KR20200003997A

KR20200003997A - 쪽잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR20200003997A
Application number: KR1020180076884A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 박종이; 최옥자
Original assignee: 재단법인 경북바이오산업연구원; 안동대학교 산학협력단
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2020-01-13
Also published as: KR102287390B1

Abstract

본 발명은 쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 쪽잎의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 강력한 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 쪽잎의 열수 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 혈소판 응집 저해에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성이 거의 없으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건에서도 응집 저해 활성의 소실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

쪽잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE LEAF EXTRACTS OF POLYGONIUM TINCTORIUM AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 쪽잎의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 강력한 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성 성분으로서의 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, XII 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 상기의 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있으며, 외인성 혈전 생성경로의 경우, factor II(prothrombin), V 인자, VII 인자, X 인자의 활성화에 따른 혈전 생성이 알려져 있다. 현재까지, 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 쪽은 천연염재 중 유일한 청색으로 색이 아름답고 천연직물에 염색성이 우수하며, 산과 알칼리에 저항력이 있고 세탁, 땀, 마찰 견뢰도가 좋으며 살충성 및 항균성 등 기능성도 우수하여 높은 관심을 받고 있는 우수한 전통염재이다(Song SW 등, 2008. J Korean Soc Dyers Finishers, 20, 18-24). 실제로 쪽잎은 염재로서 뿐만 아니라, 민간에서 해열, 해독, 소종 등의 약재로도 사용되어 왔으며(Tokuyama-Nakai S 등, 2018. Appl Biochem Biotechnol, 184, 414-431), 최근에는 쪽잎 추출물의 항산화 활성(Jang HG 등, 2012, Appl Biochem Biotechnol, 167, 1986-2004), 대장암 생육억제(Micallef MJ, 2002. Int Immunopharmacol, 2, 565-578), 항염증(Tokuyama-Nakai S 등, 2018. Appl Biochem Biotechnol, 184, 414-431; Iwaki K 등, 2011, J Ethnopharmacol, 134, 450-459), 항아토피(Han NR 등, Phytomedicine, 21, 453-600), 항알러지(Kunikata T 등, Eur J Pharmacol, 410, 93-100), 피부 사상균 및 Helicobacter pylori 생육억제(Kataoka M 등, 2001, J Gastroenterol, 36, 5-9; Honda G 등, 1980, Planta Med, 38, 275-276), 콜레스테롤 합성 억제 활성(Kimura H 등, 2015. J Pharm Biomed Anal, 108, 102-112) 및 항 HIV 활성(Zhong Y 등, 2005, Antiviral Res, 66, 119-128) 등이 보고되어 있다. 그러나, 현재까지 쪽잎 추출물의 혈소판 응집 저해에 의한 강력한 항혈전 활성은 알려진 바 없는 실정이다.

쪽과 관련된 특허로는, 쪽 색소의 제조에 관한 특허와 제조된 쪽 염료를 이용한 염색방법에 관한 특허, 쪽 염색된 생활용품에 관한 특허로 구분할 수 있다. 먼저 쪽 색소 제조와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0264675호에 [천연쪽색소의 제조방법], 등록특허 제10-0540642호에 [쪽염료로부터 쪽색소의 추출방법]이 개시되어 있으며, 염색기술과 관련하여 등록특허 제10-1619850호에 [쪽 원단 염색과 발색 장치 및 염색 방법], 등록특허 제10-1357105호에 [자연 발효 쪽 염료를 이용한 쪽 염색장치와 염색 방법]이 개시되어 있다. 또한 쪽 염색 제품으로는 등록특허 제10-1233697호에 [발효 쪽 염색을 이용한 눈 건강 안대] 및 제10-2005-0079595호에 [천연 쪽염색 기저귀]가 공개되어 있다. 그러나, 현재까지 쪽잎 추출물의 항혈전 활성 조성물은 알려진 바 없다.

Tokuyama-Nakai S, Kimura H, Ishihara T, Jisaka M, Yokota K. Appl Biochem Biotechnol. 2018. 184: 414-431.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 쪽잎으로부터 혈소판 응집 저해 활성 물질을 추출하여 분리, 정제하고, 이를 유효성분으로 하는 항혈전 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해제를 제공한다.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 쪽잎의 열수 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 혈소판 응집 저해에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성이 거의 없으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건에서도 응집 저해 활성의 소실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 사용된 건조 쪽잎을 나타낸다.
도 2은 쪽잎 열수 추출물의 인간 혈소판 응집 저해 활성을 나타낸 것이다: 1: 용매 대조구(DMSO), 2: 아스피린(0.25mg/ml), 3: 아스피린(0.125mg/ml), 4: 쪽잎 열수 추출물(0.25mg/ml), 5: 쪽잎 에탄올 추출물(0.25mg/ml).

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 쪽잎의 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 제조한 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 각각 조제하고, 상기 추출물의 항혈전 활성을 평가하여 열수 추출물을 항혈전 성분으로 회수하였으며, 상기 열수 추출물은 인간 적혈구에 대해 용혈 활성을 거의 나타내지 않으면서, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 열수 추출물을 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 천연염재로서 오랫동안 사용되어 온 쪽잎을 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 건조 쪽잎을 대상으로 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 각각 조제하고, 이들 추출물을 대상으로 항혈전 활성을 트롬빈 저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 혈액응고인자 저해(활성부분 트롬보플라스틴 타임, activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)를 평가하여, 열수 추출물에서는 양호한 프로트롬빈 저해와 약한 트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해 활성을 확인하였으며, 에탄올 추출물에서는 우수한 트롬빈 저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해 활성을 확인하였다. 상기 에탄올 추출물은 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 1.86배 연장된 트롬빈 타임, 1.79배 연장된 프로트롬빈 타임, 1.65배 연장된 aPTT를 나타내어 혈액 응고를 효율적으로 저해하였으며, 이러한 활성은 아스피린 1.5mg/ml 농도의 항응고 활성보다 우수하였다. 반면, 열수 추출물은 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 1.42배 연장된 프로트롬빈 타임을 나타내었다. 한편, 열수 추출물은 0.25mg/ml 농도에서 58%의 혈소판 응집을 나타내어 강력한 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 반대로 에탄올 추출물은 강력한 혈소판 응집 촉진효과를 나타내어 빠르고 강력한 혈전을 생성하였다. 또한, 열수 추출물은 1mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 전혀 나타내지 않아 급성독성을 유발하지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 쪽잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 쪽잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 쪽잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해제를 제공한다.

이하에서는, 본 발명의 쪽잎 열수 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 꽃봉우리가 나타나기 시작할 때 수확한 쪽잎을 음건하는 단계; 건조 쪽잎을 마쇄하는 단계; 쪽잎 분말로부터 추출물을 조제하는 단계; 상기 추출물의 항응고 활성 및 혈소판 응집저해 활성 평가 단계 및 열수 추출물의 안정성 평가 단계의 실험들을 수행하였다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "쪽잎 추출물"은 건조 쪽잎을 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수 추출이 가장 바람직하다.

본 발명의 쪽잎 추출물은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 유효성분은 혈소판 응집 저해제의 의약 용도로서 사용되며, 통상 항혈소판제로서 명명될 수도 있다.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 쪽잎의 추출물 제조 및 이의 성분 분석

2017년 10월 경북 안동에서 재배, 수확한 쪽잎을 음건한 후(도 1), 50~100메쉬로 분쇄하여 쪽잎 분말을 제조하였다. 쪽잎 에탄올 추출물 조제시에는 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 3회 반복 추출한 후 추출액을 모아 filter paper(Whatsman No. 2)로 거른 후, 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)하여 분말로 제조하여 에탄올 추출물을 제조하였으며, 열수 추출액 제조시에는 건조 쪽잎에 대해 20배의 증류수를 가한 후, 100℃에서 1시간 추출한 후 상기와 동일한 방법으로 필터, 감압 농축하여 분말로 조제하였다. 각각의 추출 수율과 추출물의 성분 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고, 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

[표 1] 쪽잎 추출물의 수율과 성분 분석

표 1에 나타낸 바와 같이, 추출 효율은 열수 추출물이 27.6%로 에탄올 추출효율보다 약 2배 높았으며, 쪽빛색은 에탄올 추출물이 더욱 선명하였다. 각각의 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정결과 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 유의적으로 높은 51.2mg/g을 나타내었으나, 특이하게 에탄올 추출물의 총당 함량(297.8mg/g)은 열수 추출물보다 1.2배 높게 나타났다. 반면, 총 플라보노이드 및 환원당 함량은 열수 및 에탄올 추출물에서 유사하게 나타났다(p<0.05). 이러한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 기존 보고된 쪽잎의 함량보다 2~3배 높게 나타났으나, 이는 사용 쪽잎의 수확시기, 성숙도 및 추출용매에 영향을 받은 결과로 판단된다.

실시예 2: 쪽잎 추출물의 항응고 활성

실시예 1에서 제조된 다양한 쪽잎 추출물의 혈액응고 저해활성을 평가하였으며, 기존에 보고된 방법(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928)과 동일하게, 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정하여 평가하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.

트롬빈 타임(Thrombin Time)

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20 mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 30.5초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임(prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 16.7초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT(activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후, 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 58.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT를 용매 대조구의 aPTT로 나눈 값으로 나타내었다.

[표 2] 쪽잎 추출물의 혈액응고 저해활성 평가

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 임상에서 사용되고 있는 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 1.64배 연장된 트롬빈 타임, 1.31배 연장된 프로트롬빈 타임, 1.60배 연장된 aPTT를 나타내어 혈액 응고를 효율적으로 저해함을 확인하였다. 한편, 쪽잎 열수 추출물에서는 양호한 프로트롬빈 저해와 약한 트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해가 나타났으며, 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 1.42배 연장된 프로트롬빈 타임을 나타내었다. 쪽잎 에탄올 추출물에서는 우수한 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해활성이 나타난 바, 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 1.86배 연장된 트롬빈 타임, 1.79배 연장된 프로트롬빈 타임, 1.65배 연장된 aPTT를 나타내어 혈액응고를 효율적으로 저해하였으며, 이러한 활성은 아스피린 1.5mg/ml 농도의 항응고 활성보다 우수하였다.

실시예 3: 쪽잎 추출물의 인간 혈소판 응집저해 활성

실시예 1에서 조제된 쪽잎 추출물을 대상으로 인간 혈소판 응집저해 활성을 평가하여 그 결과를 표 3 및 도 2에 나타내었다. 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다. 따라서, 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.

혈소판 응집저해 활성(Platelet aggregation inhibition activity)

혈소판은 인간 농축혈소판을 사용하였으며, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml이 되도록 조정하였다. 이후, 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

[표 3] 쪽잎 추출물의 인간 혈소판 응집저해 활성

그 결과, 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 용매대조구인 DMSO의 경우 혈소판은 콜라겐 첨가에 의해 빠르고 강하게 응집이 나타났으며, 혈소판 응집저해제인 아스피린은 농도 의존적으로 혈소판 응집을 강력하게 저해하였다. 이때, 아스피린은 0.25mg/ml 농도에서 19.4%의 응집도, 0.125mg/ml 농도에서 32.6%의 응집도를 나타내어 임상에서 항혈전제로 사용되는 근거를 확인하였다. 한편, 쪽잎 열수 추출물은 0.25mg/ml 농도에서 58.3%의 응집도를 나타내어, 우수한 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으나, 쪽잎 에탄올 추출물은 0.25mg/ml 농도에서 235.7%의 혈소판 응집을 보여, 오히려 혈전 생성을 촉진하는 것으로 나타났다. 현재까지 쪽잎의 혈소판 응집저해 및 혈소판 응집촉진 효과는 알려진 바 없으므로, 쪽잎 열수 추출물은 응집저해에 따른 항혈전제로, 에탄올 추출물은 응집촉진에 의한 지혈제로 개발 가능함을 제시하고 있다.

실시예 4: 쪽잎 추출물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가

상기 실시예 1에서 얻은 쪽잎 열수 추출물을 대상으로 혈소판 응집저해 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 상기 활성 분획물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 응집저해 활성의 소실이 없이 우수한 활성을 유지하였다. 이상의 결과는 천연염재로 대량 재배되고 있는 쪽잎으로부터 제조된 열수 추출물이 항혈전제로 실제적 이용이 가능함을 제시하고 있으며, 위장장해 등의 부작용이 보고된 아스피린을 보완, 대치할 수 있으리라 판단된다.

Claims

쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
쪽잎(Leaf of Polygonium tinctorium) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해제.