KR20190131017A - 선택적 오로라 a 키나아제 억제제 - Google Patents

선택적 오로라 a 키나아제 억제제 Download PDF

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KR20190131017A
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쟝-루이스 레이몬드
팔코 킬치맨
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유니버시태트 베른
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Abstract

본 발명은


[화학식 (1a)]
Figure pct00008
또는
[화학식 (1b)]
Figure pct00009
,
여기서 R1은 -I, -Br, -Cl, -F, C1-C6-알킬, -O(CH2)mCH3, -(CH2)mOCH3, C1-C6-할로알킬, 시클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 R2은 H, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, -CH2-(C3-C6-시클로알킬), 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서 R3은 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4이고, 여기서 R4은 시클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 -L-R5로부터 선택되고, 여기서 L은 C1-C5-알킬, 시클로알킬, 헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -OH, -CH2OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -CONH-R6 또는 카르복실 산의 동위체로부터 선택되고, 여기서 R6은 C1-C4-알킬, n, m 및 r은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인 화합물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

선택적 오로라 A 키나아제 억제제
본 발명은 오로라(Aurora) A의 선택적 억제제로서 티아졸리디논 유도체의 부류(class) 및 암 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다.
발명자들은 체세포 분열(mitosis)의 적절한 진행에 필수적인 진화적으로 보존된 세린/트레오닌 키나아제이며 암에서 그 중요성으로 인해 가장 집중적으로 연구된 키나아제 표적 중 하나인 오로라 A의 신규하고 선택적인 억제제를 규명하였다. 이 키나아제의 많은 강력한 억제제가 알려져 있지만, 이들 대부분은 또한 키나아제 도메인에서 오로라 A와 85% 이상의 서열 상동성을 공유하는 세포질분열(cytokinesis)에 특히 요구되는 염색체 승객 단백질(Chromosomal passenger protein)인 오로라 B를 억제한다.
현재까지 보고된 가장 선택적인 오로라 A 억제제 중 하나인 앨리서팁(MLN8237) (de Groot et al., Front Oncol, 2015, 5, 285)은 현재 다양한 고형 및 혈액학적 악성 종양의 치료를 위한 고급 임상 연구 중이다. 흥미롭게도, 앨리서팁과 그것의 친밀한 MLN8054(Hoar et al., Mol Cell Biol, 2007, 27, 4513-4525) 는 Bemis와 Murcko(Bemis and Murcko, J Med Chem, 1996, 39, 2887-2893)에 의해 정의된 4,874 스캐폴드 중에서 독특한 스캐폴드에 속하며, ChEMBL에 열거된 50 nM 이상의 효능을 갖는 11,286개의 키나아제 억제제에 존재한다(Gaulton et al., Nucleic Acids Res, 2012, 40, D1100D1107). 또한, 오로라 A 키나아제 억제제 중에서는 ChEMBL에 나열된 50 nM 이상의 효능을 가진 329 억제제에 존재하는 174개의 상이한 스캐폴드로 스캐폴드의 다양성이 매우 높다. 이것은 각각의 억제제가 각각의 스캐폴드에 대해 이미 최적화된 화합물을 나타내며, 이 특정 키나아제에 대한 선택적인 억제제를 발견하면 다른 스캐폴드를 확인해야한다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 본 명세서에서 오로라 A를 특이적으로 저해하는 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 의약으로서 사용하기 위한 것이며 암 치료에 유용하다.
본 발명의 제1양태는 화학식 (1a) 또는 (1b), 특히 (1a)를 포함하는 화합물에 관한 것으로,
[화학식 (1a)]
Figure pct00001
또는
[화학식 (1b)]
Figure pct00002
,
여기서
- R1은 -I, -Br, -Cl, -F, C1-C6-알킬, -O(CH2)mCH3 -(CH2)mOCH3, C1-C6-할로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서
- N은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 및
- M은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
- R2는 H, C1-C6-알킬, 또는 C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, -CH2-(C3-C6-시클로알킬), 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고
- R3은 NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4이고, 여기서
- R4는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는
- -L-R5로부터 선택되고, 여기서
- L은 C1-C5-알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및
- R5는 -OH, -CH2OH, -NH2, -COOH, -CONH2, CONH-R6 또는 카르복실 산의 동위체(isostere)로부터 선택되고, 여기서
- R6는 C1-C4-알킬, 특히 C1-C2-알킬로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 화합물은 그의 촉매 포켓(catalytic pocket)에 결합함으로써 오로라 A를 특이적으로 억제한다.
화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제는 오로라 A에서 R-spine의 변형, αC 나선의 외측 변위, Lys162와 Glu181 사이의 염-다리(salt-bridge)의 부재 및 Asp156, Thr292 및 Lys258 사이에서 수소 결합 네트워크의 파손을 포함하는 불활성 DFG-모티프 입체 구조(conformation)를 유도한다. 활성화제 단백질 TPX2는 Lys162와 Glu181 사이의 염-다리의 형성을 유도하기 때문에, 화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제는 ATP 결합을 방지할 뿐만 아니라 TPX2에 의한 오로라 A 활성화를 방지한다. 오로라 A에 대한 최적의 결합은 화학식 (1a)의 화합물에서 티아졸리디논(thiazolidinone)의 양쪽 엑소사이클릭(exocyclic) 결합이 Z-입체 구조(Z-configuration)인 경우에 달성된다. 화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제는 오로라 A의 ATP 결합 영역의 ATP 결합 포켓에 결합하고 Leu139, Val14, Ala160 및 Leu263과 소수성 접촉을 형성한다. 이들 억제제의 페닐 모이어티(moiety)는 Leu194, Arg195, Leu196, Leu210 및 Phe275와의 소수성 접촉을 형성함으로써 오로라 A의 소수성 백 포켓(hydrophobic back pocket)에 결합한다. 억제제 결합은 결합시 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물의 페닐 고리와 상호 작용하는 오로라 A의 Phe275의 상 방향 회전(upward rotation)을 유도한다. 화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제의 4-피리딘 고리는 Ala213과 수소 결합을 형성함으로써 오로라 A의 힌지 영역(hinge region)에 결합한다.
화학식 (1b)의 화합물은 라세미 혼합물이다. 입체 중심은 별표로 표시된다.
일 실시예에서, R1은 C1-C6-알킬, -I, -Br, -Cl, -F, -O(CH2)mCH3, -(CH2)mOCH3, 시클로알킬, 특히 C3-C6-시클로알킬, 보다 특히 C6-시클로알킬 또는 C1-C6-할로알킬로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일 실시예에서, R1은 C1-C6-알킬, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl, -F 또는 C1-C6-할로알킬로부터 선택되고, 여기서 m 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일 실시예에서, R1은 C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2 또는 3이다.
일 실시예에서, R1은 C1-C3-알킬, -CH2CF3, -CHFCF3, -CF2CF3, -CHF2, -CH2F 또는 -CF3, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2 또는 3이다.
일 실시예에서, R1은 메틴, 에틸 또는 이소프로필, -CH2CF3 또는 CF3, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2 또는 3이다.
일 실시예에서, R1은 C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2 또는 3이다.
일 실시예에서, R1은 C1-C3-알킬, -CH2CF3, -CHFCF3, -CF2CF3, -CHF2, -CH2F 또는 -CF3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택된다.
일 실시예에서, R1은 메틴, 에틸 또는 이소프로필, -CH2CF3 또는 CF3, -I, -Br, -Cl 또는 -F로부터 선택된다.
일 실시예에서, R1은 -Br, -CF3 또는 에틸로부터 선택된다.
일 실시예에서, R1 is 에틸이다.
일 실시예에서, R1 n의 n은 0, 1 또는 2, 특히 1이다.
일 실시예에서, R1 n의 n은 1이고 R1은 para-치환이다.
R1은 오로라 A의 소수성 백 포켓(hydrophobic back pocket)에 결합하는 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물의 페닐 모이어티에서의 치환체(substitute)이다. 따라서, 적합한 치환기는 알킬, 할로 알킬 또는 할로겐과 같은 소수성 모이어티를 포함한다. 화학식 (1a) 또는 (1b)의 강력한 억제제는 파라(para) 위치에서 작은 알킬 치환체 (R1), 예를 들어 4-메틸 또는 4-에틸에 의해 특징지어진다.
일 실시예에서, R2은 H, C1-C6-알킬, 또는 -(CH2)rOCH3으로부터 선택되고, 여기서 r는 1, 2, 3, 4 또는 5.
일 실시예에서, R2는 H, C1-C4-알킬 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서 r은 1, 2 또는 3, 여기서 특히 r는 1 또는 2이다.
일 실시예에서, R2는 H, C1-C2-알킬 또는 -(CH2)2OCH3로부터 선택된다.
일 실시예에서 R2는 C1-C2-알킬이다.
일 실시예에서, R2는 -CH3이다.
화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물의 티아졸리디논(thiazolidinone) 부분은 오로라 A의 ATP 결합 영역과 상호 작용한다. 엔도사이클릭 질소 원자(R2)의 치환체는 오로라 A의 Val147과 소수성 접촉을 형성할 수 있다. 따라서 메틸 또는 에틸과 같은 작은 소수성 치환기가 이 위치에 필요하다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4이다.
일 실시예에서, R3는 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택된다.
화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제의 4-피리딘 고리는 Ala213과 수소 결합을 형성함으로써 오로라 A의 힌지 영역(hinge region)에 결합한다. 2-피리딜 위치가 치환 또는 비치환 아미노기와 같은 수소 결합 수용체로 치환되는 경우, 제2수소 결합이 형성될 수 있다.
일 실시예에서, R4는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 -L-R5로부터 선택되며., 여기서 특히 R4는 -L-R5이다.
일 실시예에서, R4는 치환된 또는 비치환된 C6-아릴, 치환된 또는 비치환된 C6-헤테로아릴, 또는 -L-R5로부터 선택되며, 여기서 특히 R4는 -L-R5이다.
일 실시예에서, R4는 페닐, 또는 2-피리딜, 또는 -L-R5로부터 선택되며, 여기서 특히 R4는 -L-R5이다.
화학식 (1a) 또는 (1b)의 억제제의 결합은 2-피리딜 위치의 아미노기의 치환기에 의해 더욱 강화될 수 있다. 그러한 치환체, 예를 들어 페닐 또는 피리딜은 Aur또는a A의 Gly216 및 Leu263과 소수성 접촉을 형성할 수 있다.
일 실시예에서, R4는 -L-R5이다.
일 실시예에서, L는 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.
일 실시예에서, L는 C6-아릴, C6-헤테로아릴 또는 C1-C5-알킬로부터 선택되며, 특히 C1-C3-알킬이다.
일 실시예에서, L는 피리딜(pyridyl) 또는 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬로부터 선택된다.
일 실시예에서, R5는 -OH, -CH2OH, -NH2, -COOH, -CONH2, CONH-R6 또는 반응식 (1)에 따른 카르복실 산의 동위체(isostere)로부터 선택되고, 여기서 R6는 C1-C4-알킬, 특히 C1-C2-알킬로부터 선택된다.
일 실시예에서, R5는 -CH2OH, -NH2, -CONH2, -CONH-R6, -COOH, 테트라졸로부터 선택되고, 여기서 R6 C1-C4-알킬로부터 선택되고, 특히 C1-C2-알킬이다.
일 실시예에서, R5는 -CH2OH, -NH2, -CONH2, -COOH, 테트라졸(tetrazole)로부터 선택된다.
일 실시예에서, R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸(tetrazole)로부터 선택된다.
일 실시예에서, R5는 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH로부터 선택된다.
일 실시예에서, R5는 COOH이다.
일 실시예에서, R3는 -NHC(=O)-L-R5, 여기서 L는 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬로부터 선택되고, R5는 -COOH 또는 -NH2로부터 선택되고, 특히 -COOH이다.
일 실시예에서, R3는 -NH-L-R5, 여기서 L는 치환된 또는 비치환된 아릴, 특히 6-원자(membered) 치환된 또는 비치환된 아릴, 보다 특히 페닐, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 특히 6-원자(membered) 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 보다 특히 2-피리딜이고, R5는 -COOH 또는 -NH2로부터 선택되고, 특히 -COOH이다.
반응식 1. 카르복실 산의 동위체(isostere)
Figure pct00003
화학식 (1a) 또는 (1b)의 가장 강력한 억제제는 오로라 A의 Gly216 및 Leu263과 수소 결합을 형성할 수 있는 링커 L 및 오로라 A의 Arg137과 수소 결합을 형성할 수 있는 카르복실레이트 기(R5)와 같은 수소 결합 수용체(hydrogen bond acceptor)로 특징지어 진다.
일 실시예에서, R3은 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 from -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 -L-R5로부터 선택되고, 및 L는 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴 로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸(tetrazole), 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, 및
- R1는 -I, -Br, -Cl, -F, C1-C4-알킬, 또는 C1-C4-할로알킬로부터 선택되고, 및
- R2는 H, C1-C4-알킬 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서 r은 1, 2 또는 3, 특히 r은 2이다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 -L-R5로부터 선택되고, 및 L은 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 -Br, -CF3 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되고, 및
- R2는 selected from C1-C2-알킬로부터 선택된다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 -L-R5로부터 선택되고, 및 L은 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 에틸이고, 및
- R2는 -CH3이다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 -L-R5이고, 및 L은 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 -I, -Br, -Cl, -F, C1-C4-알킬, 또는 C1-C4-할로알킬로부터 선택되고, 및
- R2는 H, C1-C4-알킬 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서 r은 1, 2 또는 3이고, 여기서 특히 r은 2이다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 -L-R5이고, 및 L은 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 -Br, -CF3 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되고, 및
- R2는 C1-C2-알킬로부터 선택된다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 -L-R5이고, 및 L은 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 COOH로부터 선택되고, R1은 에틸이고, 및
- R1은 에틸이고, 및
- R2는 -CH3이다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4 is -L-R5, 및 L은 C6-아릴 또는 C6-헤테로아릴, 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 -COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 -Br, -CF3 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되고, 및
- R2는 C1-C2-알킬로부터 선택된다.
일 실시예에서, R3는 -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되고, 및
- R4는 -L-R5이고, 및 L은 피리딜, 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되고, 및 R5는 -CH2OH, -NH2, -COOH, 테트라졸, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 -COOH로부터 선택되고, 및
- R1은 에틸이고, 및
- R2는 -CH3이다.
본 발명의 제2양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 제1양태에 따른 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 제3양태는 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제1양태에 따른 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 제4양태는 오로라 A의 억제제로서 사용하기 위한 본 발명의 제1양태에 따른 화합물에 관한 것이다.
제5양태는 본 발명의 제1양태에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 환자, 특히 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 보다 특히 상기 질명은 암이다.
본 발명의 화합물은 체세포 분열(mitosis)을 통한 적절한 진행에 필수적인 진화적으로 보존된 세린/트레오닌 키나아제인 오로라 A의 선택적인 억제제이다. 오로라 A는 많은 인간 암에서 세포 증식에서의 그들의 역할과 상승된 발현 프로파일로 인해 항암제의 역할을 한다. 오로라 A에 대한 본 발명의 화합물의 결합은 오로라 A 키나아제 활성, 중기(metaphase) 동안 결함 있는 염색체 정렬 및 스핀들 미세소관에서의 오로라 A 국소화 손상을 나타내는 오로라 A의 Thr288의 자가 인산화를 감소시킨다.
일부 실시 양태에서, 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물은 염의 형태로, 특히 약학적으로 허용되는 염의 형태로 분리될 수 있다. 앞서 언급한 모든 실시예들에 대해서도 동일하게 적용된다. 일부 실시 양태에서, 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물은 토토머(tautomer), 수화물 또는 용매화물의 형태로 분리될 수 있다. 이러한 염은, 예를 들어 염기성 질소 원자를 갖는 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물로부터의 바람직하게는 유기 또는 무기산을 포함하는, 산부가 염으로 형성되며, 특히 약학적으로 허용 가능한 염은 이러한 방식으로 형성된다. 적합한 무기 산은 이에 한정되는 것은 아니지만, 염산과 같은 할로겐 산, 황산 또는 인산 등이다. 적합한 유기산은 이에 한정되는 것은 아니지만, 카르복실 산, 포스폰산, 술폰산 또는 술팜산 등이다. 이러한 유기산은 아세트산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트르산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 염은 또한 산성 수소를 갖는 질소 원자를 포함한 일반 화학식 (1a) 또는 (1b)의 화합물로부터 유기 또는 무기 염기를 갖는 염으로 형성될 수 있다. 적합한 양이온의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 양이온 또는 유기 질소 염기의 양이온, 예를 들어 양성자화된 모노-, 디- 또는 트리-(2-hydroxethyl)아민이다.
자유 형태의 신규한 화합물과 그의 염 형태의 그것 사이의 밀접한 관계에 비추어볼 때, 상기 및 하기 유리 화합물에 대한 임의의 언급은 적절하고 편리할 때 상응하는 염을 또한 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 수화물 또는 용매화물도 마찬가지다.
일부 실시예에서, 상기 약학적 제제는 활성 성분으로서 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 제제는 활성 성분으로서 유리 형태(free form)의 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 제제는 활성 성분으로서 유리 형태의 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 약학적 제제는 염, 토토머, 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물의 형태로 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 제제는 염, 토토머, 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물의 형태로 하나 이상의 본 발명에 따른 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 특히 상기 언급된 질환의 치료에 사용될 수 있는 본 명세서에 언급된 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학적 제제에 관한 것이다. 상기 약학적 제제는 특히 암 치료 방법에 사용될 수 있다.
용어 및 정의
본 명세서의 문맥에서, 용어 "R-spine"는 키나아제의 활성 상태에서 컬럼을 형성하는 4개의 보존된 소수성 아미노산 잔기를 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "DFG-모티프"는 키나아제의 활성화 루프의 N 말단에서 보존된 Asp-Phe-Gly 모티프를 의미한다. 상기 키나아제는 상기 활성화 루프가 촉매적 활성 상태에서 그 입체구조(conformation)와 관련하여 뒤집히면(flipped out) 촉매적으로 비활성이다. 상기 비활성 입체는 "DFG-out 입체구조"라고 불리는 반면, 활성 입체구조는 "DFG-in 입체구조"라고 불린다.
용어 "치환된"은 모체 모이어티에 치환기가 첨가된 것을 의미한다.
"치환체(Substituent) 그룹"은 보호되거나 보호되지 않을 수 있으며 사용 가능한 하나의 사이트 또는 상위 모이어티의 많은 사용 가능한 사이트에 추가될 수 있다. 치환체 그룹은 또한 다른 치환기로 더 치환될 수 있으며 직접 또는 알킬기, 아미드 또는 히드로카르빌기(hydrocarbyl group)와 같은 연결기(linking group)에 의해 모 잔기(parent moiety)에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치환체 그룹"는 할로겐, 산소, 질소, 황, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 카르복실, 지방족 기(aliphatic group), 지방족고리(alicyclic) 기, 알콕시, 치환된 옥시, 아릴, 아랄킬(aralkyl), 아미노, 이미노, 아미도 플루오로화 화합물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 특히 6개 이하의 탄소 원자를 함유하는 포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, n-헥실 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 알킬기는 전형적으로 1 내지 약 6개의 탄소 원자(C1-C6 알킬)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 10개, 특히 5 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화(또는 부분적으로 불포화된) 고리 또는 폴리 링 구조를 형성하는 상호 연결된 알킬기를 나타낸다. 사이클로알킬 그룹의 예로는 시클로프로판, 시클로펜탄, 시클로헥산, 노르보르난, 데칼린 또는 아다만탄(트리시클로[3.3.1.1]데칸) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 사이클로알킬 그룹은 전형적으로 5 내지 10개의 탄소 원자(C5-C10 사이클로알킬), 특히 5 내지 6개의 탄소 원자(C5-C6 사이클로알킬)를 포함한다.
본원에서 사용된 알킬 또는 사이클로알킬기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다. 사이클로알킬기의 치환은 또한 사이클로알킬기의 1개의 원자 또는 2개의 원자를 통해 사이클로알킬기에 연결될 수 있는 아릴, 헤테로사이클 또는 헤테로아릴 치환체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "알케닐"은 특히 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬 부분을 의미한다. 알케닐 기의 예로는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 1,3-부타디엔과 같은 디엔 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 알케닐 그룹은 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알키닐"은 특히 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 알키닐 기의 예는 이에 제한되지는 않지만, 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 알키닐 기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로사이클"은 하나 이상의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 치환되어 비방향족(nonaromatic) 구조를 형성하는 3 내지 10개, 특히 5 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화 고리 또는 폴리링 구조를 형성하는 상호 연결된 알킬기를 의미한다. 단순성 때문에, 이들은 예를 들어, C5-C10 헤테로 사이클이라고 명명되며, 여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소 또는 황 원자로 치환되어 고리 구조를 형성한다. 본 명세서에 사용된 헤테로사이클릭 기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다. 헤테로사이클릭기의 치환은 또한 헤테로사이클릭 기의 하나의 원자 또는 두 개의 원자를 통해 헤테로시 클릭기에 연결될 수 있은 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로아릴 치환체를 포함한다(인돌과 유사).
본 명세서에서 사용된 용어 "아릴"은 방향족 고리 구조를 형성하는 탄소 원자 사이에 교대로(alternating) 이중 결합 및 단일 결합을 갖는 탄화수소를 의미하며, 특히 6(C6) 내지 10(C10) 원자 고리 또는 폴리링 구조, 특히 6 원자 고리이다.
용어 "헤테로아릴"은 아릴 화합물과 유사한 적어도 하나의 원자는 산소 또는 질소 또는 황 원자인, 5 내지 10 원자 고리 또는 폴리링 구조, 특히 5 내지 6 원자 고리 구조를 포함하는 방향족 구조를 의미한다. 단순성 때문에, 이들은 예를 들어, C5-C10 헤테로아릴로 명명되고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 방향족 구조를 형성하는 산소, 질소 또는 황 원자로 치환된다. 예를 들어, C5 헤테로아릴은 적어도 하나의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 치환된 5 원자 고리 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 아릴 또는 헤테로아릴 기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다. 헤테로 아릴기의 치환체는 또한 헤테로아릴기의 하나의 원자 또는 두 개의 원자를 통해 헤테로아릴에 연결될 수 있는 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로사이클 치환체를 포함한다(인돌과 유사). 아릴 그룹에도 동일하게 적용된다.
도 1은 페닐이미노-티아졸리디논(phenylimino-thiazolidinone) hit 7의 선택적인 오로라 A 억제제 9에 대한 최적화를 나타낸다. (a) R1과 R2의 변형된 아날로그 구조와 활동. (b) 2-피리딜 치환체의 최적화. SI = selectivity index: IC50(오로라 B/INCENP)/IC50(오로라 A).
도 2는 오로라 A에 결합된 4-티아졸리디논 유도체의 결정 구조를 도시한다. 화합물 주변의 1 시그마에서 윤곽이 잡힌 2Fo-Fc 전자 밀도 맵은 포켓에서 명확한 위치를 강조 표시한다. 상기 결정 구조는 PDB 코드 4ZTQ, 4ZTR 및 4ZTS, 해상도 2.8-2.9Å을 나타낸다. 오로라 A의 촉매 포켓은 77 (a), 9 (b) 및 88 (c)와 결합하여 비활성 입체 구조를 얻는다. 아래쪽 패널은 상기 화합물과 상기 단백질 사이의 상호 작용을 개략적으로 보여준다. 점선은 수소 결합, 특히 상기 억제제의 아미노피리딘 부분과 힌지 영역(A213) 사이의 상호 작용 및 음이온(anionic) 카르복실 또는 테트라졸 기와 R137 및 R220의 구아니디늄(guanidinium) 기 사이의 상호 작용을 나타낸다. 소수성 상호 작용에 관련된 잔기는 아크(arc)로 강조된다.
도 3은 9가 방추사(mitotic spindle)에서 오로라 A의 국소화를 저해한다는 것을 보여준다. HeLa Kyoto의 대표 이미지는 화합물 9로 밤새 처리하고 DNA(파란색), 오로라 A(녹색) 및 TPX2(빨간색)에 대해 염색되었다. 대조 세포(맨 윗줄)에서 TPX2는 오로라 A와 함께 위치하였다(co-localize). 9는 방추사(mitotic spindle)에서 오로라 A 국소화를 손상시키지만, 중심체(centrosomal) 오로라 A에는 영향을 미치지 않는다. 1(MLN8237)로 처리된 세포에서 오로라 A는 또한 중심체(centrosomal)에 존재 하나 방추사에는 존재하지 않는다.
도 4는 억제제 9가 오로라 B 기능을 손상시키지 않으면서 세포에서 오로라 A 특이적 억제 표현형을 산출한다는 것을 보여준다. (a) 명시된 화합물과 하룻밤 배양 후 HeLa Kyoto 세포의 대표 이미지. 상기 세포는 pThr288 오로라 A(적색), α-튜불린(녹색) 및 DNA(청색)에 대해 염색되었다. 중기(metaphase) 플레이트에서 손상된 염색체의 정렬은 흰색 화살표로 표시된다. (b) 표시된 화합물과 하룻밤 배양 후 HeLa Kyoto 세포의 대표 이미지 및 pHis-H3(적색) 및 DNA(파란색)에 대해 염색됨. (c) 100nM 노코다졸 및 표시된 억제제로 처리된 전중기(prometaphase)에서 동기화된 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블럿. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (d) 표시된 화합물로 48시간 동안 처리된 세포의 DNA 함량 분석. 상기 세포를 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 염색하고 유동 세포 계측법을 사용하여 분석하였다.
도 5는 글루타티온(GSH)에 대한 9의 시험관내 반응성을 나타낸다. pH = 7.0에서 H2O/CH3CN(4:1) 중의 GSH(5mM)와 함께 억제제 9(30μM)를 배양하고, 반응을 LC-MS에 의해 수행하였다. a. 반응 체계(scheme) 및 변형된 유사체의 구조. b. t=0시간 및 t=14시간 후의 반응 혼합물의 LC 크로마토그램. 체류시간 tret=1.29분으로 형성된 생성물은 MS에 의해 9의 GSH-부가물(GSH-adduct of 9)로 확인된다. 9-메틸카르바졸(tret=2.44분)을 내부 대조로서 사용하였다. c. tret=1.78분에서 화합물 9의 흡수 피크(310 nm에서)의 적분에 의해 결정되는 반응 과정 동안의 화합물 9의 농도. 두 개의 독립적인 실험의 평균을 나타내었으며 SD는 모든 데이터 포인트에 대해 <5%이다. d. HTRF 생화학 분석에서의 오로라 A 억제. (d) 지시된 농도에서 밤새 9 또는 rac-92와 함께 배양된 세포의 세포내 pThr288 오로라-A 수준. 실험을 2회 반복하였고 오차 막대는 SD를 나타낸다. 유도체 rac-92는 생화학적 분석에서 24 nM의 IC50을 갖지만 세포에서 pThr288 수준을 감소시키지 않는다. 숫자는 2회의 독립적인 실험의 평균 IC50 ± SD를 나타낸다.
도 6은 공지된 오로라 억제제의 구조 및 IC50 값을 나타낸다.
실험 섹션
본 명세서에 개시된 화합물은 Kilchmann et al. (Kilchmann et al., J Med Chem 59, 7188-7211, in particular reference is made to schemes 1 to 4, to the paragraph "Synthesis" on page 7191 and to the experimental section on page 7197pp.)에 따라 합성되었다. 상기 반응식(reaction scheme) (2) 및 (3)은 Kilchmann et al. (Kilchmann et al., J Med Chem 59, 7188-7211)에 기재된 반응의 요약이다. 비교 가능한 화합물은 유사하게 합성 될 수 있이다.
화학식 (1a)의 화합물은 반응식 (2)에 따라 합성된다. 상기 온도 및 반응시간은 R1이 메틸이고 R2가 에틸인 화합물에 대해 최적이다. 다른 치환체의 경우, 온도와 반응시간을 적절하게 조절하거나 그에 따라 다른 변수를 변경해야 할 수도 있다.
반응식 (2)의 반응 단계는 다음과 같다:
단계 1: EtOH 중의 R1 n-아닐린의 용액을 R2-이소티오시아네이트(isothiocyanate)로 처리하고 78℃에서 12시간 동안 교반한다. 그 후 상기 용액을 NaOAc 및 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate)로 처리하고 78℃에서 5시간 더 교반하였다. EtOH를 진공하에 증발시켜 조 생성물을 오일로 수득하였다.
단계 2: EtOH 중 단계 1의 조반응 생성물 및 피페리딘(piperidine)의 용액을 tert-부틸(4-포르밀-피리딘-2-일)카바메이트(tert-butyl(4-formyl-pyridine-2-yl)carbamate)로 처리하고 75℃에서 15시간 동안 교반하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 여과하였다. 필터상의 고형물을 얼음-냉각된 EtOH로 세척하고 TFA에 첨가하였다. 4시간 후, 용액을 H2O 및 CH2Cl2로 희석하고 NaOH로 중화시켰다. 유기 상을 H2O로 세척하고, MgSO4ㆍ2H2O 상에서 건조시키고 진공 증발시켜 고체 생성물을 수득한다.
단계 3a: L이 알킬인 화합물을 수득하기 위해, 단계 2의 반응 생성물 및 피리딘의 용액을 Boc-보호된 아미노카르복실산(예를 들어, N-(tert-butoxycarbonyl)-3-aminopropionic acid)으로 처리하고 밤새 교반하였다. 그 다음, 상기 용액을 EtOAc로 처리하고, H2O로 씻어 내고, 진공에서 증발시켰다. 조 생성물을 TFA/THF(1:1)에 재용해시키고 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O로 희석하고 NaOH로 중화시켰다. 유기 상을 H2O로 세척하고, MgSO4ㆍ2H2O 상에서 건조시키고 진공 증발시켜 고체 생성물을 수득한다. 카르복실산을 얻기 위해, tert-부틸카르복실산(예를 들어 tert-부틸 말로네이트)이 사용될 수 있다.
다른 방법으로, 단계 2의 반응 생성물, 피리딘 및 R4에 상응하는 무수물 용액이 사용된다. 예를 들어, 무수 숙신산(succinic anhydride)을 첨가하고 12시간 동안 교반한다. EtOAc를 첨가한 후, 유기 상을 1M HCl, 염수(brine) 및 H2O로 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 조 생성물을 RP-HPLC로 정제하여 고체 생성물을 수득하였다.
글루타르산 무수물(glutaric anhydride)의 경우, 단계 2의 반응 생성물, 피리딘 및 무수물의 용액을 100℃에서 1시간 동안 가열한다. 침전물을 여과하고 EtOAc 및 H2O로 세척하였다. 생성물을 고 진공하에 밤새 건조시켜 고체 생성물을 수득한다.
다른 화합물도 유사하게 생산될 수 있다.
단계 3b: L이 아릴 또는 헤테로 아릴(둘 다 반응식에서 "Ar"으로 언급됨)인 화합물을 얻기 위해, 탈기된(degassed) 디옥산을 아르곤하에서 단계 2의 생성물, Pd2(dba)3, 잔토스(Xantphos), Cs2CO3 및 Ar-Br을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 현탁액을 탈기시키고 아르곤(5Х)으로 다시 채운 다음 100℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하고, 이어서 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 FC로 정제하여 고체 생성물을 수득하였다. 다른 화합물도 유사하게 생산될 수 있다.
[반응식 2] 화학식 1(a)의 화합물의 합성.
Figure pct00004
화학식 (1b)의 화합물은 반응식 (3)에 따라 합성된다. 상기 반응은 반응식 (2)에 따라 합성된 분자로 시작한다.
[반응식 3] 화학식 1(b)의 화합물을 수득하기 위한 화학식 1(a)의 화합물을 환원. 화학식 1(b)의 화합물은 라세미 혼합물(*입체중심)이다.
Figure pct00005
실시예
티아졸리디논 억제제(Thiazolidinone inhibitors)
본 발명자들은 화합물 7(도 1a)에서 출발하여 페닐이미노-티아졸리디논(phenylimino-thiazolidinone)을 조사하였다. 초기 SAR 프로파일 링은 N-페닐 치환기가 8로 변화할 때 최적화 가능성을 나타내었고(도 1a), 그 지점에서 알킬, 할로겐, 히드록시 또는 메톡시 치환된 페닐 고리 또는 3-피리딜 고리를 포함하는 7의 복수의 유사체는 비활성이었다. 추가 유사체를 조사하여 8의 활동에서 초기 이득이 더 향상될 수 있는지를 시험하였다(도 1a). 활성 프로파일링은 8의 최적의 4-에틸페닐이미노(ethylphenylimino) 치환체(63-70 및 93, 도 1a) 및 티아졸리디논의 엔도사이클릭(endocyclic) 질소 원자 상의 작은 알킬 치환체(75-78, 도 1a)에 대한 필요성을 확인하였다. 또한, 76 및 78의 결정 구조는 티아졸리디논 코어의 두 엑소사이클릭(exocyclic) 이중 결합의 Z-입체화학을 확립하였다.
오로라 A와 복합된(complex) 77의 추가 결정 구조(도 2)는 아실 또는 방향족기로 치환된 2-피리딜 위치에 아미노기를 배치하면 힌지 결합 상호 작용을 향상시킬 수 있다고 제안했다. 이 접근법에 의해 상당한 효능(potency)이 실제로 얻어졌으며 아마도 Arg137과 상호 작용할 가능성이 있는 카르복실레이트 또는 테트라졸 기를 갖는 치환기를 나타내는 81-83 및 87, 9 및 88은 낮은 나노몰 값에 도달했다(도 1b).
이러한 억제제는 생리 활성제 INCENP와 복합체로 사용되는 오로라 B에 비해 오로라 A에 대하여 현저한 선택성이 있었다. 가장 강력한 억제제 9(오로라 A에 대한 결합에 대해 IC50 = 2 ± 0.5nM, INCENP와 복합체에서 오로라 B에 대한 결합에 대해 IC50 = 149 ± 3nM)을 심층 분석을 위해 선택하였다. 이 화합물은 또한 세포에서 시험했을 때 가장 강력했기 때문이다(아래 참조). 활성 위치 유도 결합 경쟁 분석법(active site directed binding competition assay) (Fabian et al., Nat Biotechnol, 2005, 23, 329-336)을 사용한 456 키나아제의 kinome scan 이후 결합 친화도의 측정은 9가 현저하게 선택적이고 오로라 A(K D = 5nM)에만 단단히 결합되었음을 보여 주었다, 오로라 B (without INCENP, K D = 10 nM), and Aurora C (K D = 11 nM) (Karaman et al., Nat Biotechnol, 2008, 26, 127-132). 생화학적 억제 및 결합 친화도 측정은 모두 T288에서 자가인산화된(autophosphorylated) 유리 오로라 A로 수행되었으며, 비교 가능한 값을 주었다. 대조적으로, 오로라 B의 생화학적 억제는 키나아제 단독의 비활성으로 인하여 활성제 단백질 INCENP와의 복합체에 대해 측정되었으며, 유리 오로라 B로 측정한 K D 값에 비해 15배 더 약한 억제를 나타내었다.
오로라 A에 대한 9의 결합은 활성인자 단백질 TPX2를 배제한다
본 발명자들은 원자 레벨에서의 억제 메커니즘을 이해하기 위해, 본 발명자들은 초기 SAR 연구로부터 77, 가장 높은 친화도 억제제 9 및 그의 페닐 테트라졸(phenyl tetrazole) 유사체 88과의 복합체에서 오로라 A의 결정 구조를 해결하였다(PDB codes 4ZTQ, 4ZTR 및 4ZTS, resolution 2.8-2.9Å, Fig. 2). 3개의 억제제는 모두 아데닌 결합 영역(Leu139, Val147, Ala160, Leu263)의 ATP 포켓에 결합하고 소수성 백 포켓(Leu194, Arg195, Leu196, Leu210, Phe275)을 차지한다. 저해제는 4가지 특징을 갖는 다른 오로라 A 억제제 복합체(PDB codes 4JBQ, 4JAI, 2J5O, 2BMC, 3P9J, 3R22, 3FDN, 3K5U, 및 4BOG)에서도 발견되는 비활성 DFG 모티프 입체구조를 유도한다: (1) R-spine(잔기 Leu196, Gln185, Phe275, His254, 및 Asp311)의 파괴, (2) 활성 상태(약 2.5Å)에 비해 αC 나선의 외부 변위(outward displacement), (3) Lys162와 Glu181 사이의 염 다리(salt bridge) 부재, (4) Asp256-Thr292-Lys258 수소 결합 네트워크의 파괴.
이 입체 구조에서 Asp274는 ATP 포켓에서 멀어지고 Phe275는 위쪽으로 회전하여 억제제의 페닐이미노 모이어티와 접촉한다. 또한, Trp277(또는 9의 경우 HRD 모티프의 Arg255)은 오로라 키나아제에 특이적인 고전 DFG-in 또는 DFG-out 입체구조와 분명히 다른 배열인 Gln185 및 Asp274와 H-결합을 형성하고, 따라서 아마도 억제제 선택성에 기여한다. 억제제의 피리딘/아미노피리딘 그룹은 힌지 영역에서 Ala213과 하나 또는 두 개의 수소 결합을 일으킨다. 마지막으로, 오로라 A(PDB code 2X81)에 결합된 구조에서 앨리서팁(alisertib)과 유사하게, 9의 말단 카르복실레이트는 Arg137 및 Arg220과 염 다리를 형성하여 77에 비해 강한 친화성을 설명한다.
오로라 A에서는 DFG 모티프 뒤에 Trp277이 뒤따른다. 트립토판 형광 실험은 9 및 그의 유사체 77 및 88의 Trp277의 환경을 교란 시켰으며, 이는 결정 구조의 검사에 의해 제시된 바와 같이, DFG 루프의 재배열 및 이들 억제제의 결합시 발생하는 Gln185와의 Trp277 상호 작용을 반영한다. 이것은 DFG 모티프 재배열이 또한 용액에서 일어남을 나타낸다. 이러한 결정 구조의 추가 분석은 이러한 재배열이 αC-helix의 회전 및 그 이후의 미세소관-연관된 활성 단백질 TPX2에 결합할 때 발생하는 Lys162와 Glu181 사이의 염다리 형성과 양립할 수 없다는 것을 나타냈다(PDB 코드 1OL5 또는 4C3P).
이 가설을 시험하기 위해, 발명자들은 미소규모 온도요법(microscale thermophoresis) 를 사용하여 표지된 TPX21-43에 대한 오로라의 결합을 측정하였다(K D = 795 ± 129 nM). 본 발명자들은 세 개의 독립적인 측정에서 이 결합이 실제로 과량의 9의 존재하에서 확실히 폐지되었음을 발견했다. 9와 TPX2 사이의 비호환성(incompatibility)은 다른 보고와 유사하게 오로라 A의 활성을 3배 증가시키는 TPX2 결합이 IC50 = 2.0 nM에서 IC50 = 1.4 μM으로 9에 의한 억제로 감소되었다는 사실에 의해 더욱 입증되었다. 대조군 인간 세포에서 TPX2는 오로라 A를 방추사 미세소관(spindle microtubule)에 국한시키는데 도움을 주지만 중심체(centrosome)에는 국한시키지 않는다. 이러한 결과는 9의 첨가가 방추사 미세소관에서 국소화가 엄격히 일어나지 않도록 방지한다는 가능성을 제기했다. 사실, 앨리서팁(alisertib)(1)의 경우와 같이, 오로라 A는 9의 존재시 중심체에 국한되어 있음을 발견하였고, 방추사 미세소관으로부터 현저히 옮겨졌다(도 3).
세포에서 화합물 9는 오로라 A를 선택적으로 억제한다
본 발명자들은 인간 조직 배양 세포의 체세포 분열 진행에 대한 9의 영향을 시험하기로 하였다. HeLa 세포를 9로 처리하면 기준 억제제 1(alisertib)에서도 관찰된 바와 같이 그리고 체세포 분열에서 적시 진행을 위한 오로라 A의 역할에서 예상되는 바와 같이 분열 지수(mitotic index)가 용량-의존적으로(dose-dependent) 증가하였다. 상기 분열 지수는 4 μM의 9에서 ~15%로 10 μM의 9에서 ~ 25%로, 25μM의 9에서 40%로 증가했다. 0.25 μM의 앨리서팁(alisertib)은 ~30%의 유사 분열 지수를 보였다. 또한 억제제 9는 오로라 A 키나아제 활성을 나타내는 자가인산화 부위인 오로라 A Thr288의 인산화를 감소시켰다(IC50 = 760nM). 또한, 9는 적절한 스핀들 동역학(spindle dynamic)을 위한 오로라 A 활성 요구 조건에 일치하게, 중기(metaphase) 동안 염색체 정렬 결함을 유발하였고, 표현형 EC50 값은 6 μM이었다(도 4a). HeLa Kyoto 세포에서 약 20%의 정렬되지 않은 염색체가 4 μM의 억제제 9에서 관찰되었다. ~ 80%와 ~ 85% 정렬되지 않은(misaligned) 염색체는 각각 10 μM과 25 μM의 9에서 검출되었다. 거의 100% 정렬되지 않은 염색체가 0.25 μM의 앨리서팁(alisertib)에서 관찰되었다.
많은 오로라 A 키나아제 억제제는 또한 세포 내에서 오로라 B를 표적으로 한다. 이것이 9일 수도 있는지 여부를 다루기 위해, 오로라 B에 의한 초기 체세포 분열 동안 부여된 히스톤 변형인 phospho-Histone H3 Ser10의 분포를 조사하였다. 본 발명자들은 이 특징이 9로 처리된 세포에서 변하지 않은 것을 확인하였으며, 반면에 오로라 B 저해제인 ZM447439 (94)로 치료한 세포에서는 그렇지 않았다(도　4b/c) (Ditchfield et al., J Cell Biol, 2003, 161, 267-280). 더욱이, 94로 처리했을 때 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 관찰된, 오로라 B 불활성화 이후 결함있는 세포질분열(cytokinesis)의 특징인, 8N 및 16N DNA 함량을 가진 세포의 방대한 축적은 10 μM이 제공된 경우에도 9에 의해서는 나타나지 않았다(도 4d). 본 발명자들은 참조 억제제 앨리서팁(alisertib)을 비롯한 다른 오로라 A 억제제와 달리, 억제제 9는 세포에서의 오로라 B 활성에 영향을 미치지 않는다고 결론 지었다.
인간 세포에 대한 9의 효과가 오로라 A 억제에 특이적인 것이었는지 여부를 확실하게 시험하기 위해, 본 발명자들은 9에 민감하지 않을 것으로 결정 구조의 검사에 의해 예측된 GFP-오로라 A-Arg137Ala 또는 GFP-오로라 A-Trp277Ala 돌연변이를 발현하는 세포를 사용하여 표현형 구조 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 이들 단백질이 9의 첨가에 둔감하다는 것을 발견하였으며, 이는 이 화합물에 의해 정상적으로 유도된 표현형이 오로라 A 억제에 의해 실제로 야기되었음을 보여준다.
화합물 9는 글루타티온과 적당한 반응성을 나타낸다
오로라 A에 대한 높은 선택성에도 불구하고, 9의 세포 활성(EC50 > 1 μM)은 생화학적 활성(IC50 = 2 nM)보다 훨씬 약했다. 이 낮은 활성이 9의 친전자성 이중 결합의 공유 결합 반응에 의해 야기될 수 있는지를 이해하기 위해, 본 발명자들은 생리학적 조건하에서 세포 내 친핵성 글루타티온(GSH)에 대한 반응성을 측정하였다. GSH 부가물(adduct)로의 전환은 실제로 발견되었지만, 단지 제한된 범위이고(5 mM GSH, pH 7.4, 37℃에서, 24시간 후 50% 전환, 도 5), 이는 억제제의 상당 부분이 세포 내에서 반응하지 않고 오로라 A의 억제에 이용 가능함을 시사한다. 그럼에도 불구하고 친전자성 이중 결합이 없는 9의 유사체가 대안으로 연구되었다. 부분입체 이성질체 사이클로프로판 rac-89/rac-90은 그들의 전구체 79보다 400배 이상 활성이 낮았다. 한편, 감소된 이중 결합 유사체 rac-91은 단지 7배 적은 활성이었고, 9의 감소된 이중 결합 유사체인 rac-92는 여전히 상당히 강력했다(IC50 = 24 nM). 그러나 이 유도체는 GSH 부가물을 형성할 수 없다는 사실에도 불구하고 세포에서 어떠한 활성도 나타내지 않았다.
종합적으로 말하자면, 이 데이터는 GSH 반응성이 위에 제시된 오로라 A와 B에서 9의 세포의 생화학적 활성 세포의 IC50 값 사이의 불일치를 설명하는데 불충분하다는 것을 제시한다(오로라 A: 생화학적 IC50 = 2.0nM, 세포 IC50(pT288) = 760nM, 오로라 B/INCENP: 생화학적 IC50 = 149nM, 세포 IC50 (pH3)> 25μM). 이러한 활성 차이는 아마도 시험관내 분석(20 μM)에 비해 세포에서 더 높은 ATP 농도(1 mM) 및 TPX2와 같은 경쟁적 리간드(도 4d)의 존재뿐만 아니라 세포 흡수를 감소시키는 카르복실레이트의 존재의 결과일 것이다. 동일한 효과는 아마도 억제제 1(오로라 A: 생화학적 IC50 = 0.04 nM, 세포의 IC50 (pT288) = 6.7 nM, 오로라 B/INCENP: 생화학적 IC50 = 1.1 nM, 세포의 IC50 (pH3) = 1.5 μM) 및 더 선택적인 오로라 A 억제제 MK-5108(오로라 A: 생화학적 IC50 = 0.064 nM, 세포의 IC50 (pT288) = 300 nM, 오로라 B/INCENP: 생화학적 IC50 = 1.49 nM, 세포의 IC50 (pH3) > 10 μM)에 대해 보고된 약한 세포 대 생화학적 활성을 설명할 것이다.
재료 및 방법
화합물. 모든 시약은 상업적 원료로 구입되었고 더 이상의 정제없이 사용되었다. 플래시 크로마토그래피 정제는 실리카겔 60(Fluka, 0.040-0.063 nm, 230-400 메쉬 ASTM)으로 수행하였다. 저해상도 매스 스펙트럼은 Thermo Scientific LCQ Fleet에서 양성 모드로 전자 스프레이 이온화(ESI-MS)를 통해 얻었다. 고해상도 매스 스펙트럼은 Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL에 기록된 양성 모드에서 전자 스프레이 이온화(HR-ESI-MS)를 통해 얻었다. 1H 및 13C-NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 300 분광기(각각 300 MHz 및 75 MHz) 또는 Bruker AVANCE II 400 분광기(각각 400 MHz 및 101 MHz에서)에서 측정되었다. 1H 및 13C 화학적 시프트는 용매 신호에 대해 인용되며, 공명 다중도는 s(일중선), d(이중선), t(삼중선), q (사중선), p(오중선) 및 m(다중선)으로 보고된다; br = 넓은 피크. 화합물 순도는 254 nm 또는 310 nm의 검출 파장에서 분석 역상(analytical reversed phase) HPLC (RP-HPLC)로 평가하였다. 시험 화합물의 순도는 모든 화합물에 대해> 95%였다. 분석 RP-HPLC는 Dionex Acclaim RSLC 120 컬럼(C18, 3.0 x 50 mm, 입자 크기 2.2 μm, 120Å 공극 크기)을 사용하여, 1.2 mL min-1의 속도로 Dionex Ultimate 3000 RSLC 시스템(DAD-3000 RS 포토 다이오드 어레이 검출기)으로 수행하였다. 데이터는 Dionex Chromeleon Management System(버전 6.8) 및 Xcalibur(버전 2.2, Thermo Scientific)로 기록 및 처리되었다. 분석 RP-HPLC 용 용리액은 다음과 같다: (A) 0.05% TFA를 함유하는 milliQ-탈이온수 및 (D) 0.05% TFA를 함유하는 HPLC-등급 아세토니트릴/milliQ-탈이온수(9:1). 분석 RP-HPLC에 대한 조건은 A/D(7:3)에서 100% D(2.2분), 이어서 100% D(1분). 분취(Preparative) RP-HPLC는 Reprospher 100 컬럼(Dr. Maisch GmbH, C18-DE, 100 x 30 mm, 입자 크기 5 μm, 구멍 크기 100Å)을 사용하는 Waters Prep LC4000 크로마토그래피 시스템 및 214 nm에서 작동하는 Waters 489 Tunable Absorbance Detector로 수행하였다. 분취 RP-HPLC를 위한 용리액은 다음과 같다: (A) 0.1% TFA를 함유하는 milliQ-탈이온수 및 (D) 0.1% TFA를 함유하는 HPLC-등급 아세토니트릴/milliQ-탈이온수(9:1).
화합물 1, 7, 9, 63-70, 75-81, 84-86, 88, 93 및 rac-89-92를 하기와 같이 분석하였다: A/D(7:3)에서 100% D (2.2분) 다음에 100% D (1분); 254 nm에서의 검출. 이들 화합물의 체류시간은 1.02분 내지 2.33 분의 범위였다.
화합물 8, 82, 83 및 87을 하기와 같이 분석하였다: A/D(7:3)에서 100% D (2.2분), 이어서 100% D (1분); 310 nm에서의 검출. 이들 화합물의 체류시간은 1.43 분 내지 1.85분 범위였다.
도 1에 도시된 화합물은 문헌 Kilchmann et al. (Kilchmann et al., J Med Chem 59, 7188-7211, 특히 7191페이지의 반응식 1에서 4 및 7197 페이지에서 실험 섹션을 참조)
오로라 A 정제. 인간 오로라 A 키나아제 도메인의 클론(pET24-d 벡터의 잔기 122-403)은 Montoya 실험실(University of Copenhagen)에 의해 친절하게 제공되었다. 상기 구조물을 E. coli BL21(DE3) Rosetta 세포로 형질 전환시키고 단백질 발현을 0.5 mM IPTG로 20℃에서 12시간 동안 유도하였다. 세포를 4℃에서 25분간 6,000xg로 수확하고 용균 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 1mM PMSF, pH = 8.0)에 재현탁시켰다. 세포의 파괴는 얼음으로 냉각된 초음파 처리에 의해 수행된 후, 4℃에서 110,000xg에서 30분간 원심 분리에 의해 잔해를 제거하였다. 오로라 A는 제조사의 지시에 따라 Qiagen의 NiNTA 수지를 사용하는 친화성 크로마토 그래피에 의해 정제되었다. 로딩 후, 상기 레진을 용균 완충액으로 세척한 후, 6% 용리 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH = 8.0)으로 2회 세척하였다. 단백질을 100% 용리 완충액으로 용출시켰다. 용출액을 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 최종 완충액(20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 2 mM DTT, pH = 8.0)으로 교환하였다. His-tag는 TEV 프로테아제로 4℃에서 밤새 분해되었다. 태그 및 작은 불순물은 제2니켈 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 제거되었다. 응집되고 용해된 오로라 A는 최종 완충액에서 평형화된 HiLoad 16/60 SuperdexTM 200 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 서로 분리되었다. 용해성 오로라 A를 Vivaspin-15 농축기(Sartorius Stedim Biotech)를 사용하여 농축시켰다. 단백질 농도는 UV 흡광도에 의해 결정되었다. 오로라 A는 액체 질소에서 급속 냉동시켰고 -18℃에서 보관하였다.
HTRF 키나아제 실험. 오로라 A와 오로라 B 키나아제는 Cisbio(프랑스)의 homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF) KinEASE STK2 키트를 사용하여 분석하였다. 상기 언급한 바와 같이 발현되고 정제된 오로라 A에 대한, 효소 반응(총 부피 10 μL)을 키나아제 완충액(50mM HEPES (pH 7.0), 0.02% NaN3, 0.1mM Na3VO4, 0.01% BSA, 5mM MgCl2, 0.01% Triton X-100, 1mM DTT) 중에서 3 nM 오로라 A 키나아제 도메인, 1 μM 비오티닐화 STK2 기질, 20 μM ATP(~ Km) 및 다른 시험 화합물 또는 DMSO 대조군(최종 DMSO 농도는 2%)으로 수행하였다. 오로라 B의 경우 효소 반응(총 부피 10 μL)을 키나아제 완충액(50 mM HEPES (pH 7.0), 0.02% NaN3, 0.1 mM Na3VO4, 0.01% BSA, 5 mM MgCl2, 0.01% Triton X-100, 1 mM DTT)에서 8 nM 오로라 B/INCENP 복합체(Millipore, no. 14-835), 1 μM 비오티닐화 STK2 기질, 20 μM ATP(Km = 26 μM) 및 시험 화합물 또는 DMSO 대조군(최종 DMSO 농도 2%)으로 수행하였다. 두 효소 모두에 대해 실온에서 30분간 반응시킨 후 EDTA, 유로피움 크립테이트(europium cryptate)로 표지된 antiphospho-Ser/Thr 항체 및 XL-665 conjugated streptavidin(최종 농도 62.5 nM)을 포함하는 검출 완충제 10 μL를 첨가하여 중단시켰다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 형광은 Tecan Infinite M1000 PRO 마이크로 플레이트 리더(Greiner 384-웰 플레이트, 백색, 비-결합, 소량)를 사용하여 317 nm에서 여기시킨 후 620 nm(유로피움 크립트)와 665 nm(XL-665)에서 측정되었다(래그시간 60 μs, 적분시간 500 μs). 형광의 비율(665 nm/620 nm)을 각 웰에 대해 계산하고 결과를 다음과 같이 나타내었다: 　특정 신호 = 비율(샘플) - 비율(음성 대조군), 여기서 비율 = 665 nm / 620 nm x 104. 화합물을 10가지 농도의 3배 연속 희석법으로 측정하여 농도 범위가 아니거나 완전히 억제되도록 하였다. 각각의 농도는 중복하여 측정되었고, 두 개의 독립적인 결정이 각 IC50 값에 대해 만들어졌다. 4-파라미터 로지스틱 모델(IDF의 XLfit)을 사용하여 IC50 곡선을 생성하였다.
키놈 프로파일링(Kinome profiling). 화합물 9의 키놈 프로파일링은 DiscoveRx에 의해 수행되었다. 총 456개의 키나아제를 분석하였다(scanMAX). 대부분의 분석에서, 키나아제-표지된 T7 파지 균주는 BL21 균주 유래의 대장균 숙주에서 24-웰 블록으로 평행적으로 성장하였다. 대장균을 log-phas로 성장시키고 냉동 스톡(감염 다중도 = 0.4)로부터 T7 파지로 감염시키고, 용해까지(90-150분) 32℃에서 진탕 배양하였다. 용해물을 원심 분리(6000g)하고 여과하여(0.2㎛) 세포 파편을 제거하였다. 잔류 키나아제는 HEK-293 세포에서 생산되었으며, 이어서 qPCR 검출을 위해 DNA로 표지되었다. Streptavidin-코팅 자성 비드를 실온에서 30분 동안 바이오틴화된 소형 분자 리간드로 처리하여 키나아제 분석을 위한 친화성 레진를 생성시켰다. 리간드된 비드를 과량의 바이오틴으로 블로킹하고 비결합 리간드를 제거하고 비특이적 파지 결합을 감소시키기 위해 블로킹 완충액(SeaBlock(Pierce), 1% BSA, 0.05% Tween 20, 1 mM DTT)으로 세척하였다. 결합 반응은 1x 결합 완충액(20% SeaBlock, 0.17x PBS, 0.05% Tween 20, 6mM DTT)에서 키나아제, 리간드 친화성 비드 및 시험 화합물을 결합하여 조립하였다. 시험 화합물은 100% DMSO에서 40x의 스톡(stocks)으로 준비하고 분석에 직접 희석시켰다. 모든 반응은 최종 부피 0.04 ml의 폴리 프로필렌 384-웰 플레이트에서 수행하였다. 분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕 배양하고 친화성 비드를 세척 완충액(1x PBS, 0.05% Tween 20)으로 세척하였다. 이어서 비드를 용출 완충액(1x PBS, 0.05% Tween-20, 0.5μM 비바이오티닐화된(non-biotinylated) 친화성 리간드)에 재현탁시키고 실온에서 30분 동안 진탕 배양하였다. 용출액 중의 키나아제 농도는 qPCR에 의해 측정되었다. 화합물 114를 1 μM에서 스크리닝하고, 1차 스크린 결합 상호 작용에 대한 결과를 대조군의 %(% of control, PoC)로서 보고하였다. PoC = (시험 화합물 신호 - 양성 대조군 신호)/(DMSO 신호 - 양성 대조군 신호). 모든 키나아제에 대해 1 μM의 9의 PoC 값을 TREEspot(DiscoveRx)를 사용하여 시각화했다. K D 값을 결정하기 위해, 100x 최종 시험 농도에서 100% DMSO에서 11-포인트 3-배(11-point 3-fold) 연속 희석 9를 준비하고 이어서 분석에서 1x로 희석하였다(최종 DMSO 농도 = 1%). Hill 방정식을 사용하여 표준 용량-반응 곡선으로 K D 값을 결정하였다.
결정화, 구조 솔루션 및 정제(Crystallization, structure solution and refinement). 오로라 A 키나아제 도메인을 150μM으로 농축시키고, MgSO4 및 상응하는 화합물(DMSO에 용해됨)을 각각 2mM 및 150μM의 최종 농도로 혼합하였다. 결정화 실험은 얼음 위에서 15분 동안 복합체를 인큐베이션한 후에 설정되었다. 결정은 18℃에서 방울 확산(drop vapour diffusion)을 걸고 1 μl의 샘플 용액을 1 μl의 저장 용액과 혼합하고 500 μl의 저장 용액에 평형을 이루도록 하여 얻었다. 상기 결정을 동결 방지하에 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 각각의 착물에 대해 발견된 결정화 용액은 77/ 오로라 A에 대해 0.3 M Ammonium citrate dibasic, 25% PEG 3350 (10% MPD가 동결 방지제로 첨가됨); 9/오로라 A에 대해 0.1 M Tris pH 8.0, 28% PEG 4K (20% glycerol이 동결 방지제로 첨가됨); 88/오로라 A에 대해 5% MPD, 0.1 M Hepes pH 7.5, 10% PEG 10K (20% MPD가 동결 방지제로 첨가됨)이다.
데이터는 Swiss Light Source에서 빔라인 X06SA로 수집 된 77/오로라 A 복합체에 대한 데이터 세트를 제외하고는 스위스 Villigen의 Paul Scherrer Institut의 스위스 광원에서 빔라인 X06DA에서 수집되었습니다. 파장은 1Å이고 온도는 100 K이다. 데이터는 MOSFLM/SCALA (Evans, Acta Cryst D, 2006, 62, 72-82; Leslie et al., Nato Sci Ser II Math, 2007, 245) 또는 XDS (Kabsch, W Xds Acta Cryst D, 2010, 66, 125-132;)로 통합되고 조정(scaled)되었다. 구조는 CCP4 (Winn et al., Acta Cryst D, 2011, 67, 235-242)에서 Phaser 및 주형으로 리간드가 없는 PDB 1OL5를 사용하여 분자 치환에 의해 해결되었다. 모든 복합체는 비대칭 단위 당 하나의 분자로 P6122 공간 그룹에서 결정화되었다. 강체 세분(rigid-body refinement)의 첫 번째 라운드가 수행된 후 시뮬레이션 어닐링(Adams et al., Acta Cryst D, 2010, 66, 213-221)이 수행되었으며 초기 전자 밀도 맵은 화합물의 존재를 보여 주었다. 　이들은 Phenix에서 LigandFit을 사용하여 고착하였다(Adams et al., Acta Cryst D, 2010, 66, 213-221). 수렴될 때까지 복수의 정제(refinement) (TLS 사용) (Phenix and Refmac5 (Winn et al., Acta Cryst D, 2011, 67, 235-242) 및 모델 구축(Coot) (Emsley et al., Acta Cryst D, 2010, 66, 486-501)이 수행되었다. 　최종 모델에는 Ramachandran outlier가 없으며 N 및 C 말단에 각각 8 및 15 잔기가 부족하다. 또한, 77, 9 및 88 구조를 갖는 오로라 A의 복잡한 구조에서, 활성화 루프 내의 13 잔기는 보이지 않았다(잔기 279-291). 이 수치는 Pymol(World Wide Web http://www.pymol.org에서 DeLano, The PyMOL Molecular Graphics System(2002) 및 Ligplot(Wallace et al., Protein Eng, 1995, 8, 127-134)를 사용하여 수집되었다.
TPX2 정제. 인간 TPX2 N 말단 도메인(잔기 1-43)의 클론은 GST와 TEV 절단 부위 앞에 있으며, Conti 실험실 (MPI, Martinsried)으로부터 제공받았다. 상기 단백질은 0.1 mM IPTG를 사용하여 20℃에서 12시간 동안 대장균 Bl21 (DE3) 세포에서 발현되었다. 세포는 부서졌고 가용성 분획은 위에서 설명한대로 분리되었다. TPX2는 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH = 7.5에서 평형화된 GSTrap(GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다. GST-TPX2는 최종 완충액 + 10 mM 환원된 글루타티온을 사용하여 용출되었다. GST-tag는 TEV 프로테아제로 4℃에서 밤새 분해되었다. 최종 완충액에서 평형화된 HiLoad 16/60 SuperdexTM 75 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피의 최종 단계에서 TPX2(1-43)를 분리하였다. 단백질 농도는 UV 흡광도에 의해 결정되었다. TPX2는 액체 질소에서 급속 냉동시키고 -18℃에서 보관하였다.
미소규모 온도요법(microscale thermophoresis). TPX2는 Monolith NT.115 단백질 라벨링 키트 RED(NanoTemper Technologies)를 사용하여 표지하였다. 라벨링은 제조자의 지시에 따라 실온에서 30분 동안 44 μM 펩타이드의 농도를 적용하여 제공된 라벨링 완충액에서 수행하였다. 표지된 TPX2를 최종 완충액 및 0.05% Tween-20(NanoTemper Technologies)으로 400nM로 조정하였다. 리간드가 있거나 없는 오로라 A 키나아제를 0.05% Tween-20으로 보충된 최종 완충액에 용해시키고 DMSO/리간드 농도를 일정하게 유지하면서 동일한 완충액에서 일련의 12 희석액(1:1)을 준비하였다(최종 농도 각각 0.5% 및 125 μM). 최종 단백질 농도는 4.4 nM과 150 μM 사이였다. 온도요법(thermophoresis) 실험을 위해 각 단백질 희석액을 표지된 TPX2 1 부피와 혼합하였고, 이는 형광 표지된 TPX2에 대해 200 nM, 리간드에 대해 125 μM 및 오로라 A에 대해 2.2 nM 내지 75 μM의 최종 농도를 유도하였다 4℃에서 30분간 배양하고 2분 동안 9,600xg에서 원심 분리한 후, 용액을 Monolith NT 친수성 모세관(NanoTemper Technologies)에 채웠다. 온도요법(Thermophoresis)은 5s/30s/5s laser off/on/off 시간으로 실온에서 측정되었다. 기기 파라미터는 15% LED 강도와 80% MST 전력으로 조정되었다. 10초 후에 온도요법 신호를 사용하여 세 가지 독립 측정 데이터(NT.Analysis 소프트웨어, 버전 1.5.41, NanoTemper Technologies)를 분석했다. 4.7 μM 이상으로 측정된 포인트는 거부되었다.
세포 배양 실험. HeLa Kyoto 세포를 37℃의 가습된 5% CO2 배양기에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 GlutaMAX (Life Technologies) 배지가 있는 고 포도당 DMEM에서 배양하였다. 플라스미드 형질 감염을 위해, 세포를 80-90% 컨플루언스(confluence)로 접종하였다. 100 μl OptiMEM 중 4 μg 플라스미드 DNA와 100 μl OptiMEM 중 Lipofectamine 2000 (Life Technologies) 4 μl를 5분간 병렬로 배양하고 20분간 혼합한 후 각 웰에 첨가했다. 모든 오로라 A 클론은 적절한 PCR 프라이머 쌍을 갖는 주형으로 전장 오로라 A를 사용하여 제작되었다. 증폭된 생성물을 pcDNA3-GFP 벡터(Merdes et al., J Cell Biol, 2000, 149, 851-862)에 서브 클로닝하였다. GFP-오로라 AR137A 및 GFP-오로라 AW277A는 적절한 프라이머가 있는 부위 지정 돌연변이 유발 키트(Agilent Technologies, no. 210515)를 사용하여 설계되었다. 분열 지수(mitotic index)와 염색체 정렬 불일치를 결정하기 위해 분석 전 20시간 동안 다양한 농도의 화합물로 세포를 배양하였다. 세포를 0.25 μM MLN8237(Selleckchem, no. S1133) 또는 5 μM ZM447439(Selleckchem, no. S1103)로 마찬가지로 처리하였다. 유세포 분석을 위해, 50 nM MLN8037 및 2.5 μM ZM447439가 사용되었다. 구조 실험(rescue experiment)을 위해 HeLa Kyoto 세포를 먼저 GFP-오로라 A, GFP-오로라 AR137A 또는 GFP-오로라 AW277A로 20시간 동안 트랜스펙션 한 다음 세포를 차가운 메탄올로 고정하고 염색하기 전에 9시간 동안 또 다른 20시간 항온 배양했다. 화합물 9가 세포주기 진행에 미치는 영향을 평가하기 위해 FACS(BD Accuri C6 유동 세포 계측기)를 사용하여 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide) 염색 후 DNA 함량을 분석했다.
간접 면역 형광법 (Indirect immunofluorescence). 면역 형광 검사를 위해 세포를 차가운 메탄올에 고정시키고 PBT(0.05% Tween-20이 첨가된 PBS)로 세척한 후 다음의 1차 항체로 염색하였다: 1:200 rabbit anti-pT288 (Cell Signaling, C39D8), 1:200 rabbit anti-pH3S10 (Cell Signaling, D2C8), 1:500 mouse anti-α-tubulin (Transduction Laboratories, 612709), 1:300 mouse anti-GFP (MAB3580, Millipore), 1:200 anti-TPX2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-32863), anti-오로라 A (Invitrogen, 458900). 2차 항체는 Alexa488 또는 Alexa568에 접합된 항-마우스뿐 아니라 Alexa488 또는 Alexa568에 접합된 항-토끼이고, 1:500 (Invitrogen)에서 사용된다. 공초점 이미지는 Axiocam MRm(B/W) CCD 카메라가 장착된 Zeiss LSM 710 공초점 현미경에서 63ХNA 1.0 오일 대물 렌즈를 사용하여 획득하고 ImageJ 및 Adobe Photoshop에서 처리하여 일련의 상대적인 이미지 강도를 유지했다.
고유한 트립토판 형광(Intrinsic tryptophan fluorescence). 결합 실험은 완충액 중의 완충액(DMSO shdeh 1%)에서 다양한 화합물의 다양한 농도(0-100 μM)와 오로라 A(500 nM, 375 nM 및 각각 77, 9 및 88에 대해 150 nM)를 혼합하여 수행하였으며, 이어서 실온에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 트립토판 형광 스펙트럼은 Infinite M1000 Pro 플레이트 리더기(Tecan) 및 코닝 96 웰 절반 영역, 평평한 바닥, 비결합 표면, 흑색 폴리스티렌 플레이트를 사용하여 실온에서 기록하였다. 여기는 284 nm (대역폭 ± 5 nm)에서 및 방출은 340 nm (대역폭 ± 10 nm)에서 발생했다. 수득은 단백질 농도가 가장 높은 웰로부터 계산되었다. 각각의 측정은 3중으로 수행하였다.

Claims (15)

  1. 화학식 (1a) 또는 (1b), 특히 (1a)를 포함하는 화합물,
    [화학식 (1a)]
    Figure pct00006
    또는
    [화학식 (1b)]
    Figure pct00007
    ,
    여기서
    - R1은 -I, -Br, -Cl, -F, C1-C6-알킬, -O(CH2)mCH3, -(CH2)mOCH3, C1-C6-할로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서
    - N은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고 및
    - M은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
    - R2는 H, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, -CH2-(C3-C6-시클로알킬), 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, 여기서
    - r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
    - R3는
    - -NH2, -NH-R4, -NHC(=O)-R4, -NHC(=O)NH-R4, -NHC(=S)-R4 또는 -NHC(=S)NH-R4, 여기서
    - R4 는
    - 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는
    - -L-R5로부터 선택되고, 여기서
    - L은
    - C1-C5-알킬,
    - 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 및
    - R5는 -OH, -CH2OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -CONH-R6 또는 카르복실 산의 동위체로부터 선택되고, 여기서
    - R6는 C1-C4-알킬, 특히 C1-C2-알킬로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 C1-C6-알킬, -I, -Br, -Cl, -F, -O(CH2)mCH3, -(CH2)mOCH3, 시클로알킬, 특히 C3-C6-시클로알킬, 보다 특히 C6-시클로알킬, 또는 C1-C6-할로알킬로부터 선택되고, 특히 R1은 C1-C6-알킬, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl, -F 또는 C1-C6-할로알킬로부터 선택되고, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인 화합물.
  3. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1은 C1-C4-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 보다 특히 메틸, 에틸 또는 이소프로필, C1-C4-할로알킬, 특히 -CH2CF3, -CHFCF3, -CF2CF3, -CHF2, -CH2F 또는 -CF3, 보다 특히 -CH2CF3 또는 CF3, -O(CH2)mCH3, -I, -Br, -Cl, 또는 -F로부터 선택되고, 특히 R1은 -Br, -CF3 또는 에틸로부터 선택되고, 보다 특히 R1은 에틸이고, 여기서 m은 0, 1, 2 또는 3인 화합물.
  4. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1 n의 n은 0, 1 또는 2, 특히 n은 1이고, 여기서 보다 특히 R1은 파라-치환인 화합물.
  5. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 H, C1-C6-알킬, 또는 -(CH2)rOCH3, 특히 H, C1-C4-알킬 또는 -(CH2)rOCH3로부터 선택되고, r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 여기서 특히 r은 1, 2 또는 3이고, 보다 특히 r은 1 또는 2인 화합물.
  6. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 R2는 H, C1-C2-알킬 또는 -(CH2)2OCH3로부터 선택되고, 특히 R2는 C1-C2-알킬이고, 보다 특히 R2는 -CH3인 화합물.
  7. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3는 -NH2, -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터, 특히 -NH-R4 또는 -NHC(=O)-R4로부터 선택되는 것인 화합물.
  8. R4는 치환된 또는 비치환된 아릴, 특히 치환된 또는 비치환된 C6-아릴, 보다 특히 페닐, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 특히 치환된 또는 비치환된 C6-헤테로아릴, 보다 특히 2-피리딜, 또는 -L-R5로부터 선택되고, 여기서 특히 R4는 -L-R5인 화합물.
  9. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    L은 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 특히 L은 C6-아릴 또는 C6-헤테로아릴, 특히 피리딜, 또는 C1-C5-알킬, 특히 C1-C3-알킬로부터 선택되는 화합물.
  10. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5은 -CH2OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -CONH-R6, tetrazole, 특히 -CH2OH, -NH2 또는 -COOH, 보다 특히 -COOH로부터 선택되고, R6는 C1-C4-알킬, 특히 C1-C2-알킬로부터 선택되는 화합물.
  11. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    - R3은 -NHC(=O)-L-R5이고, 여기서 L은 C1-C3-알킬, 및 R5은 -COOH 또는 -NH2, 특히 -COOH로부터 선택되고,
    또는 여기서
    - R3는 -NH-L-R5이고, 여기서 L은 치환된 또는 비치환된 아릴, 특히 6-원자(membered) 치환된 또는 비치환된 아릴, 보다 특히 페닐, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 특히 6-원자(membered) 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 보다 특히 2-피리딜, 및 R5은 -COOH 또는 -NH2, 특히 -COOH인 화합물.
  12. 의약으로 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  13. 암의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  14. 오로라 A의 억제제로 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 특히 약학적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료 또는 예방하기 방법으로, 보다 특히 상기 질병은 암인 방법.
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