KR20190134607A - 바이오마커로서 앱타머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하기 위한 수단으로서, 대상체로부터의 샘플에 대한 라이브러리의 선택 이전 및 이후에, 공지된 결과의 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 적어도 하나의 샘플에 대해 선택된 라이브러리에서 앱타머의 상대 빈도 변화의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키고 결정된 상관관계를 근거로 상기 대상체를 진단하는 것을 포함하는 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이오마커로서 앱타머
본 발명은 병리를 진단하거나 병리의 하위-유형을 진단하기 위해, 또는 대상체에서 병리의 진행 속도를 결정하기 위해 바이오마커로서 사용될 수 있는 앱타머(aptamer)의 식별에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 병리를 진단하기 위해, 병리의 하위-유형을 진단하기 위해, 또는 대상체에서 병리의 진행 속도를 결정하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 체액 또는 조직에서 에피토프에 결합하는 서열로 농화되고 (enriched) 표현형에 따라 다양한 대상체로부터의 동일한 체액 또는 조직의 샘플에 대해 더욱 농화된 한 세트의 앱타머; 및 농화된 앱타머 빈도의 상대 빈도에서의 변동과 그러한 대상체에 걸친 표현형에서의 변동의 상관관계의 사용을 포함한다.
Strimbu 및 Tavel (Curr Opin HIV AIDS. 2010 Nov; 5(6): 463-466)은 바이오마커를 "정확하고 재현 가능하게 측정될 수 있는 - 환자의 외부에서 관찰된 의학적 상태(state)의 객관적인 표시"로 정의한다. 이 정의는 바이오마커와 의학적 상태 사이의 기능적 관계가 이해될 것을 요구하지 않으며, 이 정의는 단지 바이오마커의 측정과 의학적 상태 사이의 관계가 정확하고 재현 가능하게 측정될 것만을 요구한다.
당업계에 공지된 2가지 주요 유형의 바이오마커가 있다: "게놈 분석"으로 불리는 하나는 환자에 걸쳐서 게놈 서열 내 변형체와 의학적 상태의 상관관계에 기초한다. 제2 유형의 바이오마커는 단백질 또는 대사산물의 풍부도 (abundance)의 측정으로 구성되며, 이러한 풍부도는 의학적 상태와 상관이 있다. 게놈 분석의 경우, 상관관계는 단백질 서열의 예측에 기초한다. 상관관계의 물리적 기초는 단백질의 기능에 대한 단백질 수준에서의 서열의 효과인 것으로 가정된다. 단백질 또는 대사산물 바이오마커의 경우, 상관관계의 물리적 기초는 발현 수준의 변화, 또는 발현 특이성, 또는 번역-후 변형의 결과인 것으로 가정된다.
일반적으로, 어느 경우에나, 의학적 진단을 위한 바이오마커의 유용성의 기초는 물리적 원인과 결과 관계가 아니라 측정된 바이오마커와 의학적 상태 사이의 상관관계이다. 바이오마커는 또한 진단 그 자체보다 표현형의 확률을 지정(assign)하는데 사용될 수 있다. 예시로서, 혈액 내 높은 콜레스테롤 수준은 심부전의 진단으로서가 아니라, 심부전의 확률을 예측하는데 사용된다.
본 발명에서, 발명자들은 의학적 진단 및/또는 의학적 상태의 확률을 예측하기 위한 유용성의 동일한 일반적 근거를 충족시키는 새로운 유형의 바이오마커를 개시한다.
본 발명은 체액 또는 조직 내 에피토프에 결합하는 그들의 능력에 대해 농화된 앱타머 라이브러리의 사용에 의해 가능해진다. 앱타머는 일반적으로 특정 에피토프에 결합하는 능력을 나타내는 핵산 (DNA, RNA, PNA 또는 이들의 혼합)으로부터 형성된 짧은 올리고머이다. 리간드 및 바이오마커의 동시-발견을 위해 항체에 비한 앱타머의 주요 이점은 앱타머의 식별이 잠재적 리간드의 매우 큰 무작위 풀의 반복적 선택에 기초한다는 것이다. 따라서, 임의의 무작위 앱타머 라이브러리를 병리를 나타내는 조직에 노출시키고 이 조직 내 에피토프에 결합하는 앱타머를 선택할 수 있다. 또한, 병리를 나타내지 않는 조직 (즉, 실질적으로 건강한 조직)에 이를 노출시키고 이러한 조직에 결합하는 서열에 대해 선택함으로써 이러한 라이브러리에 대한 역-선택 (counter-selection)을 수행하는 것이 가능하다. 실질적으로 건강한 조직에의 결합에 대한 대안적인 선택, 및 병리에 영향을 받은 조직에의 결합에 대한 선택은 병리에 영향을 받은 조직에서 특이적으로 농화된 에피토프에 결합하는 서열의 농화를 초래한다. 이와 같이, 병리에 영향을 받은 조직 내에서 광범위한 에피토프에 결합하는 선택된 앱타머 라이브러리를 개발하는 것이 가능하다. 병리학적 에피토프에 대한 앱타머 서열을 농화하는 이 동일한 과정은 또한 상기 주어진 병리에 영향을 받지 않은 개인으로부터의 동일한 체액에 대한 역-선택과 함께 주어진 병리에 영향을 받은 환자로부터의 체액 내 그러한 에피토프에 대한 앱타머의 선택에 적용된다. 체액에서 앱타머의 선택을 가능케 하는 방법이 국제특허공개 WO2017035666에 제공된다.
용어 "에피토프"는 면역학으로부터 발생하였고 일반적으로 항체에 의해 인식되고 결합되는 표적 분자 상의 부위를 의미하는 것으로 여겨진다. 이러한 개념은 앱타머에 준용된다.
병리학적 에피토프에 대한 선택의 반응으로 개별 앱타머 서열의 농화는 차세대 시퀀싱 (NGS)과 같은 과정을 통해 라이브러리로부터 샘플 내 개별 서열의 상대 빈도를 측정하는 것을 특징으로 한다. 선택된 앱타머 라이브러리 내 각 앱타머의 상대 빈도는 주어진 앱타머 서열이 관찰되는 횟수 (카피수)를 라이브러리 내에서 관찰되는 앱타머 서열의 총수로 나눔으로써 결정된다. 병리학적 에피토프에 대한 연속적 선택 라운드에서 라이브러리 내 앱타머의 농화는 양성 표적에 결합하는 각 앱타머의 능력, 및 선택에 사용된 샘플 내 표적의 상대 빈도 또는 농도의 함수이다.
본 발명의 기초가 되는 이해는 상이한 환자 샘플에 대한 앱타머 라이브러리의 동시 선택으로부터 발생하는 특정 앱타머의 상대 빈도에서의 차이가 이들 환자 내 에피토프 빈도의 차이에 기인한 것이어야 한다는 점이다. 결합 친화도의 차이는 환자에 걸쳐서 동일한 에피토프 빈도가 주어지는 경우 상대 빈도에서 동일한 변화를 초래할 것이다. 즉, 선택 과정은 앱타머의 결합 친화도의 차이 및 환자에 걸친 에피토프 농도의 차이의 결과로서 선택 라이브러리 내 앱타머의 상대 빈도의 변화를 초래할 것이다. 동일한 선택 라운드에서 동시 선택 시 환자에 걸친 앱타머의 상대 빈도의 차이는 단지 이들이 결합하는 에피토프의 상대 빈도의 차이로 인한 것일 수 있다.
따라서, 실질적으로 건강한 개인과 특정 병리에 영향을 받은 개인 사이에서 선택된 라이브러리와 특정 환자 라이브러리 사이의 상대 빈도의 차이를 갖는 앱타머의 특성을 감안할 때, 이러한 앱타머의 상대 빈도의 변화는 의학적 상태의 진단을 제공하거나, 또는 그러한 의학적 상태의 발생 확률을 지정하기 위해 사용될 수 있음이 본 발명자의 이해이다.
본 발명자들은 주어진 병리의 진단에 유용한 것으로 특정된 앱타머를 "앱타마커 (AptaMarkers)"로 명명하였다.
이러한 앱타마커의 상대 빈도의 변화는 선택된 라이브러리에 존재하는 앱타머 상에서 특정 환자에 대한 선택 과정의 함수이다. 병원성 에피토프에 대한 앱타머 사이에는 경쟁이 존재한다. 만약 샘플이 다른 샘플보다 더 높은 수준의 병리학적 에피토프를 갖는다면, 이 병리학적 에피토프에 결합하는 앱타머는 다른 샘플보다 이러한 샘플에서 더 높은 수준으로 농화될 것이다. 반대로, 만약 샘플이 다른 샘플보다 더 낮은 수준의 병리학적 에피토프를 갖는다면, 이 병리학적 에피토프에 결합하는 앱타머는 다른 샘플보다 이러한 샘플에서 더 낮은 수준으로 농화될 것이다. 또한, 본 발명이 시퀀싱 과정을 특징으로 하는 일련의 서열에서 이러한 앱타머의 상대 빈도를 기초로 함을 고려할 때, 만약 이들이 결합하는 에피토프가 상기 샘플에서 더 높은 농도로 존재하기 때문에 특정 앱타머가 주어진 샘플에서 더 높은 수준으로 농화되는 경우, 샘플에 걸쳐서 농도가 동일한 에피토프에 결합하는 다른 앱타머는 덜 농화될 것이다. 즉, 임의의 주어진 앱타머가 상대 빈도에서 농화되는 경우, 다른 앱타머의 상대 빈도에서 보상적 감소가 있어야 한다.
그 후에 라이브러리 내 각 앱타머의 상대 빈도는 라이브러리 내 다른 모든 앱타머의 상대 빈도에 의해 영향을 받는다. 따라서, 본 발명은 라이브러리의 맥락에서 그들 자체의 상대 변화가 아닌, 앱타마커의 상대 빈도의 변화에 기초한다.
앱타마커의 상대 빈도의 변화가 병리의 중증도 수준 진단에 사용될 수 있음이 본 발명자들의 이해이다. 앱타마커의 상대 빈도의 변화 수준은 이들이 결합하는 병원성 에피토프의 빈도의 함수이다. 따라서, 앱타마커의 상대 빈도의 변화 수준은 병원성 에피토프 농도와 상관될 수 있다. 임상 데이터와 비교하여, 알고리즘이 개발될 수 있고, 그로써 한 세트의 앱타마커의 상대 빈도의 변화 수준이 병리의 중증도 수준을 나타내는 점수를 생성하는데 사용된다.
또한, 시간의 경과에 따라 개별 환자 내에서 앱타마커의 상대 빈도 변화가 병리의 진행 속도의 예측을 개발하는데 사용될 수 있음이 본 발명자들의 이해이다. 특정 환자는 주어진 병리의 상이한 진행 속도를 나타낼 수 있다. 시간의 경과에 따라 이러한 환자의 반복적 분석을 수행함으로써, 앱타마커의 변화율을 결정할 수 있다. 앱타마커에서 더 높은 변화율을 나타내는 환자는 더 높은 병리의 진행률을 나타내는 것으로 예측될 수 있다. 따라서, 앱타마커의 변화율을 병리의 변화율에 상관시키는 알고리즘이 개발될 수 있다.
개별 환자에 걸친 앱타마커의 상대 빈도의 변화가 환자를 계층화하는데 사용될 수 있음이 또한 본 발명자들의 이해이다. 다른 환자들이 동일한 병리에 대해 다른 병리학적 에피토프를 나타낼 수 있다. 따라서, 유사한 환자들의 클러스터를 특성화하고 결과적으로 병리 내에서 환자의 상이한 클러스터를 식별하기 위해 앱타마커의 상대 빈도의 변화를 사용할 수 있다. 이 정보는 잠재적 치료법을 시험하고 임상 연구에 참여할 대상체의 보다 표적화된 선택에 유용할 것이다. 이러한 앱타마커의 응용은 치료에 대한 반응 수준과 상관될 수 있는 환자의 계층화에 유용할 수 있다.
또한, 치료 (therapy)를 받고 있는 개별 환자에 걸친 앱타마커의 상대 빈도의 변화가 이러한 치료의 효능을 평가하는데 사용될 수 있음이 본 발명자들의 이해이다. 이러한 환자가 치료를 받기 전에, 그리고 일단 환자가 치료를 받은 후 시간의 경과에 따른 반복된 기준에 대한 측정은 어떤 앱타마커가 치료에 영향을 받는지, 얼마나 많은 앱타마커가 영향을 받는지, 앱타마커에 대한 영향과 치료의 투여량 사이에 상관관계가 존재하는지, 또는 치료의 적용 방법 및 요법의 효능 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 앱타마커가 병원성 에피토프에 결합하기 때문에 앱타마커의 상대 빈도의 변화에 대한 이 정보는 유용하다.
따라서, 특정 요법에 반응하는 병리에 영향을 받은 환자를 식별하고 동일한 치료의 적용을 위한 환자의 선택을 위한 예측 지표로서 이러한 환자의 앱타마커 반응을 사용하는 것이 가능할 것이다. 이는 치료제 개발자에게 귀중할 것이다.
다른 이들이 바이오마커를 식별하기 위해 앱타머를 사용하는 방법을 개발하려고 시도했지만, 바이오마커 그 자체로서 앱타머의 사용에 대한 것은 아니다.
특히, 미국특허공개 US20150087536은 앱타머의 사용을 통해 체액 내 단백질의 확인 및 정량을 위한 방법을 기술한다. 그러나 이 방법은 공지된 단백질에 대한 이들의 결합이 이미 확립된 앱타머의 사용으로 제한된다. 이러한 앱타머의 풀은 체액으로부터 유래한 단백질과 연합하여 이에 결합되게 한다. 결합되지 않은 앱타머는 세척에 의해 제거된다. 나머지 결합된 앱타머는 시퀀싱되고 체액 내 존재하는 단백질의 신원 및 양이 시퀀싱에 의해 밝혀진 바와 같이 앱타머의 존재 및 양에 의해 결정된다.
본 발명은 미국특허공개 US20150087536호에 기술된 발명에 비해 개선을 나타내는데, 본 발명은 무엇보다도 먼저 조직 또는 체액 내 존재하는 특성화되지 않은병원성 에피토프에 대한 앱타머의 선택을 포함한다. 본 발명자들은 이들과 결합하는 앱타머의 빈도 변화를 측정함으로써 이러한 병리학적 에피토프의 풍부도 변화의 특성화를 가능케 하였다. 그러나 US20150087536은 공지된 단백질 표적만이 식별되는 그러한 앱타머의 적용으로 제한된다. 본 발명은 주어진 단백질에 결합하는 것으로 알려진 공지의 앱타머의 개발로 제한되지 않는다.
나아가, US20150087536은 정제된 단백질에 결합하는 앱타머로 제한된다. 본 발명은 이러한 방식으로 제한되지 않는다. 본 발명자들은 실제로 다른 단백질 또는 대사산물, 또는 세포막과 같은 다른 생물학적 실체와의 복합체에서 단백질의 풍부도를 검출할 수 있었다. 본 발명자들은 대사산물 중의 복합체, 대사산물 단독, 또는 세포막과 연관된 대사산물을 포함하는 병원성 에피토프의 부분을 검출할 수 있었기 때문에, 본 발명은 또한 단백질로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 그의 풍부도가 병리에 의해 농화된 단백질의 펩티드 단편의 풍부도를 검출할 수 있다. 예시로서, 신경학적 장애의 경우에, 단백질은 종종 뇌-혈액-장벽을 통한 제거를 위해 펩티드로 절단된다. 이들 펩티드는 혈액 내에 존재하고, 병리학적 에피토프로서 본 발명의 표적이 될 수 있다. 펩티드에 의해 제시된 에피토프가 정제된 단백질에 의해 제시된 에피토프와 다를 수 있기 때문에 정제된 단백질에 대해 선택된 앱타머는 종종 이러한 단백질로부터 유래한 펩티드에는 결합하지 않을 것이다.
Berezovski 등 (J Am Chem Soc. 2008 Jul 16; 130(28): 9137-43)에 의한 공개는 앱타머의 농화된 풀의 선택을 위한 방법, 및 바이오마커를 식별하기 위한 이렇게 농화된 풀의 사용을 기술한다. 앱타머 라이브러리가 병리를 갖는 환자로부터의 혈청 중의 단백질에 대해 선택된다. 이 라이브러리는 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 상에서 후속 고정화를 위해 비오틴 그룹과 함께 합성된다. 라이브러리를 먼저 체액으로부터의 단백질과 함께 인큐베이션한 후 단백질/앱타머 복합체를 자기 비드의 도입에 의해 이 인큐베이션으로부터 제거한다. 결합된 단백질을 액체 크로마토그래피/질량 분광 (LC-MS) 분석으로 식별한다.
Berezovski 등의 개시는 잠재적 단백질 바이오마커를 식별하기 위해 앱타머를 사용하지만, 이들 바이오마커의 진단 또는 정량화를 위한 방법을 직접적으로 개발하지 않는다는 점에서 본 발명과 상이하다.
Berezovski 등의 방법은 또한 펩티드, 대사산물, 단백질과 대사산물 사이의 복합체 또는 다른 단백질과의 단백질이 아닌, 특정 단백질의 식별로 제한된다.
Berzovski 등의 방법은 또한 단백질을 발견하기 위한 도구로서 앱타머의 사용으로 제한되며 그 범위는 바이오마커로서 이러한 단백질의 후속 사용으로 제한된다.
바이오마커로서 이들 단백질에 결합하는 앱타머를 사용하는 개념은 이들 저자들에 의해 고려되지 않았다.
본 발명은 단백질의 차등적 중첩을 검출할 수 있고, 따라서 주어진 단백질의 식별에만 제한되지 않는다. 특정 단백질, 또는 이러한 단백질로부터 유래한 펩티드의 오중첩이, 예컨대 알츠하이머병의 경우 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ) 및 pTau와 같은 병리를 나타낼 수 있음이 당업계에 익히 공지되어 있다. Aβ 플라크 및 tau 뭉침 (tangles) 둘 다는 단백질 자체보다는 단백질의 중첩 상태와 관련된 병리학적 에피토프의 공급원의 예를 제공한다. 본 발명은 이러한 병리학적 에피토프의 풍부도를 직접적으로 측정할 수 있는 능력을 갖지만, Berzovski 등의 방법은 그렇지 않다.
종래 기술에 개시된 한계에 직면하여, 의학적 상태를 보다 정확히 진단하고, 이러한 의학적 상태가 발생할 확률을 지정하고, 병리 중증도의 수준을 진단하고, 병리의 진행 속도 예측을 개발하고, 환자를 계층화하고, 치료의 효능을 평가하고/하거나, 특정 치료에 반응하는 병리에 영향을 받은 환자를 식별하는 새로운 방법의 개발에 대한 충족되지 않은 요구가 남아있다.
여기서, 본 발명자들은 체액 또는 조직 내 표적에 바이오마커 그 자체로서 결합하는 앱타머를 사용하는 방법을 개발하였다. 바이오마커로서 앱타머의 사용은 체액 또는 조직에 대한 단일 라운드의 선택 후 앱타머 라이브러리 내 앱타머 또는 앱타머 세트의 상대 빈도와 표현형 또는 의학적 상태 사이의 상관관계에 기초한다.
따라서, 본 발명은 앱타머가 체액 또는 조직 내에서 무엇에 결합하는지를 알아야 할 필요를 회피한다. 실제로, 이전에 기술된 방법은 단백질을 식별하기 위해 앱타머를 사용하는 수단을 수반하며, 그 후에 이 단백질은 바이오마커로 사용된다. 그러나 본 발명은 잠재적 표적의 범위를 에피토프를 제시할 수 있는 임의의 것으로 확장시키고, 표적이 무엇인지를 식별할 필요성을 회피한다.
나아가, 체액 및 조직 내 잠재적 표적의 식별은 표적의 낮은 농도로 인해 어려울 수 있고, 표적의 복잡한 혼합에서 이러한 표적을 특성화하는 것과 관련된 어려움이 있다.
본 발명은 표적의 식별을 요구하지 않으면서 의학적 상태의 변화와 상관되는 표적의 변화를 특성화하는 것을 가능케 함으로써 이러한 어려움을 극복한다.
요약
본 발명은 대상체에서 의학적 상태(state), 질환 또는 병태(condition)를 진단하기 위한 수단으로서, 대상체로부터의 샘플에 대한 라이브러리의 선택 이전 및 이후에, 공지된 결과의 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 적어도 하나의 샘플에 대해 선택된 라이브러리에서 앱타머의 상대 빈도 변화의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 관한 것이다:
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로, 선택된 앱타머 라이브러리가 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 1개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 1개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 관한 것이다
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로, 선택된 앱타머 라이브러리가 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 2개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
- 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 2개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
일 구현예에서, 적어도 1개의 기준 대상체는 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 대상체이다.
일 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환이다.
일 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계는 2회 이상의 선택 라운드를 포함한다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 공지되고 특성화된 앱타머 서열의 서브세트(subset)를 공지된 비율로 포함한다.
일 구현예에서, 상대 빈도의 변화가 다양한 시점에서 결정되고, 그로써 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 진행 속도를 평가한다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 대상체에서 발생하는 의학적 상태, 질환 또는 병태의 확률을 지정하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 중증도 수준을 진단하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 진행 속도를 결정하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체를 계층화하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체에서 요법의 효능을 평가하기 위한 것이다.
정의
본 발명에서 하기 용어는 다음의 의미를 갖는다:
용어 "앱타머"는, 본원에 사용된 바와 같이, 리간드로서 작용하고 분석물에 결합하는 그들의 능력에서 항체를 모사하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일 구현예에서, 앱타머는 천연 DNA 뉴클레오티드, 천연 RNA 뉴클레오티드, 변형된 DNA 뉴클레오티드, 변형된 RNA 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "선택된 라이브러리" 또는 "선택된 앱타머 라이브러리"는, 본원에 사용된 바와 같이, 표적에 노출된 앱타머 서열의 수집을 지칭하고, 여기서 그러한 표적은 앱타머 선택과 같이 당해 분야에 공지된 방법을 통해 신체 조직 또는 체액일 수 있고, 그러한 선택된 라이브러리는 백만 개 서열의 샘플에서 관찰된 적어도 0.01%의 서열이 동일한 표적에 대한 후속 선택 라운드에서 다시 관찰되는 특징을 나타낸다.
용어 "대상체 -특이적 앱타머 라이브러리", "환자-특이적 앱타머 라이브러리" 또는 "진단 라이브러리"는, 본원에 사용된 바와 같이, 표적에 대한 앱타머 선택 과정에서 적어도 한 번 적용된 선택된 라이브러리로부터의 분취량을 나타내는 앱타머 서열의 수집을 지칭하고, 여기서 그러한 표적은 개인으로부터의 신체 조직 또는 체액일 수 있다.
용어 "상대 빈도"는, 본원에 사용된 바와 같이, 앱타머와 관련하여, 관찰된 서열의 총수로 나눈 선택된 앱타머 라이브러리 또는 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 중 하나로부터의 서열의 샘플 내 앱타머의 카피수를 지칭한다.
용어 "상대 빈도의 변화"는, 본원에 사용된 바와 같이, 앱타머와 관련하여, 선택된 앱타머 라이브러리 또는 다른 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 중 하나에서 동일한 앱타머의 상대 빈도와 비교한 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 해당 앱타머의 상대 빈도를 지칭한다.
용어 "앱타머 클러스터"는, 본원에 사용된 바와 같이, 상이한 서열을 갖는 앱타머의 집단 또는 풀을 지칭하며, 여기서 "앱타머 클러스터" 내 앱타머의 모든 상대 빈도는 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에 걸쳐서 통계적으로 유의미한 수준의 공분산을 나타낸다.
용어 "대상체"는 온혈 동물, 바람직하게는 인간, 애완동물 또는 가축을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "애완동물" 및 "가축"에는 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 돼지, 소, 양, 염소, 말 및 가금류가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 대상체는 남성 또는 여성 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 성인 (예를 들어, 18세 (인간 연령으로) 초과의 대상체 또는 생식 능력이 달성된 후의 대상체)이다. 다른 구현예에서, 대상체는 아동 (예를 들어, 18세 미만 (인간 연령으로)의 대상체 또는 생식 능력이 달성되기 전의 대상체)이다. 일 구현예에서, 대상체는 20세 초과, 바람직하게는 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90세 이상 초과이다. 일 구현예에서, 대상체는 30 내지 90세, 바람직하게는 40 내지 90세, 더욱 바람직하게는 50 내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 60 내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 70 내지 90세이다. 일부 구현예에서, 대상체는 "환자", 즉 의학적 치료를 받기를 기다리거나 의학적 치료를 받고 있는, 또는 본 발명에 따른 의학적 또는 진단 절차의 대상이었거나/이거나/일 것이거나 또는 질병의 발병에 대해 모니터링되는 대상체일 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하기 위한 수단으로서, 대상체로부터의 샘플에 대한 라이브러리의 선택 이전 및 이후에, 공지된 결과의 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 적어도 하나의 샘플에 대해 선택된 라이브러리에서 앱타머의 상대 빈도 변화의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상체에서 발생하는 의학적 상태, 질환 또는 병태의 확률을 지정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 증중도의 수준을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 진행 속도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체를 계층화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체에서 치료의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 1개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계, 및
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 1개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로, 선택된 앱타머 라이브러리가 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 1개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 1개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 2개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
- 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 2개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로, 선택된 앱타머 라이브러리가 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 2개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
- 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
- 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
- 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 2개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
- 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 다음을 특성화하기 위해, 병리 수준이 공지되지 않은 개인 (이하, "진단 대상체"로 지칭됨)으로부터의 샘플에 대해 구현된다:
a) 환자가 병리의 영향을 받는가?
b) a)에 대해 예인 경우, 환자가 나타내는 병리학적 효과는 어느 수준인가? 및
c) a)에 대해 예인 경우, 환자로부터의 샘플은 관련된 앱타머 빈도의 변화율을 결정하기 위해 규칙적인 시간 간격으로 처리되어야 한다. 이 정보는, 예를 들어 병리에 의한 영향의 정도에서 개별 증가율을 예측하는데 사용될 수 있다.
이들 단계는 바이오마커로서 앱타머 세트의 사용을 위한 골격 (framework)을 생성하는데 기초를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 상업적으로 이용가능한 선택된 앱타머 라이브러리이다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 초기에 (ab initio)에 제조된다
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 앱타머 선택의 과정을 통해 수득되거나 제조된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는, 앱타머 선택 후, 서열 라이브러리에 포함된 서열의 적어도 0.001%, 적어도 0.005%, 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1%를 포함한다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는, 앱타머 선택 후, 적어도 100,000개 서열, 적어도 250,000개 서열, 적어도 500,000개 서열, 적어도 750,000개 서열, 적어도 1,000,000개 서열, 적어도 1,250,000개 서열, 적어도 1,500,000개 서열, 적어도 1,750,000개 서열, 적어도 2,000,000개 서열의 라이브러리에 포함된 서열의 적어도 0.001%, 적어도 0.005%, 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1%를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는, 앱타머 선택 후, 백만 개 서열의 라이브러리에 포함된 서열의 적어도 0.01%를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택된 앱타머 라이브러리"는 적어도 하나의 에피토프에 특이적인 앱타머 서열의 라이브러리를 지칭한다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 에피토프는 병리학적 에피토프이다. 용어 "병리학적 에피토프"는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태의 특징인 에피토프를 지칭한다.
다양한 의학적 상태, 질환 또는 병태가 본원에 기재된 용도 및 방법의 어느 하나를 사용하여 조사될 수 있는 것으로 본 발명은 고려한다. 따라서, 용어 "조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태"는 그에 대한 진단이 주어진 대상체에서 결정되게 하는 주어진 의학적 상태, 질환 또는 병태를 지칭한다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 적어도 하나의 에피토프, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개 이상의 에피토프, 바람직하게는 병리학적 에피토프에 특이적인 앱타머 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태에는 신경퇴행성 질환, 신경계 질환, 암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 감염, 염증 질환 및 대사 질환이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
신경퇴행성 질환의 예시에는 알츠하이머병, 경도 인지 장애 (MCI), 기억 기능 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위측성 측색 경화증 (ALS) (가족성 ALS 및 산발적 ALS 포함), 픽병, 치매, 우울증, 수면 장애, 정신병, 간질, 정신분열증, 편집증, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 기억상실 증후군, 진행성 핵상 마비, 뇌종양, 두부 외상 및 라임병이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 초기에 제조된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 올리고뉴클레오티드 서열의 무작위 세트의 반복적인 선택에 의해 제조된다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 올리고뉴클레오티드 서열의 무작위 세트의 반복적 역-선택에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 올리고뉴클레오티드 서열의 무작위 세트의 반복적 선택 및 반복적 역-선택을 번갈아 수행하여 제조된다.
일 구현예에서, 반복적 선택은 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 적어도 1회 라운드, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 선택을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 선택이 상이한 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다. 일 구현예에서, 각 라운드의 선택은 또 다른 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다.
일 구현예에서, 반복적 역-선택은 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 적어도 1회 라운드, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 역-선택을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 역-선택이 상이한 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다. 일 구현예에서, 각 라운드의 역-선택이 또 다른 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리의 제조는 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 적어도 1회 라운드, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 교대하는 반복적 선택 및 반복적 역-선택을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 교대하는 반복적 선택 및 반복적 역-선택은 상이한 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다. 일 구현예에서, 교대하는 반복적 선택 및 반복적 역-선택의 각 라운드는 또 다른 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 수행된다.
신체 조직의 예시에는 뇌, 심장, 폐, 근육, 내장, 위, 신장, 피부, 생식선, 신경 세포, 각막, 망막 및 기타 눈의 구조, 힘줄, 뼈, 골수, 손톱-계 세포, 연골, 태반과 같은 비-태아 출산 관련 조직, 제대, 포피, 내강의 표면, 혈관 조직, 췌장, 비장, 부신, 갑상선 및 뇌하수체가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 신체 조직은 생검 샘플이다.
체액의 예시에는 혈액, 혈장, 혈청, 점액, 타액, 소변, 땀, 우유, 림프액, 뇌척수액, 복막액, 심낭액, 흉막액, 윤활액, 생리액, 정액 및 질액이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 혈액이다. 바람직한 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 뇌이다. 바람직한 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 뇌 생검 샘플이다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 1 내지 1011개 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 65 내지 100개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 66 내지 99개 뉴클레오티드, 67 내지 98개 뉴클레오티드, 68 내지 97개 뉴클레오티드, 69 내지 96개 뉴클레오티드, 70 내지 95개 뉴클레오티드, 71 내지 94개 뉴클레오티드, 72 내지 93개 뉴클레오티드, 73 내지 92개 뉴클레오티드, 74 내지 91개 뉴클레오티드, 75 내지 90개 뉴클레오티드, 76 내지 89개 뉴클레오티드, 77 내지 88개 뉴클레오티드, 78 내지 87개 뉴클레오티드, 79 내지 86개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 5'에서 3'으로 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 5' 공지의 프라이머 인식 서열 영역,
- 무작위 영역, 및
- 3' 공지의 프라이머 인식 서열 영역.
일 구현예에서, 무작위 영역은 20 내지 60개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 22 내지 58개, 24 내지 56개, 26 내지 54개, 28 내지 52개, 30 내지 50개, 32 내지 48개, 34 내지 46개, 36 내지 44개, 38 내지 42개의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 무작위 영역은 40개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 공지의 프라이머 인식 서열 영역은 10 내지 35개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 12 내지 33개, 14 내지 31개, 16 내지 29개, 18 내지 27개, 20 내지 25개 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 무작위 영역은 23개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 공지의 프라이머 인식 서열 영역은 서열번호: 47 및 48의 서열로부터 선택된다.
Figure pct00001
올리고뉴클레오티드 서열의 예시가 서열번호: 1로 제공된다:
5'AACTACATGGTATGTGGTGAACT(N40)GACGTACAATGTACCCTATAGTG-3' (서열번호: 1),
여기서 N은 A, T, C, G, U 또는 임의의 변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리 내 각각의 올리고뉴클레오티드 서열의 빈도는 약 1 내지 약 1.000.000의 범위이다.
일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 기준 대상체로부터 미리 취해졌고, 즉, 본 발명의 용도 및 방법은 기준 대상체로부터 상기 신체 조직 또는 체액을 회수하는 단계를 포함하지 않는다. 결과적으로 이 구현예에 따르면, 본 발명의 용도 및 방법은 비-침습적 용도 및 방법, 즉 시험관 내 용도 및 방법이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기준 대상체"는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 대상체, 즉 이로 제한되는 것은 아니지만, 차등 진단, 패턴 인식, 진단 기준, 임상의 결정 지원-기반 시스템, 의료 알고리즘, 진단 워크업, 감각 환제, 광 간섭 단층 촬영기 및 본 발명의 임의의 용도 및 방법을 포함하는 의학적 진단에 의해 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된/되었던 대상체를 지칭한다.
일 구현예에서, 기준 대상체는 포유류, 바람직하게는 유인원, 더욱 바람직하게는 인간이다. 일 구현예에서, 기준 대상체는 남성이다. 일 구현예에서, 기준 대상체는 여성이다. 일 구현예에서, 기준 대상체는 20세 초과, 바람직하게는 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90세 이상 초과이다. 일 구현예에서, 기준 대상체는 30 내지 90세, 바람직하게는 40 내지 90세, 더욱 바람직하게는 50 내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 60 내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 70 내지 90세이다.
일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 실질적으로 건강한 기준 대상체로부터 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 건강한"은 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되지 않은/않았던 대상체를 지칭한다. 일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액은 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된/되었던 기준 대상체로부터 제공된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 몇몇 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액의 풀 (pool)에 대한 무작위 세트의 올리고뉴클레오티드 서열의 반복적 선택에 의해 제조된다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 몇몇 기준 대상체로부터 신체 조직 또는 체액의 풀에 대한 무작위 세트의 올리고뉴클레오티드 서열의 반복적 역-선택에 의해 제조된다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 몇몇 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액의 풀에 대한 무작위 세트의 올리고뉴클레오티드 서열의 교대하는 반복적 선택 및 반복적 역-선택에 의해 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신체 조직 또는 체액의 풀"은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 50개 이상의 기준 대상체로부터 제공된 신체 조직 또는 체액의 혼합물을 포함하는 샘플을 지칭한다. 일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액의 풀은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 50개 이상의 기준 대상체로부터 제공된, 본질적으로 유사 또는 동일한 조직 또는 체액을 포함한다. 일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액의 풀은 실질적으로 건강한 기준 대상체로부터 제공된다. 일 구현예에서, 신체 조직 또는 체액의 풀은 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된/되었던 기준 대상체로부터 제공된다.
바람직한 구현예에서, 신체 조직 또는 체액의 풀은 모두가 동일한 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은, 몇몇 개인으로부터의 동일한 유형의 생물학적 샘플을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 몇몇 개인으로부터의 동일한 유형의 신체 조직 또는 체액의 풀에 대한 반복적 선택에 의해 제조된다.
바람직한 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 영향을 받지 않은 몇몇 개인으로부터의 동일한 유형의 신체 조직 또는 체액의 풀에 대한 반복적 선택에 의해 제조된다.
선택이 생물학적 샘플 (즉, 신체 조직 또는 체액 또는 이의 풀)에 결합하는 올리고뉴클레오티드 서열의 보유를 나타내고 역-선택이 생물학적 샘플 (즉, 신체 조직 또는 체액 또는 이의 풀)에 결합하지 않는 올리고뉴클레오티드 서열의 보유를 나타냄은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 5년, 적어도 10년, 바람직하게는 무기한으로 유지된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 PCR 증폭을 통해 유지된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 진단 선택 없이 유지된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 화학적 합성에 위해 유지된다.
일 구현예에서, 앱타머 서열의 서브세트는 선택된 앱타머 라이브러리 내에서 식별되고 합성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 앱타머 서열을 "앱타 마커"라 부른다. 일 구현예에서, 앱타마커는 "가상의 (simulated) 선택 앱타머 라이브러리"를 형성하도록 조합될 수 있고, 상기 가상의 선택 앱타머 라이브러리는 공지의 상대 빈도로 공지의 앱타마커를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 분석하는 추가 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리의 분석은 각각의 앱타머 서열의 특성, 양 및/또는 상대 빈도의 결정을 포함한다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리의 분석은 상기 라이브러리를 차세대 시퀀싱 (NGS), qPCR, 안티센스 서열 혼성화 또는 정량적 리가제 연쇄 반응 (qLCR)에 적용하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 NGS 분석에 적용된다. 선택된 앱타머 라이브러리로부터 NGS 분석에 의해 포착된 각 서열의 카피수가 결정된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 카피수가 결정된다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 카피수가 결정된다. 일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 카피수는 상기 카피수를 상기 라이브러리에서 관찰된 앱타머 서열의 총수로 나눔으로써 결정된다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 빈도는 각 앱타머 서열의 관찰된 수를 그 앱타머 라이브러리에 대해 관찰된 서열의 총수로 나눔으로써 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 적어도 1개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 추가 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 적어도 2개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 추가 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 추가 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된다/되었다. 일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태가 발병할 위험이 있다. 일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되지 않는다/않았다. 일 구현예에서, 적어도 2개 이상의 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된다/되었다. 일 구현예에서, 적어도 2개 이상의 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태가 발병할 위험이 있다. 일 구현예에서, 적어도 2개 이상의 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되지 않는다/않았다. 일 구현예에서, 적어도 2개 이상의 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된/되었던 적어도 1개의 대상체 및 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되지 않은/않았던 적어도 1개의 대상체를 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 2개 이상의 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되고/되었고 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태의 상이한 단계 또는 시기를 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 "진단 대상체"로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 추가 단계를 포함한다. 용어 "진단 대상체"는, 본원에 사용된 바와 같이, 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 조사되고 있는 대상체를 지칭한다.
일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단된다/되었다. 일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태가 발병할 위험이 있다. 일 구현예에서, 대상체는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태로 진단되지 않는다/않았다. 바람직하게는, 본원에 사용된 바와 같이, "진단 대상체"는 조사 중인 의학적 상태, 질환 또는 병태가 발병할 위험이 있거나 그로 진단되지 않는다/않았다.
일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 포유류, 바람직하게는 유인원, 더욱 바람직하게는 인간이다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 남성이다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 여성이다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 20세 초과, 바람직하게는 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90세 이상 초과이다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 30 내지 90세, 바람직하게는 40 내지 90세, 더욱 바람직하게는 50　내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 60 내지 90세, 더 더욱 바람직하게는 70 내지 90세이다.
일 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태에는 신경퇴행성 질환, 신경계 질환, 암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 감염, 염증 질환 및 대사 질환이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
신경퇴행성 질환의 예시에는 알츠하이머병, 경도 인지 장애 (MCI), 기억 기능 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위측성 측색 경화증 (ALS) (가족성 ALS 및 산발적 ALS 포함), 픽병, 치매, 우울증, 수면 장애, 정신병, 간질, 정신분열증, 편집증, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 기억상실 증후군, 진행성 핵상 마비, 뇌종양, 두부 외상 및 라임병이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 의학적 상태, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다.
일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대한 약물을 받고 있지 않다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 알츠하이머병에 대한 약물을 받고 있지 않다.
일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 의학적 상태, 질환 또는 병태를 위한 약물을 받고 있다. 일 구현예에서, 대상체 또는 진단 대상체는 알츠하이머병에 대한 약물을 받고 있다.
알츠하이머병 약물의 예시에는 아세틸콜린에스테라제 저해제, NMDA 수용체 길항제 및 항체가 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
아세틸콜린에스테라제 저해제의 예시에는 도네페질 (Aricept®, Namzaric®), 리바스티그민 (Exelon®), 갈란타민 (Razadyne®), 휴페르진 A 및 타크린 (Cognex®)이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
NMDA 수용체 길항제의 예시에는 메만틴 (Axura®, Ebixa®, Namenda®, Namzaric®)이 포함되지만, 이로 제한되지 않는다.
항체의 예시에는 Aβ에 대한 단일클론 항체 (예컨대, 아두카누맙, 바피네우주맙, 크레네주맙, 간테네루맙, 포네주맙, 솔라네주맙) 및 면역글로불린 요법 (예컨대, Gammagard®, Flebogamma®)이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 알츠하이머병 약물은 기관-승인된 약물, 즉 식품의약국 (Food and Drug Administration, FDA - 미국), 유럽 의약품 기구 (European Medicines Agency, EMA - 유럽연합), 의약품 및 의료기기 기구 (Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, PMDA - 일본), 중국 식품의약국 (China Food and Drug Administration, CFDA- 중국) 및 식품의약안전처 (Food Ministry of Food and Drug Safety, MFDS - 한국)로 구성된 군으로부터 선택되는 국가 또는 지역의 약물 기관에서 승인한 약물이다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리는 하위샘플로 분취된다. 일 구현예에서, 각각의 선택된 앱타머 라이브러리 하위샘플은 선택된 앱타머 라이브러리의 제조 시 초기 선택에 사용된 기준 대상체로부터의 샘플보다는 동일한 유형의 생물학적 샘플 (즉, 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액)과 접촉된다. 다시 말해, 각각의 선택된 앱타머 라이브러리 하위샘플은 개별 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉된다. 즉, 선택된 앱타머 라이브러리는 선택 과정에서 몇몇 상이한 개별 생물학적 샘플 (즉, 신체 조직 또는 체액)에 적용된다. 이러한 방식으로 샘플링된 개인의 수는 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플 (즉, 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액)은 환자 샘플이 접수됨에 따라 시간이 지나면서 지속적으로 처리된다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 적어도 하나의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리의 수득은 선택된 앱타머 라이브러리로부터 대상체 또는 진단 대상체의 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 이러한 선택으로부터 유래한 앱타머 라이브러리는 "대상체 -특이적 앱타머 라이브러리" 또는 "환자-특이적 앱타머 라이브러리"로 언급되고, 선택은 "진단 선택"으로 언급된다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 적어도 하나의 에피토프, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개 이상의 에피토프, 바람직하게는 병리학적 에피토프에 특이적인 앱타머 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 대상체 또는 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해, 상기에 기술된 바와 같은 선택된 앱타머 라이브러리의 올리고뉴클레오티드 서열의 선택에 의해 수득된다. 일 구현예에서, 진단 선택은 대상체 또는 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대한 단일 라운드의 선택을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 대상체 또는 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해, 상기에 기술된 바와 같은 선택된 앱타머 라이브러리의 올리고뉴클레오티드 서열의 반복적 선택에 의해 수득된다. 일 구현예에서, 반복적 진단 선택은 대상체 또는 진단 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 적어도 1회 라운드, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50회 라운드 이상의 선택을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 1 내지 1011개 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 65 내지 100개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 66 내지 99개 뉴클레오티드, 67 내지 98개 뉴클레오티드, 68 내지 97개 뉴클레오티드, 69 내지 96개 뉴클레오티드, 70 내지 95개 뉴클레오티드, 71 내지 94개 뉴클레오티드, 72 내지 93개 뉴클레오티드, 73 내지 92개 뉴클레오티드, 74 내지 91개 뉴클레오티드, 75 내지 90개 뉴클레오티드, 76 내지 89개 뉴클레오티드, 77 내지 88개 뉴클레오티드, 78 내지 87개 뉴클레오티드, 79 내지 86개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 5'에서 3'으로 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 5' 공지의 프라이머 인식 서열 영역,
- 무작위 영역, 및
- 3' 공지의 프라이머 인식 서열 영역.
일 구현예에서, 무작위 영역은 20 내지 60개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 22 내지 58개, 24 내지 56개, 26 내지 54개, 28 내지 52개, 30 내지 50개, 32 내지 48개, 34 내지 46개, 36 내지 44개, 38 내지 42개의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 무작위 영역은 40개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 공지의 프라이머 인식 서열 영역은 10 내지 35개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 12 내지 33개, 14 내지 31개, 16 내지 29개, 18 내지 27개, 20 내지 25개의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 무작위 영역은 23개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 공지의 프라이머 인식 서열 영역은 서열번호: 47 및 48의 서열로부터 선택된다.
Figure pct00002
올리고뉴클레오티드 서열의 예시가 서열번호: 1로 제공된다:
5'AACTACATGGTATGTGGTGAACT(N40)GACGTACAATGTACCCTATAGTG-3' (서열번호: 1),
여기서 N은 A, T, C, G, U 또는 임의의 변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 각 올리고뉴클레오티드 서열의 빈도는 약 1 내지 약 1.000.000의 범위이다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 분석하는 추가 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리의 분석은 각 앱타머 서열의 특성, 양 및/또는 상대 빈도의 결정을 포함한다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리의 분석은 차세대 시퀀싱 (NGS), qPCR, 안티센스 서열 혼성화 또는 정량적 리가제 연쇄 반응 (qLCR)에 상기 라이브러리의 적용을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 NGS 분석에 적용한다. 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터 NGS 분석에 의해 포착된 각 서열의 카피수가 결정된다.
실제로, 선택된 앱타머 라이브러리는 대상체 또는 진단 대상체로부터의 개별 생물학적 샘플 (즉, 신체 조직 또는 체액)에 대한 진단 선택에 적용될 것이다. 그 후에 대상체-특이적 앱타머 라이브러리는 NGS 분석에 적용될 것이고 라이브러리 내 앱타머 서열의 상대 빈도가 결정될 것이다. 일 구현예에서, 진단 앱타머의 상대 빈도는 NGS 분석 이외의 방법, 예컨대 정량적 PCR 분석, 안티센스 서열에 대한 혼성화, 또는 정량적 LCR 분석을 통해 결정될 것이다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 카피수가 결정된다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 카피수가 결정된다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 카피수는 이 카피수를 상기 라이브러리에서 관찰된 앱타머 서열의 총수로 나눔으로써 결정된다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열의 상대 빈도는 주어진 앱타머의 관찰된 카피수를 그 라이브러리에서 관찰된 앱타머의 총수로 나눔으로써 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이의 상태 빈도의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
라이브러리 내 앱타머의 상대 빈도는 앱타머의 전체 시스템에 대한 선택 과정의 함수이다. 따라서, 앱타머의 상대 빈도의 변화는 앱타머 자체에 대해서가 아닌 전체 라이브러리에 대한 선택의 함수이다.
선택된 앱타머 라이브러리가 시퀀싱 분석에서 관찰되지 않았던 서열을 함유할 수 있고, 라이브러리 내 이들 서열의 존재가 임의의 주어진 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 임의의 앱타머의 빈도 변화와 관련이 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 공지되고 특성화된 앱타머 서열만이 공지된 비율로 조합된 선택된 앱타머 라이브러리의 서브세트에 의해 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 서열의 상대 빈도는 선택된 앱타머 라이브러리 내 앱타머 서열의 상대 빈도와 비교되고, 그로써 앱타머 상대 빈도의 변화를 결정할 것이다. 일 구현예에서, 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 서열의 상대 빈도는 적어도 하나의 다른, 적어도 2개의 다른, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 다른 대상체-특이적 앱타머 라이브러리의 상대 빈도와 비교되고, 그로써 앱타머 상대 빈도의 변화를 결정할 것이다. 일 구현예에서, 앱타머 빈도의 변화는 바이오마커 측정이다.
일 구현예에서, 선택된 앱타머 라이브러리 및 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 둘 다에서 관찰된 각 앱타머 서열에 대한 앱타머 상대 빈도의 변화는 각 대상체-특이적 앱타머 라이브러리의 앱타머의 상대 빈도를 선택된 앱타머 라이브러리 내 동일한 앱타머의 상대 빈도로 나눔으로써 결정된다. 일 구현예에서, 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에서 관찰된 각 앱타머 서열에 대한 앱타머 상대 빈도의 변화는 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머의 상대 빈도를 또 다른 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 동일한 앱타머의 상대 빈도로 나눔으로써 결정된다.
일 구현예에서, 상대 빈도의 비교는 공-분산 특성화를 포함한다.
공-분산을 특성화하는 다수의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상관관계 분석과 같은 이러한 방법의 예시가 본 출원의 실시예에 제공된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 1개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 2개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 앱타머 상대 빈도의 공분산 분석은 기준 및 진단 대상체에 걸쳐 어떤 앱타머가 공변 (co-vary)하는지, 그리고 기준 및 진단 대상체에 걸쳐 어떤 앱타머가 공변하지 않는지를 결정하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 앱타머 상대 빈도의 공분산 분석은 공지된 결과의 대상체 및 진단 대상체에 걸쳐 어떤 앱타머가 공변하는지, 그리고 공지된 결과의 대상체 및 진단 대상체에 걸쳐 어떤 앱타머가 공변하지 않는지를 결정하는데 사용된다. 공변하는 앱타머가 동일한 병리학적 실체에 결합하고, 공변하지 않는 앱타머가 동일한 병리학적 실체에 결합하는 않는다는 것이 합리적 가정이다.
일 구현예에서, 앱타머 중에서 상대 빈도 변화의 공분산은 다중 대상체-특이적 앱타머 라이브러리에 걸친 표준 공분산 분석 과정을 통해 평가된다.
일 구현예에서, 앱타머는 공분산 분석에 기초하여 각각에 대해 클러스터화된다.
일 구현예에서, 각 앱타머 클러스터로부터의 대표적인 앱타머가 공지의 결과의 대상체 중에서 차이를 특성화하는데 사용된다.
일 구현예에서, 상대 빈도의 비교는 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 환자로부터의, 바람직하게는 질환의 진행 단계로부터의 샘플과, 병리에 영향을 받지 않은 개인으로부터의 샘플 사이에서 이루어진다. 이 정보는 진단 관련성을 갖는 앱타머를 정의하는데 사용된다. 이러한 앱타머를 "앱타마커"라 부른다.
일 구현예에서, 거리 매트릭스는 상관관계 값으로부터 도출되어 공변하는 앱타머 클러스터의 시각화를 가능케 한다.
병리에 영향을 받지 않은 개인으로부터의 생물학적 샘플 (즉, 실질적으로 건강한 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액)을 포함시키면, 병리에 영향을 받은 개인과 병리에 영향을 받지 않은 개인 사이에 일관된 구분을 제공하는 그러한 병리학적 앱타머의 클러스터를 식별하는 것이 가능하다. 앱타머 빈도의 변화 분석은 그의 의학적 상태가 공지되지 않은 진단 대상체로부터의 생물학적 샘플의 동일한 분석을 통해 병리의 진단 기초를 제공한다.
또한, 특정 병리학적 실체가 병리에 영향을 받은 모든 개인에서 공유되지 않을 수 있음이 입증된다. 이러한 병리학적 실체의 상대적 풍부도는 개인에 걸쳐 병리학적 실체를 정의하는 앱타머 클러스터의 공분산을 분석함으로써 개인에 대해 특성화될 수 있다.
병리학적 실체의 상대적 풍부도에서 변화의 특성화는 그러한 실체의 정체성을 결정하는데 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체 (본원에서는 "진단 대상체"라고 부름)에 적용하고, 그로써 라이브러리 내 앱타머의 상대 빈도와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에 결정된 상관관계에 기초하여 진단을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
이들 바이오마커의 추가 용도는 진단을 위해 다른 대상체로부터의 생물학적 샘플에 대한 선택된 앱타머 라이브러리의 후속 적용을 포함할 것이다. 이 발명의 일 구현예는 선택된 앱타머 라이브러리 내 가장 빈번한 서열을 합성하고 상기 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰되는 것과 동일한 몰비로 이들을 조합하는 것이다. 이는 선택된 라이브러리를 단순화하고 이를 무기한으로 유지하는 수단으로서 제공될 것이다.
이 발명의 또 다른 구현예는 진단을 위해 다른 대상체로부터의 생물학적 샘플에의 선택된 앱타머 라이브러리의 후속 적용을 포함할 것이다. 이 발명의 일 구현예는 이들의 상대 빈도의 변동이 의학적 상태가 특성화된 대상체에서 의학적 상태 양에서의 변동과 상관되거나 이의 진단인 것으로 나타난 그러한 앱타머를 합성하는 것이다. 이러한 앱타머 서브세트는 상기 선택된 앱타머 라이브러리에서 관찰된 것과 동일한 몰비로 조합될 수 있다. 이는 선택된 라이브러리를 단순화하고 이를 무기한으로 유지하는 수단으로서, 그리고 분석을 단순화하는 수단으로서 제공될 것이다.
선택된 라이브러리로부터의 앱타머의 서브세트의 사용을 포함하는 이 발명의 구현예는 이러한 서브세트 내에서 앱타머의 동일한 몰 혼합물로 제한되지 않으며, 서브세트를 제조하는 다른 수단이 가능하지만, 임의의 제조 수단은 진단 도구로서 적용 전에 검증을 요구할 것이다.
본 발명의 다른 구현에는 포착된 서열의 총수와 관련하여 라이브러리 내 서열의 상대 빈도의 정규화, 또는 분석을 위해 라이브러리를 증폭하는데 요구되는 PCR 반응의 수, 또는 앱타머 서브세트의 상대 빈도, 또는 이들 정규화 방법의 일부 조합을 포함할 것이다. 본 구현예의 의도는 앱타머의 상대 빈도 추정치에 대한 NGS 분석 효과를 보정함으로써 분석 오류를 감소시키는 것이다.
이로 제한되는 것은 아니지만, 주성분 분석, k-클러스터링, 피어슨 상관관계 (Pearson correlation), 또는 Ward.D2 클러스터링을 포함하는 다양한 유형의 통계학적 분석이 앱타머의 클러스터링 정도 또는 관련된 수준을 평가하는데 사용될 수 있다.
도 1은 건강한 뇌조직에 대한 역선택과 함께 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 환자의 뇌조직에 대한 선택 라운드 #16 ("선택된 라이브러리")에서 앱타머 카피수의 분포를 보여주는 그래프이다. y 축은 선택 라운드 #16에서 각 서열의 관찰된 카피수를 설명한다. x 축은 각각의 관찰된 카피수가 관찰된 빈도를 설명한다.
도 2는 알츠하이머병을 갖는 5명의 개인으로부터의 7개 뇌조직 샘플 및 2명의 건강한 뇌조직 샘플에 대한 408개 앱타머의 공분산 분석을 보여주는 방사형 이웃-연결 트리 (neighbor-joining tree) 다이어그램이다. 이러한 이미지의 표현에서 개별 표지를 식별하기는 어렵지만, 이는 서열의 클러스터의 일반적인 특성만큼 중요하지 않다.
도 3은 뇌조직 샘플에 걸쳐 앱타머 빈도의 정규화된 변화를 보여주는 히스토그램이다. 이 분석을 위해 선택된 앱타머가 범례에 열거되어 있다. "H avg"는 건강한 샘플의 평균이다.
도 4는 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 환자들 중의 글로벌 관계를 보여주는 덴드로그램이다.
도 5는 알츠하이머 뇌조직 분석을 위해 클러스터 A로 지정된 앱타머 세트에 대한 선택 라운드 및 "환자 특이적 라이브러리" 사이에서 빈도의 정규화된 변화를 보여주는 히스토그램이다. 이 분석에 사용된 앱타머가 범례에 열거되어 있다. "H avg"는 건강한 샘플에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 6은 클러스터 A에 의해 기술된 병원성 에피토프의 상대적 풍부도에 대한 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 개인으로부터의 뇌조직 샘플들 사이의 거리를 나타내는 덴드로그램이다.
도 7은 클러스터 B로 지정된 앱타머 세트에 대한 선택 라운드 및 "환자 특이적 라이브러리" 사이의 빈도의 정규화된 변화를 보여주는 히스토그램이다. 이 분석에 사용된 앱타머는 범례에 열거되어 있다. "H avg"는 건강한 샘플에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 8은 클러스터 B에 의해 기술된 병원성 에피토프의 상대적 풍부도에 대한 알츠하이머병에 걸린 개인으로부터의 뇌조직 샘플들 사이의 거리를 나타내는 덴드로그램이다.
도 9는 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 환자 샘플에 걸친 혈청 분석으로부터 앱타머의 클러스터링을 나타내는 덴드로그램이다.
도 10은 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 환자에 대한 혈청 "환자 특이적 라이브러리"로부터 선택된 16개 코어 앱타마커 사이의 관계를 나타내는 덴드로그램이다.
도 11은 알츠하이머병에 대한 16개 혈청 앱타마커에 대해 "환자-특이적 앱타머 라이브러리"와 건강한 샘플 사이에서 상대 빈도의 변화의 비교를 보여주는 히스토그램이다.
도 12는 알츠하이머병에 대한 5개 혈청 앱타마커에 대해 각 환자와 건강한 샘플 사이에서 상대 빈도의 변화의 차이에 기초하여 개발된 알츠하이머병 점수와 각 환자의 임상적 평가 사이의 비교를 보여주는 히스토그램이다.
도 13은 동일한 대상체 (Ach 1)에 대한 두 번의 복제 분석 사이에서 10,000개 앱타머의 상대 빈도를 보여주는 산점도 (scatter plot)이다. x-축은 첫 번째 복제 분석에서 10,000개 앱타머의 상대 빈도를 나타내고 y-축은 두 번째 복제 분석에서 10,000개 앱타머의 상대 빈도를 나타낸다.
도 14는 상위 100개 앱타머의 상대 빈도의 재현가능성을 보여주는 산점도이다. 이 도면은 각 샘플 (y-축)에 대해 포착된 가장 적은 수의 서열 대 100개의 가장 고도로 농화된 앱타머의 상대 빈도 (x-축) 측면에서 복제에 걸쳐 샘플에 대해 수득된 회귀 계수의 비교를 제공한다.
도 15는 앱타머 빈도의 상대 변화 대 에피토프 농도의 변화를 보여주는 히스토그램이다.
도 16은 혈청에서 후기 알츠하이머병 (AD)의 엡타마커-기반 진단의 복제 분석 (Rep 1 및 Rep2)을 보여주는 히스토그램이다.
도 17은 알츠하이머병을 진단하기 위해 일반적으로 사용되는 인지 검사 MMSE (Mini-Mental State Examination)와 비교할 때 앱타마커 점수의 관련성을 보여주는 산점도이다.
도 18은 앱타마커 점수를 기초로, 실질적으로 건강한 대상체 및 알츠하이머병 환자 사이의 전반적인 차이를 보여주는 박스 플롯이다.
도 19는 무작위 AIBL 샘플에 대해, 혈청에서 후기 알츠하이머병 (AD)의 엡타마커-기반 진단의 복제 분석 (Rep 1 및 Rep2)을 보여주는 히스토그램이다.
도 20은 2개 복제의 평균값을 보여주는 2개의 히스토그램이다: (A) 도 16; 및 (B) 도 19.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 더 상세히 설명된다.
실시예 1: 알츠하이머병에 대한 뇌조직 분석
뇌조직 샘플은 Charles Duyckaerts 교수의 지시에 따라 파리 소재의 파티에 살페트리에 병원 (
Figure pct00003
)에 있는 알츠하이머병 뇌 은행으로부터 친절하게 준비되고 제공되었다.
임의의 주어진 선택 라운드 후 선택 라이브러리가 얼마나 많은 서열을 함유하고 있는지는 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 선택 라운드 #16 후 라이브러리의 분취량의 NGS 분석으로 총 2,337,575개의 무작위 앱타머 서열을 관찰할 수 있었다.
도 1은 선택 라운드 #16 후에 관찰된 2,337,575개 서열의 카피수의 분포를 제공한다. 본 발명자들은 이 실시예에 대해 "선택된 라이브러리"에서 이 마지막 선택 라운드 후 앱타머의 포함을 위한 최소 컷-오프로 5×10-6의 빈도를 선택하였다. 카피수의 분포는 라이브러리의 복잡성에 대한 척도를 제공한다.
그 후에 "선택된 라이브러리"를 진단 선택 도중에 개별 샘플의 분석에 사용하였다. 이 실시예에서, 개별 뇌조직 샘플에 대한 앱타머의 선택된 라이브러리의 제1 선택 라운드는 "진단 선택"으로 간주되고, "진단 라이브러리"를 제공한다.
분석에 사용된 뇌조직은 알츠하이머병으로 사망한 5명의 남성 환자 (브락 (Braak) 병기 단계에 따른 VI 단계; Thal 아밀로이드 5상; 평균 사망 연령: 77.2세 [69세부터 87세까지])로부터의 PMDc (전운동 등쪽, 꼬리) 대뇌 피질 뇌조직으로 구성되었다. Aβ 플라크 및 tau 뭉침의 존재가 각 샘플에서 확인되었다. 하나의 샘플이 복제되었다. 본 발명자들은 또한 2개의 개별적인 건강한 뇌조직 샘플을 포함시켰다. 이들 샘플은 2개의 건강한 샘플이 2명의 상이한 개체로부터 왔기 때문에 병리학적 샘플의 복제가 그러한 것과 동일한 방식으로 복제를 나타내지 않는다. 분석을 위해, 이들 2개의 건강한 샘플의 평균을 사용하였다.
본 발명자들은 진단 선택 내에서 분석을 위해 선택된 라이브러리로부터 앱타머의 포함을 위한 최소 컷-오프로 5×10-6의 빈도를 선택하였다. 이는 1050개 서열을 나타낸다.
이들 1050개 서열 중에서, 408개가 적어도 6개의 진단 라이브러리에서 관찰되었다. 그 후에 이들 408개 서열을 추가 분석을 위해 선택하였다.
본 발명자들은 개별 빈도를 전체 세트에 대한 평균 빈도로 나누어 각각의 라이브러리에서 이들 408개 앱타머의 상대 빈도를 정규화하였다. 그 후에 본 발명자들은 각각의 "대상체-특이적 앱타머 라이브러리" 내 정규화된 빈도를 "선택된 앱타머 라이브러리" 내 정규화된 빈도로 나누었다. 이는 7개의 뇌조직 샘플 각각에 대해 408개 앱타머 각각에 대한 정규화된 변화 값의 데이터 세트를 제공한다.
본 발명자들은 하기 식에 따라서 앱타머에 대한 공분산 분석을 수행한다:
Figure pct00004
여기서:
-
Figure pct00005
는 각각의 뇌조직 샘플 내 모든 408개 앱타머에 대한 평균 값이고,
- sx 및 sy는
Figure pct00006
의 표준 편차이고,
- xi 및 yi는 개별 앱타머 값이다.
이는 408×408 값의 상관관계 매트릭스를 생성한다. 본 발명자들은 항등식 (unity) 값으로부터 각 값을 공제함으로써 이를 거리 매트릭스로 전환한다. 거리 매트릭스는 Newick 공식으로 변환되고, 이는 Trex 온라인 프로그램 (http://www.trex.uqam.ca/index.php?action=matrixToNewick&project=trex)을 이용해 관계를 시각화하는데 사용된다.
모든 408개 앱타머 사이의 전체 관계가 도 2에 제공된다. 앱타머의 명확한 클러스터링이 관찰되었다.
이들 앱타머 중 일부를 환자에 걸쳐 이 접근법의 진단 능력을 입증하기 위해 선택하였다. 이들 앱타머 각각에 대해 관찰된 변화율 데이터가 도 3에 제공되고, 환자의 공분산 분석 후 공간 관계가 도 4에 제공된다. 평균 및 표준 편차 값이 각각의 생물학적 샘플에 대해 결정되었음을 제외하고는, 환자의 공분산 분석을 앱타머의 공분산 분석과 동일한 방식으로 수행하였다.
"Den" 샘플의 2개 복제물이 선택된 라이브러리로부터 동일한 정규화된 변화를 나타내었음이 도 4로부터 명확하다. 건강한 샘플로부터의 샘플의 거리가 다르다는 것 역시 명확하다. 이것이 반드시 질환의 중증도의 차이로서 간주되어서는 안된다. 보다 합리적인 해석은 이들 환자가 단순히 질환에 대해 다른 병리학적 에피토프를 나타내며, 이들의 일부는 다른 것보다 더 많은 이러한 에피토프를 나타낸다는 것이다. 실제로, 모든 환자는 말기 알츠하이머병으로 고통 받았다.
각 클러스터는 상이한 병리학적 에피토프를 기반으로 한다. 이는 서로 다른 앱타머 클러스터에 대해 수행된 분석에 의해 증명된다. 앱타머 클러스터 A에 대한 변화율이 도 5에 제시되고 이 병원성 에피토프에 대한 환자 사이의 관계를 설명하는 덴드로그램이 도 6에 제시된다. 앱타머 클러스터 B에 대한 동일한 정보가 각각 도 7 및 8에 제시된다.
클러스터 A의 경우, 환자 "Boy"는 건강한 샘플보다 이 병원성 에피토프를 훨씬 더 많이 나타내지 않았다. 클러스터 B의 경우, 환자 "Sti"는 건강한 샘플보다 훨씬 더 많은 병원성 에피토프를 나타내지 않았다. 이는 이들 앱타머 클러스터가 다른 표적 실체에 결합한다는 것을 분명히 보여준다. 이는 또한 환자들이 그들의 병원성 에피토프의 상대적 풍부도에서 다르다는 것을 명백히 증명한다. 특정 경우에, 이러한 변동은 특정 병원성 에피토프에 대한 이환된 환자 및 건강한 개인 사이에 차이가 없음을 나타낸다.
실시예 2: 알츠하이머병에 대한 혈청 분석
환자 샘플을 파리 소재의 파티에 살페트리에 병원에서 IFRAD 코호트로부터 친절하게 제공받았다. 이들은 Bruno Dubois 교수가 이끄는 병원 내 임상의 팀에 의해 알츠하이머병에 대해 평가된 환자들로부터 도출되었다. P1 내지 P3 및 P9로 표지된 환자들은 말기 알츠하이머병을 나타내었다. P4 내지 P8로 표지된 환자는 중반 내지 초기 알츠하이머병 증상을 나타내었다. 건강한 혈청 샘플은 Sigma Aldrich Chemicals로부터 구입하였다.
실시예 1에서 사용된 라이브러리에 대한 설명과 동일한 DNA 앱타머 라이브러리의 반복적 선택이 이 실시예에 사용되었다. FRELEX라 불리는 독점적 앱타머 선택 과정이 캐나다의 NeoVentures Biotechnology로부터의 라이센스 하에서 이 분석 전체에서 사용되었다 (국제특허공개 WO2017035666). 이 과정은 표적 분자의 고정화에 대한 요구를 회피한다. 라이브러리를 모두 4명의 후기 AD 환자로부터의 혈청 풀에 대한 23회 라운드의 반복적 선택에 적용하였다. 역 선택을 Sigma Aldrich로부터 구입한 건강한 혈청 샘플에 대해 수행하였다.
선택 라운드 #16 내지 #23을 차세대 서열 (NGS) 분석으로 분석하였다. 400개 앱타머 서열의 복합 세트를 높은 카피수 및 하나의 선택에서 다음 선택으로의 보존에 기초하여 선택하였다.
선택 라운드 #23으로부터 "선택된 라이브러리"를 분취하고 개별적으로 9명의 환자 각각으로부터의 혈청뿐만 아니라 건강한 혈청의 2개 복제물에 대한 선택에 적용하였다. 각각의 선택은 반복되었지만, 환자 샘플 6 및 7의 경우에는, 제1 선택 라운드 후 불충분한 양의 라이브러리가 회수되어 제2 선택 라운드를 가능케 하였다. 이렇게 선택된 라이브러리를 "환자 특이적 라이브러리"로 지정하고 모두 NGS 분석에 적용하였다.
4명의 후기 AD 환자 및 2명의 건강한 환자에 걸친 상위 400개 서열의 공분산 분석이 도 9에 제시된다. 이들 "환자 특이적 라이브러리" 각각과 "선택된 라이브러리" (즉, 선택 라운드 #23으로부터의 라이브러리) 사이에서 상대 빈도의 변화에 대해 상관관계 분석을 수행하였다. 다수의 서열 클러스터가 관찰되었음이 분명하고, 이는 본 발명의 앱타머 라이브러리가 혈청 내 여러 가지 다른 병리학적 에피토프에 결합하였음을 나타낸다. 이들 서열 중 16개의 서브세트는 400개 앱타머 세트를 특징으로 하는 에피토프의 범위를 나타내는 것에 기초하여 선택되었다. 4명의 후기 AD 환자 및 2명의 건강한 라이브러리 샘플에 대한 이 16개 앱타머의 서브세트의 공분산 분석이 도 10에 제공된다. 본 발명자들은 이들 16개 앱타머를 "앱타마커 (AptaMarkers)"로 명명한다.
혈청 진단의 핵심은 알츠하이머병 환자와 건강한 개인 사이의 상대 빈도의 변화를 비교하는 것이다. 도 11에서, 본 발명자들은 9명의 알츠하이머병 환자 각각에서 16개 앱타마커 각각의 상대 빈도를 건강한 샘플 내 상대 빈도로 나눈 그래픽 지문을 제공한다. 이들 환자 각각에 기안한 임상 정수가 표 1에 제공된다. 임상 점수 값이 낮을수록, 질환의 중증도가 더 커지며, 최대 점수 30은 질환에 영향을 받지 않은 개인을 나타낸다.
이 실시예에 사용된 9명의 알츠하이머병 환자의 임상 점수.
환자 임상 점수 (MMS)
P1 0
P2 1
P3 2
P4 19
P5 18
P6 19
P7 25
P8 19
P9 3
이는 상대 빈도의 변화 규모를 제거하고 이를 후기 알츠하이머병 환자와 건강한 샘플 사이의 차이 규모로 대체하기 때문에, 이는 차이를 묘사하는 유용한 수단이다.
후기 알츠하이머병 환자에서 큰 증가를 나타내는 이들 앱타마커는 아마도 건강한 환자에 비해 후기 알츠하이머병 환자에서 농화된 에피토프를 나타낼 것이다.
이러한 차이가 환자들에 걸쳐 완전히 일치하지 않는다는 점이 흥미롭다. 즉, 특정 앱타마커는 특정 환자와 건강한 샘플 사이에서 현저한 차이를 보이는 반면, 동일한 차이가 다른 환자를 이용한 동일한 앱타마커에 대해서는 분명하지 않다. 예를 들어, 앱타마커 L3은 환자 1에 대해서 건강한 샘플과 현저히 다르지 않은 반면, 환자 2 및 3에 대해서는 그렇다. 앱타마커 L14는 환자 2에 대해서 건강한 샘플과 현저한 차이를 보이지 않는 반면, 환자 1 및 3에 대해서는 그렇다. 앱타마커 L16은 단지 환자 3 및 건강한 샘플 사이에서 현저한 차이를 나타내고, 다른 2명의 환자에 대해서는 그렇지 않다. 이는 아마도 이들의 병리의 결과로서 이들이 나타내는 에피토프에 대한 환자간의 차이 때문일 것이다. 이러한 관찰로부터 본 발명자들은 알츠하이머병의 적절한 진단을 가능케 하기 위해 여러 앱타마커를 사용할 필요가 있는 것으로 결론 내렸다.
본 발명의 핵심 적용은 환자에서 알츠하이머병을 진단하기 위한 이 방법의 사용이다. 이는 적어도 2개의 앱타마커에 대한 "진단 라이브러리"와 "선택된 라이브러리" 사이의 농화율이 건강한 샘플에 대한 이들 2개의 동일한 앱타마커에 대한 농화율보다 훨씬 더 높다는 것을 입증함으로써 달성될 수 있다.
임상 점수 (MMI)에 기초한 병리의 덜한 진행을 나타내는 환자가 또한 건강한 샘플에 비해 앱타마커의 상대 빈도의 변화에서 더 적은 차이를 나타냄이 또한 도 11에서 명백하다.
본 발명자들은 표시된 값의 로그(10)로서 각 앱타마커에 대해 9명의 환자에 걸쳐 관찰된 도 11에 묘사된 앱타마커 중 최대값의 5개 (L2, L6, L12, L13 및 L15)의 상대 비율을 기반으로 알고리즘을 개발하였다. 이들 상대 비율의 평균을 AD 점수로서 각 환자에 대해 결정하였다. 각 환자에 대한 임상적 평가 값이 도 12에 AD 점수와 함께 제공된다. 모든 환자에서, 본 발명자들은 AD 점수와 임상 점수 사이에 0.78의 상관관계를 관찰하였다. 이 상관관계의 통계학적 유의성은 8의 자유도를 고려할 때 P > 0.98이다.
실시예 3: 확장된 인간 대상체 세트로부터의 혈청 분석
재료 및 방법
선택을 위한 ssDNA 라이브러리는 서열번호: 1로 개시된 바와 같은 프라이머 혼성화를 위한 2개의 불변 영역이 플랭킹된 40-mer 무작위 영역 (Trilink Biotechnologies, San Diego, CA, USA)으로 구성되어 있었다:
5'AACTACATGGTATGTGGTGAACT(N40)GACGTACAATGTACCCTATAGTG-3'
(서열번호: 1), 여기서 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다.
증폭에 사용된 프라이머는 IDT DNA technologies로부터 구매하였다.
신경심리학, 생활양식 및 기분 평가를 포함하는 코호트 모집 과정은 이전에 상세하게 설명된바 있다 (Ellis et al., Int Psychogeriatr. 2009 Aug; 21(4): 672-87). 간략하게는, AIBL 연구는 기준선에서 60세를 초과하는 총 1166명의 참가자를 모집했으며, 이들 중에서 54명은 동반 질환 또는 동의 철회로 인해 제외되었다. AD 진단을 위한 NINCDS-ARDA 국제 기준 (Tierney et al., Neurology. 1988 Mar; 38(3): 359-64) 및 MCI 진단을 위한 증상성 치매-전단계 기준 (Albert et al., Alzheimers Dement. 2011 May; 7(3): 270-9)을 사용하여, 임상 검토 패널은 각 평가 시점에서 질환 분류를 결정하여 참가자들 사이에서 정확하고 일관된 진단을 보정하였다. 이러한 진단 기준에 따라서, 참가자들을 3개 그룹 중 하나로 분류하였다; AD (알츠하이머병), MCI (경도 인지 장애), 또는 HCs (건강한 대조군). 기준선에서, 총 768명의 HCs, 133명의 MCI, 및 211명의 AD 대상체가 있었다.
AIBL 연구는 18개월 간격으로 참가자를 추적하는 전향적, 종단 연구이다. 이 특정 연구는 전체 연구 평가를 완료한 711명의 개인과 기준선, 18개월 및 36개월 추적 시점에서 해당 혈액 샘플 수집을 보고한다.
Austin Health, St. Vincent's Health, Hollywood Private Hospital, 및 Edith Cowan University의 기관 윤리 위원회가 AIBL 연구에 대한 윤리 승인을 부여하였다. 모든 지원자는 연구에 참여하기 전에 서명 동의서를 제공하였다.
이 연구에서 분석된 샘플이 표 2에 설명되어 있다.
MMSE 샘플 날짜 (월)
Neo ID 연령 샘플 1 샘플 2 샘플 1 샘플 2 PET 스캔/아밀로이드 라이브러 리 훈련 개별 분석
Ach -1 83 24 0 0 18 양성 S2
Ach -2 83 25 15 0 18 양성 S2
Ach -3 78 14 0 18 36 양성 S1 S2
Ach -4 62 14 5 0 18 양성 S2 S2
Ach -5 84 15 2 36 54 양성 S2
Ach -6 22 9 18 36 양성 S2 S2
Ach -9 74 22 13 18 36 양성 S2
Ach -10 62 16 3 18 36 양성 S2
Ach -11 64 24 12 18 36 양성 S2
Ach -12 62 16 4 18 36 양성 S2
Ach -13 71 22 11 0 18 양성 S2
Ach -15 71 13 4 18 36 양성 S2 S2
Ach -16 71 18 9 18 36 양성 S2 S2
Ach -17 71 21 11 18 36 양성 S2 S2
Ach -18 65 12 0 18 36 양성 S2 S2
Ach -44 80 17 16 18 36 양성 S2
Ach -19 71 30 30 90 108 음성 S1 S2
Ach -20 67 29 29 90 108 음성 S2
Ach -21 68 29 30 90 108 음성 S2
Ach -22 64 29 30 90 108 음성 S1 S2
Ach -23 75 29 30 72 90 음성 S2
Ach -24 69 30 30 54 72 음성 S2
Ach -25 66 30 29 90 108 음성 S2
Ach -26 65 28 30 90 108 음성 S1
Ach -27 62 29 30 90 108 음성 S1
Ach -28 62 29 30 90 108 음성 S1
Ach -29 62 30 30 72 90 음성 S2
간이 정신상태 검사 (Mini-Mental State Examination, MMSE)는 치매를 진단하기 위해 개발된 인지 검사이다 (Folsteinet al., J Psychiatr Res. 1975 Nov; 12(3): 189-98). 점수 30은 완전한 인지 능력을 나타내고, 이 값으로부터 점수의 감소는 인지 능력의 감소 및 알츠하이머병의 후기 단계와 상관이 있다.
샘플을 18-개월 간격으로 대상체로부터 얻었고, MMSE 검사를 각 대상체에 대해 각 샘플링 날짜에 수행하였다. 표 2에서, "샘플 1" 및 "샘플 2"는 18개월 간격으로 2회의 후속 샘플링 날짜를 설명한다. 이 시험에서 대상체가 등록한 시점으로부터의 개월 수가 "샘플링 날짜" 제목 아래에 각 샘플링 날짜에 대해 나열된다. "연령"이라는 제목의 열은 코호트 프로젝트의 시작 시 대상체의 연령을 제공한다. 따라서 샘플링 시점의 대상체의 연령은 상기 연령에 샘플링 날짜 열의 개월을 추가하여 제공된다.
본 발명자들은 양성 선택을 위해 "라이브러리 훈련" 열에 요약된 6명의 대상체 (후기 AD), 및 음성 선택을 위한 5명의 대상체 (건강함)로부터의 혈청 풀을 사용했다. 개별 분석을 위한 샘플은 마지막 열에 설명되어 있다. S1 및 S2는 "샘플 1" 및 "샘플 2", 즉 훈련 또는 분석에 사용되는 샘플의 샘플링 날짜를 나타낸다.
NeoNeuro SAS는 앱타머 라이브러리 선택을 위해 NeoVentures Biotechnology Inc.에서 본 연구를 위해 FRELEX 선택 시스템 (그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 국제특허공개 WO2017035666호에 기술됨)을 사용하도록 친절하게 허가되었다.
FRELEX는 티올화 무작위 8개 염기쌍 DNA 올리고뉴클레오티드 (이후, "8-mer"로 언급됨)로 코팅된 금 칩을 포함하는 고정화 필드의 준비를 요구한다. 8-mer를 50 μL의 인산염 완충 식염수 (PBS) (8.0　mM Na2PO4, 1.4 mM KH2PO4, 136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 10　μM의 농도로 용해시켰다. 이 용액을 실온 (RT)에서 1시간 동안 7×10×0.3 mm 크기의 금 표면 칩 (Xantec, Germany) 상에서 인큐베이션하였다. 그 후에 칩을 공기-건조시키고 티올-말단 폴리에틸렌 글리콜 (SH-PEG) 분자를 포함하는 50 μL의 용액을 부드럽게 진탕하면서 30분간 인큐베이션하였다. 이 단계는 8-mer로 커버되지 않는 임의의 나머지 금 표면을 차단한다. 이어서 SH-PEG를 16시간 동안 두 번째로 첨가하였다. 그 후에, SH-PEG 용액을 칩으로부터 제거하고 관능화된 금 칩 표면을 탈이온수로 세척하고 공기-건조시켰다.
이 연구에 사용된 FRELEX의 첫 번째 단계 (이하, "단계 I" 또는 "음성 선택 단계"로 언급됨)에서, 이전에 기술된 무작위 앱타머 라이브러리로부터의 1016개 서열 (서열번호: 1로 개시된 핵산 서열 포함)을 상기 라이브러리를 95℃로 10분간 가열한 후 이어서 빙조에 즉시 침지시켜 스냅-냉각시켰다. 이들 단일 가닥 (ss) DNA 서열을 50 μL의 선택 완충제 (10 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl)에서 30분간 실온에서 관능화된 고정화 필드 (8-mer로 코팅된 금 칩)와 함께 인큐베이션하였다. 나머지 용액을 제거하고 버렸다. 이는 너무 많은 2차 구조를 갖는 서열을 제거하여 표면상의 8-mer에의 결합을 가능케 한다. 고정화 필드를 50 μL의 10× TE 완충제로 2회 세척하고 나머지 결합된 올리고뉴클레오티드를 용리시키고 95℃에서 1 mL의 선택 완충제에서 각각 15분간 2회 인큐베이션으로 회수하였다. 이러한 용리액을 제조사에 의해 기술된 바와 같이 GeneJET PCR 정제 키트 (Thermo Fisher Scientific, Germany)를 사용하여 풀링하고 정제한 후 25 μL의 탈이온수로 용리시켰다.
FREELEX의 두 번째 단계 ("단계 II" 또는 "양성 선택 단계")에서, 8-mer에 결합하는 능력에 대해 선택된 이 앱타머 라이브러리를 총 50 μL 부피의 1X 선택 완충제 중의 후기 AD로부터의 혈청 풀로 양성 선택에 사용하였다. 이 용액을 15분간 인큐베이션한 후 실온에서 15분간 고정화 필드와 함께 인큐베이션하였다. 나머지 용액을 조심스럽게 회수하고 새 튜브에 보관하였다. 고정화 필드를 50 μL의 1× 선택 완충제로 2회 세척하는데 각각의 세척액을 수집하여 첫 번째 단계에서 제거된 용액과 풀링하였다. 아마도 이들이 그 대신에 혈청 내의 일부 모이어티에 결합되기 때문에, 이 용액은 고정화 필드에 결합하지 않은 서열을 포함한다. 이렇게 풀링된 용액을 FREELEX의 "단계 I"에 대해 기술된 바와 같이 정제하고, 400 μL로 용리시키고 적절한 수의 주기 동안 PCR 증폭에 적용하여 대략 5 ng의 증폭된 DNA의 명확한 밴드를 생성하였다.
제1 라운드의 선택 (즉, 단계 I 및 II) 후, PCR을 사용하여 적절한 수의 주기 동안 선택된 ssDNA를 이중 가닥 DNA (dsDNA)로 증폭하여 대략 5 ng의 증폭된 DNA의 명확한 밴드를 생성하였다. 모든 PCR 절차는 표준 분자생물학 프로토콜에 따라 다음 조건하에서 수행하였다:
- 95℃에서 5분,
- 95℃에서 10초의 x 주기,
- 55℃에서 15초,
- 72℃에서 30초,
- 이어서 72℃에서 5분간의 최종 신장.
이 과정에서, 본 발명자들은 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된 산물의 3' 말단에 T7 프로모터를 생성하였다. 그 후에, dsDNA를 55℃에서의 밤새 반응에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관 내 전사를 위한 주형으로 사용하여 안티센스 RNA 카피를 수득하였다. 전사된 안티센스 RNA를 DNase I으로 처리하고, RNeasy Minelute 클린업 (Qiagen)으로 정제하여 나머지 dsDNA 주형을 제거하였다. 그 후에 이 안티센스 RNA 라이브러리를 역전사 반응의 주형으로 사용하여 센스 가닥 cDNA 올리고뉴클레오티드를 수득하였다. cDNA-RNA 혼합물을 제조사의 지침에 따라 RNase H로 처리하여 나머지 안티센스 RNA 분자를 제거하였다. cDNA를 PCR 클린업 칼럼으로 정제하고 다음 라운드의 선택을 위한 주형으로 사용하였다.
본원에 기술된 선택 과정을 그 후에 몇 차례 라운드에서 반복하였다. 건강한 환자로부터의 혈청 풀이 음성 선택 단계 (FRELEX의 "단계 I")에 추가되는 것을 제외하고는 후속 선택 라운드가 동일한 방식으로 수행되었고, 여기서 본 발명자들은 고정화 필드에 결합하는 능력을 나타내는 앱타머를 선택한다. 건강한 혈청의 포함은 이 물질 내에 존재하는 표적에 결합하는 앱타머에 대한 선택을 가능케 한다. 이는 후기 인간 AD 혈액 풀에서 농화된 에피토프에 결합하는 앱타머를 효과적으로 선택하는 대조를 생성한다. 이 선택 과정을 총 10회 선택 라운드에서 반복하였다. 선택 라운드 #5 내지 #10으로부터의 분취량을 Illumina HiSeq 기기를 사용하여 어린이 병원 (Hospital for Sick Children, 토론토, 캐나다)에서 NGS 분석으로 분석하였다. 서열 분석을 NeoVentures Biotechnology Inc.의 독점 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
10번째 선택 라운드로부터 남은 앱타머 라이브러리 ("선택된 앱타머 라이브러리")를 이전에 기술된 바와 같이 증폭하고 cDNA로 전환시켰다. 200 ng의 cDNA를 FREELEX의 "단계 II" (즉, 후기 AD 단계 풀에 대한 라이브러리의 양성 선택 단계)와 동일한 방식으로 단일 "진단 선택"을 위해 각 개별 대상체로부터의 혈청에 적용하였다.
선택 후, 각각의 선택된 라이브러리를 캐나다 토론토 소재의 어린이 병원에서 Illumina HiSeq 기기를 사용하는 차세대 시퀀싱으로 분석하였다.
결과
일반적으로, 하나의 복제된 분석으로부터 다른 분석으로 앱타머의 상대 빈도의 재현성은 매우 중요한 회귀 값을 나타낸다. 도 13에서, 동일한 대상체 (Ach 1)에 대한 2개의 복제 분석 사이에서 10,000개 앱타머의 상대 빈도가 예시로서 제공된다.
각각의 NGS 과정에 의해 포착된 서열의 수는 이들 샘플로부터의 앱타머의 상대 빈도의 재현성에 영향을 미쳤다. 도 14는 선택 라운드 #10에서 가장 고도로 농화된 100개의 앱타머의 상대 빈도 (즉, 상위 100개 앱타머의 상대 빈도의 재현성) 측면에서 각 샘플에 대한 둘 중 하나의 복제에서 포착된 가장 적은 수의 서열과 복제에 걸쳐 샘플에 대해 수득된 회귀 계수의 비교를 제공한다.
본 발명자들은 포착된 서열의 수와 앱타머의 상대 빈도의 재현성 사이에 곡선 관계가 있는 것으로 추측하였다. 일관된 수준의 재현성을 보장하기 위해서 백 만개 이상의 서열을 분석할 필요가 있다. 이러한 이해를 바탕으로, 본 발명자들은 추가 분석에서 6개의 샘플을 제거하였다: 2개의 건강한 샘플 (Ach-20 및 24) 및 3개의 AD 샘플 (Ach-4, 16 및 44).
앱타머 각각의 상대 빈도는 시각적 비교를 위해 3차원 그래프로 플롯팅될 수 있다 (제시하지 않음). 그러나, 본 발명자들은 이러한 3차원 그래프에서 보이는 패턴을 점수로 정량화하는 방법을 개발할 필요가 있었다. 이를 위해, 본 발명자들은 가장 많은 정보를 제공하는 농화된 라이브러리에서 이러한 앱타머를 식별하는데 중점을 두었다.
라이브러리 내 앱타머는 두 그룹으로 분류될 수 있다: 이들이 결합하는 에피토프가 건강한 혈액 샘플과 AD 혈액 샘플 사이에서 변하는, 동적 (dynamic) 그룹, 및 이들이 결합하는 에프토프가 건강한 혈액 샘플과 AD 혈액 샘플 사이에서 변하지 않는, 불변 (constant) 그룹. 도 15는 이 점을 개략적으로 도시한다.
불변 앱타머는 동적 앱타머의 작용에 의해 영향을 받는다. 만약 동적 앱타머에 대한 에피토프가 주어진 혈액 샘플에서 더 높은 농도인 경우, 불변 앱타머는 감소를 나타낼 것이다. 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명의 앱타마 서열 데이터베이스는 두 유형의 앱타머를 모두 포함할 것이고, 두 유형은 모두 상대 빈도의 변화를 나타낼 것이다. 따라서 본 발명자들은 주어진 혈액 샘플에서, 동적 앱타머 쌍의 한 구성원은 상대 빈도가 증가하고 다른 구성원은 감소하는 동적 앱타머 쌍을 식별하고자 하였다.
개별 앱타머의 상대 빈도가 재현 가능하지만, 한 복제에서 다른 복제로의 작은 변화가 다른 클러스터에 지정된 앱타머에 현저하게 영향을 미칠 수 있다. 그 결과 본 발명자들은 앱타머의 동적 쌍을 식별함으로써 본 발명의 개선을 개발하였다. 본 발명자들은 동적 앱타머 쌍을, 하나의 상대 빈도를 다른 하나의 상대 빈도로 나누는 경우, 개인들 사이에서 유의미한 차이를 나타내는 앱타머 쌍으로서 정의한다. 하나의 앱타머가 상대 빈도에서 증가하는 반면 다른 앱타머는 감소하는 함수이거나, 또는 그 반대이다.
그러한 동적 쌍의 거동에 내재하는 생물학적 의미가 있을 수 있다. 단백질은 병리학적 상태에서 특정한 방식으로 중첩하여 앱타머가 결합하는 에피토프를 생성하고, 건강한 상태에서 다른 방식으로 중첩하여 동일한 앱타머가 이에 결합하지 않지만 다른 앱타머는 결합하게 하는 것이 예일 수 있다. 이 예에서, 병리학적 에피토프에 결합하는 앱타머는 상대 빈도에서 증가할 것이고 건강한 에피토프에 결합하는 앱타머는 조율된 방식으로 상대 빈도에서 감소할 것이다. 즉, 하나가 증가하면 다른 하나는 항상 감소한다.
이러한 동적 쌍에 내재하는 가능한 생물학적 의미의 다른 예는 병리학적 상태에서 단백질에 부착된 대사산물의 존재, 및 건강한 상태에서 이러한 대사산물의 부재를 포함할 수 있다. 이들 예는 단지 동적 쌍에 내재하는 잠재적 생물학적 의미의 개념을 설명하기 위한 것일 뿐으로 완전한 것으로 간주해서는 안된다.
동적 쌍의 개념은 그러한 동적 쌍이 측정된 차이를 은연중에 증가시키고, 조율된 방식으로 그렇게 한다는 점에서 개인에 걸친 앱타머의 상대 빈도의 변화를 보다 강력하게 해석하기 위한 기초를 제공한다.
이러한 동적 쌍이 실제로 본 발명의 효과적인 구현예로서 제공하기 위해 쌍을 이루는 생물학적 기초를 가질 필요는 없다.
앱타머의 동적 쌍을 식별하기 위해, 본 발명자들은 먼저 각 샘플에서 상위 100개 앱타머 각각의 비례적 상대 빈도를 서로 결정하였다. 이는 100개 앱타머 세트에서 각각의 앱타머의 상대 빈도를 각각의 다른 앱타머의 상대 빈도로 나누는 것을 포함한다.
각각의 복제 내에서, 이들 비율 각각에 대한 평균값을 AD 대상체 및 건강한 대상체에 대해 계산하였다. 각 세트 (AD 및 건강한 대상체) 내 각 값에 대한 표준 편차의 평균으로 나눈 이들 평균값 사이의 차이를 결정하였다. 이는 Z 통계량으로 간주될 수 있다.
각 개별 비율에 대해 각 복제로부터의 Z 통계량을 곱했다. 따라서 동일한 방향 (음성 또는 양성)인 Z 통계량은 양성 값이 되고, 반대 방향의 Z 통계량은 음성 값이 될 것이다.
그 후에 본 발명자들은 1.2의 컷-오프 값을 사용하여 AD와 정상을 구별할 수 있는 가장 강력한 그러한 앱타머 쌍에 상응하는 각 복제로부터의 Z 통계량의 산물을 식별하였다. 그 결과로 표 3에 기술된 72개 앱타머 쌍이 식별되었다.
식별된 72개의 동적 앱타머 쌍의 목록. 각 쌍 내 숫자는 표 4에 기술된 앱타마커 서열의 서열번호를 지칭한다.
동적 쌍
3/5 8/13 29/13 10/16 45/23 8/32
4/5 10/13 30/13 12/16 45/24 8/38
12/5 11/13 31/13 20/16 6/27 6/42
45/5 12/13 34/13 22/16 8/27 8/42
46/5 14/13 35/13 28/16 12/27 21/42
45/2 18/13 36/13 28/17 20/27 28/42
45/9 19/13 40/13 35/16 28/27 45/37
2/13 20/13 41/13 43/16 30/27 45/38
3/13 22/13 43/13 45/15 35/27 45/39
4/13 25/13 45/13 45/16 45/27 45/42
6/13 26/13 46/13 45/17 45/32 45/44
7/13 28/13 8/16 46/16 45/33 46/39
45개 앱타마커 서열의 목록. 이 서열은 서열번호: 1의 40-mer 무작위 영역 (즉, N40 부분)에 해당한다.
서열번호: 앱타마커 서열 (5'에서 3')
(서열번호: 1의 40-mer 무작위 영역)
2 CCTGCATTACCGACTAGCCGCCACATAGCCACTCCTTTCA
3 GACCTCATTCCAAGCCCGCACCACAGCACCAGAGCCGATG
4 TTCGGGACCCTACGCGGCGCTCCCATCCACGCACATCCAA
5 AACCTTTTACCCTTGGCCATTACACCACTGCCATCCTGTC
6 CCCCGGTATCCCTCGAGGGCCCAGCCACAACCTGCTGCCA
7 CGCCGCCAATCATAGCAACCCGGCCATCCACATCCTGCGA
8 GATTGACCAGGGGACCCAGCCATCCGACCCCACACCAGCA
9 GCCCCTGATTCGACTCAAGGACCACCGACCATATACCTCG
10 ATTCAGGTTTGACCCCTCGACACACACACCACCATCCAGA
11 TGACCGTTATATATCCGGCTATCGACCACGACCACCTGCT
12 CTAGACAGGCGCGCTACCTATTTTTGCCACCACAGCCACG
13 TGTCCCTGCGTATCCTGAGAACCGATTACACCCACTACCA
14 CAACCTTGACTGTCGACAATTCACCGCACACCCGATCCTG
15 GAACCCACGAATTGTCAACCCGATCCAATCACCACGACCA
16 TACTGATCGATCTTCATACTCCGCCACATTGACCATCCCG
17 AGCGCCAAACAGCCATATCCCGACGATACCACATAACCGA
18 CGCCGACGGTTGCTCTCGACTTGCCCATCCCCTGCCATGA
19 GCCAGTAGACGCTGACCGCCAACCCACCGCCATCCATGAG
20 TGGCACTGGGGCTGGCCGAACACCACCCACCCTATAGCAA
21 CGAGAGACAGATATCCCTTCGCATCCACTACCAATCGCCG
22 TAGGAGCAGTACCCCGATCGACCACACCACTCTACGGGCA
23 GCCCTTGAATCGATCCCGGACTTGCCACATCCACAGCAGA
24 TGCCAACAGATGACTACTGCGCACCCATCAGCCACATCCA
25 ATCAGAACCTTACCGGCCGTCACTTTGCCACCACAACCGA
26 GAACCGTCGTCTACCTCGATCCCGCCCACAGCACTACCAG
27 CACTATTTCTTACAACACGCGCGCTTTACCACCATACCGA
28 TCTGGGCCCAACAGACCTCGACCCGCTGACACCGCTACCA
29 CGCCGGCATATCGCTCTAACCCGGGACCACACCCACGACT
30 TAGCTCGGATTGAGACGCCCACCTCCACAGCCCTTGACCG
31 TAGGCCATCCCTTCATCCACGTAGCCGCCATTGACCCCGA
32 TGGCCATATGTTCTCCCATAAGCTGCACCACACCCCTTGA
33 AAGGTCGTCGAATAACCCCTCATCCACCGCCGTACCACAA
34 AGGCCGTCCTCGAACATACCTAACCACACCCCACTGACCG
35 CAGACGCCTTAACCTCTACCCGAGCCCTGCCACGCCATGT
36 GCCCCCTGCTATTACACATCGAGCATTCGCCCACACCCAG
37 CCCAGATAACCCATCCCGACCTGAGAGCCCCGATACCATA
38 CGGCTCTACCTGCTCTGTCCGTTCCACATAACCCAAACCA
39 GTGTGCTACCAACAGATAATGACCACTCCCAATGAGCGCG
40 ACCTCTATTCCCGGCGCCCCAACCACATATCCAGGACTTG
41 ATCGACTTCCACTCTAGTCTCGACCGCCCACCGTACCATA
42 CAGCCTTTTGTTAACCTGCACCCACAGTACCCGATAGACA
43 ACGGACACACGCCGGCTAGCCACCCTTAACCTATATGTCG
44 TGACGCTTTAATCCGCCCCATAGCACCACACCACCAATCA
45 CAGAAACCGCTAAGCCCTTGCCACAGACCAGCATGTGCCG
46 AGCCGGAATGAGAACCCCCGACCAACCCATCCATACCGAA
5'AACTACATGGTATGTGGTGAACT(N40)GACGTACAATGTACCCTATAGTG-3'
(서열번호: 1), 여기서 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다.
72개의 이들 앱타머 쌍 모두는 건강한 평균에 비해 AD 평균에 대해 더 낮은 값을 나타내었다. 양성 Z 값 생성물이 AD 평균이 두 복제 모두에서 건강한 평균보다 더 높고, AD 평균이 두 복제 모두에서 건강한 평균보다 더 낮은 비율로부터 도출될 수 있기 때문에, 이는 이러한 분석 과정의 필수적인 결과로 예상되지 않았다. 따라서, 무작위 데이터 세트는 한 평균이 다른 평균보다 더 높은 비율의 평균 절반이고, 한 평균이 다른 것보다 더 낮은 비율의 절반에서 산출할 것으로 예상된다.
무작위 확률 분포로부터의 이러한 매우 중요한 차이는 단지 상대 빈도의 생물학적 의미의 표시로서 취해질 수 있다. 이러한 의미는 선택 과정과 AD 및 건강한 대상체의 혈액에서 에피토프의 상대 빈도에서의 차이의 특성 둘 다의 결과이다.
모든 값이 동일한 방향에 있다고 가정하고, 본 발명자들은 각 개별 샘플 내에서 동일한 72개 앱타머 쌍에 대한 상대 빈도의 비율을 합산하였다. 이들 값을 도 16에 제공하였다. AD 값과 건강한 값 사이에 0의 좌표를 만들기 위해, 모든 합에서 상수 연산자 값 2.7을 공제하였다. 이 최종 값이 "앱타마커 점수"로 언급된다.
이들의 MMSE 점수에 대한 각 대상체의 평균 "앱타마커 점수"의 비교가 도 17에 제공된다. 앱타마커 플랫폼을 이용한 인간 대상체의 혈액 분석은 MMSE 점수의 감소에 근거하여 대상체를 구별하는데 효과적이고 안정적으로 사용될 수 있음이 분명하다.
도 18은 이 분석을 기초로 AD 대상체와 건강한 대상체 사이의 구별에 대한 전반적인 요약을 제공한다.
결론
앱타마커 플랫폼을 사용하여 알츠하이머병의 영향을 받은 환자와 건강한 환자를 이들의 혈액 샘플에 기초해 구별할 수 있음이 이러한 데이터로부터 분명하다.
앱타마커 지문과 질환 중증도 수준의 상관관계는 중간-단계 알츠하이머병 샘플에 대해 앱타머 라이브러리를 훈련시킴으로써 분석될 것이다.
실시예 4: 후기 AIBL 데이터의 무작위 분석
실시예 3에 기술된 본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 13명의 AD 및 6명의 건강한 대상체를 포함하였다. 무작위 그룹화가 동일한 분포로 설정되었지만, 건강한 대상체 중 4명을 무작위로 AD 그룹에 지정하였고, 4명의 AD 대상체를 건강한 그룹에 무작위로 지정하였다.
동적 앱타머 쌍을 실시예 3의 원래 분석과 동일한 방식으로 선택하였다. 이러한 46개의 쌍이 식별되었다.
관찰된 첫 번째 차이는 AD 대상체와 건강한 대상체에 대한 평균 사이의 차이가 모두 동일한 방향에 있지는 않았다는 점이다. 실시예 3에 제공된 분석에서, 72개의 모든 동적 쌍은 AD 풀에서보다 건강한 풀에서 더 높은 값을 나타내었다. 이 무작위 분석에서, 첫 번째 복제에서는, 30개의 동적 쌍이 AD 풀에서 더 높은 값을 나타내었다. 두 번째 복제에서, 동일한 동적 쌍의 17개가 AD 풀에서 더 높은 값을 나타내었다.
따라서 최선의 방책은 건강한 풀에서보다 AD 풀에서 더 낮은 값을 갖는 그러한 값을 더하고 건강한 풀에서보다 AD 풀에서 더 높은 값을 갖는 값을 빼는 것이다. 이 알고리즘은 첫 번째 복제에 대해 확립되었다. 도 19는 두 복제에 걸친 결과를 요약한 것이다.
알고리즘을 첫 번째 복제에 핏팅하였고 결과는 실시예 3의 분석에서와 같이 우수하지 않았다 (도 16). 이 알고리즘을 두 번째 복제로부터의 데이터에 핏팅하여 수득된 결과는 전혀 특별한 경향을 나타내지 않았다. 그럼에도 실시예 3의 분석에서, 동일한 알고리즘이 복제된 두 데이터 세트 모두에 사용되었다.
도 20은 실시예 3의 분석 (도 20A)과 본 실시예에 따른 가상의 무작위 분석 (도 20B)에서 인간 대상체당 전체 평균 사이의 비교를 제공한다.
이들 결과는 앱타마커를 이용해 AD와 건강한 대상체 사이에서 달성된 구별이 앱타머의 동적 쌍을 식별하는데 사용된 통계적 과정의 함수가 아니라 생물학적 현실을 반영함을 명백히 입증한다.
결론
알츠하이머병의 진행 속도는 환자마다 크게 다를 수 있다. 건강 관리 계획의 보조로서 개별 기준으로 이 속도를 예측할 필요가 있다. 후보 요법의 성능을 특성화하는 수단으로서 병리학 발단 속도를 특성화할 수 있는 것 또한 유용할 것이다.
본 발명자들은 각 환자에서 질환이 진행되는 속도를 특성화하기 위해 알츠하이머병의 영향을 받은 환자로부터의 혈청의 반복 분석을 이용하는 것을 고려하였다. 앱타마커 농화의 속도 차이는 질병 진행 속도와 상관될 것이며 진단 기준으로 감소 속도를 예측하는데 사용될 것이다.
이 앱타마커 플랫폼이 에피토프의 차이, 또는 에피토프 축적 속도의 차이에 기초하여 환자의 하위그룹 또는 병리의 하위유형을 식별할 수 있는 능력을 갖는다는 점은 본 발명자들의 주의를 끌었다. 따라서, 이 플랫폼의 적용은 후보 요법의 임상 시험을 위한 환자의 계층화를 위한 가이드로서 매우 유용할 것이다. 또한, 질환을 나타내는 에피토프의 진행을 특성화하는 이 접근법의 능력은 성공적인 요법에 대한 동반 진단으로서 이 접근법의 사용을 매력적으로 만들 것이다.
이 과정에 대한 개선이 앱타머의 서브세트를, 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 실시예 3에서 확인된 72개의 동적 쌍에 관련된 앱타머의 서브세트의 사용을 포함할 수 있음이 또한 본 발명자들의 주의를 끌었다. 이러한 세트는 적용되는 각 시험에서 앱타머 분포가 동일함을 보장하도록 합성될 수 있다. 이러한 서브세트의 사용은 또한 분석되는 대상체들 사이에서 에피토프의 빈도 변화에 대한 개별 앱타머 반응의 크기를 증가시킬 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NEONEURO <120> APTAMER AS BIOMARKERS <130> IPA191063-FR <150> US 62/460,887 <151> 2017-02-20 <160> 48 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer library <220> <221> misc_feature <222> 1..23 <223> /note="Constant region for primer hybridization" <220> <221> misc_feature <222> 24..63 <223> /note="N can be A, T, C, G, U or any modified nucleotide, preferably N can be A, T, C or G" <220> <221> misc_feature <222> 64..86 <223> /note="Constant region for primer hybridization" <400> 1 aactacatgg tatgtggtga actnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnngacgtac aatgtaccct atagtg 86 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamarker <400> 2 cctgcattac cgactagccg ccacatagcc actcctttca 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamarker <400> 3 gacctcattc caagcccgca ccacagcacc agagccgatg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamarker <400> 4 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Claims (14)

  1. 대상체에서 의학적 상태(state), 질환 또는 병태(condition)를 진단하기 위한 수단으로서의, 대상체로부터의 샘플에 대한 라이브러리의 선택 이전 및 이후에, 공지된 결과의 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 적어도 하나의 샘플에 대해 선택된 라이브러리에서 앱타머(aptamer)의 상대 빈도 변화의 용도.
  2. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법:
    - 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로서, 선택된 앱타머 라이브러리가 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 1개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머와 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 1개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
    - 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 방법:
    - 선택된 앱타머 라이브러리를 제공하는 단계로서, 선택된 앱타머 라이브러리가 적어도 1개의 기준 대상체로부터의 신체 조직 또는 체액에 대해 선택되고 선택적으로 역-선택된 앱타머 서열의 수집을 포함하는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리를 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 적어도 2개의 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계,
    - 선택된 앱타머 라이브러리로부터 생물학적 샘플에 결합하는 앱타머를 선택하고, 그로써 대상체-특이적 앱타머 라이브러리를 수득하는 단계,
    - 적어도 2개의 대상체-특이적 앱타머 라이브러리로부터의 앱타머 사이에서 상대 빈도의 변화를 결정하는 단계,
    - 대상체-특이적 앱타머 라이브러리 내 앱타머 사이의 상대 빈도의 변화를 적어도 2개의 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태에 상관시키는 단계, 및
    - 의학적 상태, 질환 또는 병태가 공지되지 않은 대상체에 선택된 앱타머 라이브러리를 적용하고, 그로써 이전 단계에서 라이브러리 내 앱타머의 상대 변화와 상기 의학적 상태, 질환 또는 병태 사이에서 결정된 상관관계를 기준으로 대상체의 의학적 상태, 질환 또는 병태를 진단하는 단계.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 적어도 1개의 기준 대상체가 의학적 상태, 질환 또는 병태에 대해 공지된 결과를 갖는 대상체인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 상태, 질환 또는 병태가 신경퇴행성 질환인, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 상태, 질환 또는 병태가 알츠하이머병인, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 앱타머 라이브러리를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계가 2회 이상의 선택 라운드를 포함하는, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 앱타머 라이브러리가 공지되고 특성화된 앱타머 서열의 서브세트(subset)를 공지된 비율로 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상대 빈도의 변화가 다양한 시점에서 결정되고, 그로써 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 진행 속도를 평가하는, 용도 또는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 대상체에서 발생하는 의학적 상태, 질환 또는 병태의 확률을 지정(assigning)하기 위한 것인, 용도 또는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 중증도 수준을 진단하기 위한 것인, 용도 또는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 대상체에서 의학적 상태, 질환 또는 병태의 진행 속도를 결정하기 위한 것인, 용도 또는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체를 계층화하기 위한 것인, 용도 또는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 의학적 상태, 질환 또는 병태에 영향을 받은 대상체에서 요법의 효능을 평가하기 위한 것인, 용도 또는 방법.
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