와 같이 상단에 가하고 37℃ 항온처리기 및 5% CO2에서 48 시간 동안 항온처리한 후 상이한 생체적합성 검정을 이러한 작제물에 적용하였다.
3D 세포 증식 검정
CellTiter-Glo 발광성 3D 세포 생존능 검정은 ATP 존재의 정량화를 기반으로 하여 3D 하이드로겔 속의 생존가능한 세포(viable cell)의 수를 측정하였으며, ATP 존재는 대사적으로 활성인 세포의 존재를 나타낸다. 각각의 시점에서, 세포와 함께 배양한 하이드로겔을 DPBS로 2회 세척하였다. 신선한 배지를 각각의 웰에 가하고 동량의 CellTiter-Glo 발광성 시약을 또한 겔에 가하였다. 내용물을 2분 동안 혼합하여 하이드로겔을 소화시킨 후 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 발광성을 플레이트 판독기(PHERAstar FS, 독일)를 사용하여 기록하였다.
3D 바이오프린팅
3D 바이오프린터를 이용하여 펩타이드 바이오잉크를 사용하여 작제물을 프린트하였다. 펩타이드 바이오잉크를 프린트하기 위해, 본 발명자들은 3개의 입구가 있는 공-축 침(co-axial nee이ㄷ)을 설계하였다. 상단 입구를 10X PBS 용액에 연결시키고, 우측 입구를 혈청 유리된 배지 속에 현탁시킨 세포에 연결시키고 좌측 입구를 milliQ 물에 용해된 펩타이드(15 mg/mL)에 연결시켰다. 튜브, 연결기 및 공-축 노즐을 프린팅 전에 오토클레이빙(autoclaving)하였다. 프린팅 동안, 3개의 용액을 노즐 내로 주사기 펌프의 도움으로 펌핑하였다. 펩타이드 용액 및 세포 용액의 유동 속도는 25 μL/min이었으나 10X PBS의 유동 속도는 20 μL/min에서 유지시켰다. 펩타이드 용액을 배출 직전에 공-축 노즐 내부 연결부에서 세포 및 10X PBS와 혼합하였다. 겔화는 순간적으로 일어나며 펩타이드 바이오잉크가 프린트되었다. 샘플 환 구조를 약 8 mm의 직경 및 약 2 mm의 두께를 사용하여 층별 양식(layer-by-layer fashion)으로 바이오프린트하였다. 작제물을 35-mm 조직 배양 페트리 디쉬 위에 프린트하였다. 바이오프린팅 후, 작제물을 생체안전성 캐비넷(biosafety cabinet) 속에 3분 동안 두어 펩타이드 바이오잉크의 자가-조립을 추가로 촉진하였다. 이후에, 작제물을 배양 배지를 사용하여 2 또는 3배 온화하게 세척하였다. 각각의 디쉬에, 3mL의 배양 배지를 가하고 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 예정된 시점에서, 작제물을 취하여 상술한 바와 같은 세포의 3D 검정 및 세포골격 염색을 수행하였다.
본 발명에 따른 펩타이드는 탁월한 겔화제이며, 형성된 겔은 많은 상이한 목적 및 적용을 위해 사용할 수 있다. 앞서의 설명, 청구범위 또는 동반된 도면에 개시된 특징은 별도로 및 이의 임의의 조합으로, 본 발명을 이의 다양항 형태로 실현하기 위한 물질일 수 있다.
바람직한 구현예의 추가의 변형은 청구범위에 의해 단지 정의된 본 발명의 영역에 벗어남이 없이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> King Abdullah University of Science and Technology <120> A peptide capable of forming a gel for use in tissue engineering and bioprinting <130> K31631WO <150> US 62/504,976 <151> 2017-05-11 <160> 128 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 1 Ile Val Phe Lys 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa is O = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Ile Val Xaa Lys 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 3 Ile Phe Val Lys 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa is O = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can 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<223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 58 Ile Val Xaa Xaa 1 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 59 Ile Phe Val Xaa 1 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 60 Ile Xaa Val Xaa 1 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 61 Phe Ile Val Xaa 1 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 62 Xaa Ile Val Xaa 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 63 Phe Val Ile Xaa 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein C-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 64 Xaa Val Ile Xaa 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 65 Lys Phe Val Ile 1 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Lys Xaa Val Ile 1 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 67 Lys Val Phe Ile 1 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 68 Lys Val Xaa Ile 1 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 69 Lys Val Ile Phe 1 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 70 Lys Val Ile Xaa 1 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 71 Lys Ile Val Phe 1 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 72 Lys Ile Val Xaa 1 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 73 Asp Phe Val Ile 1 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 74 Asp Xaa Val Ile 1 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 75 Asp Val Phe Ile 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 76 Asp Val Xaa Ile 1 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 77 Asp Val Ile Phe 1 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 78 Asp Val Ile Xaa 1 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 79 Asp Ile Val Phe 1 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 80 Asp Ile Val Xaa 1 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 81 Glu Phe Val Ile 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 82 Glu Xaa Val Ile 1 <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 83 Glu Val Phe Ile 1 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 84 Glu Val Xaa Ile 1 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 85 Glu Val Ile Phe 1 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 86 Glu Val Ile Xaa 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 87 Glu Ile Val Phe 1 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 88 Glu Ile Val Xaa 1 <210> 89 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 89 Ser Phe Val Ile 1 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 90 Ser Xaa Val Ile 1 <210> 91 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 91 Ser Val Phe Ile 1 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 92 Ser Val Xaa Ile 1 <210> 93 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 93 Ser Val Ile Phe 1 <210> 94 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 94 Ser Val Ile Xaa 1 <210> 95 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 95 Ser Ile Val Phe 1 <210> 96 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 96 Ser Ile Val Xaa 1 <210> 97 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 97 Arg Phe Val Ile 1 <210> 98 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 98 Arg Xaa Val Ile 1 <210> 99 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 99 Arg Val Phe Ile 1 <210> 100 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 100 Arg Val Xaa Ile 1 <210> 101 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 101 Arg Val Ile Phe 1 <210> 102 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 102 Arg Val Ile Xaa 1 <210> 103 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly <400> 103 Arg Ile Val Phe 1 <210> 104 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 104 Arg Ile Val Xaa 1 <210> 105 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 105 Xaa Phe Val Ile 1 <210> 106 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 106 Xaa Xaa Val Ile 1 <210> 107 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 107 Xaa Val Phe Ile 1 <210> 108 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 108 Xaa Val Xaa Ile 1 <210> 109 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 109 Xaa Val Ile Phe 1 <210> 110 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 110 Xaa Val Ile Xaa 1 <210> 111 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 111 Xaa Ile Val Phe 1 <210> 112 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dbu and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 112 Xaa Ile Val Xaa 1 <210> 113 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 113 Xaa Phe Val Ile 1 <210> 114 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 114 Xaa Xaa Val Ile 1 <210> 115 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 115 Xaa Val Phe Ile 1 <210> 116 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 116 Xaa Val Xaa Ile 1 <210> 117 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 117 Xaa Val Ile Phe 1 <210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 118 Xaa Val Ile Xaa 1 <210> 119 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 119 Xaa Ile Val Phe 1 <210> 120 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Dpr and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 120 Xaa Ile Val Xaa 1 <210> 121 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 121 Xaa Phe Val Ile 1 <210> 122 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 122 Xaa Xaa Val Ile 1 <210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 123 Xaa Val Phe Ile 1 <210> 124 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 124 Xaa Val Xaa Ile 1 <210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 125 Xaa Val Ile Phe 1 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 126 Xaa Val Ile Xaa 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 127 Xaa Ile Val Phe 1 <210> 128 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of forming a gel by self-assembly, wherein N-terminal X or Xaa = Orn and the other X or Xaa = cyclohexylalanine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 128 Xaa Ile Val Xaa 1

Claims (43)

  1. 자가-조립에 의해 겔을 형성할 수 있는 펩타이드로서, 상기 펩타이드가 다음으로부터 선택된 화학식을 갖는 펩타이드:
    a) Zo-XnBXmW-Z'p, 및
    b) Zo-WXmBXn-Z'p,
    여기서 Z는 N-말단 보호 그룹이고 Z'는 C-말단 보호 그룹이고, o 및 p는 0 및 1로부터 독립적으로 선택되며;
    여기서 X는, 각각 존재시 독립적으로, 이소루이신, 노르루이신, 루이신, 발린, 알라닌, 글리신, 호모알릴글리신 및 호모프로파르길글리신으로부터 선택된 지방족 아미노산이고, n 및 m은 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택되는 정수이며, 단 m+n은 ≤2이며,
    여기서 B는 페닐알라닌 및 트립토판으로부터 선택된 방향족 아미노산이거나, 상기 방향족 아미노산의 지방족 대응부이며, 상기 지방족 대응부는 사이클로헥실알라닌, 4-하이드록시-사이클로헥실알라닌, 3,4-디하이드록시사이클로헥실알라닌으로부터 선택되고,
    여기서 W는 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 5-N-에틸-글루타민(테아닌), 시트룰린, 티오-시트룰린, 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌, 에티오닌, 셀레노메티오닌, 텔루로메티오닌, 트레오닌, 알로트레오닌, 세린, 호모세린, 타이로신, 히스티딘, 아르기닌, 호모아르기닌, 오르니틴, 라이신, N(6)-카복시메틸라이신, 히스티딘, 2,4-디아미노부티르산(Dab), 2,3-디아미노프로피온산(Dap), 및 N(6)-카복시메틸라이신으로부터 선택된 극성 아미노산이며,
    여기서 상기 극성 아미노산은 바람직하게는 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 오르니틴(Orn), 2,4-디아미노부티르산(Dab), 및 2,3-디아미노프로피온산(Dap)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, o 및 p가 각각 1인 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Z가 화학식 -C(O)-R을 가지며, 여기서 R은 H, 비치환되거나 치환된 알킬, 및 비치환되거나 치환된 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    여기서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 및 이소부틸로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택되며,
    여기서 Z'는 -NR1R2이고, R1 및 R2는 H 및 C1-C10 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 따라서 상기 -NR1R2는 상기 펩타이드의 C-말단에서 아미드 그룹을 형성하며,
    여기서 바람직하게는 Z은 아세틸 그룹이고, 여기서 바람직하게는 Z'는 NH2이인 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드내 상기 아미노산이 L-아미노산 또는 D-아미노산인 펩타이드.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 친수성 아미노산이 하이드록실, 에테르, 카복실, 이미도, 아미도, 에스테르, 아미노, 구아니딘, 티오, 티오에테르, 셀레노 및 텔루로 그룹으로부터 독립적으로 선택된 극성 그룹을 갖는 펩타이드.
  6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겔이 하이드로겔 또는 오가노겔인 펩타이드.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 다음으로부터 선택된 서열로 이루어진 펩타이드:
    IVFK (서열 번호: 1)
    IVOK (서열 번호: 2)
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    (Orn)VIO (서열 번호: 126)
    (Orn)IVF (서열 번호: 127)
    (Orn)IVO (서열 번호: 128)로부터 선택된 서열로 이루어지며,
    여기서 I는 이소루이신이고, L은 루이신이며, V는 발린이고, F는 페닐알라닌이며, K는 라이신이고, D는 아스파르트산이며, O는 사이클로헥실알라닌이고, (Dab)는 2,4-디아미노부티르산이고, (Dap)는 2,3-디아미노프로피온산이며, (Orn)은 오르니틴이고;
    여기서 각각의 서열은 N-말단에서 보호되거나 보호되지 않을 수 있고, 바람직하게는 아세틸화되거나 비-아세틸화되며, C-말단에서 아미드화되거나 비-아미드화될 수 있으며, 여기서, 바람직하게는, 상기 서열은
    Ac-IVFK-NH2 (서열 번호: 1)
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    여기서 Ac는 아세틸이고 N-말단을 아세틸화하며, NH2는 아민이므로, C-말단을 아미드화하고, -COOH는 보호되지 않은 C-말단이다.
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 보호 그룹 Z가 펩티도미메틱(peptidomimetic) 분자, 예를 들면, 천연 및 합성 아미노산 유도체이며, 여기서 상기 펩티도미메틱 분자의 N-말단은 카복실산, 아미드, 알코올, 알데하이드, 아민, 이민, 니트릴, 우레아 유사체, 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트, 말레이미드, 비닐 설폰, 아지드, 알킨, 알켄, 알킨, 알켄, 탄수화물, 이미드, 퍼옥사이드, 에스테르, 아릴, 케톤, 설파이트, 니트라이트, 포스포네이트, 및 실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용 그룹으로 변형될 수 있는 펩타이드.
  9. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 그룹 Z'가 소 분자, 작용 그룹 및 링커의 그룹으로부터 선택되는 펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 C-말단 그룹 Z'가
    - 작용 그룹, 예를 들면, 극성 또는 비-극성 그룹, 예를 들면(이에 한정되지 않는)
    -COOH, -COOR, -COR, -CONHR 또는 -CONRR'(여기서 R 및 R'는 H, 비치환되거나 치환된 알킬, 및 비치환되거나 치환된 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된다),
    -NH2, -OH, -SH, -CHO, 말레이미드, 이미도에스테르, 카보디이미드 에스테르, 이소시아네이트;
    - 소 분자,
    예를 들면(이에 한정되지 않는) 당, 알코올, 하이드록시산, 아미노산, 비타민, 바이오틴;
    - 극성 작용 그룹에서 종결되는 링커,
    예를 들면(이에 한정되지 않는) 에틸렌디아민, PEG, 카보디이미드 에스테르, 이미도에스테르;
    - 소 분자 또는 비타민에 커플링된 링커,
    예를 들면, 바이오틴, 당, 하이드록시산으로부터 선택되는 펩타이드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 C-말단 그룹 Z'가 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 화학적 접합 또는 커플링에 사용되기에 적합한 펩타이드로서, 여기서 상기 화학적 접합은 펩타이드의 자가-조립 전 또는 후에 수행될 수 있는 펩타이드:
    생활성 분자 또는 모이어티,
    예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 지질, 세포 수용체 리간드, 호르몬, 전구약물, 약물, 비타민, 항원, 항체, 항체 단편, 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 제한없이, DNA, 전령 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭(small interfering) RNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산, 압타머), 사카라이드;
    표지(들), 염료(들),
    예를 들면, 형광성 또는 방사활성 표지(들), 영상 대조제;
    병원체,
    예를 들면, 바이러스, 세균 및 기생충;
    마이크로- 및 나노입자
    또는 이의 조합물.
  12. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드의 C-말단이 예를 들면, 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 화학적 접합 또는 커플링에 의해 기능화되는 펩타이드로서, 여기서 상기 화학적 접합은 펩타이드 및/또는 펩티도미메틱의 자가-조립 전 또는 후에 수행될 수 있는 펩타이드:
    생체활성 분자 또는 모이어티,
    예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 지질, 세포 수용체 리간드, 호르몬, 전구약물, 약물, 비타민, 항원, 항체, 항체 단편, 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 제한없이, DNA, 전령 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산, 압타머), 사카라이드;
    표지(들), 염료(들),
    예를 들면, 형광성 또는 방사활성 표지(들), 영상 대조제;
    병원체,
    예를 들면, 바이러스, 세균 및 기생충;
    마이크로- 및 나노입자
    또는 이의 조합물.
  13. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 그룹 Z'가 펩티도미메틱 분자, 예를 들면, 천연 및 합성 아미노산 유도체이고, 여기서 상기 펩티도미메틱 분자의 C-말단은 카복실산, 아미드, 알코올, 알데하이드, 아민, 이민, 니트릴, 우레아 유사체, 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트, 말레이미드, 비닐 설폰, 아지드, 알킨, 알켄, 탄수화물, 이미드, 퍼옥사이드, 에스테르, 아릴, 케톤, 설파이트, 니트라이트, 포스포네이트, 및 실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용 그룹으로 변형될 수 있는 펩타이드.
  14. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액 속에서 생리학적 조건에서 주위 온도에서 1일 내지 적어도 6개월의 범위의 기간 동안, 바람직하게는 적어도 8개월 까지, 보다 바람직하게는 적어도 12개월 동안 안정한 펩타이드.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 90℃까지의 온도에서 적어도 1시간 동안 생리학적 조건에서 용액 속에서 안정한 펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  17. 제16항에 있어서, 하이드로겔이 주위 온도에서 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 2 내지 4개월, 보다 바람직하게는 적어도 6 내지 12개월의 기간 동안 수용액 속에서 안정한 하이드로겔 또는 오가노겔.
  18. 제16항 도는 제17항에 있어서, 하이드로겔이 2 내지 5보다 큰 저장 모듈러스 G' 대 손실 모듈러스 G'' 비에 의해 특징화되는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 또는 오가노겔이 0.1 Hz 내지 100 Hz의 범위의 주파수에서 500Pa 내지 200,000 Pa의 저장 모듈러스 G'에 의해 특징화되는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 또는 오가노겔이 콜라겐 또는 이의 가수분해된 형태(젤라틴)보다 더 높은 기계적 강도를 갖는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드의 섬유를 포함하며, 상기 섬유가 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드, 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 마이크로- 또는 나노입자, 작은 유기 분자 또는 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나를 엔트랩핑(entrapping)할 수 있는 네트워크를 정의하는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  22. 제21항에 있어서, 하이드로겔이 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드, 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 소 유기 분자, 마이크로- 또는 나노입자, 또는 섬유의 네트워크에 의해 엔트랩핑된 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  23. 제22항에 있어서, 섬유가 미생물, 바이러스 입자, 펩타이드, 펩토이드, 단백질, 핵산, 올리고사카라이드, 다당류, 비타민, 무기 분자, 합성 중합체, 작은 유기 분자, 마이크로- 또는 나노입자, 또는 섬유의 네트워크에 의해 트래핑된 약제학적으로 활성인 화합물 중 적어도 하나와 커플링되는 하이드로겔 또는 오가노겔.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 또는 오가노겔이 연료 전지, 태양 전지, 전자 전지, 바이오센싱 장치(biosensing device), 의학 장치, 임플란트, 약제학적 조성물 및 화장 조성물 중 적어도 하나 속에 포함된 하이드로겔 또는 오가노겔.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 주사가능한 하이드로겔 또는 오가노겔.
  26. 다음 중 적어도 하나에서의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔의 용도:
    의학 도구 키트,
    연료 전지,
    태양 전지,
    전자 전지,
    재생 의약 및 조직 재생,
    이식가능한 스캐폴드,
    질환 모델,
    상처 치유,
    2D 및 3D 합성 세포 배양 기질,
    줄기 세포 치료요법,
    주사가능한 치료요법,
    바이오센서 개발,
    고-처리량 스크리닝,
    생체기능화된 표면,
    프린팅,
    생체제작, 예를 들면, 바이오-프린팅, 및
    유전자 치료요법.
  27. 하이드로겔 또는 오가노겔을 제조하는 방법으로서, 이러한 방법이 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 수용액 또는 유기 용액 각각에 용해시킴을 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 수용액 또는 유기 용액 속의 용해된 펩타이드가 온도에 추가로 노출되며, 여기서 온도는 20℃℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 70℃의 범위인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 펩타이드가 0.01 μg/ml 내지 100 mg/ml의 농도에서, 바람직하게는 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도에서, 보다 바람직하게는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도에서 용해되는 방법.
  30. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 세포 또는 조직 이식체 또는 장치.
  31. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 상처 드레싱 또는 상처 치유제.
  32. 펩타이드 스캐폴드를 포함하는 수술용 임플란트, 또는 스텐트로서, 여기서 펩타이드 스캐폴드가 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔에 의해 형성되는 수술용 임플란트, 또는 스텐트.
  33. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 생체의학 장치 및/또는 전자 장치 및/또는 용액.
  34. 제33항에 있어서, 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함하는, 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 생체의학 장치 및/또는 전자 장치 및/또는 용액.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 용액이 국소 겔 또는 크림, 스프레이, 분말, 또는 시트, 패치 또는 막의 형태로 제공되거나,
    여기서 약제학적 및/또는 화장용 조성물 및/또는 용액이 주사가능한 용액의 형태로 제공되는 약제학적 또는 화장용 조성물 또는 용액.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는. 약제학적 또는 화장용 조성물 및/또는 용액.
  37. 부품의 키트(kit of parts)로서, 키트가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 지닌 제1 용기 및 수성 또는 유기 용액을 지닌 제2 용기를 포함하는, 부품의 키트.
  38. 제37항에 있어서, 제2 용기의 수용액 또는 유기 용액이 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함하고/하거나
    여기서 펩타이드를 지닌 제1 용기가 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함하는, 부품의 키트.
  39. 다음의 단계를 포함하는 조직 재생의 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 방법:
    (a) 제16항 내지 제25항 주 어느 한 항에 정의한 바와 같은 하이드로겔을 제공하는 단계,
    (b) 재생된 조직을 형성하기 위해 세포에 상기 하이드로겔 또는 오가노겔을 노출시키는 단계,
    (c) 상기 세포가 상기 하이드로겔 또는 오가노겔 위에서 성장하도록 하는 단계.
  40. 제39항에 있어서, 생체내에서 수행되며, 여기서 단계 a)에서, 상기 하이드로겔이 조직 재생이 의도된 체내 부위에 제공되며,
    여기서 상기 단계 a)가 바람직하게는 조직 재생이 의도되는 신체내 부위에 상기 하이드로겔을 주사함으로써 수행되는 방법.
  41. 상처의 치료 및 상처 치유 방법으로서, 상기 방법이
    유효량의 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오나노겔 또는 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 상처에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 시험관내 및/또는 생체내에서 사용하기 위한, 바람직하게는 경구 적용을 위한, 주사를 위한 및/또는 국소 적용을 위한, 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 생체영상화 장치(bioimaging device).
  43. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 또는 오가노겔을 포함하는 2D 또는 3D 세포 배양 기질.
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