KR20190131116A - 펩티드-기반 백신, 그의 제조 방법, 및 면역 반응을 유도하기 위한 그의 용도 - Google Patents

펩티드-기반 백신, 그의 제조 방법, 및 면역 반응을 유도하기 위한 그의 용도 Download PDF

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KR20190131116A
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제프리 린
앤드류 이시즈카
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아비디아 테크놀로지스, 인크.
더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

본 개시내용은 신규 펩티드-기반 백신, 신규 펩티드-기반 백신을 제조하는 방법, 및 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 유도하기 위해 펩티드 항원을 대상체에게 전달하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

펩티드-기반 백신, 그의 제조 방법, 및 면역 반응을 유도하기 위한 그의 용도
우선권 서류
본 출원은 2017년 4월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/481,432, 및 2018년 1월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/617,519를 우선권 주장하며, 이들 둘 다는 "펩티드-기반 백신, 그의 제조 방법, 및 면역 반응을 유도하기 위한 그의 용도"란 발명의 명칭으로 출원되고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 보건 복지부 기관인 국립 보건원과의 공동 연구 개발 계약을 수행함으로써 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 신규 펩티드-기반 백신, 신규 펩티드-기반 백신을 제조하는 방법, 및 대상체에서 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 유도하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용의 펩티드-기반 백신의 실시양태는 감염성 질환 및 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 자가면역 및 알레르기를 예방 또는 치료하기 위하여 면역관용을 유도하거나 또는 면역을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
항원의 면역원성 조성물을 포함하는 백신은 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위해, 또는 심지어 자가면역 또는 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 면역관용 및/또는 면역 억제를 유도하는 것을 포함하여, 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 암 및 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위해 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물은 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 항원 및 특이적 유형의 아주반트 및/또는 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 암성 세포의 병원체 제거 또는 사멸을 매개하는 항원에 대한 항체를 함유한다. 대조적으로, 면역관용성 또는 억제성 반응을 유도하기 위한 백신의 조성물은 항원 및 비히클 (예를 들어, 전달 시스템, 예컨대 입자 운반체) 및/또는 면역-억제성 화합물, 예컨대 mTOR 억제제를 함유할 수 있지만, 세포독성 T 세포를 유도하는 특이적 아주반트가 결여될 것이며, 대신 상기 반응의 정성적 특징을 하향 조절하거나 또는 조정하는 조절 세포, 예컨대 조절 T 세포의 T 세포 면역관용 또는 활성화를 유도할 수 있다.
유전적 배경, 특히 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 대립유전자의 조성, 및 환자의 환경이 암, 감염성 질환, 자가면역 및 알레르기에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 그러한 병태를 치료하기 위해 사용된 백신에 대한 그들의 반응에 영향을 미칠 수 있다는 인식이 증가하고 있다. 질환의 분자적 기초의 이해를 제공하는 새로운 진단 및 정보학 방법의 지속적인 개발은 환자의 구체적 정보가 점점 더 이용가능하다는 것을 의미하였다. 따라서, 암, 감염성 질환, 자가면역 및 알레르기를 치료 또는 예방하기 위한 백신을 포함한 특별한 면역요법의 선택을 포함하여, 개인이 받는 의료를 지시하기 위해 개인의 유전자, 단백질 및 환경에 관한 정보를 이용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다.
암 요법에서는, 개인의 종양에 관한 구체적 정보를 사용하여 진단하는데 도움을 주거나, 치료 계획을 세우거나, 치료가 얼마나 잘 작동하는지를 알아 보거나 또는 예후할 수 있다. 예를 들어, 개인의 유전자, 단백질 및 환경에 관한 구체적인 정보는 이러한 정보를 기반으로 하여 백신을 개발함으로써 암 치료에 대한 예방적 접근법을 맞춤화하는데 사용될 수 있다. 특정 암의 면역학적 치료 또는 예방을 위해 사용되는 백신은 종양-연관 항원에 대항한 면역 반응을 유도해야 한다. 하나의 바람직한 면역 반응은 종양-연관 항원을 인식하는 CD8 T 세포 반응 및/또는 CD4 T 세포 반응이다.
유사하게, 자가면역 또는 알레르기를 치료하기 위한 개인화된 접근법은 면역-매개 병리학의 원인인 특이적 자기-항원 또는 외래 항원 각각의 확인을 통해 가능하다. 일부 자가-항원 및 알레르겐이 환자 전체에 걸쳐 공지되어 있고 공통적이지만, 일부 자가-항원 및 알레르겐은 환자-특이적일 수 있으므로, 이들 환자의 치료는 맞춤화되어야만 한다. 병리상태의 원인으로서 확인된 항원은 자가-항원 (즉, 자기-항원)에 대항한 면역관용을 유도할 수 있는 백신으로서 펩티드의 형태로 투여될 수 있다. 또 다른 한편으로는, 알레르기를 일으키는 외래 항원에 대항한 면역 반응은 병리상태를 초래하는 특별한 유형의 면역 반응일 수 있다. 따라서, 이러한 외래 항원에 대항한 백신은 펩티드-기반 백신으로서 제공되어, 상기 면역 반응을, 병리상태를 초래하지 않는 정성적으로 별개의 유형의 면역 반응으로 전환시킬 수 있다.
암 치료 또는 예방에 있어서의 T 세포의 역할
T 세포는 입양 T 세포 요법 및 면역 체크포인트 억제제에 기반한 면역요법을 사용하여 나타낸 바와 같이 종양 퇴행을 매개하고 환자 생존을 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 인간에 대한 여러 연구는 단일 종양-연관 항원을 인식하는 다수의 확장된 CD8 및/또는 CD4 T 세포의 정맥내 주입이 종양 퇴행을 매개하고 생존을 개선시킬 수 있다는 것을 보여주었다 (문헌 [E. Tran et al., N Engl J Med 375:2255-2262, 2016; 및 E. Tran et al., Science 344: 641-645, 2014] 참조). 부가적으로, T 세포 억제를 차단하거나 또는 역전시키는 약물, 예컨대 CTLA-4, PD-1 및/또는 PD-L1을 차단하는 모노클로날 항체 (소위 '체크포인트 억제제')로 특정 암을 치료하면 종양 퇴행 및 전반적인 생존에 있어서의 개선이 초래된다 (문헌 [D. M. Pardoll, Nat Rev Cancer, 12:252-264, 2012; F. S. Hodi et al., N Engl J Med, 363:711-723, 2010; and, M. Reck et al., N Engl J Med, 375:1823-1833, 2016; J. E. Rosenberg et al., Lancet 387:1909-1920, 2016] 참조). PD-1/PD-L1은 PD-1이 T 세포 상에서 발현되고 PD-L1이 종양 내의 세포 상에서 발현되는 수용체-리간드 쌍이다. PD-1/PD-L1 상호작용은 T 세포가 이펙터 기능을 수행하는 것을 차단하는데, 그렇지 않았으면 T 세포에 의해 인식되는 종양-연관 항원을 발현하는 종양 세포의 성장이 느려지거나 또는 종양 세포가 제거되는 결과가 초래되었을 것이다. PD-1/PD-L1 상호작용을 모노클로날 항체로 차단하면 억제 시그널이 중단되고, 그에 의해 T 세포가 방출되어 이펙터 기능이 수행되어, 종양 세포 성장을 지연시키거나 또는 종양 세포를 사멸시킨다 (D. M. Pardoll, Nat Rev Cancer, 12: 252-264, 2012).
환자에서 종양 제거를 촉진시키는데 있어서의 T 세포의 역할은 치료 시작 시점에 자신의 종양 생검에 존재하는 더 높은 수준의 T 세포 침윤을 갖는 환자에서 체크포인트 억제제가 더 높은 효능 (더 낮은 사망률)을 나타낸다는 것을 보여주는 인간에서의 연구에 의해 뒷받침된다 (문헌 [J. E. Rosenberg et al., Lancet 387:1909-1920, 2016] 참조). 더욱이, 종양이 더 높은 수준의 돌연변이를 갖는 환자에서 체크포인트 억제제가 더 높은 효능을 나타내는 것으로 또한 밝혀졌는데 (문헌 [A. Snyder et al., N Engl J Med 371, 2189-2199 2014; 및 N. A. Rizvi et al., Science, 348: 124-128, 2015] 참조), 이는 아마도 돌연변이의 수가 증가하면 돌연변이체 단백질의 수가 더 많아져서, T 세포가 종양 세포를 인식하고, 이를 제거하기 위해 표적화할 수 있는 더 많은 수의 잠재적 표적이 제공되기 때문일 것이다.
그러나, 주요 과제는 많은 우세한 종양 (예를 들어, 전립선 암, 유방암 및 췌장암)에 돌연변이 부담이 적고 (문헌 [T. N. Schumacher, R. D. Schreiber, Science, 348: 69-74, 2015] 참조), 이들 암 환자가 체크포인트 억제제로부터의 혜택을 거의 또는 전혀 실현할 수 없다는 것이다. 더욱이, 높은 돌연변이 부담을 갖는 종양 중에서도, 대다수의 대상체에게 면역요법이 특정 효과를 매개하는데 요구되는 필수적인 기존의 종양-특이적 T 세포 반응이 결여되어 있기 때문에, 환자의 일부만이 체크포인트 억제제 요법으로부터 혜택을 누린다.
암 치료 또는 예방을 위해 종양-연관 항원을 표적으로 하는 백신
암 치료 또는 예방을 위한 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 생성하기 위해서는, 적합한 종양-연관 항원의 확인이 필요하다. 종양-연관 항원은 특정의 건강한 세포에 존재하지만 종양 세포에 의해 우선적으로 발현되는 자기-항원; 발암성 미생물 병원체로부터의 병원체 유래 항원; 및/또는 종양 세포에 특이적이고 항상은 아니지만 종종 개별 환자에게 독특한 비정상적인 단백질인 신생항원을 포함한다.
적합한 자기-항원은 산후 대상체에서 더 이상 발현되지 않는 단백질로부터 유래된 항원일 수 있다. 예를 들어, 적합한 자기-항원은 종양 세포에 의해 우선적으로 발현되는 항원, 예컨대 NY-ESO-1 및 MAGE-A3을 포함할 수 있다 (문헌 [N. N. Hunder et al., N Engl J Med, 358:2698-2703, 2008] 참조). 또 다른 한편으로는, 자기-항원은 건강한 조직에서 발현되는 항원을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 건강한 조직에 대항한 T 세포 반응은 환자에게 과도하게 해롭지 않으며, 예를 들어, 전립선 산 포스파타제 (PAP)이다 (문헌 [P. W. Kantoff et al., N Engl J Med 363:411-422, 2010] 참조). 종양-연관 항원은 병원체 유래 항원, 예컨대 바이러스, 또는 신생물 프로세스의 근본적인 구동인자인 다른 병원체, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스 (HPV)로부터의 단백질일 수 있다 (문헌 [G. G. Kenter et al., N Engl J Med, 361: 1838-1847, 2009] 참조).
신생항원은 종양 세포에만 존재하고 정상 세포에는 존재하지 않는 돌연변이의 결과인 항원이다 (문헌 [T. N. Schumacher, R. D. Schreiber, Science, 348: 69-74, 2015] 참조). 신생항원은 비-보존적 아미노산 변화를 초래하는 뉴클레오티드 다형성에 의해 창출될 수 있다. 신생항원은 삽입 및/또는 결실에 의해 창출될 수 있으며, 이는 삽입 또는 결실 또는 프레임시프트 돌연변이를 함유하는 펩티드 항원을 야기할 수 있다. 신생항원은 그의 새로운 맥락에서 정지 코돈 기구에 의해 인식되지 않는 정지 코돈의 도입에 의해 창출될 수 있어, 코돈을 스키핑하는 리보솜이 초래되고 단일 아미노산 결실을 함유하는 펩티드가 생성된다. 신생항원은 스플라이스 부위에서의 돌연변이에 의해 창출될 수 있으며, 이는 잘못 스플라이싱된 mRNA 전사체를 초래한다. 신생항원은 융합 펩티드를 야기하는 역위 및/또는 염색체 전위에 의해 창출될 수 있다.
최종적으로, 종양-연관 항원은 돌연변이되지 않거나 또는 돌연변이체 펩티드의 신규 번역 후 변형을 함유할 수 있으며, 여기서 번역 후 변형은 정상 조직에는 존재하지 않는다.
요약하면, 종양-연관 항원은 신생물 세포에 의해 생산되는 임의의 항원이며, T 세포 반응에 의해 표적화될 때, 이상적으로는 종양 성장의 의미있는 퇴행을 초래하거나, 또는 종양 발생을 예방하고, 건강한 비-암성 세포에 대한 제한적인 영향을 미친다.
백신 분야가 직면한 과제
특정 암의 치료를 위해, 바람직한 면역 반응은 종양-연관 항원을 인식하는 CD8 T 세포 반응 (문헌 [E. Tran et al., N Engl J Med 375:2255-2262, 2016] 참조) 및/또는 CD4 T 세포 반응 (문헌 [E. Tran et al., Science 344: 641-645, 2014; 및 N. N. Hunder et al., N Engl J Med, 358:2698-2703, 2008] 참조)으로, 이는 높은 규모와 고도의 기능성 (고 품질)으로 우선적으로 지속될 수 있다 (L. Gattinoni et al., Nature Medicine, 17:1290-1297, 2011).
대상체에서 항원, 예를 들어, 종양-연관 항원에 대항한 T 세포 반응을 유도하는 한 가지 수단은 백신접종을 통하는 것이다. DNA/RNA-기반, 바이러스 벡터-기반 및 펩티드-기반 접근법을 포함하여, 종양-연관 항원에 대항한 CD8 및/또는 CD4 T 세포 반응을 유도하기 위해 현재 조사중인 수많은 접근법이 있다 (예를 들어, 문헌 [L. M. Kranz et al., Nature 534, 396-401, 2016; 및 C. J. Melief, S. H. van der BurgNat Rev Cancer 8:351-360, 2008] 참조). 그러나, 암에 대항하여 유효한 T 세포 면역을 생성하는데 있어서의 주요 과제는, 대부분의 현재 백신 접근법이 CD8 T 세포 면역을 이끌어 내기 위한 약한 면역원성과, 대부분의 예측된 신생항원에 대항한 제한된 항원 폭의 반응에 의해 제한된다는 것이다 (문헌 [S. Kreiter et al., Nature 520, 692-696, 2015] 참조).
항-종양 T 세포 면역을 유도하기 위한 많은 노력이 단순히 상이한 면역자극제 및/또는 비히클 (아주반트)과 혼합된 합성 펩티드 항원 (문헌 [C. J. Melief, S. H. van der Burg, Nat Rev Cancer 8:351-360, 2008; 및 M. S. Bijker et al., Eur J Immunol 38, 1033-1042, 2008] 참조) 또는 RNA (문헌 [Kranz LM, et al. Nature 534(7607):396-401, 2016 및 Kreiter S, et al. Nature 520(7549):692-696, 2015] 참조)를 사용하는 것에 중점을 두었다.
그러나, 암에 대항하여 유효한 T 세포 면역을 생성하는데 있어서의 주요 과제는, 펩티드 항원 또는 RNA에 기반한 대부분의 현재 백신 접근법이 신생항원을 포함한 종양-연관 항원에 대항한 낮은 규모 및 제한된 항원 폭의 반응에 의해 방해를 받았다는 것이다. 예를 들어, 항원 폭과 관련하여, 펩티드 항원 (예를 들어, 25개 아미노산 길이의 합성 펩티드를 아주반트 폴리IC:LC와 혼합함) 또는 RNA에 기반한 현재의 최적 기준 펩티드-기반 백신 접근법이, 예측된 신생항원의 10% 미만에 대항하여 T 세포 반응을 유도한다 (문헌 [S. Kreiter et al., Nature 520, 692-696, 2015] 참조). 따라서, 개선된 백신 접근법, 특히 펩티드-기반 백신 접근법이 필요하다.
현대의 백신 기술에 의한 T 세포 반응의 낮은 규모 및 빈약한 항원 폭에 대한 완전한 설명은 여전히 결정되어야 하므로, 현재의 어려운 문제는 암 치료 및 예방을 위해서 뿐만 아니라 감염성 질환의 치료 및 예방을 포함한 다른 적용을 위해 T 세포 면역의 확실한 프라이밍을 보장하기 위해, 펩티드 항원을 전달하기 위한 최적의 파라미터에 관한 합의가 현재 존재하지 않는다는 것이다. 유사하게, 억제 및 면역관용을 유도하기 위한 펩티드-기반 백신의 최적 파라미터는 공지되어 있지 않다.
펩티드-기반 T 세포 백신에 관한 현재의 과제
감염성 질환 및 암의 치료 또는 예방을 위한 백신의 개발에 대한 주요 과제는, 대부분의 항원에 대항하여 높은 규모의 T 세포 면역을 확실하게 이끌어 내기 위해 펩티드-기반 백신을 어떻게 최상으로 구축하는지에 관한 합의가 현재 없다는 것이다. 유사하게, 면역관용을 유도하거나, 또는 알레르기를 유도하는 반응에서부터 무해한 유형의 반응으로 면역 반응을 전환시키기 위해 펩티드-기반 백신을 어떻게 최상으로 구축하는지에 관한 합의가 없다. 예를 들어, 최적의 펩티드 항원 길이, 펩티드 항원 전달의 물리적 포맷 (예를 들어, 가용성 대 미립자), 및 암 및 감염성 질환의 치료 또는 예방 뿐만 아니라 자가면역 및 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 최적의 T 세포 면역을 유도하는데 필요한 선천 면역 자극의 유형 (예를 들어, 아주반트 선택)에 관해서는 여전히 상당한 논쟁이 있다. 실제로, 면역 반응에 대한 CD4 및 CD8 T 세포 에피토프를 플랭킹하는 아미노산의 영향, 사용된 링커 화학, 전하 등을 포함한, 펩티드-기반 백신의 많은 파라미터의 영향력은 아직 크게 탐구되지 않고 있다. 이러한 문제는 개인화된 백신 접근법이 각각의 환자에 대해 독특하게 맞춤화되어야 하므로, 환자-특이적 항원에 대항한 면역, 특히 T 세포 면역을 확실하게 이끌어 내기 위한 범용 펩티드-기반 백신 접근법이 필요하다는 것을 고려할 때 특히 두드러진다.
현재의 펩티드-기반 백신 접근법이 직면한 또 다른 주요 과제는 펩티드 항원의 광범위한 가능한 물리적 및 화학적 특징을 설명하지 못한다는 것이다. 예를 들어, 개별화된 암 백신 접근법은, 각각의 환자로부터 광범위한 가능한 물리적 및 화학적 특징을 가질 수 있는 독특한 펩티드 항원 세트가 생성될 것을 요구할 것이다. 자가면역과 관련하여, 다수의 상이한 항원이 병리상태의 원인으로서 확인될 수 있다. 따라서, 면역관용 유도 백신은 각각의 환자에 대해 독특한 펩티드 항원 세트를 함유해야만 한다. 문제는 펩티드 항원 조성에 있어서의 가변성으로 인해, 천연 펩티드 항원으로서 제조하기 어렵거나 또는 불가능한 일부 펩티드-기반 항원이 생성될 수 있다는 것인데, 이는 25개 이상 아미노산 길이의 펩티드-기반 항원의 약 10 내지 30%인 것으로 추정된다. 따라서, 천연 펩티드 항원이 효율적으로 생산될 수 없거나 또는 합성 후에 단리될 수 없기 때문에 많은 항원이 현재의 백신 접근법에 의해 표적화될 수 없다. 부가적으로, 현재의 펩티드-기반 백신 접근법에서 제어되지 않는, 전하 및 용해도에 영향을 미치는 펩티드 항원 조성에 있어서의 가변성은 펩티드의 물질 부하를 포함하여, 백신 제형의 다양한 속성에 강한 영향력을 미칠 수 있고/있거나 펩티드 항원과 다른 펩티드 항원 또는 백신의 다른 성분과의 불리한 상호작용을 야기시킬 수 있다.
따라서, 현재의 펩티드-기반 백신 접근법의 한계를 극복하기 위해, (i) 제조 동안 및 백신 제형에서 펩티드 항원의 물리적 및 화학적 특성에 있어서의 가변성을 설명하는 신규 펩티드-기반 백신 조성물 및 제조 방법이, (ii) 대부분의 항원에 대항하여 대상체에서 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 확실하게 유도하기 위해 펩티드 항원의 최적 전달을 보장하는데 필요하다. 펩티드 항원 가변성을 설명하므로, 임의의 펩티드 항원에 대해 일반화될 수 있는 이러한 백신 및 방법은 개인화된 암 치료 분야에서 특히 유용할 것이며, 여기서 개인화된 암 백신에 사용되는 펩티드 항원의 특징은 환자마다 다양할 수 있다. 그러나, 임의의 펩티드 항원에 대한 펩티드-기반 백신 조성물의 적용가능성은, 이러한 조성물이 또한 다른 개인화된 면역학적-기반 치료에 사용될 수 있다는 것, 예컨대 자가면역 및 알레르기 각각의 치료를 위해 면역관용을 유도하거나 또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 조정하기 위해 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 현재의 펩티드-기반 백신 접근법의 한계 중 적어도 한 가지를 극복하는 신규 펩티드-기반 백신 조성물 및 제조 방법을 개발하였다. 본원에 개시된 신규 펩티드-기반 백신 조성물 및 제조 방법은 펩티드 항원의 물리적 및 화학적 특성에 있어서의 가변성을 설명하므로, 임의의 펩티드 항원에 대해 일반화될 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 신규 펩티드-기반 백신 조성물은 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 상이한 펩티드 항원의 최적 전달을 보장한다.
본원에 개시된 신규 조성물은 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 펩티드 항원 접합체는 직접적으로 또는 임의적 링커 (L)를 통해 및/또는 펩티드 항원의 N-말단 또는 C-말단에 각각 연결되는 임의적 N- 또는 C-말단 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로, 입자를 형성하는 소수성 분자 (H) 또는 미리 형성된 입자 (P)에 연결되는 펩티드 항원 (A)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자는 부가적으로, 임의적 하전된 분자 (C)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자는 펩티드 항원 접합체에 연결되어 수성 조건에서 입자를 안정화시킨다. 다른 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 별도의 분자 상에 제공되고 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자 내로 혼입된다.
특정의 N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2) 및/또는 하전된 분자 (C)를 부가하면, 고체 상 합성에 의한 펩티드-기반 백신 제조에 있어서 예상치 못한 개선과, 개선된 유기 용매 용해도를 통한 개선된 정제의 용이성 뿐만 아니라 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성에 대한 제어에 있어서의 예상치 못한 개선이 초래된다. 이들 조성물은 특히 종양-연관 항원에 대항하여 생성된 T 세포의 규모 및 폭과 관련하여, T 세포 면역 및 종양 제거에 있어서 예상치 못한 개선을 나타낸다.
본 개시내용의 실시양태는 펩티드 항원 (A); 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)를 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함하며, 여기서 펩티드 항원 (A)은 직접적으로, 또는 이러한 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되는 N-말단 연장부 (B1) 또는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 C-말단 연장부 (B2)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결된다. 본 개시내용의 부가의 실시양태는 상기 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에는 질환을 앓고 있는 환자에게 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암 치료를 위해 사용되는 백신은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 화학요법, 체크포인트 억제제, 방사선, 및 암을 퇴치하기 위해 사용되는 임의의 다른 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 면역요법 및 암 치료 양식과 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 또한 본원에는 질환을 앓고 있는 환자에게 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 개시된다.
더욱이, 본원에는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체 또는 면역원성 조성물의 용도가 개시된다.
본원에 개시된 예상치 못한 발견은 하기에 관한 것이다:
(i) T 세포 면역의 확실한 프라이밍을 보장하기 위해 암 백신에 사용되는 최적 길이의 펩티드 항원 (A);
(ii) 펩티드-기반 백신의 제조를 용이하게 하는 펩티드 항원 연장 서열, 즉 N- 또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2) 및/또는 임의적 하전된 분자 (C)의 사용;
(iii) 펩티드 항원 접합체를 구성하는 소수성 분자 (H)의 특징이 입자의 크기 및 안정성 뿐만 아니라 제조 능력에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 이들 파라미터가 생물학적 활성에 어떻게 영향을 미치는지;
(iv) T 세포 면역을 증진시키기 위해 최적 크기의 입자를 유도하고 안정화시키는데 필요한 하전된 분자 (C)의 조성 및 펩티드 항원 접합체의 순 전하;
(v) 펩티드 항원 접합체와 관련하여 전달되는 최소 에피토프의 효율적인 프로세싱을 촉진하는 효소 분해성 펩티드 서열의 조성; 및/또는
(vi) 펩티드 항원 접합체 상에 전달된 아주반트 특성 (예를 들어, PRR 효능제)을 갖는 리간드의 효력 및 정성적 특징이 T 세포 반응의 폭, 규모 및 품질에 어떻게 부여되는지.
도 1: 펩티드 항원 접합체의 특정 실시양태의 카툰 개략도.
도 2: 아지드를 보유하는 링커 전구체 X1를 포함하는 펩티드 항원 단편을, DBCO를 보유하는 링커 전구체 X2와 반응시켜, 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H)에 연결시키는 트리아졸 링커 (L)를 형성함으로써 펩티드 항원 접합체의 합성에 대한 일반적인 계획.
도 3: 화합물 1의 합성을 위한 개략도.
도 4: MC38 종양 세포주로부터 유래된 합성 긴 펩티드 (SLP 또는 "LP") 또는 최소 ("Min") CD8 T 세포 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A) 및 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 분자량 및 유체역학적 거동. LP로 구성된 펩티드 항원 (A)은 연결되지 않은 채로 남아 있거나 또는 DBCO-W3 또는 DBCO-2BXy3으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 연결되었다. LP로 구성된 펩티드 항원 (A)은 연결되지 않은 채로 남아 있거나 또는 DBCO-W3 또는 DBCO-2BXy3으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 연결된 연장부 (B1)에 연결되었다.
도 5: 펩티드-기반 신생항원 (Irgq)의 면역원성에 대한 TLR-7/8 효능제 (TLR-7/8a)의 펩티드 항원 (A) 길이, 유체역학적 거동 및 공동-전달의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, TLR-7/8a 아주반트와 혼합된 펩티드 항원 (A) 단독으로서; 소수성 분자 (H), W3에 연결되고 TLR-7/8a 아주반트와 혼합된 펩티드 항원 (A)으로서; 또는 TLR-7/8a 아주반트, 2BXy3을 공동 전달하는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)으로서 MC38 종양 세포주로부터 유래된 항원 Irgq의 합성 긴 펩티드 (LP, 종종 "SLP"로서 지칭됨) 또는 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Min, 종종 ME로서 지칭됨)에 기반한 펩티드 항원 (A)을 포함하는 상이한 면역원성 조성물로 면역시켰다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, 항원-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+)을 제0일 및 제25일에 전혈로부터 평가하였다. 열린 원형은 펩티드 항원 (A)이 가용성 (즉, 비-미립자)이었다는 것을 표시하는 반면, 닫힌 원형은 마우스가 펩티드 항원 (A)의 미립자 면역원성 조성물을 받았다는 것을 표시한다.
도 6: 펩티드-기반 신생항원 (Cpne1)의 면역원성에 대한 TLR-7/8a 아주반트의 펩티드 항원 (A) 길이, 유체역학적 거동 및 공동-전달의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, TLR-7/8a 아주반트와 혼합된 펩티드 항원 (A) 단독으로서; 소수성 분자 (H), W3에 연결되고 TLR-7/8a 아주반트와 혼합된 펩티드 항원 (A)으로서; 또는 TLR-7/8a 아주반트, 2BXy3을 공동 전달하는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)으로서 MC38 종양 세포주로부터 유래된 항원 Cpne1의 합성 긴 펩티드 (LP) 또는 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Min)에 기반한 펩티드 항원 (A)을 포함하는 상이한 면역원성 조성물로 면역시켰다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, 항원-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+)을 제0일 및 제25일에 전혈로부터 평가하였다. 열린 원형은 펩티드 항원 (A)이 가용성 (즉, 비-미립자)이었다는 것을 표시하는 반면, 닫힌 원형은 마우스가 펩티드 항원 (A)의 미립자 면역원성 조성물을 받았다는 것을 표시한다.
도 7: B16 종양 세포주로부터 유래된 합성 긴 펩티드 (SLP 또는 "LP") 또는 최소 ("Min") CD8 T 세포 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A) 및 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 분자량 및 유체역학적 거동. LP로 구성된 펩티드 항원 (A)은 연결되지 않은 채로 남아 있거나 또는 DBCO-W3 또는 DBCO-BXy3으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 연결되었다. LP로 구성된 펩티드 항원 (A)은 연결되지 않은 채로 남아 있거나 또는 DBCO-W3 또는 DBCO-2BXy3으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 연결된 연장부 (B1)에 연결되었다.
도 8: 펩티드 항원 접합체의 면역원성에 대한 소수성 분자 (H)에 연결된 TLR-7/8a의 펩티드 항원 (A) 길이 및 효력의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, 소수성 분자 (H) DBCO-2BXy5 또는 DBCO-2B5에 연결된 B16 종양 유래 펩티드 항원 (A)의 합성 긴 펩티드 (LP), 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Min) 또는 SLP와 Min 둘 다를 전달하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 상이한 면역원성 조성물로 면역시켰다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응 (전체의 % IFNg+)을 제24일에 전혈로부터 평가하였다. 막대 그래프는 각각의 펩티드 항원 (M47, M44, M30, M25, M33, M27 및 M08)에 대한 평균 반응의 합을 보여준다.
도 9: 펩티드 신생항원의 라이브러리에 대항하여 생성된 T 세포 반응의 폭 및 면역원성에 대한, 소수성 분자 (H)에 연결된 TLR-7/8a의 효력의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, 2BXy5 또는 2B5 소수성 분자 (H)에 연결된 별개의 MC38 종양 유래 최소 CD8 T 세포 에피토프 (40개의 전체 에피토프)를 전달하는 4가지 독특한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로 면역시켰다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, 항원-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+)을 제24일에 전혈로부터 평가하였다. 40개의 에피토프 각각에 대항한 CD8 T 세포 반응이 도시되어 있다. CD8 T 세포 반응을 야기하는 최소 CD8 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)의 비율이 파이 차트에 제시되어 있다.
도 10: 펩티드 기반 신생항원의 면역원성에 대한, 펩티드 항원 (A)의 수 및 용량 뿐만 아니라 백신접종 부위의 수의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, 단일 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Adpgk)를 포함하는 펩티드 항원 접합체, 또는 4가지 상이한 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Dpagt, Cpne1, Adpgk 및 Aatf)를 포함하는 펩티드 항원 접합체로 면역시켰다. 펩티드 항원 (A)의 용량 및 백신접종 부위의 수는 상이한 군에 대해 다양하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, 항원-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+)을 제24일에 전혈로부터 평가하였다.
도 11: 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 개략도.
도 12: CD8 T 세포 활성화에 대한 시험관내 효력에 대한 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)의 영향. APC 및 신생항원 (Cpne1)-특이적 CD8 T 세포를 이용한 비장세포 배양물을 상이한 연장부 (B1 및 B2)에 연결된 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Cpne1) 펩티드 항원 (A)으로 시험관 내에서 자극하고, Cpne1-특이적 CD8 T 세포의 IFNg 생산을 자극할 수 있는 능력에 관하여 평가하였다.
도 13: 도 12에서 평가된 펩티드 항원 접합체. 최소 에피토프, Cpne1 (Ser-Ser-Pro-Tyr-Leu-His-Tyr-Leu 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)로 구성된 펩티드 항원 (A)을, 카텝신 및/또는 면역 프로테아솜 절단 부위를 포함하는 B1 및/또는 B2 연장부 중 하나 또는 둘 다에 연결시켰으며, 부가적으로 여기서 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H), 2BXy3에 연결된 DBCO 분자에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 직접적으로 또는 B2 연장부를 통해 연결되었다.
도 14: 최소 CD8 T 세포 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 생체내 면역원성에 대한 하전된 분자 (C) 및 연장부 (B1 및/또는 B2)의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, 제0일 및 제14일에 상이한 하전된 분자 (C) 및 연장부(들) (B1 및/또는 B2)를 포함하는 펩티드 항원 접합체로 면역시키고, 항원-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+)을 제10일 (상부 패널) 및 제24일 (하부 패널)에 전혈로부터 평가하였다.
도 15: CD8 T 세포 활성화에 대한 시험관내 효력에 대한 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)의 영향. 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Adpgk) 펩티드 항원 (A)을 상이한 연장부 (B1 및 B2)에 연결하고 Adpgk-특이적 CD8 T 세포로부터의 IFNg 생산을 자극할 수 있는 능력에 관하여 평가하였다.
도 16: 절반 최대 활성에서의 유효 농도 (EC50)가, 도 15에서 평가된 상이한 펩티드 항원 접합체에 대해 도시되어 있다. EC50이 더 낮을수록 더 높은 효력을 표시한다.
도 17: CD8 T 세포 활성화에 대한 시험관내 효력 및 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위한 생체내 효력에 대한 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)의 영향. (A) 최소 CD8 T 세포 에피토프 (Adpgk) 펩티드 항원 (A)을 상이한 연장부 (B1 및 B2)에 연결하고 Adpgk-특이적 CD8 T 세포로부터의 IFNg 생산을 자극할 수 있는 능력에 관하여 평가하였다. (B) 소수성 분자 (H) 2B3W2에 연결된 상이한 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)를 수반한 펩티드 항원 접합체의 능력을, 단일 면역화 후 제13일에 평가하였다.
도 18: 유체역학적 거동에 대한 펩티드 항원 접합체 순 전하 및 소수성 분자 조성의 영향. pH 7.4 하의 PBS 중 0.1 mg/mL 또는 0.5 mg/mL에서 화학식 V의 다양한 상이한 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. 펩티드 항원 접합체의 순 전하 및 수 또는 질량 평균 입자 직경이 보고된다. 혼탁도는 490 nm에서 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 혼탁도 > 0.04는 응집을 표시한다.
도 19: 유체역학적 거동에 대한 펩티드 항원 접합체 순 전하의 영향. (A) pH 7.4 하의 PBS 중 0.1 mg/mL 또는 0.5 mg/mL로 현탁된 화학식 V의 다양한 상이한 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동에 대한 순 전하의 영향을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. (B) 본 도면의 패널 B는 본 도면의 패널 (A)에 제시된 데이터의 선별된 목록을 보여준다. 펩티드 항원 접합체로서 전달된 항원의 (C) GRAVY 빈도 분포 및 (D) 전하 빈도 분포. (E) +6 또는 ≥ +8 순 전하를 갖는 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 제조된 일치된 LP 신생항원 (n=39)의 입자 크기. (F) 유체역학적 거동에 대한 펩티드 항원 접합체 순 전하 및 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY)의 영향. pH 7.4 하의 PBS 중 0.1 mg/mL로 현탁된 다양한 상이한 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. 순 전하 및 GRAVY 값의 함수로서 수 평균 입자 직경이 보고된다.
도 20: 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동에 대한 펩티드 항원 접합체 순 전하 및 소수성 분자 (H) 길이 및 조성의 영향. 모델 신생항원-기반 최소 에피토프 (Min), Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser (서열식별번호: 2) ("Adpgk")를 전달하는 다양한 순 전하 및 소수성 분자 조성을 수반한, pH 7.4 하의 PBS 중 0.1 mg/mL로 현탁된 상이한 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. (A) 수 평균 입자 직경은 4가지 상이한 소수성 분자 (2B2W8, 2BXy5, 2B5, W5)에 대한 펩티드 항원 접합체의 순 전하의 함수로서 보고된다. (B) 나노입자로 자기 어셈블리되는 +6 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체 ("Min-SNP-7/8a"), 및 동일한 펩티드 항원 (A)을 전달하지만 마이크로입자 / 응집체로 어셈블리되는 0의 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체 ("Min-MP-7/8a")에 대한 크기 분포 데이터가 제시된다.
도 21: 소수성 펩티드 항원을 전달하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동에 대한 순 전하의 영향. (A) 4가지 뮤린 종양 모델 (B16.F10, MC38, 3123 및 Panc02)로부터 1,377개의 LP 신생항원의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY)의 분포도. (B) 본 도면의 패널 (A)에서 확인된 가장 소수성인 LP 신생항원 (적색 닫힌 원형)을, TLR-7/8a을 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 전달된 LP 및 Min으로서 제조되었으며, 입자 크기에 대한 순 전하의 영향 (절대 값)에 관하여 평가하였다. 입자 크기를 pH 7.4 하의 PBS 중 0.5 mg/mL로 현탁된 펩티드 항원 접합체로 동적 광 산란함으로써 평가하였다. 질량 평균 입자 직경이 펩티드 항원 접합체의 순 전하의 함수로서 보고된다.
도 22: 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 신생항원 최소 에피토프, Adpgk에 대한 CD8 T 세포 반응을 생성하기 위한 면역원성에 대한, 하전된 분자 (C 또는 "C 블록") 및 소수성 분자 (H 또는 "H 블록") 조성의 영향. (A-E) 최소 에피토프, Adpgk를 전달하는 다양한 하전된 분자 조성 (폴리(K), 폴리(R), 폴리(D) 또는 없음) 및 소수성 분자 조성 (W5, 2BXy3W2 또는 2B3W2)을 갖는 펩티드 항원 접합체를 제0일, 제14일 및 제28일에 상이한 용량으로 마우스 (용량당 군당 N=3)에게 투여하고, 그 후 일련의 시점에서 전혈로부터 신생항원 (Adpgk)-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가하였다.
도 23: 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 신생항원 최소 에피토프, Adpgk에 대한 CD8 T 세포 반응을 생성하기 위한 면역원성에 대한, 하전된 분자 (C 또는 "C 블록") 조성의 영향. (A) 최소 에피토프, Adpgk를 전달하는 폴리(K)- 폴리(D)- 또는 PEG-기반 C 블록을 수반한 펩티드 항원 접합체를 제0일, 제14일 및 제28일에 상이한 용량으로 마우스 (용량당 군당 N=3)에게 투여하고, 제36일에 전혈로부터 신생항원 (Adpgk)-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가하였다 (B).
도 24: 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")에 의해 생성된 CD8 T 세포 반응에 대한 투여 경로의 영향. 신생항원 최소 에피토프 (Adpgk = Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met (서열식별번호: 77))를 전달하는 폴리(K) 하전된 분자 (C) 및 2B3W2 소수성 분자 (H)를 수반한 펩티드 항원 접합체를 제0일, 제14일 및 제28일에 마우스에게 투여하고, 제36일에 전혈로부터 신생항원 (Adpgk)-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가하였다.
도 25: CD4 및 CD8 T 세포 반응에 대한 소수성 분자 (H)의 조성 및 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동의 영향. 마우스 (군당 N=5)를, 다양한 양 및 효력의 TLR-7/8 효능제를 운반하는 마이크로입자 (MP) (> 500 nm 직경) 또는 나노입자 (NP) 미셀 (< 200 nm 직경)로서 최소 CD8 T 세포 에피토프 및 CD4 T 세포 에피토프 (PADRE 에피토프)를 포함하는 면역원성 조성물로 면역시켰다. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고, (A) 항원 (Adpgk)-특이적 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 % IFNg+) 및 (B) PADRE-특이적 CD4 T 세포 반응을 제24일에 전혈로부터 평가하였다.
도 26: LP 또는 Min 에피토프 형태의 펩티드 항원을 전달하는 폴리(K) 하전된 분자 (C) 및 2B3W2-기반 소수성 분자 (H)를 수반한 펩티드 항원 접합체의 카툰 및 화학적 개략도.
도 27: 펩티드 신생항원의 미립자 전달은 펩티드 항원 (A) 기반 신생항원에 대항하여 유도된 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다. (A) 천연 LP, 마이크로입자 ("MP-7/8a")로 어셈블리되는 소수성 분자 (2B3W2)에 연결된 LP, 또는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 합성된 LP로서 상이한 신생항원의 혼탁도. 혼탁도 > 0.05 OD는 응집을 표시한다. (B-E) 마우스를, 폴리ICLC와 혼합된 천연 LP, 또는 제0일 및 제14일에 MP-7/8a 또는 SNP-7/8a로서 전달된 LP로 면역시키고, CD8 T 세포 반응을 제28일에 전혈로부터 평가하였다. 로그 스케일 상의 데이터가 95% CI를 갖는 기하 평균으로서 보고되었다; 통계적 유의성에 대한 다중 군의 비교는 일원 또는 이원 ANOVA를 사용하여 결정되었다; ns = 유의미하지 않음; *, p = 0.05; **, p = 0.01.
도 28: TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)의 개선된 면역원성을 설명하는 메커니즘. (A-C) 최소 에피토프, Adpgk를 형광 표지한 다음, 작은 분자 TLR-7/8a (7/8a)와 혼합된 가용성 펩티드로서, MP-7/8a와 혼합된 가용성 펩티드로서, 또는 MP-7/8a 또는 SNP-7/8a에 공유적으로 연결되어 제0일에 마우스의 뒷발바닥 내로 피하로 투여하였다. 면역화 부위를 배출하는 림프절 (군당 시점당 N=5)을 그 후 일련의 시점에서 수집하고, 펩티드 수량 (E), 세포당 기준으로 림프절 APC에 의한 펩티드 흡수 (F) 및 IL-12p40 시토카인 생산 (G)에 관하여 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 보고된다. 통계적 유의성에 대한 다수의 군의 비교는 일원 또는 이원 ANOVA를 사용하여 결정되었다; ns = 유의미하지 않음; *, p = 0.05; **, p = 0.01.
도 29: TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 LP 또는 Min으로서 전달된 펩티드-기반 신생항원의 면역원성. 상이한 펩티드-기반 신생항원은 펩티드 항원 접합체로서 전달된 LP 또는 Min으로서 제조되었으며, 여기서 하전된 분자 (C)는 폴리(리신)이고 소수성 분자 (H)는 2B3W2이고, 이는 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리된다 ("SNP-7/8a"로서 지칭됨). 마우스 (N=7/군)를, 제0일 및 제14일에 SNP-7/8a에 연결된 LP 또는 Min 형태의 펩티드-기반 신생항원으로 면역시켰다. (A) CD8 T 세포 반응 및 (B) CD4 T 세포 반응을 제28일에 전혈로부터 평가하였다. 로그 스케일 상의 데이터가 95% CI를 갖는 기하 평균으로서 보고되고; 통계적 유의성에 대한 다수의 군의 비교는 일원 또는 이원 ANOVA를 사용하여 결정되었다; ns = 유의미하지 않음; *, p = 0.05; **, p = 0.01.
도 30: 하전된 분자 (C)가 폴리(리신)이고 소수성 분자 (H)가 2B3W2이며, 폴리ICLC와 혼합된 천연 LP와 비교 시 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 LP-기반 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a"로서 지칭됨)로서 전달된 펩티드-기반 신생항원의 면역원성. 마우스를 제0일 및 제14일에 면역시키고 CD8 T 세포 반응을 제28일에 전혈로부터 평가하였다.
도 31: 면역원성과 예측된 결합 친화도 사이의 관계. (A) 소수성 분자 (H)가 중합체-TLR-7/8a인 펩티드 항원 접합체로서 전달될 때 CD8 T 세포 반응을 생성하기 위한 최소 에피토프 (N=179)의 면역원성으로, 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB) 컨센서스 알고리즘을 사용하여 예측된 결합 친화도에 대항하여 플롯된다. (B) 결합제로서 0.5 컨센서스 스코어 또는 500 nM의 컷오프에 기반한 상이한 MHC-I 결합 예측 알고리즘의 감수성 및 특이성에 대한 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선.
도 32: TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a) 상에 펩티드 항원 (A)으로서 전달된 자기-항원 및 신생항원은 확립된 흑색종의 CD8 및 CD4 T 세포-매개된 제거를 이끌어 낸다. 확립된 B16.F10 종양을 갖는 마우스를 제2일, 제9일 및 제16일에, PD1 및 Adpgk LP (B16.F10에 존재하지 않는 CD8 T 세포 에피토프), 자기-항원, Trp1, 최소 CD8 T 세포 에피토프, 또는 CD4 T 세포 에피토프를 갖는 신생항원, M30 LP를 전달하는 SNP-7/8a로 처리하였다.
도 33: 피하 및 정맥내 경로에 의해 투여된 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 전달된 신생항원은 확립된 종양의 강력한 CD8 T 세포-매개된 제거를 이끌어 낸다. 확립된 MC38 종양을 갖는 마우스를 제9일 및 제16일에 피하 또는 정맥내 경로에 의해 Adpgk LP-SNP-7/8a로 백신접종하고, 그 후 일련의 시점에서 종양 용적을 평가하였다.
도 34: TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 전달된 신생항원은 확립된 흑색종의 CD8 T 세포-매개된 제거를 이끌어 낸다. 확립된 B16.F10 종양을 갖는 마우스를 제1일, 제8일 및 제15일에, PDL1, 및 Med12 (CD8 T 세포 에피토프를 수반한 MC38 신생항원), Trp1 (CD8 T 세포 에피토프를 수반한 B16 자기-항원) 또는 M39 (CD8 T 세포 에피토프를 수반한 B16 신생항원)를 전달하는 SNP-7/8a로 처리하였다. (A) 종양 성장을 모니터링하였고 (B) 제17일에 CD8 T 세포 반응을 평가하였다.
도 35: TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 전달된 바이러스 (HPV) 항원은 HPV+ 종양의 CD8 T 세포-매개된 거부를 이끌어 낸다. (A & B) 마우스를, 제0일 및 제14일에 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는, 하전된 분자 (C)가 폴리(리신)이고 소수성 분자 (H)가 2B3W2인 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a"로서 지칭됨)로서 전달된 HPV로부터 유래된 상이한 E6 및 E7 펩티드 최소 에피토프 (Min)로 면역시켰다. (A) CD8 T 세포 반응을 제28일에 평가하고 마우스를 HPV+ 암 세포주 (TC1)로 시험 감염하였고, (B) 종양 용적을 시험 감염 후 제14일에 평가하였다.
도 36: 다중 항원 입자의 입자 크기 및 안정성. (A) 다양한 전하 (-6 내지 +6) 및 소수친수도 (GRAVY -2 내지 +2)을 수반한 펩티드 항원 (A) (A1 내지 A9)으로서의 신생항원 LP를, (B) TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 합성하였으며, 여기서 하전된 분자 (C)는 폴리(K)이고, B1은 VR이고, B2는 SPVZ이며, X1 링커 전구체는 아지도-리신 ("X"는 K'로서 지칭되기도 함)이고 소수성 분자 (H)는 2B3W2이다. 펩티드 항원 접합체를 PBS pH 7.4 하에 0.5 mg/mL로 현탁시키고, 혼탁도 (OD 490 nm) 및 입자 크기 (직경, nm)에 관하여 평가하였다. (C) 다수의 상이한 펩티드 항원 접합체 (A1-A9)를 포함하는 다중-항원 입자를 DMSO 용액에서 상이한 비율로 함께 혼합한 다음 (시나리오 1-7), PBS pH 7.4 하에 0.5 mg/mL로 현탁시키고 혼탁도 (OD 490 nm) 및 입자 크기 (직경, nm)에 관하여 평가하였다. 각각의 시나리오에 대하여 다중-항원 입자를 구성하는 각각의 펩티드 항원 접합체의 퍼센트가 표에 제공된다.
도 37: 종양-연관 자기-항원, 감염성 질환 (HIV) 항원 및 외래 항원을 전달하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체에 의해 유도된 T 세포 반응을 도시한다.
도 38: 상이한 하전된 분자 (C), 또는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 39: 상이한 PRR 효능제에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 40: 펩티드 항원 (A)이 상이한 링커 화학 (아미드 및 티오-에테르)을 사용하여 소수성 분자 (H)에 연결되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 41: 지방산, 지질 및 콜레스테롤에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 42: A-B 유형 디-블록 공중합체에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 IV 및 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 43: 미리 형성된 입자 (P)에 연결된 펩티드 항원 (A)에 기반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 안정성을 도시한다.
도 44: 면역관용을 유도하기 위해 사용되는 자가-항원을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
도 45: A-H + C-H 또는 A-H(C) (화학식 VI)로 구성된 입자의 입자 크기 및 생물학적 활성을 도시한다.
용어 및 방법의 세부사항은 본 개시내용을 실시하는데 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자를 가이드할 목적으로 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 화합물, 조성물, 방법 및 그의 용도에 관하여 더 큰 명확성을 제공하기 위해 하기에 제공된다. 본 개시내용에서의 용어는 특별한 실시양태의 더 나은 설명을 제공할 목적으로 유용한 것으로 이해되며 제한적인 것으로 간주되서는 안된다.
약: 본 개시내용의 맥락에서, "약"은 설정된 양으로부터 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다. 예를 들어, "약 10"은 9.5 내지 10.5를 지칭한다. "약 5:1"의 비는 4.75:1 내지 5.25:1의 비를 지칭한다.
아주반트: 항원의 면역원성을 증강시키거나 또는 변형시키기 위해 백신에 부가되는 임의의 물질. 아주반트는 전달 시스템, 예컨대 무기 염 (예를 들어, 명반으로서 지칭되는 수산화 알루미늄 또는 포스페이트 염)에 기반한 입자, 유중수 또는 수중유 에멀젼 또는 중합체 입자 (예를 들어, PLGA)일 수 있으며, 여기서는 항원이 단순히 그와 혼합되거나 또는 부착되거나, 그 내에 혼입되거나, 또는 공유 상호작용을 통하여 간접적으로 또는 직접적으로 연결된다. 또 다른 한편으로는, 아주반트는 패턴 인식 수용체 (PRR) 효능제, 예컨대 톨(Toll)-유사 수용체 (TLR)의 합성 또는 자연적으로 발생하는 효능제, 인터페론 유전자의 자극제 (STING), 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 유사 수용체 (NLR), 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체 (RLR) 또는 C-유형 렉틴 수용체 (CLR) 뿐만 아니라 생물학적 분자 ("생물학적 아주반트"), 예컨대 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL을 포함하여, 규정된 수용체에 결합하고 하류 시그널링 경로를 유도하는 화학적으로 규정된 분자일 수 있다. TLR-2/6의 효능제, TLR-4, STING 및 NOD 뿐만 아니라 톨-유사 수용체-7 (TLR-7) 및 TLR-7/8a와 각각 결합하는 뉴클레오티드 염기의 작은 분자 유사체, 예컨대 히드록시아데닌 및 이미다조퀴놀린이 본 개시내용에서 예시적인 PRR 효능제로서 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 아주반트가 익숙하다 (문헌 [Perrie et al., Int J Pharm 364:272-280, 2008 및 Brito et al., Journal of controlled release, 190C:563-579, 2014] 참조). 일반적으로, 본원에 열거된 임의의 PRR 효능제 또는 생물학적 아주반트는 임의의 적합한 수단을 통해 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체에 연결될 수 있다.
투여: 특정 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을, 임의의 유효한 경로에 의해 대상체에게 공급하거나 또는 제공하는 것.
예시적인 투여 경로는 경구, 주사 (예컨대, 피하, 근육내, 피내, 복강내 및 정맥내), 경피 (예를 들어, 국소), 비강내, 질 및 흡입 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"화합물의 투여" 및 "화합물을 투여하는 것"은 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 화합물의 프로드러그, 또는 제약 조성물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 화합물 또는 조성물은 또 다른 사람에 의해 대상체에게 투여될 수 있거나 또는 대상체에 의해 자기 투여될 수 있다.
항원 제시 세포 (APC): 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, T 세포 및 랑게르한스(Langerhans) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합된 항원을 T 세포에 제시하는 임의의 세포.
항원: T 세포 또는 B 세포 수용체에 결합하고 대상체에서 면역 반응, 특히 B 세포 반응 및/또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프를 함유하는 임의의 분자. 에피토프는 펩티드, 글리코펩티드, 지질, 또는 특이적 B 세포 또는 T 세포 단백질의 성분과 상호작용할 수 있는 에피토프를 함유하는 임의의 적합한 분자로 구성될 수 있다. 이러한 상호작용은 면역 세포에 의해 반응을 생성할 수 있다. "에피토프"는 B 및/또는 T 세포 단백질, 즉 B-세포 수용체 및 T-세포 수용체와 상호작용하는 펩티드 항원의 영역을 지칭한다.
본 개시내용의 실시양태에서 사용되는 항원은 병원체, 암성 세포, 자가-항원 또는 알레르겐으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 병원체 (예컨대, 바이러스, 박테리아 또는 진균) 또는 관심 조직 (예컨대, 암성 세포)으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 영역을 포함할 수 있는 펩티드-기반 항원일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원은 병원체로부터 유래된 전체 단백질 또는 당단백질, 또는 이러한 단백질 또는 당단백질의 펩티드 또는 글리코펩티드 단편일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원은 주로 종양 조직 (건강한 조직은 아님)에 의해 발현되고 종양-연관 항원인 단백질 또는 단백질의 펩티드 단편일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원은 자가면역과 연관되는 단백질 또는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 알레르기와 연관되는 단백질 또는 당단백질이다.
다수의 이러한 항원은 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있으며 본원에 보다 상세하게 논의된다.
방향족: 방향족 화합물은 고리를 형성하는 탄소 또는 질소 원자 사이에 비국재화된 홀수의 파이 오비탈 전자 쌍을 갖는 불포화 시클릭 고리이다. 방향족 아미노산은 방향족 기를 포함하는 측쇄를 갖는 것, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 포함한다. 3개의 이중 결합을 함유하는 6-탄소 고리인 벤젠은 원형적 방향족 화합물이다. 페닐알라닌 (Phe) 및 트립토판 (Trp)은 원형적 방향족 아미노산이다. 아릴은 방향족 치환기를 지칭할 수 있고 아릴-아민은 아민을 포함하는 방향족 기를 지칭할 수 있다. 예시적인 방향족 아민은 아닐린이다. 방향족 헤테로사이클은 탄소 및 또 다른 원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황을 포함하는 시클릭 고리 구조를 포함하는 방향족 고리를 지칭한다. 뉴클레오티드 염기, 예컨대 아데닌 및 시토신은 예시적인 방향족 헤테로사이클이다.
생체 적합성: 물질이 신체 유체, 세포 또는 조직과 접촉하는 동안 최소한의 파괴적 또는 숙주 반응 효과를 발휘하는 경우에, 이러한 물질은 생체 적합성인 것으로 간주된다.
생체 적합성 기는 하기 부류: 지방족, 지환족, 헤테로 지방족, 헤테로 지환족, 아릴 또는 헤테로아릴로부터의 것을 포함한, 화학적 모이어티를 함유할 수 있다. 그러나, 분자 조성에 따라, 이러한 모이어티가 항상 생체 적합성인 것은 아니다.
용어 "생체 적합성"은 또 다른 한편으로는, 인식 단백질 및/또는 생물학적 시스템의 다른 성분 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 항체, 당단백질을 포함한 세포 단백질, 또는 세포)과의 최소한의 상호작용; 또는 생물학적 시스템의 성분과의 상호작용을 유발하도록 구체적으로 의도된 물질 및 관능기 (예를 들어, 약물 및 프로드러그)로, 이러한 상호작용의 결과가 실질적으로 부정적이거나 파괴적이지 않도록 하는 것을 의미한다.
CD4: 다른 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 II 분자와 상호작용하는 표면 당단백질인 분화 클러스터 4. T 세포의 서브세트는 CD4를 발현하고, 이들 세포는 통상적으로 헬퍼 T 세포로서 지칭된다.
CD8: 다른 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I 분자와 상호작용하는 표면 당단백질인 분화 클러스터 8. T 세포의 서브세트는 CD8을 발현하고, 이들 세포는 통상적으로 세포독성 T 세포 또는 킬러 T 세포로서 지칭된다.
전하: 용질 및 용매를 포함한, 다른 원자 및 분자와의 상호작용에 영향을 미치는 물질의 물리적 특성. 하전된 물질은 다른 유형의 하전된 물질 뿐만 아니라 극성 분자와 같이 전하의 전체 정수 값을 보유하지 않는 분자로부터의 정전기력을 경험한다. 동일한 전하의 2개의 하전된 분자는 서로 밀어내는 반면, 상이한 전하의 2개의 하전된 분자는 서로 끌어 당긴다. 전하는 종종, 양 또는 음의 정수 단위로 기재된다.
하전된 분자 (C): 하전된 분자 (C)는 양 또는 음으로 하전된 하나 이상의 관능기를 갖는 임의의 분자를 지칭한다. 하전된 분자를 구성하는 관능기는 부분 또는 전체 정수 값의 전하일 수 있다. 하전된 분자는 단일 하전된 관능기 또는 다수의 하전된 관능기를 갖는 분자일 수 있다. 관능기는 영구적으로 하전될 수 있거나 또는 하전된 분자를 구성하는 관능기는 pH에 따라 전하를 가질 수 있다. 하전된 분자는 양으로 하전된 관능기, 음으로 하전된 관능기, 또는 양으로 하전된 관능기와 음으로 하전된 관능기 둘 다로 구성될 수 있다. 하전된 분자의 순 전하는 양, 음 또는 중성일 수 있다. 분자의 전하는 분자의 루이스 구조 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 허용된 방법에 기반하여 용이하게 추정될 수 있다. 전하는 유도 효과로부터 비롯될 수 있는데, 예를 들어, 전자 친화도에 있어서의 차이와 함께 결합된 원자는 극성 공유 결합을 초래하여 부분적으로 음으로 하전된 원자 및 부분적으로 양으로 하전된 원자를 야기할 수 있다. 예를 들어, 수소에 결합된 질소는 질소 상에 부분 음전하를 초래하고 수소 원자 상에 부분 양전하를 초래한다. 또 다른 한편으로는, 원자는 이러한 원자에 할당된 전자의 수가 원자의 원자 수 이하일 때 전체 정수 값의 전하를 갖는 것으로 간주될 수 있다. 관능기의 전하는 관능기를 구성하는 각각의 원자의 전하를 합함으로써 결정된다. 하전된 분자 (C)의 순 전하는 이러한 분자를 구성하는 각각의 원자의 전하를 합함으로써 결정된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 분자 또는 관능기 내의 각각의 원자의 공식 전하를 각각 합산함으로써, 분자 또는 개별 관능기의 전하를 추정하는 프로세스가 익숙하다.
하전된 분자 (C)는 생리적 pH, 예를 들어 pH 약 7.4 하에 산의 공액 염기로서 발생하는 것과 같은 음으로 하전된 관능기 (예를 들어, pKa가 약 6.5 미만인 관능기)를 포함할 수 있다. 이들은 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 포스포르아미데이트 및 포스포네이트를 보유하는 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하전된 분자는 생리적 pH에서 염기의 공액 산으로서 발생하는 것과 같은 양으로 하전된 관능기 (예를 들어, 염기의 공액 산의 pKa가 약 8.5 초과인 관능기)를 포함할 수 있다. 이는 1급, 2급 및 3급 아민 뿐만 아니라 암모늄, 구아니디늄을 보유한 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하전된 분자는 4급 암모늄, 포스포늄 및 술포늄 관능기를 포함하여, pH 독립적인 전하를 갖는 관능기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자는 음 또는 양으로 하전된 아미노산, 또는 음으로 하전된 아미노산과 양으로 하전된 아미노산 둘 다로 구성된 폴리(아미노산)이다. 일부 실시양태에서, 음으로 하전된 아미노산은 글루탐산 또는 아스파르트산이다. 다른 실시양태에서, 양으로 하전된 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다수의 이러한 실시양태가 가능하다는 것을 인식한다.
클릭 화학 반응: 최소, 생체 적합성 및/또는 무해한 부산물을 생성하는 고 수율 반응에서 온화한 조건 하에 두 화합물을 함께 연결하는 생물직교 반응을 지칭할 수 있다. 본 개시내용에 사용되는 예시적인 클릭 화학 반응은 링커 전구체 X1 상에 제공된 아지드 기와, 스트레인 촉진된 [3+2] 아지드-알킨 부가 환화를 통해 트리아졸 링커 (L)를 형성하는 링커 전구체 X2 상에 제공된 알킨과의 반응이다.
유효량: 원하는 반응을 유도하는데 필요한 양. 예를 들어, 펩티드 항원 접합체에 대한 면역 반응을 유도하는데 필요한, 예를 들어, 단독으로 또는 하나 이상의 부가 작용제와 함께 하는 작용제의 양.
연장부(들): 용어 연장부는 아미노산, 비-자연 아미노산; 친수성 에틸렌 옥시드 단량체 (즉, PEG); 소수성 알칸 쇄; 또는 그의 조합으로 구성되고 펩티드 항원 (A)의 분해 속도를 조정하는 기능을 하는, 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단에 연결된 분자를 설명하기 위해 본원에 사용된다. 펩티드 항원의 N-말단에 연결된 연장부는 B1로서 지칭되고, 펩티드 항원의 C-말단에 연결된 연장부는 B2로서 지칭된다. 연장부 (B1 및 B2)는 주로 펩티드 항원의 분해 속도를 제어하는 기능을 하지만 임의의 하나 이상의 부가 기능을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 또 다른 분자, 예컨대 하전된 분자 (C) 또는 소수성 분자 (H)에 연결될 수 있고, 링커로서 기능할 뿐만 아니라 다른 분자로부터의 펩티드 항원 (A)의 방출 속도를 제어할 수 있다. 부가의 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 임의의 2개의 이종 분자 사이에 거리, 즉 공간을 제공하는 기능을 한다. 다른 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 펩티드 항원 접합체에 소수성 또는 친수성 특성을 부여하는 기능을 한다. 또 다른 실시양태에서, 링커로서 사용된 연장부 (B1 및/또는 B2)의 조성은 펩티드 항원 (A)과 이종 분자 간에 강성 또는 유연성을 부여하도록 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 프로테아제와 같은 효소에 의한 인식 및 가수분해를 위해 선택되는 펩티드 서열이다. B1 및 B2 연장부는 또한, 각각 B1 및 B2 링커 또는 B1 및 B2로서 지칭될 수 있다는 것에 주목해야 한다. 본 개시내용의 실시에 적합할 것인 연장부의 구체적 조성은 본원 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
그라프트 중합체: 하나의 조성의 중합체가 상이한 조성의 제2 중합체의 측쇄에의 연결로부터 비롯되는 중합체로서 기재될 수 있다. 공단량체를 통해 제2 중합체에 연결된 제1 중합체가 그라프트 공중합체이다. 말단 기를 통해 제2 중합체에 연결된 제1 중합체는 블록 중합체 (예를 들어, A-B 유형 디-블록) 또는 말단-그라프트된 중합체로서 기재될 수 있다.
소수친수도 지수 / GRAVY 값: 아미노산의 소수성 또는 친수성 특징을 나타내는 수이다. 펩티드를 구성하는 아미노산의 상대적 소수성 및 친수성 특징을 설명하기 위해 사용될 수 있는 각종 척도가 있다. 본 개시내용에서, 카이트(Kyte)와 두리틀(Doolittle)의 소수친수도 척도 (문헌 [Kyte J, Doolittle RF, J. Mol. Biol 157: 105-32, 1983])는 펩티드 항원 (A), 펩티드-기반 N- 및 C-말단 임의적 연장부 (B1 및 B2) 및 임의적 하전된 분자 (C)를 포함한 펩티드 항원 접합체를 구성하는 아미노산 서열의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값 (종종 GRAVY 스코어로서 지칭됨)을 계산하기 위해 사용된다. 펩티드의 GRAVY 값은 펩티드를 구성하는 모든 아미노산의 소수친수도 값의 합을 펩티드의 길이 (즉, 아미노산 수)로 나눈 값이다. GRAVY 값은 상대 값이다. GRAVY 값이 더 클수록, 펩티드 서열이 더 소수성인 것으로 간주되는 반면, GRAVY 값이 더 낮을수록, 펩티드 서열이 더 친수성인 것으로 간주된다.
친수성: 물질이 수성 매질에서 자유롭게 분산되는 경향을 지칭한다. 물질이 다른 친수성 물질과 상호작용하는 것을 선호하고 소수성 물질과의 상호작용을 피하는 경우, 그러한 물질은 친수성인 것으로 간주된다. 일부 경우에, 친수성은 상대적인 용어로서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 동일한 분자는 친수성으로서 기재될 수 있거나 또는 비교되는 것에 의존하지 않을 수 있다. 친수성 분자는 종종 극성 및/또는 하전되고 우수한 수 용해도를 가지며, 예를 들어 0.1 mg/mL 또는 그 초과까지 가용성이다.
소수성: 물과의 접촉을 피하는 물질의 경향을 지칭한다. 물질이 다른 소수성 물질과 상호작용하는 것을 선호하고 친수성 물질과 상호작용을 피하는 경우, 그러한 물질은 소수성인 것으로 간주된다. 소수성은 상대적 용어이며; 동일한 분자는 소수성으로서 기재될 수 있거나 또는 비교되는 것에 의존하지 않을 수 있다. 소수성 분자는 종종 비-극성이고 비-하전되며 불량한 수 용해도를 가지고, 예를 들어 0.1 mg/mL 또는 그 미만에 이르기까지 불용성이다.
소수성 리간드: 생물학적 수용체에 결합하고 소수성 특징을 갖는 분자이다. 일부 실시양태에서, 소수성 리간드는 중합체의 주쇄를 따라 어레이됨으로써, 그에 연결되는 중합체에 소수성 특성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 소수성 리간드는 제한된 수 용해도를 가지므로, 소수성으로서 기재될 수 있는 패턴 인식 수용체 효능제이다. 부가의 실시양태에서, 소수성 리간드는 TLR-7 또는 TLR-7/8 효능제, 예컨대 이미다조퀴놀린이다.
소수성 분자 (H): 본 개시내용에서, 용어 "소수성 분자" (H)는 펩티드 항원에 연결되어 수성 조건에서 입자를 형성하는 펩티드 항원 접합체를 생성할 수 있는, 제한된 수 용해도 또는 양친매성 특징을 갖는 분자를 설명하기 위한 일반적인 용어로서 사용된다. 이와 관련하여 소수성 분자 (H)는 특정 온도 및 pH 범위에 걸쳐 수성 조건에서 그의 불량한 용해도, 또는 입자로 어셈블리되는 경향으로 인해 입자 어셈블리를 촉진시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 소수성 분자 (H)는 초분자 구조, 예컨대 미셀 또는 이중층 형성 층상 또는 다중 층상 구조 (예를 들어, 리포솜 또는 폴리머솜)를 형성할 수 있는 양친매성 분자 뿐만 아니라 완전히 불용성이고 응집체만을 형성하는 화합물을 포함한다. 분자의 소수성 특징은 온도- 및/또는 pH-반응성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 낮은 온도에서는 수용성이지만, 예를 들어, 20℃ 이상 온도, 예컨대 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40℃에서는 불용성이거나 또는 미셀을 형성하는 중합체이다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 낮은 pH, 예를 들어 6.5 미만의 pH에서 수용성이지만, 예를 들어 6.5 초과의 pH에서는 불용성인 중합체이다. 소수성 분자 (H)의 예는 지방산, 콜레스테롤 및 그의 유도체, 장쇄 지방족, 지질 및 다양한 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA) 뿐만 아니라 주로 소수성 아미노산으로 구성된 폴리(아미노산)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 다수의 소수성 리간드가 부착된 친수성 중합체이다. 본 개시내용의 실시에 유용한 각종 소수성 분자가 본원에 개시된다.
면역 반응: 예컨대, 세포성 또는 시토카인 중개를 통하여 직접 또는 간접적으로 자극의 결과로서, 면역 체계의 세포, 예컨대 B 세포, T 세포 또는 단핵구의 활성에 있어서의 변화. 한 실시양태에서, 상기 반응은 특별한 항원에 특이적이다 ("항원-특이적 반응"). 한 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대 CD4 T 세포 반응 또는 CD8 T 세포 반응이다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 부가의 T 세포 자손의 생산을 초래한다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포의 이동을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 반응은 B 세포 반응이며, 특이적 항체의 생산 또는 부가의 B 세포 자손의 생산을 초래한다. 다른 실시양태에서, 상기 반응은 항원 제시 세포 반응이다. "면역 반응을 증강시키는 것"은 아주반트와 면역원, 예컨대 펩티드 항원 접합체의 일부로서의 펩티드 항원의 공동 투여를 지칭하며, 여기서 아주반트의 부재 하에 대상체에게 면역원을 투여하는 것과 비교해서 아주반트는 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 암성 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포의 활성화를 야기하는 면역 반응을 자극하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역관용 또는 면역 억제를 유도하는데 사용된다. 면역관용성 반응은 항원에 대한 T 세포 또는 B 세포의 비-반응성으로부터 비롯될 수 있다. 억제성 면역 반응은 면역 반응을 하향 조절하는, 즉 면역 반응을 약화시키는 조절 세포, 예컨대 조절 T 세포의 활성화로부터 비롯될 수 있다. 아주반트의 부재 하에 환자에게 투여된 항원은 일반적으로, 면역관용성 또는 억제성이고, 아주반트와 함께 투여된 항원은 일반적으로, 자극성이며 면역 세포의 동원, 확장 및 활성화로 이어진다.
면역원성 조성물: 항원 및 임의로 항원에 대항한 측정가능한 면역 반응을 유도하는 아주반트를 포함하는 물질의 제형.
리간드: 생물학적 수용체에 결합하는 임의의 분자를 설명하기 위한 일반적인 용어이다. 패턴 인식 수용체 효능제는 패턴 인식 수용체에 결합하는 특이적 유형의 리간드이며, 또한 아주반트 또는 아주반트 특성을 갖는 리간드로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, PRR 효능제는 PRR, 예컨대 TLR에 결합하는 리간드이다. PRR에 결합하는 리간드 (또는 PRRa)는 또한, 아주반트, 분자 아주반트, 아주반트 분자 또는 아주반트 특성을 갖는 리간드로서 지칭될 수 있다. 수중 용해도가 제한된 리간드는 소수성 리간드로서 지칭될 수 있는 반면, 수용성인 리간드는 친수성 리간드로서 지칭될 수 있다. 아주반트 특성을 갖는 소수성 리간드 또는 친수성 리간드는 각각 소수성 아주반트 또는 친수성 아주반트로서 지칭될 수 있다.
연결된 또는 커플링된: 용어 "연결된" 또는 "커플링된"은 직접 또는 간접적으로 함께 연결된 것을 의미한다. 제1 모이어티는 제2 모이어티에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 분자는 공유 결합에 의해 또 다른 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 분자는 정전기적 인력에 의해 또 다른 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 분자는 쌍극자-쌍극자 힘 (예를 들어, 수소 결합)에 의해 또 다른 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 분자는 반 데르 발스 힘 (런던 힘으로서 공지되기도 함)에 의해 또 다른 분자에 연결된다. 제1 분자는 이러한 커플링의 임의의 및 모든 조합에 의해 또 다른 분자에 연결될 수 있다.
분자는, 예컨대 링커를 사용함으로써 간접적으로 연결될 수 있다. 분자는 두 분자와 독립적으로 비-공유적으로 결합하는 성분의 개입에 의해 간접적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "연결된" 및 그의 변형은 적어도 세포, 특히 면역 세포와 접촉할 때까지, 면역화 후를 포함하여 분자를 화학적 또는 물리적 회합으로 유지하는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 연결된 성분들은 적어도 세포, 예컨대 면역 세포와 접촉할 때까지, 성분들이 서로 자유롭게 분산되지 않도록 회합된다. 예를 들어, 2개의 성분은 서로 공유적으로 연결되어, 이러한 2개의 성분이 별도로 분산 또는 확산될 수 없도록 한다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 직접적으로, 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 공유적으로 결합되는 펩티드 항원 (A)으로 구성된다. 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 수성 조건에서 입자로 어셈블리되며, 여기서 2개 이상의 펩티드 항원 접합체는 안정성을 형성하도록 회합되며, 여기서 개별 펩티드 항원 접합체 및 펩티드 항원 접합체를 구성하는 성분은 세포, 예컨대 면역 세포와 접하기 전에 분산 또는 확산될 수 없다.
연결은, 예를 들어 종래의 백신, 예를 들어 아주반트와 혼합된 수용성 펩티드 항원을 함유하는 백신에서 발견될 수 있는 바와 같은 항원과 아주반트의 단순한 혼합물과 구체적으로 구별된다. 단순한 혼합물에서는, 상기 성분들이 백신접종된 조직 내에서 및 그 이상으로 독립적으로 자유롭게 분산될 수 있다.
링커, 링커 전구체 및 링커 (L): 링커는 둘 이상의 모이어티를 함께 연결 또는 커플링 또는 결합시키는 분자 또는 원자 군이다. 본원에 개시된 펩티드 항원 접합체는 임의의 적합한 수단을 통해 함께 연결되거나 또는 결합될 수 있는, 다수의 상이한 기능성 성분 (펩티드 항원 (A), 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2), 임의적 하전된 분자 (C), 임의적 링커 (L), 또는 임의적 아주반트(들) 등)을 포함하는 복합 분자이다. 예를 들어, 소수성 분자 (H)에 연결되는 펩티드 항원 (A)은 펩티드 항원 (A)과 소수성 분자 (H) 사이에 링커를 사용할 수 있다. 펩티드 항원 (A)은 임의의 적합한 링커를 포함한 임의의 적합한 수단을 통하여, 직접적으로 또는 링커 (L), 연장부 (B1 또는 B2) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 커플링되는 모이어티 둘 다에 공유적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 링커는 이작용성이며, 이는 링커가 2개의 부위에 관능기를 포함한다는 것을 의미하고, 여기서 관능기는 링커를 2개의 모이어티에 커플링하는데 사용된다. 2개의 관능기는 동일하거나 (동종이작용성 링커로 간주될 것임) 또는 상이할 수 있다 (이종이작용성 링커로 간주될 것임). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 알킨 및 산을 추가로 포함하는 이종-이작용성 링커를 포함하는 링커 전구체 X2는 아민을 보유하는 소수성 분자 (H)와, 아지드를 보유하는 링커 전구체 X1에 연결된 펩티드 항원 (A)을 연결하는데 사용되며; 링커 전구체 X2의 산과 알킨은 반응하여, 아민 및 아지드를 각각 수반한 아미드 및 트리아졸 결합을 형성하여, 2개의 이종 분자를 연결시킨다. 일부 실시양태에서, 이종이작용성 링커를 포함하는 링커 전구체 X2는 산에 연결된 디벤조시클로옥틴 (DBCO) 분자이다. 다른 실시양태에서, 링커 전구체는 아민과 티올을 연결하는 말레이미드 또는 2개의 아민을 연결하는 비스(카르복실산)에 연결된 산이다. 또 다른 실시양태에서, 삼작용성 또는 다작용성 링커가 사용될 수 있으며, 여기서 연결은 동일하거나 상이하다. 다른 실시양태에서, 절단가능한 N- 또는 C-말단 펩티드 연장부 (B1 또는 B2)는 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H)에 연결하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 펩티드 연장부 (B1 또는 B2)는 이종이작용성이며, 예를 들어, B2 연장부의 N-말단 아민은 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되고, B2 연장부의 C-말단 카르복실 기는 소수성 분자 (H)에 직접적으로 연결된다. 연장부 (B1 또는 B2)는 링커로서 기능할 수 있지만, 모든 링커가 연장부인 것은 아니다.
링커 (L)는 링커 전구체 X1과 링커 전구체 X2의 반응으로부터 생성되고 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 특이적으로 연결시키는 기능을 하는 링커의 특이적 서브세트이다. 링커는 부위-선택적으로 커플링되는, 즉 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)와 함께 결합 또는 연결시키는 특이적 기능을 수행한다. 링커 전구체 X1은 전형적으로 고체 상 펩티드 합성 동안 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 펩티드 항원에 연결될 수 있다. 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단에 직접적으로 연결된 링커 전구체 X1은 펩티드 항원의 분해 속도를 조정하는 기능을 구체적으로 하지 않기 때문에 연장부로 간주되지 않는다는 것에 주목해야 한다. 링커 전구체 X1은 펩티드 항원 (A)의 분해 속도에 일부 영향을 미칠 수 있지만, 링커 전구체 X1은 펩티드 항원 (A)의 분해 속도 또는 다른 분자로부터의 그의 방출을 조정하도록 선택되지 않으며, 대신 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 특이적으로 연결시키는 기능을 한다.
일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 고체 상 펩티드 합성 동안 펩티드 항원 (A)에 연결될 수 있으며; 이러한 연결은 직접적이거나, 또는 분해성 펩티드 링커를 포함한 연장부 (B1 또는 B2)를 통한 간접적일 수 있다. 전형적으로, 펩티드 항원 (A)에 직접 또는 간접적으로 연결된 링커 전구체 X1은 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 상에 제공된 링커 전구체 X2와의 생물직교 반응을 촉진하도록 선택된다. 생물직교 반응은 펩티드 항원 (A)을 구성하는 임의의 아미노산의 변형을 초래하지 않으면서 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 대한 펩티드 항원 (A)의 부위-선택적 연결을 허용한다. 생물직교 반응을 허용하는 바람직한 링커 전구체 X1은 아지드 또는 알킨을 보유하는 것을 포함한다. 항원의 조성에 따라 부위-선택적 반응성을 허용하는 부가의 링커 전구체 X1은 티올, 히드라진, 케톤 및 알데히드를 포함한다. 여러 실시양태에서, 링커 전구체는 아지드 관능기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 아지드를 보유하는 비-자연 아미노산, 예를 들어, 아지도-리신 Lys(N3)이다. 이러한 실시양태에서, 아지드 관능기를 보유하는 링커 전구체 X1에 연결된 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H) 상에 제공된 알킨 보유 링커 전구체 X2와 반응하여, 펩티드 항원 (A)과 소수성 분자 (H)를 연결하는 트리아졸 링커를 형성시킬 수 있다. 다양한 링커 전구체 (X1 및 X2) 및 링커는 본원 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
본원에서, 링커 및 링커 전구체 X1은 둘 다 태그 (T)로서 지칭될 수 있지만, 태그 (T)의 맥락은 태그 (T)가 링커인지 아니면 링커 전구체 (X1)인지를 식별하기 위해 사용된다. 임의적 연장부 (B1 또는 B2) 또는 임의적 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결되지만 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에는 연결되지 않은 태그 (T)가 또한, 링커 전구체 X1로서 지칭될 수 있다. 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결하는 태그 (T)는 또한, 링커 (L)로서 지칭될 수 있다. 링커 전구체 X2는 링커 전구체 X1과 반응하여 링커를 형성한다. 링커 전구체 X1은 종종 태그로서 지칭될 수 있고, 링커 전구체 X2는 태그에 대해 특이적이거나 또는 반응성인 관능기를 포함하는 태그 반응성 모이어티 또는 태그 반응성 분자로서 지칭될 수 있다.
순 전하: 분자, 또는 명시된 경우 분자의 일정 절편에 의해 운반되는 정전하의 합.
입자: 분자의 어셈블리로 구성된 나노- 또는 마이크로-크기의 초분자 구조. 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체는 미셀 또는 다른 초분자 구조로 어셈블리되는 미리 형성된 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)을 포함한다. 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 세포 (예를 들어, 면역 세포, 예컨대 항원 제시 세포) 내로 흡수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 수용액 중의 입자를 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체에 의한 입자 형성은 pH 또는 온도에 의존적이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 나노입자는 5 나노미터 (nm) 내지 500 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 나노입자는 100 nm 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 나노입자는 면역 세포에 의해 흡수되기에는 너무 큰 더 큰 입자 구조에 포함되며 (예를 들어, 약 5000 nm 초과 입자), 펩티드 항원 접합체를 포함하는 더 작은 나노입자를 서서히 방출한다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 나노입자를 형성한다. 나노입자는 소수성 상호작용을 통해 펩티드 항원 접합체의 회합에 의해 형성되므로 초분자 어셈블리로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 미셀이다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자 미셀은 약 5 내지 50 nm 직경이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 미셀을 형성하고, 이러한 미셀 형성은 온도-의존적, pH-의존적, 또는 온도- 및 pH-의존적 둘 다이다. 일부 실시양태에서, 개시된 나노입자는 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예를 들어, PRR 효능제에 연결된 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)으로 구성되는 펩티드 항원 접합체를 포함하고; 나노입자에서 펩티드 항원이 PRR 효능제와 함께 연결되면, PRR 효능제가 대상체에게 투여된 후 자유롭게 분산되는 것을 방지하여 전신 독성을 방지시켜 준다.
입자는 펩티드 항원 접합체를 구성하는 개별 분자의 어셈블리에 의해 형성될 수 있거나, 또는 미리 형성된 입자 (P)에 연결된 펩티드 항원 (A)으로 구성된 펩티드 항원 접합체의 경우에는, 입자가 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 가교될 수 있다.
미리 형성된 입자 (P) / 화학식의 입자 (P): 미리 형성된 입자 (P) 또는 단순히 '입자' (P)는 펩티드 항원 (A)에의 연결 전에 이미 형성된 입자를 설명한다. 따라서, 입자 (P)는 화학식의 입자를 설명하기 위해 사용되며 소수성 분자 (H)를 포함하는 둘 이상의 펩티드 항원 접합체의 어셈블리에 의해 형성된 입자와는 뚜렷이 구별된다. 명확성을 위해, 펩티드 항원 접합체의 어셈블리에 의해 형성된 입자는 미리 형성된 입자 (P) 또는 화학식의 입자 (P)와 뚜렷이 구별된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 입자 (P)에 직접 또는 간접적으로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성할 수 있고, 펩티드 항원 접합체는 수성 조건에서 입자일 수 있다.
펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자와 미리 형성된 입자 (P) 간을 묘사하기 위해, 미리 형성된 입자 또는 화학식의 입자 (P)를 언급할 때, 문자 p는 항상 '입자'에서 대문자로 표시되고, 그 다음에 괄호 대문자 'P'가 오는데, 즉 "입자 (P)"이다. 일부 실시양태에서, 입자 (P)는 수성 조건에서 형성된 다음, 펩티드 항원 (A)에 연결되어 수성 조건에서 입자로서 잔존하는 펩티드 항원 접합체를 형성하는 PLGA 입자 (P)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자 (P)는 지질, 예컨대 리포솜 입자 (P)로 구성될 수 있으며, 이는 수성 조건에서 형성된 다음, 펩티드 항원 (A)에 연결되어 수성 조건에서 입자로서 잔존하는 펩티드 항원 접합체를 형성한다.
패턴 인식 수용체 (PRR): 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP) 뿐만 아니라 손상 연관 분자 패턴 (DAMP)으로서 지칭되는 다양한 군의 합성 및 자연적으로 발생하는 분자에 결합하는 다양한 세포 집단, 특히 선천 면역 세포에 의해 발현된 수용체. PAMP는 특정 미생물 유기체 및 바이러스 상에 존재하는 보존된 분자 모티프이다. DAMP는 세포 사멸 또는 손상 동안 방출되거나 또는 발현되는 세포성 성분이다.
패턴 인식 수용체의 PAMP 또는 DAMP 활성화는 세포내 시그널링 캐스케이드를 유도하여 숙주 세포의 생리를 변경시킨다. 이러한 생리적 변화는 다양한 염증 유발성 및 생존 증진성 유전자의 발현을 유도하기 위해 세포의 전사 프로파일에 있어서의 변화를 포함할 수 있다. 이들 유전자의 협조된 발현은 적응 면역을 증강시킬 수 있다.
PRR에는 여러 부류가 있다. PRR의 비제한적 예는 톨-유사 수용체 (TLR), RIG-I-유사 수용체 (RLR), NOD-유사 수용체 (NLR), 인터페론 유전자 수용체의 자극제 (STING), 및 C-유형 렉틴 수용체 (CLR)를 포함한다. 이러한 PRR의 효능제는 표적 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
PRR의 효능제는 아주반트이고, 리간드 또는 아주반트 특성을 갖는 리간드로서 지칭될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, PRR 효능제는 펩티드 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 아주반트로서 사용된다.
톨-유사 수용체 (TLR) 1-13은 다양한 범위의 PAMP를 인식하는 막횡단 PRR이다. TLR에는 크게 두 가지 범주: 세포 표면에 국한된 것과 엔도솜 루멘에 국한된 것이 있다. 세포 표면에 존재하는 TLR은 전형적으로, 박테리아의 인식에 중요하다. 엔도솜의 루멘에 국한되는 TLR, 예컨대 TLR 3, 7, 8 및 9는 핵산을 인식하는 역할을 하므로, 바이러스를 인식하고 항바이러스 면역 반응을 촉진시키는데 있어서 전형적으로 중요하다. 폴리이노신산-폴리시티딜산은 TLR-3에 대한 리간드이다. TLR-7 및 TLR-8은 단일 가닥 RNA 뿐만 아니라 뉴클레오티드 염기 유사체 및 이미다조퀴놀린을 인식한다. TLR-9는 주로 박테리아에서 발견되는, 메틸화되지 않은 데옥시시티딜레이트-포스페이트-데옥시구아닐레이트 (CpG) DNA를 인식한다.
NOD-유사 수용체 (NLR) 및 RIG-I-유사 수용체 (RLR)는 세포질에 국한된다. RLR의 비제한적 예는 RIG-I, MDA5 및 LGP2를 포함한다. 5개의 구조적으로 관련된 NLR 패밀리 A, B, C, P 및 X로 세분될 수 있는 22개의 인간 NLR이 있다. 모든 NLR은 3개의 도메인, 즉 시그널링에 관여하는 N-말단 도메인, 뉴클레오티드-결합 NOD 도메인, 및 리간드 인식에 중요한 C-말단 류신 풍부 영역 (LRR)을 갖는다. NLR의 비제한적 예는 NALP3 및 NOD2를 포함한다.
패턴 인식 수용체에 관한 더 많은 정보를 위해, 문헌 [Wales et al., Biochem Soc Trans., 35:1501-1503, 2007]을 참조할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드: 아미드 결합을 통해 함께 연결되는 둘 이상의 자연 또는 비-자연 아미노산 잔기. 아미노산 잔기는 번역 후 변형(들) (예를 들어, 글리코실화 및/또는 인산화)을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 생체 내에서 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연일 수 있는 번역 후 변형을 모방할 수 있다. 펩티드 항원 접합체의 성분 중 임의의 하나 이상은 펩티드로 구성될 수 있다.
펩티드의 길이에 대한 개념적 상한치는 없다. 펩티드의 길이는 전형적으로, 적용에 따라 선택된다. 여러 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 3 내지 1,000개 아미노산 길이, 전형적으로는 300개 이하의 아미노산 길이일 수 있는 펩티드로 구성된다. 일부 실시양태에서, N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2)는 약 1 내지 8개 아미노산 길이의 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산, 또는 양으로 하전된 아미노산과 음으로 하전된 아미노산 둘 다로 구성된 펩티드이고, 전형적으로 16개 이하의 아미노산 길이이다.
바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 5 내지 약 50개의 아미노산, 전형적으로 약 7 내지 35개의 아미노산, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개의 아미노산의 펩티드이다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 약 50개 이상의 아미노산 길이이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 단백질로 간주될 수 있다.
펩티드 항원 (A)은 최소 에피토프 (종종 min 또는 ME로서 지칭됨), 또는 최소 에피토프를 포함하는 긴 펩티드 (종종 LP 또는 SLP로서 지칭됨)일 수 있다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 최소 에피토프 또는 긴 펩티드가 펩티드 항원 접합체로서 전달된다고 하는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 이러한 최소 에피토프 또는 긴 펩티드가 펩티드 항원 (A)인 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 임의적 하전된 분자 (C), 항원 (A), 임의적 연장부 (B1 및 B2), 및 링커 전구체 X1은 아미노산이고, 종종 "펩티드 항원 단편"으로서 지칭되는 연속되는 펩티드 서열로서 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 항원 단편의 순 전하 또는 GRAVY의 계산은 링커 전구체 X1을 포함하지 않는다는 것에 주목해야 한다.
펩티드 항원을 지칭하는 펩티드 서열은 "PA"로서 지명되고, N-말단 연장부 (B1)를 지칭하는 펩티드 서열은 "PN"으로서 지명되며, C-말단 연장부 (B2)를 지칭하는 펩티드 서열은 "PC"로서 지명된다. 펩티드 항원 (A)을 구성하는 아미노산의 서열은 화학식 PA1...PAn으로서 나타내며, 여기서 PA는 펩티드 항원 (A)을 구성하는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, n은 정수 값이다. 예를 들어, 8개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 PA1-PA2-PA3-PA4-PA5-PA6-PA7-PA8로서 나타낼 수 있다. N-말단 연장부 (B1)를 구성하는 아미노산의 서열은 화학식 PN...PNn으로서 나타내며, 여기서 PN은 N-말단 연장부를 구성하는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, n은 정수 값이다. C-말단 연장부 (B2)를 구성하는 아미노산의 서열은 화학식 PC1...PCn으로서 나타내며, 여기서 PC는 C-말단 연장부를 구성하는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, n은 정수 값이다.
펩티드 변형: 펩티드는 하기에 제시된 바와 같은 여러 변형 중 하나 이상으로 변경되거나 또는 달리 합성될 수 있다. 또한, 이들 펩티드의 유사체 (비-펩티드 유기 분자), 유도체 (펩티드로부터 출발하여 수득된 화학적으로 관능화된 펩티드 분자) 및 변이체 (상동체)가 본원에 기재된 방법에 활용될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드는 L- 및/또는 D-버전일 수 있는 아미노산, 유사체, 유도체 및 변이체의 서열로 구성된다. 이러한 펩티드는 자연적으로 발생하는 펩티드, 유사체, 유도체 및 변이체, 및 그 밖의 것을 함유할 수 있다.
펩티드는 비-변형된 펩티드와 본질적으로 동일한 활성을 가지며 임의로 다른 바람직한 특성을 갖는 유도체를 생산하기 위해 각종 화학적 기술을 통해 변형될 수 있다. 예를 들어, 카르복실 말단에서든지 아니면 측쇄에서든지 간에, 펩티드의 카르복실산 기는 제약상 허용되는 양이온의 염 형태로 제공되거나 또는 CC1-CC16 에스테르를 형성하도록 에스테르화될 수 있거나 (여기서 CC는 탄소 쇄 지칭하므로, CC1은 단일 탄소를 지칭하고 CC16은 16개의 탄소를 지칭함), 또는 아미드로 전환될 수 있다. 아미노 말단에서든지 아니면 측쇄에서든지 간에, 펩티드의 아미노 기는 제약상 허용되는 산 부가 염, 예컨대 HCl, HBr, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 벤조산, 톨루엔 술폰산, 말레산, 타르타르산 및 다른 유기 염의 형태일 수 있거나, 또는 변형될 수 있거나 또는 아미드로 전환될 수 있다.
아미노산은 공유 연결을 통해 PRR 효능제, 예컨대 TLR 효능제, 예를 들어, 이미다조퀴놀린-기반 TLR-7 또는 TLR-7/8 효능제를 함유하도록 변형될 수 있다.
펩티드는 양전하 또는 음전하 또는 둘 다를 함유하는 치환기를 함유하도록 변형될 수 있다. 양전하 및/또는 음전하는 펩티드가 존재하는 pH에 의해 영향을 받을 수 있다.
펩티드 측쇄의 히드록실 기는 널리 인식된 기술을 사용하여 CC1-CC16 알콕시 또는 CC1-CC16 에스테르로 전환될 수 있거나, 또는 히드록실 기는 음전하를 도입하도록 전환될 수 있다 (예를 들어, 황산화되거나 또는 인산화됨). 펩티드 측쇄의 페닐 및 페놀 고리는 하나 이상의 할로겐 원자, 예컨대 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘으로 치환되거나, 또는 CC1-CC16 알킬, CC1-CC16 알콕시, 카르복실산 및 그의 에스테르, 또는 이러한 카르복실산의 아미드로 치환될 수 있다. 펩티드 측쇄의 메틸렌 기는 상동 CC2-CC4 알킬렌으로 연장될 수 있다. 티올은, 예를 들어 말레이미드와의 반응을 통해 디술피드 결합 또는 티오에테르를 형성하는데 사용될 수 있다. 티올은 다수의 널리 인식된 보호기 중 어느 하나, 예컨대 아세트아미드 기로 보호될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한, 안정성을 증강시키는 구조에 입체 형태적 제약을 선택하고 제공하기 위해 본 발명의 펩티드 내로 시클릭 구조를 도입하는 방법을 인식할 것이다. 관능기에 대해 이루어질 수 있는 부가의 변형에 관한 세부사항은 문헌 [Greene et al., "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis" Fourth Edition, John Wiley & Sons, Inc. 2006]을 참조할 수 있다.
펩티드 항원 (A)의 펩티드 모방제 및 유기 모방제 실시양태가 고려됨으로써, 이러한 펩티드 모방제 및 유기 모방제의 화학적 구성분의 3차원 배열은 펩티드 주쇄 및 성분 아미노산 측쇄의 3차원 배열을 모방하여, 면역관용 또는 면역 억제를 유도할 수 있는 측정가능한 능력, 또는 자극성 면역 반응, 예컨대 세포독성 T 세포 또는 항체 반응을 생성할 수 있는 증강된 능력을 갖는 면역원성 펩티드의 펩티드 모방제 및 유기 모방제가 생성된다.
제약상 허용되는 비히클: 본 개시내용에 유용한 제약상 허용되는 담체 (비히클)은 통상적이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에는 하나 이상의 치료 조성물, 예컨대 하나 이상의 치료 암 백신, 및 부가의 의약품의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제형이 기재되어 있다.
일반적으로, 담체의 성질은 이용되는 특별한 투여 방식에 좌우될 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 통상적으로, 비히클로서 제약상 및 생리학상 허용되는 유체, 예컨대 물, 생리 식염수, 균형잡힌 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고형 조성물 (예를 들어, 분말, 환제, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 비-독성 고체 담체는, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여될 제약 조성물은 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
극성: 물질의 특성에 대한 설명. 극성은 상대적인 용어이며, 질소와 수소 사이의 결합과 같이 분자 내에서 함께 결합된 원자들 사이의 전기 음성도 상의 차이로부터 비롯되는 부분 전하를 갖는 분자 또는 분자의 일부분을 설명할 수 있다. 극성 분자는 다른 극성 분자와 상호작용하는 것을 선호하며, 전형적으로 비-극성 분자와 회합되지 않는다. 구체적인 비제한적 경우에, 극성 기는 하이드록실 기, 또는 아미노 기, 또는 카르복실 기 또는 하전된 기를 함유할 수 있다. 구체적인 비제한적 경우에, 극성 기는 극성 용매, 예컨대 물과 상호작용하는 것을 선호할 수 있다. 구체적인 비제한적 경우에, 부가의 극성 기의 도입은 분자의 일부분의 용해도를 증가시킬 수 있다.
중합체: 반복 구조 단위 (단량체)를 포함하는 분자. 본 개시내용 전반에 걸쳐 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 중합체는 펩티드 항원 접합체의 임의의 수의 성분에 사용될 수 있고 자연 또는 합성일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 소수성 또는 양친매성 중합체가 소수성 분자 (H)로서 사용되고 펩티드 항원 접합체의 입자 어셈블리를 구동한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 아미노산을 포함하는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 연장부 (B1 및 B2)는 중합체, 예컨대, 예를 들어, PEG, 폴리(아미노산) 또는 그의 조합을 포함한다. 개시된 실시양태에 포함된 중합체는 불리한 부작용을 유발시키지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있는 중합체 나노입자를 형성할 수 있다. 개시된 실시양태에 포함된 중합체는 면역 반응을 유발시키거나 또는 질환을 치료 및/또는 완화시키기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 중합체 나노입자를 형성할 수 있다. 개시된 실시양태에 포함된 중합체는, 예를 들어, 면역 억제 또는 면역관용을 유도하기 위해 사용되는 아주반트 또는 분자, 예컨대 매크로라이드, 예를 들어 라파마이신에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있는 관능기를 갖는 측쇄를 포함할 수 있다. 여러 실시양태에서, 중합체는 링커를 통해 연결된 2개 이상의 중합체 블록을 함유하여 블록 공중합체, 예컨대 양친매성 디-블록 공중합체를 창출할 수 있다. 여러 실시양태에서, 중합체 블록은 특질상 주로 소수성일 수 있다. 여러 실시양태에서, 중합체는 펩티드, 그의 유사체, 유도체 및 변이체로 이루어진다. 본 발명의 실시에 유용한 중합체의 다양한 조성이 다른 곳에서 더 상세하게 논의된다.
중합: 통상적으로 촉매, 열 또는 빛으로 수행되는 화학 반응으로, 여기서 단량체는 조합하여 쇄 유사 또는 가교된 거대 분자 (중합체)를 형성한다. 쇄는 추가로, 적절한 치환기 및 화학 반응을 사용하여 부가의 화학 합성에 의해 조합될 수 있다. 단량체는 반응성 물질을 함유할 수 있다. 중합은 통상적으로 부가 또는 축합에 의해 일어난다. 부가 중합은 개시제, 통상적으로 자유 라디칼이 단량체 내의 이중 결합과 반응할 때 발생한다. 자유 라디칼은 상기 이중 결합의 한쪽에 부가되어 다른 쪽에 자유 전자를 생산한다. 이어서, 이러한 자유 전자는 또 다른 단량체와 반응하고, 쇄는 자기 전파되므로, 성장하는 쇄의 끝에 한 번에 하나씩 단량체 단위를 부가한다. 축합 중합은 물 분자로부터 분리되는 2개의 단량체의 반응을 포함한다. 다른 형태의 중합에서, 단량체는 고체 상 펩티드 합성 동안과 같이 활성화된 단량체의 단계적 도입을 통해 한 번에 하나씩 성장하는 쇄에 부가된다.
정제된: 물질에 불순물을 섞거나 또는 물질을 오염시키는 불순물 또는 물질이 비교적 없는 조성을 갖는 것. 용어 정제된 이란 상대적인 용어이며 절대 순도를 요구하지는 않는다. 따라서, 예를 들어, 정제된 펩티드 제제는 펩티드 또는 단백질이 그의 자연 환경, 예를 들어, 세포 내에 있는 것보다 더 풍부하게 있는 것이다. 한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체가 제제의 총 함량의 적어도 50%를 나타내도록 제제를 정제한다. 실질적인 정제는 다른 단백질 또는 세포성 성분으로부터의 정제를 의미한다. 실질적으로 정제된 단백질은 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 순수하다. 따라서, 하나의 구체적인 비제한적 예에서, 실질적으로 정제된 단백질은 다른 단백질 또는 세포성 성분 또는 오염 펩티드가 90% 없다.
가용성: 용매에 분자적으로 또는 이온적으로 분산되어 균질한 용액을 형성할 수 있다. 펩티드를 언급할 때, 가용성 펩티드는 소수성 또는 다른 비-공유 상호작용을 통해 다량체 또는 다른 초분자 구조로 어셈블리되지 않는 용액 중의 단일 분자인 것으로 이해된다. 가용성 분자는 용액에서 단일 분자로서 자유롭게 분산되는 것으로 이해된다. 여러 실시양태에서, 펩티드 항원은 실온 하에 pH 7.4의 인산염 완충 식염수에 적어도 0.1 mg/ml 이하에서 용해되는 가용성 펩티드 항원일 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 실온 하에 디메틸술폭시드 및/또는 다른 유기 용매(들)에서는 용해될 수 있지만, 실온 하에 pH 7.4 하에 인산염 완충 식염수와 같은 수성 용매(들)에서는 용해되지 않을 수 있다. 본원에 기재된 소수성 분자는 약 0.1 mg/mL에 이르기까지 불용성이다. 용해도는 육안 검사, 혼탁도 측정 또는 동적 광 산란에 의해 결정될 수 있다.
대상체: 조류 및 비-인간 포유류, 예컨대 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 비-인간 영장류 (예를 들어, 레서스 원숭이), 반려 동물 (예를 들어, 사육된 개 및 고양이), 가축 (예를 들어, 돼지, 양, 암소, 라마 및 낙타) 뿐만 아니라 비-사육 동물 (예를 들어, 큰 고양이)을 포함한, 인간 및 비-인간 동물 둘 다를 지칭한다.
초분자: 비-공유 상호작용을 통해 회합되는 2개 이상의 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 분자는 소수성 상호작용으로 인해 회합된다. 일부 실시양태에서, 분자는 정전기적 상호작용으로 인해 회합된다. 이러한 회합은 구성분 분자 중 하나에 의해 공유되지 않은 초분자 복합체에 새로운 특성, 예컨대 증가된 크기를 부여하여, 면역 체계와의 물질 상호작용 및 상이한 면역 반응에 영향을 미친다. 예를 들어, 펩티드 항원 접합체는 응집되어 초분자 복합체를 형성할 수 있다.
T 세포: 면역 체계의 일부이며 면역 반응에 참여할 수 있는 일종의 백혈구. T 세포는 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD4 T 세포는 그의 표면 상에 CD4 당단백질을 표시하고, 이들 세포는 종종 헬퍼 T 세포로서 지칭된다. 이들 세포는 종종, 항체 반응 및 세포독성 T 세포 반응을 포함한 면역 반응을 조정하지만, CD4 T 세포는 또한 면역 반응을 억제할 수 있거나 또는 CD4 T 세포가 세포독성 T 세포로서 작용할 수 있다. CD8 T 세포는 그의 표면 상에 CD8 당단백질을 표시하고, 이들 세포는 종종, 세포독성 또는 킬러 T 세포로서 지칭되지만, CD8 T 세포는 또한 면역 반응을 억제할 수 있다.
텔레켈릭(telechelic): 동일하거나 상이할 수 있는 1개 또는 2개의 반응성 말단을 갖는 중합체를 설명하기 위해 사용된다. 이 단어는 끝과 발톱에 각각 해당하는 그리스어인 텔로스(telos)와 켈레(chele)로부터 유래된다. 세미-텔레켈릭 중합체는 부가의 반응, 예컨대 중합을 겪을 수 있는 반응성 관능기와 같은 단일 말단기만을 갖는 중합체를 설명한다. 헤테로-텔레켈릭 중합체는 상이한 반응성 특성을 갖는 반응성 관능기와 같은 2개의 말단기를 갖는 중합체를 설명한다.
본원에서, 소수성 분자 (H)는 한쪽 또는 양쪽 말단에 반응성 기를 갖는 중합체로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 중합체의 한쪽 말단에 배치되고 중합체의 다른 말단은 직접적으로, 또는 연장부 (B1 또는 B2) 또는 링커 (L)를 통해 간접적으로 펩티드 항원에 연결되는 링커와 반응할 수 있다. 이러한 예에서, 중합체는 아주반트에 대해서 세미-텔레켈릭이며, 이는 아주반트가 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체 쇄의 한쪽 말단에만 부착된다는 것을 의미한다.
질환의 치료, 예방 또는 완화: "치료하는" 것은 질환 또는 병리학적 상태가 발생하기 시작한 후 그의 징후 또는 증상 또는 마커를 감소시키는 개입을 지칭한다. 예를 들어, 질환을 치료하는 것이 종양 부담을 감소시킬 수 있으며, 이는 종양 및/또는 전이의 수 또는 크기에 있어서의 감소를 의미하거나, 또는 질환을 치료하는 것이 자가면역과 연관된 체계를 감소시키는 면역관용을 초래할 수 있다. 질환을 "예방하는" 것은 질환의 완전한 발생을 억제하는 것을 지칭한다. 질환이 전혀 발생하지 못하게 할 수 있다. 질환은 중증도 또는 정도 또는 종류에 있어서 발생되지 못하게 할 수 있다. "완화시키는" 것은 암과 같은 질환의 징후 또는 증상 또는 마커의 수 또는 중증도에 있어서의 감소를 지칭한다.
질환 또는 질환과 관련된 병리학적 상태의 징후 또는 증상 또는 마커를 감소시키는 것은 치료의 임의의 관찰가능한 유익한 효과 및/또는 증상의 여부에 상관없이 근위, 대리 종말점, 예를 들어, 종양 용적에 대한 임의의 관찰가능한 효과를 지칭한다. 종양 또는 바이러스 감염과 연관된 징후 또는 증상을 감소시키는 것은, 예를 들어, 감수성 대상체 (예컨대, 아직 전이되지 않은 종양을 갖는 대상체, 또는 바이러스 감염에 노출될 수 있는 대상체)에서 질환의 임상 증상의 지연된 발병, 질환의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도에 있어서의 감소, 질환의 진행 속도 둔화 (예를 들어, 종양 또는 바이러스 감염이 있는 대상체의 수명을 연장시킴), 질환의 재발 횟수 감소, 대상체의 전반적인 건강 또는 웰빙에 있어서의 개선, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 파라미터 (예를 들어, 특별한 종양 또는 바이러스 감염에 특이적인 것)에 의해 입증될 수 있다. "예방적" 처치는 질환의 징후를 나타내지 않거나 또는 병리상태 발생의 위험 또는 중증도를 감소시킬 목적으로 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여되는 처치이다.
한 예에서, 원하는 반응은 대상체에서 종양의 크기, 용적, 성장 속도 또는 수 (예컨대, 전이)에 있어서의 감소를 초래하는 면역 반응을 유도하는 것이다. 예를 들어, 작용제(들)는 이러한 작용제의 부재 하에서의 반응과 비교 시 원하는 양만큼, 예를 들어 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 종양의 크기, 용적 또는 수를 감소시키는 면역 반응을 유도시킬 수 있다.
종양 또는 암 또는 신생물: 양성 또는 악성일 수 있는 세포의 비정상적인 성장으로, 항상은 아니지만 종종 임상 증상을 유발한다. "신생물" 세포 성장은 성장 및 억제 인자와 같은 생리적 신호에 반응하지 않는 세포 성장을 지칭한다.
"종양"은 신생물 세포의 컬렉션이다. 대부분의 경우, 종양은 고형 덩어리를 형성하는 신생물 세포의 컬렉션을 지칭한다. 이러한 종양은 고형 종양으로서 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 신생물 세포는 일부 백혈병의 경우와 같이 고형 덩어리를 형성하지 않을 수 있다. 이러한 경우, 신생물 세포의 컬렉션은 액상 암으로서 지칭될 수 있다.
암은 고형 또는 액상인 신생물 세포의 악성 성장을 지칭한다. 악성으로서 규정되는 암의 특색은 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능의 간섭, 시토카인 또는 다른 분비 산물의 비정상적인 수준의 방출 및 염증성 또는 면역학적 반응(들)의 억제 또는 악화, 주변 또는 원위 조직 또는 기관, 예컨대 림프절의 침습 등을 포함한다.
실질적인 불리한 임상 증상을 나타내지 않고/않거나 느리게 성장하는 종양은 "양성"으로서 지칭된다.
"악성"은 차후에 심각한 임상 증상을 유발하거나 또는 유발할 가능성이 있다는 것을 의미한다. 주변 조직에 침습하고/하거나 전이되고/되거나 근처 또는 원위 신체 시스템에 영향을 미치는 화학적 매개인자의 생산 및 분비를 통해 실질적인 임상 증상을 초래하는 종양이 "악성"으로서 지칭된다.
"전이성 질환"은 원래의 종양 부위를 떠난 채, 예를 들어, 혈류를 통해, 림프계를 통해, 또는 체강, 예컨대 복강 또는 흉강을 통해 신체의 다른 부분으로 이동한 암 세포를 지칭한다.
개체 내의 종양의 양이 "종양 부담"이다. 종양 부담은 종양의 수, 용적 또는 질량으로서 측정될 수 있으며, 종종 신체 검사, 방사선 영상화 또는 병리학적 검사에 의해 평가된다.
"확립된" 또는 "존재하는" 종양은 요법이 개시되는 시점에 존재하는 종양이다. 종종, 확립된 종양은 진단 시험에 의해 식별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확립된 종양은 손으로 만져질 수 있다. 일부 실시양태에서, 확립된 종양은 적어도 500 mm3, 예컨대 적어도 600 mm3, 적어도 700 mm3, 또는 적어도 800 mm3 크기이다. 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 1 cm 길이이다. 고형 종양과 관련하여, 확립된 종양은 일반적으로, 새로이 확립되고 강력한 혈액 공급을 가지며, 조절 T 세포 (Treg) 및 골수성 유래 억제 세포 (MDSC)를 유도할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 제공된 정의가 허용되지 않는 치환 패턴 (예를 들어, 5개의 상이한 기로 치환된 메틸 등)을 포함하도록 의도되지 않았다는 것을 인식할 것이다. 이러한 허용되지 않는 치환 패턴은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식된다. 본원에 개시되고/되거나 상기 정의된 임의의 관능기는 본원에 달리 표시되지 않는 한 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수의 표현은 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 용어 "포함하다"는 "포함한"을 의미한다. 따라서, "A" 또는 "B"를 포함하는 것은 A를 포함하거나, B를 포함하거나, 또는 A와 B 둘 다를 포함하는 것을 지칭한다. 추가로, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며 설명을 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
면역원성 조성물
본원에는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)을 추가로 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자를 포함하는 신규 면역원성 조성물이 기재되어 있다. 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A)을 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결하는, 예를 들어 공유적으로 연결하거나 또는 달리 연결하는 것으로부터 비롯되는 화합물을 지칭한다. 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 펩티드 항원 접합체를 입자로 어셈블리하도록 유도하여, 펩티드 항원 (A)에 대항하여 유도된 면역 반응에 있어서의 예상치 못한 개선을 초래한다. 펩티드 항원 접합체는 부가적으로, 제조 및 생물학적 활성에 있어서 예상치 못한 개선을 제공하는, 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단에 각각 연결된 임의적 N-말단 연장부 (B1) 및/또는 C-말단 연장부 (B2); 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 안정성에 있어서의 예상치 못한 개선을 제공함으로써, 개선된 제조 및 개선된 생물학적 활성을 초래하는 임의적 하전된 분자 (C); 및 펩티드 항원 (A)에 연결된 링커 전구체 X1과 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 상에 제공된 링커 전구체 X2의 반응으로부터 비롯되고, 그에 의해 펩티드 항원 접합체의 제조 효율에 있어서의 예상치 못한 개선을 초래하는 효율적인 프로세스로 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 및 입자 (P)와 연결시키는 임의적 링커 (L)를 포함할 수 있다. 펩티드 항원 접합체를 구성하는 성분은 임의의 적합한 수단을 통해 연결될 수 있으며 전체에 걸쳐 보다 상세하게 기재된다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 직접적으로 연결되어 화학식 A-H 또는 A-P의 펩티드 항원 접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결되어 화학식 A-L-H 또는 A-L-P의 펩티드 항원 접합체를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결되는 연장부 (B1 또는 B2)에 연결되어, 화학식 A-B2-H, A-B2-L-H, H-B1-A, H-L-B1-A, A-B2-P, A-B2-L-P, P-B1-A 또는 P-L-B1-P 중 어느 하나의 펩티드 항원 접합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 직접적으로 또는 연장부 (B1 및 B2)를 통해 링커 전구체 X1에 연결되어 화학식 A-X1, A-B2-X1, X1-A 또는 X1-B1-A의 펩티드 항원 단편을 형성하며, 이는 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 상의 링커 전구체 X2, 즉 X2-H 또는 X2-P와 반응하여, 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결시키는 링커 (L)를 형성하여, 화학식, 즉 A-L-H, A-L-P, A-B2-L-H, A-B2-L-P, H-L-A, P-L-A, H-B1-A, 또는 P-B1-A 중 어느 하나의 펩티드 항원 접합체를 생성시킨다. 본 개시내용에서, 이러한 실시양태는 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 것으로 나타난 수성 조건에서 입자를 형성하는 것으로 밝혀졌다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 양쪽 연장부 (B1 및 B2)에 연결된다. 이러한 실시양태는 화학식 B1-A-B2-H, B1-A-B2-L-H, B1-A-B2-P, B1-A-B2-L-P, H-B1-A-B2, H-L-B1-A-B2, P-B1-A-B2, 또는 P-L-B1-A-B2의 펩티드 항원 접합체를 포함한다. 본 개시내용에서, 이러한 실시양태는 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 것으로 입증되는 수성 조건에서 입자를 형성하는 것으로 밝혀졌다.
일부 실시양태에서, 정전하를 부여하는 관능기를 함유하는 분자, 즉 하전된 분자 (C)는 직접적으로, 또는 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2), 임의적 링커 (L) 또는 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결된다. 하전된 분자에 의해 펩티드 항원 접합체 상에 부여된 전하는 수성 조건에서 형성된 초분자 구조를 안정화시킨다. 하전된 분자 (C)를 포함하는 펩티드 항원 접합체의 비제한적 예는 C-A-H, C-B1-A-H, C-A-B2-H, C-B1-A-B2-H, A-H(C), A-B2-H(C), B1-A-H(C), B1-A-B2-H(C), C1-A-H(C2), C1-A-B2-H(C2), C1-B1-A-H(C2), C1-B1-A-B2-H(C2), H-A-C, H-B1-A-C, H-A-B2-C, H-B1-A-B2-C, H(C)-A, H(C)-B1-A, H(C)-A-B2, H(C)-B1-A-B2, H(C1)-A-C2, H(C1)-B1-A-C2, H(C1)-A-B2-C2, H(C1)-B1-A-B2-C2, C-A-L-H, C-B1-A-L-H, C-A-B2-L-H, C-B1-A-B2-L-H, A-L-H(C), A-B2-L-H(C), B1-A-L-H(C), B1-A-B2-L-H(C), C1-A-L-H(C2), C1-A-B2-L-H(C2), C1-B1-A-L-H(C2), C1-B1-A-B2-L-H(C2), H-L-A-C, H-L-B1-A-C, H-L-A-B2-C, H-L-B1-A-B2-C, H(C)-L-A, H(C)-L-B1-A, H(C)-L-A-B2, H(C)-L-B1-A-B2, H(C1)-L-A-C2, H(C1)-L-B1-A-C2, H(C1)-L-A-B2-C2, H(C1)-L-B1-A-B2-C2, C-A-P, C-B1-A-P, C-A-B2-P, C-B1-A-B2-P, A-P(C), A-B2-P(C), B1-A-P(C), B1-A-B2-P(C), C1-A-P(C2), C1-A-B2-P(C2), C1-B1-A-P(C2), C1-B1-A-B2-P(C2), P-A-C, P-B1-A-C, P-A-B2-C, P-B1-A-B2-C, P(C)-A, P(C)-B1-A, P(C)-A-B2, P(C)-B1-A-B2, P(C1)-A-C2, P(C1)-B1-A-C2, P(C1)-A-B2-C2, P(C1)-B1-A-B2-C2, C-A-L-P, C-B1-A-L-P, C-A-B2-L-P, C-B1-A-B2-L-P, A-L-P(C), A-B2-L-P(C), B1-A-L-P(C), B1-A-B2-L-P(C), C1-A-L-P(C2), C1-A-B2-L-P(C2), C1-B1-A-L-P(C2), C1-B1-A-B2-L-P(C2), P-L-A-C, P-L-B1-A-C, P-L-A-B2-C, P-L-B1-A-B2-C, P(C)-L-A, P(C)-L-B1-A, P(C)-L-A-B2, P(C)-L-B1-A-B2, P(C1)-L-A-C2, P(C1)-L-B1-A-C2, P(C1)-L-A-B2-C2 또는 P(C1)-L-B1-A-B2-C2를 포함한다.
하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시킨다. 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 접합체에 직접적으로 연결될 수 있다. 또 다른 한편으로는, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자와 회합되는 별도의 분자 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 소수성 분자 (H)에 연결되어 화학식 C-H, 또는 C-A'-H (여기서 A'는 보존된 항원임)의 하전된 분자 접합체를 형성하며, 이는 화학식 [C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H의 펩티드 항원 접합체 (여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시함)와 수성 조건에서 혼합되며, 이로써 생성되는 입자는 C-H, 또는 C-A'-H 및 펩티드 항원 접합체를 포함한다.
소수성 분자 (H)는 펩티드 항원 접합체를 수성 조건에서 입자로 어셈블리되도록 유도하는 임의의 적합한 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체를 구성하는 소수성 분자 (H)는 수 용해도가 제한된 중합체이다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 특별한 온도 또는 pH 값에서 제한된 수 용해도를 갖는 온도- 또는 pH-반응성 중합체이다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 지질, 지방산 또는 콜레스테롤이다. 많은 소수성 분자 (H)가 본 개시내용에 유용하며, 전체에 걸쳐 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 개시된 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자는 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 종양-연관 항원을 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 암의 치료 또는 예방을 위하여 T 세포 반응, 예컨대 세포독성 CD4 또는 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위해 대상체에게 제공된다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환 항원을 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위하여 T 세포 반응, 예컨대 세포독성 CD4 또는 CD8 T 세포 반응 또는 항체 반응을 유도하기 위해 대상체에게 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가-항원을 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 자가면역 질환의 치료를 위하여 면역관용성 또는 억제성 T 세포 반응을 유도하기 위해 대상체에게 제공된다.
펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A), 임의적 N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2), 임의적 링커 (L), 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 및 임의적 하전된 분자(들) (C)를 포함한다. 이러한 성분 각각이 하기 및 전체에 걸쳐 보다 상세히 기재되어 있다.
펩티드 항원 (A)
펩티드 항원 (A)은 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 임의의 항원일 수 있다. 펩티드 항원 (A)은 적용에 요구되는 면역 반응의 성질에 따라 염증 유발성 또는 면역관용성 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 종양-연관 항원, 예컨대 자기-항원, 신생항원 또는 종양-연관 바이러스 항원 (예를 들어, HPV E6/E7)이다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 감염성 질환 항원, 예컨대 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생 미생물 병원체로부터 단리된 단백질로부터 유래된 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 알레르기 또는 자가면역을 유발하는 것으로 공지되어 있거나 또는 의심되는 알레르겐 또는 자가 항원으로부터 유래된 펩티드이다.
펩티드 항원 (A)은 대상체에서 면역 반응, 예컨대 T 세포 또는 B 세포 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열 또는 펩티드 모방제로 구성된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 번역 후 변형을 갖는 아미노산(들), 비-자연 아미노산 또는 펩티드 모방제를 포함한다. 펩티드 항원은 항원 또는 예측된 항원, 즉 T 세포 또는 B 세포 에피토프를 갖는 항원을 갖는 자연, 비-자연 또는 번역 후 변형된 아미노산, 펩티드 모방제 또는 그의 임의의 조합의 임의의 서열일 수 있다.
면역원성 조성물은 각각 상이한 펩티드 항원 (A) 조성을 갖는 하나 이상의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 각각 독특한 펩티드 항원 (A) 조성을 갖는 50개 이하의 상이한 펩티드 항원 접합체를 수반한 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 20개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 모자이크 입자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 5개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 모자이크 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 각각 독특한 펩티드 항원 접합체로부터 어셈블리된 20개의 상이한 입자 조성물을 포함한다 (즉, 각각의 입자는 단일 펩티드 항원 접합체 조성을 함유함). 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 각각 독특한 펩티드 항원 접합체로부터 어셈블리된 5개의 상이한 입자 조성을 포함한다 (즉, 각각의 입자는 단일 펩티드 항원 접합체 조성을 함유함). 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 단일 펩티드 항원 접합체 조성으로 구성된 단일 입자 조성을 포함한다.
펩티드 항원 (A)의 길이는 특이적 적용에 의존하고 전형적으로 약 5 내지 약 50개의 아미노산이다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 약 7 내지 35개의 아미노산, 예를 들어, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 아미노산이다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원은 폴리펩티드의 단편이다. 또 다른 경우에, 펩티드 항원은 완전한 길이의 폴리펩티드, 예컨대 재조합적으로 발현될 수 있는 단백질 항원이다. 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원에 기반한 펩티드 항원 (A)은, 바람직하게 50개 이하의 아미노산 길이이긴 하지만, 완전한 길이의 서열로서 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 7 내지 35개의 아미노산, 전형적으로 약 25개이다. 따라서, 25개 초과 아미노산 길이의 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원, 예를 들어, 100개의 아미노산 항원의 경우, 이러한 항원은 7 내지 35개의 아미노산, 예를 들어 25개의 아미노산, 펩티드 항원 (A)으로 나눠질 수 있으며, 여기서 각각의 펩티드 항원 (A)은 독특한 아미노산 조성을 함유하거나; 또는 펩티드 항원 (A)은 중복 펩티드 풀일 수 있으며, 여기서 항원은 중복 서열을 갖는 7 내지 35개의 아미노산, 예를 들어, 25개의 아미노산, 펩티드 항원 (A)의 세트 수로 나눠진다. 예를 들어, 100개의 아미노산 항원을 포함하는 중복 펩티드 풀은 12개의 아미노산에 의해 각각 상쇄되는 8개의 25개 아미노산 펩티드 항원 (A)으로 나눠질 수 있다 (즉, 100개 아미노산 펩티드 서열을 구성하는 각각의 후속 25개 아미노산 펩티드는 선행 펩티드로부터 13번째 아미노산 위치에서 출발함). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원으로부터 펩티드 풀을 생성하기 위한 많은 순열이 존재한다는 것을 이해한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 MHC-I 또는 MHC-II 분자에 결합하는 것으로 인 실리코 예측되는 (또는 경험적으로 측정되는) 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원의 일부분을 포함하는 최소 CD8 또는 CD4 T 세포 에피토프이다. 종양-연관 항원의 경우, MHC-I 또는 MHC-II 분자에 결합하는 것으로 인 실리코 예측되는 (또는 경험적으로 측정되는) 최소 CD8 또는 CD4 T 세포 에피토프인 펩티드 항원 (A)은 또한, 종양 세포에 대해 독특한 아미노산의 서열이어야 한다. MHC-I 또는 MHC-II 결합을 예측하기 위한 알고리즘은 널리 이용가능하다 (문헌 [Lundegaard et al., Nucleic Acids Res., 36:W509-W512, 2008] 및 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/ 참조). 특별한 대상체 (예를 들어, 환자)에 대한 개인화된 요법의 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체를 구성하는 펩티드 항원 (A)은 상기 대상체에 의해 발현되는 특별한 MHC-I 대립 유전자에 대해 < 1,000 nM 결합 친화도를 갖는 것으로 예측되는, 전형적으로 7 내지 13개 아미노산 펩티드인 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원으로부터의 최소 CD8 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 특별한 대상체 (예를 들어, 환자)에 대한 개인화된 요법의 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 상기 대상체에 의해 발현되는 특별한 MHC-II 대립 유전자에 대해 < 1,000 nM 결합 친화도를 갖는 것으로 예측되는, 10 내지 16개 아미노산 펩티드인 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원으로부터의 최소 CD4 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 최소 CD8 또는 CD4 T 세포 에피토프가 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원에 대해 확인될 수 없는 경우, 또는 종양-연관 항원, 감염성 질환 항원, 알레르겐 또는 자가-항원이 다수의 CD8 및 CD4 T 세포 에피토프를 함유하는 경우, 펩티드 항원 (A)은 16 내지 35개의 아미노산일 수 있고, 50개 이하의 아미노산, 예를 들어, 35개 이하의 아미노산, 25개 이하의 아미노산, 또는 20개 이하의 아미노산, 또는 16개 이하의 아미노산일 수 있으므로, 가능한 모든 CD8 또는 CD4 T 세포 에피토프를 함유할 수 있게 된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 종양-연관 항원으로부터 유래된다. 종양-연관 항원은 건강한 세포 상에는 존재하지만 종양 세포에 의해 우선적으로 발현되는 자기-항원일 수 있거나, 또는 종양 세포에 특이적이고 개별 환자에 독특한 비정상적인 단백질인 신생항원일 수 있다. 적합한 자기-항원은 종양 세포에 의해 우선적으로 발현되는 항원, 예컨대 CLPP, 사이클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAgE1b/GAGED2a, 멜란-A/MART-1, TRP-1, 티로시나제, CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인(Kallikrein) 4, KIF20A, 렝신(Lengsin), 멜로에(Meloe), MUC5AC, 생존, 전립선 산 포스파타제, NY-ESO-1 및 MAGE-A3을 포함한다. 신생항원은 암의 내재된 유전적 불안정성으로부터 발생하며, 이는 DNA, RNA 스플라이스 변이체 및 번역 후 변형에서의 변화로 이어질 수 있으며, 모두 잠재적으로, 집합적으로 신생항원으로서 또는 종종 예측되는 신생항원으로서 지칭되는 드 노보 단백질 산물을 초래할 수 있다. DNA 돌연변이는 비-동의 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 삽입, 결실, 염색체 역위 및 염색체 전위를 포함한 DNA에 대한 변화를 포함하며, 이는 모두 잠재적으로 신규 유전자 산물 및 그에 따른 신생항원을 초래한다. RNA 스플라이스 부위 변화는 새로운 단백질 산물을 초래할 수 있고, 미스센스 돌연변이는 항원성일 수 있는 번역 후 변형 (예를 들어, 인산화)에 허용되는 아미노산을 도입할 수 있다. 종양 세포의 불안정성은 또한, 후성적 변화 및 특정 전사 인자의 활성화를 초래할 수 있으며, 이는 건강한 비-암성 세포에 의해 발현되지 않는 종양 세포에 의한 특정 항원의 선택적 발현을 초래할 수 있다.
개인화된 암 백신에 사용되는 펩티드 항원 접합체는 종양 세포에 독특한 종양-연관 항원의 부분을 포함하는 펩티드 항원 (A)을 포함해야 한다. 미스센스 돌연변이로부터 발생하는 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 1개 이상의 뉴클레오티드 다형성에 의해 코딩된 아미노산 변화를 포괄해야 한다. 프레임 시프트 돌연변이, 스플라이스 부위 변이체, 삽입, 역위 및 결실로부터 발생하는 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 신규 펩티드 서열 및 신규 펩티드 서열의 연접부를 포괄해야 한다. 신규 번역 후 변형을 갖는 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 번역 후 변형(들), 예컨대 포스페이트 또는 글리칸을 보유하는 아미노산을 포괄해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 아미노산 변화를 플랭킹하는 한쪽 측면 또는 돌연변이로 인해 발생하는 신규 연접부 상에 0 내지 25개의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 단일 뉴클레오티드 다형성으로부터 발생하는 아미노산 변화를 플랭킹하는 한쪽 측면 상에 12개 아미노산을 포함하는 신생항원 서열, 예를 들어 25개 아미노산 펩티드이며, 여기서 13번째 아미노산은 단일 뉴클레오티드 다형성으로부터 비롯되는 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 신규 번역 후 변형을 수반한 아미노산을 플랭킹하는 한쪽 측면 상에 12개 아미노산을 포함하는 신생항원 서열, 예를 들어 25개 아미노산 펩티드이며, 여기서 13번째 아미노산은 신규 번역 후 변형 부위로부터 비롯되는 아미노산 잔기이다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 삽입, 결실 또는 역위에 의해 창출된 신규 연접부를 플랭킹하는 한쪽 측면 상에 0 내지 12개 아미노산을 포함하는 신생항원 서열이다. 일부 경우에, 신규 서열로부터 비롯된 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 발생할 수도 있는 신규 연접부의 한쪽 측면 상에 0 내지 25개 아미노산을 포함한, 전체 신규 서열을 포괄할 수 있다.
본 개시내용의 면역원성 조성물에 대한 펩티드 항원 (A)으로서 적합한 종양-연관 항원은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙한 다양한 기술을 통해 확인될 수 있다. 종양-연관 항원은 건강한 세포, 즉 대상체로부터의 비-암성 세포와 비교 시 종양 세포의 단백질 발현을 평가함으로써 확인될 수 있다. 단백질 발현을 평가하기 위한 적합한 방법은 면역 조직 화학, 면역 형광, 웨스턴 블롯, 크로마토그래피 (즉, 크기 배제 크로마토그래피), ELISA, 유동 세포계수법 및 질량 분석법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 종양 세포에 의해서는 우선적으로 발현되지만 건강한 세포에 의해서는 그렇지 않거나 또는 제한된 수의 건강한 세포에 의해 발현되는 단백질 (예를 들어, CD20)이 적합한 종양-연관 항원이다. RNA로서 발현되고 환자 항원 제시 세포 (APC) 상에서 MHC-I 또는 MHC-II 대립 유전자에 결합할 것으로 예측되는 펩티드를 생산하는 단백질 코딩 DNA에서의 돌연변이를 확인하기 위해 환자 종양 생검의 DNA 및 RNA 서열 분석에 이어서 생체 정보학을 또한 사용하여, 본 개시내용의 면역원성 조성물에 대한 펩티드 항원 (A)으로서 적합한 종양-연관 항원을 확인할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물에 대한 펩티드 항원 (A)으로서 적합한 종양-연관 항원은 질량 분석법을 사용하여 확인된다. 적합한 펩티드 항원 (A)은 환자 종양 생검으로부터의 MHC 분자로부터 용출 후 질량 분석법에 의해 확인된 단백질이지만, 동일한 대상체로부터의 건강한 조직으로부터는 그렇지 않은 펩티드이다 (즉, 펩티드 항원은 종양 세포 상에만 존재하고, 동일한 대상체로부터의 건강한 세포 상에는 존재하지 않음). 질량 분석법은 단독으로 또는 다른 기술과 조합하여 사용되어 종양-연관 항원을 확인할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개시된 발명의 실시를 위한 펩티드 항원 (A)으로서 적합한 종양-연관 항원, 예컨대 신생항원을 확인하는 많은 방법이 있다는 것을 인식한다 (문헌 [Yadav et al., Nature, 515:572-576, 2014] 참조).
바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)으로서 사용된 종양-연관 항원은 신생물 세포 집단 내에서 클로날 또는 거의 클로날이며, 이는 다른 측면에서 이질적인 것으로 간주될 수 있다.
개인화된 암 백신접종 계획에서 펩티드 항원 (A)으로서 사용하기 위해 선택된 종양-연관 항원은 종양 내에서의 펩티드-MHC 결합 및/또는 인 실리코 예측된 MHC 결합 친화도 및 RNA 발현 수준의 질량 분석법 확증에 기반하여 선택될 수 있다. 이들 데이터는 종양-연관 항원이 종양 세포에 의해 발현되고 제시되는지의 여부, 및 이에 따라 T 세포에 대한 적합한 표적이 될 것인지에 관한 정보를 제공한다. 이러한 기준은 개인화된 암 백신에 사용되는 펩티드 항원 (A)을 선택하는데 사용될 수 있다.
면역원성 조성물에 기반한 개인화된 암 백신은 각각 독특한 펩티드 항원 (A) 조성을 갖는 하나 이상의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양에서, 개인화된 암 백신은 각각 독특한 펩티드 항원 (A)을 갖는 10 내지 50개의 상이한 펩티드 항원 접합체 조성을 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 7 내지 35개의 아미노산 길이, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개의 아미노산, 전형적으로 50개 이하의 아미노산의 펩티드 항원 (A)을 각각 포함하는 20개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함한다. 비제한적 예에서, 8개 아미노산 길이의 펩티드 항원 (A)으로 구성된 20개의 상이한 펩티드 항원 접합체로부터 형성된 입자로 구성된 면역원성 조성물이 개인화된 암 백신으로서 사용된다. 또 다른 비제한적 예에서, 25개 아미노산 길이의 펩티드 항원 (A)으로 구성된 20개의 상이한 펩티드 항원 접합체로부터 형성된 입자로 구성된 면역원성 조성물이 개인화된 암 백신으로서 사용된다.
50개 초과의 종양-연관 신생항원을 갖는 고도로 돌연변이된 종양을 수반한 환자의 경우, 하향 선택 프로세스를 사용하여 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 사용하기 위한 펩티드 항원 (A)을 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 세포 내에서 가장 높은 MHC 결합 친화도 및 RNA 발현 수준을 갖는 것으로 예측되는 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 선택하기 위해 하향 선택 프로세스가 사용된다. 종양-연관 자기-항원 또는 신생항원의 선택을 위한 부가의 기준이 적용될 수 있다. 예를 들어, 자가면역을 유발할 수 있는 다른 자기-항원과 반응하는 T 세포를 유도하는 펩티드 항원 (A)의 예측된 면역원성 또는 예측된 능력이 부가의 기준으로 고려된다. 예를 들어, 종양-연관 항원을 포함하고 높은 예측된 면역원성을 갖지만 또한 자가면역으로 이어질 가능성이 낮은 펩티드 항원 (A)이, 개인화된 암 백신에 사용하기 위한 잠재적 펩티드 항원 (A)을 선택하는데 사용되는 기준이다. 일부 실시양태에서, 건강한 세포 상에서 발견되는 자기-항원과 반응하는 T 세포 또는 항체 반응을 초래할 것으로 예상되는 신생항원은 펩티드 항원 (A)으로서 사용하기 위해 선택되지 않는다. 예를 들어, 20 내지 50개 미만의 예측된 신생항원을 갖는 환자의 경우, 하향 선택 프로세스가 중요하지 않을 수 있으므로, 20 내지 50개의 예측된 신생항원 모두가 개인화된 암 백신에서 펩티드 항원 (A)으로서 사용될 수도 있다.
암 백신은 환자-특이적인 종양-연관 항원 및/또는 환자들 간에 공유되는 종양-연관 항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양-연관 항원은 보존된 자기-항원, 예컨대 NY-ESO-1 (고환암) 또는 gp100 (흑색종)일 수 있거나, 또는 상기 항원은 건강한 세포에 의해서는 전형적으로 발현되지 않지만 환자들 간에는 보존되는 잠재적 에피토프, 예컨대 Na17 (흑색종)일 수 있다. 본 개시내용의 면역원성 조성물은 우연히 예측되는 것보다 더 자주 발생하는 특정 유전자 또는 유전자 영역에서 빈번한 돌연변이인 소위 핫스팟(hot-spot) 돌연변이로부터 발생하는 펩티드 항원 (A)을 포함할 수 있다. 핫스팟 돌연변이의 비제한적 예는 흑색종, 유두 갑상선 및 결장직장 암종에 공통인 BRAF 단백질에서의 V600E 돌연변이, 또는 가장 흔한 돌연변이 중 하나인 KRAS G12 돌연변이, 예컨대 KRAS G12C를 포함한다. 핫스팟 돌연변이로부터 발생하는 신생항원 뿐만 아니라 다수의 적합한 자기-항원이 공지되어 있고 본원에 참조로 포함된다 (문헌 [Chang et al., Nature Biotechnology, 34: 155-163, 2016; Vigneron, N., et al., Cancer Immunology, 13: 15-20, 2013] 참조).
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 혈액학적 종양으로부터 유래될 수 있다. 혈액학적 종양의 비제한적 예는 급성 백혈병 (예컨대, 11q23-양성 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병 (예컨대, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함한 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종 (무통성 및 고 악성도 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성 증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수형성 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 고형 종양으로부터 유래될 수 있다. 고형 종양, 예컨대 육종 및 암종의 비제한적 예는 섬유 육종, 근육 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종 및 다른 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 림프계 악성 종양, 췌장암, 유방암 (기저 유방 암종, 도관 암종 및 소엽성 유방 암종 포함), 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 수질 갑상선 암종, 유두 갑상선 암종, 크롬친화세포종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 맥락막 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종 및 CNS 종양 (예컨대, 신경교종, 성상세포종, 수질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 음향 신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막 모세포종)을 포함한다. 여러 예에서, 종양은 흑색종, 폐암, 림프종, 유방암 또는 결장암이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 유방암, 예컨대 도관 암종 또는 소엽성 암종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 전립선암으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 피부암, 예컨대 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종 또는 흑색종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 폐암, 예컨대 선암종, 세기관지 폐포 암종, 대세포 암종 또는 소세포 암종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 뇌암, 예컨대 교모세포종 또는 수막종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 결장암으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 간암, 예컨대 간세포 암종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 췌장암으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 신장암, 예컨대 신장 세포 암종으로부터의 종양-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 고환암으로부터의 종양-연관 항원이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 전-악성 병태, 예컨대 계내 암종의 변이체, 또는 외음부 상피내 신생물, 자궁 경부 상피내 신생물, 또는 질 상피내 신생물로부터 유래된 종양-연관 항원이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 감염체, 예컨대 바이러스, 박테리움 또는 진균으로부터의 항원이다. 부가의 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 감염체로부터 유래된 펩티드 또는 글리코펩티드; 예를 들어, HIV 외막 융합 펩티드 또는 HIV로부터의 V3 또는 V1/V2 글리코펩티드이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 자가-항원을 나타낸다. 자가-항원은 환자 자신의 MHC-I 분자와 관련하여 존재하는 자기-항원에 대항한 자가 반응성에 대해 대상체 자신의 T 세포를 스크리닝하는 것에 기초하여 확인되고 선택될 수 있다. 또 다른 한편으로는, 펩티드 항원은 (i) 대상체 자신의 MHC-I 분자에 결합하기 위한 예측된 높은 친화도를 가지며, (ii) 발현되고/되거나 대상체의 자가면역 증후군을 설명하는 병리상태와 연관되는 것으로 공지되는 잠재적 자가-항원을 예측하기 위해 인 실리코 방법을 사용하여 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원은 알레르겐으로부터 유래된 CD4 에피토프를 나타내고, 환자 자신의 MHC-II 분자에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 펩티드 항원에 기초하여 선택된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 면역 반응을 유발하고 질환의 예방 또는 치료에 유용한 임의의 펩티드, 단백질 또는 번역 후 변형된 단백질 (예를 들어, 당단백질)이, 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기 위한 펩티드 항원 (A)으로서 사용하기 위해 선택될 수 있다는 것을 인식한다.
연장부 (B1 및 B2):
임의적 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)는 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단에 각각 연결된 분자를 나타낸다. N- 및 C-말단 연장부 B1 및 B2는 하기 중 임의의 하나 이상으로 구성될 수 있다: 비-자연 아미노산을 포함한 아미노산; 친수성 에틸렌 옥시드 단량체 (예를 들어, PEG); 소수성 알칸 쇄 등; 또는 그의 조합. N- 및 C-말단 연장부 B1 및 B2는 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 안정한 아미드 결합을 통해 펩티드 항원 (A)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 연장부 (B1 및 B2)는 펩티드 항원 (A)의 분해 속도를 제어하는 기능을 하지만, 임의의 하나 이상의 부가 기능을 수행할 수도 있다. 일부 실시양태에서, N- 또는 C-말단 연장부 (B1 또는 B2)는 자유로울 수 있고 (여기서 N- 또는 C-말단 연장부의 한쪽 말단은 펩티드 항원 (A)에 연결되고 다른 말단은 또 다른 분자에 연결되지 않음), 펩티드 항원의 분해를 느리게 하는 작용을 하며; 예를 들어, B1 펩티드-기반 연장부는 아미드 결합을 통해 펩티드 항원의 N-말단에 연결되어 분해를 느리게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2)는 이종 분자에 연결될 수 있고, 링커로서 기능할 수 있으며 또한 펩티드 항원 (A) 분해를 조정할 수 있다. 링커 기능을 제공하는 N- 및/또는 C-말단 연장부는 펩티드 항원을 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 간접적으로 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H), 및/또는 하전된 분자 (C)에 연결시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 임의의 2개의 이종 분자 사이에 거리, 즉 공간을 제공하는 기능을 한다. 다른 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 펩티드 항원 접합체에 소수성 또는 친수성 특성을 부여하는 기능을 한다. 또 다른 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)의 조성은 강성 또는 유연성을 부여하도록 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2)는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는 것을 도와줄 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장부 (B1 및/또는 B2)는 하전된 관능기, 예를 들어, 하전된 아미노산 잔기 (예를 들어, 아르기닌, 리신)로 구성되며, 이는 생리적 pH에서 정전하를 부여한다. 연장부에 존재하는 하전된 잔기의 수는 펩티드 항원 접합체의 순 전하를 조정하는데 사용될 수 있다. 프로테아제에 의해 인식되고 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는 기능을 하는 특별한 정전하를 부여하는 펩티드-기반 연장부 (B1 및/또는 B2)를 선택하기 위한 체계적인 프로세스를 설명하는 알고리즘이 본원에 개시된다.
부가적으로, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)에 부가된 C-말단 연장부 (B2)는 β-시트 형성을 방해하고 고체 상 펩티드 합성 동안 서열 말단절단을 방지하는 아미노산 서열을 B2 내로 혼입시킴으로써, [C]-[B1]-A-B2-[X1]을 포함하는 펩티드 (여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시함)의 제조를 용이하게 하도록 선택된다. 비제한적 예에서, C-말단 디펩티드 링커 (B2)인 Gly-Ser는 고체 상 펩티드 합성 동안 슈도프롤린 디펩티드 (예를 들어, Gly-Ser(Psi(Me,Me)pro))로서 혼입된다. 부가의 실시양태에서, 프롤린은 카텝신 절단가능한 C-말단 연장부 (B2) 서열, 예를 들어, Ser-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 21)에 포함되며; 이로써, 프롤린은 엔도솜 프로테아제에 의해 연장부의 제조를 용이하게 하면서 또한 프로세싱을 촉진하기 위해 포함된다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 C-말단에서, 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결되는 B2 연장부에 연결된다. 일부 실시양태에서, B1 연장부는 펩티드 항원의 N-말단에 연결되고 B2 연장부는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되며, 여기서 B1 또는 B2는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결된다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 N-말단에서, 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 입자 또는 소수성 분자 (H)에 연결되는 B2 연장부에 연결된다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단에 각각 연결되는 연장부 B1 또는 B2에 연결되며, 여기서 하전된 분자 (C)에 연결되지 않은 연장부는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결된다. 부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단 둘 다에 각각 연결되는 B1 및 B2 연장부 둘 다에 연결된다. 부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결된 B1 연장부에 연결되지만, 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 부착된 B2 연장부에는 연결되지 않으며, 이는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결될 수 있다. 링커 전구체 X1 또는 링커 (L)는 임의의 적합한 수단, 예컨대 아미드 결합을 통해 연장부 (B1 또는 B2) 중 하나에 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연장부 (B1 및 B2)는 효소, 예컨대 프로테아제에 의한 인식 및 가수분해를 위해 선택되는 펩티드 서열이다. 연장부 (B1 및 B2)는 바람직하게, 엔도솜 프로테아제 또는 면역 프로테아솜 중 하나 또는 둘 다에 의해 인식되는 아미노산을 포함한 절단가능한 펩티드이다.
본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 분해성 펩티드로 구성된 연장부 (B1 또는 B2)의 조성은, 그 연장부가 펩티드 항원 (A)의 N-말단 (B1) 또는 C-말단 (B2)에 연결되어 있는지에 의존적이다.
일부 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 약 1 내지 8개의 아미노산 길이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산, 전형적으로 10개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열이며, 이는, 예를 들어, 연장부 (B1)의 카르복실 기와 펩티드 항원 (A)의 N-말단 잔기의 알파 아민 간에 형성된 아미드 결합을 통해 펩티드 항원 (A)에 연결된다. B1과 펩티드 항원 (A) 사이의 아미드 결합은 효소에 의해 절단될 수 있다. 아미노산 위치를 절단 부위로부터 근위에서 원위로 있는 순서대로 번호를 매기는 것이 통상적인 것으로 이해되며, 절단 부위에 대해 C-말단인 아미노산 위치가 프라임 부호 (예를 들어, Pn')로서 표시된다. 예를 들어, 옥타펩티드 (PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8')인 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결된 테트라펩티드 연장부 (PN4-PN3-PN2-PN1), 예를 들어, PN4-PN3-PN2-PN1-PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8'의 경우, PN1과 PA1' 사이의 아미드 결합이 효소에 의해 인식되고 가수분해된다.
일부 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 엔도솜 프로테아제에 의해 인식되는 효소 분해성 테트라펩티드이며, 여기서 테트라펩티드 연장부 (예를 들어, PN4-PN3-PN2-PN1)의 PN1 위치는 바람직하게, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되고 (예를 들어, PN4-PN3-PN2-Arg); PN2는 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PN3은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PN4는 글리신, 세린, 아르기닌, 리신, 아스파르트산 또는 글루탐산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 엔도솜 프로테아제에 의해 인식되는 효소 분해성 트리펩티드이며, 여기서 트리펩티드 연장부 (예를 들어, PN3-PN2-PN1)의 PN1 위치는 바람직하게, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되고; PN2는 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PN3은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린 또는 류신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 엔도솜 프로테아제에 의해 인식되는 효소 분해성 디펩티드이며, 여기서 디펩티드 연장부 (예를 들어, PN2-PN1)의 PN1 위치는 바람직하게, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되고; PN2는 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택된다. 또한 부가의 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 엔도솜 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산이며, 여기서 PN1 위치는 바람직하게, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 면역 프로테아솜에 의해 인식되는 효소 분해성 펩티드이며, 여기서 테트라펩티드 연장부 (PN4-PN3-PN2-PN1)의 PN1 위치는 바람직하게, 이소류신, 류신, 노르류신 또는 발린으로부터 선택되고, 예를 들어, PN4-PN3-PN2-Leu이다.
부가의 실시양태에서, N-말단 연장부 (B1)는 엔도솜 프로테아제와 면역 프로테아솜 둘 다에 의해 인식되는 효소 분해성 펩티드이며, 여기서 옥타펩티드 연장부 (PN8-PN7-PN6-PN5-PN4-PN3-PN2-PN1)의 PN5 및 PN1 위치는 카텝신에 의해 인식된 PN5 위치의 경우에는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되고, 면역 프로테아솜에 의해 인식된 PN1 위치의 경우에는 이소류신, 류신, 노르류신 또는 발린으로부터 선택되며; 예를 들어, PN8-PN7-PN6-Arg-PN4-PN3-PN2-Leu이다. 카텝신 및 면역 프로테아솜에 의해 인식된 N-말단 연장부 (B1)의 비제한적 예는 Lys-Pro-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu (서열식별번호: 3)이다.
면역 프로테아솜에 의해 인식되는 테트라펩티드 N-말단 연장부 (B1)의 비제한적 예는: Ser-Leu-Val-Cit, Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 4), Ser-Pro-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 5), Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6), Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7), Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8), Lys-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 9), Glu-Leu-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 10), Glu-Pro-Val-Cit 및 Lys-Pro-Val-Cit를 포함한다. 트리펩티드 N-말단 연장부 (B1)의 비제한적 예는: Leu-Val-Cit, Leu-Val-Leu, Pro-Val-Cit, Leu-Val-Arg, Pro-Val-Arg, Pro-Leu-Arg, Gly-Val-Ser을 포함한다. 디펩티드 N-말단 연장부 (B1)의 비제한적 예는: Val-Cit, Val-Leu, Val-Arg, Leu-Arg를 포함한다. 단일 아미노산 N-말단 연장부 (B1)의 비제한적 예는 Cit, Arg, Leu 또는 Lys를 포함한다. 상기 예에서, Arg는 Lys로 대체될 수 있고; Lys는 Arg로 대체될 수 있으며; Glu는 Asp로 대체될 수 있고; Asp는 Glu로 대체될 수 있다. 주: Cit = 시트룰린.
일부 실시양태에서, 연장부 (B2)는 펩티드 항원 (A)의 C-말단 잔기에 연결된 분해성 펩티드이고, 특정 프로테아제에 의해 인식되고 가수분해되는 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, C-말단 연장부 (B2)는 약 1 내지 8개의 아미노산 길이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산, 전형적으로 10개 이하의 아미노산의 펩티드 서열이다. 바람직한 실시양태에서, C-말단 연장부 (B2)는 펩티드 항원 (A)의 C-말단 카르복실 기와 연장부 (B2)의 N-말단 잔기의 알파 아민 간에 형성된 아미드 결합을 통해 펩티드 항원 (A)에 연결된다. B2와 펩티드 항원 (A) 사이의 아미드 결합은 효소에 의해 절단될 수 있다. 아미노산 위치를 절단 부위로부터 근위에서 원위로 있는 순서대로 번호를 매기는 것이 통상적인 것에 주목해야 하고, 절단 부위에 대해 C-말단인 아미노산 위치가 프라임 부호 (예를 들어, Pn')로서 표시된다. 예를 들어, 옥타펩티드 항원 (PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1)의 C-말단에 연결된 테트라펩티드 연장부 (PC1'-PC2'-PC3'-PC4'), 예를 들어, PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1'-PC2'-PC3'-PC4'의 경우, PA1과 PC1' 사이의 아미드 결합은 효소에 의해 인식되고 가수분해된다.
바람직한 실시양태에서, C-말단 연장부 (B2)는 면역 프로테아솜 인식 및 절단 및 임의로 엔도솜 프로테아제 인식을 촉진하도록 선택되는 아미노산 서열이다. 펩티드 항원 (A)은 전형적으로, 예를 들어, 펩티드 항원 (A)의 C-말단 잔기에 근접한 아미드 결합에서 면역 프로테아솜에 의한 가수분해를 촉진하는 C-말단 잔기, 예를 들어 류신을 함유하기 때문에, 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결된 연장부는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 근접한 아미드 결합에서 면역 프로테아솜 인식 및 절단을 촉진하도록 선택되어야 한다. 면역 프로테아솜은 펩티드 항원 (A)의 C-말단 아미노산인 PA1에 인접한 PC1' 위치에서의 작은 비-하전된 아미노산, 예를 들어, PA1과 PC1' 사이의 아미드 결합을 선호한다. 그러나, 엔도솜 프로테아제는 벌키 소수성 아미노산 (예를 들어, 류신, 노르류신, 메티오닌 또는 글루타민) 및 염기성 아미노산 (즉, 아르기닌 및 리신)을 선호한다. 따라서, C-말단 연장부는 프로테아제의 부류 중 하나 또는 둘 다에 의한 인식을 촉진시키기 위해 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열 PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1을 수반한 펩티드 항원 (A)은 서열 PC1'...PCn'을 수반한 C-말단 펩티드 연장부 (B2) (여기서 n은 1 내지 8의 정수 값임)에 연결되며, 예를 들어, PA8-PA7-PA6-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1'...PCn'이다. C-말단 연장부 (B2)의 조성은 사용된 연장부 서열의 길이에 좌우된다. 일부 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 Gly, Ala, Ser, Arg, Lys, Cit, Gln, Thr, Leu, Nle 또는 Met로부터 선택된 단일 아미노산 PC1'이다. 부가의 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 디펩티드인 PC1'-PC2'이며, 여기서 PC1'는 Gly, Ala 또는 Ser로부터 선택되고; PC2'는 Gly, Ala, Ser, Pro, Arg, Lys, Cit, Gln, Thr, Leu, Nle, 또는 Met로부터 선택된다. 부가의 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 트리펩티드인 PC1'-PC2'-PC3'이며, 여기서 PC1'는 Gly, Ala, 또는 Ser로부터 선택되고; PC2'는 Gly, Ala, Ser, 또는 Pro로부터 선택되고; PC3'는 Gly, Ser, Arg, Lys, Cit, Gln, Thr, Leu, Nle 또는 Met로부터 선택된다.
부가의 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 테트라펩티드 연장부인 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'이며, 여기서 PC1'는 글리신, 알라닌 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC3'는 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC4'는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된다. 부가의 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 펜타펩티드인 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'이며, 여기서 PC1'는 글리신, 알라닌 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아르기닌, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택되고; PC3'는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC4'는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC5'는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된다. 부가의 실시양태에서, C-말단 연장부 B2는 헥사펩티드인 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6'이며, 여기서 PC1'는 글리신, 알라닌 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'는 글리신, 알라닌, 세린 또는 프롤린으로부터 선택되고; PC3'는 글리신, 세린, 프롤린, 아르기닌, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택되고; PC4'는 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC5'는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC6'는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된다.
헥사펩티드 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 11), Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 12), Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 13), Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit; Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit, Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 14), Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 15), Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 16)를 포함한다. 펜타펩티드 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 17), Gly-Ser-Leu-Val-Cit, Gly-Lys-Pro-Val-Cit, Gly-Lys-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 18), Gly-Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 19), Gly-Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 20)를 포함한다. 테트라펩티드 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Ser-Leu-Val-Cit, Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 4), Ser-Pro-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 5), Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6), Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7), Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8), Glu-Leu-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 10), Glu-Pro-Val-Cit, Glu-Gly-Val-Cit를 포함한다. 트리펩티드 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Arg, Gly-Ser-Leu, Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Gly, Gly-Pro-Arg, Gly-Pro-Leu, Gly-Pro-Cit를 포함한다. 디펩티드 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly-Ser; Gly-Pro, Val-Cit, Gly-Arg, Gly-Cit를 포함한다. 단일 아미노산 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly, Ser, Ala, Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Met, Thr, Gln 또는 Nle를 포함한다. 상기 예에서, Arg는 Lys로 대체될 수 있고; Lys는 Arg로 대체될 수 있으며; Glu는 Asp로 대체될 수 있고; Asp는 Glu로 대체될 수 있다.
펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결된 C-말단 링커 (B2)는 면역 프로테아솜과 엔도솜 프로테아제 둘 다에 의한 인식 (즉, 가수분해)을 위해 선택될 수 있다. 비제한적 예에서, 서열 PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1을 수반한 펩티드 항원 (A)은 서열 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'을 수반한 C-말단 테트라펩티드 연장부 (B2)에 C-말단에서 연결되며, 여기서 PC1'는 글리신, 알라닌 또는 세린으로부터 선택되고, PC4'는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되며, 예를 들어, Ser-P3-P2-Arg이다. 일부 실시양태에서, 서열 PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1을 수반한 항원은 서열 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6'을 수반한 C-말단 헥사펩티드 연장부 (B2)에 C-말단에서 연결되며, 여기서 PC1' 및 PC2'는 글리신, 알라닌, 프롤린 또는 세린으로부터 선택되고, PC6'는 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되며, 예를 들어, Gly-Gly-PC3'-PC4'-PC5'-Arg이다. 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는, 면역 프로테아솜과 카텝신 둘 다에 의한 프로세싱을 촉진시키는 C-말단 연장부 (B2)의 비제한적 예는 Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 12)이다. 면역 프로테아솜과 카텝신에 의한 프로세싱을 선호하는, 펩티드 항원 (A)의 C-말단에서 연결되는 C-말단 연장부 (B2)의 부가의 비제한적 예는 Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit이다.
링커 (L) 및 링커 전구체 (X1 및 X2)
펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)와 부위 선택적으로 커플링하는, 즉 결합 또는 함께 연결시키는 특이적 기능을 수행하는 링커의 서브세트가 "링커 (L)"로서 지칭된다. 링커 (L)는 링커 전구체 X1과 링커 전구체 X2 사이의 반응의 결과로서 형성된다. 예를 들어, 직접적으로, 또는 연장부 (B1 또는 B2) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결되는 링커 전구체 X1은 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 부착된 링커 전구체 X2와 반응하여, 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결하는 링커 (L)를 형성할 수 있다. 링커 전구체 X1은 펩티드 항원 (A)과 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)의 부위-선택적 연결을 허용한다. 일부 실시양태에서, 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 링커 전구체 X1에 연결된 펩티드 항원 (A)은 생산 및 단리된 다음, 펩티드 항원 (A)과 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)를 연결하는 링커 (L)를 형성하도록 선택적으로 반응하는 링커 전구체 X2를 함유하는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 별도로 부가될 수 있다.
링커 (L) 또는 링커 전구체 X1은 직접적으로, 또는 N-말단 연장부 (B1) 또는 C-말단 연장부 (B2) 각각을 통해 간접적으로 펩티드 항원의 N- 또는 C-말단 중 하나에서 펩티드 항원 (A)에 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 링커 (L) 또는 링커 전구체 X1은 아미드 결합을 통해 펩티드 항원 (A) 또는 연장부 (B1 또는 B2)에 연결된다. 펩티드 항원의 N- 또는 C-말단에 직접적으로 연결된 링커 (L) 또는 링커 전구체 X1은 연장부로 간주되지 않는다는 것에 주목해야 한다.
적합한 링커 전구체 X1은 펩티드 항원 (A) 또는 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 또는 임의적 하전된 분자 (C)의 임의의 다른 부위에서 발생하는 연결 없이 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 상의 링커 전구체 X2와 선택적으로 반응하는 것이다. 이러한 선택성은 펩티드 항원 (A)에 대한 변형 없이 펩티드 항원 (A)과 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 간에 연결이 형성될 수 있도록 보장하는데 중요하다. 링커 (L)는 공유적 및/또는 높은 친화도 상호작용을 통해 펩티드 항원 (A)을 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 입자 또는 소수성 분자 (H) 상의 링커 전구체 X2와 공유 결합을 형성한다.
바람직한 실시양태에서, 링커 (L)는 링커 전구체 X1과 X2 사이의 생물직교 "클릭 화학" 반응의 결과로서 형성된다. 일부 실시양태에서, 클릭 화학 반응은 무촉매 클릭 화학 반응, 예컨대 구리 또는 임의의 촉매의 사용을 필요로 하지 않는 스트레인 촉진된 아지드-알킨 부가 환화 반응이다. 생물직교 반응을 허용하는 링커 전구체 X1의 비제한적 예는 아지드, 알킨, 테트라진 및 트랜스시클로옥텐으로부터 선택된 관능기를 포함하는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아지드를 포함하는 링커 전구체 X1은 링커 전구체 X2와 반응하여 트리아졸 링커를 형성한다. 다른 실시양태에서, 테트라진을 포함하는 링커 전구체 X1은 트랜스시클로옥텐 (TCO)을 포함하는 링커 전구체 X2와 반응하여, 역 수요 딜스-알더(Diels-Alder) 라이게이션 산물을 포함하는 링커를 형성한다. 바람직한 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 안정한 트리아졸 고리를 형성하기 위해 1,3-이극성 부가 환화를 겪는 알킨 존재를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응하는 아지드 관능기를 보유하는 비-자연 아미노산이다. 바람직한 실시양태에서, 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결된 X2 링커 전구체는 스트레인 촉진된 부가 환화를 겪는 알킨, 예컨대 디벤조시클로옥틴 (DBCO)을 포함한다. 부가의 실시양태에서, X1 링커 전구체는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 상에 존재하는 아지드를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응하는 알킨이다.
다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)의 조성에 따라 부위-선택적 반응성을 허용하는 링커 전구체 X1은 티올, 히드라진, 케톤 및 알데히드를 포함하는 관능기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올을 포함하는 링커 전구체 X1은 피리딜-디술피드 또는 말레이미드를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응하여, 각각 디술피드 또는 티오에테르 링커를 형성한다. 다른 실시양태에서, 히드라진을 포함하는 링커 전구체 X1은 케톤 또는 알데히드를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응하여 히드라존 링커를 형성한다. 일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 티올 관능기를 수반한 자연 또는 비-자연 아미노산 잔기, 예컨대 시스테인이며, 이는 티올 반응성 관능기, 예컨대 말레이미드 또는 피리딜 디술피드를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응한다.
일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 상에 제공된 링커 전구체 X2를 포함하는 또 다른 펩티드 서열에 라이게이션되는 펩티드 서열이다. 다른 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 높은 친화성, 비-공유적 상호작용, 예를 들어, 코일드-코일 상호작용 또는 정전기 상호작용을 통해 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H) 상에 링커 전구체 X2를 포함하는 상보적 분자에 결합한다. 다른 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 단백질, 예를 들어, 비오틴에 결합하여, 단백질, 예를 들어 스트렙타비딘과의 높은 친화성 상호작용을 형성한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 링커 전구체 X1 및 X2에 대해 선택된 적합한 쌍의 관능기 또는 상보성 분자가, X1과 X2 간에 전위될 수 있다는 것을 인식한다. 예를 들어, 트리아졸로 구성된 링커는 아지드 및 알킨을 각각 포함하는 링커 전구체 X1 및 X2로부터, 또는 알킨 및 아지드를 각각 포함하는 링커 전구체 X1 및 X2로부터 형성될 수 있다. 따라서, 링커를 초래하는 임의의 적합한 관능기 쌍이 X1 또는 X2 상에 위치될 수 있다.
본 개시내용에 제시된 특별한 링커 전구체 (X1 및 X2) 및 링커 (L)는 제조 능력에 있어서의 예상치 못한 개선 및 생물학적 활성에 있어서의 개선을 제공한다. 이러한 많은 링커 전구체 (X1 및 X2) 및 링커 (L)가 본 발명의 실시에 적합할 수 있으며, 전체에 걸쳐 보다 상세히 기재된다.
링커 전구체 (X1)는 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 직접적으로 또는 B2 연장부 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결된 아미노산이고 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00001
여기서 관능기 (FG)는 링커 전구체 X2 상의 FG와 특이적으로 반응하도록 선택되고, 전형적으로 아민, 아지드, 히드라진 또는 티올로부터 선택되며; R1은 전형적으로, OH 또는 NH2로부터 선택되고, y1은 임의의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며; 아미노산의 알파 아민은 전형적으로, 연장부 B2의 C-말단 아미노산에 연결되거나, 또는 B2 연장부가 없는 경우에는, 펩티드 항원 (A)의 C-말단 아미노산에 연결된다.
다른 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되고 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
여기서 관능기 (FG)는 링커 전구체 X2와 반응하도록 선택되고, 전형적으로 아민, 아지드, 히드라진 또는 티올로부터 선택되며; y2는 임의의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며; 카르보닐은 전형적으로, 연장부 B1의 N-말단 아미노산의 알파 아민에 연결되거나, 또는 B1이 존재하지 않는 경우에는, 펩티드 항원 (A)에 연결된다.
소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 상에 제공된 링커 전구체 X2는, 링커 전구체 X1과의 선택적 반응이 링커 (L)를 형성할 수 있도록 선택되는 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, X2를 구성하는 관능기는 링커 전구체 X1 상에 제공된 아민 또는 히드라진과 반응하여 아미드 또는 히드라존을 포함하는 링커 (L)를 형성하는 카르보닐, 예컨대 활성화된 에스테르/카르복실산 또는 케톤을 포함한다. 다른 실시양태에서, X2를 구성하는 관능기는 링커 전구체 X1 상에 제공된 알킨과 반응하여 트리아졸을 형성하는 아지드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, X2를 구성하는 관능기는 링커 전구체 X1 상에 제공된 티올과 반응하여 티오에테르 또는 디술피드를 포함하는 링커 (L)를 형성하는 말레이미드 또는 디술피드로부터 선택된다. 링커 전구체 X2는 임의의 적합한 수단을 통해 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 펩티드를 포함하고 X2는 펩티드-기반 소수성 분자 (H)의 N-말단에 연결된다.
링커 (L)는 아지드 및 알킨을 각각 포함하는 링커 전구체 X1과 X2 간에 형성된 트리아졸을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트리아졸을 포함하는 링커는 아지도 함유 링커 전구체 X1과 알킨 (예를 들어, 시클로옥틴) 함유 링커 전구체 X2의 반응으로부터 비롯된다. 일부 실시양태에서, 아지도 함유 링커 전구체 X1은 펩티드 항원 (A)의 N-말단 또는 연장부 (B1) 또는 펩티드 항원 (A)의 C-말단 또는 연장부 (B2)에 연결되는 아지드 관능기를 보유하는 비-자연 아미노산이다. 아지드 관능기는 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 연결되거나 또는 N-말단 연장부 (B1) 또는 C-말단 연장부 (B2)을 통해 간접적으로 연결되는 반응성 핸들를 제공하고, 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결되는 알킨 (예를 들어, 시클로옥틴) 함유 링커 전구체 X2와 선택적으로 반응함으로써, 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결시키는 트리아졸 링커 (L)를 형성한다.
일부 실시양태에서, 링커 전구체 X1은 직접적으로 또는 B2 연장부 또는 하전된 분자 (C)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결된 아지도 아미노산이고 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00003
여기서 아미노산의 알파 아민은 B2의 C-말단 아미노산에 연결되거나, 또는 B2 연장부가 없는 경우에는, 펩티드 항원 (A)에 연결되고; R1은 OH 또는 NH2로부터 선택되고 n은 임의의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 아지도 함유 링커 전구체 X1의 비제한적 예는 5-아지도-2-아미노 펜탄산, 4-아지도-2-아미노 부탄산 및 3-아지도-2-아미노 프로판산이다.
다른 실시양태에서 아지도 함유 링커 전구체 X1이 N-말단 연장부 (B1)에 연결되거나, 또는 B1이 존재하지 않는 경우에 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 직접적으로 연결되면, 링커 전구체 X1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00004
여기서 카르보닐은 전형적으로, 연장부 B1의 N-말단 아미노산의 알파 아민에 연결되거나, 또는 B1이 존재하지 않는 경우에 펩티드 항원 (A)에 연결되고; y2는 임의의 정수, 전형적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 또는 8이다. 아지도-함유 링커 전구체의 비제한적 예는 6-아지도-헥산산, 5-아지도-펜탄산, 4-아지도-부탄산 및 3-아지도-프로판산을 포함한다.
링커 전구체 X1이 아지드를 포함하는 일부 실시양태에서, 링커 전구체 X2는 알킨 모이어티를 포함한다. 알킨의 비제한적 예는 지방족 알킨, 시클로옥틴, 예컨대 디벤질시클로옥틴 (DBCO 또는 DIBO), 디플루오로옥틴 (DIFO), 및 비아릴아자시클로옥틴온 (BARAC)을 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, 알킨 함유 링커 전구체 X2는 DBCO 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, C-말단 연장부 (B2)는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에서 아미드 결합을 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되며, 이는 결국, 링커 (L)를 통해 소수성 블록 (H)에 연결된다. 이러한 C-말단 연결된 펩티드 항원 접합체의 예는 (A)7-35-B2-L-H이며, 여기서 (A)7-35는 7 내지 35개의 아미노산을 포함하는 펩티드 항원을 나타낸다. 비제한적 예에서, 옥타펩티드 서열 PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1을 수반한 펩티드 항원 (A)은 아지도 함유 링커 전구체 (X1) 아지도-리신 (6-아지도 2-아미노 헥산산, Lys(N3))에 연결되는 테트라펩티드 연장부 (B2), 예를 들어, Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7)에 C-말단에서 연결되며, 이는 결국, 소수성 분자 (H)에 연결되는 시클로옥틴 함유 링커 전구체 (X2)의 디벤조시클로옥틴 (DBCO) 모이어티와 반응하여 PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)를 생산한다.
일부 대안적 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 펩티드 항원 (A)의 N-말단에서 N-말단 연장부 (B1)에 연결되고, 이는 결국, 링커 (L)를 통해 소수성 블록 (H)에 연결된다. 비제한적 예에서, 서열 PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8'을 수반한 펩티드 항원은 아지도-펜탄산 (Azp)에 연결되는 테트라펩티드 연장부 (PN4-PN3-PN2-PN1), 예를 들어, Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7)에 N-말단에서 연결되며, 이는 결국, 소수성 분자 (H)에 연결되는 시클로옥틴 함유 링커 전구체 (X2)의 디벤조시클로옥틴 (DBCO) 모이어티와 반응하여 H-DBCO-Azp-Ser-Leu-Val-Arg-PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8'를 생산한다.
다른 링커 및 연결
링커는 일반적으로, 펩티드 항원 접합체의 임의의 2개 이상의 이종 분자를 함께 결합하고 부가적으로 하기 기능 중 임의의 하나 이상을 수행할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다: I) 수 용해도를 증가 또는 감소시키거나; II) 펩티드 항원 접합체의 임의의 2개의 성분, 즉 이종 분자 사이의 거리를 증가시키거나; III) 강성 또는 유연성을 부여하거나; 또는 IV) 임의의 2개 이상의 이종 분자 사이의 연결의 분해 / 가수분해 속도를 제어 / 조정한다. 본원에 사용된 특이적 유형의 링커가 명명된다. 링커 (L)는 펩티드 항원 (A)을 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 부위 특이적으로 연결하는데 사용되는 특이적 유형의 링커 분자이다. 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단에 각각 배치된 N- 및 C-말단 연장부인 B1 및 B2는 이종 분자, 예컨대 하전된 분자 (C), 링커 (L), 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H), 또는 임의의 이종 분자에 연결될 수 있으므로, 링커로서 기능할 수 있다는 것에 주목해야 한다. 명확성을 위해, 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단에 배치된 임의의 분자는 N- 또는 C-말단 연장부 (B1 또는 B2)이지만, 이러한 연장부는 그것이 또 다른 분자, 예를 들어, 하전된 분자 (C)에 연결될 때 링커로서 작용할 수도 있다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이, 항원의 N-말단 또는 C-말단에서의 링커는 항상 연장부 (B1 또는 B2)이지만, 연장부가 항상 링커인 것은 아니다.
펩티드 항원 접합체의 임의의 2가지 성분, 예를 들어, 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)을 연결하는데 사용되는 링커는 임의의 적합한 수단을 통해 이루어질 수 있다. 링커는 공유 또는 비-공유 수단을 사용하여 임의의 2개 이상의 성분, 즉 이종 분자, 예를 들어 펩티드 항원 (A) 및 소수성 분자 (H)를 연결할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 링커는 공유 결합을 통해 펩티드 항원 접합체의 임의의 2가지 성분을 연결시킬 수 있다. 공유 결합은 펩티드 항원 접합체의 임의의 2가지 성분, 즉 이종 분자를 연결하고, 대상체에게 투여 후, 다른 성분, 예를 들어 펩티드 항원 및 소수성 분자 (H)로부터 즉시 분산될 수 있는 성분이 없도록 보장하기 위해 사용되는 바람직한 연결이다. 더욱이, 공유 연결은 전형적으로, 비-공유 연결에 비해 더 큰 안정성을 제공하고, 펩티드 항원 접합체의 각각의 성분이, 투여된 각각의 성분의 비율에서 또는 그 근사치에서 항원 제시 세포에 공동 전달되는 것을 보장하도록 도와준다.
공유 연결의 비제한적 예에서, 클릭 화학 반응은 펩티드 항원 접합체의 임의의 2가지 성분을 연결하는, 즉 함께 결합하는 트리아졸을 초래할 수 있다. 여러 실시양태에서, 클릭 화학 반응은 스트레인 촉진된 [3+2] 아지드-알킨 부가 환화 반응이다. "클릭 화학"에 의해 연결될 펩티드 항원 접합체를 구성하는 각각의 분자 상에 알킨 기 및 아지드 기가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아지드 관능기를 보유하는 리간드, 예컨대 TLR 효능제는 적절한 반응성 기, 예컨대 알킨, 예를 들어, 디벤질시클로옥틴 (DBCO)을 갖는 소수성 분자 (H)에 커플링된다. 부가의 실시양태에서, 티올 관능기를 보유하는 X1 링커 전구체는 직접적으로 또는 N- 또는 C-말단 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결된다. 티올은 적절한 반응성 기, 예컨대 알킨, 알켄, 말레이미드를 갖는 소수성 분자 (H)에 연결되어 티오에테르 결합을 초래할 수 있거나, 또는 티올은 피리딜 디술피드와 반응하여, 예를 들어, 디술피드 연결을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아민이 하나의 분자 상에 제공되며, 아민을 임의의 적합한 친전자성 기, 예컨대 카르복실산, 산 클로라이드 또는 활성화된 에스테르 (예를 들어, NHS 에스테르)와 반응시킴으로써 또 다른 분자에 연결될 수 있으며, 이는 아미드 결합 형성을 초래하거나, 또는 아민은 알켄 (마이클 부가를 통함), 알데히드 및 케톤 (쉬프 염기를 통함)과 반응될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 링커 전구체 X1, 임의적 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2), 임의적 하전된 분자 (C) 및 펩티드 항원 (A)은 고체 상 펩티드 합성에 의해 생산된 단일 펩티드 서열로서 아미드 결합을 통해 함께 연결된다. 통상의 기술자에게 익숙한 공유 결합, 즉 연결을 초래하는 다수의 적합한 반응이 이용가능하다.
펩티드 항원 접합체의 임의의 2개 이상의 이종 분자, 즉 별개의 성분을 연결하는데 사용되는 링커의 유형은 특이적 기능을 수행하고 적용의 특이적 요건을 충족시키기 위해 선택될 수 있다. 전형적으로, 링커는 펩티드 항원 접합체의 2개 이상의 이종 분자 사이에 공유 결합을 형성할 수 있으며, 여기서 성분은 펩티드 항원 (A), 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H), 임의적 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2), 임의적 링커 (L); 임의적 하전된 분자 (C); 임의적 제2 중합체 (이는 소수성 분자 (H)에 연결됨); 및 임의적 리간드, 예컨대 PRR 효능제이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 많은 적합한 링커가 있으며, 직쇄 또는 분지된 쇄 탄소 링커, 헤테로시클릭 탄소 링커, 강성 방향족 링커, 유연성 에틸렌 옥시드 링커, 펩티드 링커, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 탄소 링커는 C1-C18 알칸 링커, 예컨대 저급 알킬 C4를 포함할 수 있고; 알칸 링커는 2개 이상의 이종 분자 사이의 공간을 증가시키는 역할을 하는 반면, 더 장쇄 알칸 링커는 소수성 특징을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 한편으로는, 친수성 링커, 예컨대 에틸렌 옥시드 링커는 알칸 링커 대신에 사용되어 임의의 2개 이상의 이종 분자 사이의 공간을 증가시키고 수 용해도를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 링커는 방향족 화합물, 또는 강성을 부여하는 폴리(방향족) 화합물일 수 있다. 링커 분자는 친수성 또는 소수성 링커를 포함할 수 있다. 여러 실시양태에서, 링커는 세포내 효소 (예컨대, 카텝신 또는 면역 프로테아솜)에 의해 절단가능한 분해성 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 폴리(에틸렌 옥시드) (PEG)로 구성될 수 있다. 링커의 길이는 링커의 목적에 좌우된다. 예를 들어, 링커, 예컨대 PEG 링커의 길이는 면역원성 조성물의 성분을 분리하기 위해, 예를 들어 입체 장애를 감소시키기 위해 증가될 수 있거나, 또는 친수성 PEG 링커의 경우에는, 수 용해도를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 링커, 예컨대 PEG는 적어도 2개의 단량체 길이일 수 있는 짧은 링커일 수 있다. 링커, 예컨대 PEG는 약 4 내지 약 24개의 단량체 길이, 예컨대 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개 또는 그 초과의 단량체 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 PEG 링커를 통해 소수성 분자 (H)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커가 탄소 쇄를 포함하는 경우, 링커는 약 1 또는 2개 내지 약 18개의 탄소, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개 또는 그 초과의 탄소 길이의 쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커가 탄소 쇄를 포함하는 경우, 링커는 약 12 내지 약 20개의 탄소 쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커가 탄소 쇄를 포함하는 경우, 링커는 18개 이하의 탄소 쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드, 예컨대 PRR 효능제는 저급 알킬을 통해 소수성 분자 (H)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커는 세포내 조건 하에서 절단가능하여, 링커의 절단은 링커에 연결된 임의의 성분, 예를 들어, 펩티드 항원의 방출을 초래한다.
예를 들어, 링커는 세포내 소포 내에 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 또는 카베올레아 내에) 국한된 효소에 의해, 또는 세포질 내의 효소, 예컨대 프로테아솜 또는 면역 프로테아솜에 의해 절단가능할 수 있다. 링커는, 예를 들어, 세포내 소포에 국한된 프로테아제, 예컨대 리소좀 또는 엔도솜 구획 내의 카텝신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 전형적으로, 1 내지 10개 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과 (예컨대 20개 이하)의 아미노산 길이, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다. 특정의 디펩티드는 카텝신, 예컨대 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함하는 프로테아제에 의해 가수분해되는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 예를 들어, 티올-의존적 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티드 링커 (예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly (서열식별번호: 23) 링커)가 사용될 수 있다. 이러한 링커의 다른 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,345 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 구체적 실시양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커이다 (예를 들어, Val-Cit 링커를 이용한 독소루비신의 합성을 기재하고 있는 미국 특허 번호 6,214,345 참조).
링커 내의 절단가능한 펩티드에 대한 특별한 서열은 세포내 흡수 후 면역 세포에 의한 프로세싱을 촉진하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 여러 실시양태는 면역 세포, 예컨대 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)에 의해 내재화되는 수성 조건에서 입자를 형성한다. 절단가능한 펩티드 링커는 면역 세포에 의한 세포내 흡수 후 펩티드 링커의 프로세싱 (즉, 가수분해)을 촉진하도록 선택될 수 있다. 절단가능한 펩티드 링커의 서열은 세포내 프로테아제, 예컨대 세포내 소포에서의 카텝신 또는 세포질 공간에서의 프로테아좀 또는 면역 프로테아솜에 의한 프로세싱를 촉진하도록 선택될 수 있다.
여러 실시양태에서, 화학식 Pn...P4-P3-P2-P1의 펩티드 서열로 구성된 링커는 카텝신에 의한 인식을 촉진하기 위해 사용되며, 여기서 P1은 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되고; P2는 글리신, 류신, 발린 또는 이소류신으로부터 선택되고; P3은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; P4는 글리신, 세린, 아르기닌, 리신, 아스파르트산 또는 글루탐산으로부터 선택된다. 비제한적 예에서, 화학식 P4-P3-P2-P1의 테트라펩티드 링커는 아미드 결합을 통해 이종 분자에 연결되고, 서열 Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8)을 갖는다. 명확성을 위해, 아미노산 잔기 (Pn)는 절단 부위로부터 근위에서 원위로 번호가 매겨지며, 이는 P1 잔기에 대한 C-말단이고, 예를 들어, P1과 P1' 사이의 아미드 결합이 가수분해된다. 엔도솜 및 리소좀 프로테아제, 예컨대 카텝신에 의한 절단을 촉진하는 적합한 펩티드 서열은 문헌에 널리 기재되어 있다 (문헌 [Choe, et al., J. Biol. Chem., 281: 12824-12832, 2006] 참조).
여러 실시양태에서, 펩티드 서열로 구성된 링커는 프로테아솜 또는 면역 프로테아솜에 의한 인식을 촉진하도록 선택된다. 화학식 Pn...P4-P3-P2-P1의 펩티드 서열은 프로테아솜 또는 면역 프로테아솜에 의한 인식을 촉진하기 위해 선택되며, 여기서 P1은 염기성 잔기 및 소수성, 분지된 잔기, 예컨대 아르기닌, 리신, 류신, 이소류신 및 발린으로부터 선택되고; P2, P3 및 P4는 임의로, 류신, 이소류신, 발린, 리신 및 티로신으로부터 선택된다. 비제한적 예에서, 프로테아솜에 의해 인식되는 화학식 P4-P3-P2-P1의 절단가능한 링커는 P1에서 아미드 결합을 통해 이종 분자에 연결되고, 서열 Tyr-Leu-Leu-Leu (서열식별번호: 24)을 갖는다. 프로테아솜 또는 면역 프로테아솜에 의한 분해를 촉진하는 서열은 단독으로 또는 카텝신 절단가능한 링커와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 프로테아솜 프로세싱을 촉진하는 아미노산은 엔도솜 프로테아제에 의한 프로세싱을 촉진하는 링커에 연결된다. 면역 프로테아솜에 의한 절단을 촉진하는 수많은 적합한 서열이 문헌에 널리 기재되어 있다 (문헌 [Kloetzel, et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2: 179-187, 2001, Huber, et al., Cell, 148:727-738, 2012, 및 Harris et al., Chem. Biol, 8:1131-1141, 2001] 참조).
바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단에 각각 연결되는 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2)는 부가의 분자, 예를 들어, 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H)에 각각 연결되고, 절단가능한 펩티드로 구성된다. 여러 실시양태에서, 절단가능한 펩티드 연장부는 펩티드 항원 (A)의 N- 및/또는 C-말단 중 하나 또는 둘 다에 배치된다. 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 배치된 절단가능한 펩티드 연장부는 N-말단 연장부 (B1)이지만, 그 연장부가 펩티드 항원 외에, 또 다른 분자, 예를 들어, 하전된 분자 (C)에 연결되는 경우에는 부가적으로 링커로서 기능할 수 있다. 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 배치된 연장부는 C-말단 연장부 (B2)이지만, 그 연장부가 또 다른 분자, 예를 들어, 소수성 분자 (H)에 연결되는 경우에는 부가적으로 링커로서 기능할 수 있다. N- 또는 C-말단 (B1 및 B2) 중 하나에서 링커를 포함하는 절단가능한 펩티드의 바람직한 서열은 별개이고, 전체에 걸쳐 더 상세하게 기재되어 있다.
다른 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체의 임의의 2개 이상의 성분은 산성 조건 하의 가수분해에 대해 감수성인 pH-감수성 링커를 통해 함께 연결될 수 있다. 다수의 pH-감수성 연결은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙하고, 예를 들어, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661] 참조). 바람직한 실시양태에서, 연결은 생리적 pH, 예를 들어 약 7.4의 pH에서 안정적이지만, 리소좀 pH인 ~ pH 5-6.5에서 가수분해된다. 일부 실시양태에서, 리간드, 예컨대 TLR-7/8 효능제는 케톤과 히드라진 사이의 반응과 같은 pH-감수성 결합을 형성하는 FG를 통해 소수성 분자 (H)에 연결되어 pH 불안정한 히드라존 결합을 형성한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로, 케톤기를 보유하는 링커 전구체 X1에 연결되고, 소수성 분자 (H) 상의 히드라진을 포함하는 링커 전구체 X2에 연결된다. pH-감수성 연결, 예컨대 히드라존은 생리학 pH인 약 pH 7.4에서 결합이 안정적이지만 더 낮은 pH, 예컨대 세포내 소포의 pH에서 가수분해된다는 이점을 제공한다.
다른 실시양태에서, 링커는 환원성 조건, 예컨대 환원성 디술피드 결합 하에서 절단가능한 연결을 포함한다. 디술피드 연결을 도입하기 위해 사용되는 많은 상이한 링커가 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68:92809290, 2008)] 참조). 또한, 미국 특허 번호 4,880,935 참조. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H)에 연결된 피리딜 디술피드를 포함하는 X2 링커 전구체와 디술피드 연결을 형성하는 티올 관능기를 보유하는 링커 전구체 X1에 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 연결된다.
또 다른 부가의 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체의 임의의 2가지 성분 사이의 연결은 효소적 반응, 예컨대 발현된 단백질 라이게이션 또는 소르타제(sortase) (문헌 [Fierer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 111:W1176-1181, 2014 및 Theile et al., Nat. Protoc, 8:1800-1807, 2013] 참조), 화학 효소적 반응 (문헌 [Smith, et al., Bioconjug. Chem., 25:788-795, 2014]) 또는 비-공유적 높은 친화성 상호작용, 예컨대, 예를 들어, 비오틴-아비딘 및 코일드-코일 상호작용 (문헌 [Pechar, et al., Biotechnol. Adv., 31:90-96, 2013]) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지되어 있는 임의의 적합한 수단 (문헌 [Chalker, et al., Acc. Chem. Res., 44:730-741, 2011, Dumas, et al., Agnew Chem. Int. Ed. Engl., 52:3916-3921, 2013] 참조)에 의해 형성될 수 있다.
입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)
본 개시내용의 면역원성 조성물은 미리 형성된 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)를 추가로 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함한다. 입자 (P)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 수성 조건에서 입자로서 발생한다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 유기 용매 (예를 들어, DMSO)에서 단일 가용성 분자로서 발생할 수 있지만 수성 조건에서 입자로 어셈블리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 유기 용매 (예를 들어, DMSO) 및 특정 온도 및 pH 범위에 걸쳐 수성 조건에서 단일 가용성 분자로서 발생할 수 있지만, 특정 온도 및 pH 범위에 걸쳐, 예를 들어 생리적 온도 및 pH 하에 수성 조건에서 입자로 어셈블리될 수 있다.
입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)의 목적은 약동학을 조정하고 항원 제시 세포에 의한 흡수를 촉진시키기 위한 수단으로서 펩티드 항원 접합체를 미립자 포맷으로 만드는 것이다. 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자는 약 10 nm 내지 10,000 nm 직경의 크기여야 한다. 바람직한 실시양태에서, 입자는 세포 (예컨대 면역 세포)의 엔도솜 시스템 내로 흡수될 수 있는 크기의 나노입자가다. 나노입자는 약 10 nm 내지 약 500 nm 직경의 평균 크기 범위일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 나노입자는 평균 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm 또는 500 nm 직경일 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노입자는 평균 약 10 내지 50 nm, 또는 약 10 내지 100 nm, 또는 약 10 내지 200 nm 또는 약 10 내지 500 nm 직경일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 입자 크기는 약 20 내지 200 nm 직경의 범위이다. 조성물 중의 입자는 크기가 다양할 수 있지만, 일반적으로 본원에 제시된 크기 범위 내에 속할 것이다. 예를 들어, 조성물 중의 입자의 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과가 본원에 제시된 크기 범위 내에 속할 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결되는 연장부 (B1 또는 B2)에 연결될 수 있으며, 이는 면역 세포에 의해 흡수되기에 너무 크고 주사 부위에서 저장소를 형성하는 입자 (예를 들어, 약 5,000 nm 초과 입자)로 어셈블리된다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 미리 형성된 입자 (P)에 연결된다. 입자 (P)는 수성 조건에서 구조를 유지하는 소수성 물질, 예컨대 중합체 또는 지질, 가교 친수성 중합체, 예컨대 히드로겔, 또는 가교 소수성 중합체, 예컨대 가교 폴리스티렌으로 구성될 수 있다. 입자 (P)의 비제한적 예는 중합체 입자, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA), 폴리머솜 또는 폴록사머; 지질-기반 미셀, 리포솜 또는 다중 적층 소포; 수중유 에멀젼, 예컨대 수중 미네랄 오일 및 메네랄 오일중 수 에멀젼; 및 무기 염 입자, 예컨대 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄 염 입자 (즉, 명반)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 입자 (P)는 리포솜 나노입자가다. 다른 실시양태에서, 입자 (P)는 철 입자이다. 또 다른 실시양태에서, 입자 (P)는 중합체 입자이다.
미리 형성된 입자 (P)에 대한 펩티드 항원 (A) 연결의 효율은 펩티드 항원의 성질 및 사용된 연결 유형에 의존한다. 예를 들어, 펩티드 항원 (A)은 입자 (P) 내부에 흡착 또는 혼입될 수 있으며, 이러한 프로세스의 효율은, 펩티드 항원 (A)의 성질이 흡착 및 혼입에 영향을 미칠 수 있기 때문에 각각의 펩티드 항원 (A)에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 펩티드 항원 (A)은 높은 친화성 상호작용 (예를 들어, 정전기) 또는 공유 결합을 통해 입자 (P)에 연결될 수 있으며, 여기서 입자 (P)는 이러한 입자 (P)에 연결될 수 있는 펩티드 항원 (A)의 수를 지시할 것인 설정된 수의 반응성 부위를 갖는다. 다수의 상이한 펩티드 항원 (A), 예를 들어 20개의 상이한 펩티드 항원 (A)을 포함하는 면역원성 조성물의 경우, 각각의 유형의 펩티드 항원 (A)의 다중 카피가 별도의 입자 (P) 상에 전달될 수 있거나, 또는 20개 모든 유형의 펩티드 항원 (A)의 다중 카피가 동일한 입자 (P) 상에 전달될 수 있다.
미리 형성된 입자 (P)의 제한은 항원 대 입자 (P)의 비를 용이하게 제어할 수 없다는 것이다. 또 다른 한편으로는, 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해, 수성 조건에서 입자 어셈블리를 촉진하는 소수성 분자 (H)에 연결된다. 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H)에 연결되는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 임의로 연결된 펩티드 항원 (A)으로 구성된 펩티드 항원 접합체가 분자적으로 규정된 실체이며 펩티드 항원 (A) 대 소수성 분자 (H)의 비는 정확하게 제어될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 그 비는 1:1 펩티드 항원 (A) 대 소수성 분자 (H)이다. 부가의 비제한적 예에서, 그 비는 1:3 내지 3:1 펩티드 항원 (A) 대 소수성 분자 (H)일 수 있다.
미리 형성된 입자와 대조적으로, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A)을 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2) 및/또는 링커 (L)를 통해 간접적으로 화학적으로 규정된 단일 분자를 생산하는 소수성 블록 (H)에 연결함으로써 형성될 수 있다. 소수성 분자 (H)는 실질적으로 제한된 수 용해도를 갖는 분자이거나 또는 특성상 양친매성이며, 수성 조건에서 초분자 구조, 예를 들어, 미셀, 나노입자 또는 마이크로입자로 어셈블리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 수성 조건에서 약 0.1 mg/mL 또는 약 0.01 mg/mL에 이르기까지 불용성이거나 또는 미셀을 형성한다.
소수성 분자 (H)는 고급 알칸, 시클릭 방향족, 지방산, 테르펜/이소프렌으로부터 유래되는 화합물, 또는 제한된 수 용해도를 갖고/가지거나 수성 조건에서 입자로 어셈블리되는 분자를 초래하는 양친매성 특징을 갖는 중합체를 포함하는 임의의 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 고급 알칸은 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸, 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸 및 옥타데칸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 시클릭 방향족은 벤젠 및 융합된 벤젠 고리 구조 또는 헤테로시클릭 방향족 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 포화 및 불포화 지방산은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 또는 올레산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 지방산, 예를 들어 미리스트산이다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 디아실 지질, 예컨대 s1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 리포펩티드, 예를 들어 Pam2Cys를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방산 또는 지질 기반 소수성 분자 (H)는 PEG를 추가로 포함할 수 있다. 테르펜/이소프렌으로부터 유래되는 예시적인 화합물은 스테롤 유도체, 예컨대 콜레스테롤 및 스쿠알렌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 콜레스테롤을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 제한된 수 용해도를 갖는 중합체이거나 또는 양친매성이며 수성 조건에서 입자, 예를 들어 미셀로 어셈블리될 수 있다. 예시적인 중합체는 PLGA, 소수성 폴리(아미노산), 폴리(벤질 글루타메이트), 폴리스티렌, 에틸렌 옥시드 프로필렌 옥시드 단량체에 기반한 폴록사머 및 온도 반응성 중합체, 예컨대 폴리(N,N'-디에틸 아크릴아미드), 폴리(N-n-프로필아크릴아미드), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리[디(에틸렌 글리콜)메타크릴레이트 메틸 에테르] 및 특정 PEG화 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(γ-(2-메톡시에톡시)에스테릴-L-글루타메이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 소수성 아미노산으로 구성된 폴리(아미노산)이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리(아미노산)을 포함하는 소수성 분자 (H)는 방향족 고리를 포함하는 아미노산으로 구성된다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리간드, 예컨대 PRR 효능제에 연결되는 폴리(아미노산)이다. 다른 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 A-B 유형 디-블록 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 디-블록 공중합체는 온도 반응성이고, 온도 변화에 반응하여 입자로 어셈블리될 수 있다. 일부 실시양태에서, A-B 유형 디-블록 공중합체를 포함하는 소수성 분자 (H)는 디-블록 공중합체의 하나의 블록에 연결된 리간드, 예컨대 PRR 효능제를 추가로 포함한다. 펩티드 항원 접합체에 대한 소수성 분자 (H)로서 유용한 중합체는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
중합체
소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 선형 또는 분지된 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 단독중합체, 공중합체 또는 삼원중합체일 수 있다. 중합체는 하나 또는 많은 상이한 유형의 단량체 단위로 구성될 수 있다. 중합체는 통계적 공중합체 또는 교대 공중합체일 수 있다. 중합체는 블록 공중합체, 예컨대 A-B 유형일 수 있거나, 또는 중합체는 그라프트된 공중합체로 구성될 수 있으며, 그에 의해 2개의 중합체는 중합체 유사 반응을 통해 연결된다.
소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 자연적으로 발생하는 단량체 및/또는 비-자연 단량체 및 그의 조합을 포함하는 중합체를 포함할 수 있다. 자연 생체중합체는 아미노산으로 구성된 펩티드 (종종 폴리(아미노산)으로서 지칭됨)를 포함할 수 있고; 구체적인 예는 폴리(트립토판)이다. 자연 생체중합체는 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 글루탐산 또는 리신 잔기로 구성된 생체중합체는 리간드의 부착을 위해 각각 감마 카르복실 또는 엡실론 아미노 기에서 변형될 수 있다. 생체중합체는 폴리사카라이드일 수 있으며, 이는 글리코겐, 셀룰로스 및 덱스트란을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 부가의 예는 알기네이트 및 키토산을 포함한, 천연에서 발생하는 폴리사카라이드를 포함한다. 중합체는 또한, 자연적으로 발생하는 작은 분자, 예컨대 락트산 또는 글리콜산으로 구성될 수 있거나, 또는 그 둘의 공중합체 (즉, PLGA)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 음이온성 (예를 들어, 폴리(산성)) 중합체 또는 양이온성 (예를 들어, 폴리(염기성)) 중합체 또는 음이온성 중합체와 양이온성 중합체의 조합으로 구성된다. 양이온성 중합체는 정전기적 상호작용에 의해 음으로 하전된 펩티드에 결합할 수 있거나 또는 음으로 하전된 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA를 복합체 형성하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 pH 7.4에서 수 불용성 양쪽성 이온이지만 pH 약 6 미만에서 순 양전하를 띠며 수용성이다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체를 포함하는 소수성 분자 (H)는 제2 중합체 상에 음 또는 양전하에 대해 각각 상보적인 양 또는 음전하를 운반하고, 제1 및 제2 중합체는 전하 중화를 통해 정전기적 복합체를 형성하여 이러한 복합체를 불용성으로 만든다. 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 자연적으로 발생하거나 또는 합성인 폴리(아민), 예컨대 폴리(리신) 또는 폴리(에틸렌이민) (PEI)일 수 있다. 부가의 실시양태에서, 양이온성 중합체는 아민과 비스(아크릴아미드) 또는 비스(아크릴에스테르)와의 마이클 부가 반응으로부터 생산된 폴리(아미도 아민) (PAA) 또는 폴리(베타 아미노 에스테르) (PBAE)일 수 있다. 개시된 실시양태에서 사용될 수 있는 양이온성 중합체의 비제한적 예는 폴리(에틸렌이민), 폴리(알릴아니온 히드로클로라이드; PAH), 푸트레신, 카다베린, 폴리(리신) (PL), 폴리(아르기닌), 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리(프로필렌이민), 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-시클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 카다베린, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(히스티딘), 양이온화 젤라틴, 덴드리머, 키토산, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 양이온성 중합체는 메틸화된 키토산 상에 존재하는 것과 같은 4급 암모늄 기를 함유할 수 있다. 또 다른 한편으로는, 중합체는 음이온성 중합체일 수 있다. 일부 비제한적 예에서, 폴리음이온성 중합체는 폴리(글루탐산)이다. 대안적인 실시양태에서, 폴리음이온성 중합체는 폴리(아스파르트산)이다. 중합체는 폴리포스포에스테르-기반 중합체일 수 있다. 중합체는, 예를 들어, 1-4)-연결된 β-D-만누로네이트 및 굴루론산으로 구성된 알기닌산을 포함한, 자연 음이온성 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 중합체는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 폴리음이온성 중합체가 동일하게 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 특정 pH 범위에 걸쳐 수용성 양이온성 중합체이지만, 생리적 pH 7.4 부근의 pH 범위에서는 하전되지 않고 수 불용성이다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 방향족 아민을 포함하는 중합체이며, 여기서 방향족 아민의 공액 산의 pKa는 7.5 미만이다. 방향족 아민의 pKa 미만의 pH에서, 방향족 아민은 양성자화되어 중합체에 양전하를 부여한다. 방향족 아민을 포함하는 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 폴리(페닐알라닌 아민)이다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 질소 헤테로사이클을 포함하는 중합체이며, 여기서 헤테로사이클을 구성하는 질소 원자의 pKa는 7.5 미만이다. 헤테로사이클을 구성하는 질소 원자의 pKa 미만의 pH에서, 질소는 양성자화되고 중합체에 양전하를 부여한다. 양성자화가능한 (즉, 염기성) 질소 원자를 수반한 헤테로사이클을 포함하는 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 폴리(히스티딘)이다. 본원에서, 본 발명자들은 양성자화가능한 질소 (예를 들어, 방향족 아민)를 포함하는 중합체로 구성된 소수성 분자가 제조, 입자 안정성 및 생물학적 활성에 있어서 예상치 못한 개선을 제공한다는 예상치 못한 발견을 보고한다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 폴리(디에틸렌 글리콜 메틸 에테르 메타크릴레이트)-(DEGMA) 기반 중합체일 수 있다. 부가의 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 스티릴 및 비닐 모이어티의 단량체를 포함할 수 있는 중합체이다. 스티릴 기반 및 비닐-기반 단량체 뿐만 아니라 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드의 구체적인 예는 N-2-히드록시프로필(메타크릴아미드) (HPMA), 히드록시에틸(메타크릴레이트) (HEMA), 스티렌 및 비닐피롤리돈 (PVP)을 각각 포함한다. 중합체는 N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm); N-이소프로필메타크릴아미드 (NIPMAm); N,N'-디에틸아크릴아미드 (DEAAm); N-(L)-(1-히드록시메틸)프로필 메타크릴아미드 (HMPMAm); N,N'-디메틸에틸메타크릴레이트 (DMEMA), 2-(2-메톡시에톡시)에틸 메타크릴레이트 (DEGMA)의 단량체로 구성된 열 반응성 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 HPMA, 또는 HPMA DEGMA 단량체를 포함하는 중합체이다. 일부 실시양태에서, HPMA 및 DEGMA 단량체를 포함하는 중합체는 A-B 유형 디-블록 중합체이다. 본원에 보고된 예상치 못한 발견은 HPMA 친수성 블록을 포함하는 A-B 유형 디-블록 공중합체에 연결된 펩티드 항원 (A)이, 펩티드 항원 (A) 조성과 독립적으로 균일한 크기의 나노입자 미셀로 어셈블리된다는 것이다.
소수성 분자 (H)는 또한, 시클릭 우레탄, 시클릭 에테르, 시클릭 아미드, 시클릭 에스테르, 시클릭 무수물, 시클릭 술피드 및 시클릭 아민을 포함하는 시클릭 단량체에 기반한 중합체를 포함할 수 있다.
시클릭 단량체를 포함하는 중합체에 기반한 소수성 분자 (H)는 개환 중합에 의해 생산될 수 있으며, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리카르보네이트, 폴리아미드, 폴리우레탄 및 폴리포스페이트를 포함하고; 구체적인 예는 폴리카프로락톤 및 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 중합체는 또한, 축합 반응을 통해 생산될 수 있으며, 폴리아미드, 폴리아세탈 및 폴리에스테르를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 3 내지 10,000개 단량체 단위를 포함할 수 있는 중합체이다. 바람직한 실시양태에서, 중합체는 약 3 내지 300개 단량체 단위, 예컨대 3 내지 10개, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 단량체 단위; 또는 약 10 내지 100개 단량체 단위, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개; 또는 약 100 내지 200개 단량체 단위; 또는 약 200 내지 300개 단량체 단위, 전형적으로 1,000개 이하의 단량체 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 1,000 내지 10,000개 이하의 단량체 단위를 포함할 수 있다. 전형적으로, 펩티드 항원 접합체의 입자 형성을 촉진하기에 충분한 크기의 소수성 분자 (H)를 형성하기 위해서는 적어도 5개의 단량체가 필요하지만, 예상치 못하게도, 방향족 고리를 포함하는 3개 이하의 단량체를 갖는 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)가 펩티드 항원 접합체의 입자 어셈블리를 구동하기에 충분하였다. 3개에서 5개 단량체 및 5개에서 10개 단량체로 중합체의 길이를 증가시키면, 입자 형성을 촉진시키는 힘의 강도가 증가되어, 펩티드 항원 접합체에 의해 보다 안정적이고 더 큰 크기의 입자가 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체를 구성하는 소수성 분자 (H)는 5 내지 100개의 단량체로 구성된 중합체이며, 이는 수성 조건에서 대략 10 내지 300 nm 직경의 입자를 형성한다. 부가의 실시양태에서, 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체는 약 300개의 단량체로 구성되며, 약 20 내지 500 nm, 또는 약 100 내지 500 nm의 입자로 어셈블리되는 펩티드 항원 접합체가 생성된다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체의 평균 분자량은 약 1,000 내지 1,000,000 g/mol일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 중합체의 평균 분자량은 약 1,000 내지 60,000 g/mol이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체 분자량은 약 1,000 내지 5,000, 또는 약 5,000 내지 10,000, 또는 약 10,000 내지 20,000, 또는 약 20,000 내지 30,000, 또는 약 25,000 내지 60,000이다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 약 10,000 g/mol 내지 약 60,000 g/mol, 예컨대 약 10,000 g/mol, 20,000 g/mol, 30,000 g/mol, 40,000 g/mol, 50,000 g/mol 또는 60,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는 A-B 유형 디-블록 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 A-B 유형 디-블록 중합체이며, 여기서 A 블록 및 B 블록의 분자량의 비는 약 1:5 내지 약 5:1이다. 비제한적 예에서, 평균 분자량이 약 60,000 g/mol인 A-B 유형 디-블록 중합체는 평균 분자량이 약 10,000 g/mol인 A 블록 및 평균 분자량이 약 50,000 g/mol인 B 블록; 평균 분자량이 약 20,000 g/mol인 A 블록 및 평균 분자량이 약 40,000 g/mol인 B 블록; 평균 분자량이 약 30,000 g/mol인 A 블록 및 평균 분자량이 약 30,000 g/mol인 B 블록; 평균 분자량이 약 40,000 g/mol인 A 블록 및 평균 분자량이 약 20,000 g/mol인 B 블록; 평균 분자량이 약 50,000 g/mol인 A 블록 및 평균 분자량이 약 10,000 g/mol인 B 블록으로 구성된다.
중합체의 다분산도 Mw/Mn은 약 1.0 내지 약 5.0의 범위일 수 있다. 중합체는 각종 중합 기술에 의해 형성될 수 있다. 펩티드 및 뉴클레오티드-기반 중합체는 고체 상 합성에 의해 제조될 수 있고, 중합체가 분자적으로 규정됨에 따라 1.0의 다분산도를 가질 것이다. 연쇄 성장 중합에 의해 형성된 중합체는 다분산도 > 1.0을 가질 것이다. 중합체는 리빙 중합 기술 또는 용액 자유 라디칼 중합에 의해 합성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 기반 생체중합체는 고체 상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 수성 조건에서 소수성이긴 하지만, 방향족 고리를 수반한 아미노산, 예컨대 트립토판을 포함하는 펩티드 (또는 "폴리(아미노산)") 기반 중합체는, 방향족 고리를 수반하지 않은 펩티드 (또는 "폴리(아미노산)")과 비교 시 고체 상 합성에 의한 제조에 있어서 예상치 못한 개선을 제공하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 고체 상 합성에 의해 생산된 펩티드에 기반한 소수성 분자 (H)는 방향족 고리를 포함하는 아미노산을 포함한다. 부가의 실시양태에서, 아크릴아미드- 및 아크릴레이트-기반 중합체는 가역적 부가-단편화 쇄 전달 (RAFT) 중합에 의해 합성된다. 부가의 실시양태에서, 폴리(아미노산) 및 폴리(포스포에스테르)는 개환 중합에 의해 합성된다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리간드(들), 예컨대 PRR 효능제를 추가로 포함하는 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)는 리간드에 커플링될 수 있거나, 또는 리간드에 커플링될 수 있는 링커에 커플링될 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 단량체를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)는 중합체의 말단 및/또는 측쇄에 연결되는 리간드를 포함할 수 있다.
암 및 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 바람직한 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리간드에 연결되는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)에 연결되는 리간드는 방향족 고리 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체에 연결된 리간드는 소수성이며 수성 조건에서 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 증가된 안정성을 촉진시킨다. 다른 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)에 연결되는 리간드는 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)에 연결되는 리간드는 아릴 아민을 추가로 포함하는 방향족 고리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)에 부착된 리간드는 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는 소수성 리간드이며, 임의로 여기서 소수성 리간드는 방향족 아민 (즉, Ar-NH2)을 추가로 포함한다. 소수성 분자 (H)가 헤테로사이클 및/또는 아릴 아민을 임의로 포함하는 방향족 기를 포함하는 리간드를 포함하는 실시양태에서, 본 발명자들은 이러한 소수성 분자 (H)가 제약상 허용되는 유기 용매, 예컨대 DMSO 및 에탄올에서는 고도로 가용성이지만, 수성 완충제에서는 불용성이라는 예상치 못한 발견을 보고하였다.
일부 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)에 연결된 리간드는 아주반트 특성을 갖는 패턴 인식 수용체 효능제 (PRRa), 예컨대 STING, NOD 수용체 또는 TLR의 효능제이다. 중합체에 연결된 아주반트 특성을 갖는 리간드는 임의의 적합한 아주반트 화합물, 예컨대 PRR 효능제일 수 있거나, 또는 이로부터 유래될 수 있다. 아주반트 특성을 갖는 적합한 리간드는 작은 유기 분자, 즉 약 3,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자를 포함하는 화합물을 포함하지만, 일부 실시양태에서 아주반트는 약 700 달톤 미만의 분자량을 가질 수 있으며, 일부 경우에 아주반트는 약 200 달톤 내지 약 700 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 사용되는 면역원성 조성물의 바람직한 실시양태에서의 소수성 분자 (H)는 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결된 중합체이다. 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예컨대 PRR 효능제는 임의의 적합한 링커를 통해 중합체의 측쇄 또는 말단 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체-기반 소수성 분자 (H)를 구성하는 단량체는 아주반트 특성을 갖는 리간드에 커플링될 수 있거나, 또는 아주반트 특성을 갖는 리간드에 커플링될 수 있는 링커에 커플링될 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 측쇄를 포함한다. 중합체-기반 소수성 분자 (H)가 아주반트 특성을 갖는 리간드를 포함하는 일부 실시양태에서, 중합체의 모든 단량체는 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결된다. 소수성 분자 (H)가 아주반트 특성을 갖는 리간드를 포함하는 다른 실시양태에서, 중합체 중의 모든 단량체가 아주반트에 연결되는 것은 아니다.
소수성 분자 (H)가 중합체의 주쇄를 따라 분포된 단량체 단위를 통해 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결된 중합체를 포함하는 일부 실시양태에서, 중합체 상의 리간드의 밀도를 증가시키면 펩티드 항원 (A)에 대한 면역 반응에 있어서 예상치 못한 개선이 초래된다.
특정 실시양태에서, 중합체의 단량체에 대한 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예컨대 PRR 효능제의 몰 비는 약 1:100 내지 1:1 mol/mol (또는 약 1 mol% 내지 약 100 mol%), 예컨대 1:2.5 내지 1:1 mol/mol로부터 선택될 수 있다.
중합체에 연결된, 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예컨대 PRR 효능제의 밀도는 특별한 적용을 위해 필요에 따라 다양할 수 있다. 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예컨대 PRR 효능제는 중합체 1 내지 100 mol%, 예컨대 1 내지 10 mol% 또는 50 내지 100 mol%에 연결될 수 있다. mol%는 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예컨대 PRR 효능제에 연결되는 중합체를 구성하는 단량체의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 10 mol% 리간드 (예를 들어, PRR 효능제)는 총 100개 단량체 단위 중에서 리간드에 연결된 10개 단량체 단위와 동일하다. 나머지 90개는 리간드에 연결되지 않은 거대 분자 형성 단량체 단위일 수 있다.
중합체-기반 소수성 분자 (H)에 연결된 리간드, 예컨대 아주반트 특성을 갖는 리간드의 밀도는 펩티드 항원 접합체가 (i) 제약상 허용되는 유기 용매, 예컨대 DMSO에서 가용성이 되도록 선택되어야 하고/하거나; (ii) 생리적 온도 및 pH 하에 수성 조건에서 안정한 나노입자를 형성할 수 있도록 선택되어야 하고/하거나; (iii) 대상체에서 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 유도할 수 있도록 선택되어야 한다.
중합체에 연결된 리간드, 예컨대 PRR 효능제의 최적 밀도는 리간드의 조성 뿐만 아니라 중합체 조성, 중합체 길이에 의존한다. 리간드가 수 용해도가 낮은 소수성 / 양친매성 분자, 예컨대 이미다조퀴놀린-기반 톨-유사 수용체-7 및 -8 효능제 (TLR-7/8a)이고 중합체 단독이 수용성인 경우 (즉, 리간드에 연결되지 않은 중합체가 수용성임), 이러한 리간드는 전형적으로, 중합체가 약 5 내지 30개 단량체 단위로 구성될 때 약 20 내지 100 mol%의 밀도로 중합체에 연결되거나; 중합체가 30 내지 100개 단량체 단위로 구성될 때 10 내지 50 mol%의 밀도로 중합체에 연결되거나; 또는 중합체가 100 내지 300개 단량체 단위로 구성될 때 5 내지 20 mol%의 밀도로 중합체에 연결된다. 일반적으로, 아주반트 특성을 갖는 리간드의 mol%는 더 짧은 중합체에 대해 더 높고 더 긴 중합체에 대해 더 낮다.
10,000 g/mol 초과이고 N-2-히드록시프로필(메타크릴아미드) (HPMA), 히드록시에틸(메타크릴레이트) (HEMA), 스티렌, 비닐피롤리돈 (PVP), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm); N-이소프로필메타크릴아미드 (NIPMAm); N,N'-디에틸아크릴아미드 (DEAAm); N-(L)-(1-히드록시메틸)프로필 메타크릴아미드 (HMPMAm); N,N'-디메틸에틸메타크릴레이트 (DMEMA), 2-(2-메톡시에톡시)에틸 메타크릴레이트 (DEGMA) 또는 치환된 폴리(포스포에스테르)로부터 선택된 공단량체에 기반한 친수성 또는 온도 반응성 중합체에 부착된, 아주반트 특성을 갖는 리간드, 예를 들어 PRRa의 최적 밀도는 1 내지 25%이고, 예를 들어, 중합체에 부착된 아주반트의 밀도는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24% 또는 약 25%일 수 있다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 양친매성 A-B 유형 디-블록 공중합체이며, 여기서 하나의 블록은 소수성이고 다른 블록은 친수성이다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)가 양친매성 A-B 유형 디-블록 공중합체이고 리간드가 소수성, 예컨대 이미다조퀴놀린 TLR-7/8 효능제인 경우, 리간드는 바람직하게, 약 1 내지 50 mol%, 전형적으로 약 1 내지 20 mol%의 밀도로 소수성 블록에 연결된다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)가 양친매성 A-B 유형 디-블록 공중합체이고 리간드가 친수성인 경우, 리간드는 바람직하게, 약 1 내지 20 mol%의 밀도로, 또는 친수성 블록의 친수성 말단에서 친수성 블록에 연결되므로, A-B 유형 디-블록 공중합체는 리간드에 대해서 세미-텔레켈릭이다. 비제한적 예에서, 소수성 분자 (H)는 HPMA 블록 및 DEGMA 블록을 포함하는 온도-반응성 A-B 유형 디-블록 공중합체를 포함하고, 이미다조퀴놀린 TLR-7/8 효능제는 약 1 내지 5 mol%의 밀도로 DEGMA 블록에 연결된다. 부가의 비제한적 예에서, 소수성 분자 (H)는 HPMA 공중합체 소수성 블록 및 HPMA 단독중합체 친수성 블록을 포함하는 A-B 유형 디-블록 중합체를 포함하고, 이미다조퀴놀린 TLR-7/8 효능제는 약 20 mol%의 밀도로 HPMA 공중합체 소수성 블록에 연결된다. 일부 실시양태에서, 소수성 분자는 트리-블록 공중합체, 예를 들어, A-B-A 또는 다른 멀티-블록 공중합체 조성물이다.
본원에 보고된 예상치 못한 발견은 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결된 HPMA 친수성 블록을 포함하는 A-B 유형 디-블록 공중합체에 연결된 펩티드 항원 (A)이 펩티드 항원 (A) 조성과 독립적으로 균일한 크기의 나노입자 미셀로 어셈블리되고, 이러한 나노입자 미셀 형성의 개선된 신뢰도는 T 세포 면역의 증가된 규모와 연관이 있었다. 비제한적 예에서, 펩티드 항원 (A)은 트리아졸 링커 (Lys(N3)-DBCO)를 통해 HPMA 공중합체 소수성 블록 (즉, p[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]) 및 HPMA 단독중합체 친수성 블록 (즉, p(HPMA))로 구성된 디-블록 공중합체에 연결되어, 펩티드 항원 접합체 p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A를 형성하며, 여기서 2B는 화합물 1로서 지칭되기도 하는 TLR-7/8a이다. 부가의 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 트리아졸 링커 (Lys(N3)-DBCO)를 통해 DEGMA 공중합체 소수성 블록 (즉, p[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]) 및 HPMA 단독중합체 친수성 블록 (즉, p(HPMA))로 구성된 디-블록 공중합체에 연결되어, 펩티드 항원 접합체 p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A를 형성하며, 여기서 2B는 화합물 1로서 지칭되기도 하는 TLR-7/8a이다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 트리아졸 링커 (Lys(N3)-DBCO)를 통해 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결된 DEGMA 단독중합체 (즉, 2BXy-p(DEGMA)) 및 HPMA 단독중합체 친수성 블록 (즉, p(HPMA))으로 구성된 디-블록 공중합체에 연결되어 펩티드 항원 접합체 2BXy-p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A를 형성하며, 여기서 펩티드 항원 (A) 및 2BXy (화합물 2로서 지칭되기도 하는 TLR-7/8a)는 중합체의 반대쪽 말단 상의 단일 부위에서 연결되어, 중합체를 헤테로-텔레켈릭으로 만든다.
여러 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 글루탐산 또는 아스파르트산 및 방향족 및/또는 소수성 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 아미노 페닐알라닌아민 (또는 "페닐알라닌아민"), 트립토판, 티로신, 벤질 글루타메이트, 히스티딘, 류신, 이소류신, 노르류신 및 발린의 공단량체로 구성되는 폴리(아미노산)-기반 중합체이고, 아주반트 특성을 갖는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, PRRa는 글루탐산의 감마 카르복실산 또는 아스파르트산의 베타 카르복실산을 통해 중합체에 부착된다. 바람직한 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 글루탐산 및 트립토판의 공단량체로 구성된 폴리(아미노산)-기반 중합체이고, 여기서 아주반트 특성을 갖는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, PRRa는 감마 카르복실산을 통해 글루탐산 잔기에 연결된다. 부가의 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리신 및 방향족 및/또는 소수성 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 아미노 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 벤질 글루타메이트, 류신, 이소류신, 노르류신 및 발린의 공단량체로 구성된 폴리(아미노산)-기반 중합체이며, 여기서 아주반트 특성을 갖는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, PRRa는 리신의 엡실론 아민을 통해 중합체에 부착된다. 바람직한 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리신 및 트립토판의 공단량체로 구성된 폴리(아미노산)-기반 중합체이며, 여기서 아주반트 특성을 갖는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, PRRa는 엡실론 아민을 통해 리신에 연결된다. 소수성 분자 (H)가 아주반트 특성을 갖는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, PRRa에 연결된 폴리(아미노산) 공중합체인 바람직한 실시양태에서, 중합체는 5 내지 30개의 아미노산 길이이고, 아주반트는 20 내지 100 mol%, 예컨대 30%, 50%, 60%, 80% 및 100 mol%의 밀도로 부착된다. 부가의 실시양태에서, 리간드는 폴리(아미노산) 중합체의 단일 말단, 즉 세미-텔레켈릭 중합체에만 부착된다. 본원에서, 본 발명자들은 방향족 기, 예컨대 방향족 아미노산 (예를 들어, 페닐알라닌, 아미노 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 벤질 글루타메이트) 또는 중합체에 연결된 방향족 리간드 (예를 들어, 이미다조퀴놀린)를 추가로 포함하는 폴리(아미노산)-기반 공중합체로 구성된 소수성 분자 (H)가, 주로 지방족 아미노산 또는 지방족 리간드로 구성된 폴리(아미노산)과 비교 시, 개선된 유기 용매 용해도, 및 펩티드 항원 접합체의 개선된 입자 안정성과 생물학적 활성을 통해, 제조 능력에 있어서의 예상치 못한 개선을 초래한다는 예상치 못한 발견을 보고하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 폴리(아미노산), 또는 다른 부류의 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)는 하나 이상의 방향족 아미노산 및/또는 방향족 기를 포함하는 리간드를 포함한다.
부가의 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 전적으로 글루탐산, 아스파르트산, 또는 카르복실산을 보유하는 비-자연 아미노산 잔기로 구성된 폴리(아미노산)-기반 중합체이며, 여기서 아주반트 특성을 갖는 리간드는 글루탐산, 아스파르트산 또는 비-자연 아미노산 잔기 모두에 연결되는데, 즉 아주반트 특성을 갖는 리간드는 100 mol%의 밀도로 부착된다. 부가의 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 전적으로 리신, 또는 유리 아민을 보유하는 비-자연 아미노산으로 구성된 폴리(아미노산)-기반 중합체이고, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 상기 리신 또는 비-자연 아미노산 잔기 모두에 연결되는데, 즉 아주반트는 100 mol%의 밀도로 부착된다. 부가의 실시양태에서, PEG화된 공단량체, 예컨대 γ-(2-메톡시에톡시)에스테릴-L-글루타메이트)는 공중합체에 온도 반응성 특성을 부여하기 위해 포함된다. 다른 실시양태에서, 온도-반응성 중합체는 폴리(아미노산)의 펜던트 측쇄에 그라프트되어 그라프트 공중합체를 형성할 수 있다. 부가의 실시양태에서, 온도-반응성 중합체는 폴리(아미노산) 중합체의 말단에 연결되어 온도-반응성 디-블록 중합체를 형성할 수 있다. 또한 부가의 실시양태에서, 소수성인 제2 중합체는 그라프트 공중합체를 형성하기 위해 펜던트 측기를 통해 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결되거나 또는 디-블록 공중합체를 형성하기 위해 폴리(아미노산)의 말단에 연결되는 폴리(아미노산) 중합체에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 리간드, 예컨대 아주반트 특성을 갖는 소수성 리간드에 연결된 폴리(아미노산)-기반 중합체이고, 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00005
화학식 I에서, R2는 전형적으로, 수소, 히드록실 또는 아민 중 하나로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R2는 임의의 적합한 링커 분자를 통해 리간드 또는 또 다른 중합체에 연결된다. 메틸렌 단위의 수, y3은 전형적으로 1 내지 6, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단 아민은 전형적으로, 링커 전구체 X2에 연결되거나 또는 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 연결될 수 있다. 단량체 반복의 수는 k로서 표시되며, 전형적으로 3 내지 300이다. 임의의 적합한 링커 X는 리간드, 예컨대 아주반트 특성을 갖는 소수성 리간드를 폴리(아미노산) 주쇄에 연결하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 리간드에 연결되는 제2 중합체에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단량체 k는 2개 이상의 상이한 리간드에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 하기이다:
Figure pct00006
여기서 y4는 임의의 정수, 예컨대 0 내지 6, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 리간드는 임의의 적합한 수단을 통해 관능기 (FG)에 연결될 수 있고, FG는 직접적으로 또는 링커를 통해 리간드의 부착, 즉 연결을 위한 아민, 카르복실산, 티올, 히드록실, 아지드, 알킨, 히드라진, 알데히드 또는 케톤을 포함한 임의의 적합한 관능기이다.
y3이 1인 경우, 화학식 I의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 하기이다:
Figure pct00007
화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통하여 펩티드 항원 (A)에 링커 (L)를 통해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되거나 또는 아미드 결합을 통해 B2 연장부의 C-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 링커 전구체 (X1)와 반응하는 링커 전구체 (X2)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 시클로옥틴 (예를 들어, DBCO) 함유 링커 전구체 (X2)는 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단에 부착되고 아지도 함유 링커 전구체 (X1)와 반응하여 트리아졸 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, 폴리(아미노산)-기반 소수성 분자 (H)는 유기 용매에서의 제조 동안 바람직하게 가용성이지만, 수성 조건에서 입자를 형성할 수 있는 물질을 생산하기 위해 소수성 분자 (H)의 물리적 및 화학적 특징을 보상하거나 또는 조정하는데 유용한, 소수성 아미노산 (예를 들어, 방향족 아미노산), 또는 소수성 아미노산 (예를 들어, 방향족 아미노산) 및 리간드에 결합된 아미노산 뿐만 아니라 부가의 아미노산, 예컨대 하전된 또는 친수성 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 하기 화학식을 갖는 폴리(아미노산)-기반 중합체이다:
Figure pct00008
화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 전형적으로, 단량체 l, 및 임의적 단량체 m, n 및 o를 포함한다. R3은 전형적으로, 수소, 히드록실 또는 아민 중 하나로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R3은 임의의 적합한 링커 분자를 통해 소수성 분자 (H)에 연결되는 리간드, 예컨대 아주반트 특성을 갖는 리간드, 또는 또 다른 중합체이다. y5, y6, y7, 및 y8로서 표시된 메틸렌 단위의 수는 전형적으로 1 내지 6, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단 아민은 전형적으로, 링커 전구체 X2에 연결되거나, 또는 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 연결될 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 임의의 자연 또는 비-자연 아미노산으로부터 선택된 단량체 l을 포함하며, 여기서 R4는 저급 알킬 또는 방향족 기로부터 선택되고, 중합체 주쇄에 소수성 특성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 화학식 II 내에 포함된 R4는 하기로부터 선택될 수 있고,
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
여기서 R4의 X는 임의의 적합한 링커이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 임의적 공단량체 m을 포함하며, 이는 임의의 자연 또는 비-자연 아미노산, 예컨대 PEG 아미노산 스페이서 (예를 들어, 화학식 II의 m은 -NH-(CH2-CH2-0)y9-(CH2)y10-(CO)-이며, y9는 전형적으로 1 내지 24의 정수이고, y10은 전형적으로 1 내지 3의 정수임) 또는 작은 치환기를 갖는 아미노산로부터 선택되고, 여기서 예를 들어, R5는 수소, 저급 알킬 또는 히드록실을 포함하는 저급 알킬로부터 선택되고 중합체 주쇄의 간격 또는 유연성을 증가시키기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II에 포함된 R5는 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 임의적 공단량체 n을 포함하고, 이는 임의의 자연 또는 비-자연 아미노산으로부터 선택되며, 여기서 R6은 영구적으로 또는 특이적 pH에서 전하를 운반하는 관능기를 포함하는 임의의 기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II에 포함된 R6은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00013
일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 임의적 공단량체 o를 포함하며, 이는 임의의 자연 또는 비-자연 아미노산으로부터 선택되고, 여기서 리간드는 임의의 적합한 링커 X를 통해 단량체 o에 연결된다. 리간드는 아주반트 특성을 갖는 리간드일 수 있다. 화학식 II의 폴리(아미노산)에 연결된 리간드는 특성 상 소수성, 친수성, 양친매성, 하전된 또는 중성일 수 있다. 단량체 o를 포함하는 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 단량체 o에 부착된 리간드의 특성을 보상해 주는 단량체 단위 l, m 및 n을 추가로 포함할 수 있다.
화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체에서, 단량체 반복의 수는 l, m, n 및 o로서 표시되며, 여기서 l, m, n 및 o의 합은 전형적으로, 3 내지 300의 임의의 정수이다. 각각의 상이한 유형의 단량체 l, m, n 또는 o는 동일하거나 상이할 수 있다. "l"로서 표시된 단량체는 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체에 소수성 특성을 부여하는데, 즉 중합체를 수 불용성 소수성 분자 (H)로 만든다. 소수성 단량체 l은 동일하거나 상이할 수 있고, 전형적으로 방향족 고리를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 소수성 단량체 l은 헤테로시클릭 및/또는 아민-치환된 방향족 고리를 포함한다. "m"으로서 표시된 임의적 공단량체는 중합체 주쇄를 구성하는 상이한 단량체의 유연성 또는 간격을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. "n"으로서 표시된 임의적 공단량체는 하전된 관능기를 포함한다. "o"로서 표시된 임의적 공단량체는 리간드, 예컨대 PRR 효능제의 부착을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 링커를 통해 단량체 o에 부착된 리간드는 PRR 효능제이다. 일부 실시양태에서, 단량체 o는 양전하 또는 음전하를 운반하는 리간드에 연결되고, 반대 전하의 단량체 n에 인접해 있다. 일부 실시양태에서, 하전된 공단량체 n은 이러한 공단량체 n을 구성하는 관능기의 반대 전하의 관능기를 포함하는 공단량체 o에 인접하게 배치되며, 반대 전하는 제로 순 전하를 초래하므로, 단량체 n은 단량체 o에 부착된 리간드에 의해 운반되는 전하를 중화시키는 기능을 한다.
화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체를 구성하는 단량체 l, m, n 및 o의 백분율은 특이적 적용에 의존한다. 일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 전적으로 단량체 l로 구성된다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 공단량체 l 및 o, 예컨대 5 내지 95 mol% 단량체 l 및 약 95 내지 5 mol% 단량체 o로 구성된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 공 단량체 l 및 m을 포함하고, 여기서 m은 소수성 단량체 l 사이에 공간, 즉 거리를 제공하고 중합체 강성을 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 단량체 l, m 및 o를 포함하고, 여기서 단량체 m은 단량체 l 및 o를 구성하는 벌키 치환기 사이에 공간을 제공한다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 단량체 l 및 o, 및 임의로 단량체 m 및 n을 포함하고, 여기서 단량체 n은 중합체 주쇄의 전하를 조정하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 전적으로 단량체 m 및 o로 구성된다. 다른 실시양태에서 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 전적으로 단량체 m, n 및 o로 구성되거나, 또는 오직 n 및 o로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 단량체 l, m, n 및 o를 포함한다.
화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체가 아주반트를 포함하는 경우, 임의의 적합한 링커를 통해 아주반트에 연결되는, 단량체 o로서 나타낸 중합체를 구성하는 단량체의 백분율은 전형적으로 10 내지 60%이며, 예를 들어, 20개 아미노산 길이의 중합체의 2 내지 12개의 아미노산이 단량체 o이다. 화학식 II의 폴리(아미노산) 중합체의 일부 실시양태에서, l이 대부분의 단량체 단위이다. 부가의 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체는 전적으로 l 단량체로 구성되는데, 즉 모든 단량체가 l 단량체이며, 임의로 여기서 아주반트는 폴리(아미노산)의 말단에 직접적으로 또는 제2 중합체를 통해 또는 임의의 적합한 링커 분자를 통해 간접적으로 부착된다.
화학식 II의 중합체가 o 단량체를 포함하는 공중합체인 경우, 리간드는 하기에 나타낸 바와 같이 중합체의 주쇄를 따라 분포된 펜던트 관능기 (FG)에 연결될 수 있다:
Figure pct00014
여기서 y11은 메틸렌 단위의 수를 표시하고 임의의 정수, 예컨대 0 내지 6, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 관능기 (FG)는 직접적으로 또는 링커를 통해, 리간드의 부착, 즉 연결을 허용해 주는, 아민, 카르복실산, 티올, 히드록실, 아지드, 알킨, 히드라진, 알데히드 또는 케톤을 포함한 임의의 적합한 관능기이다.
일부 실시양태에서, y5, y6, y7 및 y8은 1이고, 화학식 II의 중합체는 하기이다:
Figure pct00015
아주반트 특성을 갖는 리간드는 본 개시내용의 소수성 분자 (H) 중 임의의 것에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 화학식 II의 중합체에 연결된다. 아주반트 특성을 갖는 리간드는 o 단량체 상의 펜던트 관능기 (FG)를 통해; 중합체의 말단에서; 또는 펜던트 관능기 (FG)와 그라프트되거나 또는 중합체의 말단에서 그라프트되는 또 다른 분자 또는 중합체를 통해 간접적으로, 화학식 II의 폴리(아미노산)-기반 중합체에 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단량체 o의 관능기 (FG)는 아주반트 특성을 갖는 리간드, 또는 다른 리간드 분자를 공유 결합을 통해 폴리(아미노산) 주쇄에 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 화학식 II의 단량체 o를 구성하는 FG는 제2 중합체에 연결될 수 있다. 화학식 II에 포함된 FG는 카르복실산, 알데히드, 케톤, 아민, 히드라진, 티올, 아지드 또는 알킨, 또는 리간드 또는 또 다른 중합체를 중합체 주쇄에 연결시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 적합한 관능기로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 링커 전구체 X1과 X2의 반응을 통하여 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 또는 직접적으로, 펩티드 항원 (A)에 링커 (L)를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 직접적으로 (즉, 링커 (L)가 존재하지 않음) 연결되거나, 또는 아미드 결합을 통해 B2 연장부의 C-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 아지도 함유 링커 전구체 (X1)와 반응하는 시클로옥틴 (DBCO) 함유 링커 전구체 (X2)에 연결된다.
화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)은 N-말단 아민, C-말단 카르복실산을 통해 또는 임의적 측쇄를 통해, 예를 들어, 공단량체의 관능기를 통해, 직접적으로 또는 링커 (L) 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결될 수 있는 소수성 분자 (H)이다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)은 펩티드 항원 (A)에 연결되는 소수성 분자 (H)로, 이로써 화학식 [C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H, 또는 [B1]-A-[B2]-[L]-H(C)의 펩티드 항원 접합체가 생성되며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)은 하전된 분자 (C)에 연결되는 N-말단 연장부 (B1)에 N-말단에서 연결되는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 C-말단 연장부 (B2)에 연결되는 링커 (L)에 N-말단에서 연결되는 소수성 분자 (H)이다.
예를 들어: C-B1-A-B2-T-H
부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 직접적으로 연결될 수 있거나, 또는 연장부를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 링커 (L)를 통해 연결될 수 있다. 여기서 A-B2-L(C)-H의 경우, 괄호 표기법은 L이 C와 H 둘 다에 연결된다는 것을 표시한다.
예를 들어: A-B2-L(C)-H 또는 A-B2-L-H(C)
추가 실시양태에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)은 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 C-말단 연장부 (B2)와 임의적 하전된 분자 (C) 둘 다에 연결되는 링커 (L)에 N-말단에서 연결되는 소수성 분자 (H)이다.
예를 들어: A-B2-(C-L)-H
바람직한 실시양태에서, 소수성 블록은 폴리(아미노산)을 포함하며, 여기서 아주반트 특성을 갖는 리간드는 폴리(아미노산)의 주쇄를 따라 분포된 측기에 부착된다. 아주반트 특성을 갖는 리간드는 특성 상 소수성 또는 친수성, 하전된 또는 비-하전된 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 PRR 효능제이다.
여러 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 패턴 인식 수용체 (PRR) 효능제일 수 있다. 패턴 인식 수용체 (PRR) 효능제의 비제한적 예는 TLR-1/2/6 효능제 (예를 들어, 리포펩티드 및 당지질, 예컨대 Pam2cys 또는 Pam3cys 리포펩티드); TLR-3 효능제 (예를 들어, dsRNA, 예컨대 폴리I:C, 및 뉴클레오티드 염기 유사체); TLR-4 효능제 (예를 들어, 리포폴리사카라이드 (LPS) 유도체, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 작은 분자는 피리미도인돌의 유도체 또는 유사체임); TLR5 효능제 (예를 들어, 플라젤린); TLR-7 & -8 효능제 (예를 들어, ssRNA, 및 이미다조퀴놀린, 히드록시-아데닌, 벤조나프티리딘 및 록소리빈의 유도체를 포함한 뉴클레오티드 염기 유사체); 및 TLR-9 효능제 (예를 들어, 비-메틸화된 CpG); 인터페론 유전자 자극인자 (STING) 효능제 (예를 들어, 시클릭 디뉴클레오티드, 예컨대 시클릭 디아데닐레이트 모노포스페이트); C-유형 렉틴 수용체 (CLR) 효능제 (예컨대, 선형 또는 분지될 수 있는 다양한 모노, 디, 트리 및 중합체성 당, 예를 들어, 만노스, 루이스-X 트리-사카라이드 등); RIG-I-유사 수용체 (RLR) 효능제; 및 NOD-유사 수용체 (NLR) 효능제 (예컨대, 박테리아로부터의 펩티도글리칸 및 구조적 모티프, 예를 들어, 메소-디아미노피멜산 및 뮤라밀 디펩티드); 및 그의 조합을 포함한다. 여러 실시양태에서, 패턴 인식 수용체 효능제는 TLR 효능제, 예컨대 이미다조퀴놀린-기반 TLR-7/8 효능제일 수 있다. 예를 들어, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 FDA에 의해 인간 사용 승인을 받은 이미퀴모드 (R837) 또는 레시퀴모드 (R848)일 수 있다.
여러 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 TLR-7 효능제, TLR-8 효능제 및/또는 TLR-7/8 효능제일 수 있다. 많은 상이한 이미다조퀴놀린 화합물을 포함한 수많은 상기 효능제가 공지되어 있다.
이미다조퀴놀린은 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 이미다조퀴놀린은 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포) 상의 톨-유사 수용체 7 및 8 (TLR-7/TLR-8)에 결합하여 이들 수용체의 자연 리간드, 바이러스 단일 가닥 RNA를 구조적으로 모방함으로써 작용하는 합성 면역조정 약물이다. 이미다조퀴놀린은 융합된 퀴놀린-이미다졸 골격을 포함하는 헤테로시클릭 화합물이다. 그의 유도체, 염 (수화물, 용매화물 및 N-옥시드 포함) 및 프로드러그도 본 개시내용에 의해 고려된다. 특별한 이미다조퀴놀린 화합물은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,518,265; 및 미국 특허 번호 4,689,338 참조). 일부 비제한적 실시양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물은 이미퀴모드가 아니고/아니거나 레시퀴모드가 아니다.
일부 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 이미다조퀴놀린 아민 및 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 예컨대, 예를 들어, 아미드 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미드 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환된 이미다조퀴놀린 에테르, 티오에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 히드록실아민 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 옥심 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 6-, 7-, 8-, 또는 9-아릴, 헤테로아릴, 아릴옥시 또는 아릴알킬렌옥시 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 및 이미다조퀴놀린 디아민; 아미드 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미드 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 에테르, 티오에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 히드록실아민 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 옥심 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 및 테트라히드로이미다조퀴놀린 디아민을 포함하나 이에 제한되지는 않는 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민; 아미드 치환된 이미다조피리딘 아민, 술폰아미드 치환된 이미다조피리딘 아민, 우레아 치환된 이미다조피리딘 아민, 아릴 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 아미도 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 우레아 치환된 이미다조피리딘 에테르, 및 티오에테르 치환된 이미다조피리딘 아민을 포함하나 이에 제한되지는 않는 이미다조피리딘 아민; 1,2-브릿지된 이미다조퀴놀린 아민; 6,7-융합된 시클로알킬이미다조피리딘 아민; 이미다조나프티리딘 아민; 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민; 옥사졸로퀴놀린 아민; 티아졸로퀴놀린 아민; 옥사졸로피리딘 아민; 티아졸로피리딘 아민; 옥사졸로나프티리딘 아민; 티아졸로나프티리딘 아민; 피라졸로피리딘 아민; 피라졸로퀴놀린 아민; 테트라히드로피라졸로퀴놀린 아민; 피라졸로나프티리딘 아민; 테트라히드로피라졸로나프티리딘 아민; 및 피리딘 아민, 퀴놀린 아민, 테트라히드로퀴놀린 아민, 나프티리딘 아민, 또는 테트라히드로나프티리딘 아민과 융합된 IH-이미다조 이량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 5원 질소 함유 헤테로시클릭 고리와 융합된 2-아미노피리딘을 갖는 작은 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 하기 화학식을 갖는 이미다조퀴놀린이다:
Figure pct00016
화학식 III에서, R7은 수소, 임의로 치환된 저급 알킬, 또는 임의로 치환된 저급 에테르 중 하나로부터 선택되고; R8은 임의로 치환된 아릴아민, 또는 임의로 치환된 저급 알킬아민 중 하나로부터 선택된다. R8은 중합체에 연결되는 링커에 대해 임의로 치환될 수 있다. R8이 저급 알킬아민으로부터 선택된 일부 화합물에서, 그 화합물이 아릴아민으로부터 선택된 R8보다 덜 강력하였지만, 반응 품질은 개선되었다는 예상치 못한 발견이 있었다. 따라서, 화학식 III의 중간 정도의 효력 아주반트는 보다 우수한 품질 반응을 유도하였다. 주: 화학식 III의 아주반트(들)는 특정 유형의 리간드이며, 화학식 III의 아주반트 또는 아주반트 특성을 갖는 리간드로서 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 III에 포함된 R7은 수소,
Figure pct00017
로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, R8은
Figure pct00018
로부터 선택될 수 있고, 여기서 e는 메틸렌 단위의 수를 표시하고 1 내지 4의 정수이다.
일부 실시양태에서, R8은
Figure pct00019
일 수 있다.
일부 실시양태에서, R8은
Figure pct00020
일 수 있다.
일부 실시양태에서, R7은
Figure pct00021
일 수 있고, R8은
Figure pct00022
일 수 있다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00023
여기서 k는 3 내지 300이다. 예를 들어, k = 5이면, 펩티드는 화학식 III의 아주반트에 연결된 5개의 아미노산으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)는 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결될 수 있으며, 이는 임의의 적합한 수단을 통해 하전된 분자 (C)에 임의로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되거나, 또는 아미드 결합을 통해 B2 연장부의 C-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 링커 전구체 X2와 반응하는 클릭가능한 링커 전구체 X2, 예를 들어, 알킨 또는 DBCO, 또는 티올-반응성 링커 전구체 X2, 예를 들어, 말레이미드에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, DBCO 링커 전구체 X1은 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 N-말단에 부착되고, 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 아지드 보유 링커 전구체 X2와 반응하는데 사용된다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00024
예를 들어:
Figure pct00025
여기서 공단량체 l은 전형적으로 정수 3 내지 300이고, 임의적 공단량체 o는 전형적으로 정수 3 내지 300개의 아미노산 잔기이며, l과 o의 합은 전형적으로 약 3 내지 300이다. 또 다른 한편으로는, o는 0이고 중합체는 전적으로 l로 구성되는데, 즉 중합체는 아주반트에 연결되지 않는 폴리(트립토판) 중합체이다. 일부 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통해 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되거나, 또는 아미드 결합을 통해 B2 연장부의 C-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단은 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되는 링커 전구체 X1과 반응하는 클릭가능한 링커 전구체 X2, 예를 들어, DBCO, 또는 티올-반응성 링커 전구체 X2, 예를 들어, 말레이미드에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, DBCO 링커 전구체 X2는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)의 N-말단에 부착되고, 아지드 관능기를 보유하는 링커 전구체 X1과 반응하는데 사용된다.
본원에 개시된 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체의 소수성 분자 (H)를 포함하는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)의 길이, 즉 단량체 단위의 수가, 펩티드 항원 (A)에 대항하여 생성된 T 세포 반응의 규모에 영향을 미치는 주요 결정 요인이라는 것이다. 따라서, 5개 이상의 단량체 단위를 갖는 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)로 구성된 펩티드 항원 접합체는 5개 미만의 아미노산 길이인 동일한 화학식의 폴리(아미노산)과 비교 시 T 세포 반응의 더 높은 품질 및 규모를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 부가의 발견은 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)에 연결된 화학식 III의 아주반트의 수가 또한, 생성된 면역 반응의 규모에 영향을 미쳤다는 것인데, 화학식 III의 3개 이상의 아주반트를 포함하는 화학식 I 또는 II의 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체가, 화학식 III의 3개 미만의 아주반트를 포함하는 화학식 I 또는 II의 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체와의 비교 시 더 높은 규모의 T 세포 반응을 초래하였다. 이들 발견에 대한 비제한적인 설명은 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 소수성 분자 (H)의 증가된 길이가, 심지어 친수성 펩티드 항원에 연결될 때 미셀 또는 다른 초분자 구조의 형성을 보장한다는 것과, 이러한 입자 형성으로 인해, 가능하게는 입자에 기인하지만 가용성 물질에는 기인하지 않는 세포성 흡수 및 개선된 약동학를 통해 개선된 면역 반응이 유발된다는 것이다. 부가의 비제한적인 설명은 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)의 길이를 증가시키면, 수성 완충제 중에서 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 개선된 안정성, 예를 들어 동역학적 안정성이 초래되고; 입자의 개선된 안정성은 입자가 무손상으로 유지되도록 함으로써, 그 입자를 구성하는 펩티드 항원 접합체의 제거 (신장 또는 간)를 지연시키고 항원 제시 세포에 의한 흡수를 촉진시켜 준다.
본원에 개시된 부가의 예상치 못한 발견은, 펩티드 항원 접합체의 소수성 분자 (H)를 구성하는 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)에 연결된 화학식 III의 아주반트의 효력이 다수의 면역화 후 펩티드 항원에 대항하여 생성된 T 세포 반응의 규모 및 폭과 반비례하는 것으로 밝혀진 것이다. 따라서, 본 발명자들은 화합물 1로서 지칭된 화학식 III의 아주반트 (여기서 R7 =
Figure pct00026
및 R8 =
Figure pct00027
)에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)이, 화합물 2로서 지칭된 화학식 III의 아주반트 (여기서 R7 =
Figure pct00028
및 R8 =
Figure pct00029
)에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)과의 비교 시 더 높은 규모와 폭의 T 세포 반응을 초래한다는 것을 밝혀내고 본원에 개시하였다.
비제한적인 설명은 R7 =
Figure pct00030
인 화학식 III의 아주반트의 더 낮은 효력이, R7 =
Figure pct00031
인 화학식 III의 아주반트보다 덜한 염증을 유발한다는 것과, 더 낮은 효력의 효능제에 의해 유도된 중간 정도의 염증이 T 세포 반응의 소모를 줄이며, 전반적으로 T 세포 반응의 규모 및 폭을 더 크게 제공한다는 것이다.
이들 발견에 기반하여, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 대한 바람직한 실시양태는 하기이다:
Figure pct00032
본 발명자들은 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 소수성 분자 (H)는, 폴리(아미노산) 중합체가 5 내지 10개의 아미노산으로 구성될 때 (여기서 공중합체의 60 내지 100%는 화학식 III의 아주반트 (여기서 R7 =
Figure pct00033
및 R8 =
Figure pct00034
) (화합물 1)에 연결된 공단량체 o로 구성됨), T 세포 반응의 규모 및 품질에 있어서 상당한 증가를 초래한다는 예상치 못한 발견을 보고하고 본원에 개시하였다. 바람직한 실시양태에서, 공단량체 o는 화학식 II의 폴리(아미노산)의 단량체 단위의 20 내지 60%, 예를 들어, 60%를 포함한다.
예를 들어:
Figure pct00035
본원에 개시된 예상치 못한 데이터는 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체의 길이 및 부착된 아주반트 특성을 갖는 리간드 (즉, 화학식 III의 TLR-7/8 효능제)의 수 및 효력이, 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 항원 (A)에 대항하여 생성된 면역 반응의 규모 및 품질의 주요 결정 요인이라는 것을 밝혀낸다. 이들 데이터는 리간드에 연결된 아미노산 및/또는 소수성 아미노산으로 구성되는 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)가, 입자 어셈블리를 구동시키는 폴리(아미노산)-기반 소수성 분자 (H)의 경향에 대응할 수 있는 고도로 친수성인 펩티드 항원 (A)을 포함한 임의의 펩티드 항원 (A)에 연결될 때 입자 형성을 가능하게 할 정도로 충분히 길어야 한다는 것을 암시한다. 불충분한 길이, 예를 들어 3개 미만 아미노산 길이의 폴리(아미노산)은 특정 펩티드 항원, 특히 높은 전하 밀도를 갖는 친수성 펩티드 항원에 연결된 경우에 수성 조건에서 입자 형성을 촉진시키기에 충분한 소수성 표면적을 제공하지 않을 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)은 3개 초과의 아미노산 길이, 바람직하게 5 내지 30개의 아미노산 길이, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 30개 아미노산 길이여야 한다. 더 긴 폴리(아미노산), 예컨대 30개 초과의 아미노산, 예컨대 약 30, 40 또는 50개 아미노산 길이의 폴리(아미노산)이, 예를 들어, 고체 상 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 고체 상 펩티드 합성에 대한 대안으로서, 용액 중합 반응을 사용하여 소수성 단량체로 구성된 장쇄 폴리(아미노산)을 생성할 수 있다.
본 발명자들은 108 nmolar의 TLR-7 활성에 대한 시험관내 결정된 효력 (즉, EC50)을 갖는 화합물 1이, 18.7 nmolar의 TLR-7 활성에 대한 시험관내 결정된 효력 (즉, EC50)을 갖는 더 강력한 효능제인 화합물 2와의 비교 시, 반복 면역화 후에 개선된 T 세포 반응을 유도한다는 부가의 예상치 못한 발견을 본원에 개시한다. 이들 데이터는 면역원성 조성물에 포함된 아주반트의 효력이 면역 반응을 최적화하도록 조정될 수 있다는 것과, 아주반트에 의한 선천 면역 활성화가 조정되어 T 세포 면역을 최적화하는데 필요한 적절한 수준의 자극을 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 선천 면역 자극의 수준은 펩티드 항원 접합체 상에 다수의, 예를 들어, 3개 이상의 중간 정도 효력의 효능제 (즉, EC50 > 100 nmolar를 갖는 효능제)를 전달하거나 또는 3개 미만의 높은 효력의 효능제 (즉, EC50 < 100 nmolar를 갖는 효능제)를 전달함으로써 조정될 수 있다.
다양한 TLR-7, TLR-8 및 조합된 TLR-7 & -8 효능제의 효력은 문헌으로부터 용이하게 확인될 수 있다. 이미다조퀴놀린 기반 및 아데닌-기반 TLR-7 및 TLR-7/8 효능제가 보고되었고 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Shukla, et al. J. Med. Chem., 53:4450-4465, 2010 및 Gerster, et al., J. Med. Chem., 2005], 미국 특허 번호 6,069,149 및 문헌 [Hirota, et al., J. Med. Chem., 45:5419-5422, 2002] 참조), 화학식 III의 아주반트의 R2에 대해 선택된 방향족 링커, 예컨대 벤질 및 크실릴 링커가, 화학식 III의 아주반트의 R2가 저급 알킬로부터 선택되는 화합물과 비교 시 TLR-7에 대한 효력이 증가된 화합물을 초래하는 것으로 밝혀졌다.
본원에 기재된 예상치 못한 발견에 기반하여, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)의 바람직한 실시양태는 전형적으로 5 내지 30개의 아미노산 길이이고, 여기서 화학식 III의 아주반트에 연결된 공단량체의 밀도는 20 내지 100 mol%이다. 임의로, 화학식 III의 아주반트가 저급 알킬로부터 선택된 R8을 포함하는 경우 (예를 들어, 화합물 1), 화합물 1에 연결된 아미노산의 밀도는 40 내지 100%, 예컨대 60%여야 한다. 임의로, 화학식 III의 아주반트가 방향족으로부터 선택된 R8을 포함하는 경우 (예를 들어, 화합물 2), 화합물 2에 연결된 아미노산의 밀도는 20% 미만이어야 하거나, 또는 화합물 2의 1 내지 2개 분자가 각각의 중합체 상에 전달된다.
바람직한 실시양태에서, 분자량이 약 10,000 g/mol 미만이고 N-2-히드록시프로필(메타크릴아미드) (HPMA), 히드록시에틸(메타크릴레이트) (HEMA), 스티렌, 비닐피롤리돈 (PVP), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm); N-이소프로필메타크릴아미드 (NIPMAm); N,N'-디에틸아크릴아미드 (DEAAm); N-(L)-(1-히드록시메틸)프로필 메타크릴아미드 (HMPMAm); N,N'-디메틸에틸메타크릴레이트 (DMEMA), 2-(2-메톡시에톡시)에틸 메타크릴레이트 (DEGMA) 또는 치환된 폴리(포스포에스테르)로부터 선택된 공단량체에 기반한 중합체에 연결된 화학식 III의 아주반트의 밀도는 약 5 내지 100 mol%이고, 예를 들어, 상기 중합체에 부착된 아주반트의 밀도는 약 5-6%, 약 6-7%, 약 8-9%, 약 9-10%, 약 10-11%, 약 11-12%, 약 12-13%, 약 13-14%, 약 15-16%, 약 17-18%, 약 18-20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 분자량이 10,000 g/mol 초과이고 N-2-히드록시프로필(메타크릴아미드) (HPMA), 히드록시에틸(메타크릴레이트) (HEMA), 스티렌, 비닐피롤리돈 (PVP), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm); N-이소프로필메타크릴아미드 (NIPMAm); N,N'-디에틸아크릴아미드 (DEAAm); N-(L)-(1-히드록시메틸)프로필 메타크릴아미드 (HMPMAm); N,N'-디메틸에틸메타크릴레이트 (DMEMA), 2-(2-메톡시에톡시)에틸 메타크릴레이트 (DEGMA) 또는 치환된 폴리(포스포에스테르)로부터 선택된 공단량체에 기반한 중합체에 연결된 화학식 III의 아주반트의 밀도는 약 1 내지 25 mol%이고, 예를 들어, 상기 중합체에 부착된 아주반트의 밀도는 약 1-2%, 약 2-3%, 약 3-4%, 약 5-6%, 약 6-7%, 약 7-8%, 약 8-9%, 약 9-10%, 약 10-11%, 약 11-12%, 약 13-14%, 약 14-15%, 약 16-17%, 약 17-18%, 약 19-20%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25%일 수 있다.
부가의 실시양태에서, 소수성 및/또는 온도-반응성 단량체로 구성되는 제2 중합체는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)의 말단 또는 측기에 연결된다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)에 그라프트된 온도-반응성 DEGMA-기반 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 명확성을 위해 하기에 제공된다:
Figure pct00036
여기서 공단량체 k는 전형적으로 정수 3 내지 300이고, 공단량체 k'는 전형적으로 정수 3 내지 300개의 아미노산 잔기이며, 여기서 k와 k'의 합은 전형적으로 약 3 내지 300이다. 바람직한 실시양태에서, k는 약 3 내지 10이고 k는 약 1 내지 10이다. 링커 X는 임의의 적합한 링커 분자일 수 있고, m은 전형적으로 약 10 내지 300개 단량체 단위이다. 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통해 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성하며, 이는 하전된 분자 (C)를 부가로 포함할 수 있다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 말단에 연결된 온도-반응성 DEGMA-기반 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 명확성을 위해 하기에 제공된다:
Figure pct00037
여기서 공단량체 k는 전형적으로 정수 3 내지 100개 단량체 단위이다. 링커 X는 임의의 적합한 링커 분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, k'는 약 3 내지 10개 단량체 단위이다. 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통해 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성하며, 이는 하전된 분자 (C)를 부가로 포함할 수 있다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 말단에 연결된 폴리-포스포에스테르-기반 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 명확성을 위해 하기에 제공된다:
Figure pct00038
여기서 공단량체 k는 전형적으로 정수 3 내지 100개 단량체 단위이다. 링커 X는 임의의 적합한 링커 분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, k는 약 5 내지 10개 단량체 단위이고, m은 약 10 내지 300개 단량체 단위이다. 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통해 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성하며, 이는 하전된 분자 (C)를 부가로 포함할 수 있다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I의 폴리(아미노산)의 말단에 연결된 폴리(벤질 글루타메이트)-기반 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)의 비제한적 예는 명확성을 위해 하기에 제공된다:
Figure pct00039
여기서 공단량체 k는 전형적으로 정수 3 내지 100개 단량체 단위이고, m은 전형적으로 정수 50 내지 300개의 아미노산 잔기이다. 링커는 임의의 적합한 링커 분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, x는 약 5 내지 10개 단량체 단위이고, m은 약 10 내지 300개 단량체 단위이다. 폴리(아미노산)의 N-말단은 임의의 적합한 수단을 통해 펩티드 항원 (A)에 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)을 통해 간접적으로 연결되어 펩티드 항원 접합체를 형성하며, 이는 하전된 분자 (C)를 부가로 포함할 수 있다.
비제한적 예에서, 펩티드 항원 (A)은 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결되며, 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 및 임의적 링커 (L)를 부가로 포함하여 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체를 산출할 수 있으며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다:
Figure pct00040
화학식 IV의 펩티드 항원 (A)은 아미노산의 정수, n으로 구성되며, 여기서 n은 전형적으로 7 내지 35, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 아미노산이고, 소수성 분자 (H)는 전형적으로, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 II의 폴리(아미노산)이다.
화학식 III의 아주반트에 연결되는 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결되는 트리아졸 링커 (L)에 연결되는, 임의로 카텝신 절단가능한 테트라펩티드 연장부 (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg 서열식별번호: 8)에 N-말단에서 연결되고 조합된 면역 프로테아솜 및 카텝신 절단가능한 헥사펩티드 연장부 (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13)에 C-말단에서 연결되는 펩티드 항원 (A)으로 구성된 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 비제한적 예가 한 예로서 하기에 제시된다:
Figure pct00041
임의적 하전된 분자 (C)
본원에 개시된 펩티드 항원 접합체는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)으로 구성되고, 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2), 임의적 링커 (L) 및 임의적 하전된 분자 (C)를 부가적으로 포함할 수 있으며, 여기서 C는 정전하를 부여하는 관능기를 보유하는 하전된 분자를 나타낸다. 수성 조건에서 입자로 어셈블리되는 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결된 펩티드 항원을 포함하는 본원에 개시된 면역원성 조성물은 입자를 안정화시키기에 충분한 표면 전하 없이 응집될 수 있다. 따라서, 하전된 분자 (C)는 입자를 안정화시키고 응집을 방지하기 위한 수단으로서 펩티드 항원 접합체에 임의로 연결될 수 있거나; 또는, 또 다른 한편으로는, 하전된 분자 (C)는 안정화된 입자에 대한 수단으로서 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자 내로 혼입될 수 있다. 따라서 하전된 분자 (C)의 목적은 이들 입자의 안정성을 증진시키는 수단으로서 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 순 전하를 제어하는 것이다.
하전된 분자 (C)는 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제에서 양으로 또는 음으로 하전되는 하나 이상의 관능기를 갖는 임의의 분자를 지칭한다. 하전된 분자 (C)를 구성하는 관능기는 부분 또는 전체 정수 값의 전하일 수 있다. 하전된 분자 (C)는 단일 하전된 관능기 또는 다수의 하전된 관능기를 갖는 분자일 수 있다. 하전된 분자 (C)의 순 전하는 양, 음 또는 중성일 수 있다. 하전된 분자 (C)를 구성하는 관능기의 전하는 하전된 분자 (C)가 분산되는 용액의 pH에 의존적이거나 또는 비-의존적일 수 있으며, 이러한 추세는, 예를 들어, 각각 pH 의존적 및 pH 비-의존적인 3급 아민 및 4급 암모늄 화합물의 경우에 그러하다. 분자의 전하는 분자의 루이스 구조 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 허용된 방법에 기반하여 용이하게 추정될 수 있다. 전하는 유도 효과로부터 비롯될 수 있으며, 예를 들어, 전자 친화도에서의 차이와 함께 결합된 원자는 극성 공유 결합을 야기하여, 부분적으로 음으로 하전된 원자 및 부분적으로 양으로 하전된 원자를 초래할 수 있다. 예를 들어, 수소에 결합된 질소는 질소 상에 부분 음전하를 일으키고 수소 원자 상에 부분 양전하를 초래한다. 또 다른 한편으로는, 분자 내의 원자는 그 원자에 할당된 전자의 수가 원자의 원자 수 이하인 경우에 전체 정수 값의 전하를 갖는 것으로 간주될 수 있다. 분자의 전하는 분자를 구성하는 각각의 원자의 전하를 합산함으로써 결정된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 분자 내의 각각의 원자의 공식 전하를 합산하여 분자의 전하를 추정하는 프로세스에 익숙하다.
하전된 분자 (C)는 순 음전하, 순 양전하 또는 중성 전하를 운반할 수 있으며 본원에 개시된 본 발명의 구체적 적용에 필요한 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 의존한다. 예를 들어, 대부분의 세포 표면은 순 음전하를 운반하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 순 양으로 하전된 입자는 고도의 특이성 없이 모든 세포 표면과 상호작용할 수 있다. 대조적으로, 순 음으로 하전된 입자는 대부분의 세포 표면으로부터 정전기적으로 반발될 것이지만, 특정 항원 제시 세포 집단에 의한 선택적 흡수를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 순환계 내로 정맥내로 전달된 양으로 하전된 입자는 비장 내의 항원 제시 세포에서 뿐만 아니라 간 및 폐에 축적되는 것으로 밝혀진 반면, 음으로 하전된 입자는 정맥내 투여 후 비장 내의 항원 제시 세포에 우선적으로 축적되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 하전된 분자 (C)의 순 전하는 적용의 특이적 요구를 충족시키도록 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 순 음전하를 가지며, 생리적 pH인 약 7.4의 pH에서 음전하를 운반하는 관능기로 구성된다. 순 음전하를 운반하는 적합한 하전된 분자 (C)는 생리적 pH인 약 7.4의 pH에서 산의 공액 염기로서 발생하는 관능기 (예를 들어, pKa가 약 6.5 미만인 관능기)를 보유하는 분자를 포함한다. 이들은 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 포스포르아미데이트 및 포스포네이트를 보유하는 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 카르복실레이트를 보유하는 하전된 분자 (C)는 글루탐산, 아스파르트산, 피루브산, 락트산, 글리콜산, 글루쿠론산, 시트레이트, 이소시트레이트, 알파-케토-글루타레이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 및 옥살로아세테이트 및 그의 유도체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 음으로 하전된 분자 (C)는 1 내지 20개의 음으로 하전된 관능기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 음으로 하전된 관능기이지만, 전형적으로 16개 이하의 음으로 하전된 관능기를 갖는 분자로 구성된다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 2 내지 6개 아미노산 길이의 폴리(글루탐산) 펩티드이다. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산으로 구성된 폴리(글루탐산) 서열은 pH 7.4에서 -1, -2, -3, -4, -5 및 -6의 음전하를 운반할 것으로 예상된다. 부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 포스포세린 또는 술포세린이다.
특정 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 순 음전하를 가지며 1개 이상의 음으로 하전된 아미노산으로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)는 1 내지 20개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 음으로 하전된 아미노산으로 구성된다. 비제한적 예에서, 16개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 25)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -16의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 15개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 26)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -15의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 14개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 27)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -14의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 13개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 28)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -13의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 12개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 29)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -12의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 11개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 30)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -11의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 10개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 31)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -10의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 9개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 32)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -9의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 8개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 33)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -8의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 7개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 34)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -7의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 6개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 35)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -6의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 5개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 36)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -5의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 4개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp (서열식별번호: 37)로 구성된 하전된 분자 (C)는 -4의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 3개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp-Asp로 구성된 하전된 분자 (C)는 -3의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 2개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp-Asp로 구성된 하전된 분자 (C)는 -2의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 1개의 아스파르트산 단량체, 예를 들어, Asp로 구성된 하전된 분자 (C)는 -1의 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용된다. 상기 예에서, 아스파르트산 (Asp)은 글루탐산, 술포-세린 또는 포스포-세린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 음으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있으며, 여기서 음으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 순 양전하를 가지며 양으로 하전된 관능기로 구성된다. 적합한 양으로 하전된 분자 (C)는 생리적 pH인 약 7.4의 pH에서 양전하를 운반하는 관능기, 예컨대 약 염기의 공액 산을 갖는 것을 포함하며, 여기서 염기의 공액 산의 pKa는 약 8.5 초과이다. 적합한 양으로 하전된 분자 (C)는 1급, 2급 및 3급 아민 뿐만 아니라 4급 암모늄, 구아니디늄, 포스포늄 및 술포늄 관능기를 보유하는 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암모늄 관능기를 보유하는 적합한 분자는, 예를 들어, 이미다졸륨 및 테트라-알킬 암모늄 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 pH와 독립적인 영구적 양전하를 운반하는 4급 암모늄 화합물로 구성된다.
pH와 독립적으로 전하를 갖는 양으로 하전된 관능기의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00042
여기서 X-는 임의의 적합한 반대 음이온이다.
부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 생리적 pH에서 염기의 공액 산으로서 발생하는 관능기, 예컨대, 예를 들어, 1급, 2급 및 3급 아민으로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 양으로 하전된 분자 (C)는 1 내지 20개의 양으로 하전된 관능기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 양으로 하전된 관능기이지만, 전형적으로 16개 이하의 하전된 관능기로 구성된다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 1 내지 6개 아미노산 길이의 폴리(리신) 펩티드이다. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산으로 구성된 폴리(리신) 서열은 pH 7.4에서, 각각 +1, +2, +3, +4, +5 또는 +6의 양전하를 운반하는 것으로 예상될 것이다. 부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 2 내지 6개 아미노산 길이의 폴리(아르기닌) 펩티드이다.
특정 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 순 양전하를 가지며 1개 이상의 양으로 하전된 아미노산으로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)는 1 내지 20개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 양으로 하전된 아미노산으로 구성된다. 비제한적 예에서, 16개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 38)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +16의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 15개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 39)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +15의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 14개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 40)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +14의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 13개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 41)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +13의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 12개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 42)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +12의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 11개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 43)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +11의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 10개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 44)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +10의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 9개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 45)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +9의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 8개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 46)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +8의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 7개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 47)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +7의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 6개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 48)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +6의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 5개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 49)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +5의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 4개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys-Lys (서열식별번호: 50)로 구성된 하전된 분자 (C)는 +4의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 3개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys-Lys로 구성된 하전된 분자 (C)는 +3의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되며; 2개의 리신 단량체, 예를 들어, Lys-Lys로 구성된 하전된 분자 (C)는 +2의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용되고; 1개의 리신, 예를 들어, Lys로 구성된 하전된 분자 (C)는 +1의 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 제조하기 위해 사용된다. 상기 예에서, 리신 (Lys)은 트리메틸-리신 또는 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 양으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있으며, 여기서 양으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
하전된 분자 (C)는 부가적으로, i) 수 용해도를 개선시키고, ii) 하전된 관능기 사이의 거리를 증가시켜 불완전한 이온화를 방지하는 기능을 하는 작은 비-하전된 친수성 아미노산, 또는 친수성 링커, 예를 들어, 에틸렌 옥시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체 상의 하나의 관능기의 이온화는 국소 효과를 통해 이웃 관능기의 pKa에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 제2 아민에 근접한 아민의 양성자화는 제2 아민의 공액 산의 pKa를 낮출 수 있다. 이웃 관능기의 이온화 전위에 대한 국소 효과의 영향을 감소시키기 위해, 하전된 분자를 구성하는 하전된 관능기 사이의 거리를 증가시키기 위해 링커 분자가 사용될 수 있다. 링커 분자는 1 내지 5개의 작은 비-하전된 친수성 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 및 5개의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 한편으로는, 링커는 1 내지 4개 단량체 단위, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 에틸렌 옥시드 단량체 길이의 에틸렌 옥시드 (즉, PEG) 링커를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1 내지 2개의 작은 비-하전된 친수성 아미노산은 하전된 분자 (C)를 구성하는 이웃 하전된 아미노산 사이에 배치되며, 여기서 아미노산은 아미드 결합을 통해 연결된다. 특정 실시양태에서, 세린은 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 구성하는 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치된다. 바람직한 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 리신 및 세린의 반복 디펩티드, 즉 (Lys-Ser)n으로 구성되며, 여기서 n은 전형적으로 임의의 정수 1 내지 20, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 다른 예로서, 세린은 순 +2 전하를 갖는 트리펩티드 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Lys-Ser-Lys이며; 세린은 순 +3 전하를 갖는 5개 아미노산의 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Lys-Ser-Lys-Ser-Lys (서열식별번호: 51)이며; 세린은 순 +4 전하를 갖는 7개 아미노산의 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys (서열식별번호: 52)이다. 상기 예에서, 리신 (Lys)은 트리메틸-리신 또는 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 양으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있으며, 여기서 양으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세린은 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)를 구성하는 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치된다. 바람직한 실시양태에서, 하전된 분자는 아스파르트산 및 세린의 반복 디펩티드, 즉 (Asp-Ser)n으로 구성되며, 여기서 n은 전형적으로 임의의 정수 1 내지 20, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 예를 들어, 세린은 순 -2 전하를 갖는 트리펩티드 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Asp-Ser-Asp이며; 세린은 순 -3 전하를 갖는 5개 아미노산의 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Asp-Ser-Asp-Ser-Asp (서열식별번호: 53)이며; 세린은 순 -4 전하를 갖는 7개 아미노산의 하전된 분자 (C)의 각각의 하전된 아미노산 사이에 배치되고, 예를 들어, Asp-Ser-Asp-Ser-Asp-Ser-Asp (서열식별번호: 54)이다. 상기 예에서, 아스파르트산 (Asp)은 글루탐산, 술포-세린, 또는 포스포-세린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 음으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있으며, 여기서 음으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 음으로 하전된 아미노산과 양으로 하전된 아미노산 둘 다로 구성된다. 반대 전하의 아미노산으로 구성된 디펩티드, 예를 들어 Lys-Asp는 pH 7.4에서 순 중성인 0 전하를 갖는 것으로 예측되기 때문에 쯔비터이온 디펩티드로서 지칭된다. 하나 이상의 쯔비터이온 디펩티드는 i) 수 용해도를 개선시키고, ii) 특정 pH 범위에 걸쳐 우세한 전하 (예를 들어, 순 음전하 또는 순 양전하)를 제공하기 위한 수단으로서 하전된 분자 (C) 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 쯔비터이온 디펩티드는 pH 7.4에서 펩티드 서열의 전하를 증가 또는 감소시키지 않으면서 펩티드 서열의 친수성 특질을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 쯔비터이온은 특별한 pH에서 순 전하를 부여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 예에서 N-말단 아민 및 C-말단 카르복실산의 기여를 제외하고, 쯔비터이온 디펩티드 Lys-Asp는 pH 7.4에서 순 전하 0을 갖지만, pH < 4에서는 순 전하 +1을 갖고 pH > 10에서는 순 전하 -1을 갖는다. 하나 이상의 쯔비터이온 디펩티드, 예를 들어, 1개의 디펩티드, Lys-Asp; 2개의 디펩티드 Lys-Asp-Lys-Asp (서열식별번호: 55); 3개의 디펩티드, Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp (서열식별번호: 56) 등이 하전된 분자 (C)의 서열에 부가될 수 있다. 상기 예에서, 리신 (Lys)은 트리메틸-리신 또는 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 양으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있고, 아스파르트산 (Asp)은 글루탐산, 술포-세린, 또는 포스포-세린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 음으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있으며, 여기서 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
하전된 분자 (C)의 조성은 특이적 적용을 위해 펩티드 항원 접합체에 필요한 순 전하를 제공하도록 선택된다. 본원에 개시된 여러 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 리신 또는 아르기닌, 또는 리신 또는 아르기닌과 비-하전된 아미노산으로 구성된 양으로 하전된 폴리(아미노산)이다. 일부 실시양태에서, 하전된 모이어티는 pH 독립적인 양전하를 운반하는 술포늄 또는 4급 암모늄 관능기를 포함하였다. 본원에 개시된 여러 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 글루탐산 또는 아스파르트산, 또는 글루탐산 또는 아스파르트산과 비-하전된 아미노산으로 구성된 음으로 하전된 폴리(아미노산)이다. 일부 실시양태에서 하전된 모이어티는 포스페이트 또는 술페이트 기, 예컨대 술포세린 또는 포스포세린을 포함한다. 부가의 실시양태에서, 하전된 분자는 리신 또는 아르기닌과 글루탐산 또는 아스파르트산, 또는 리신 또는 아르기닌과 글루탐산 또는 아스파르트산 뿐만 아니라 비-하전된 아미노산으로 구성된다. 양으로 하전된 관능기와 음으로 하전된 관능기 둘 다는 동일한 하전된 분자 (C) 상에 포함될 수 있다. 하전된 분자 (C)는 양, 음 또는 중성일 수 있지만, 펩티드 항원 접합체의 순 전하는 0이 아니어야 하며, 예를 들어, +3보다 크거나 또는 -3보다 작은 순 전하가 바람직하고, 이는 특이적 적용에 좌우된다.
하전된 분자 (C)에 관한 부가의 고려 사항은 선택된 반대 이온이다. 양전하 갖는 관능기를 보유하는 하전된 분자 (C)의 비제한적 예는 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드 음이온을 포함한 할라이드, 및 포스페이트, 술페이트, 술파이트 및 카르복실레이트 음이온 (포르메이트, 숙시네이트, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트 포함)을 포함한 산의 공액 염기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 음전하를 갖는 관능기를 보유하는 하전된 분자 (C)에 적합한 반대 이온은 수소 및 알칼리 및 알칼리 토금속, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘, 또는 약 염기, 예컨대 암모늄 화합물의 공액 산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
하전된 분자 (C)는 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2), 링커 (L), 링커와 연장부 (B1 또는 B2)를 통해, 또는 직접적으로 또는 링커 (L) 및/또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 간접적으로 펩티드 항원에 연결되는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)를 통해 간접적으로 펩티드 항원 (A)에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결되는 임의적 연장부 (B2)에 C- 또는 N-말단 각각에서 연결되는 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단 각각에 연결되는 임의적 N- 또는 C-말단 연장부 (B1 또는 B2)에 연결되어 화학식 V의 펩티드 항원 접합체를 산출하며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다:
Figure pct00043
여러 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 N-말단에 배치되고, 여기서 하전된 분자 (C)는 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)에 연결되는 링커 (L)에 연결되는 조합된 면역 프로테아솜 및 카텝신 절단가능한 헥사펩티드 연장부 (B2 = PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6')로 구성된 C-말단 연장부 (B2)에 C-말단에서 연결되는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되는 카텝신 절단가능한 테트라펩티드 연장부 (B1 = PN4-PN3-PN2-PN1)로 구성된 N-말단 연장부 (B1)에 연결된다. 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 펩티드 항원 (A)은 정수의 아미노산, n으로 구성되며, 여기서 n은 전형적으로 7 내지 35개의 아미노산이고 소수성 분자 (H)는 전형적으로, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 II의 폴리(아미노산)이다.
화학식 III의 아주반트에 연결되는 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결되는 트리아졸 링커 (L)에 연결되는 카텝신 절단가능한 헥사펩티드 연장부 (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13)에 C-말단에서 연결되는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에서 카텝신 절단가능한 테트라펩티드 연장부 (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg 서열식별번호: 8)에 연결된 하전된 분자 (C = Lys-Lys)를 포함하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 비제한적 예가 하기에 제공된다:
Figure pct00044
부가의 실시양태에서, 하전된 분자 (C; 또는 2개의 하전된 분자가 존재하는 경우 C1 및 C2)는 부가의 임의적 하전된 모이어티 (C1)에 임의로 연결되는 N-말단 연장부 (B1)에 N-말단에서 임의로 연결되는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 C-말단 연장부 (B2)에 연결되는 링커 (L) 또는 소수성 분자 (H)에 직접적으로 연결될 수 있거나; 또는 하전된 분자 (C; 또는 2개의 하전된 분자가 존재하는 경우 C1 및 C2)는 부가의 임의적 하전된 모이어티 (C2)에 임의로 연결되는 C-말단 연장부 (B2)에 C-말단에서 임의로 연결되는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되는 N-말단 연장부 (B1)에 연결되는 링커 (L) 또는 소수성 분자 (H)에 직접적으로 연결되어 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체를 산출할 수 있으며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다:
Figure pct00045
여러 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체의 C-말단에 배치되며, 여기서 하전된 분자 (C)는 하기에 제시된 바와 같이, 전형적으로 1 내지 4개 아미노산 길이의 카텝신 절단가능한 연장부 (B1 = PN1, PN2-PN1, PN3-PN2-PN1 또는 PN4-PN3-PN2-PN1)에 N-말단에서 임의로 연결되는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 전형적으로 1 내지 6개 아미노산 길이의 면역 프로테아솜, 카텝신 또는 조합된 면역 프로테아솜 및 카텝신 절단가능한 연장부로 구성된 C-말단 연장부 (B2) (B2 = PC1', PC1'-PC2', PC1'-PC2'-PC3', PC1'-PC2'-PC3'-PC4', PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5', 또는 PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6')에 임의로 연결되는 링커 (L)에 연결되며, 여기서 링커 (L)는 소수성 분자 (H)에 부가적으로 연결된다:
Figure pct00046
화학식 VI의 펩티드 항원 접합체의 펩티드 항원 (A)은 정수의 아미노산, n으로 구성되며, 여기서 n은 전형적으로 7 내지 35개의 아미노산, 또는 50개 이하의 아미노산이고, 소수성 분자는 전형적으로, 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 II의 폴리(아미노산)이다.
카텝신 절단가능한 테트라펩티드 N-말단 연장부 (예를 들어, B1 = Lys-Pro-Leu-Arg 서열식별번호: 8)에 N-말단에서 연결되는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 조합된 면역 프로테아솜 및 카텝신 절단가능한 헥사펩티드 C-말단 연장부 (예를 들어, B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13)에 연결되는 링커 (L)의 C-말단에 아미드 결합을 통해 연결된 하전된 분자 (예를 들어, C = Lys-Lys)로 구성된 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체 (여기서 링커 (L)는 화학식 III의 아주반트에 연결되는 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성되는 소수성 분자 (H)에 부가적으로 연결됨)의 비제한적 예가 하기에 제공된다:
Figure pct00047
화학식 VI의 펩티드 항원 접합체인 B1-A-B2-L-H(C)의 부가의 비제한적 예는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 조합된 면역 프로테아솜 및 카텝신 절단가능한 헥사펩티드 C-말단 연장부 (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13)에 연결되는 링커 (L)에 연결되는 화학식 III의 아주반트에 연결되는 화학식 I의 폴리(아미노산)으로 구성되는 소수성 분자 (H)에 링커를 통해 연결된 하전된 모이어티 (C = Lys-Lys-Lys-Lys-Lys 서열식별번호: 49)이고, 펩티드 항원 (A)의 N-말단은 카텝신 절단가능한 테트라펩티드 N-말단 연장부 (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg 서열식별번호: 8)에 연결된다:
Figure pct00048
화학식 VI의 펩티드 항원 접합체인 B1-(A)7-35-B2-L(-C)-H의 비제한적 예에서, 서열 Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala (서열식별번호: 22)을 갖는 펩티드 항원 (A)은 서열 Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7)을 갖는 N-말단 연장부 (B1) 및 서열 Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7)을 갖는 C-말단 연장부 (B2)에 연결되며, 이러한 B2는 소수성 분자 (H)에 연결되는 DBCO 분자를 포함하는 링커 전구체 X2와, 서열 Glu-Lys을 갖는 디펩티드로 구성된 하전된 모이어티 (C)에 연결되는 링커 전구체 X1, 예를 들어, Lys(N3)에 연결되어, 예를 들어: Ser-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)-Glu-Lys이며, 여기서 Glu-Lys 서열은 링커 (L) (Lys(N3-DBCO)의 C-말단에 연결되어, pH 7.4에서 +4의 예측된 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체를 생성시킨다. 여기서 소수성 분자 (H)는 펩티드 항원 접합체의 전하에 무시할 만한 기여를 하는 것으로 가정된다. 하전된 모이어티 (C) 및 연장부 서열 (B1 및 B2)의 조성은 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같은 펩티드 항원 접합체를 구성하는 펩티드 서열의 원하는 순 전하 및 소수친수도를 제공하는 특별한 수의 하전된 잔기를 제공하도록 선택될 수 있다는 것에 주목해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 하전된 모이어티 (C)를 구성하는 하전된 관능기의 수는 하전된 모이어티 (C), 펩티드 항원 (A), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2), 링커 (L) 및 소수성 분자 (H)을 포함하는 펩티드 항원 접합체의 순 전하가 약 -3 내지 -10 또는 +3 내지 +10이 되도록 조정된다.
하전된 모이어티 (C)가 소수성 분자 (H)에 연결되는 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체는 개인화된 요법, 예컨대 개인화된 암 백신의 신속한 생산에 유리할 수 있다. 하전된 분자 (C) 및 링커 전구체 X2 (예를 들어, 시클로옥틴을 포함하는 X2)에 연결되는 소수성 분자 (H)는 벌크로 제조된 다음, 링커 전구체 X1 (예를 들어, 아지드를 포함하는 X1)을 보유하는 임의의 펩티드 항원 (A)과 용이하게 조합되어, 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체, [C1]-[B1]-A-[B2]-L-H(C2), 또는 H(C)-L-[B1]-A-[B2]-[C2]를 형성할 수 있으며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다.
하전된 모이어티 (C)의 기능은 수성 조건에서 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 나노입자를 안정화시키는 것이다. 소수성 분자 (H)는 펩티드 항원 접합체의 입자 형성을 유도하지만, 임의적 하전된 분자 (C)는 응집을 방지하는 상쇄 력을 제공하고, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체가 하전된 모이어티 (C)에 의해 제공된 표면 전하를 갖는 나노입자 미셀로 어셈블리되도록 구동시킨다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 하전된 분자를 포함하지 않으며, 예컨대 [B1]-A-[B2]-[L]-H이고, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시한다. 비제한적 예는 A-H, A-L-H, A-B2-H, A-B2-L-H, B1-A-B2-L-H를 포함한다. 하전된 분자 (C)를 포함하지 않는 펩티드 항원 접합체는 수성 조건에서 응집을 겪을 수 있다. 하전된 모이어티 (C)를 포함하지 않는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 안정성을 개선시키기 위해, 하전된 또는 양친매성 분자가 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하전된 모이어티 (C)를 포함하지 않는 제1 펩티드 항원 접합체 (즉, [B1]-A-[B2]-[L]-H)를, 하전된 모이어티를 포함하는 제2 펩티드 항원 접합체 (예를 들어, C-[B1]-A-[B2]-[L]-H)와 DMSO 용액 중에서 혼합한 다음, 수성 조건에서 재현탁시켜 안정한 나노입자를 형성한다. 다른 실시양태에서, 하전된 분자 (C)를 포함하지 않는 펩티드 항원 접합체 (즉, [B1]-A-[B2]-[L]-H)를 하전된 분자 (C)에 연결된 소수성 분자 (H), 예컨대 C-H와 DMSO 용액 중에서 혼합한 다음, 수성 조건에서 재현탁시켜 안정한 나노입자를 형성한다.
일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)를 포함하지 않는 펩티드 항원 접합체, 예컨대 [B1]-A-[B2]-[L]-H (여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시함)는 양친매성 운반체인 C-[B1]-[A']-[B2]-[L]-H (여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시하고, 임의적 A'는 보존된 항원 (즉, 환자-특이적이 아님)임)와 조합된다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)를 포함하는 펩티드 항원 접합체는 양친매성 운반체와 조합된다. 양친매성 운반체는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 나노입자, 예컨대 나노입자 미셀을 안정화시키는 역할을 한다.
하전된 분자 및 연장부 (B1 및 B2)의 선택
임의적 하전된 분자(들) (C)와 함께, 펩티드 항원 (A)의 N- 및 C-말단 각각에서 연결된 임의적 연장부인 B1 및 B2의 조성은: I) 생리적 온도 및 pH 약 7.4에서 수성 완충제 중 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 적절한 순 전하 및 친수성 특징과 소수성 특징의 균형을 달성하도록 선택되어야 하고; II) 펩티드 항원 접합체와 관련하여 전달된 펩티드 항원 (A)이 펩티드 항원 (A) 상에 제공된 최소 CD4 및/또는 CD8 T 세포 에피토프를 방출하도록 프로세싱될 수 있게 보장하여, 상기 에피토프가 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자의 맥락 내에서 제시될 수 있도록 선택되어야 한다. 하기 설명은 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성에 대한 제어에 있어서의 예상치 못한 개선 및/또는 상당히 증강된 T 세포 반응을 유발시키는 상기 입자 상에 펩티드 항원 (A)으로서 제공된 CD4 및/또는 CD8 T 세포 에피토프의 프로세싱 및 제시에서의 개선을 초래하는, 하전된 분자 (C)와 함께 B1 및 B2 연장부의 특이적 조성을 개시한다.
본원에 개시된 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, 화학식 IV, V 및 VI의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 최소 CD8 T 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 항원 (A)이, 시험관 내에서 가장 효율적으로 프로세싱되고, C-말단 효소 분해성 연장부 (B2)가 펩티드 항원 (A)과 소수성 분자 (H) 사이의 C-말단에 사용될 때 및/또는 N-말단 효소 분해성 연장부 (B1)가 펩티드 항원 (A)의 N-말단과 하전된 분자 (C) 사이에 사용될 때 생체 내에서 보다 높은 CD8 T 세포 반응을 유도시킨다는 것이다. 일부 실시양태에서, 하전된 분자 (C)와 펩티드 항원 (A) 사이에 카텝신 절단가능한 부위를 포함하는 B1 연장부를 포함하면 (예를 들어, C-B1-A-[B2]-[L]-H, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시함), 펩티드 항원 접합체로부터 최소 T 세포 에피토프의 보다 효율적인 프로세싱이 초래되었으며, 이는 생체 내에서 더 높은 규모의 T 세포 반응과 연관되었다. 따라서, 화학식 V 및 VI의 바람직한 실시양태는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자로서 제공된 펩티드 항원 (A)의 효율적인 프로세싱 및 제시를 가능하게 하기 위해, 카텝신 절단가능한 서열을 N-말단 (B1) 및 C-말단 (B2) 연장부로서 사용해야 한다.
부가의 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체의 일부 실시양태에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 순 전하의 확인에 관한 것이다. 펩티드 항원 접합체로서 전달된 고도로 소수성인 펩티드 항원 (A)은 수성 조건에서 응집하는 경향을 갖는다. 이러한 경향에 대응하기 위해, 하전된 분자 (C) 및 특정 연장부 (B1 또는 B2)는 펩티드 항원 접합체 (예를 들어, 화학식 V 및 VI 참조)에 대한 부착을 위해 선택될 수 있거나, 또는 하전된 분자를 포함하는 접합체 (예를 들어, C-[A']-[L]-H, 여기서 A'는 보존된 항원이고, [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시함)는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자에 부가될 수 있다. 본원에 개시된 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, 폴리(아미노산) 기반 소수성 분자 (H)를 포함하는 화학식 V 및 VI의 펩티드 항원 접합체의 일부 실시양태에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 전하의 양 (즉, 순 전하)이, 펩티드 항원 (A), 임의적 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및 B2)를 포함하는 펩티드 항원 단편의 소수친수도 (즉, 소수성 특성)에 의존한다는 것이다. 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체의 특정 실시양태에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 유용한 순 전하가 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편의 소수친수도에 기반하여 결정될 수 있다는 예상치 못한 발견을 보고한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체의 순 전하는 펩티드 항원 (A)의 계산된 소수친수도에 기반하여 선택되고, 하전된 분자 (C) 및 임의로 연장부 (B1 및/또는 B2)에 의해 조정된다. 다른 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체의 순 전하는 펩티드 항원 단편의 계산된 소수친수도에 기반하여 선택되고 하전된 분자 (C)에 의해 조정된다. 명확성을 위해, 링커 전구체 (X1 및 X2), 링커 (L) 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 펩티드 항원 접합체의 순 전하를 선택하기 위해 사용된 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편에 대한 소수친수도 값을 결정하는데 있어서 고려되지 않는다. 따라서, 펩티드 항원 접합체의 소수친수도는 펩티드 항원 단편의 소수친수도과 등가이다.
펩티드 항원 (A), 또는 펩티드 항원 (A), 임의적 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)를 포함하는 펩티드 항원 단편의 소수친수도는 펩티드의 소수성 / 친수성 특징을 결정하는데 이용가능한 각종 방법 중 어느 하나를 사용하여 계산될 수 있다. 비제한적 예로서, 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편의 소수친수도를 결정하는 방법은 후술하는 바와 같은 카이트와 두리틀에 의한 방법을 사용하여 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값을 계산하는 것이다. 비-자연 아미노산 (즉, 시트룰린, 술포세린, 포스포세린 및 트리메틸리신)에 대해 제공된 추정치와 함께 하기 소수친수도 값은 카이트와 두리틀의 방법을 기반으로 하고 본원에서 GRAVY 값을 계산하는데 사용된다:
Figure pct00049
Figure pct00050
펩티드의 GRAVY 값을 결정하는 프로세스는 펩티드를 구성하는 각각의 개별 아미노산의 소수친수도 값을 합한 다음, 이를 펩티드의 총 길이로 나누는 것이다. 예를 들어, 서열 Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu (서열식별번호: 57)을 갖는 9개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 3.86의 GRAVY 값 (예를 들어, (4.2 + 4.2 + 4.5 + 1.8 + 4.5 + 2.8 + 4.5 + 4.5 + 3.8)/9개 아미노산)을 갖는다. 비제한적 예로서, 하전된 분자 (C = Lys-Ser-Lys-Gly-Gly 서열식별번호: 58)가 링커 전구체 X1 (여기서 X1은 Lys(N3)-NH2임)에 연결되는 C-말단에서 C-말단 연장부 (B2 = Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 11)에 연결되고 펩티드 항원의 N-말단에서 N-말단 연장부 (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg 서열식별번호: 8)에 연결되는, 고체 상 펩티드 합성에 의해 펩티드 항원 단편으로서 제조된 상기와 동일한 펩티드 항원 (A), 즉 Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu (서열식별번호: 57)으로, Ac-Lys-Ser-Lys-Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg-Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu-Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg-Lys(N3)-NH2이고, 0.75의 GRAVY 값 및 +6의 순 전하를 갖는다.
펩티드 항원 단편 또는 펩티드 항원 (A)의 GRAVY 값의 결정은 펩티드 서열의 소수성 / 친수성 특징에 대한 설명을 제공한다. 일반적으로, 0보다 작은 GRAVY 값은 전형적으로, 펩티드가 주로 친수성 아미노산으로 구성된다는 것을 표시하는 반면, 0보다 큰 GRAVY 값은 펩티드가 주로 소수성 아미노산 잔기로 구성된다는 것을 표시한다. 본원에 보고된 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편의 GRAVY 값이 증가함에 따라, 펩티드 항원 (A) (또는 펩티드 항원 단편)을 포함하는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 순 전하 (양 또는 음)의 규모가 또한 증가한다는 것이다. 따라서, 보다 높은 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편은 전형적으로, 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 안정성을 보장하기 위해 더 높은 순 전하를 필요로 한다.
펩티드 항원 (A), 임의적 하전된 분자 (C) 및/또는 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)의 아미노산 조성 (링커 전구체 (X1 및 X2), 링커 (L) 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)를 구성할 수 있는 임의의 아미노산의 기여는 배제함)에 기반하여 계산되는, 펩티드 항원 (A) 또는 펩티드 항원 단편의 GRAVY 값은, 펩티드 항원 접합체의 일부 실시양태에 의한 안정한 입자 형성을 보장하는데 필요한 순 전하를 결정하기 위해 계산될 수 있다. 주: 펩티드 항원 접합체의 GRAVY는 펩티드 항원 단편의 GRAVY와 동등한 것으로 간주되고; 따라서, 펩티드 항원 단편의 GRAVY 값은 또한 펩티드 항원 접합체의 GRAVY 값을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)의 GRAVY 값은 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 순 전하를 결정하는데 사용된다. 비제한적 예로서, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A)에 대한 GRAVY 값이 0.75 초과일 때 ≥ (이상) +6 또는 ≤ (이하) -6의 순 전하를 가져야 하고; GRAVY 값이 0.25 내지 0.75일 때 ≥ (이상) +5 또는 ≤ (이하) -5의 순 전하를 가져야 하며; GRAVY 값이 0.25 미만일 때 ≥ (이상) +4 또는 ≤ (이하) -4의 순 전하를 가져야 한다. 바람직한 실시양태에서, 순 양전하가 필요한지 아니면 순 음전하가 필요한지에 따라, 각각 순 전하가 +4 이상 또는 -4 이하이다. 일부 실시양태에서, 0.25 미만의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 (A)은 약 +4 내지 +15, 예를 들어, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14 또는 +15이지만, 전형적으로 약 +4 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -4 내지 -15, 예를 들어, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -4 내지 -12의 순 음전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성된다. 일부 실시양태에서, 0.25 내지 0.75의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 (A)은 약 +5 내지 +15, 예를 들어, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15이지만, 전형적으로 약 +5 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -5 내지 -15, 예를 들어, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -5 내지 -15의 순 음전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성된다. 일부 실시양태에서, 0.75 초과의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 (A)은 약 +6 내지 +15, 예를 들어, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15이지만, 전형적으로 약 +6 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -6 내지 -15, 예를 들어, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -6 내지 -12의 순 음전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성된다.
원하는 순 전하의 펩티드 항원 접합체를 생산하기 위해 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)를 선택하는 프로세스의 한 실시양태에서, 상기 프로세스는 (i) 펩티드 항원 (A)의 GRAVY 및 전하를 결정하는 단계; 및 (ii) 원하는 순 전하에 도달하기에 충분한 수의 하전된 관능기를 달성하기 위해 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 비제한적 예에서, 펩티드 항원 접합체에 필요한 순 전하는 하기 기준에 따라 펩티드 항원 (A) 소수친수도에 따라 다양할 수 있다: 0.75 초과의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 +6 이상의 전하가 필요하고; 0.25 내지 0.75의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 +5 이상의 전하가 필요하며; 0.25 미만의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 +4 이상의 전하가 필요하다. 따라서, 이러한 비제한적 예에서, 2.0의 GRAVY 값 및 +2의 전하를 갖는 25개의 아미노산 펩티드 항원 (A)은 +6의 펩티드 항원 접합체의 순 전하를 달성하기 위해 적어도 +4의 순 전하를 포함하는 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)와 조합되어야 한다. 부가의 비제한적 예에서, 펩티드 항원 접합체에 필요한 순 전하는 하기 기준에 따라 펩티드 항원 (A) 소수친수도에 따라 다양할 수 있다: 0.75 초과의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 -6 이하의 전하가 필요하고; 0.25 내지 0.75의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 -5 이하의 전하가 필요하며; 0.25 미만의 GRAVY 값을 갖는 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)에 대해서는 -4 이하의 전하가 필요하다. 따라서, 이러한 비제한적 예에서, 2.0의 GRAVY 값 및 +2의 전하를 갖는 펩티드 항원 (A)은 -6의 펩티드 항원 접합체의 순 전하를 달성하기 위해 -8의 순 전하를 포함하는 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)와 조합되어야 한다.
일부 실시양태에서, 임의적 하전된 분자 (C), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 및 펩티드 항원 (A)을 포함한 펩티드 항원 단편에 대한 GRAVY 값의 결정은 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는데 필요한 순 전하를 결정하는데 사용된다. 비제한적 예로서, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 단편의 GRAVY 값이 0.75 초과일 때 ≥ (이상) +6 또는 ≤ (이하) -6의 순 전하를 가져야 하고; GRAVY 값이 0.25 내지 0.75일 때 순 전하는 ≥ (이상) +5 또는 ≤ (이하) -5여야 하며; GRAVY 값이 0.25 미만일 때 순 전하는 ≥ (이상) +4 또는 ≤ (이하) -4여야 한다. 바람직한 실시양태에서, 순 양전하가 필요한지 아니면 순 음전하가 필요한지에 따라, 각각 순 전하가 +4 이상 또는 -4 이하이다. 일부 실시양태에서, 0.25 미만의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 단편은 약 +4 내지 +15, 예를 들어, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14 또는 +15이지만, 전형적으로 약 +4 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -4 내지 -15, 예를 들어, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -4 내지 -12의 순 음전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 0.25 내지 0.75의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 단편은 약 +5 내지 +15, 예를 들어, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15이지만, 전형적으로 약 +5 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -5 내지 -15, 예를 들어, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -5 내지 -12의 순 음전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 0.75 초과의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 단편은 약 +6 내지 +15, 예를 들어, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15이지만, 전형적으로 약 +6 내지 +12의 순 양전하를 갖거나; 또는 약 -6 내지 -15, 예를 들어, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 또는 -15이지만, 전형적으로 약 -6 내지 -12의 순 음전하를 갖는다.
부가의 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체, 예를 들어 화학식 V 및 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체의 특정 실시양태에 의해 형성된 입자를 안정화시키기 위해 요구되는 순 전하의 규모가 일반적으로, 펩티드 항원 (A)의 길이에 따라 증가한다는 것이다. 일부 실시양태에서, 7 내지 14개의 아미노산 펩티드 항원 (A)은 +6 이상 또는 -6 이하의 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성되고; 15 내지 24개의 아미노산 펩티드 항원 (A)은 +7 이상 또는 -7 이하의 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성되며; 25 내지 35개의 아미노산 펩티드 항원 (A)은 +8 이상 또는 -8 이하의 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 합성된다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 화학식 [B1]-A-[B2]-[L]-H의 펩티드 항원 접합체 및 화학식 C-[A']-[L]-H의 하전된 분자 (C) 접합체로 구성된 입자를 포함하며, 여기서 [ ]는 그 기가 임의적이라는 것을 표시하고 A'는 임의적 보존된 항원 (즉, 환자 특이적이지 않음)이며, 부가적으로 여기서 [B1]-A-[B2]-[L]-H 대 C-[A']-[L]-H의 몰 비는 1:20 내지 20:1의 범위, 예컨대 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1 및 20:1로부터 선택되고, C-[A']-[L]-H의 순 전하는 음이며 -2 내지 -20, 예컨대 -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19 또는 -20, 전형적으로 약 -4 내지 약 -12로부터 선택되거나, 또는 양이고 +2 내지 +20, 예컨대 +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +15, +16, +17, +18, +19 또는 +20, 전형적으로 약 +4 내지 +12로부터 선택된다. 비제한적 예에서, 면역원성 조성물은 0의 순 전하 (펩티드 단편이 C-말단 아미드를 갖는다는 것에 주목해야 함)를 운반하는, 1 몰 당량의 펩티드 항원 접합체인 Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Lys(N3-DBCO-H)-NH2, 및 +6의 순 전하를 운반하는, (Lys)5-Lys(N3-DBCO-NH)-NH2로 구성된 1 몰 당량의 하전된 분자 (C) 접합체를 포함하는 입자를 포함하고; 펩티드 항원 접합체 대 하전된 분자 접합체의 비는 1:1이며, 이들 두 분자의 각각의 세트의 순 전하는 +6이다. 따라서, 입자의 순 전하는 펩티드 항원 접합체 대 하전된 분자 (C) 접합체의 비를 조정함으로써 또는 하전된 분자 접합체의 순 전하를 조정함으로써 조정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체 대 하전된 분자의 비는 약 1:4 내지 4:1이고 하전된 분자의 순 전하는, 입자를 구성하는 분자의 평균 순 전하가 약 +4 내지 약 +12 또는 약 -4 내지 약 -12가 되도록 선택된다. 예를 들어, 입자는 펩티드 항원 접합체 대 하전된 분자 접합체 (C)의 1:1 몰 비를 포함하고, 여기서 펩티드 항원 접합체는 0의 순 전하를 가지며, 하전된 분자 (C) 접합체의 순 전하가 +8일 때 분자의 평균 순 전하는 +4이다.
특정의 적용에 대하여, 양으로 하전된 펩티드 항원 접합체가 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A), 양으로 하전된 관능기를 포함하는 하전된 분자 (C), 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 및 임의적 링커 (L)를 포함할 수 있다. 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)의 조성은 펩티드 항원 접합체의 입자 안정성 및 생물학적 활성을 최대화하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 순 양전하를 갖는 하전된 분자 (C)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H)에 연결되는 C-말단 펩티드 연장부 (B2)에 연결되는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 N-말단 펩티드 연장부 (B1)에 연결되며, 이로써 생성되는 펩티드 항원 접합체는 순 양전하를 갖는다. 이러한 예에서, 펩티드 항원 (A)의 C-말단을 통해 연결된 소수성 분자 (H)는 입자 형성을 유도하는 기능을 하고, 펩티드 항원 (A)의 N-말단을 통해 연결된 하전된 분자 (C)는 입자의 표면에서의 높은 양전하 밀도를 통해 그 입자를 안정화시키는 기능을 한다. 따라서, 화학식 V의 순 양으로 하전된 펩티드 항원 접합체의 소수성 분자 (H)에 근접하여 배치된 임의적 B2 연장부 (여기서 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N-말단을 통해 연결됨)는 바람직하게, 입자 형성을 촉진시키는데 도움을 주는 비-하전된 및 소수성 아미노산으로 구성되고, 전형적으로, 단일 아미노산, 예컨대 글리신, 세린, 시트룰린, 류신, 노르류신 또는 메티오닌; 디펩티드, 예컨대 Gly-Cit, Gly-Ser 또는 Gly-Leu; 트리펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Cit, 또는 Gly-Pro-Gly; 테트라펩티드, 예컨대 Ser-Pro-Val-Cit 또는 Gly-Pro-Gly-Cit; 펜타펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Val-Leu-Cit, Gly-Pro-Val-Leu-Cit; 또는 헥사펩티드, 예컨대 Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit, 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 하전된 아미노산을 포함하는 C-말단 연장부 (B2)가 사용되고, 이는 전형적으로, 단일 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 리신; 디펩티드, 예컨대 Gly-Arg 또는 Gly-Lys; 트리펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Arg 또는 Gly-Ser-Lys; 테트라펩티드, 예컨대 Gly-Pro-Gly-Arg (서열식별번호: 59), Gly-Ser-Val-Arg (서열식별번호: 60) 또는 Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7) (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음); 펜타펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 17) (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음); 및 헥사펩티드, 예컨대 Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 13) 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 61) (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된다. 화학식 V의 양으로 하전된 펩티드 항원 접합체의 하전된 분자 (C)에 근접하여 배치된 B1 연장부 (여기서 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N-말단을 통해 연결됨)는 바람직하게, 하전된 아미노산, 예컨대 Arg 또는 Lys를 함유하고, 전형적으로 Arg 또는 Lys로부터 선택된 단일 아미노산; Val-Arg 또는 Leu-Arg (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된 디펩티드; Pro-Val-Arg 또는 Gly-Val-Arg (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된 트리펩티드; 또는 Lys-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 62), Lys-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 9), Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8), Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7) 및 Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6) (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된 테트라펩티드로부터 선택된다. 상이한 연장부, B1 및 B2는 임의의 하전된 분자 (C), 펩티드 항원 (A), 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 및 링커 (L)와 조합되어, 의도된 적용에 필요한 펩티드 항원 접합체의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값 및 순 전하를 달성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 순 양전하를 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결되는 링커 (Lys(N3)-DBCO)에 연결되는 C-말단 연장부 (B2), 예를 들어, Ser-Pro-Val-Cit에 연결되는, 전형적으로 7 내지 35개의 아미노산을 포함하는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 디펩티드 N-말단 연장부 (B1), 예를 들어 Val-Arg에 연결되는, 전형적으로 4 내지 12개의 양으로 하전된 관능기, 예를 들어, (Lys)4-12를 포함하는 하전된 분자 (C)를 포함한다.
특정 적용을 위해, 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체가 요구된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A), 음으로 하전된 관능기를 포함하는 하전된 분자 (C), 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 및 임의적 링커 (L)를 포함할 수 있다. 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2)의 조성은 펩티드 항원 접합체의 입자 안정성 및 생물학적 활성을 최대화하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 순 음전하를 갖는 하전된 분자 (C)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 직접적으로 또는 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (H)에 연결되는 C-말단 펩티드 연장부 (B2)에 연결되는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 N-말단 펩티드 연장부 (B1)에 연결되며, 이로써 생성되는 펩티드 항원 접합체는 순 음전하를 갖는다. 따라서, 화학식 V의 순 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체의 소수성 분자 (H)에 근접하여 배치된 B2 연장부 (여기서 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에서 B1 연장부를 통해 연결됨)는 바람직하게, 입자 형성을 촉진시키는데 도움을 주는 비-하전된 및 소수성 아미노산으로 구성되고, 전형적으로, 단일 아미노산, 예컨대 글리신, 세린, 시트룰린, 류신, 노르류신 또는 메티오닌; 디펩티드, 예컨대 Gly-Ser, Gly-Cit 또는 Gly-Leu; 트리펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Cit, 또는 Gly-Pro-Gly; 테트라펩티드, 예컨대 Ser-Pro-Val-Cit, Ser-Pro-Val-Cit 또는 Gly-Pro-Gly-Cit; 펜타펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Val-Leu-Cit, Gly-Pro-Val-Leu-Cit; 또는 헥사펩티드, 예컨대 Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit, 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 하전된 아미노산을 포함하는 C-말단 연장부 (B2)가 사용되고, 이는 전형적으로 단일 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 리신; 디펩티드, Gly-Arg (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음); 트리펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Arg (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음); 테트라펩티드, 예컨대 Gly-Pro-Gly-Arg (서열식별번호: 59), Gly-Ser-Val-Arg (서열식별번호: 60), Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7), Asp-Leu-Val-Cit 또는 Asp-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 63) (여기서 Asp는 Glu로 대체될 수 있고 Arg는 Lys으로 대체될 수 있음); 펜타펩티드, 예컨대 Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 17) 또는 Gly-Asp-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 64) 또는 Gly-Asp-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 65); 및 헥사펩티드, 예컨대 Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 13) 또는 Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 61) (여기서 Asp는 Glu로 대체될 수 있고 Arg는 Lys으로 대체될 수 있음); 또는 Gly-Ser-Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 66) 또는 Gly-Gly-Asp-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 67) (여기서 Asp는 Glu로 대체될 수 있고 Arg는 Lys으로 대체될 수 있음)로부터 선택된다. 화학식 V의 순 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체의 하전된 분자 (C)에 근접하여 배치된 B1 연장부 (여기서 하전된 분자 (C)는 B1 연장부를 통하여 펩티드 항원의 N-말단을 통해 연결됨)는 바람직하게, 하전된 아미노산, 예컨대 Asp 또는 Glu를 함유하고, 전형적으로 단일 아미노산, 예컨대 Cit, Leu, Arg 또는 Lys; Val-Cit, Leu-Cit, Val-Arg 또는 Leu-Arg (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된 디펩티드; Pro-Val-Arg, Pro-Val-Cit, Gly-Val-Arg 또는 Gly-Val-Cit (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있음)로부터 선택된 트리펩티드; 또는 Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7), Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6), Ser-Pro-Leu-Cit, Ser-Leu-Val-Cit, Ser-Pro-Val-Cit, Asp-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 68), Asp-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 69), Asp-Leu-Val-Cit, Asp-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 63), Ser-Gly-Val-Cit 또는 Asp-Pro-Val-Cit (여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있고 Asp는 Glu로 대체될 수 있음)로부터 선택된 테트라펩티드로부터 선택된다. 상이한 연장부, B1 및 B2는 임의의 하전된 분자 (C), 펩티드 항원 (A) 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)와 조합되어, 필요한 펩티드 항원 접합체의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값 및 순 전하를 달성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 순 음전하를 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 I 또는 화학식 II의 폴리(아미노산)으로 구성된 소수성 분자 (H)에 연결되는 링커 (Lys(N3)-DBCO)에 연결되는 C-말단 연장부 (B2), 예를 들어, Ser-Pro-Val-Cit에 연결되는, 전형적으로 7 내지 35개의 아미노산을 포함하는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 디펩티드 N-말단 연장부 (B1), 예를 들어 Val-Cit에 연결되는, 전형적으로 6 내지 14개의 음으로 하전된 관능기, 예를 들어, (Glu)6-14를 포함하는 하전된 분자 (C)를 포함한다.
여러 실시양태에서, 하전된 분자 (C) 및/또는 연장부 (B1 및 B2)의 부가는 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 단편의 GRAVY 값을 감소시키고 서열의 순 전하를 증가시켰으며, 이는 펩티드 항원 단편의 제조에 있어서 예상치 못한 개선과 연관이 있었다. 여러 실시양태에서, 하나 이상의 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg) 아미노산 잔기를 포함하는 하전된 분자 (C)의 부가는, 천연 펩티드 항원 (즉, 다른 변형이 없는 천연 펩티드 항원)으로서 달리 제조가능하지 않았던 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 단편의 성공적인 합성 및 HPLC 정제를 야기시켰다. 여러 실시양태에서, 하나 이상의 프롤린, 슈도 프롤린 (Pro), 아르기닌 (Arg) 또는 리신 (Lys) 아미노산으로 구성된 C-말단 연장부 (B2)에 연결된 펩티드 항원 (A)은, 천연 펩티드 항원 (즉, 다른 변형이 없는 천연 펩티드 항원)으로서 달리 제조가능하지 않았던 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 단편의 성공적인 합성을 초래하였다. 여러 실시양태에서, 하나 이상의 방향족 아민, 예컨대 페닐알라닌 아민을, 전적으로 고체 상 펩티드 합성에 의해 생산된 펩티드 항원 단편 또는 펩티드 항원 접합체에 부가하면, 천연 펩티드 항원 (즉, 다른 변형이 없는 천연 펩티드 항원)으로서 달리 제조가능하지 않았던 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 단편 또는 펩티드 항원 접합체의 성공적인 합성이 초래되었다.
개인화된 암 백신에 사용하기 위한 펩티드 항원 (A)의 선택
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체를 구성하는 펩티드 항원 (A)은 개별 환자에 특이적이다. 개별 환자에 특이적인 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 접합체는 개인화된 요법을 위해, 예컨대 개인화된 암 백신으로서 사용하기 위해 또는 자가면역 또는 알레르기를 치료하기 위한 면역관용 또는 억제를 유도하기 위한 개인화된 백신으로서 사용하기 위해 사용될 수 있다.
개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)의 선택은 다단계 프로세스이며, 일부 단계는 필요하지 않을 수 있다.
제1 단계는 종양에 특이적이거나, 또는 정상 조직에 비해 종양에 의해 과다 발현되는 종양-연관 항원의 확인을 포함한다. 따라서, 종양 조직 및 정상 조직을 수득한다. 종양 조직 및 정상 조직은 포르말린 및 파라핀 포매로 고정될 수 있거나, 또는 신선하게 단리된 조직일 수 있다. 정상 조직은 백혈구를 함유하는 혈액일 수 있다. 종양 조직 및 정상 조직은 DNA를 단리하기 위해 프로세싱된다. DNA는 종양 DNA와 정상 조직 DNA 사이의 차이를 확인하기 위해 추가로 프로세싱되고 서열 분석된다. 이러한 DNA 차이는 비-동의 돌연변이를 초래하는 단일 또는 이차 또는 고차 뉴클레오티드 변화; 프레임시프트 돌연변이를 야기하는 삽입 및 결실; 교대 스플라이스 변이체를 초래하는 스플라이스 부위 돌연변이; 또는 단일 아미노산 결실을 초래하는, 판독될 수 있는 정지 코돈일 수 있다. 염색체 전위 또는 역위 또는 복제를 통해 추가 돌연변이가 가능할 수 있다. DNA 수준에서의 변화가, 종양-특이적이고 신생항원 또는 예측된 신생항원으로서 지칭될 수 있는 이상한 펩티드 서열 및/또는 이상한 번역 후 변형을 수반하는 펩티드를 야기할 수 있는 많은 방법이 있다.
제2 단계는 단계 1에서 확인된 종양-연관 항원이 실제로 종양에 의해 발현되는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 종양 RNA는 단계 1에 의해 확인된 돌연변이가 종양 세포에 의해 RNA로서 발현되는지를 결정하기 위해 단리되고, 프로세싱되며, 서열 분석된다. 종양 및 정상 조직의 DNA 서열 분석으로부터 확인된 돌연변이를 포함하는 펩티드 항원 (A)은 RNA 발현 수준에 기초하여 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위해 선택될 수 있다. 부가적으로, 비-암성 조직과 비교 시 종양에서 더 높은 수준의 RNA를 생산하는 종양 연관 자기-항원이, 봉입을 위한 펩티드 항원 (A)으로서 선택될 수 있다. RNA 전사체가 확인되지 않은 돌연변이는 일반적으로, 백신 내에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)으로서 선택되지 않는다. 돌연변이 또는 종양-연관 자기-항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 돌연변이체 펩티드 (즉, 신생항원) 또는 종양-연관 자기-항원의 RNA 발현 수준에 기초하여 우선 순위를 매길 수 있으며, 예를 들어, 보다 고도로 발현된 돌연변이 또는 종양-연관 자기-항원이 우선적으로 처리될 수 있다. 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)의 선택에서 다수의 기준이 동시에 사용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 펩티드 (즉, 신생항원) 또는 종양-연관 자기-항원에 의해 함유된 에피토프의 RNA 발현 수준 및 예측된 MHC 결합 친화도는 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 최적의 펩티드 항원 (A) 세트를 선택하기 위해 함께 사용될 수 있다. 이러한 시나리오에서, 매우 고도로 발현되는 중간 정도의 결합 친화도를 갖는 T 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 항원 (A)은, 더 높은 결합 친화도를 갖지만 매우 낮은 수준에서 종양에 의해 발현되는 T 세포 에피토프를 함유하는 상이한 펩티드 항원 (A)보다 우선 순위가 매겨질 수 있다.
또 다른 고려 사항은 클로날 또는 보존된 돌연변이 또는 종양-연관 자기-항원이 종양을 구성하는 상이한 종양 세포 전체에 걸쳐 어떻게 존재하는지이다. 돌연변이의 클론성은 돌연변이의 빈도를 종양 단리된 DNA에서의 야생형 변이체의 빈도와 비교함으로써 평가된다. 종양-연관 신생항원 또는 자기-항원은 이들이 포함하는 돌연변이의 클론성 또는 근사 클론성에 기초하여 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)으로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 항원 (A)은 이들이 종양 세포의 >50%, 종양 세포의 >75%, 종양 세포의 >85%, 종양 세포의 >95% 또는 종양 세포의 >99%에 존재하는 것으로 예측되는 경우에 봉입을 위해 우선적으로 처리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)은 인 실리코 결합 알고리즘에 의해 결정된 바와 같이 주어진 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 대해 항원 내에 함유된 에피토프의 예측된 결합에 기초하여 추가로 우선 순위를 매길 수 있다. 비제한적 예에서, 각각의 대상체의 MHC 유형은 먼저, 서열 분석을 통해 확인된다. 그 다음, 임의의 적합한 수단 (예를 들어, DNA 서열 분석, RNA 발현 또는 질량 분석법)에 의해 확인된 각각의 돌연변이체 펩티드 (즉, 신생항원) 또는 종양-연관 자기-항원은 대상체에 존재하는 각각의 MHC 분자에 대한 예측된 결합에 관하여 시험되며, 인간 환자의 경우에는, 예를 들어, 6개 이하의 독특한 클래스 I MHC 대립 유전자일 수 있다. netMHC 인공 신경망, 안정화된 매트릭스 방법 및 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB) 분석 리소스 컨센서스 알고리즘을 포함하여, MHC 결합을 예측하는데 사용될 수 있는 공개적으로 이용가능한 여러 알고리즘이 있다. 비-공개 알고리즘도 사용될 수 있다. 높은 예측된 결합 친화도를 갖는 에피토프를 함유하는 펩티드 항원 (A)은 낮은 예측된 결합 친화도를 갖는 에피토프를 함유하는 펩티드 항원 (A)보다 면역 반응을 유도할 가능성이 더 높다. 본원에 개시된 예상치 못한 발견은 IEDB 컨센서스 알고리즘에 의해 0.5 백분위수 미만의 예측된 결합 친화도를 갖는 에피토프를 갖는 예측된 신생항원을 포함한 펩티드 항원 (A)의 50% 초과가, 본원에 기재된 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 사용하여 투여되는 경우에 T 세포 반응 (즉, CD8 T 세포 반응)을 생성할 수 있다는 것이다. 이러한 예상치 못한 발견에 기반하여, 예측된 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)을 포함하고, IEDB 컨센서스 알고리즘으로 0.5 백분위수 미만의 결합 친화도를 갖는 에피토프를 함유하는 펩티드 항원 (A)이, 펩티드 항원 접합체를 포함하는 개인화된 암 백신에 사용하기 위해 선택될 수 있다.
부가적으로, MHC에 대한 항원 결합의 질량 분석법 확인, 또는 MHC에 대한 항원의 질량 분석법 결합에 대해 훈련된 알고리즘을 사용하여, 개인화된 암 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 항원 (A)을 선택할 수 있다. 이러한 시나리오에서, 종양 조직은 MHC 분자에 결합된 펩티드를 확인하기 위해 프로세싱된다. 돌연변이체 펩티드 (즉, 신생항원), 프로테아솜 스플라이스-변이체 또는 종양-연관 자기-항원일 수 있는 종양 세포의 표면 상에서는 확인되지만, 정상 세포의 경우에는 그렇지 않은 펩티드가, 개인화된 암 백신에 봉입시키는데 우선적으로 처리될 수 있다. 본원에 개시된 예상치 못한 발견은 종양 세포 상의 MHC-I에 대한 결합이 확인된 질량 분석법에 기초하여 개인화된 암 백신에 사용하기 위해 선택된 예측된 신생항원의 높은 비율 (즉, 7개 중 7개)이, 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에서 펩티드 항원 (A)으로서 전달될 때 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 야기시켰다는 것이며, 이는 질량 분석법, 또는 질량 분석법에 기반한 예측 알고리즘이 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에서 펩티드 항원 (A)으로서 사용하기 위한 신생항원을 선택하기 위한 신뢰할 수 있는 필터일 수 있음을 시사한다.
펩티드 항원 (A)은 또한, T 세포 인식 검정에 기초하여 봉입시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 예측된 신생항원 또는 종양-연관 자기-항원을 포함하는 합성 펩티드 (또는 계내에서 펩티드를 생산하는 발현 시스템)를 대상체로부터의 혈액, 종양 조직 또는 다른 조직으로부터 유래된 T 세포의 시험관내 배양에 부가하는 검정을 사용할 수 있다. 주어진 펩티드의 T 세포 인식은, 예를 들어, ELISpot 검정에 의해 또는 유동 세포계수법에 의해 평가될 수 있다. 시험관내 T 세포 검정에서 인식된 항원은 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 백신에 펩티드 항원 (A)으로서 봉입시키기 위해 우선적으로 처리될 수 있다.
최종적으로, 펩티드 항원 (A)은 임의의 수의 예측 알고리즘에 기반하여 선택될 수 있다. 큰 데이터 세트에 대해 훈련된 예측 알고리즘에 기반하여 면역원성이거나 또는 효능이 있는 것으로 예측되는 펩티드 항원 (A)이 사용될 수 있다. 부가적으로, 예측 알고리즘을 사용하여, 돌연변이체 에피토프에 대해서는 특이적이지만 야생형 에피토프에 대해서는 그렇지 않은 T 세포 반응, 즉 자기-항원에 대해 상호 반응성이 아닌 T 세포 반응을 유발할 것으로 예상되는 펩티드 신생항원을 선택할 수 있다.
상기 방법의 임의의 조합이, 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 사용하기 위한 신생항원 또는 종양-연관 자기-항원 등을 포함하는 펩티드 항원 (A)의 확인 및 선택을 위해 사용될 수 있다.
펩티드 항원 (A) 길이, 및 개인화된 암 백신에 대한 CD8 및 CD4 T 세포 반응의 유도에 대한 효과
비-동의 아미노산 치환을 초래하는 단일 뉴클레오티드 다형성은 전형적으로 8 내지 13개 아미노산 길이인 클래스 I MHC에 결합하는 펩티드 에피토프 내의 임의의 위치에 나타날 수 있다. 따라서, 주어진 클래스 I MHC에 결합할 수 있는 가능한 모든 에피토프를 커버하기 위해, 개인화된 암 백신에 사용하기 위한 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)은 비-동의 돌연변이의 한쪽에 12개의 아미노산을 포함하여, 중간 (13번째) 잔기로서 돌연변이체 아미노산을 수반하는 25개 아미노산 길이의 펩티드를 만들 수 있다. 또 다른 한편으로는, 펩티드 항원 (A)은 클래스 I MHC에 결합하는 것으로 예상되는 최소 에피토프 (8 내지 13개 아미노산 길이)만을 포함할 수 있다. 또 다른 한편으로는, 개인화된 암 백신은 25개의 아미노산 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 (A)과, 신생항원의 예측된 최소 에피토프만을 포함하는 펩티드 항원 (A) 둘 다를 함유할 수 있었다.
MHC 클래스 II의 펩티드 결합 포켓은 전형적으로, 12 내지 16개 아미노산 및 일부에서는 무려 20개 이상의 아미노산의 펩티드에 결합한다. 따라서, 예측된 클래스 I 결합 최소 에피토프 (전형적으로 8 내지 13개 아미노산 길이)만을 함유하는 펩티드 항원 (A)으로 구성되는 개인화된 암 백신은 CD4 T 세포 반응을 유도할 가능성이 없다. 그러나, 25개 아미노산 (또는 "25-mer") 펩티드 항원 (A)을 함유하는 암 백신은 주어진 돌연변이를 표적으로 하는 CD4 T 세포 반응을 항상은 아니지만 유도할 수 있다.
암 백신에서 25개 아미노산 (또는 "25 mer") 펩티드 항원 (A)은 정확히 ~ 7 내지 12개의 아미노산 최소 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)과 비교해서 더 낮은 수준의 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는데, 이는 아마도 상이한 길이의 펩티드 항원의 프로세싱 및 제시 효율에서의 차이에 기인한다. 따라서, 암 백신에 포함된 25개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 최소 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)에 의해 유도된 것과 비교해서 더 작은 규모의 CD8 T 세포 반응을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 암 백신에 포함된 25개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 검출가능한 CD8 T 세포 반응을 초래할 수 없는 반면, 정확히 최소 에피토프를 포함하는 7 내지 12개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 검출가능한 CD8 T 세포 반응을 초래한다. 부가의 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 암 백신에 포함된 25개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 검출가능한 CD4 T 세포 반응을 초래하는 반면, 정확히 최소 에피토프를 포함하는 7 내지 12개 아미노산 펩티드 항원 (A)은 검출가능한 CD4 T 세포 반응을 초래하지 않는다. 이들 예상치 못한 발견에 기반하여, 일부 실시양태에서, 동일한 에피토프, 즉 최소 CD8 T 세포 에피토프 ("Min" 또는 최소 에피토프 (ME)로서 지칭됨)와 25개 아미노산 펩티드 (합성 긴 펩티드 (SLP) 또는 긴 펩티드로서 지칭됨) 둘 다를 포함하는 2개 길이의 펩티드 항원 (A)이, 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에서 펩티드 항원 (A)으로서 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최소 CD4 및 CD8 T 세포 에피토프로 이루어진 펩티드 항원 (A)은 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 포함된다. 부가의 실시양태에서, 최소 CD8 T 세포로 이루어진 펩티드 항원 (A) 및 범용 CD4 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A) 및 임의로 최소 CD4 T 세포 에피토프로 이루어진 펩티드 항원 (A)이, 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 암 백신에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체로 구성된 개인화된 백신에 포함된 펩티드 항원 (A)은 7 내지 35개 아미노산, 전형적으로 15 내지 35개 아미노산, 예를 들어, 25개 아미노산이다.
조합 면역요법
본원에 개시된 펩티드 항원 접합체는 종양 또는 감염성 질환을 치료하기 위해 면역원성 조성물에 사용될 수 있다. 펩티드 항원 접합체는 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 암의 치료를 위해, 펩티드 항원 접합체로 구성된 면역원성 조성물은 임의의 형태의 치료, 예컨대 수술, 방사선 요법 또는 화학 요법 이전, 동안 또는 이후에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 면역 조정제, 예컨대 시토카인 (예를 들어, IL-2), 항-종양 항체, 체크포인트 억제제 (예컨대, 항-PD1) 항체, 또는 면역-억제를 역전시키거나, 종양 세포를 직접 사멸시키거나 또는 종양에 대항한 면역 반응을 증강시키는 다른 작은 분자 또는 생물제제와 조합하여 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체에 기반한 암 백신은 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD1, 항-PDL1, 항-CTLA4)와 조합하여 종양 보유 대상체에게 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 암 백신, 예를 들어, 개인화된 암 백신은 체크포인트 억제제의 투여 전에 대상체에게 제공된다. 본원에 개시된 펩티드 항원 접합체는 또한, 이종 프라임-부스트 면역화, 예컨대 펩티드 항원 접합체로의 프라임 또는 부스트, 및 이종 백신, 예컨대 바이러스 벡터로의 프라임 또는 부스트에 사용될 수 있다.
조성물 제형화
본원에 개시된 펩티드 항원 접합체로 구성된 면역원성 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제조되고 본원에 기재된 바와 같은 치료학상 유효량의 하나 이상의 면역원을 포함하는 제약 조성물로서 제형화될 수 있다. 개시된 화합물의 치료상 유효량은 투여 경로, 대상체의 종 및 치료받는 대상체의 물리적 특징에 좌우될 것이다. 고려될 수 있는 구체적 요인은 질환 중증도 및 병기, 체중, 식이 요법 및 공동 약물을 포함한다. 개시된 화합물의 치료상 유효량을 결정하기 위한 이들 요인의 관계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다.
대상체에게 투여하기 위한 면역원성 조성물은 제약 조성물일 수 있으며, 선택된 분자 이외에, 적어도 하나의 추가의 제약상 허용되는 첨가제, 예컨대 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 계면 활성제 등을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한, 하나 이상의 부가의 활성 성분, 예컨대 항미생물제, 마취제 등을 포함할 수 있다. 이들 제형에 유용한 제약상 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)]에는 본원에 개시된 화합물의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제형이 기재된다.
일반적으로, 담체의 성질은 이용되는 특별한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 통상적으로, 비히클로서 제약상 및 생리학상 허용되는 유체, 예컨대 물, 생리 식염수, 균형 잡힌 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 포함하는 주사용 유체를 함유한다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여되는 제약 조성물은 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
면역원성 조성물을 제형화하기 위해, 개시된 나노입자 성분 또는 개시된 나노입자 성분을 함유하는 용액은 다양한 제약상 허용되는 첨가제 뿐만 아니라 나노입자의 분산을 위한 기제 또는 비히클과 조합될 수 있다. 원하는 첨가제는 pH 제어제, 예컨대 아르기닌, 수산화나트륨, 글리신, 염산, 시트르산 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 국소 마취제 (예를 들어, 벤질 알콜), 등장화제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨), 흡착 억제제 [예를 들어, 트윈 80 또는 미글리올(Miglyol) 812], 용해도 증강제 (예를 들어, 시클로덱스트린 및 그의 유도체), 안정화제 (예를 들어, 혈청 알부민) 및 환원제 (예를 들어, 글루타티온)가 포함될 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 다른 적합한 아주반트 중에서, 수산화 알루미늄 [예를 들어, 암포겔(Amphogel), 와이어쓰 래보러토리즈 (Wyeth Laboratories; 미국 뉴저지 매디슨)], 프로인트 아주반트, MPL™ [3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 코릭사 (Corixa; 미국 인디애나주 해밀턴)] 및 IL-12 [제네틱스 인스티튜트 (Genetics Institute; 미국 매사추세츠주 캠브리지)]와 같은 아주반트가 조성물에 포함될 수 있다. 조성물이 액체인 경우, 단일성으로서 취한 0.9% (w/v) 생리 식염수 용액의 등장성과 관련하여 측정된 바와 같은 제형의 등장성은 전형적으로, 실질적인 비가역적 조직 손상이 투여 부위에서 유도되지 않을 값으로 조정된다. 일반적으로, 용액의 등장성은 약 0.3 내지 약 3.0, 예컨대 약 0.5 내지 약 2.0, 또는 약 0.8 내지 약 1.7의 값으로 조정된다.
본 개시내용의 면역원성 조성물은 전형적으로, 제조, 저장 및 사용 조건 하에서 멸균되고 안정하다. 멸균 용액은 필요에 따라 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 화합물을 혼입한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 화합물 및/또는 다른 생물학적 활성제를, 기본 분산 매질 및 본원에 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하며, 이는 사전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 부가의 원하는 성분이 더해진 화합물의 분말을 산출한다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 면역원성 조성물, 활성 성분, 및/또는 포유 동물 대상체에서 질환 및 다른 병태의 예방 및 치료에 사용하기 위해 이를 투여하기 위한 수단을 함유하는 키트, 패키지 및 다중 용기 유닛을 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 키트는 본원에 기재된 면역원성 조성물 중 하나 이상을 함유하는 용기 또는 제형을 포함한다. 한 예에서, 면역원성 조성물은 대상체에게 전달하기 위한 제약 제제로 제형화된다. 면역원성 조성물은 벌크 분배 용기 또는 유닛 또는 다중 단위 투여 형태에 임의로 함유된다. 임의적 분배 수단, 예를 들어 폐 또는 비강내 분무 어플리케이터가 제공될 수 있다. 패키징 물질은 임의로, 치료 목적이 무엇인가에 관한 것 및/또는 그와 함께 패키징된 의약품이 사용될 수 있는 방식에 관하여 표시하는 라벨 또는 설명서를 포함한다.
면역 반응을 유도하는 방법
본원에 기재된 바와 같은 펩티드 항원 (A)을 포함하는 면역원성 조성물은 대상체에서 펩티드 항원 (A)에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 개시된 방법으로부터 혜택을 얻을 수 있는 대상체는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 감염체에 대한 노출 또는 노출가능성으로 인해, 펩티드 항원을 포함하는 감염체에 의한 감염을 갖거나 또는 감염이 발생할 위험이 있는 대상체가 치료를 위해 선택된다. 치료상 유효량의 개시된 면역원성 조성물의 투여 후, 대상체는 감염, 감염과 관련된 증상 또는 둘 다에 대해 모니터링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 암, 예컨대 악성 종양을 갖거나 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체가 치료를 위해 선택된다. 치료상 유효량의 개시된 면역원의 투여 후, 대상체는 암의 존재, 종양 부담의 감소, 암의 임의의 적절한 증상 또는 그의 조합에 대해 모니터링될 수 있다.
본 개시내용의 치료제 및 방법으로 치료하기 위한 전형적인 대상체는 인간 뿐만 아니라 비-인간 영장류 및 다른 동물을 포함한다. 본 개시내용의 방법에 따라 예방 또는 치료를 위한 대상체를 확인하기 위해, 허용된 스크리닝 방법을 이용하여 표적화되거나 또는 의심되는 질환 또는 병태와 연관된 위험 인자를 결정하거나, 또는 대상체에서 기존의 질환 또는 병태의 상태를 결정한다. 이러한 스크리닝 방법은, 예를 들어, 표적화되거나 또는 의심되는 질환 또는 병태와 연관될 수 있는 환경적, 가족성, 직업적 및 다른 위험 요인을 결정하기 위한 통상적인 워크-업 뿐만 아니라 질환 또는 병태를 검출하고/하거나 그 특징을 규명하기 위해 관련 기술분야에서 이용가능하고 널리 공지되어 있는 진단 방법, 예컨대 다양한 ELISA 및 다른 면역검정 방법을 포함한다. 이들 및 다른 일상적인 방법은 임상의가 본 개시내용의 방법 및 제약 조성물을 사용하여 치료를 필요로 하는 환자를 선택할 수 있게 한다. 이들 방법 및 원리에 따라, 조성물은 본원의 교시, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 통상적인 방법에 따라, 독립적인 예방 또는 치료 프로그램으로서, 또는 다른 치료에 대한 후속 조치, 보조 또는 협조적 치료 요법로서 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 펩티드 항원을 포함한 치료상 유효량의 면역원성 조성물의 투여는 예방 또는 치료 목적을 위한 것일 수 있다. 예방적으로 제공되는 경우, 면역원성 조성물은 임의의 증상에 앞서, 예를 들어 감염 또는 종양의 발생에 앞서 제공된다. 면역원성 조성물의 예방적 투여는 질환 또는 병태의 후속 발생을 예방 또는 완화시키는 역할을 한다. 따라서 일부 실시양태에서, 방법은 감염에 걸릴 위험이 있거나 또는 종양을 발생시킬 위험이 있는 대상체를 선택하고, 치료상 유효량의 개시된 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 면역원성 조성물은 예상되는 중증도, 감염 또는 종양의 지속 기간 또는 정도, 및/또는 임의의 연관된 질환 증상을 약화시키기 위해, 감염체에 대한 예상되는 노출, 또는 종양의 발생 전에 제공될 수 있다.
치료적으로 제공되는 경우, 개시된 면역원성 조성물은 질환 또는 병태의 증상의 발병 시점 또는 후에, 예를 들어 감염 증상의 발생, 감염의 진단 또는 종양 증상의 발생 후에, 또는 종양의 진단 후에 제공될 수 있다. 감염 또는 종양의 치료는 대상체에서 감염 또는 종양의 징후 또는 증상을 지연시키고/시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하는 치료는 대상체의 생존 시간을 연장시킨다.
면역원성 조성물은 협조적 면역화 프로토콜 또는 조합 제형화에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료상 유효량의 개시된 면역원성 조성물은 대상체에서 감염체를 치료 또는 억제하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 감염체는 바이러스, 박테리아 및 진균을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대상체를 감염시킬 수 있는 인자이다. 감염체에 의한 감염이 있거나, 또는 감염이 있는 것으로 의심되거나, 또는 감염 발생의 위험이 있는 대상체가 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감염체는 전술한 바와 같은 바이러스, 박테리아 또는 진균이고, 펩티드 항원은 특별한 바이러스, 박테리아 또는 진균으로부터의 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료상 유효량의 개시된 면역원성 조성물은 대상체에서 종양 및/또는 암을 치료 또는 억제하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 종양 및/또는 암이 있거나, 또는 종양 및/또는 암이 있는 것으로 의심되거나, 또는 종양 및/또는 암 발생의 위험이 있는 대상체가 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 종양 및/또는 암을 치료하는 것은 종양의 성장 및/또는 증식을 감소시킨다. 종양은 임의의 관심 종양일 수 있고 양성 또는 악성일 수 있다.
종양의 치료는 일반적으로, 종양의 진단 후 또는 전구체 상태의 개시 (예컨대 이형성증 또는 양성 종양의 발생) 후에 개시된다. 치료는 암의 초기 단계에서 개시될 수 있으며, 예를 들어, 대상체가 병태의 증상을 나타내기 전에, 예컨대 병기 I 진단 동안 또는 이형성증이 진단될 때 개시될 수 있다. 그러나, 치료는 예컨대 병기 I, 병기 II, 병기 III 및 병기 IV 암이지만 이에 제한되지는 않는 질환의 임의의 병기 동안 개시될 수 있다. 일부 예에서, 치료는 악성 또는 심지어 전이성 종양으로 전환될 수 있는 양성 종양을 갖는 이들 대상체에게 투여된다.
악성 암과 같은 병태의 발생 후 개시된 치료는 병태 중 하나의 증상의 중증도를 감소시키거나, 또는 그 증상을 완전히 제거하거나, 또는 전이, 종양 용적 또는 종양의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 예에서, 종양은 치료 후 검출할 수 없게 된다. 본 개시내용의 한 측면에서, 전이와 같은 종양의 형성은 지연, 예방 또는 감소된다. 또 다른 측면에서, 원발성 종양의 크기가 감소된다. 추가 측면에서, 종양의 증상이 감소된다. 또 다른 측면에서, 종양 용적이 감소된다.
예를 들어, 대상체가 종양을 갖고 있는지를 결정하기 위해, 개시된 요법을 개시하기 전에 대상체를 스크리닝할 수 있다. 종양의 존재는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 전형적으로 세포학적 및 형태학적 평가를 포함한다. 종양은 확립된 종양일 수 있다. 세포는 생검으로부터 수득된 세포를 포함하여 생체내 또는 생체 외일 수 있다. 종양의 존재는 종양이 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있다는 것을 표시한다.
치료상 유효량은 질환의 중증도 및 환자 건강의 일반적인 상태에 따라 좌우될 것이다. 치료상 유효량은 임상의 또는 다른 유자격 관찰자가 지적한 바와 같이, 증상(들)의 주관적 완화 또는 객관적으로 확인가능한 개선을 제공하는 양이다. 한 실시양태에서, 치료상 유효량은 종양 성장을 억제하는데 필요한 양, 또는 종양의 징후 또는 증상을 감소시키는데 유효한 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료상 유효량은 감염체에 의한 감염을 억제하는데 필요한 양, 또는 감염의 징후 또는 증상을 감소시키는데 유효한 양이다. 투여되는 작용제의 치료상 유효량은 원하는 효과 및 치료될 대상체에 따라 다양할 수 있다. 일부 예에서, 치료량은 환자의 종양 부담을 없애거나 또는 감소시키거나, 또는 전이성 세포의 증식을 예방 또는 감소시키거나, 또는 대상체에서 감염체의 부하를 감소시키는 양이다.
면역원성 조성물의 실제 투여량은 대상체의 질환 적응증 및 특별한 상태 (예를 들어, 대상체의 연령, 크기, 체력, 증상의 정도, 감수성 요인 등), 투여 시간 및 경로, 공동으로 투여되는 다른 약물 또는 치료 뿐만 아니라 대상체에서 원하는 활성 또는 생물학적 반응을 유발하기 위한 화합물의 특이적 약리학과 같은 요인에 따라서 다양할 것이다. 투여 요법은 최적의 예방적 또는 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료상 유효량은 또한, 임상적 관점에서 치료상 유익한 효과가 화합물 및/또는 다른 생물학적 활성제의 임의의 독성 또는 유해한 부작용을 능가하는 양이다.
표적 부위 (예를 들어, 폐 또는 전신 순환계)에서 원하는 농도를 유지하기 위해 주치의에 의해 투여량을 변화시킬 수 있다. 전달 방식, 예를 들어, 경피, 직장, 경구, 폐, 골내 또는 비내 전달 대 정맥내 또는 피하 또는 근육내 전달에 기반하여 더 높거나 더 낮은 농도가 선택될 수 있다. 투여량은 또한, 투여된 제형, 예를 들어, 폐내 스프레이 대 분말, 지속된 방출 경구 대 주사된 미립자 또는 경피 전달 제형의 방출 속도 등에 기반하여 조정될 수 있다.
국소 및 전신 투여를 포함한 임의의 투여 방법이 개시된 치료제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 국소, 경구, 혈관내, 예컨대 정맥내, 근육내, 복강내, 비내, 피내, 척수강내 및 피하 투여가 사용될 수 있다. 특별한 투여 방식 및 투여 요법은 그 사례의 세부사항 (예를 들어, 대상체, 질환, 관련 질환 상태, 및 처치가 예방적인지의 여부)을 고려하여 주치의에 의해 선택될 것이다. 2가지 이상의 작용제 또는 조성물이 투여되는 경우, 하나 이상의 투여 경로가 사용될 수 있다.
개시된 치료제는 정확한 투여량의 개별 투여에 적합한 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 또한, 개시된 치료제는 단일 용량 또는 다중 용량 스케줄로 투여될 수 있다. 다중 용량 스케줄은 1차 치료 과정이 2개 이상의 별도의 용량, 예를 들어 1 내지 10개의 용량을 이용한 다음, 조성물의 작용을 유지 또는 강화하는데 필요한 후속 시간 간격으로 다른 용량이 제공될 수 있는 것이다. 치료는 수일 내지 수개월, 또는 심지어 수년에 걸쳐 화합물을 매일 또는 수일 투여하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 투여 요법은 또한, 적어도 부분적으로, 치료될 대상체의 특별한 필요에 기반하여 결정될 것이며 투여 실무자의 판단에 의존할 것이다.
실시예
화합물 1
Figure pct00051
2B로서 지칭된 화합물 1인 1-(4-아미노부틸)-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민을 도 3에 도시된 계획에 따라 합성하였다.
1-c. 중간체 1-b인 2,4-퀴놀린디올로부터 출발하여, 기존에 보고된 바와 같이 제조하였다 (Lynn GM, et al., Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015). 210 mL의 트리에틸아민 (TEA) (10% w/w) 중의 21 g의 1-b (87.8 mmol, 1 eq)에 16.34 g (87.8 mmol, 1 eq)의 N-boc-1,4-부탄디아민을 격렬하게 교반시키면서 부가하였다. 반응 혼합물을 70℃로 가열하고 HPLC에 의해 모니터링하여, 본 반응이 2시간 후에 완료되었다는 것을 확인하였다. 트리에틸아민을 진공 하에 제거하고, 이로써 생성된 오일을 200 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 3x100 mL DI H2O로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 진공 하에 제거하고, 이로써 생성된 오일을 1:1 (v:v) 헥산 및 디에틸 에테르로 연마하여 30.7 g의 중간체 1-c의 황색 결정을 산출하였다. C18H23ClN4O4에 대한 계산된 MS (APCI), m/z 394.1, 실측치, 394.9.
1-d. 30.7 g (76.4 mmol)의 중간체 1-c를, 아르곤과 함께 버블링시킨 파르(Parr) 반응기 용기에서 300 mL의 에틸 아세테이트에 용해시킨 다음, 3 g의 탄소 상 10% 백금을 부가하였다. 반응 용기를 아르곤 하에 유지시킨 다음, 비우고 H2(g)로 수 차례 가압시킨 후, 격렬하게 진탕시키면서 55 PSI H2(g)로 가압시켰다. 55 PSI에서 압력이 안정화될 때까지 H2(g)를 연속적으로 부가하였고, 이 시점에서 반응이 완료된 것으로 결정되었다. 이어서, 파르 반응기로부터의 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 증발 건조시켜 황색 오일을 수득하고, 이를 1:1 헥산 / 에테르로 연마하여 백색 결정을 산출하고, 이를 여과에 의해 수집하여 27.4 g의 1-d의 분광학적으로 순수한 백색 결정을 수득하였다. C18H25ClN4O2에 대한 계산된 MS (APCI), m/z 364.2, 실측치, 365.2.
1-e. 50 mL의 THF 중 10 g (27.4 mmol, 1 eq)의 1-d에 7.7 mL의 트리에틸아민 (54.8 mmol, 2 eq)을 부가한 다음, 반응 혼합물을 얼음 위에 놓아두는 동안 격렬하게 교반시키면서 30 mL의 THF 중 3.6 g의 발레로일 클로라이드 (30.1 mmol, 1.1 eq)에 적가하였다. 90분 후, 빙욕을 제거하고 THF를 진공 하에 제거하면, 황색 오일이 생성되는데, 이를 100 mL의 디클로로메탄 (DCM)에 용해시키고, 3x50 mL의 pH 5.5 100 mM 아세테이트 완충제로 세척하였다. DCM를 오일 중 진공 하에 제거하고, 에틸 아세테이트로 연마하여 10.4 g의 백색 고체를 수득하며, 이를 1 g의 CaO (s)과 함께 메탄올에 용해시키고, 격렬하게 교반시키면서 5시간 동안 100℃ 하에 가열하였다. 반응 혼합물을 여과시키고 건조시켜 10.2 g의 회백색 고체인 중간체 1-e를 산출하였다. C23H31ClN4O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 430.21, 실측치, 431.2.
1-f. 10.2 g (23.7 mmol, 1 eq)의 1-e에 30.4 g (284 mmol, 12 eq)의 벤질아민 액체를 부가하고, 격렬하게 교반시키면서 110℃로 가열하였다. 10시간 후에 반응을 완료하고, 반응 혼합물을 200 mL 에틸 아세테이트에 부가하고, 4x100 mL 1 M HCl로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 진공 하에 제거하고, 이로써 생성된 오일을 에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 10.8 g의 분광학적으로 순수한 백색 결정의 중간체 1-f를 수득하였다. C30H39N5O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 501.31, 실측치, 502.3.
화합물 1. 10.8 g (21.5 mmol)의 1-f를 54 mL의 진한 (>98%) H2SO4에 용해시키고, 반응 혼합물을 3시간 동안 격렬하게 교반시켰다. 3시간 후, 점성의 적색 반응 혼합물을 격렬하게 교반시키면서 500 mL의 DI H2O에 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반시킨 다음, 셀라이트를 통해 여과시킨 후, 용액의 pH가 ~ pH 10이 될 때까지 10 M NaOH를 부가하였다. 이어서, 수성 층을 6x200 mL의 DCM으로 추출하고, 이로써 생성되는 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 진공 하에 감소시켜 분광학적으로 순수한 백색 고체를 산출한다. 1H NMR (400 MHZ, DMSO-d6) δ 8.03 (d, J = 8.1 HZ, 1H), 7.59 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.47 (s, 2H), 4.49 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 7.78 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.64 Hz, 1H), 1.80 (m, 4H), 1.46 (sep, J= 7.75 Hz, 4H), 0.96 (t, J = 7.4 Hz, 3H). C18H25N5에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 311.21, 실측치 312.3.
화합물 2
Figure pct00052
2BXy로서 지칭된 화합물 2, 1-(4-(아미노메틸)벤질)-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민은 기존에 보고되었다 (문헌 [Lynn GM, et al., In vivo characterization of the physicochemical properties of polymer-linked TLR agonists that enhance vaccine immunogenicity. Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015, 및 Shukla NM, et al. Syntheses of fluorescent imidazoquinoline conjugates as probes of Toll-like receptor 7. Bioorg Med Chem Lett 20(22):6384-6386, 2010] 참조). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.35 - 7.28 (m, 1H), 7.25 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.06 - 6.98 (m, 1H), 6.94 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.50 (s, 2H), 5.81 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 2.92-2.84 (m, 2H), 2.15 (s, 2H), 1.71 (q, J = 7.5Hz, 2H), 1.36 (q, J = 7.4Hz, 2H), 0.85 (t, J = 7.4 Hz, 3H). C22H25N5에 대한 계산된 MS (APCI), m/z 359.2, 실측치 360.3.
화합물 3
Figure pct00053
DBCO-2BXy3, 2BXy3 또는 DBCO-(Glu(2BXy)3)으로서 지칭된 화합물 3을 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-(Glu)3-NH2 전구체로부터 출발하여 합성하였다. 50 mg의 Fmoc-(Glu)3-NH2 (0.08 mmol, 1 eq), 143 mg의 화합물 2 (0.40 mmol, 5 eq), 84 mg의 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 (CDMT) (0.48 mmol, 6 eq) 및 48.5 mg의 4-메틸모르폴린 (NMM) (0.48 mmol, 6 eq)을 주위 공기 하의 실온에서 격렬하게 교반시키면서 3.25 mL의 DMSO에 부가하였다. 반응 진행을 HPLC (AUC 254 nm)에 의해 모니터링하였다. 1 부가 당량의 화합물 2 및 2 부가 당량의 CDMT와 NMM 둘 다를 30분 후에 부가하였다. 2시간 후, 반응을 완료하고, 반응 혼합물을 50 mL의 1 M HCl 용액에 부가하여 Fmoc 보호된 중간체를 침전시키고, 이를 4℃ 하에 10분 동안 3000 g로 상기 용액을 원심분리시킴으로써 수집하였다. HCl 용액을 버리고 Fmoc 보호된 중간체를 고체 백색 펠릿으로서 수집하였다. 백색 고체를 50 mL의 1 M HCl 용액에 재현탁시키고 5분 동안 4℃ 하에 3000 g로 회전시켰으며: 1 M HCl 용액을 버리고 산물을 고체 펠릿으로서 수집하였다. 이러한 프로세스를 반복한 다음, 고체를 수집하고 진공 하에 건조시켜 156.1 mg의 Fmoc 보호된 중간체를 정량적 수율로 산출하였다. 이어서 Fmoc 보호된 산물을 실온 하에 30분 동안 DMF 용액 중 1.5 mL의 20% 피페리딘에 부가하여 탈보호된 산물을 산출한 다음, 50 mL의 에테르로부터 침전시키고 30분 동안 4℃ 하에 3000 g로 원심분리시켰다. 산물을 백색 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 다음, 진공 하에 건조시켜 126.4 mg의 중간체를 산출하였다. 이어서, 이로써 생성된 중간체인 NH2-(Glu-2BXy)3-NH2 (0.042 mmol, 1 eq) 60 mg을 실온 하에 6시간 동안 1 mL의 DMSO 중의 18.6 mg (0.046 mmol, 1.1 eq)의 DBCO-NHS 에스테르 (미국 애리조나주 스코츠데일) 및 8.5 uL의 트리에틸아민 (0.084 mmol, 2 eq)과 반응시켰다. 이로써 생성된 산물인 화합물 3을, 애질런트(Agilent) 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에 12분에 걸쳐 30-70% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 7.0분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 40.12 mg (55.7% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C100H106N20O8에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1714.85, 실측치 858.9 (M/2)+.
화합물 4
Figure pct00054
DBCO-2BXy5, 2BXy5 또는 DBCO-(Glu(2BXy)5)로서 지칭된 화합물 4를, 화합물 2의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-(Glu)5-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 4를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 38-48% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 8.0분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 45.9 mg (63.4% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C154H166N32O12에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2655.34, 실측치 886.6 (M/3)+.
화합물 5
Figure pct00055
DBCO-2B5, 2B5 또는 DBCO-(Glu(2B)5)로서 지칭된 화합물 5를, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-(Glu)5-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 5를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 33-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 10.0분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 25.2 mg (62.6% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C134H166N32O12에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2415.34, 실측치 1209.3 (M/2)+.
화합물 6
Figure pct00056
DBCO-2B3W2, 2B3W2 또는 DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2)로서 지칭된 화합물 6을, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 6을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 33-47% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 8분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 197 mg (50.6% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C110H126N24O10에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1943.01, 실측치 973.0 (M/2)+.
화합물 7
Figure pct00057
DBCO-2B2W3, 2B2W3 또는 DBCO-(Glu(2B)2(Trp)3)로서 지칭된 화합물 7을, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-Trp-Glu-Trp-Glu-Trp-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 7을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 35-65% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 9분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 11.6 mg (62.5% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C98H106N20O9에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1706.85, 실측치 854.9 (M/2)+.
화합물 8
Figure pct00058
DBCO-2B2W8, 2B2W8 또는 DBCO-(Glu(2B)2(Trp)8)로서 지칭된 화합물 8을, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 8을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 35-85% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 8.0분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 3.3 mg (16.3% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C153H156N30O14에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2637.24, 실측치 1320.2 (M/2)+.
화합물 9
Figure pct00059
DBCO-2B1W4, 2B1W4 또는 DBCO-(Glu(2B)1(Trp)4)로서 지칭된 화합물 9를, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 9를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 50-55% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 8.9분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 9.7 mg (55.4% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C86H86N16O8에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1470.68, 실측치 736.6 (M/2)+.
화합물 10
Figure pct00060
DBCO-W3, W3 또는 DBCO-(Trp)3으로서 지칭된 화합물 10을, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 50.2 mg (0.08 mmol, 1 eq)의 트리펩티드 전구체 NH2-(Trp)3-NH2를 1.5 mL의 DMSO 중의 35 mg의 DBCO-NHS (0.096 mmol, 1.1 eq) 및 44 mg의 트리에틸아민 (0.44 mmol, 5 eq)과 반응시킴으로써 합성하였다. 화합물 10을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-95% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 9분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 31.2 mg (41.5% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다.
화합물 11
Figure pct00061
DBCO-W5, W5 또는 DBCO-(Trp)5로서 지칭된 화합물 11을, DBCO-NHS와의 접합을 위한 펩티드 전구체로서 NH2-(Trp)5-NH2 (서열식별번호: 70)를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 10에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 11을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-95% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 ~ 10분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 28.7 mg (44.1% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C74H66N12O7에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1234.52, 실측치 1235.6 (M+H)+.
화합물 12
Figure pct00062
DBCO-2BXy3W2, 2BXy3W2 또는 DBCO-(Glu(2BXy)3(Trp)2)로서 지칭된 화합물 12를, 출발 물질로서 Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2 및 화합물 2를 사용하여 제조하였다. 500 mg의 Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2 (0.5 mmol, 1 eq), 595.6 mg의 티아졸린-2-티올 (TT) (5 mmol, 10 eq), 및 575.7 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) (3 mmol, 6 eq)를 26 mL의 DCM에 현탁시켰다. 18.3 mg의 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP) (0.2 mmol, 0.3 eq)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 교반시켰다. 반응 진행을 분석적 HPLC에 의해 모니터링하였다. 4시간 후, 부가의 4 당량의 TT 및 2 당량의 EDC를 부가하였다. 밤새 교반시킨 후, 2 당량의 TT 및 1/2 당량의 EDC를 부가하였다. 6시간 후, 반응을 완료하였다. DCM을 진공 하에 제거하고, 고체를 6 mL의 건조 DMSO에 흡수시켰다. 539.3 mg의 화합물 2 (1.5 mmol, 3 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 이어서, 접합된 중간체를 300 mL의 1 M HCl로부터 침전시키고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 펠릿을 수집하고, 1 M HCl로 한 번 더 세척하며 DI 수로 1회 세척하였다. 최종 수집된 펠릿을 동결시키고 진공 하에 건조시켰다. 809.06 mg의 Fmoc-2BXy3W2-NH2 (0.4 mmol, 1 eq)를 DMF 중 4 mL의 20% 피페리딘에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 이어서, 탈보호된 중간체를 100 mL의 에테르로부터 침전시키고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 중간체를 산출하였다. 729 mg NH2-2BXy3W2-NH2 (0.4 mmol, 1 eq)를 6 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. 488.8 mg의 DBCO-NHS (1.2 mmol, 3 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 이로써 생성되는 산물을 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 36-46% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시키며, 냉동 건조시켜 239 mg (38.1% 수율)의 분광학적으로 순수한 백색 분말을 수득하였다. C122H126N24O10에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2087.65 실측치 697 (m/3)+.
화합물 13
Figure pct00063
DBCO-2B6W4, 2B6W4 또는 DBCO-(Glu(2B)6(Trp)4)로서 지칭된 화합물 13을, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-(Glu-Trp-Glu-Trp-Glu)2-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 13을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 24-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C201H236N46O18에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 3582.4, 실측치 717.7 (M/5)+.
화합물 14
Figure pct00064
DBCO-2B4W6, 2B4W6 또는 DBCO-(Glu(2B)4(Trp)6)로서 지칭된 화합물 14를, 화합물 1의 접합을 위한 출발 물질로서 Fmoc-(Trp-Glu-Trp-Glu-Trp)2-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 14를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 24-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C177H196N38O16에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 3111.7, 실측치 777.5 (M/4)+.
화합물 15
Figure pct00065
DBCO-2BXy1W4, 2BXy1W4 또는 DBCO-(Glu(2BXy)1(Trp)4)로서 지칭된 화합물 15를, 출발 물질로서 Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 15를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 16분에 걸쳐 40-70% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 3.4 mg (73.3% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C90H85N15O9에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1519.67, 실측치 760.5 (M/2)+.
화합물 16
Figure pct00066
DBCO-(GG2B)5, 2B5G10 또는 DBCO-(Glu(2B)5(Gly)10)로서 지칭된 화합물 16을, 출발 물질로서 Fmoc-(Gly-Gly-Glu)5-NH2 및 화합물 1을 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 3에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 16을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 22-42% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 7분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 22.8 mg (36.2% 수율)의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C154H196N42O22에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2985.51, 실측치 598.5 (M/5)+.
화합물 17
Figure pct00067
DBCO-(GG2BGGW)2GG2B, 2B3W2G10 또는 DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2(Gly)10)로서 지칭된 화합물 17을, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 전구체 및 화합물 1로부터 합성하였다. 235.4 mg의 Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 (0.15 mmol, 1 eq)를 DMF 중 2 mL의 20% 피페리딘에 용해시켰다. 30분 후, 반응을 완료시키고, 산물을 100 mL의 에테르로부터 침전시키며, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 ~ 200 mg의 탈보호된 중간체를 산출하였다. 200 mg (0.15 mmol, 1 eq)의 NH2-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2를 2 mL의 건조 DMSO에 용해시키고, 89.73 mg의 DBCO-NHS (0.22 mmol, 1.5 eq)를 부가한 다음, TEA (0.22 mmol, 1.5 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 이로써 생성된 DBCO 중간체를, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-50% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 중간체를 수득하였다. 25 mg의 DBCO-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 (0.015 mmol, 1 eq) 및 17.11 mg의 화합물 1 (0.055 mmol, 3.6 eq)을 1.2 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. TEA (0.183 mmol, 12 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 5분 동안 실온 하에 교반시켰다. 19.17 mg의 HATU (0.05 mmol, 3.3 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 교반시켰다. 반응의 진행을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 1.2 부가 당량의 화합물 1 및 1.1 당량의 HATU를 1시간 후에 부가하였다. 2시간 후, 반응을 완료하였다. 이로써 생성된 산물을 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-60% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 백색 분말을 수득하였다. C130H156N34O20에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2515.96, 실측치 839 (m/3)+.
화합물 18
Figure pct00068
Bis(TT)로서 지칭된 화합물 18을, 출발 물질로서 수베르산 및 2-티아졸린-2-티올 (TT)을 사용하여 합성하였다. 간단히, 500 mg의 수베르산 (2.87 mmol, 1 eq), 752.7 mg의 TT (6.31 mmol, 2.2 eq) 및 1.431 g의 EDC (7.46 mmol, 2.6 eq)를 17.5 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. 70.15 mg의 DMAP (0.57 mmol, 0.2 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 1 M HCl로 2회 세척하고 DI 수로 1회 세척하였다. 유기 분획을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에 증발시켜 황색 고체를 정량적 수율로 제공하였다.
화합물 19
Figure pct00069
2B-TT로서 지칭된 화합물 19를, 출발 물질로서 화합물 18 및 화합물 1을 사용하여 합성하였다. 간단히, 50 mg (0.16 mmol, 1 eq)의 화합물 1을 0.6 mL의 메탄올에 용해시키고, 1.93 mL의 DCM 중의 301.1 mg의 화합물 18 (0.8 mmol, 5 eq)의 격렬하게 교반하는 용액에 적가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 칼럼 상으로 직접 주사하고, 2-단계 구배: 5 칼럼 용적 (CV) 상의 DCM 중 5% 메탄올에 이어, 20 CV 상의 DCM 중 5-50% 메탄올 구배를 사용하여 플래시 크로마토그래피함으로써 정제한다. 분획을 합하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. C29H40N6O2S2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 568.27, 실측치 569.3 (m+H)+.
화합물 20
Figure pct00070
DBCO-(2BGWGWG)5, 2B5W10G15 또는 DBCO-(Glu(2B)5(Trp)10(Gly)15)로서 지칭된 화합물 20을, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-(Lys-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly)5-NH2 펩티드 전구체 및 화합물 19로부터 합성하였다. 49.8 mg (0.01 mmol, 1 eq)의 Fmoc-(Lys-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly)5-NH2를 0.5 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. 이러한 용액에, 건조 DMSO 중 40 mg/mL 원액으로서 0.492 mL의 화합물 19 (0.03 mmol, 2.5 eq)을 부가하였다. TEA (0.01 mmol, 1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 4시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 10분에 걸쳐 45-65% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 이용하는 분석적 HPLC는 펜타-치환된 중간체로의 완전한 전환을 나타내었다. 아미노-2-프로판올 (0.03 mmol, 2.5 eq)을 부가함으로써 반응을 켄칭한 다음, DMF 중 0.5 mL의 20% 피페리딘을 부가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 50 mL의 에테르에 부가하고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 다음, 진공 하에 건조시켜 탈보호된 중간체를 산출시킨다. 73.4 mg의 탈보호된 중간체 (0.0131 mmol, 1 eq)를 0.5 mL의 건조 DMSO에 용해시킨 다음, 0.066 mL (0.0196 mmol, 1.5 eq)의 DBCO-NHS (40 mg/mL) 및 TEA (0.0131 mmol, 1 eq)를 부가하였다. 반응물을 1시간 동안 실온 하에 교반시킨 다음, 아미노-2-프로판올 (0.0196 mmol, 1.5 eq)을 부가함으로써 켄칭하였다. 이어서, 산물을 50 mL의 1 M HCl로부터 침전시키고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 1 M HCl로 한 번 더 세척하고 DI 수로 한 번 더 세척하였다. 최종 수집된 펠릿을 진공 하에 건조시켜 15.1 mg (26% 수율)의 최종 산물을 산출하였다. C319H396N72O42에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 5909.1 실측치 1183(m/5)+.
화합물 21
Figure pct00071
Mal-2B3W2 또는 Mal-(Glu(2B)3(Trp)2)로서 지칭된 화합물 21을, Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2 및 화합물 1로부터 출발하여 합성하였다. 100 mg의 Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2 (0.1 mmol, 1 eq) 및 112.1 mg의 화합물 1 (0.36 mmol, 3.6 eq)을 8 mL의 건조 DMF에 용해시켰다. TEA (1.2 mmol, 12 eq)를 부가하고, 용액을 5분 동안 교반시키면서 빙욕으로 냉각시켰다. HATU (0.33 mmol, 3.3 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 4℃ 하에 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 50 mL의 1 M HCl에 부가하고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 1 M HCl로 한 번 더 세척하고 DI 수로 한 번 더 세척하여 접합된 중합체를 제공한다. 이어서, 188 mg의 Fmoc-2B3W2-NH2 (0.1 mmol, 1 eq)를 DMF 용액 중 2 mL의 20% 피페리딘에 용해시키고, 30분 동안 실온 하에 교반시켰다. 탈보호된 중간체를 100 mL의 에테르로부터 침전시키고, 30분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 탈보호된 중간체를 산출한다. 30 mg의 NH2-2B3W2-NH2 (0.018 mmol, 1 eq)를 0.3 mL의 건조 DMSO에 용해시킨 다음, 22 mg의 숙신이미딜 6-(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH) (0.058 mmol, 3.2 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시키고, 이로써 생성되는 산물을 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-50% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 4.75분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 23 mg (66.7% 수율)의 분광학적으로 순수한 백색 분말을 수득하였다. C104H129N25O12에 대한 계산된 MS (ESI), 1921.33, 실측치 961 (m/2)+.
화합물 22
Figure pct00072
NHS-2B3W2로서 지칭된 화합물 22를, 125 ug (0.0004 mmol, 1 eq)의 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르 (Az-NHS, 클릭 화학 툴)를 건조 DMSO 중 0.8 mg의 (0.0004 mmol, 1.0 eq) 화합물 6과 반응시킴으로써 합성하였다. HPLC는 NHS 활성화된 화합물로의 완전한 전환을 나타냈으며, 이를 반응성 아민을 보유하는 펩티드 접합을 위해 즉시 사용하였다. C117H133N28O17S에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2234 실측치 1119 (m/2)+.
화합물 23
Figure pct00073
DBCO-2BXy로서 지칭된 화합물 23을, 5.0 mg (0.01 mmol, 1 eq)의 DBCO-NHS를 건조 DMSO 중 4.91 mg (0.011 mmol, 1.1 eq)의 화합물 2와 반응시킴으로써 합성하였다. 이러한 DMSO 용액을 에틸 아세테이트에 용해시킨 다음, 1 M HCl로 세척하였다. 유기 층을 진공 하에 제거하여 ~ 3 mg의 분광학적으로 순수한 백색 고체를 수득하였다. C41H40N6O2에 대한 계산된 MS (ESI), 646.31, 실측치 647.3 (m/2)+.
화합물 24
Figure pct00074
DBCO-WWTTWW 또는 W4TT로서 지칭된 화합물 24를, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2를 사용하여 제조하였다. 32.8 mg의 NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2 (0.04 mmol, 1 eq)를 0.5 mL의 건조 DMSO에 용해시키고, 15.5 mg (0.04 mmol, 1 eq)의 DBCO-NHS를 부가한 다음, TEA (0.04 mmol, 1 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 이로써 생성되는 DBCO 중간체를, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 16분에 걸쳐 40-70% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켰다. DBCO-펩티드를 활성화시키기 위해, 6.1 mg의 DBCO-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2 (0.005 mmol, 1 eq), 0.68 mg의 TT (0.006 mmol, 1.1 eq) 및 1.26 mg의 EDC (0.007 mmol, 1.3 eq)를 DMSO와 DCM의 1:1 용액 0.2 mL에 용해시켰다. 이러한 반응 혼합물에 0.06 mg의 DMAP (0.001 mmol, 0.1 eq)를 실온 하에 격렬하게 교반시키면서 부가하였다. 2시간 후, 부가의 3.3 당량의 TT, 4.0 당량의 EDC 및 0.1 당량의 DMAP를 부가하고, 총 3시간 후에 반응을 완료하였다. DBCO-WWTTWW를 후속 단계에서 중간체로서 사용하였다.
화합물 25
Figure pct00075
DBCO-WWPIWW, WW(PI)WW 또는 PIW4로서 지칭된 화합물 25. 프리미도-인돌-Peg4-NH2 (PI-NH2, TLR-4 효능제)를 기존에 보고된 바와 같이 제조하였다 (Lynn GM, et al., In vivo characterization of the physicochemical properties of polymer-linked TLR agonists that enhance vaccine immunogenicity. Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015). 3.6 mg의 PINH2 (0.005 mmol, 2 eq)에 DMSO 중의 3.31 mg의 화합물 33 (0.0026 mmol, 1 eq) 및 TEA (0.003 mmol, 1.1 eq)를 부가하고, 실온 하에 밤새 교반시켰다. 이로써 생성되는 산물을, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 16분에 걸쳐 45-75% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켰다. C103H107N17O15S에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1854.77, 실측치 928.6 (m/2)+.
화합물 26
Figure pct00076
TLR-2/6 효능제인, Pam2Cys-TT 또는 P2C-TT로서 공지된 화합물 26을, Fmoc-Pam2Cys-산을 출발 물질로서 사용하고 반응을 TLC (DCM 중 1% 메탄올)로 모니터링하였다는 것을 제외하고는, 화합물 24에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 이러한 절차는 황색 고체를 정량적 수율로 생산하였고, 이는 후속 반응 단계에서 중간체로서 사용되었다.
화합물 27
Figure pct00077
DBCO-WWPam2CysWW, WW(P2C)WW 또는 P2C(W)4로서 지칭된 화합물 27을, 출발 물질로서 화합물 24, PEG2-디아민, 및 화합물 26을 사용하여 제조하였다. 먼저, 1.15 mg의 Peg2-디아민 (0.008 mmol, 3 eq)을, 3.31 mg의 화합물 24 (0.0026 mmol, 1 eq)를 함유하는 반응 혼합물에 부가하고, 이러한 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 15 mL의 DI 수에 부가하고 원심분리시켰다. 펠릿을 수집하고, DI 수로 추가로 3회 세척하며 냉동 건조시켰다. 중간체 (DBCO-WWPeg2NH2WW)를 0.1 mL의 건조 DMSO에 흡수시키고, 2.58 mg의 화합물 26 (0.0026 mmol, 1 eq)을 DCM 중 100 mg/mL 원액으로서 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시킨 다음, DCM을 진공 하에 제거한 후, DMF 중 0.2 mL의 20% 피페리딘을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시킨 다음, DCM으로 희석시키고, DI 수로 3회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 이로써 생성된 오일을 DMSO에 용해시키고, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 9.4x100 mm, 5 μm 상에서 16분에 걸쳐 70-100% 이소프로판올/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 합하고 증발시켜 산물 DBCO-WWPam2CysWW를 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 27의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 28
Figure pct00078
NH2-GK(DBCO)GW5로서 지칭된 화합물 28을, 출발 물질로서 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-Gly-Lys-Gly-(Trp)5-NH2 및 DBCO-NHS를 사용하여 합성하였다. 50 mg의 Fmoc-Gly-Lys-Gly-(Trp)5-NH2 (0.04 mmol, 1 eq)를 0.25 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. TEA (0.04 mmol, 1 eq)를 부가하고 용액을 5분 동안 실온 하에 교반시켰다. 14.24 mg의 DBCO-NHS (0.04 mmol, 1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응을 아미노-2-프로판올 (0.04 mmol, 1 eq)로 켄칭하고 DMF 중 0.5 mL의 20% 피페리딘을 부가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 실온 하에 교반시켰다. 이어서, 산물을 50 mL의 에테르로부터 침전시키고, 10분 동안 4℃ 하에 3000 g으로 원심분리시켰다. 산물을 고체 펠릿으로서 수집한 다음, 에테르로 두 번 더 세척한 후, 진공 하에 건조시켰다. 산물을 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 9.4분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 회백색 고체를 수득하였다. C84H84N16O10에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1477.64 실측치 739.6 (m/2)+.
화합물 29
Figure pct00079
TLR-7 효능제인, CL264-아지드, 히드록시아데닌-아지드 또는 TLR-7-아지드로서 지칭된 화합물 29를, 출발 물질로서 CL264 [인비보겐 (Invivogen; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)] 및 아지도-프로필-아민을 사용하여 합성하였다. 5 mg의 CL264 (0.012 mmol, 1 eq) 및 6.1 mg의 아지도-프로필-아민 (0.061 mmol, 5 eq)을 건조 DMF에 용해시켰다. TEA (0.073 mmol, 6 eq)를 부가하고, 용액을 빙욕으로 0℃로 냉각시켰다. 27.6 mg의 HATU (0.073 mmol, 6 eq)를 부가하고, 반응물을 1시간 동안 0℃ 하에 교반시켰다. 화합물 29를 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 20-40% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 5분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시키며 냉동 건조시켰다. C22H29N11O3에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 495.25 실측치 496.3 (m+H)+.
화합물 30
Figure pct00080
DBCO-GK(CL264)G-W5, Cl264-(W)5 또는 DBCO-Gly-Lys(DBCO-CL264)-Gly-(Trp)5-NH2로서 지칭된 화합물 30을, 출발 물질로서 화합물 28 및 29를 사용하여 합성하였다. 5 mg의 화합물 28 (0.0034 mmol, 1 eq)을 0.25 mL의 건조 DMSO에 용해시키고, 1.68 mg의 화합물 29 (0.0034 mmol, 1 eq)를 부가하며, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반시킨 다음, 1.5 mg의 DBCO-NHS (0.0037 mmol, 1.1 eq) 및 0.5 eq의 TEA를 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 밤새 교반시킨 다음, 산물을 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-55% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 9.4분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 백색 고체를 수득하였다. C125H128N28O15에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2261.01 실측치 1132.2 (m/2)+.
화합물 31
Figure pct00081
STING 효능제인 DMXAA-아지드로서 지칭된 화합물 31을, 출발 물질로서 DMXAA (인비보겐)를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 29에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 31을, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 35-65% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 6분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 백색 고체를 수득하였다. C20H22N4O3에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 366.42 실측치 365.2.
화합물 32
Figure pct00082
DBCO-GK(DMXAA)-G-W5, DMXAA-(W)5, DMXAA-W5 또는 DBCO-Gly-Lys(DBCO-DMXAA)-Gly-(Trp)5-NH2로서 지칭된 화합물 32를, 효능제 카고로서 화합물 31을 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 30에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 32를, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 45-85% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C123H121N21O15에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2131.94 실측치 1067.6 (m/2)+.
화합물 33
Figure pct00083
NH2-GRK(DBCO)GW5, NH2-Gly-Arg-Lys(DBCO)-Gly-(Trp)5-NH2로서 지칭된 화합물 33을, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-GRKGW5-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 28에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 33을, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-55% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 7.5분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켰다. C90H96N20O11에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1633.74 실측치 817.5 (m/2)+.
화합물 34
Figure pct00084
NOD 2 효능제인 뮤라밀 아지드로서 지칭된 화합물 34를, 출발 물질로서 뮤라밀 트리-리신 (M-트리Lys, 인비보겐) 및 아지도 프로피온산 술포 NHS를 사용하여 합성하였다. 5 mg의 뮤라밀 트리-리신 (0.008 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 건조 DMSO에 용해시키고, TEA (0.02 mmol, 2.5 eq) 및 2.2 mg의 아지도 프로피온산 술포 NHS (0.008 mmol, 1 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 아미노-2-프로판올 (0.008 mmol, 1 eq)로 켄칭하고, 중간체를 반응에 즉시 사용하였다.
화합물 35
Figure pct00085
DBCO-GRK(뮤라밀)GW5, 뮤라밀-W5 또는 DBCO(뮤라밀)W5로서 지칭된 화합물 35를, 화합물 33 및 34를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 30에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 35를, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 35-65% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 4.6분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켰다. C137H158N30O26에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2639.2 실측치 1319.5 (m/2)+.
화합물 36
Figure pct00086
NH2-GGRK(DBCO)RGGW5로서 지칭된 화합물 36을, 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조된 Fmoc-GGRKRGGW5-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 28에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 36을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 7.8분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C100H114N26O14에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1902.9, 실측치 951.4 (m/2)+.
화합물 37
Figure pct00087
DBCO-GGRK(AMP)RGW5 또는 DBCO(AMP)W5로서 지칭된 화합물 37을, 화합물 36 및 아지도-프로피온산으로 치환된 아데노신 모노포스페이트 8-(6-아미노헥실)아미노아데노신 5' 모노포스페이트 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 30에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 37을, 애질런트 프렙 C-18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 30-60% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 5.2분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 합하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 백색 고체를 수득하였다. C138H158N37O24P에 대한 계산된 MS (ESI) 2748.2 실측치 917.5 (m/3)+.
화합물 38
Figure pct00088
NH2-GRRK (DBCO)-RGW5로서 지칭된 화합물 38을, Fmoc-GRRKRGW5-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 28에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 38을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-55% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 산물을 5.1분으로 용출시키고, 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C102H120N28O13에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 1944.96, 실측치 973.4 (m/2)+.
화합물 39
Figure pct00089
NH2-GK(DBCO)[GGK(DBCO)]2GW5로서 지칭된 화합물 39를, Fmoc-GK(GGK)2GW5-NH2를 출발 물질로서 사용하였고 부가의 3 당량의 TEA 및 DBCO-NHS를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 28에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 39를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 45-85% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. C142H146N26O20에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 2535.12 실측치 1269 (m/2)+.
화합물 40
Figure pct00090
NH2-[GRK(DBCO)RG]3-W5로서 지칭된 화합물 40을, NH2-[GRK(DBCO)RG]3-W5를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 39에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 40을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 35-65% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 수득하였다. C178H218N50O26에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 3471.31, 실측치 695.6 (m/5)+.
화합물 41
Figure pct00091
E10-2B3W2로서 지칭된 화합물 41을, 아지도-(Glu)10-NH2 및 화합물 6을 출발 물질로서 사용하여 합성하였다. 5 mg의 아지도-(Glu)10-NH2 (0.0035 mmol, 1 eq)를 건조 DMSO에 용해시키고, 6.77 mg의 화합물 6 (0.0035 mmol, 1 eq)을 건조 DMSO 중 40 mg/mL 용액으로서 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 밤새 교반시켰다. 화합물 41을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 25-45% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 11.8 mg의 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 정량적 수율로 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3377.31, 실측치 1127 (M/3)+.
화합물 42
Figure pct00092
K10-2B3W2로서 지칭된 화합물 42를, 아지도-(Lys)10-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 41에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 42를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 20-40% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하고, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말을 정량적 수율로 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3367.58, 실측치 482 (M/7)+.
화합물 43
Figure pct00093
DBCO-G5-2B3W2-G5-D9 또는 DBCO-2B3W2(D)9로서 지칭된 화합물 43을, 출발 물질로서 NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)9-NH2, 화합물 6 및 DBCO-NHS를 사용하여 합성하였다. 5 mg의 NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)9-NH2 (0.0028 mmol, 1 eq)를 0.1 mL의 건조 DMSO에 용해시키고, 6.56 mg의 화합물 6 (0.0034 mmol, 1.2 eq)을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 밤새 교반시켰다. 3.55 mg의 DBCO-NHS (0.0084 mmol, 3 eq)을 부가한 다음, TEA (0.0028 mmol, 1 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 화합물 43을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-40% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 3.8 mg (33.7% 수율)의 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 4008.31, 실측치 1003.3 (m/4)+.
DBCO-G5-2B3W2-G5-D8 또는 DBCO-2B3W2(D)8로서 지칭된 화합물 44를, NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)8-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 43에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 44를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 30-40% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3894.52, 실측치 974.6 (m/4)+.
DBCO-G5-2B3W2-G5-D7 또는 DBCO-2B3W2(D)7로서 지칭된 화합물 45를, NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)7-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 43에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 45를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 29-39% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3779.43, 실측치 945.8 (m/4)+.
DBCO-G5-2B3W2-G5-D6 또는 DBCO-2B3W2(D)6으로서 지칭된 화합물 46을, NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)6-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 43에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 46을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 29-39% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3664.35, 실측치 917.1 (m/4)+.
DBCO-G5-2B3W2-G5-D5 또는 DBCO-2B3W2(D)5로서 지칭된 화합물 47을, NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)5-NH2를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 43에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 47을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 29-41% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3549.26, 실측치 1184.1 (m/3)+.
화합물 48
Figure pct00094
DBCO-2B3W2-R6 또는 DBCO-2B3W2(R)6으로서 지칭된 화합물 48을, NH2-Lys(N3)-(Arg)6-NH2을 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 43에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 48을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 26-36% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 17.8 mg (51.8% 수율)의 표제 화합물을 분광학적으로 순수한 (254 nm 하에 > 95% AUC) 백색 분말로서 수득하였다. 계산된 MS (ESI), m/z 3338.19, 실측치 478.1 (m/7)+.
화합물 49
Figure pct00095
Myr-DBCO 또는 C14-DBCO로서 지칭된 화합물 49를, 미리스토일 클로라이드 및 DBCO-아민으로부터 제조하였다. 50 mg의 DBCO-아민 (0.18 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시켰다. TEA (0.22 mmol, 1.2 eq)를 부가하고, 용액을 실온 하에 5분 동안 교반시켰다. 미리스토일 클로라이드 (0.16 mmol, 0.9 eq)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 1시간 동안 교반시켰다. TLC (DCM 중 2.5% 메탄올)는 Myr-DBCO에 대한 0.5의 rf를 갖는 새로운 스팟을 나타내었다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고, 12 CV 상에서 DCM 중 0-3% 메탄올의 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 86 mg의 Myr-DBCO를 정량적 수율로 제공하였다. C32H42N2O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 486.32 실측치 487.3 (m+H)+.
화합물 50
Figure pct00096
Val-DBCO 또는 C5-DBCO로서 지칭된 화합물 50을, 발레로일 클로라이드를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 49에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 제조하였다. Val-DBCO를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 40-60% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 이로써 생성된 분획을 수집하며, 동결시킨 다음, 냉동 건조시켜 80 mg의 Val-DBCO을 정량적 수율로 수득하였다. C23H24N2O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 360.18 실측치 361.2 (m+H)+.
화합물 51
Figure pct00097
Plm-DBCO 또는 C16-DBCO로서 지칭된 화합물 51을, 팔미토일 클로라이드를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 49에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 제조하였다. 화합물 51을, 12 CV 상에서 DCM 중 0-3% 메탄올의 구배를 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 80 mg의 Plm-DBCO를 정량적 수율로 제공하였다. C34H46N2O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 514.36 실측치 515.3 (m+H)+.
화합물 52
Figure pct00098
Myr-Peg11-DBCO 또는 C14-PEG11-DBCO로서 지칭된 화합물 52를, 미리스토일 클로라이드, Boc-Peg11-아민 및 DBCO-NHS를 출발 물질로서 사용하여 합성하였다. 116.06 mg Boc-Peg11-아민 (0.18 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시켰다. TEA (0.22 mmol, 1.2 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 5분 동안 교반시켰다. 미리스토일 클로라이드를 부가하고, 반응물을 실온 하에 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 1 M HCl로 2회 세척하고 DI 수로 1회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 중간체를 0.35 mL의 DCM에 용해시키고 0.15 mL의 TFA를 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시킨 다음, 공기로 취입함으로써 건조시키고, 고 진공 하에 추가로 건조시켰다. 122.5 mg의 오일 (0.162 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시켰다. TEA (0.49 mmol, 3 eq)를 부가하고, 용액을 실온 하에 5분 동안 교반시켰다. 65.19 mg의 DBCO-NHS (0.162 mmol, 1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고, 15 CV 상에서 DCM 중 0-15% 메탄올의 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 Myr-Peg11-DBCO를 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 52의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 53
Figure pct00099
Plm-Peg11-DBCO 또는 C16-PEG11-DBCO로서 지칭된 화합물 53을, 팔미토일 클로라이드를 출발 물질로서 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 52에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. Plm-Peg11-DBCO를, 15 CV 상에서 DCM 중 0-15% 메탄올의 구배를 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 Plm-Peg11-DBCO를 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 53의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 54
Figure pct00100
NH2-Pam2Cys-DBCO로서 지칭된 화합물 54를, 출발 물질로서 화합물 26 및 DBCO-아민을 사용하여 합성하였다. 30 mg의 화합물 26 (0.03 mmol, 1 eq)을 DCM 중 100 mg/mL 원액으로서 제조하였다. 이러한 원액에 8.34 mg의 DBCO-아민 (0.03 mmol, 1 eq)을 또한 DCM 중 100 mg/mL 원액으로서 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시킨 다음, 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고 정제하였다. 사용된 구배는 DCM 중 0-5% 메탄올로부터의 단계별 구배였다 (5 CV 유지, 메탄올 농도를 1%만큼 증가시키는 1 CV). 분획을 수집하고 건조시켜 DBCO 중간체를 제공하였다. 26 mg의 Fmoc-Pam2Cys-DBCO (0.023 mmol, 1 eq)를 DMF 중 1 mL의 20% 피페리딘에 용해시키고, 실온 하에 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, DI 수로 3회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 고체를 0.5 mL의 DCM에 흡수시키고, 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고 정제하였다. 사용된 구배는 DCM 중 0-5% 메탄올로부터의 단계별 구배였다. 분획을 수집하고 건조시켜 NH2-Pam2Cys-DBCO를 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 54의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 55
Figure pct00101
NH2-Pam2Cys-Peg11-DBCO로서 지칭된 화합물 55를, 출발 물질로서 화합물 26, Boc-Peg11-아민, 및 DBCO NHS를 사용하여 합성하였다. 60 mg의 화합물 26 (0.06 mmol, 1 eq)을 0.6 mL의 DCM에 용해시켰다. 38.9 mg의 Boc-Peg11-아민 (0.06 mmol, 1 eq)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시켰다. DCM을 진공 하에 제거하고, 오일을 DMSO에 흡수시키며, DI 수에 부가하였다. 물을 5분 동안 3000 g으로 원심분리시키고, 펠릿을 수집하며, 진공 하에 건조시켰다. PEG화된 중간체를 0.35 mL의 DCM에 용해시키고, 0.15 mL의 TFA를 부가하였다. 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시킨 다음, 공기로 취입 건조시키고, 고 진공 하에 추가로 건조시켰다. 71.76 mg의 Boc 탈보호된 오일 (0.05 mmol, 1 eq)을 1 mL의 DMSO에 용해시키고, TEA (0.1 mmol, 2eq)를 부가한 다음, 20.3 mg의 DBCO-NHS (0.05 mmol, 1 eq)를 부가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. DMF 중 0.5 mL의 20% 피페리딘을 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, pH 9.5 중탄산나트륨으로 3회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 고체를 0.5 mL의 DCM에 흡수시키고, 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고 정제하였다. 사용된 구배는 30 CV 상에서 DCM 중 0-10% 메탄올이었다. 이는 산물을 6.7% 전체 수율로 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 55의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 56
Figure pct00102
Chol-TT로서 지칭된 화합물 56을, 출발 물질로서 콜레스테릴 헤미숙시네이트 및 TT를 사용하여 제조하였다. 100 mg의 콜레스테릴 헤미숙시네이트 (0.21 mmol, 1 eq), 26.94 mg의 TT (0.23 mmol, 1.1 eq), 및 51.20 mg의 EDC (0.27 mmol, 1.3 eq)를 1 mL의 DCM에 용해시켰다. 2.51 mg의 DMAP (0.02 mmol, 0.1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 교반시켰다. 1시간 후, 밝은 황색 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 1 M HCl로 2회 세척하며 DI 수로 1회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켜 120 mg의 황색 고체를 정량적 수율로 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 56의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 57
Figure pct00103
Chol-DBCO로서 지칭된 화합물 57을, 화합물 56 및 DBCO-아민으로부터 제조하였다. 106.28 mg의 화합물 56 (0.18 mmol, 1 eq) 및 50 mg의 DBCO-아민 (0.18 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시키고, 실온 하에 교반시켰다. 1시간에 걸쳐 용액의 밝은 황색이 희미해졌고 DCM 중에서의 TLC는 화합물 56의 완전한 부재를 표시하였다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고, 12 CV 상에서 DCM 중 0-3% 메탄올의 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 139 mg의 Chol-DBCO를 정량적 수율로 제공하였다. 산물 분자량은 화합물 57의 펩티드 항원 접합체에 대한 MS (ESI+)에 기반하여 검증되었다.
화합물 58
Figure pct00104
Chol-Peg11-DBCO로서 지칭된 화합물 58을 화합물 56, Boc-Peg11-아민 및 DBCO-NHS로부터 제조하였다. 50 mg의 화합물 56 (0.085 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시켰다. 60.38 mg의 Boc-Peg11-아민 (0.09 mmol, 1.1 eq)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 교반시켰다. 1시간에 걸쳐 용액의 밝은 황색이 희미해졌고 DCM 중에서의 TLC는 화합물 56의 완전한 부재를 표시하였다. 반응 혼합물에 150 uL의 TFA를 부가하여 DCM 중 30% 용액으로 만들었다. 반응 혼합물을 실온 하에 30분 동안 교반시킨 다음, 공기로 취입시킴으로써 건조시키고, 고 진공 하에 추가로 건조시켰다. 86.25 mg의 오일 (0.085 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DCM에 용해시켰다. TEA (0.26 mmol, 3 eq)를 부가하고, 용액을 실온 하에 5분 동안 교반시켰다. 34.26 mg의 DBCO-NHS (0.085 mmol, 1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 칼럼 상에 주사하고, 15 CV 상에서 DCM 중 0-15% 메탄올의 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 수집하고 건조시켜 Chol-Peg11-DBCO를 제공하였다.
화합물 59
Figure pct00105
LA-TT로서 지칭된 화합물 59를, 출발 물질로서 레불린산 및 TT를 사용하여 합성하였다. 500 mg의 레불린산 (4.3 mmol, 1 eq), 564.7 mg의 TT (4.7 mmol, 1.1 eq), 및 1.032 g의 EDC (5.4 mmol, 1.3 eq)를 10 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. 52.6 mg의 DMAP (0.4 mmol, 0.1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 화합물 59를, 에틸 아세테이트에서 희석시키고 1 M HCl로 2회 세척하며 DI 수로 1회 세척함으로써 후처리하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공 하에 제거하였다. 고체를 에틸 아세테이트로부터 재결정화하였다. C8H11NO2S2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z, 217.02, 실측치 218 (M+H)+.
화합물 60
Figure pct00106
LA-2BXy로서 지칭된 화합물 60을, 출발 물질로서 화합물 59 및 화합물 2를 사용하여 합성하였다. 50 mg의 화합물 59 (0.23 mmol, 1 eq) 및 82.62 mg의 화합물 2 (0.23 mmol, 1 eq)를 1 mL의 DMSO에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온 하에 1시간 동안 교반시켰다. TLC (헥산 중 35% 에틸 아세테이트)는 출발 물질 둘 다가 사라진 것으로 나타났다. 화합물 60을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 15-30% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C27H31N5O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z, 457.25, 실측치 458.3 (M+H)+.
화합물 61
Figure pct00107
CTA-TT로서 지칭된 화합물 61을, 출발 물질로서 4-시아노-4-(티오벤조일티오)펜탄산 (CTA)을 사용하고 용매로서 DCM을 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 59에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 61을, DCM에서 희석시키고 1 M HCl로 2회 세척하며 DI 수로 1회 세척함으로써 후처리하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공 하에 제거하였다. 고체를 에틸 아세테이트로부터 재결정화하였다. C16H16N2OS4에 대한 계산된 MS (ESI), m/z, 380.01, 실측치 381.1 (M+H)+.
화합물 62
Figure pct00108
CTA-DBCO로서 지칭된 화합물 62를, "CTA-NHS" (4-시아노-4-(페닐카르보노티오일티오)펜탄산 N-숙신이미딜 에스테르; 시그마-알드리치) 및 DBCO-아민 (클릭 화학 툴)으로부터 합성하였다. 210 mg의 CTA-NHS (0.56 mmol, 1 eq) 및 167.8 mg의 DBCO-아민 (0.61 mmol, 1.1 eq)을 2 mL의 건조 DMSO에 용해시키고 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 1 M HCl로 2회 세척하며 DI 수로 1회 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 화합물 62를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 50-70% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C31H27N3O2S2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 537.7, 실측치 538.2 (M+H)+.
화합물 63
Figure pct00109
CTA-2BXY로서 지칭된 화합물 63을, 출발 물질로서 화합물 61 및 화합물 2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 60에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 63을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 12분에 걸쳐 40-50% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C35H36N6OS2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 620.83, 실측치 621.2 (M+H)+.
화합물 64
Figure pct00110
ACVA-TT로서 지칭된 화합물 64를, 출발 물질로서 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)를 사용하였고, 활성 부위의 배가를 반영하기 위해 TT, EDC, 및 DMAP의 당량을 배가시켰다는 것을 제외하고는, 화합물 59에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 64를, 에틸 아세테이트에서 희석시키고 1 M HCl로 2회 세척하며 DI 수로 1회 세척함으로써 후처리하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공 하에 제거하였다. 고체를 DCM:에테르부터 재결정화하였다. C18H22N6O2S4에 대한 계산된 MS (ESI), m/z, 482.65, 실측치 483.1 (M+H)+.
화합물 65
Figure pct00111
ACVA-2BXy로서 지칭된 화합물 65를, 출발 물질로서 화합물 64를 사용하였고, 활성 부위의 배가를 반영하기 위해 화합물 2의 당량을 배가시켰다는 것을 제외하고는, 화합물 60에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 65를, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 50x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 28-48% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C56H62N14O2에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 963.21, 실측치 482.4 (M/2)+.
화합물 66
Figure pct00112
ACVA-DBCO로서 지칭된 화합물 66을, 출발 물질로서 화합물 64 및 DBCO-아민 (클릭 화학 툴)을 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 60에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 합성하였다. 화합물 66을, 15 CV 상에서 DCM 중 0-3% 메탄올의 구배를 사용하여 플래시 크로마토그래피함으로써 정제하였다. C48H44N8O4에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 796.93, 실측치 797.3 (M+H)+.
화합물 67
Figure pct00113
Azp-2BXY로서 지칭된 화합물 67을 5-아지도-펜탄산 (Azp) 및 화합물 2로부터 합성하였다. 16.2 mg의 Azp (0.114 mmol, 1.1 eq), 12.3 mg의 TT (0.103 mmol, 1 eq) 및 27.2 mg의 EDC (0.142 mmol, 1.3 eq)를 0.5 mL의 건조 DMSO에 용해시켰다. 1.4 mg의 DMAP를 부가하고, 반응 혼합물을 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 37.09 mg의 화합물 2 (0.103 mmol, 1 eq)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온 하에 교반시켰다. 화합물 67을, 애질런트 프렙-C18 칼럼, 30x100 mm, 5 μm 상에서 10분에 걸쳐 22-42% 아세토니트릴/H2O (0.05% TFA)의 구배를 사용하여 예비 HPLC 시스템 상에서 정제하였다. C27H32N8O에 대한 계산된 MS (ESI), m/z 484.27, 실측치 485.3 (M+H)+.
화합물 68
Figure pct00114
화합물 68은 (HPMA-2B)-b-(HPMA)-DBCO 또는 p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO로서 지칭되기도 한다. 미셀 형성 디-블록 공중합체 (A-B 유형)를, 기존에 보고된 바와 같이 제조된 (문헌 [Lynn GM, et al. Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015] 참조) 전구체 HPMA 및 MA-b-Ala-TT 뿐만 아니라 2-시아노-2-프로필 벤조디티오에이트 ("CTA-ABIN", 시그마 알드리치), 아조비스이소부티로니트릴 ("AIBN", 시그마 알드리치), 화합물 1 및 화합물 66을 사용하여 2가지 합성 단계에서 RAFT 중합에 의해 생산하였다. 소수성 블록 A는 tert-부틸 알콜 / DMSO 혼합물 중에서 16시간 동안 70℃ 하에 연쇄 전달제로서 CTA-AIBN을 사용하고 개시제로서 AIBN을 사용하여 HPMA를 MA-b-Ala-TT로 공중합시킴으로써 제조되었다. 소수성 블록 B는 연속해서, 70℃ 하에 AIBN의 존재 하에 16시간 더 HPMA를 부가함으로써 RAFT 메커니즘을 통해 연쇄 연장 중합시켰다. A-B 디-블록 공중합체인 p{[HPMA)-co-(MA-b-TT)]-b-p(HPMA)}-DTB를 침전에 의해 단리시켜 녹색 고체를 산출하였다. 상기 공중합체의 한쪽 말단 상의 DTB 기를, DMSO 중에서 2시간 동안 80℃ 하에 화합물 66과 반응시킨 다음, 화합물 1을 부가함으로써 대체시켰다. 산물을 침전시킨 다음, LH-20에 의해 정제시켜 화합물 68을 산출한 다음, 이를 펩티드 항원과의 반응에 사용하여, 하기에 상세히 기재되는 상이한 유형의 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(펩티드 항원)를 산출하였다.
화합물 69
Figure pct00115
화합물 69는 (HPMA-NHNH-2BXy)-b-(HPMA)-DBCO 또는 p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN=CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO로서 지칭되기도 한다. 미셀 형성 디-블록 공중합체 (A-B 유형)를, 기존에 보고된 바와 같이 제조된 (문헌 [Lynn GM, et al. Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015] 참조) 전구체 HPMA 및 MA-Acap-NHNH-Boc 뿐만 아니라 2-시아노-2-프로필 벤조디티오에이트 ("CTA-ABIN", 시그마 알드리치), 아조비스이소부티로니트릴 ("AIBN", 시그마 알드리치), 화합물 60 및 화합물 66을 사용하여 2가지 합성 단계에서 RAFT 중합에 의해 생산하였다. 소수성 블록 A는 tert-부틸 알콜 / DMSO 혼합물 중에서 16시간 동안 70℃ 하에 연쇄 전달제로서 CTA-AIBN을 사용하고 개시제로서 AIBN을 사용하여 HPMA를 MA-Acap-NHNH-Boc로 공중합시킴으로써 제조되었다. 소수성 블록 B는 연속해서, 70℃ 하에 AIBN의 존재 하에 16시간 더 HPMA를 부가함으로써 RAFT 메커니즘을 통해 연쇄 연장 중합시켰다. A-B 디-블록 공중합체인 p p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN=CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DTB를 침전에 의해 단리시킨 다음, 30% 트리플루오르아세트산 TFA/DCM에서 Boc-탈보호시켰다. TFA/DCM을 진공 하에 제거한 다음, 상기 공중합체의 한쪽 말단 상의 DTB 기를, DMSO 중에서 2시간 동안 80℃ 하에 화합물 66과 반응시킨 다음, 화합물 60을 부가함으로써 대체시켰다. 산물을 침전시킨 다음, LH-20에 의해 정제시켜 화합물 69를 산출한 다음, 이를 펩티드 항원과의 반응에 사용하여, 하기에 상세히 기재되는 상이한 유형의 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(펩티드 항원)를 산출하였다.
화합물 70
Figure pct00116
화합물 70은 (DEGMA-2B)-b-(HPMA)-DBCO 또는 p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO로서 지칭되기도 한다. 온도 반응성인 미셀 형성 디-블록 공중합체 (A-B 유형)를, 기존에 보고된 바와 같이 제조된 (문헌 [Lynn GM, et al. Nat Biotechnol 33(11): 1201-1210, 2015] 참조) 전구체 DEGMA, HPMA 및 MA-b-Ala-TT 뿐만 아니라 2-시아노-2-프로필 벤조디티오에이트 ("CTA-ABIN", 시그마 알드리치), 아조비스이소부티로니트릴 ("AIBN", 시그마 알드리치), 화합물 1 및 화합물 66을 사용하여 2가지 합성 단계에서 RAFT 중합에 의해 생산하였다. 온도 반응성인 소수성 블록 A는 tert-부틸 알콜 / DMSO 혼합물 중에서 16시간 동안 70℃ 하에 연쇄 전달제로서 CTA-AIBN을 사용하고 개시제로서 AIBN을 사용하여 DEGMA를 MA-b-Ala-TT로 공중합시킴으로써 제조되었다. 소수성 블록 B는 연속해서, 70℃ 하에 AIBN의 존재 하에 16시간 더 HPMA를 부가함으로써 RAFT 메커니즘을 통해 연쇄 연장 중합시켰다. A-B 디-블록 공중합체인 p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DTB를 침전에 의해 단리시켜 녹색 고체를 산출하였다. 상기 공중합체의 한쪽 말단 상의 DTB 기를, DMSO 중에서 2시간 동안 80℃ 하에 화합물 66과 반응시킨 다음, 화합물 1을 부가함으로써 대체시켰다. 산물을 침전시킨 다음, LH-20에 의해 정제시켜 화합물 70을 산출한 다음, 이를 펩티드 항원과의 반응에 사용하여, 하기에 상세히 기재되는 상이한 유형의 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(펩티드 항원)를 산출하였다.
화합물 71
Figure pct00117
(DEGMA-2BXy)-b-(HPMA)-DBCO 또는 p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO로서 지칭되기도 하는 화합물 71을, 리간드로서 화합물 2를 사용하였다는 것을 제외하고는, 화합물 70에 대해서와 동일한 절차를 사용하여 제조하였다. 산물을 침전시킨 다음, LH-20에 의해 정제시켜 화합물 71을 산출한 다음, 이를 펩티드 항원과의 반응에 사용하여, 하기에 상세히 기재되는 상이한 유형의 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(펩티드 항원)를 산출하였다.
화합물 72
Figure pct00118
화합물 72는 2BXy-DEGMA-b-HPMA-DBCO로서 지칭되기도 한다. 미셀 형성 디-블록 공중합체 (A-B 유형)를, 전구체 DEGMA, HPMA, 화합물 63, 화합물 65 및 화합물 66을 사용하여 2가지 합성 단계에서 RAFT 중합에 의해 생산하였다. 소수성 블록 A는 tert-부틸 알콜 / DMSO 혼합물 중에서 16시간 동안 70℃ 하에 연쇄 전달제로서 화합물 63을 사용하고 개시제로서 화합물 65를 사용하여 DEGMA를 공중합시킴으로써 제조되었다. 소수성 블록 B는 연속해서, 70℃ 하에 AIBN의 존재 하에 16시간 더 HPMA를 부가함으로써 RAFT 메커니즘을 통해 연쇄 연장 중합시켰다. A-B 디-블록 공중합체인 2BXy-[p(DEGMA)-b-p(HPMA)]-DTB를 침전에 의해 단리시키고, 상기 공중합체의 한쪽 말단 상의 DTB 기를, DMSO 중에서 2시간 동안 80℃ 하에 화합물 66과 반응시킴으로써 대체시켰다. 산물을 침전시킨 다음, LH-20에 의해 정제시켜 화합물 72를 산출한 다음, 이를 펩티드 항원과의 반응에 사용하여, 하기에 상세히 기재되는 상이한 유형의 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, 2BXy-p[(DEGMA)-b-p(HPMA)]-DBCO-(펩티드 항원)를 산출하였다.
실시예 2: 펩티드 항원 접합체를 생산하기 위한 펩티드 항원 단편과 소수성 분자 (H)의 반응
펩티드 항원 (A), 임의적 하전된 분자 (C), 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 및 링커 전구체 X1, 예를 들어, [C]-[B1]-A-[B2]-X1 (여기서 [ ]는 그 기가 본 실시예에서 임의적이라는 것을 표시함)로 구성된 펩티드 항원 단편을 소수성 분자 (H)에 연결된 X2, 예를 들어, X2-H와 반응시켜 펩티드 항원 접합체, 예를 들어, [C]-[B1]-A-[B2]-L-H를 제공할 수 있다. 펩티드 항원 단편이 아지드를 포함하는 링커 전구체 X1, 예를 들어, 종종 K'로서 지칭되는 아지도-리신 (Lys(N3))을 포함하는 경우, 펩티드 항원 단편은 소수성 분자 (H)에 연결되어 트리아졸 링커 (L)를 형성하는, 알킨, 예컨대 DBCO를 포함하는 링커 전구체 X2와 반응될 수 있다. 비제한적 예로서, 화합물 3 내지 5는 화학식 III의 아주반트 (즉, TLR-7/8a)에 부가적으로 연결되는 DBCO 링커 전구체 X2를 보유하는 화학식 I의 소수성 분자 (H)의 예이고; 화합물 6 내지 11은 화학식 III의 아주반트 (즉, TLR-7/8a)에 부가적으로 연결되는 DBCO 링커 전구체 X2를 보유하는 화학식 I의 소수성 분자 (H)의 예이며; 화합물 10 내지 11은 아주반트 특성을 갖는 리간드를 함유하지 않는 DBCO 링커 전구체 X2를 보유하는 화학식 II의 소수성 분자 (H)의 예이다.
도 2에 도시된 비제한적 예는, 1.1 내지 1 몰 비로 아지드 보유 링커 전구체 X1을 포함하는 펩티드 항원 단편과 반응하는, DBCO를 포함하는 링커 전구체 X2에 연결된 소수성 분자 (H)의 반응이다. HPLC 크로마토그램에 표시된 바와 같이, 소수성 분자 (H) 상의 DBCO는 아지드를 포함하는 링커 전구체 X1과 반응하여, 하전된 분자 (C)에 연결되는 B1 연장부에 연결되는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 B2 연장부에 연결되는 트리아졸 링커 (L)를 생성함으로써, 펩티드 항원 (A)과 소수성 분자 (H)를 연결시켜 펩티드 항원 접합체를 제공한다. 아지드 보유 펩티드 항원 단편과 DBCO 보유 소수성 분자 (H)와의 반응에 의해 형성된 상이한 펩티드 항원 접합체의 수백 가지 예가 전체에 걸쳐 기재되어 있다. 아지드와 DBCO의 반응은 생산된 모든 펩티드 항원 접합체 전체에 걸쳐 신뢰할 수 있고 일관성이 있기 때문에, 접합체를 형성하는데 사용된 반응 뿐만 아니라 이들의 특징 규명에 대한 완전한 설명은 제공되지 않는다. 주: 부가 환화로부터 발생하는 펩티드 항원 접합체의 분자량은 출발 물질의 질량의 합이다.
펩티드 항원 단편이 티올을 포함하는 링커 전구체 X1, 예를 들어, 종종 C로서 지칭되는 시스테인 (Cys)을 포함하는 경우, 펩티드 항원 단편은 말레이미드를 포함하는 링커 전구체 X2를 보유하는 소수성 분자 (H), 예를 들어, 화합물 21과 반응하여, 티오-에테르 기반 링커 (L)를 생성할 수 있다. 펩티드 항원 단편이 아민을 포함하는 링커 전구체 X1, 예를 들어, 종종 K로서 지칭되는 리신 (Lys)을 포함하는 경우, 펩티드 항원 단편은 활성화된 에스테르, 예컨대 NHS를 포함하는 링커 전구체 X2를 보유하는 소수성 분자 (H), 예를 들어, 화합물 22와 반응할 수 있고, 이로써 아미드 결합이 형성된다.
실시예 3: 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 합성 및 생물학적 특징 규명
선행 연구는 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위한 수단으로서 다양한 백신 아주반트와 조합된 ~ 20-40개 아미노산의 합성 "긴" 펩티드 (SLP 또는 LP)로서의 T 세포 에피토프의 전달을 보고하였다. 그러나, 면역원성에 대한 펩티드 길이 및 유체역학적 거동의 영향 뿐만 아니라 펩티드와 면역 자극제, 예컨대 TLRa와의 공동 전달의 영향은 충분히 연구되지 않았다. 펩티드-기반 항원의 상이한 파라미터가 T 세포 면역에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 더 큰 통찰력을 제공하기 위해, 본 발명자들은 본원에 기재된 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 상이한 특성이 생체 내에서 CD4 및 CD8 T 세포 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 체계적으로 평가하였다.
CD8 T 세포 반응에 대한 펩티드 항원 유체역학적 거동, 펩티드 항원 (A) 길이 및 TLR-7/8a의 공동-전달의 영향
본 개시내용의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 항원 (A)의 길이가 면역원성, 구체적으로, 생성된 CD8 및/또는 CD4 T 세포 반응의 규모 및 품질에 어떻게 영향을 미칠지에 관해서는 선험적으로 분명하지 않았다.
펩티드 항원 (A) 길이가 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지를 체계적으로 조사하기 위해, 뮤린 종양 모델 MC38로부터 유래 된 2가지 모델 신생항원 CD8 T 세포 에피토프 Irgq 및 Cpne1을 펩티드 항원 접합체로서 생산하였으며, 여기서 펩티드 항원 (A)은 26개 아미노산의 합성 긴 펩티드 (SLP 또는 "LP")이거나 또는 10개 아미노산의 최소 에피토프 (ME 또는 "Min")였다 (도 4). SLP-기반 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H)의 N-말단에 연결된 링커 전구체 X2, DBCO에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 C-말단에서 연결된 반면; 최소 에피토프 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H)의 N-말단에 연결된 링커 전구체 X2, DBCO에 연결된 C-말단 연장부 (B2)에 연결되어, 도 4에 요약된 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체를 생성하였다.
펩티드 항원 접합체의 합성을 위한 일반적인 계획은 실온에서 DMSO 중 1.2 당량의 DBCO 보유 소수성 분자 (H)를, 반응성 아지드를 보유하는 1.0 당량의 펩티드 항원 단편과 반응시키는 것이었다. 24시간 후에 반응이 완료되었으며 추가 정제는 필요하지 않았다.
본 발명자들은 먼저, 펩티드 항원 (A)과 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동을 평가하였다 (도 4). 특히, Irgq와 Cpne1 둘 다의 최소 에피토프 (Min) 및 LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)은 0.1 mg/mL 이하에서 수용성인 것으로 밝혀졌지만, 펩티드 항원 (A)이 2개의 소수성 분자 (H)인 W3 또는 2BXy3 중 하나에 부착되면, W3에 부착된 Cpne1의 LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 제외하고는, 입자 형성을 겪는 펩티드 항원 접합체가 생성되었다. 이러한 결과는 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체가 수용성 펩티드의 입자 형성을 유도한다는 것과, 소수성 분자 (H)의 길이를 증가시키거나 또는 더 소수성인 단량체 (예를 들어, 트립토판에 비해 Glu(2BXy))를 사용하면 입자 형성의 신뢰성이 개선된다는 것을 나타낸다.
따라서, 예상치 못하게도, 화학식 I의 소수성 분자 (H)가 화학식 III의 아주반트에 연결된 5개 이상의 단량체 단위로 구성된 경우에는, 시험된 대부분의 펩티드 항원 접합체가 입자를 형성하였지만, 5개 미만의 단량체 단위, 예컨대 1 또는 3개 단량체 단위를 갖는 화학식 I 또는 II의 소수성 분자 (H)는 덜 확실하게 입자 형성을 유도시켰다는 것이 밝혀졌다. 이들 데이터에 기반하여, 펩티드 항원 접합체에 사용되는 소수성 분자 (H)의 바람직한 실시양태는 5개 이상의 단량체 단위로 구성되어 고도로 친수성이고/이거나 하전된 펩티드 항원 (A)의 입자 형성을 보장한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 소수성 분자 (H)는 3개 이상의 단량체 단위, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30개 또는 그 초과의 단량체 단위, 전형적으로 약 300개 이하의 단량체 단위 길이일 수 있다.
이어서, 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체의 유체역학적 거동 뿐만 아니라 펩티드 항원 접합체를 구성하는 TLR-7/8a 아주반트의 공동 전달 및 펩티드 항원 (A) 길이가 생체내 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지에 관해서 평가하였다. 26개 아미노산의 긴 펩티드 (LP) 또는 10개 아미노산의 최소 에피토프 (Min)로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를, 2BXy로서 지칭된 작은 분자 TLR-7/8a인 화합물 2와 혼합하거나; 소수성 분자 (H), W3에 연결하고 2BXy와 혼합하거나; 또는 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H), 2BXy3에 연결하여, 입자를 형성하고 펩티드 항원 (A)과 TLR-7/8a 아주반트와의 공동 전달을 보장한다 (도 4-6 참조). 소수성 분자 (H), 2BXy3에 연결된 최소 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체로 면역된 마우스는 단일 면역화 후 가장 높은 규모의 CD8 T 세포 반응 (전체 CD8 T 세포의 >1% IFNg+)을 제공하였는데, 이는 입자 포맷으로 TLR-7/8a와 최소 에피토프의 공동 전달이 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위한 효율적인 접근법이라는 것을 표시한다. 특히, TLR-7/8a와 혼합된 가용성 최소 에피토프 및 가용성 LP는 나이브(naive) 군과 비교 시 통계적으로 유의미하지 않은 가장 낮은 CD8 T 세포 반응을 유도시켰는데, 이는 펩티드 항원 (A)의 가용성 형태가 거의 면역원성이 없다는 것을 표시한다 (도 5 및 6). 마지막으로, 소수성 분자 (H), 2BXy3에 연결된 Irgq의 최소 에피토프 또는 Irgq의 LP로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체가 거의 동등한 규모의 CD8 T 세포 반응을 제공하였지만, 최소 에피토프 Cpne1로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체는 LP로서 Cpne1을 전달하는 펩티드 항원 접합체와 비교 시 거의 10배 더 높은 CD8 T 세포 반응을 유도하였다.
화학식 IV의 펩티드 항원 접합체에 대한 CD4 및 CD8 T 세포 면역을 촉진시키기 위한 면역원성에 대한 펩티드 항원 (A) 길이의 역할을 추가로 조사하기 위해, 뮤린 종양 모델인 B16으로부터 유래된 7가지 예측된 최소 CD8 T 세포 에피토프 (즉, 예측된 신생항원)가, 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체를 구성하는 펩티드 항원 (A)으로서 27개 아미노산의 합성 긴 펩티드 (LP) 또는 10개 아미노산의 최소 에피토프 (ME 또는 Min으로 지칭됨)로서 전달되었다 (도 7 참조). LP-기반 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H)의 N-말단에 연결된 링커 전구체 X2, DBCO에 연결된 링커 전구체 X1, 아지도-리신 (K')에 C-말단에서 직접적으로 연결된 반면; 최소 에피토프 펩티드 항원 (A)은 소수성 분자 (H)의 N-말단에 연결된 링커 전구체 X2, DBCO에 연결된 C-말단 연장부 (B2)에 연결되어, 도 7에 요약된 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체를 생성하였다. 펩티드 항원 (A)을 2BXy5 또는 2B5 소수성 분자 (H)에 연결하여 펩티드 항원 접합체를 형성하였다. 구조적으로 유사하지만 TLR-7에 대한 효력 면에서 상이한 2BXy5와 2B5를 비교하면, 염증이 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지에 관해 평가할 수 있었다. 최소 에피토프 (Min)로서, LP로서 또는 최소 에피토프와 LP 둘 다로서 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체로 구성된 면역원성 조성물로 마우스를 면역시켰다. CD4 및 CD8 T 세포 반응의 규모는 2회 면역화 후 2주에 평가되었다 (도 8).
놀랍고 예상치 못한 발견은 최소 에피토프 ("Min")를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 투여받은 마우스가 가장 큰 규모의 CD8 T 세포 반응을 유도한 반면, LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체는 더 낮은 수준의 CD8 T 세포 반응을 유도하였다는 것이다. 이러한 경향은 소수성 분자 (H)인 2BXy5와 2B5 둘 다에 대해 명백하였다. 따라서, 소수성 분자 (H), 2BXy5에 연결된 LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 경우에는, CD8 T 세포 반응이 ~0.35%였고 CD4 T 세포 반응은 ~0.25%였다 (도 8). 대조적으로, 소수성 분자 (H), 2BXy5에 연결된 최소 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 투여받은 마우스 군의 경우에는, CD8 T 세포 반응이 ~1.9%였고 CD4 T 세포 반응은 ~0.1%였는데, 이는 LP를 전달하는 펩티드 항원 접합체에 비해 CD8 T 세포 반응에 있어서 약 6배 증가를 제공하였지만, CD4 T 세포 반응은 검출가능하지 않았다. 최소 에피토프와 LP 둘 다 ("LP + min")를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 투여받은 마우스 군에서는, CD8 T 세포 반응이 ~0.6%였고 CD4 T 세포 반응이 ~0.5%였는데, 이는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포 사이의 균형을 제공한다 (도 8).
2BXy를 포함하는 소수성 분자 (H), 2BXy5와 비교 시, 덜 강력한 TLR-7/8 효능제, 2B를 포함하는 2B5 소수성 분자 (H)를 사용하는 펩티드 항원 접합체에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다. 따라서, LP를 포함하는 펩티드 항원 (A) 및 2B5 소수성 분자 (H)를 포함한 펩티드 항원 접합체를 투여받은 군에서는, CD8 T 세포 반응이 ~1.0%로 검출되었고 CD4 T 세포 반응은 ~0.75%로 검출된 반면, Min 단독을 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 투여받은 군에서는, CD8 T 세포 반응이 ~4.5%로 검출되었고, CD4 T 세포 반응은 ~0.1%로 검출되었으며, 이는 CD8 T 세포 반응에 있어서의 거의 4배 증가였지만 CD4 T 세포 반응은 검출가능하지 않았다. 소수성 분자 (H) 2B5에 연결된 최소 에피토프와 LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 백신을 투여받은 군에서는, CD8 T 세포 반응이 ~2.2%였고 CD4 T 세포 반응은 ~0.95%였다 (도 8).
요약하면, 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 펩티드 항원 (A)으로서 ME (또는 "Min")를 사용하면, LP를 포함하는 펩티드 항원 (A)과 비교 시 CD8 T 세포 반응에 있어서 예상치 못하게 현저한 증가가 초래되었다. 그러나, 이것은 또한 CD4 T 세포 반응에 있어서의 감소로 이어졌다. 중요하게도, 마우스에 투여되는 면역원성 조성물에 펩티드 항원 (A)으로서 LP와 Min을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 봉입시키면, LP 단독으로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체와 비교 시 CD4 T 세포 반응이 복구되었고 CD8 T 세포 반응이 예상치 못하게 더 높았다. 또 다른 주요 발견은 염증의 양이 면역원성에 현저한 영향을 미쳤다는 것이다. 소수성 분자 (H), 2B5는 소수성 분자 (H), 2BXy5 상에 전달되는 화합물 2, 2BXy보다 거의 10배 덜 강력한 TLR-7/8a, 화합물 1을 함유한다. 따라서, 소수성 분자 (H), 2B5를 포함하는 펩티드 항원 접합체에 대한 CD4 및 CD8 T 세포 반응이, 2BXy5를 사용하는 것과 비교 시 거의 3배 내지 4배 증가하였다는 것은, 아주반트 효력의 조정을 통해 염증 양을 완화시키는 것이 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체에 대한 최적 수준의 면역원성을 달성하는데 바람직할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, MC38 뮤린 종양 세포주로부터 유래된 40개의 상이한 펩티드-기반 신생항원의 면역원성의 스크린에서, 소수성 분자 (H), 2B5에 연결된 최소 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체에 기반한 개인화된 암 백신은 소수성 분자 (H), 2BXy5에 연결된 최소 에피토프로 구성된 펩티드 항원 접합체와 비교 시, 달성된 CD8 T 세포 반응의 폭이 6배 개선되었다 (도 9).
부가의 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체로서 다수의 상이한 T 세포 에피토프를 투여하는 최적의 수단을 확인하고자 하는 연구와 관련되었다. 선행 연구는 동일한 MHC 분자에 결합하는 동일한 부위에 다수의 T 세포 에피토프를 투여하는 것이 APC 상의 MHC 분자에 결합하는 것을 놓고 경쟁할 수 있다는 것과, 이로써 T 세포에 대한 제시를 놓고 경쟁할 수 있으며, 그에 의해 면역화 부위당 단일 에피토프로서 단독으로 전달된 에피토프와 비교 시, 함께 전달된 에피토프에 대한 T 세포 반응의 규모가 더 감소될 수 있다는 것을 제안하였다. 본 발명자들은 단일 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 접합체를 포함한 면역원성 조성물을 마우스에게 투여하면, 1개 또는 4개의 부위에 동일한 MHC 분자 모두에 결합하는 상이한 에피토프를 포함하는 3개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 상기 동일한 에피토프와 공동 투여하는 것과 비교 시, 상기 에피토프에 대항한 더 큰 규모의 T 세포 반응이 초래되었다는 것을 관찰하였지만 (도 10), 예상치 못한 발견은 동일한 동물에서 4개의 별도의 부위에 동일한 4개의 에피토프 (즉, 부위당 1개의 독특한 에피토프)가 전달되는 것이, 4개의 부위에 4개의 에피토프 모두를 함께 전달하는 것보다 더 낮은 반응을 야기시켰다는 것이다 (도 10). 이는 다수의 에피토프를 다수의 부위에 함께 전달하는 것보다는, 에피토프 사이의 경쟁을 피하기 위해 별개의 부위에 다수의 에피토프를 투여하는 것이 더 낫다는 것을 시사하는 현재의 패러다임에 대한 예상치 못한 역설적인 것이었다. 이들 데이터는 각각의 에피토프가 투여되는 부위의 수를 최대화하는 것에 기반하여 다수의 상이한 에피토프를 전달하기 위한 새로운 패러다임을 제안한다. 따라서, 면역 반응을 유도하는 바람직한 방법에서, 다수의 상이한 펩티드 항원 (A)을 포함하는 면역원성 조성물은 면역 반응을 최대화하기 위해 다수의 부위에 투여된다.
실시예 3: 화학식 V의 펩티드 항원 접합체
선행 데이터는 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 파라미터가 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지를 입증한다. 이들 데이터는 입자에서 TLR-7/8a와 함께 펩티드 항원 (A)의 공동 전달을 보장하는 펩티드 항원 접합체가 CD8 T 세포 면역을 유도하기 위한 바람직한 실시양태라는 것을 보여준다. 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체의 제한은 이러한 접근법에 의해 형성된 입자가, 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 (A)의 조성에서의 가변성으로 인해 가변적 크기와 안정성을 가질 수 있다는 것이다. 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 안정화시키는 하나의 가능한 수단은 입자 응집을 방지하고 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자를 수성 매질에서 안정화시키는 표면 전하를 도입하는 것이다.
화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 하전된 분자 (C)를 소수성 분자 (H)에 연결되는 펩티드 항원 (A)에 첨부함으로써 규정된 크기의 안정한 입자가 형성될 수 있게 한다 (도 11). 그러나, 펩티드 항원 (A)에 바로 인접한 소수성 분자 (H) 및/또는 하전된 분자 (C)를 직접적으로 접합하면, APC의 프로세싱 및 제시 기구의 간섭을 유발할 수 있어, MHC-I 및 MHC-II의 맥락에서 최소 에피토프를 제시할 수 있다. 따라서, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체를 사용하여 전달된 최소 에피토프 (Min) 또는 LP에 기반한 펩티드 항원 (A)의 효율적인 프로세싱을 보장하기 위해, 본 발명자들은 펩티드 항원 (A)을 N- 및 C-말단 각각에서 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H)에 연결하는 효소 분해성 연장부 (B1 및 B2)의 사용을 평가하였다 (도 11).
화학식 V의 펩티드 항원 접합체로부터 최소 CD8 T 세포 에피토프의 프로세싱에 대한 연장부 (B1 및 B2)의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 하전된 분자 (C)가 링커 전구체 X1 (Lys(N3))에 대한 C-말단에서 임의적 연장부 (B2)에 연결된 최소 에피토프인 Cpne1의 N-말단에서 임의적 연장부 (B1)에 연결된 일련의 펩티드를 합성하였고, 하전된 분자 (C)와 연장부 (B1 및/또는 B2)가 Cpne1-특이적 CD8 T 세포를 활성화시키기 위하여 펩티드 항원 (A)의 시험관내 효력에 어떻게 영향을 미쳤는지를 평가하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 펩티드 서열은 최소 에피토프의 N- 및 C-말단 (B1 및/또는 B2) 중 하나 또는 둘 다에서 카텝신 절단가능한 연장부, 또는 조합된 카텝신 절단가능한 연장부와 면역 프로테아솜 연장부를 사용하여 제조되었다. 연장부 (B1 및/또는 B2)에 연결된 이들 펩티드 항원 (A) 서열을, APC에 의한 최소 에피토프 Cpne1의 흡수 및 제시를 촉진하기 위한 상이한 구축물의 효율을 평가하기 위해 상이한 농도로 비장세포 배양물에 부가하였다.
예상한 바와 같이, 프로세싱을 요구하지 않고 MHC-I의 맥락에서 직접적으로 부하될 수 있으며 APC에 제시될 수 있는 최소 에피토프 (■, 도 12)가 가장 효율적이었고 시험관 내에서 가장 높은 효력 (가장 낮은 EC50)을 제공하였다. 그러나, 분해성 연장부 (B1)의 사용 없이 하전된 분자 (C) (Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys 서열식별번호: 71)를 최소 에피토프의 N-말단에 직접적으로 부가하면 (◆), 단독으로 사용된 최소 에피토프와 비교 시 효력이 거의 10,000배 감소되었다. 특히, 하전된 분자 (C)와 최소 에피토프 사이에 효소 분해성 테트라펩티드 연장부 (B1) (즉, Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 7)를 단순히 배치함으로써 최소 에피토프의 활성을 복원시켰다 (6각형, 도 12). C-말단에 부가의 카텝신 절단가능한 연장부 (B2)를 배치하거나 (즉, Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 7), 또는 면역 프로테아솜 분해성 서열을 N-말단에서의 카텝신 절단가능한 연장부 (B1) (Ser-Leu-Val-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu 서열식별번호: 72) 또는 C-말단에서의 카텝신 절단가능한 연장부 (B2) (Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13)와 조합하는 것이, 하전된 분자 (C)와 최소 에피토프 펩티드 항원 (A) 사이에 단일 테트라펩티드 연장부 (B1)을 사용하는 것과 비교 시, 효력에 대한 최소한의 부가적인 영향을 가졌다.
그 다음 연구는 소수성 분자 (H)가 2BXy3인 화학식 V의 펩티드 항원 접합체를 사용하여 생체내 항원 교차 제시의 효율에 대한 효소 분해성 연장부 (B1 및 B2)의 영향을 평가하고자 하였다.
화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 합성에 대한 일반적인 계획은 실온 하에 DMSO 중의 1.2 당량의 DBCO 보유 소수성 분자 (H)와 반응성 아지드를 보유하는 1.0 당량의 펩티드 항원을 반응시키는 것이었다. 24시간 후에 반응이 완료되었으며 추가 정제는 요구되지 않았다.
도 13에 제시된 바와 같이, 최소 에피토프 Cpne1의 N- 및 C-말단에서의 효소 분해성 연장부 (B1 및 B2)의 상이한 조합을 사용하여, 상이한 하전된 분자 (C) (예를 들어, Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser 서열식별번호: 73, Glu-Ser-Glu-Ser-Glu-Ser 서열식별번호: 74 및 Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys 서열식별번호: 71)를 수반한 펩티드 항원 접합체를 합성하였다. 0일 및 14일에 도 13에 보고된 상이한 면역원성 조성물로 마우스를 백신접종하고, 제10일 (도 14A) 및 제28일 (도 14B)에 전혈로부터 T 세포 반응을 평가하였다. 도 12로부터의 시험관내 데이터와 일치하여, B1 연장부를 사용하지 않고 최소 에피토프의 N-말단에 3개의 하전된 분자 (C) 중 임의의 것을 배치하면, 단일 면역화로 프라이밍된 동물의 전혈에서의 반응을 평가한 후 CD8 T 세포 반응이 완전히 중단되었다 (전체 CD8+ T 세포의 ~0.1%IFN-γ+) (도 14). 그러나, 최소 에피토프로 구성된 펩티드 항원 (A)의 N-말단과 하전된 분자 (C) 사이에 카텝신 절단가능한 연장부 (B1)를 배치하면, 양으로 하전된 분자 (C) (Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser 서열식별번호: 73)를 사용하는 펩티드 항원 접합체의 CD8 T 세포 반응에 있어서는 거의 10배의 증가가 초래되었고, ES 및 EK 하전된 분자 (C)를 수반한 펩티드 항원 접합체에 대한 CD8 T 세포 반응에서는 중간 정도의 개선이 초래되었다 (도 14). 양으로 하전된 분자 (C) (Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser 서열식별번호: 73)를 포함하는 펩티드 항원 접합체로 백신접종된 군 중에서, N-말단 및 C-말단 카텝신 절단가능한 연장부 (B1 및 B2) 둘 다를 부가하면, 단일 면역화 후 약 3.5%의 CD8 T 세포 반응이 초래된 반면, 카텝신 절단가능한 서열 외에도 B1 및/또는 B2에 면역프로테아솜 서열을 부가하면, CD8 T 세포 반응의 규모에 있어서 중간 정도의 추가 증가만이 야기되었다 (도 14). 하전된 분자 (C)와 소수성 분자 (H) 사이에 N- 및 C-말단 카텝신 절단가능한 연장부 (B1 및 B2) 각각을 포함한 3개 세트의 하전된 분자 (C) 모두를 사용하여 펩티드 항원 접합체에 대한 2회 면역화가 일반적으로, 면역 프로테아솜 링커의 부가에 의한 반응에 있어서의 개선이 거의 없거나 전혀 없이 가장 높은 규모의 반응을 야기한 후의 데이터에서 경향들이 일치하였다.
이들 데이터는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 펩티드 항원의 N-말단에 배치된 카텝신 절단가능한 펩티드 연장부 (B1), 예를 들어, 예컨대 Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7)가, 시험관내 항원 제시 및 생체내 CD8 T 세포의 교차-프라이밍을 촉진시키는 바람직한 실시양태라는 예상치 못한 발견을 예시한다. 카텝신 절단가능한 펩티드 연장부가 N- 및 C-말단 둘 다에 배치되는 경우, 및 C-말단에서의 카텝신 절단가능한 연장부 (B2)가 면역 프로테아솜 프로세싱을 부가적으로 선호하는 서열 (예를 들어, Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg 서열식별번호: 13의 디펩티드 Gly-Gly)과 조합되는 경우에, CD8 T 세포 반응에서의 중간 정도의 부가의 개선이 관찰되었다. 요약하면, 펩티드 항원 접합체의 바람직한 실시양태는 펩티드 항원 (A)의 N-말단과 임의의 부가의 성분, 예를 들어, 하전된 분자 (C) 사이의 카텝신 절단가능한 연장부 (B1); 및 임의로 C-말단에서 카텝신 또는 조합된 카텝신 및 면역 프로테아솜 분해성 연장부 (B2)를 포함한다.
이러한 발견을 연장하기 위해, 본 발명자들은 최소 에피토프, Adpgk의 N- 및 C-말단에서의 카텝신 분해성 연장부 (B1 및 B2)의 상이한 조합 및 조성을 갖는 펩티드 항원 접합체를 합성하였다 (도 15). APC에 의한 최소 에피토프 Adpgk의 흡수 및 제시를 촉진하기 위한 상이한 구축물의 효율을 평가하기 위해, 도 15에 제시된 상이한 조성의 펩티드를 상이한 농도로 비장세포 배양물에 부가하였다. N- 및 C-말단에서의 카텝신 분해성 연장부 (B1 및 B2)의 상이한 조합 및 조성을 갖는 펩티드 항원 Adpgk에 대한 시험관내 결정된 효력 (EC50)이 도 16에 도시되어 있다. 시험관내 발견을 확증하기 위해, 도 15에 제시된 화학식 C-B1-A-B2-X1에 기반한 서열의 서브세트를 소수성 분자 (H), 2B3W2에 연결한 다음, 마우스에게 투여하였다. CD8 T 세포 반응을 제13일에 평가하였고 (도 17), 시험관내 스크린으로부터의 결과와 일치하였는데, 이는 펩티드 항원 (A)을 N- 및 C-말단에서 각각 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H)에 연결하는 카텝신 분해성 연장부가, 시험관 내에서 개선된 항원 제시를 야기시킬 수 있을 뿐만 아니라 생체내 항원 교차 제시의 개선된 효율을 야기할 수 있다는 것을 확증시켜 준다.
입자 크기에 대한 순 전하 및 연장부 서열 (B1 및 B2)의 영향
입자의 표면 전하가 용액에서의 이들의 안정성에 영향을 미치는 것으로 이해되지만, 펩티드 항원 접합체의 전하 밀도 및 순 전하가 수용액에서의 펩티드 항원 접합체의 초분자 어셈블리의 크기 및 안정성에 미치는 영향은 널리 연구되지 않았다.
양친매성 거대 분자의 순 전하와 전하 밀도가 자기 어셈블링 입자의 유체역학적 거동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 큰 이해를 제공하기 위해, 본 발명자들은 다양한 조성의 펩티드 항원 (A), 하전된 분자 (C), 연장부 (B1 및 B2) 및 소수성 분자 (H)를 갖는 일련의 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (도 18)를 합성하였고, 이들 파라미터가 pH 약 7.4 하의 수용액에 현탁된 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하였다 (도 18).
본 발명자들의 초기 연구는 순 전하를 증가시키는 것이 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 안정성에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 조사하였다 (도 18 및 19). 본 발명자들의 결과는 전하의 규모와, 광범위한 상이한 펩티드 항원 (A) (N=754)을 전달하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로 형성된 입자의 크기 사이의 역의 관계를 보여주며, 순 전하 (절대 값) > 6을 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 항원 (A)의 약 90%가 ~20-40 nm 나노입자 미셀로 어셈블리된다. 특히, 나노입자 미셀화를 보장하기 위해 요구되는 순 전하의 규모는 펩티드 항원 (A)의 길이 및 소수친수도에 크게 의존하였으며, LP-기반 펩티드 항원 (A)을 전달하는 대부분의 펩티드 항원 접합체는 +8 이상, 또는 -8 이하의 순 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체로서 미셀을 형성하지만, 안정적인 나노입자 미셀 형성을 보장하기 위해, 가장 고도로 소수성인 항원은 +10 이상 또는 -10 이하의 순 전하를 필요로 한다.
펩티드-기반 PCV에 대한 주요 과제는 인간 게놈으로부터 비롯될 수 있는 임의의 가능한 펩티드 항원을 사용하여 제형 일관성을 보장해야만 한다는 것이다. PCV로서의 SP-7/8a의 일반성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 먼저, 모든 가능한 미스센스 돌연변이 (72.6M 24-mer)를 포함하여, 표준 전사체로부터 비롯되는 모든 가능한 25개 아미노산 펩티드 (11.3M 25-량체)의 전하 및 소수친수도 빈도 분포를 계산하였다. 예상치 못하게, 본 발명자들의 결과는 25개 아미노산 펩티드-기반 신생항원의 98% 초과가 -6 내지 +6 (pH 7.4에서)의 전하 및 +2 내지 -2의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY)을 가질 것이란 사실을 시사한다. 이들 결과는 본원에 사용된 마우스 신생항원의 전하 및 소수친수도 분포가 인 실리코 예측된 인간 신생항원의 특징을 대표한다는 것을 표시한다 (도 19 C&D). 특히, 약 2 내지 4 정수 단위의 순 전하의 중간 정도의 증가 조차도, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 안정성을 현저하게 개선시킨다. 따라서, +6의 순 전하를 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 LP 신생항원의 약 25% 이상이 응집되었지만, +8 이상의 순 전하를 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 상기 동일한 LP 신생항원은 안정한 나노입자 미셀로 어셈블리되었다 (도 19E). 이들 결과는 각각 +6 및 +8 이상 (또는 -6 및 -8 이하)의 순 전하를 갖는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 Min 및 LP 펩티드 항원이 나노입자 미셀로 확실하게 어셈블리된다는 것을 보여준다. 중요하게도, 이들 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체가, 충분한 순 전하가 가능한 25개 아미노산 신생항원의 98%에 적용된다는 것을 보장하기 위해 약 -6 내지 약 +6의 전하 범위를 갖는 25개 아미노산 펩티드 항원 (A)을 수용할 수 있어야만 한다는 것을 시사하며; 따라서, 충분한 양의 전하가 펩티드 항원 (A)에 부가되어 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14개의 하전된 관능기를 보유함) 펩티드 항원 접합체의 필요한 순 전하를 달성하도록 보장하기 위해서는, 적어도 13개의 독특한 하전된 분자 (C) 및 임의적 연장부 (B1 및/또는 B2) 조합이 필요하다.
펩티드 항원 접합체의 순 전하와, 수성 완충제에서 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성 사이의 경향을 보다 철저히 조사하기 위해, 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체 (예를 들어, 펩티드-기반 하전된 분자 (C), 펩티드 연장부 (B1 및 B2) 및 펩티드 항원 (A)을 포함하는 펩티드 항원 단편)를 구성하는 펩티드 서열의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값과, 형성된 입자의 크기 및 안정성 사이의 상호작용을 조사하였다 (도 19F). GRAVY 값, 순 전하 및 입자 크기 간에는 강력한 상호 의존성이 있었다. 따라서, +4의 순 전하 및 0 미만의 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값을 갖는 다수의 펩티드 항원 접합체는 안정한 입자를 형성하였다 (도 19F). 대조적으로, +4의 순 전하 및 0 초과의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 접합체의 약 25%는 응집체를 형성하는 반면, +6의 순 전하 및 0 초과의 GRAVY 값을 갖는 펩티드 항원 접합체는 응집체를 거의 형성하지 않았다. 이들 데이터는 바람직한 실시양태에서, 전달된 펩티드 항원 (A)의 GRAVY 값을 상쇄시키도록 순 전하의 규모가 선택되어야 한다는 것을 표시한다. 바람직한 실시양태에서, 하전된 분자 (C) 및 연장부 (B1 및 B2)의 조성은 +4 이상의 순 전하 또는 -4 이하의 전하를 갖는 펩티드 항원 접합체를 제공하도록 선택되어, 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 안정한 입자의 형성을 촉진시키는데, 심지어 가장 소수성인 펩티드 항원 (A)의 안정한 나노입자 형성을 보장하기 위해 +6 초과 또는 -6 미만의 순 전하가 사용되었다 (도 19 F). 실제로, 고도로 소수성인 LP-기반 항원은 훨씬 더 큰 절대 값의 순 전하를 요구할 수 있다. 따라서, 펩티드 항원 접합체는 0.25 미만의 GRAVY 값을 갖는 LP 펩티드 항원 (A)에 대해 순 전하가 +8 이상 또는 -8 이하여야 하고; 약 0.25 내지 0.75의 GRAVY 값을 갖는 LP 펩티드 항원 (A)에 대해 순 전하가 +9 이상 또는 -9 이하여야 하며; 0.75 초과의 GRAVY 값을 갖는 LP 펩티드 항원 (A)에 대해 순 전하가 +10 이상 또는 -10 이하여야 하며, 여기서 LP는 최소 에피토프보다 더 긴 펩티드 항원 (A), 예를 들어 15개 초과의 아미노산, 전형적으로 20개 이상, 예컨대 25개 아미노산의 펩티드 항원을 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명자들의 분석은 전하 및 소수친수도의 관점에서 극도의 조성을 갖는 펩티드 항원을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 4가지 뮤린 종양 세포주로부터 취한 총 1,377개의 예측된 신생항원 중에서 가장 - 즉, 90번째 백분위 수 또는 그 이상의 - 소수성 (Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu (서열식별번호: 57)), 양으로 하전된 (Lys-Asn-His-Arg-Asn-Arg-Qln-Val-Ile 서열식별번호: 75), 및 음으로 하전된 (Ser-Pro-Glu-Arg-Asn-Asp-Trp-Glu-Pro-Leu 서열식별번호: 76) 서열을 나타내는 3개의 독특한 펩티드 항원 뿐만 아니라 검증된 CD8 T 세포 에피토프 (Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser (서열식별번호: 2))가 평가를 위해 선택되었다. 검증된 CD4 T 세포 에피토프 (PADRE = Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala 서열식별번호: 22)를 포함하는 펩티드 항원 (A)이 또한, 공지된 범용 CD4 T 세포 에피토프로서 본 분석에 포함되었다 (도 18).
입자 크기에 대한 소수성 분자 (H) 길이 및 조성의 영향
펩티드 항원 접합체 상의 순 전하가 형성된 입자의 안정성을 촉진시키는데 결정적인 것으로 밝혀졌지만, 본 발명자들은 이어서, 입자 크기에 영향을 미치는 부가의 요인을 탐색하였다. 선행 연구는 미셀, 리포솜 및 폴리머솜을 포함하는 거대 분자의 길이가 조정되어 형성된 입자의 크기를 변화시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 항원 (A)으로서 모델 CD8 T 세포 에피토프를 사용하여, 본 발명자들은 소수성 분자 (H)의 길이 및 조성이 입자 크기에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 평가하였다 (도 20). 선행 데이터와 일치하게, 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성이, 사용된 다양한 상이한 소수성 분자 (H) 전체에 걸쳐 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 크게 의존적이었다는 것을 밝혀내었다 (도 20). +4 이상의 순 전하를 사용하여, 5개의 트립토판 단위로 구성된 가장 작은 소수성 분자 (H), W5는 ~ 10 nm의 평균 직경을 가진 가장 작은 입자를 초래한 반면, 본 실시예에 사용된 가장 큰 소수성 분자 (H), 2B2W8은 30 내지 100 nm 직경의 입자를 초래하였다 (도 20). 특히, 순 전하가 +4 이상인 경우, 중간 크기의 소수성 분자 (H), 2B5 및 2BXy5는 ~ 10-30 nm 크기의 입자 직경의 중간 크기 입자를 초래하였다.
전체적으로, 이들 결과는 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H)의 정밀하게 규정된 화학적 파라미터가, 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성을 조정하는데 어떻게 사용될 수 있는지에 관한 예상치 못한 발견을 제공한다.
고도로 소수성인 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 안정성에 대한 순 전하의 영향
고도로 소수성인 펩티드 항원 (A)을 전달하기 위한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 내약성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 4가지 뮤린 종양 세포주로부터의 1,377개의 펩티드 신생항원의 라이브러리 중에서 가장 소수성인 LP 신생항원을 선택하고, TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)로서 전달된 LP 또는 Min으로서의 펩티드 항원을 합성하였다 (도 21). SNP-7/8a로서 전달된 소수성 Min (GRAVY = 3.96)을 안정화하기 위해서는 순 전하가 8 이상이어야 하지만, SNP-7/8a로서 전달된 소수성 LP (GRAVY = 2.0)를 안정화하기 위해서는 10 이상의 순 전하가 필요하였다 (도 21). 부가의 예상치 못한 발견은 천연 LP 및 Min이 고체 상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 없었지만; 고체 상 펩티드 합성 동안 수지 상의 펩티드 항원 (A)에 하전된 분자 (C) 및 연장부 (B1 및 B2)를 부가하면, 서열 말단절단을 방지하고 수성 및 유기 용매에서의 개선된 용해도에 기인하여 HPLC 정제를 허용함으로써 그 제조가 개선되었다는 것이다.
면역원성에 대한 펩티드 항원 접합체 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H) 조성의 영향
본 발명자들의 상기 결과는 순 전하가 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 나노입자 미셀을 안정화시키는데 중요하다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 이어서, 최소 에피토프, Adpgk를 전달하는 펩티드 항원 접합체의 면역원성에 대한 하전된 분자 (C) 및 소수성 분자 (H) 조성의 영향을 조사하였다 (도 22 내지 24). 아주반트를 수반하지 않은 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않았지만 (도 22), TLR-7/8a에 연결된 펩티드 항원 접합체의 다른 모든 조성은 강력한 CD8 T 세포 반응을 유도하였다 (도 22). 특히, 하전된 분자 (C)를 수반하지 않은 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체, 및 리신 (즉, 폴리 (K)) 또는 아르기닌 (즉, 폴리 (R))-기반 하전된 분자 (C)를 수반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 0.25 nmol 용량 아래로 투여될 때에도 강력한 CD8 T 세포 반응을 유도하긴 하였지만, 아스파르트산 (즉 폴리(D))-기반 하전된 분자 (C)를 수반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 투여된 동일한 신생항원은 0.25 또는 1 nmol에서 투여될 때 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않았지만, 4 및 16 nmol에서 투여될 때 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 유도하였다. 특히, 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체 (도 22)는 다수의 면역화 후 가장 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 유도하였는데 (전체 CD8 T 세포의 ~30% IFNg+), 이는 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체 또는 화학식 V의 양으로 하전된 펩티드 항원 접합체에 의해 유도된 CD8 T 세포 반응보다 약 1.5 내지 2배 더 높았다. 이들 결과는 마이크로입자 (도 22) 또는 양으로 하전된 나노입자 (도 22)로 자기 어셈블리되는 펩티드 항원 접합체가 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체와 비교 시 CD8 T 세포 반응을 유도하는데 더 강력하지만, TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 음으로 하전된 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)는 더 부스트가능한 CD8 T 세포 반응을 유도하여, 다수의 면역화 후 더 높은 규모의 반응을 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명자들의 발견을 연장하기 위해, 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체의 하전된 분자 (C) 조성이 피하 투여 경로 후에 CD8 T 세포 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 평가하였다 (도 23). 특히, 음으로 또는 양으로 하전된 폴리(아미노산)-기반 하전된 분자 (C)인 폴리(K) 또는 폴리(D) 각각을 수반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는, 중성의 PEG-기반 B1 연장부를 수반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체보다 더 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 유도하였다 (도 23).
중요하게도, TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드-항원 접합체 (SNP-7/8a)는 백신접종의 통상적인 경로 (근육내 (IM), 피하 (SC)) 뿐만 아니라 정맥내 경로 후에 CD8 T 세포 반응을 유도하는데 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다 (도 24).
면역원성에 대한 펩티드 항원 접합체 입자 크기 및 아주반트 효력 및 조성의 영향
TLR 효능제의 양 및 효력 및 입자 크기가 단일 또는 다수의 ('부스터') 면역화 후 T 세포 반응에 어떻게 영향을 미치는지는 이전에 공지되지 않았다. 종래 기술의 상태는 면역 자극제의 양 또는 효력을 증가시키는 것이 더 높거나 적어도 비-열등한 CD8 T 세포 반응을 야기할 것이지만; 생체내 CD8 T 세포 반응의 프라이밍 및 부스팅에 대한 면역 자극제, 예를 들어, TLR 효능제의 양 및 효력의 영향은 널리 연구되지 않았다. 따라서, 본 발명자들의 다음 연구는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 상에 전달되는 효능제의 양 및 효력 및 입자 크기가 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 평가하고자 하였다.
입자 크기 및 효능제 조성이 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 결정하기 위해, 하나는 최소 CD8 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하고 다른 하나는 최소 CD4 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 2개의 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로 마우스에게 백신접종하였다 (도 25). 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 이들이 상이한 양 및 효능의 TLR-7/8 효능제를 전달하는 작은 입자 (~ 20-100 nm 직경 나노입자 (NP))를 형성하는지 아니면 큰 입자 ~ 1,000 nm 직경 마이크로입자 (MP))를 형성하는지에 기초하여 구별되었다. 작은 입자 또는 큰 입자의 각각의 세트 내에서, 펩티드 항원 접합체는 1, 2, 3 또는 5개 분자의 화합물 1, 2B 또는 5개 분자의 더 높은 효력의 효능제인 화합물 2, 2BXy를 함유한 소수성 분자 (H)를 포함하였다. 주어진 면역원성 조성물로 마우스에게 2회 백신접종하고, 각각의 백신접종 후 1주에 혈액에서 T 세포 반응을 측정하였다.
놀랍고도 예상치 못한 발견은 작은 입자 (20-100 nm)와 큰 입자 (~ 1000 nm) 둘 다의 경우에, 소수성 분자 (H)에 연결된 효능제 2B의 양을 증가시키면 CD4 및 CD8 T 세포 반응이 증가되었고, 단일 2B 분자만을 포함하는 소수성 분자 (H)에 연결된 펩티드 항원 접합체를 사용하면 가장 낮은 CD8 및 CD4 T 세포 반응이 야기되었다는 것이다. CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다는 2개의 2B 분자를 부가함으로써 증가되었고, 소수성 분자 (H)에 3 또는 5개의 2B 분자를 부가한 후에는 중간 정도의 부가의 증가가 있었다. 더 강력한 효능제 TLR-7/8a인 2BXy의 3개 이상의 분자를 전달하는 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체가, 덜 강력한 효능제인 2B의 3개 이상의 분자를 전달하는 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체와 비교 시 다수의 면역화 후 더 낮은 CD8 T 세포 반응을 초래하였다는 것을 보여주는 본 발명자들의 이전의 예상치 못한 데이터 (도 6 및 7)와 일치하여, 도 25로부터의 결과는 2BXy5가 중간 정도 효력의 효능제, 2B5를 전달하는 소수성 분자 (H)의 사용과 비교 시 더 낮은 CD8 및 CD4 T 세포 반응을 초래한다는 것을 보여준다. 이러한 예상치 못한 발견, 즉 더 높은 효력의 효능제가 더 낮은 면역 반응을 초래한다는 것은 문헌에 보고된 기존의 발견에 기초하여 예측하지 못하였을 것이다.
요약하면, 펩티드 항원 접합체에 대한 효능제인 화합물 1, 2B의 수를 증가시키면 CD8 T 세포 반응이 일반적으로 더 높아졌지만, 선천적 자극제가 더 높은 효력의 효능제로 변하는 경우에는 이들 반응의 규모가 감소되었다. 따라서, 바람직한 실시양태는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 사용하여 최적의 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위해, 고 밀도의 중간 정도 효력의 TLR-7/8a 효능제 또는 저 밀도의 높은 효력의 TLR-7/8a를 사용한다.
입자 크기
또 다른 놀랍고도 예상치 못한 발견은 ~ 10-200 nm 직경의 작은 입자를 형성하는 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이, 더 큰 입자 (> 1,000 nm 직경)를 형성하는 펩티드 항원 접합체와 비교 시, 더 높은 규모의 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도하였다는 것이다. 예를 들어, 소수성 분자 (H) 2B5에 연결된 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 투여되고 작은 입자를 형성한 군에서의 CD8 T 세포 반응은, 더 큰 입자를 형성한 소수성 분자 (H) 2B5에 연결된 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 투여된 군에 대한 ~0.5%와 비교해서 ~2.5%였다 (도 25). 유사하게, 작은 입자로서 소수성 분자 (H) 2B3W2에 연결된 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 투여된 군에서의 CD8 T 세포 반응은, 큰 입자로서 소수성 분자 (H) 2B3W2에 연결된 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 투여된 군보다 대략 10배 더 높았다.
요약하면, 이들 데이터는 면역원성 조성물에 사용된 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기가 CD8 T 세포 반응에 크고 예상치 못한 영향을 미쳤다는 것을 보여준다. 따라서, 20 내지 100 nm의 입자를 형성하는 펩티드 항원 접합체는 최적의 T 세포 면역을 유도하기 위한 면역원성 조성물에 사용하기에 바람직한 실시양태이다.
전체적으로, 이들 연구는 본 개시내용의 펩티드 항원 접합체를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 최대화하는데 최적인 정확한 물리적 및 화학적 파라미터를 설명한다.
부가의 예상치 못한 발견은 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 유체역학적 거동 및 안정성이, 카이트와 두리틀의 방법 (문헌 [Kyte J, Doolittle RF, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol 157: 105-32, 1983] 참조)을 사용하여 결정된 바와 같이, 펩티드 항원 접합체를 구성하는 펩티드 서열의 순 전하와 소수친수도의 전체 평균 (GRAVY) 값 둘 다에 의존한다는 것이다. 주: GRAVY 값 및 전하 결정은 링커 (L) 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)의 기여를 배제하였다.
따라서, GRAVY 값 > 0.75을 갖는 고도로 소수성인 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체는 이러한 펩티드 항원 접합체의 순 전하가 ≥ (이상) +6 또는 ≤ (이하) -6인 경우에 pH 약 7.4 하의 수성 완충제에서 안정한 입자를 확실하게 형성하였고; GRAVY 값 0.25 내지 0.75를 갖는 중간 정도로 소수성인 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체는 이러한 펩티드 항원 접합체의 순 전하가 ≥ (이상) +5 또는 ≤ (이하) -5인 경우에 pH 약 7.4 하의 수성 완충제에서 안정한 입자를 확실하게 형성하였으며; GRAVY 값 0.25 미만을 갖는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체는 순 전하가 ≥ (이상) +4 또는 ≤ (이하) -4인 경우에 pH 약 7.4 하의 수성 완충제에서 안정한 입자를 확실하게 형성하였다. 따라서, 본 발명자들의 예상치 못한 발견에 기반하여, 하전된 분자 (C) 및 연장부 서열 (B1 및 B2)의 적절한 조성은 임의의 조성의 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 안정한 입자 형성을 촉진시키는 수단으로서 전하를 조정하도록 선택될 수 있다.
면역원성에 대한 펩티드 신생항원의 유체역학적 거동의 영향
다음으로, 본 발명자들은 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)를 사용하는 보다 일관된 제형 (도 26)이, 마이크로입자/응집체 (MP-7/8a)를 초래하는 전하 안정화 없이 LP 신생항원을 소수성 중합체-TLR-7/8a에 연결하는 것과 비교 시, 또는 LP 신생항원을 미립자 아주반트와 혼합하는 (LP + 폴리ICLC) 보다 통상적인 접근법과 비교 시 CTL 반응의 면역원성을 개선시킬 것인지의 여부를 평가하였다 (도 27). 본 발명자들은 평가를 위해 3가지 LP 신생항원, 즉 Adpgk, Cpne1 및 Irgq를 선택하였다. Adpgk는 천연 LP로서 입자로 어셈블리되지만, Cpne1과 Irgq LP 둘 다는 수용성이다 (도 27A).
본 발명자들의 이전의 발견과 일치하여, 입자로서 전달된 신생항원 LP만이 생체내 CD8 T 세포 반응을 유도하였다 (도 27 B&C). 따라서, pICLC와 혼합된 가용성 LP Cpne1 및 Irgq는 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않았지만, MP-7/8a (마이크로입자/응집체) 또는 SNP-7/8a (나노입자)로서 전달된 동일한 신생항원은 높은 규모의 CD8 T 세포 면역의 생성을 야기시켰다 (도 27 B-E). 앞서 언급된 바와 같이, pICLC와 혼합된 가용성 LP가 불활성인 반면, 입자 LP, Adpgk는 배경에 비해 CD8 T 세포 반응에서의 상당한 증가를 유도하였으며, 이는 아주반트, 즉 pICLC가 아니라 펩티드 신생항원의 물리적 형태가, pICLC와 혼합된 Cpne1 및 Irgq LP에 의한 약한 T 세포 반응의 이유가 되는 것으로 예상된다는 것을 표시한다.
입자 포맷으로 신생항원을 전달하는 제형 중에서, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체에 기반한 나노입자 미셀 (SNP-7/8a)이 가장 큰 규모의 반응을 제공하였고, 그 다음으로 큰 규모의 반응을 제공한 것은 마이크로입자 (MP-7/8a) 제형이며, 마지막으로는 아주반트와 혼합된 LP 단독이다 (도 27 B-E). 특히, 단일 면역화 후 나노입자 미셀 (SNP-7/8a)에 의한 반응은 마이크로입자 제형에 의한 반응보다 상당히 (~5-10배) 더 높았지만, 2회 또는 3회 면역화 후의 반응은 거의 동등한 수준이었는데, 이는 더 작은 나노입자 미셀이 마이크로입자와 비교 시 T 세포 유도의 더 신속한 동역학을 갖는다는 것을 표시한다.
면역원성에 있어서의 관찰된 차이를 설명하기 위한 기계론적 연구 결과, 안정한 나노입자 미셀을 형성하는 펩티드 항원 접합체가, 제1일에 림프절 APC에 의한 흡수 및 농도에서의 초기 피크와 함께 배수 림프절로의 가장 많은 양의 신생항원 흡수를 초래한 반면, 마이크로입자는 림프절로의 더 느린 흡수를 나타냈고, 제7일에 농도가 피크에 이르렀으며, 이는 마이크로입자로부터 비롯된 CD8 T 세포 반응의 더 느린 동역학을 설명할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 28). 대조적으로, 가용성 또는 입자 아주반트와 혼합된 가용성 신생항원은 배수 림프절로의 신생항원의 제한된 흡수를 나타냈다. 림프절에서 선천적 면역 활성화의 거의 동등한 규모 및 동역학을 유도하는 아주반트의 모든 입자 제형에도 불구하고, 항원의 입자 형태만이 CD8 T 세포 반응을 초래하였다. 림프절에서의 가용성 신생항원의 제한된 축적이, CD8 T 세포 반응을 유도할 수 없는 이유인 것으로 예상된다.
면역원성에 대한 펩티드 길이의 영향
펩티드 길이는 펩티드 항원 (A) 면역원성에 영향을 미치는 주요 인자로 간주된다. 따라서, 본 발명자들은 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 전달된 펩티드 신생항원의 길이가, 생체 내에서 생성된 CD4 및 CD8 T 세포 반응의 규모에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 조사하였다 (도 29). MC38 종양 세포주로부터 유래된 7가지 펩티드 신생항원을 본원에서 SNP-7/8a로서 지칭된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 최소 에피토프 (min) 또는 LP-기반 펩티드 항원 (A)으로서 제조한 다음, 마우스에게 투여하였다. 본 발명자들의 결과는 SNP-7/8a로서 전달된 신생항원의 min 형태와 LP 형태 둘 다가 거의 동등한 규모의 CD8 T 세포 반응을 이끌어 내는데, 이는 이전에 비-면역원성인 것으로 보고된 4가지 신생항원에 대항한 것을 포함한 배경보다 약 10 내지 100배 더 높다는 것을 보여준다 (도 29 A). 그러나, 예상한 바와 같이, LP는 min과 비교 시 상당히 더 높은 CD4 T 세포 반응을 유도시켰는데, 이는 min이 CD4 에피토프를 인코딩하기에는 너무 짧기 때문인 것으로 예상된다 (도 29 B). 중요하게도, 이들 결과는 펩티드 길이가 CD8 T 세포 반응에 최소한의 영향을 미친다는 것을 나타내며, 입자로 적절히 제형화될 때 제조하기에 더 효율적인 최소 CD4 또는 CD8 에피토프를 함유하는 짧은 펩티드 (7 내지 14개 아미노산)가 LP (> 20개 아미노산)에 비해 백신에 사용하는데 있어서 바람직할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, MHC-II 예측 알고리즘에서의 개선은 CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다를 유도함으로써 LP를 사용할 필요성을 회피하기 위해 최소 에피토프의 사용을 가능하게 해야 한다.
통상적인 접근법과 비교 시 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 신생항원의 면역원성을 벤치마킹한다
그 다음으로, 본 발명자들은 천연 LP를 미립자 아주반트 폴리ICLC와 혼합하는 통상적인 펩티드-기반 백신 접근법을 사용하여 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 본 발명자들의 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")의 활성을 벤치마킹하였다 (도 30). 문헌 [Yadav M, et al. Nature 515(7528):572-576 (2014)]의 발견과 일치하여, 질량 분석법으로 검증되고 예측된 7가지 신생항원 중 2개 (Reps1 및 Adpgk, 둘 다 미립자임)만이 pICLC와 조합될 때 면역원성이었지만; 7가지 LP 신생항원 모두는 SNP-7/8a로서, 즉 화학식 V의 펩티드 항원 접합체로서 전달된 펩티드 항원 (A)으로서 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 이끌어 내었다 (도 30). 특히, 도 30에 도시된 7가지 신생항원 모두는 질량 분석법에 의해 종양 MHC-I에 결합하는 것으로 확인되었으며, 이는 질량 분석법이 펩티드 항원 (A), 예를 들어, 신생항원의 면역원성을 예측하기 위한 신뢰할 수 있는 필터라는 예상치 못한 발견을 제공한다.
최소 에피토프 예측된 결합 친화도와 면역원성 사이의 관계
본 발명자들의 결과는 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 전달된 펩티드-기반 신생항원이 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도하기 위한 고도로 효율적인 접근법이라는 것을 보여준다. 백신 플랫폼의 개선된 효율을 통해, 면역원성에 대한 예측 알고리즘을 개선하는 것이 가능할 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 생체 내에서 192개의 독특한 CD8 T 세포 에피토프를 SNP-7/8a로 스크리닝한 후 예측된 MHC-I 결합과 면역원성 사이의 강한 상관 관계를 관찰하였으며, 고 친화도 에피토프의 거의 50% (IEDB 컨센서스 스코어 < 0.5 백분위수)가 CD8 T 세포 반응을 유발시키는데, 이는 공개된 반응과 비교 시 프라이밍 CD8 T 세포 반응의 효율에 있어서의 거의 5배 증가이다 (도 31). 이들 결과는 인 실리코 예측된 결합 친화도, 특히 IEDB 컨센서스 스코어가 펩티드 항원 (A) 면역원성을 매우 예측한다는 것을 보여준다.
펩티드 항원 접합체는 생체 내에서 종양 제거를 매개하는 강력한 종양-연관 (자기-항원, 신생항원 및 바이러스 항원)-특이적 CD8 및 CD4 T 세포 반응을 이끌어 낸다
본 발명자들은 이전에 보고된 비-면역원성 에피토프에 대항한 CD8 T 세포 반응이 확립된 종양의 제거를 개선시킬 수 있었는지를 조사하였다 (도 32-33). 본 발명자들의 결과는 이전에 비-면역원성인 것으로 보고된 2가지 종양 모델인 MC38 및 B16.F10으로부터의 여러 신생항원이, TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 ("SNP-7/8a")로서 전달될 때 확립 된 종양의 제거를 야기시켰다는 것을 보여준다. 특히, 크라이터(Kreiter) 등은 기존에, 신생항원-특이적 CD4 T 세포 반응이 확립된 B16.F10 종양의 제거를 주로 매개하였다고 보고하였지만, 본 발명자들은 백신의 개선된 효율이 신생항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다를 동원하여 B16.F10의 제거를 매개할 수 있다는 것을 관찰하였다 (도 32 및 34). 중요하게도, 이러한 발견은 SNP-7/8a로서 전달된 바이러스 항원 (HPV E6 및 E7, 도 35)과 자기-항원 (Trp1, 도 32) 둘 다가, 개선된 종양 제거와 연관된 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 이끌어 냈기 때문에 신생항원의 사용을 넘어 확장되었다.
다수의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 안정적이며, 균일한 입자 크기를 나타낸다
PCV 접근법은 T 세포 반응의 폭을 증가시키기 위해 환자에게 다수의 상이한 에피토프의 투여를 요구할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명자들은 다수의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 다중-항원 입자 백신에 사용하기 위해 TLR-7/8a를 공동 전달하는 나노입자로 자기 어셈블리되는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 (SNP-7/8a)의 면역관용을 평가하였다 (도 36). 다수의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자는 신생항원 LP 조성에 관계 없이 20 내지 40 nm의 일관된 입자 크기를 제공하였다 (도 36).
종양-연관 자기-항원 또는 감염성 질환 항원을 전달하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체
본 발명자들의 상기 발견을 확장시키기 위해, 본 발명자들은 T 세포 면역을 유도하기 위한 범용 백신 플랫폼으로서 펩티드 항원 접합체를 사용하는 일반화가능성을 평가하였다. 도 37에 도시된 바와 같이, 종양 유전자 (Kras), 바이러스 (HIV)로부터 유래된 펩티드 및 외래 항원 (즉, 오브알부민)을 포함하는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 모두 안정한 나노입자를 형성하였고, 생체 내에서 높은 규모의 T 세포 반응을 유도하였다.
화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 상이한 소수성 분자 (H) 또는 상이한 하전된 분자 (C)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성
상기 입증된 바와 같이, 펩티드 항원 접합체 백신은 각각의 성분, 예를 들어, 하전된 분자 (C), 연장부 (B1 및 B2), 펩티드 항원 (A), 링커 (L), 및 소수성 분자 (H)의 광범위한 상이한 조성을 허용할 수 있는 모듈형 플랫폼이다. 일부 실시양태에서, 가장 생리학적으로 관련된 pH 범위, 예를 들어, pH 4.5 내지 약 pH 8.5에 걸쳐 pH 독립적인 관능기를 포함하는 하전된 분자 (C)를 포함시키는 것이 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 포스포세린 또는 트리메틸-리신 (pH 독립적 4급 암모늄) 아미노산을 각각 포함하는 하전된 분자 (C)를 사용하여 순 음전하 또는 순 양전하를 갖는 펩티드 항원 접합체를 합성하였다 (도 38). 본 발명자들의 결과는 포스포세린 또는 트리메틸-리신 기반 하전된 분자 (C)를 포함한 펩티드 항원 접합체가 안정적인 나노입자를 형성하고 높은 규모의 T 세포 반응을 유도하는 반면, 하전된 분자 (C)를 수반하지 않는 펩티드 항원 접합체는 응집체를 형성한다는 것을 보여준다.
이러한 발견을 확장하기 위해, 본 발명자들은 화학식 III의 아주반트에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 DBCO 보유 소수성 분자 (H)의 상이한 길이, 즉 30개 아미노산 (2B5W10G10으로서 지칭된 화합물 20) 및 15개 아미노산 (2B5G10으로서 지칭된 화합물 16)를 갖는 펩티드 항원 접합체를 생산하였다. 예상치 못한 발견은 소수성 블록 상의 아민 및 방향족 기의 함량을 증가시키면, 더 적은 수의 방향족 기 또는 아민을 갖는 소수성 블록과 비교시, 유기 용매 용해도가 개선되었고 그에 따라 제조가 개선되었다는 것이다. 따라서, 더 긴 쇄임에도 불구하고, 2B5W10G10 및 그의 펩티드 전구체는 2B5G10 및 그의 전구체보다 제조하기에 더 효율적이었다.
2가지 상이한 소수성 분자 (H)인 2B5W10G10 및 2B5G10을, 펩티드 항원 (A)으로서 긴 펩티드-기반 신생항원을 포함하는 펩티드 항원 단편에 트리아졸 링커 (L)를 통해 연결시켜 화학식 V의 펩티드 항원 접합체를 형성하였다. 본 발명자들의 초기 발견과 일치하여, 안정한 나노입자 형성은 상이한 소수성 분자 (H)를 포함하는 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 의존적이었다 (도 38). 예상치 못하게도, 소수성 분자 (H) 상의 소수성 기의 높은 밀도에도 불구하고, 두 펩티드 항원 접합체는 안정적인 나노입자 미셀을 형성하였고, 생체 내에서 높은 규모의 T 세포 반응을 유도하였다 (도 38). 일부 실시양태에서, 보다 긴 소수성 분자 (H)는 정맥내 경로에 의해 전달되는 백신에 요구될 수 있는 바와 같이, 펩티드 항원 접합체의 동역학적 안정성을 개선시키기 위해 사용된다.
상이한 PRR 효능제에 연결된 화학식 II의 폴리(아미노산)에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성
면역원성 조성물의 상기 예는 주로, TLR-7/8a (예를 들어, 화학식 III의 아주반트)에 연결되거나 또는 리간드에 연결되지 않은 소수성 분자 (H)로 구성된 펩티드 항원 접합체를 사용하였지만, 소수성 분자 (H)는 임의의 리간드에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 소수성 분자 (H) 상에 포함되는 반면, 다른 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖지 않는 리간드가 소수성 분자 상에 포함된다. 아주반트 특성을 갖는 상이한 리간드를 전달하는 펩티드 항원 접합체의 일반화가능성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 TLR-4 효능제 (즉, WW(PI)WW), TLR-2/6 효능제 (즉, WW(PI)WW), TLR-7 효능제 (즉, CL264-W5), NOD 효능제 (뮤라밀-W5) 및 STING의 효능제 (즉, DMXAA-W5)를 포함한 상이한 리간드에 연결된 화학식 II의 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체를 합성하였다. 본 발명자들의 초기 발견과 일치하여, 안정한 나노입자 형성은 상이한 소수성 분자를 포함하는 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 의존적이었으며 (도 39), 아주반트 특성을 갖는 상이한 리간드를 포함하는 소수성 분자 (H)에 기반한 상이한 면역원성 조성물 모두는 측정가능한 T 세포 면역을 유도하였다. 특히, TLR-7 효능제는 가장 높은 규모의 반응을 유도하였고, 따라서 TLR-7 또는 TLR-7/8 효능제는 감염성 질환 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 T 세포 반응을 유도하기 위한 펩티드 항원 접합체의 바람직한 실시양태에 사용된다.
상이한 링커 화학 (아미드 및 티오-에테르)을 사용하여 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H)에 부착한다
펩티드 항원 접합체의 바람직한 실시양태는 클릭 화학을 사용하여 링커 전구체 X1 및 링커 전구체 X2로부터 링커 (L)를 형성하지만, 다른 유형의 링커 화학이 적합하다. 따라서, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 아미드 또는 티오-에테르 기반 링커 (L)를 사용하여 소수성 분자 (H)에 연결되며, 여기서 링커 (L)는 펩티드 항원 (A)의 N- 또는 C-말단을 통해 연결되었다. 본 발명자들의 결과는 아미드 링커 (L)를 통해 소수성 분자 (B)에 연결된 펩티드 항원 (A)이 티오에테르 링커 (L)를 사용하여 연결된 것과 비교 시 더 높은 규모의 반응을 유도시키긴 했지만, 아미드 또는 티오-에테르를 포함하는 링커 (L)에 펩티드 항원의 N- 또는 C-말단을 통해 (B1 또는 B2 연장부를 통해) 연결된 펩티드 항원 (A)이 안정적인 나노입자를 형성하고 생체 내에서 높은 규모의 T 세포 반응을 유도한 펩티드 항원 접합체를 야기시켰다는 것을 보여준다 (도 40). 따라서, 바람직한 실시양태에서, 안정적인 아미드 또는 트리아졸 링커 (L)는 펩티드 항원 (A)을 소수성 분자 (H)에 직접적으로 또는 연장부 (B1 또는 B2)를 통해 연결시키기 위해 사용된다.
지방산, 지질 및 콜레스테롤에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성
펩티드 항원 접합체의 바람직한 실시양태는 중합체, 예를 들어, 폴리(아미노산) 또는 A-B 유형 디-블록 공중합체로 구성된 소수성 분자 (H)를 사용하지만, 소수성 분자 (H)는 각종 다른 소수성 분자, 예컨대 지방산, 지질, 및 콜레스테롤에 기반할 수 있다. 따라서, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 미리스트산 (Myr 또는 C14, 화합물 49 및 52), 팔미트산 (Palm 또는 C16, 화합물 51 및 53), 콜레스테롤 (Chol, 화합물 57 및 58) 및 디아실 지질 (Pam2Cys, 화합물 54 및 55)에 기반한 소수성 분자 (H)에 연결되었다. 본 발명자들의 초기 발견과 일치하여, 안정한 나노입자 형성은 상이한 소수성 분자를 포함하는 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 의존적이었고 (도 41), +6 이상의 순 전하는 안정한 나노입자 형성을 초래하였다. 중요하게도, 지방산, 콜레스테롤 및 지질 기반 소수성 분자 (H)에 기반한 펩티드 항원 접합체의 면역원성 조성물은 생체 내에서 높은 규모의 T 세포 반응을 유도하였다 (도 41). 지방산, 콜레스테롤 및 지질 기반 입자는 펩티드 항원 접합체로서의 입자 형성 및 생물학적 활성 측면에서 적합한 성능을 명확하게 보여주었지만, 한가지 제한은 지방산, 콜레스테롤 및 지질에 기반한 소수성 분자 (H)가, 많은 용매에서의 이들 물질의 제한된 용해도 (예를 들어, DMSO, DMF 및 많은 알콜에서의 불량한 용해도)로 인해 제조하기가 더 어려워지므로, 생물학적으로 더 강한 염소화 용매 (예를 들어, 디클로로메탄 및 클로로포름)를 필요로 하게 되고, 이는, 예를 들어, 대부분의 유기 용매 (예를 들어, DMSO, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등)에서 가용성인 방향족 기를 포함하는 중합체로 구성된 소수성 분자 (H)와 비교 시, 특히 개인화된 백신 전략의 경우에 특징 규명 및 정제를 더욱 어렵게 만들고 안전성 위험을 증가시킨다.
A-B 유형 디-블록 공중합체에 기반한 상이한 소수성 분자 (H)로 구성된 화학식 IV 및 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성
화학식 IV 및 화학식 V의 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A)을 HPMA-기반 디-블록 공중합체에 부착시킴으로써 제조하였다 (화합물 68 내지 72 참조). 예상치 못하게도, 미셀 형성 디-블록 공중합체는 펩티드 항원 단편의 순 전하와 무관하게 고도로 안정적인 나노입자 미셀을 형성하였다 (도 42). 따라서, 소수성 분자 (H)가 HPMA 단량체로 구성된 디-블록 공중합체인 일부 실시양태에서, 화학식 IV의 펩티드 항원 접합체가 바람직할 수 있다. 디-블록은 온도와 무관하게 수성 조건에서 입자를 형성할 수 있거나, 또는 입자 형성은 온도 의존적일 수 있다. 더욱이, 리간드는 디-블록 공중합체의 말단 또는 측기에서, 두 블록 중 하나 상에 포함될 수 있다. 본 발명자들의 결과는 HPMA 단량체로 구성된 A-B 유형 디-블록 중합체가 안정적인 나노입자 형성을 보장하고, 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 소수성 분자 (H)로서 포함되는 경우에 높은 규모의 T 세포 반응을 초래한다는 것을 보여준다 (도 42).
입자에 연결된 펩티드 항원 (A)에 기반한 화학식 V의 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 안정성
바람직한 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 소수성 분자 (H)를 포함하지만; 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 접합체는 미리 형성된 입자 (P)를 포함한다. 입자 (P)를 포함하는 화학식 V의 펩티드 항원 접합체에 기반한 입자의 안정성에 대한 펩티드 항원 단편의 전하의 의존성은 상이한 순 전하를 갖는 펩티드 항원 단편 (C-B1-A-B2-)을, 리포솜, 폴리스티렌, 규산 및 산화철 입자에 기반한 미리 형성된 입자 (P)에 부착함으로써 평가되었다. 본 발명자들의 초기 발견과 일치하여, 안정한 나노입자 형성은 상이한 소수성 분자를 포함하는 펩티드 항원 접합체의 순 전하에 의존적이었다 (도 43).
면역관용을 유도하기 위해 사용되는 자가-항원을 전달하는 펩티드 항원 접합체의 입자 크기 및 생물학적 활성
펩티드 항원 접합체는 또한 면역관용 또는 억제성 조절 T 세포를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 면역관용 또는 면역 억제를 유도하기 위한 바람직한 실시양태에서, 아주반트 특성을 갖는 리간드는 전형적으로 포함되지 않는다. 대신에, 펩티드 항원 접합체는 펩티드 항원 (A), 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 및 임의적 링커 (L), 하전된 분자 (C) 및 연장부 (B1 및/또는 B2)를 포함하는 입자를 포함해야 하며, 여기서 아주반트 특성을 갖는 리간드는 포함되지 않는다. 면역관용 또는 억제를 유도하기 위해 사용하기 위한 본원에 기재된 펩티드 항원 접합체의 일반화가능성을 평가하기 위해, 관절염 (즉, 콜라겐 II) 및 MS와 유사한 CNS 증후군 (즉, 미엘린 희돌기아교세포 당단백질, "MOG")을 유도하기 위한 모델 자가-항원이 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 상의 펩티드 항원 (A)으로서 생산되었다. 본 발명자들의 초기의 결과와 일치하여, 화학식 V의 펩티드 항원 접합체 상에 전달된 자가-항원은 안정한 나노입자로 어셈블리되었고, 낮은 수준의 조절 T 세포 반응을 유도하였다 (도 44).
A-H + C-H 또는 A-H(C) (화학식 VI)로 구성된 입자의 입자 크기 및 생물학적 활성
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하전된 분자 접합체 (예를 들어, C-[A']-[L]-H)와 혼합된 하전된 분자를 수반하지 않는 펩티드 항원 접합체 (예를 들어, A-[B2]-[L]-H)로 구성된 입자를 포함한다. 예를 들어, LP 신생항원 (Adpgk)으로 구성된 펩티드 항원 접합체는 트리아졸 링커 (L)를 통해 소수성 분자 2B3W2에 연결되어 펩티드 항원 접합체 (A-L-H)를 형성하였으며, 이를 하전된 분자 접합체 (C-H), 화합물 42 (K10-2B3W2)와 혼합하여 안정한 나노입자를 형성하였는데, 이는 높은 규모의 T 세포 면역을 유도시켰다 (도 45). 또 다른 실시양태에서, LP 신생항원 (Adpgk)으로 구성된 펩티드 항원 접합체는 트리아졸 링커 (L)를 통해 소수성 분자 2B3W2에 연결되어 펩티드 항원 접합체 (A-L-H)를 형성하였으며, 이를 보존된 항원 A'를 부가적으로 포함하는 하전된 분자 접합체 (즉, C-A'-H)와 혼합하여 안정한 나노입자를 형성하였는데, 이는 높은 규모의 T 세포 면역을 유도시켰다 (도 45).
또 다른 한편으로는, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)에 연결되는 소수성 분자 (H)에 연결되어 화학식 VI의 펩티드 항원 접합체를 형성할 수 있다. 비제한적 예에서, 펩티드 신생항원 (Adpgk)은 화학식 A-[L]-H(C)의 펩티드 항원 접합체 상에 펩티드 항원 (A)으로서 전달되고, 이로써 생성된 접합체는 안정한 나노입자를 형성하고 높은 규모의 T 세포 면역을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 입자를 포함하는 면역원성 조성물의 바람직한 실시양태에서, 하전된 분자 (C)는 펩티드 항원 (A)에 대한 직접 또는 간접 연결을 통해 제공되거나, 또는 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자와 회합되는 별도의 분자 상에 제공될 수 있다.
중요하게도, 본 개시내용은 종양-연관 항원 (자기-항원, 신생항원 및 바이러스 항원), 감염성 질환 항원 및 외래 항원을 포함한 펩티드 항원 (A)에 대항하여 생성된 T 세포의 규모 및 폭에 있어서의 예상치 못한 개선을 야기하는, 펩티드 항원 접합체로서 지칭되는 신규 펩티드-기반 백신 접근법을 기재한다. 아주반트를 배제한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 또한, 자가면역 및/또는 알레르기를 치료하는데 유용할 수 있는, 자가 항원에 대항한 낮은 수준의 면역관용성 / 억제성 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
본 개시내용에서, 본 발명자들은 최소 에피토프 (ME)를 포함하는 펩티드 항원 (A)이, 펩티드 항원 접합체로 구성된 나노입자로서 둘 다를 전달함으로써 약동학에 대해 정규화될 때 합성 긴 펩티드 (SLP)로서 전달된 동일한 ME보다 더 높은 규모의 CD8 T 세포 반응을 초래할 수 있다는 예상치 못한 발견을 명확하게 보여주었다. 부가적으로, 본 발명자들은 펩티드 항원 접합체로서 SLP 내에 전달된 ME가 단일 면역화 후에 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않지만, 펩티드 항원 접합체로서 전달된 ME는 아마도, APC에 의한 MHC I 분자의 맥락 내에서 ME의 세포 표면 제시를 증가시켜 주는 보다 효율적인 프로세싱를 통해 상기 반응을 유도하는 예를 제공한다. 이러한 ME 기반 백신은 T 세포 반응의 폭을 확장시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 확립된 종양의 성장을 감소시키는 것과 관련하여 부가적으로 기능적인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들의 예상치 못한 발견에 기반하여, 면역원성 조성물의 바람직한 실시양태는 최소 에피토프, 또는 ME와 SLP의 조합에 기반하여 펩티드 항원 (A)을 전달하는 펩티드 항원 접합체를 사용한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원 (A)은 SLP (또는 "LP")이다.
더욱이, 다양한 특성을 갖는 펩티드 항원 (A)을 전달하는 입자의 물질 부하 및 크기 및 안정성에 대한 개선된 제어를 제공하기 위해, 본 발명자들은 수성 완충제 중에서 미셀 및 나노-크기의 초분자 회합체로 어셈블리되는 펩티드 항원 접합체로서 펩티드 항원 (A)을 전달하기 위한 신규 접근법을 본원에 개시한다. 중요하게도, 본 발명자들은 규정된 크기의 안정한 입자가 임의의 가능한 펩티드 항원 (A)에 대해 달성될 수 있다는 것을 보장하도록, 임의적 입자-안정화 하전된 분자 (C), 소수성 분자 (H) 임의적 (링커) 및 임의적 연장부 서열 (B1 및 B2)을 포함한 펩티드 항원 접합체의 조성을 최적화시킬 수 있는 방법을 보여준다. 본 발명자들은 소수성 분자 (H)의 길이 및 소수성 특징을 조정하고, 또한 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 전하를 조정함으로써, 신뢰성 있는 입자 형성 및 개선된 안정성이 달성될 수 있다는 것을 보여준다.
펩티드 항원 접합체를 구성하는 T 세포 에피토프의 프로세싱을 개선하기 위한 수단으로서, 본 발명자들은 수성 조건에서 안정적이지만 항원 제시 세포의 엔도솜 내의 효소에 의해 우선적으로 가수분해되는 N- 및 C-말단 연장부 (B1 및 B2 또는 '연장부')를 사용함으로써, 항원의 프로세싱 및 제시를 그러한 세포로 제한하고, APC 내에서의 최소 CD8 및/또는 CD4 T 세포 에피토프의 효율적인 방출을 촉진시키는 유용성을 입증한다.
최종적으로, 본 개시내용에서, 본 발명자들은 T 세포 면역을 촉진시키는데 필요한 PRR 효능제 기반 면역 자극제의 최적의 조성, 수 및 효력을 체계적으로 평가하였다. 본 발명자들은 IL-12 및 유형-I IFN의 생산을 유도하는 TLR 효능제의 수 및 효력에 있어서의 점진적인 증가가 초기에는, T 세포 반응의 규모를 개선시키지만, 예상치 못한 새로운 발견에서는 그러한 부가의 증가가 더 좁은 항원 폭 및 더 낮은 규모의 T 세포 반응을 초래한다는 데이터를 제공한다. 따라서, 본 발명자들은 T 세포 면역의 최적의 규모, 품질 및 폭을 제공하는데 바람직한, 소수성 분자 (H)에 부착된 면역 자극제 (즉, PRR 효능제)의 조성, 수 및 효력을 보고한다.
요약하면, 본원에 개시된 예상치 못한 발견은 하기에 관한 것이다:
i. T 세포 면역의 신뢰성 있는 프라이밍을 보장하기 위해 암 백신에 사용되는 펩티드 항원 (A)의 최적의 길이.
ii. 펩티드-기반 백신의 제조를 용이하게 하고, 입자 안정성을 촉진하고, APC에 의한 효율적인 제시를 가능하게 하는 프로세싱을 용이하게 하는 펩티드 항원 연장부 서열, 즉 N- 및/또는 C-말단 연장부 (B1 및/또는 B2)의 사용.
iii. T 세포 면역을 촉진시키기 위한 최적의 크기의 입자를 유도하고 안정화시키는데 필요한 하전된 분자 (C)의 조성 및 펩티드 항원 접합체의 순 전하.
iv. 소수성 분자 (H) 길이 및 조성이, 펩티드 항원 접합체에 의해 형성된 입자의 크기 및 안정성 뿐만 아니라 생체 내에서의 그의 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지에 관한 것.
v. 소수성 분자 (H) 상에 포함된 리간드 (예를 들어, PRR 효능제)의 효력 및 정성적 특징이 T 세포 반응의 폭, 규모 및 품질에 어떻게 영향을 미치는지에 관한 것.
본 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"라는 단어 및 "포함하는" 및 "포함한"과 같은 변형은 언급 된 정수 또는 정수 군의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않거나; 또는 언급된 조성(들)을 포함하지만, 임의의 다른 조성(들)의 배제는 아니다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은 그러한 선행 기술이 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 임의의 형태의 제안에 대한 인정이 아니며, 그렇게 간주되어서는 안된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그의 사용에 있어서 기재된 특별한 적용으로 제한되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 본원에 기재되거나 또는 도시된 특별한 요소 및/또는 특색과 관련하여 그의 바람직한 실시양태로 제한되지 않는다. 본 발명은 개시된 실시양태(들)로 제한되지 않지만, 하기 청구범위에 의해 제시되고 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서도 수많은 재배열, 변형 및 대체가 가능한 것으로 인지할 것이다.
SEQUENCE LISTING - 13ter <110> Avidea Technologies, Inc. National Institutes of Health <120> PEPTIDE-BASED VACCINES, METHODS OF MANUFACTURING, AND USES THEREOF FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE <130> AVI-03-PCT <150> US 62/481,432 <151> 2017-04-04 <150> US 62/617,519 <151> 2018-01-15 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Ser Ser Pro Tyr Leu His Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Lys Pro Leu Arg Tyr Leu Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ser Leu Val Leu 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Glu Leu Val Arg 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Ser Pro Val Arg 1 <210> 7 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 Gly Ile Pro Val His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu 1 5 10 15 Met Ser Ser Ile Val His Gln Gln Val Phe Pro Thr 20 25 <210> 84 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 Asp Phe Thr Gly Ser Asn Gly Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Ser Leu His 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Pro Thr Gly Val Asn Glu Tyr 20 25 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Lys Ala Arg Asp Glu Thr Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ala Pro Leu Phe Val Pro Pro Ala Asp 20 25 <210> 86 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 Ser Lys Leu Leu Ser Phe Met Ala Pro Ile Asp His Thr Thr Met Ser 1 5 10 15 Asp Asp Ala Arg Thr Glu Leu Phe Arg Ser 20 25 <210> 87 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Glu Ala Gly Gln Ser Leu Val Ile Ser Ala Ser Ile Ile Val Phe Asn 1 5 10 15 Leu Leu Glu Leu Glu Gly Asp Tyr Arg 20 25 <210> 88 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 88 Asp Ile Asp Pro Ser Ser Ser Val Leu Phe Glu Tyr Met Glu Lys Pro 1 5 10 15 Asp Phe Ser Leu Phe Ser Pro 20 <210> 89 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Gly Arg Val Leu Glu Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val 1 5 10 15 Val Leu Gln Ile Met Glu Leu Cys Gly Ala Thr Arg 20 25 <210> 90 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 Glu Thr Leu Gly Glu Ile Ser Phe Leu Leu Ser Leu Asp Leu His Phe 1 5 10 15 Thr Asp Gly Asp Tyr Ser Ala Gly Asp 20 25 <210> 91 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Thr Cys Gln Phe Thr His Val Glu Asn Gly 1 5 10 15 Thr Asn Tyr Ile Val Thr Ala Thr Arg 20 25 <210> 92 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 Val Val Asp Arg Asn Pro Gln Phe Leu Asp Pro Val Leu Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser 20 25 <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Asn Ile Glu Gly Ile Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Lys Pro Phe Leu 1 5 10 15 Val Asn Asn Lys Ile Asn Lys Ile Glu Asn Ile 20 25 <210> 94 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 Met Ala Ala Ala Leu Thr Phe Arg Arg Leu Leu Thr Leu Pro Arg Ala 1 5 10 15 Ala Arg Gly Phe Gly Val Gln Val Ser 20 25 <210> 95 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 Gly Arg Gly His Leu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Ile Val Gly Lys Gln 1 5 10 15 Val Leu Leu Gly Arg Lys Val Val Val Val Arg 20 25 <210> 96 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 Gln Gly Thr Asp Val Val Ile Ala Ile Phe Ile Ile Leu Ala Met Ser 1 5 10 15 Phe Val Pro Ala Ser Phe Val Val Phe 20 25 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 Leu Lys Ser Ser Pro Glu Arg Asn Asp Trp Glu Pro Leu Asp Lys Lys 1 5 10 15 Val Asp Thr Arg Lys Tyr Arg Ala Glu 20 25

Claims (57)

  1. 하기를 포함하는 펩티드 항원 접합체로서,
    a. 펩티드 항원 (A); 및
    b. 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나,
    여기서 펩티드 항원 (A)은 직접적으로, 또는 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되는 임의적 N-말단 연장부 (B1) 또는 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 연결되는 임의적 C-말단 연장부 (B2)를 통해 간접적으로 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나에 연결되고, 임의로 여기서 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P)는 링커 (L)를 통해 간접적으로 연장부 (B1 또는 B2)에 연결되는 것인
    펩티드 항원 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 하전된 분자 (C)를 추가로 포함하는 펩티드 항원 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 펩티드 항원 접합체가 pH 약 7.4 하의 수성 완충제 중에서 약 +3 이상 또는 약 -3 이하의 순 정전하를 갖는 것인 펩티드 항원 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하전된 분자 (C), 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나가 둘 다 펩티드 항원 (A)의 N-말단 또는 C-말단 중 하나에 직접적으로, 또는 임의적 N-말단 연장부 (B1) 또는 임의적 C-말단 연장부 (B2) 각각을 통해 부착되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 하전된 분자 (C), 및 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나가 펩티드 항원 (A)의 반대쪽 말단에 부착되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  6. 제5항에 있어서, (i) 하전된 분자 (C)가 N-말단 연장부 (B1)를 통해 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 부착되고, (ii) 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나가 C-말단 연장부 (B2)를 통해 펩티드 항원 (A)의 C-말단에 부착되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 연장부 (B1)가 아미노산 PN1을 포함하는 효소 분해성 펩티드 서열을 포함하며, 여기서 PN1은 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신, 또는 메티오닌으로부터 선택되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 PN1을 포함하는 효소 분해성 펩티드 서열이 하기 중 적어도 하나를 부가적으로 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체:
    a. 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택된 아미노산 PN2;
    b. 글리신, 세린, 프롤린 또는 류신으로부터 선택된 아미노산 PN3;
    c. 아르기닌, 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신 또는 세린으로부터 선택된 아미노산 PN4; 또는
    d. a-c의 조합 중 임의의 것.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    효소 분해성 펩티드 서열이 하기로부터 선택된 테트라펩티드를 포함하며:
    a. Ser-Leu-Val-Cit;
    b. Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 4);
    c. Ser-Pro-Val-Cit;
    d. Gly-Pro-Val-Cit;
    e. Gly-Pro-Leu-Cit;
    f. Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 5);
    g. Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6);
    h. Ser-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 21);
    i. Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7);
    j. Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8);
    k. Glu-Leu-Val-Cit;
    l. Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 10);
    m. Glu-Pro-Val-Cit; 또는
    n. Glu-Gly-Val-Cit,
    여기서 Glu는 Asp로 대체될 수 있고/있거나; 여기서 Arg는 Lys로 대체될 수 있는 것인
    펩티드 항원 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 연장부 (B2)가 하기를 포함하는 효소 분해성 펩티드 서열을 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체:
    i. 글리신, 세린, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 단일 아미노산 PC1';
    ii. PC1'가 글리신 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'가 글리신, 세린, 프롤린, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 것인 디펩티드;
    iii. PC1'가 글리신 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'가 글리신, 세린, 또는 프롤린으로부터 선택되고; PC3'가 글리신, 세린, 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 것인 트리펩티드;
    iv. PC1'가 글리신 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'가 글리신, 세린, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC3'가 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC4'가 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 것인 테트라펩티드;
    v. PC1'가 글리신 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'가 글리신, 세린, 프롤린, 아르기닌, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택되고; PC3'가 글리신, 세린, 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC4'가 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC5'가 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 것인 펜타펩티드; 또는
    vi. PC1'가 글리신 또는 세린으로부터 선택되고; PC2'가 글리신, 세린 또는 프롤린으로부터 선택되고; PC3'가 글리신, 세린, 프롤린, 아르기닌, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택되고; PC4'가 프롤린 또는 류신으로부터 선택되고; PC5'가 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되고; PC6'가 아르기닌, 리신, 시트룰린, 글루타민, 트레오닌, 류신, 노르류신 또는 메티오닌으로부터 선택된 것인 헥사펩티드.
  11. 제10항에 있어서, C-말단 연장부 (B2)가 하기를 포함하는 효소 분해성 펩티드 서열을 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체:
    a. 하기로부터 선택된 헥사펩티드:
    i. Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 11);
    ii. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 13);
    iii. Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 61);
    iv. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit;
    v. Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit;
    vi. Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit;
    vii. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 14);
    viii. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 15);
    ix. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 16);
    x. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Cit; 및
    여기서 Glu는 Asp로 대체될 수 있고/있거나; Arg는 Lys로 대체될 수 있음; 또는
    b. 하기로부터 선택된 펜타펩티드:
    i. Gly-Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 17);
    ii. Gly-Ser-Pro-Val-Cit;
    iii. Gly-Ser-Pro-Leu-Cit;
    iv. Gly-Ser-Leu-Val-Cit;
    v. Gly-Lys-Pro-Val-Cit;
    vi. Gly-Lys-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 18);
    vii. Gly-Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 19);
    viii. Gly-Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 20); 및
    여기서 Glu는 Asp로 대체될 수 있고/있거나; Arg는 Lys로 대체될 수 있음; 또는
    c. 하기로부터 선택된 테트라펩티드:
    i. Ser-Leu-Val-Cit;
    ii. Ser-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 4);
    iii. Ser-Pro-Val-Cit;
    iv. Ser-Pro-Leu-Cit;
    v. Glu-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 5);
    vi. Ser-Pro-Val-Arg (서열식별번호: 6);
    vii. Ser-Leu-Val-Arg (서열식별번호: 7);
    viii. Lys-Pro-Leu-Arg (서열식별번호: 8);
    ix. Glu-Leu-Val-Cit;
    x. Glu-Leu-Val-Leu (서열식별번호: 10);
    xi. Glu-Pro-Val-Cit; 또는
    xii. Glu-Gly-Val-Cit; 및
    여기서 Glu는 Asp로 대체될 수 있고/있거나; Arg는 Lys로 대체될 수 있음; 또는
    d. 하기로부터 선택된 트리펩티드:
    i. Gly-Ser-Gly;
    ii. Gly-Ser-Arg;
    iii. Gly-Ser-Leu;
    iv. Gly-Ser-Cit;
    v. Gly-Pro-Gly;
    vi. Gly-Pro-Arg;
    vii. Gly-Pro-Leu;
    viii. Gly-Pro-Cit; 또는
    e. 하기로부터 선택된 디펩티드:
    i. Gly-Ser;
    ii. Gly-Pro;
    iii. Gly-Arg;
    iv. Gly-Cit; 또는
    f. Gly, Ser, Ala, Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Met, Thr, Gln 또는 Nle로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 아미노산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 (P)가 폴리스티렌, 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA), 리포솜, 알루미늄의 미네랄 염 또는 에멀젼을 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 분자 (H)가, 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 약 0.1 mg/mL에 이르기까지 불용성인, 분지된, 장쇄 또는 시클릭 지방족 분자, 또는 지방산, 지질 또는 스테롤 유도체인 펩티드 항원 접합체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 분자가 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메트(아크릴레이트), 메트(아크릴아미드), 스티릴 단량체, 비닐 단량체, 디옥소포스폴란, 시클릭 에스테르, 자연 또는 비-자연 아미노산으로부터 선택된 단량체 단위에 기반한 중합체, 및 디올 또는 디아민과 디- 또는 폴리-이소시아네이트와의 반응으로부터 발생하는 중합체를 포함하며, 임의로 여기서 아주반트가 이러한 중합체를 구성하는 하나 이상의 단량체에 연결되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 소수성 분자 (H)가 화학식 I의 폴리(아미노산)인 펩티드 항원 접합체:
    Figure pct00119

    여기서 R2는 수소, 히드록실 또는 아민 중 하나로부터 선택되고, x는 3 내지 300이고; y3은 1 내지 8이고, 리간드는 임의의 적합한 수단을 통하여 링커 X를 통해 부착된다.
  16. 제14항에 있어서, 소수성 분자 (H)가 화학식 II에 기반한 폴리(아미노산)인 펩티드 항원 접합체:
    Figure pct00120

    여기서 l은 3 내지 300이고, o은 0 내지 300이고; R3은 수소, 히드록실 또는 아민 중 하나로부터 선택되고; R4는 수소, 저급 알킬,
    Figure pct00121

    중 하나로부터 선택되고; y11은 전형적으로 1 내지 8로부터 선택되고, FG는 아주반트 특성을 갖는 리간드에 연결되는 카르복실산, 알데히드, 케톤, 아민, 티올, 아지드 또는 알킨으로부터 선택된 관능기이고; N-말단은 아미드 결합을 통해 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 펩티드 항원에 연결되거나, 또는 연장부 (B1 또는 B2) 및/또는 링커 (L) 또는 하전된 분자 (C)를 통해 연결된다.
  17. 제14항에 있어서, 소수성 분자 (H)가, 폴리(류신), 폴리(트립토판), 폴리(γ-글루타밀 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르), 폴리(γ-벤질 글루타메이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAM), 폴리[2-(2-메톡시에톡시)에틸메타크릴레이트)] (DEGMA) 또는 폴리[N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드) (HPMA)로 이루어진 단독중합체 또는 공중합체를 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  18. 제15항에 있어서, 화학식 I의 폴리(아미노산)을 포함하는 소수성 분자 (H)가, 폴리(류신), 폴리(트립토판), 폴리(γ-글루타밀 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르), 폴리(γ-벤질 글루타메이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAM), 폴리[2-(2-메톡시에톡시)에틸메타크릴레이트)] (DEGMA) 또는 폴리[N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드) (HPMA)에 기반한 제2 중합체에 말단에서 그라프트되거나 또는 연결되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  19. 제16항에 있어서, 화학식 II의 폴리(아미노산)을 포함하는 소수성 분자 (H)가, 폴리(류신), 폴리(트립토판), 폴리(γ-글루타밀 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르), 폴리(γ-벤질 글루타메이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAM), 폴리[2-(2-메톡시에톡시)에틸메타크릴레이트)] (DEGMA) 또는 폴리[N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드) (HPMA)에 기반한 제2 중합체에 말단에서 그라프트되거나 또는 연결되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 제2 중합체가 약 30 내지 500개 단량체 단위의 복수의 단량체 단위를 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트가, 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체에 펜던트 측기로서 연결되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  22. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트가 중합체의 한쪽 말단에 연결되는 것 (세미-텔레켈릭)인 펩티드 항원 접합체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 아주반트가 톨-유사 수용체 효능제 또는 STING 효능제인 펩티드 항원 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 톨-유사 수용체-7 및/또는 -8의 효능제인 펩티드 항원 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 아주반트가 화학식 III의 이미다조퀴놀린인 펩티드 항원 접합체:
    Figure pct00122

    여기서 R7은 수소, 임의로 치환된 저급 알킬, 또는 임의로 치환된 저급 에테르 중 하나로부터 선택되고; R8은 임의로 치환된 아릴아민, 또는 임의로 치환된 저급 알킬아민 중 하나로부터 선택된다.
  26. 제25항에 있어서, 화학식 III의 3개 이상의 이미다조퀴놀린 분자가, 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체에 연결되고, R8이 임의로 치환된 저급 알킬아민 중 하나로부터 선택되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  27. 제26항에 있어서, 화학식 III의 3개 이하의 이미다조퀴놀린 분자가, 소수성 분자 (H)를 구성하는 중합체에 연결되고, R8이 임의로 치환된 아릴아민 중 하나로부터 선택되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)가 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 및 약 20℃ 내지 40℃의 온도 하에 0.1 mg/mL에 이르기까지 불용성인 펩티드 항원 접합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 접합체가, 2개 이상의 펩티드 항원 접합체를 포함하고 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 5 nm 초과 직경인 미셀 또는 다른 유형의 나노- 또는 마이크로-크기의 초분자 회합체로 구성된 입자로 어셈블리되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  30. 제29항에 있어서, 펩티드 항원 접합체가 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 약 5 내지 200 nm 직경의 미셀로 어셈블리되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  31. 제29항에 있어서, 펩티드 항원 접합체가 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 응집체인 펩티드 항원 접합체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 전구체 X1이 직접적으로 또는 C-말단 연장부 (B2)를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되고, 소수성 분자 (H) 또는 입자 (P) 중 하나 상에 링커 전구체 X2와의 링크를 형성하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  33. 제32항에 있어서, 링커 전구체 X1이 하기 화학식을 갖는 것인 펩티드 항원 접합체:
    Figure pct00123

    여기서 태그의 N-말단 아민은 직접적으로 또는 C-말단 연장부 B2를 통해 펩티드 항원 (A)에 연결되고; R1은 수소, 히드록실 또는 아민 중 하나로부터 선택되고; y1은 정수 1 내지 8이고; FG는 티올, 아민, 아지드 또는 알킨 (또는 DBCO) 중 하나로부터 선택된다.
  34. 제33항에 있어서, FG가 아지드이고 y1이 4이며, 부가적으로 여기서 아지드는 입자 (P) 또는 소수성 분자 (H)에 연결되는 DBCO 분자에 연결되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 전구체 X1이 N-말단 연장부 (B1)에 연결되고 하기 화학식을 갖는 것인 펩티드 항원 접합체:
    Figure pct00124

    여기서 태그의 카르보닐은 직접적으로 또는 B1 연장부를 통해 펩티드 항원 (A)의 N-말단에 연결되고; y2는 정수 1 내지 8이고; FG는 티올, 아민, 아지드 또는 알킨 (또는 DBCO) 중 하나로부터 선택된다.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 (P), 임의적 N-말단 연장부 (B1), 임의적 C-말단 연장부 (B2) 및 임의적 하전된 분자 (C) 및 임의적 링커 전구체 X1이 고체 상 펩티드 합성에 의해 단일 펩티드로서 합성되고, C-말단 연장부 (B2)가 프롤린 (또는 서열이 펩티드를 합성하기 위해 사용된 수지에 부착되어 있는 고체 상 펩티드 합성 동안에는 슈도프롤린)을 함유하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  37. 제2항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하전된 분자 (C)가 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 4급 아민, 구아니디늄, 이미다졸륨, 암모늄, 술포늄, 포스포늄, 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 포스포르아미데이트, 또는 포스포네이트로부터 선택된 하나 이상의 관능기를 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 하전된 분자 (C)가 음으로 하전된 관능기와 양으로 하전된 관능기 둘 다를 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체.
  39. 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하전된 분자 (C)를 구성하는 하전된 관능기의 수가 하기로 조정되는 것인 펩티드 항원 접합체:
    a. 펩티드 항원 (A)이 약 0.75 이상의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 +6 이상의 양의 값을 포함함;
    b. 펩티드 항원 (A)이 약 0.25 이상 내지 약 0.75 미만의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 +5 이상의 양의 값을 포함하거나;
    c. 펩티드 항원 (A)이 약 0.25 미만의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 +4 이상의 양의 값을 포함함;
    d. 펩티드 항원 (A)이 약 0.75 이상의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 -6 이하의 음의 값을 포함함;
    e. 펩티드 항원 (A)이 약 0.25 이상 내지 약 0.75 미만의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 -5 이하의 음의 값을 포함함; 또는
    f. 펩티드 항원 (A)이 약 0.25 미만의 소수친수도의 전체 평균 값을 갖는 경우, 펩티드 항원 접합체의 순 정전하는 약 -4 이하의 양의 값을 포함함.
  40. 제39항에 있어서, 펩티드 항원 (A), N-말단 연장부 (B1), C-말단 연장부 (B2), 하전된 분자 (C) 및 링커 전구체 X1이, 약 7.4의 pH 하의 수성 완충제 중에서 약 1.0 mg/mL 이하에서 가용성인 단일 펩티드로서 생산되는 것인 펩티드 항원 접합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 펩티드 항원 접합체를 포함하는 입자.
  42. 제41항에 있어서, 입자가 복수의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 것인 입자.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 펩티드 항원 접합체 또는 제41항 또는 제42항의 입자를 포함하는 면역원성 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 백신 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 조성물이 복수의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 (A)이 종양-연관 항원을 포함하는 것인 펩티드 항원 접합체, 입자 또는 면역원성 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 종양-연관 항원이 신생항원인 펩티드 항원 접합체, 입자 또는 면역원성 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 (A)이 최소 CD4 또는 CD8 T 세포 에피토프인 펩티드 항원 접합체, 입자 또는 면역원성 조성물.
  49. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이, 최소 CD4 T 세포 에피토프, CD8 T 세포 에피토프, 또는 최소 CD4 T 세포 에피토프와 CD8 T 세포 에피토프 둘 다로부터 선택된 펩티드 항원 (A)으로 구성된 10 내지 50개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  50. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이, 최소 CD4 T 세포 에피토프, 최소 CD8 T 세포 에피토프, 또는 최소 CD4 T 세포 에피토프와 최소 CD8 T 세포 에피토프 둘 다 뿐만 아니라 CD8 T 세포 에피토프 및/또는 CD4 T 세포 에피토프를 포함하는 15 내지 35개 아미노산의 합성 긴 펩티드로부터 선택된 펩티드 항원 (A)으로 구성된 10 내지 50개의 상이한 펩티드 항원 접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 CD8 T 세포 또는 CD4 T 세포 에피토프가, 대상체와 일치된 MHC 분자에 대한 IEDB 컨센서스 알고리즘에 의해 0.5 백분위수 이하의 예측된 결합 친화도를 갖는 것인 펩티드 항원 접합체, 입자 또는 면역원성 조성물.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 접합체를 부가적으로 포함하며, 여기서 펩티드 항원 (A)은 범용 CD4 T 세포 에피토프인 면역원성 조성물.
  53. 질환을 앓고 있는 환자에게 제1항 내지 제40항 및 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 펩티드 항원 접합체 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 방법이 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 항-PD-L1 또는 항-CTLA-4 항체; 종양 침윤 림프구 및 키메라 항원 수용체 T 세포 기반 요법; 이중특이적 항체; 항-종양 항체; 또는 면역 억제를 극복하도록 설계된 약물을 포함한, 부가의 면역요법 양식을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 방법이 이종 면역화 계획을 포함하며, 여기서 제1항 내지 제40항 및 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 펩티드 항원 접합체가 프라임으로서 또는 부스트로서 이종 백신과 함께 사용되는 것인 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 방사선 요법, 화학요법 또는 수술과 조합되어 사용되는 것인 방법.
  57. 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 펩티드 항원 접합체, 입자 또는 면역원성 조성물의 용도.
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