KR20190127856A - 반월상연골 복원을 촉진시키기 위해 기능화 된 스캐폴드 (functionalized scaffold to promote meniscus repair) - Google Patents

반월상연골 복원을 촉진시키기 위해 기능화 된 스캐폴드 (functionalized scaffold to promote meniscus repair) Download PDF

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meniscus
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마틴 롯츠
이광일
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더 스크립스 리서치 인스티튜트
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Abstract

본 개시에서 제공되는 스캐폴드는 탈세포화된 반월상연골 조직을 포함하고, 상기 상기 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된다. 또한 본 개시에서 제공되는 대상의 조직 손상에서 필요로 하는 복원 및/또는 치료 방법으로서: 탈세포화된 반월상연골 조직을 포함하는 스캐폴드를 제공하는 단계; 및 상기 파열 위에 상기 스캐폴드를 이식하여 상기 조직 손상을 복원 및/또는 치료하는 단계를 포함하고, 상기 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된다.

Description

반월상연골 복원을 촉진시키기 위해 기능화 된 스캐폴드 (FUNCTIONALIZED SCAFFOLD TO PROMOTE MENISCUS REPAIR)
본 발명의 개시는 스캐폴드(scaffolds) 및 스캐폴드를 사용한 조직(tissue) 복구 및/또는 재생 방법과 관련된 것이다.
여기에 모든 간행물들은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 그리고 개별적으로 참조에 의해 포함되도록 지시되는 것과 동일한 정도인 것처럼 참조에 의해 포함된다. 이하의 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공되는 임의의 정보가 선행 기술이거나 또는 현재 청구된 발명과 관련된다거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행기술임을 인정하는 것이 아니다.
반월상연골 파열들은 가장 흔한 무릎 부상 중 하나이다. 파열들은 무릎 관절의 강한 비틀림, 회전, 또는 과다-굽힘으로 인해 발생한다. 파열된 반월상연골은 무릎 통증, 붓기, 굳음(stiffness), 그리고 무릎을 늘리는데 제한을 유발한다. 반월의 파열들, 특히, 이너 써드(inner third)에서 발생하는 가장 일반적인 형태들은, 일반적으로 자연적으로 치유되지 않으며 그리고 무릎 관절염(OA, osteoarthritis)의 발병에 대한 주요 위험 요소를 나타낸다. 반월의 복원에 대한 전략들은 따라서 OA와 관련된 장애 및 통증을 예방하는데 필수적이다.
비록 반월의 손상들에 대한 여러 치료들이 현재 존재하지만, 치료 옵션들은 반월상연골 복원 또는 재생을 야기하지 않는다. 대부분의 반월의 손상들은 부분 반월상연골절제술(meniscectomy)에 의해 치료된다. 환자들은 단기적으로 이 치료에 잘 반응할 수도 있지만, 이들은 주로 수술 후 여러 년에 OA가 발병한다. 제거된 조직의 양은 연골 변성의 정도 및 속도와 관련되었다. 대부분 반월의 조직이 손상에 의해 영향을 받는 경우, 완전 반월상연골절제술이 수행된다. 만약 상당한 관절 변성 없이 환자가 완전 반월상연골절제술 후 통증을 경험하면, 반월의 동종이식편과 함께 이차적 치료가 가능하다. 그러나, 동종이식편의 사용은 조직 이용가능성 및 좁은 징후들(indications)에 의해 제한된다.
반월의 복구 및 재생은 인접한 윤활막(synovium) 및 관절 주머니(joint capsule)로부터 비롯된 섬유아세포들(fibroblasts)의 이동 및 증식을 통해 매개된다. 이 세포들은 섬유혈관 흉터 조직은 생성하고, 산소 농도 및 정수압(hydrostatic pressure)과 같은, 적절한 환경 조건들 하에서, 섬유연골성(fibrocartilaginous) 변질 형성(metaplasia)의 과정을 거치고 섬유 조직을 섬유 연골(fibrocartilage)로 변형시키는 것을 야기한다. 섬유아세포들은 처음부터 섬유연골성 조직을 합성하지 않을 것이다. 따라서, 섬유성결합조직(fibrous connective tissue)을 섬유 연골로 조절하기 위해 외부 환경 자극이 요구된다. 그래서, 반월의 조직 재생을 장려할 수 있는 새로운 조직 복원 장치들, 뿐만 아니라, 이러한 조직 복원 장치들을 사용하기 위한 방법들에 대한 수요가 존재한다.
여기에 개시된 다양한 실시예들은 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된, 탈세포화된 반월상연골(meniscus) 조직을 포함하는: 스캐폴드를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 상기 혈소판 유래 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자-AA, 혈소판 유래 성장 인자-BB 및/또는 혈소판 유래 성장 인자-AB이다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 줄기 세포들을 더 포함한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 반월상연골 세포들을 더 포함한다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 콜라겐 섬유들을 포함하고, 그리고 상기 콜라겐 섬유 배향(orientation)은 반월상연골 결함과 매치(matched)된다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 구멍들(pores)을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 구멍들은 콜라게나아제(collagenase) 소화, 기계적인 뚫림, 및/또는 레이저 적용에 의해 상기 탈세포화된 반월상연골 조직에 생성된다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 20일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 강도는, 헤파린 및 상기 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 크다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 강도는, 헤파린 및 상기 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 크다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 크다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 상기 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 필수적으로 시트 형태이다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 삼 차원 형태이다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 의료용 드레싱에 있다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 포유동물로부터 비롯된다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 사람으로부터 비롯된다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 멸균 상태에 있고 그리고 멸균 용기에 포장된다.
여기에 개시된 다양한 실시예들은 대상의 조직 손상에서 필요로 하는 복원 및/또는 치료 방법을 포함하고, 상기 방법은 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된, 탈세포화된 반월상연골(meniscus) 조직을 포함하는 스캐폴드를 제공하는 단계; 및 상기 파열 위에 상기 스캐폴드를 이식하여 상기 조직 손상을 복원 및/또는 치료하는 단계;를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직 손상은 상기 조직의 파열이다. 일 실시예에서, 상기 조직은 반월상연골 조직이다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 상기 혈소판 유래 성장 인자는 PDGF-AA, PDGF-BB 및/또는 PDGF-AB이다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 반월상연골 조직의 상기 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 효과적인 세포 침윤(infiltration) 및 숙주 세포들로부터 상기 스캐폴드로의 이동에 최적화되었다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 관절경(arthroscopic) 수술에 의해 상기 반월상연골 파열 위에 이식된다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 20일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 강도는, 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 크다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 강도는, 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 크다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드의 상기 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 크다. 일 실시예에서, PDGF는 상기 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된다. 일 실시예에서, 상기 조직 안에 상기 파열의 복원 및/또는 치료 방법은 이차 치료 요법을 더 포함한다. 일 실시예에서, 상기 이차 치료 요법은 휴식, 얼음, 압박, 증가(elevation) 및/또는 물리 치료와 같은 비-수술적 치료를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 이차 치료 요법은 수술적 복원, 부분 반월상연골절제술 및/또는 완전 반월상연골절제술과 같은 수술적 치료를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 대상은 포유동물이다. 일 실시예에서, 상기 대상은 사람이다.
본 개시의 추가적인 실시예들은 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 스캐폴드를 포함하는 멸균 용기; 및 상기 키트를 사용하기 위한 지침을 포함하는: 키트를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 상기 혈소판 유래 성장 인자는 PDGF-AA, PDGF-BB 및/또는 PDGF-AB이다. 일 실시예에서, 상기 키트는 상기 스캐폴드를 손상된 반월상연골 안으로 전달하기 위한 수단을 더 포함한다. 일 실시예에서, 상기 전달하기 위한 수단은 의료용 글루(glue), 의료용 봉합사들(sutures), 의료용 스테이플스(staples), 및/또는 의료용 앵커들이다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드이다. 일 실시예에서, 상기 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 상기 무혈관 또는 혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 상기 헤파린 결합은 상기 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 상기 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어난다.
본 개시의 실시예들은 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 무세포성 스캐폴드를 포함하는: 장치를 또한 포함하고, 상기 장치는 조직들의 복원을 위한 장치이다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드이다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 천연 반월상연골과 비교하여 유사한 생물학적 및 기계적 특징을 가진다. 일 실시예에서, 상기 성장 인자는 상기 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 효과적인 세포 침윤(infiltration) 및 숙주 세포들로부터 상기 스캐폴드로의 이동에 최적화되었다. 일 실시예에서, 상기 장치는 상기 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 상기 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어난다.
본 개시의 실시예들은 세포 이동을 유도하는 방법을 더 포함하고, 상기 방법은 하나 이상의 성장 인자들의 상기 고정화를 위해 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드를 제공는 단계; 및 상기 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드로 세포 이동을 유도하는 단계;를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 하나 이상의 성장 인자들은 PDGF이다. 일 실시예에서, 헤파린은 고정화를 위해 사용된다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드는 대상에 직접 이식된다. 일 실시예에서, 상기 대상은 포유동물이다. 일 실시예에서, 상기 대상은 사람이다.
본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 예시의 방식으로, 본 발명의 다양한 실시예들을 도시하는, 첨부되는 도면들과 함께 고려되는, 이하의 상세한 설명들로부터 명백해질 것이다.
예시적인 실시예들이 참조 도면들에 도시되어 있다. 여기에 개시된 실시예들과 도면들은 제한적인 것 보다는 예시적인 것으로 고려되도록 의도되었다.
도 1은 여기에 실시예들에 따라, 반월상연골 파열들의 치유 동안의 섬유 연골 형성(fibrochondrogenic) 분화 방법을 도시한다.
도 2는 여기에 실시예들에 따라, 세포 모집에 의한 통합적인 치유의 신규 기술을 도시한다.
도 3은 여기에 실시예들에 따라, 보바인(bovine) 반월상연골로부터 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드(DMS, decellularized meniscus scaffold)를 도시한다.
도 4는 여기에 실시예들에 따라, 헤파린 결합된 DMS에서의 PDGF-BB 고정화의 개략도를 도시한다.
도 5는 여기에 실시예들에 따라, 탈세포화 및 보바인 반월상연골의 PDGF 결합을 도시한다. (A) 탈세포화된 반월상연골 블록들의 이미지; (B) DNA 내용(content); (C) 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) 염색된 DMS 이미지; (D) 톨루이딘 블루 내용의 정량.
도 6은 여기에 실시예들에 따라, DMS로부터의 PDGF-BB 방출 역학들을 도시한다. PDGF-BB는 DMS 또는 헤파린 코팅된 DMS와 결합되고 그리고 DMS는 37℃에서 16일까지 배양되었다. 각 타입의 DMS는 100ng의 PDGF-BB와 결합되었다. 지시된 시점들에서 상청액(supernatant)들이 수집되었고 그리고 ELISA에 의해 PDGF-BB를 분석하였다. 결과들은 3개의 분리된 실험들에서 얻은 것이다.
도 7은 여기에 실시예들에 따라, 반월상연골 표본의 항 PDGFRβ 면역조직화학을 도시한다: (A) & (B) 사람 반월상연골; (C) & (D) 생체-외 배양 2주 후 보바인 반월상연골 절편들 안으로 삽입된 DMS(DMS는 헤파린 및 50 ng/ml PDGF-BB과 결합되었음); (E) (C) & (D)로부터의 항 PDGFRβ 양성 세포들(%).
도 8은 여기에 실시예들에 따라, (A) 천연 보바인 반월상연골; (B) 반월상연골 절편들 안으로 삽입된 DMS; (C) 반월상연골 절편 안으로 삽입된 PDGF 코팅된 DMS의 비교 DAPI 이미지들을 도시한다. 2주 배양 후 보바인 절편 안으로 삽입된 PDGF-BB (50 ng/ml) 코팅된 DMS의 염색 이미지들; (D) DAPI; (E) 사프라닌(Safranin)-O; (F) 피크로시리우스 레드(Picrosirius red)의 비교 DAPI 이미지들을 도시한다. 검정색 화살표들은 새로 생성된 ECM을 지시한다.
도 9는 여기에 실시예들에 따라, 2주 배양 후 헤파린 및 PDGF-BB (200 ng/ml)과 결합된 DMS를 도시한다. (A) DAPI 염색; (B) 사프라닌-O 염색; (C) 피크로시리우스 레드 염색의 편광 뷰(view).
도 10은 여기에 실시예들에 따라, 생체 외 배양 후 2 및 4주 때의 인장 테스트를 도시한다.
도 11은 여기에 실시예들에 따라, 헤파린 결합에 의한 성장 인자 고정화를 도시한다.
도 12는 여기에 실시예들에 따라, 생체 외 모델들을 도시한다.
도 13은 여기에 실시예들에 따라, 생체-외 배양 후 기계적 테스트를 도시한다.
도 14는 여기에 실시예들에 따라, 사람의 항 PDGFRβ 및 보바인 반월상연골 (2주)을 도시한다.
도 15는 여기에 실시예들에 따라, 삽입된 DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골 절편들에서의 세포 이동을 도시한다. DAPI는 2주 동안 배양된 절편들의 섹션들을 염색함 (그룹 당 n=3-6, 40x). (a.) 천연의 손상되지 않은 반월상연골; (b.) DMS 없이 배양된 손상된 반월상연골; (c.) DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (d.) PDGF-DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (e.) 이동한 세포들의 수가 있는 그래프. 데이터는 3개의 분리된 실험들에서의 6-8 값들의 평균을 나타낸다.
도 16은 여기에 실시예들에 따라, 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색 분석 (2 & 4 주)을 도시한다.
도 17은 여기에 실시예들에 따라, DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골 조직의 기계적 특성들을 도시한다. 손상된 절편들은 DMS 또는 PDGF-결합된 DMS와 함께 삽입되고 그리고 2 및 4주 동안 배양되었다. 인장 특성들은 실패까지 당김에 의해 측정된다. 데이터는 3개의 분리된 실험들에서의 7-10 값들의 평균을 나타낸다.
도 18은 여기에 실시예들에 따라, DMS 또는 PDGF 결합된 DMS와 함께 생체 외 배양을 도시한다. (A) DAPI 염색 및 (B) 정량 분석, (C) 항-PDGFRβ IHC 및 (D) 정량 분석, (E) 2주 후 조직학 이미지들, (F) 2 및 4주 후 인장 테스트.
도 19는 여기에 실시예들에 따라, PDGF-HEP-DMS의 준비를 도시한다. DMS는 탈세포화된 보바인 반월상연골로부터 만들어졌다. DMS와 0.1% (wt/v) 헤파린 결합 후, PDFG는 헤파린 결합된 DMS에 바운드(bound) 되었다.
도 20은 여기에 실시예들에 따라, 항-PDGFRβ 양성 세포들의 정량 분석을 도시한다: 양성 세포들은 보바인 반월상연골 절편 중 총 세포 수의 백분율이다. DMS가 삽입된 보바인 반월상연골 절편 (A); 50ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 보바인 반월상연골 절편 (B); 100ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 보바인 반월상연골 절편 (C); 200ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 보바인 반월상연골 절편 (D) 2주 생체 외 배양 후.
도 21은 여기에 실시예들에 따라, 2주 생체 외 배양 후 보바인 반월상연골 절편들에 삽입된 DMS의 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색을 도시한다: 50ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 절편 (A, B); 100ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 절편 (C, D); 200ng/ml PDGF-BB가 코팅된 DMS가 삽입된 절편.
도 22는 여기에 실시예들에 따라, 2주 생체 외 배양 후 보바인 반월상연골 절편들에 삽입된 DMS 및 PDGF 코팅된 DMS의 면역조직화학을 도시한다: 항-아그레칸(Aggrecan) (A); 항-콜라겐 타입 1a1 (B); 항-MKX (C); 항-콜라겐 타입 2a1 (D).
도 23은 여기에 실시예들에 따라, 손상된 반월상연골 절편들의 PDGFRβ 양성 세포들을 도시한다. 2주 동안 배양된 절편들의 항-PDGFRβ 염색된 섹션들 (그룹당 n=3-6, 40x). (a.) 천연의 손상되지 않은 반월상연골; (b.) DMS 없이 배양된 손상된 반월상연골; (c.) DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (d.) PDGF-DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (e.) 이동한 세포들의 수가 있는 그래프. 데이터는 3개의 분리된 실험들에서의 6-8 값들의 평균을 나타낸다.
도 24는 여기에 실시예들에 따라, 손상된 반월상연골 절편들에서의 ECM 형성을 도시한다. (a-b.) 사프라닌-O 염색: 2 및 4주 동안 천연 손상되지-않은 반월상연골; (c-d.) 사프라닌-O 염색: 2 및 4주 동안 DMS 없이 손상된 반월상연골; (e-f.) 사프라닌-O 염색: 2 및 4주 동안 DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (g-h.) 사프라닌-O 염색: 2 및 4주 동안 PDGF-DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (i-j.) 피크로시리우스 레드 염색: 2 및 4주 동안 DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (k-l.) 피크로시리우스 레드 염색: 2 및 4주 동안 PDGF-DMS와 함께 배양된 손상된 반월상연골; (m-n.) 사프라닌-O 양성 염색된 영역 (전체 영역 중 %) 및 피크로시리우스 레드 염색에 의해 평가된 DMS와 절편 사이의 통합 % 및 전체 인터페이스 영역 중 통합 인터페이스 %로 표시된다.
도 25는 여기에 실시예들에 따라, 반월상연골 결함에서의 콜라겐 섬유 배향과 함께 DMS의 콜라겐 섬유 배향의 정렬을 도시한다. 조직들은 정의된 배향으로부터 채취된다 (a) 수직으로 뚫린 실린더의 AVAS_섹션; (b) 수평으로 뚫린 실린더의 AVAS_섹션; (c) 수직으로 뚫린 실린더의 VAS_섹션; 및 (d) 수평으로 뚫린 실린더의 VAS_섹션.
도 26은 여기에 실시예들에 따라, DMS의 콜라게나아제 소화를 도시한다. 일 실시예에서, 콜라게나아제 소화는 세포 이동 및 침윤을 촉진시켰다.
도 27은 여기에 실시예들에 따라, PDGF-결합된 DMS가 세포 이동 및 침윤을 유도함을 도시한다.
도 28은 여기에 실시예들에 따라, PDGF-결합된 DMS가 세포 이동 및 침윤을 유도함을 도시한다.
관련 출원들에 대한 상호-참조
본 출원은 3월 17일, 2017년에 출원된 미국 임시(provisional) 특허 출원 일련 번호 제62/472,917호의 우선권 이익을 주장하고, 이들 각각의 전체 내용들은 여기에 참조에 의해 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 서술
발명은 국립보건원(NIH, National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 제AG007996호 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부가 발명에 특정 권리를 갖는다.
여기에 인용된 모든 참고 문헌들, 간행물들, 및 특허들은 이들이 완전히 제시된 것처럼 전체가 참조에 의해 통합된다. 다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Hornyak, et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); 및 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 본 출원에서 사용된 많은 용어들에 대한 일반적인 가이드를 본 기술분야의 기술자에게 제공한다. 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 여기에 설명된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법들 및 자료들을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 설명된 방법들 및 재료들에 제한되지 않는다.
반월상연골 파열들은 무릎 관절의 가장 흔한 손상이다. 반월상연골 파열들, 특히 이너 써드(inner third)에서 발생하는 가장 일반적인 형태들은, 일반적으로 자연적으로 치유되지 않으며 그리고 무릎 관절염의 발병에 대한 주요 위험 요소를 나타낸다.
여기에 설명된 바와 같이, 그리고 여기에 다양한 실시예들에 따라, 발명자들은 통합적인 반월상연골 치유를 위한 신규한 화학주성(chemotactic)-무세포성 반월상연골 인공물을 개발하였다. 발명자들은 숙주 세포 침윤을 위한 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드를 특징지었고; 체외에서 세포 모집 및 반월상연골 복원에 대한 DMS의 PDGF 코팅의 효과를 시험하였고; 그리고 반월상연골 통합 치유의 효능에 대해 동물 모델을 사용하여 PDFG-코팅된 DMS를 테스트하였다.
일 실시예에서, 발명자들은 어떤 외인성(exogenous) 세포들 없이도 화학주성 성장 인자만으로 스캐폴드에 적용될 수 있고 그리고 손상된 영역으로 이동할 것으로 예상되는 내인성(endogenous) 세포들이 치유 과정을 수행한다는 것을 보여주었다. 일 실시예에서, 발명자들은 PDGF가 전구 세포(progenitor cell)들에 대한 강한 화학주성 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 일 실시예에서, 발명자들은 스캐폴드로서 탈세포화된 반월상연골과 함께 PDGF의 적용은 내인성 세포 이동에 의해 반월상연골 손상을 치유할 수 있다는 것을 보여주었다.
다양한 실시예들에서, 발명자들은 헤파린 결합된 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드들이 적어도 이주 동안 PDGF-BB를 묶고 그리고 천천히 방출한다는 것을 보여주었다. 다른 실시예에서, 발명자들은 무혈관 반월상연골의 결함들에 PDGF 처리된(treated) 스캐폴드의 삽입이 증가된 PDGFRβ 발현 및 결함 영역 안으로의 세포 이동으로 이끄는 것을 보여주었다. 다른 실시예에서, 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색은 스캐폴드와 손상된 절편들 사이의 조직 통합을 보여주었다. 다른 실시예에서, PDGF 코팅된 스캐폴드 처리된 손상된 절편의 인장 특성들은 PDGF 없는 스캐폴드에서 보다 상당히 높았다.
일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직을 포함하는, 스캐폴드가 여기에 개시되고, 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, PDFG는 PDGF-AA, PDGF-BB, 및/또는 PDGF-AB이다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 줄기 세포들을 더 포함한다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 반월상연골 세포들을 더 포함한다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 콜라겐 섬유들을 포함하고, 그리고 콜라겐 섬유 배향은 반월상연골 결함과 매치된다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 구멍들을 포함한다. 일 실시예에서, 구멍들은 콜라게나아제 소화, 기계적인 뚫림, 및/또는 레이저 적용에 의해 탈세포화된 반월상연골 조직에 생성된다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일, 또는 투여 후 적어도 20일, 또는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 강도는, 헤파린 및 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 크다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 강도는, 헤파린 및 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 크다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 크다. 일 실시예에서, 성장 인자는 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 1 ng/mL 내지 1 μg/mL 사이, 또는 1 μg/mL 내지 500 μg/mL 사이, 또는 500μg/mL 내지 1 mg/mL 사이, 또는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 사이로 구성된다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 필수적으로 시트 형태이다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 삼 차원 형태이다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 의료용 드레싱에 있다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 포유동물로부터 비롯된다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 조직은 사람으로부터 비롯된다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 멸균 상태에 있고 그리고 멸균 용기에 포장된다.
일 실시예에서, DMS와 결합된 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들일 수 있다. 일 실시예에서, PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB, 및/또는 PDGF-AB이다. 일 실시예에서, 적용된 성장 인자 투여량은 10ng/ml 내지 1mg/ml 사이이다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 근원은 반월상연골 조직일 수 있다. 반월상연골은 사람 또는 다른 포유동물로부터 비롯될 수 있다. 일 실시예에서, DMS의 3-차원 형태는 더 큰 반월상연골 결함들을 채우기 위해 준비될 수 있다. 탈세포화 과정 및 헤파린/PDGF 결합은 DMS 시트를 위해 여기에 설명된 것과 유사하다. 일 실시예에서, 반월상연골 결함들 안으로의 이식을 위해, PDGF-결합된 스캐폴드들은 줄기 세포들 또는 반월상연골 세포들 (천연 또는 성장 인자들에서의 전배양 또는 바이러스성의 유전자 전이에 의한 변형)을 붙이는데 또한 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 헤파린/PDFG 결합된 DMS는 관절경 수술 중에 반월상연골 결함 안으로 삽입될 것이다. DMS는 글루, 봉합사들, 스테이플 또는 앵커들의 적용에 의해 고정된다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 조직 손상의 치료를 촉진하도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 세포 이동을 촉진하도록, DMS의 콜라겐 섬유 배향은 반월상연골 결함과 매치된다. 이것은 반월상연골로부터 DMS를 수평으로 절단하고 그리고 헤파린/PDGF 결합된 DMS를 동일한 배향에 삽입하여 달성된다. 다른 실시예에서, 세포 이동 및 침윤을 촉진하도록, 콜라게나아제 소화, 기계적인 뚫림 또는 레이저 적용을 사용하여 구멍들은 DMS의 밀집된(dense) 콜라겐 섬유 네트워크 안에 생성된다.
일 실시예에서, 대상의 조직 손상에서 필요로 하는 복원 및/또는 치료 방법이 여기에 개시되고, 상기 방법은 탈세포화된 반월상연골 조직을 포함하는 스캐폴드를 제공하는 단계; 및 파열 위에 스캐폴드를 이식하여 조직 손상을 복원 및/또는 치료하는 단계;를 포함하고 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된다. 일 실시예에서, 조직 손상은 조직의 파열이다. 일 실시예에서, 조직은 반월상연골 조직이다. 일 실시예에서, 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB, 및/또는 PDGF-AB이다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 반월상연골 조직의 무혈관 또는 혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 효과적인 세포 침윤(infiltration) 및 숙주 세포들로부터 스캐폴드로의 이동에 최적화된다. 일 실시예에서, 무세포성 스캐폴드는 관절경 수술에 의해 반월상연골 파열 위에 이식된다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 투여 후 적어도 20일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 실질적으로 1차 역학으로 성장 인자를 방출한다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 강도는, 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 크다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 강도는, 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 크다. 일 실시예에서, 스캐폴드의 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 크다. 일 실시예에서, PDGF는 상기 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된다. 일 실시예에서, 조직의 파열의 복원 및/또는 치료 방법은 이차 치료 요법을 더 포함한다. 일 실시예에서, 이차 치료 요법은 휴식, 얼음, 압박, 증가 및/또는 물리 치료와 같은 비-수술적 치료를 포함한다. 일 실시예에서, 이차 치료 요법은 수술적 복원, 부분 반월상연골절제술 및/또는 완전 반월상연골절제술과 같은 수술적 치료를 포함한다. 일 실시예에서, 대상은 포유동물이다. 일 실시예에서, 대상은 사람이다. 일 실시예에서, 대상은 말이다.
일 실시예에서, 발명자들은 손상된 반월상연골 병변 안으로 삽입되어 통합적인 조직 치유를 촉진시킬 수 있는 신규한 스캐폴드를 개발하였다. 구체적으로, 다양한 실시예들에서, 사람 탈세포화된 반월상연골 (적절한 콜라겐 배향과 함께) 준비를 위한 방법이 개시된다; 탈세포화된 반월상연골의 헤파린 및 PDGF-BB 결합; 및 파열된 반월상연골 안으로의 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드 삽입 방법이다. 보바인 반월상연골 절편들은 반월상연골 파열들을 생성하기 위해 사용되었다. PDGF-BB 결합된 반월상연골 스캐폴드의 삽입은 스캐폴드를 향한 세포 이동, 결함을 연결시키고(bridged) 그리고 생체역학적 특성들을 개선시키는 새로운 콜라겐의(collagenous) 세포외 기질(matrix)의 생성을 이끌었다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골은 반월상연골 병변의 치유를 촉진시키고 그리고 만성 무릎 통증 및 기능 장애를 예방하기 위해 관절경 검사(arthroscopy) 중 반월상연골 파열 안으로 삽입될 수 있다.
일 실시예에서, 장치가 여기에 개시되며, 장치는: 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 무세포성 스캐폴드를 포함하고, 장치는 조직들을 복원하기 위함이다. 일 실시예에서, 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 무세포성 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드이다. 일 실시예에서, 무세포성 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 상기 무세포성 스캐폴드는 천연 반월상연골과 비교하여 유사한 생물학적 및 기계적 특징을 가진다. 일 실시예에서, 성장 인자는 무혈관 또는 혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 무세포성 스캐폴드는 숙주 세포들로부터 스캐폴드로의 효과적인 세포 침윤 및 이동에 최적화된다. 일 실시예에서, 장치는 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어난다.
일 실시예에서, 세포 이동을 유도하는 방법이 여기에 개시되고, 상기 방법은 하나 이상의 성장 인자들의 고정화를 위해 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드를 제공하는 단계; 및 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드로 세포 이동을 유도하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 성장 인자들은 PDGF이다. 일 실시예에서, 헤파린은 고정화를 위해 사용된다. 일 실시예에서, 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드는 대상에 직접 이식된다. 일 실시예에서, 대상은 사람이다. 일 실시예에서, 대상은 말이다.
다양한 실시예들에서, 본 개시는 헤파린 결합된 DMS가 느리게 방출된, PDGF-BB의 강력한 고정화를 보여주는 것을 제공한다. PDGF-BB 코팅된 DMS는 내인성 반월상연골 세포들의 결함 영역 및 스캐폴드 안으로의 이동을 촉진시켰다. 천연 반월상연골과 스캐폴드 사이의 공간을 연결하는 새로운 기질이 형성되었고 그리고 이것은 개선된 생체역학적 특성들과 관련이 있었다. PDGF-BB 코팅된 DMS는 반월상연골 파열들의 통합적인 치유를 위한 유망한 접근법이다.
본 개시는 또한 스캐폴드를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 조직의 파열을 복원 및/또는 치료하는 데 독창적인 방법을 실시하는데 유용하다. 키트는 독창적인 스캐폴드들 중 적어도 하나를 포함하는, 재료들 또는 구성들의 조합이다. 따라서, 일부 실시예들에서 키트는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 스캐폴드를 포함하는 멸균 용기 및 키트를 사용하기 위한 지침을 포함한다. 일 실시예에서, 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1과 같은 다른 케모카인들로 구성된 그룹에서 선택된다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일 실시예에서, 키트는 손상된 반월상연골 안으로의 스캐폴드의 전달을 위한 수단을 더 포함한다. 일 실시예에서, 전달하기 위한 수단은 의료용 글루, 의료용 봉합사들, 의료용 스테이플스, 및/또는 의료용 앵커들이다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드이다. 일 실시예에서, 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 무세포성 스캐폴드는 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집한다. 일 실시예에서, 헤파린 결합은 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어난다.
독창적인 키트를 구성하는 구성들의 정확한 성질은 의도된 목적에 의존한다. 예를 들어, 몇몇의 실시예들은 조직의 파열을 치료 및/또는 치유하기 위한 목적을 위해 구성된다. 일 실시예에서, 키트는 특히 포유류의 대상들을 치료하기 위한 목적으로 구성된다. 다른 실시예에서, 키트는 특히 사람 대상들을 치료하기 위한 목적으로 구성된다. 추가적인 실시예들에서, 키트는 수의학에 적용, 농경용 가축(farm animals), 가축(domestic animals), 및 실험 동물, 그러나 이에 제한되지 않는, 대상들을 치료하기 위해 구성된다.
사용하기 위한 지침은 키트에 포함되어 있을 수 있다. “사용하기 위한 지침”은 일반적으로 조직의 치료, 복원, 및/또는 치유와 같은, 원하는 결과에 영향을 주기 위해 키트의 구성들을 사용하는데 사용되는 기술을 설명하는 구체적인 표현을 포함한다. 선택적으로, 키트는 또한 희석액들, 완충제, 약학적으로 받아들여지는 매개체들(carriers), 주사기들(syringes), 카테터들(catheters), 어플리케이터들(applicators), 피펫팅(pipetting) 또는 측정 도구들, 붕대 재료들 또는 본 기술분야의 기술자들에 의해 쉽게 인식될 수 있는 다른 유용한 용품(paraphernalia), 과 같은, 다른 유용한 구성들을 포함한다.
키트에 조립된 재료들 또는 구성들은 이들의 조작성 및 유용성을 보존하기 위한 임의의 편리하고 그리고 적합한 방식들로 저장되어 전문가들에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 구성들은 용해된, 탈수된, 또는 냉동 건조된 형태일 수 있고; 그것들은 상온, 냉장온 또는 냉동온에서 제공될 수 있다. 구성들은 일반적으로 적합한 포장 재료(들)에 포함되어 있다. 여기에 사용되는 바와 같이, "포장 재료" 구절은 독창적인 구성들 및 기타 같은 종류의 것들과 같은, 키트의 내용물들을 수용하는데 사용되는, 하나 이상의 물리적인 구조들을 나타낸다. 포장 재료는 바람직하게 무균, 오염물질-없는 환경을 제공하기 위해, 잘 알려진 방법들에 의해 구성된다. 키트에 사용된 포장 재료들은 의료 및 바이오-제약 분야에서 관례적으로 사용되는 것들이다. 여기에 사용되는 바와 같이, 용어"포장"은 개별 키트 구성들을 고정할 수 있는, 유리, 플라스틱, 종이, 포일(foil), 기타 같은 종류의 것과 같은 적합한 고체 기질 또는 재료들을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 포장은 화학주성 성장 인자와 함께 코팅된 무세포성 스캐폴드를 포함하는 독창적인 구성의 적합한 양을 담는데 사용되는 유리병(glass vial)일 수 있다. 포장 재료는 일반적으로 키트 및/또는 그 구성들의 내용들 및/또는 목적을 나타내는 외부 라벨을 갖는다.
본 개시의 실시예들은 다음의 예시들에서 추가로 설명된다. 예시들은 단지 예시일 뿐이며 그리고 청구된 바와 같은 발명의 범위를 어떠한 방법으로도 제한하지 않는다.
예시들
예시 1
일반적으로
무릎 관절의 강한 비틀림, 회전, 또는 과다-굽힘은 대단히 충격적인(traumatic) 반월상연골의 파열들로 이끈다. 파열된 반월상연골은 무릎 통증, 붓기, 굳음, 그리고 무릎을 늘리는데 제한을 유발한다. 반월상연골 파열들을 해결하기 위한 현재 수술적 접근은 봉합, 및 부분 반월상연골절제술을 포함한다. 그러나 무혈관 영역인, 이너 써드에서 반월상연골 파열들은, 일반적으로 자연적으로 또는 외과적 수술 후에 치유되지 않으며 그리고 무릎 관절염(OA)의 발병에 대한 주요 위험 요소를 나타낸다. 반월상연골의 중간 및 안쪽 영역들은 혈액 공급이 부족하고 그러므로 치유 가능성이 가장 낮다.
반월의 복원 및 재생을 촉진시킬 가능성이 있는 세포들은 파열에 인접한 반월상연골 및 윤활막 및 관절 주머니에 존재한다. 파열 부분에 화학주성 인자들의 적용은 따라서 복원을 매개하는(mediate) 세포들을 모집할 가능성이 있다. 성장 인자들은 반월상연골의 치유를 촉진시킬 가능성이 있고 그리고 반월상연골 세포들로의 유전자 전이 또는 유전자 변환(transduced) 세포들의 적용을 포함하는 다양한 접근법들이 추구되어 왔다. PDGF는 연골세포들(chondrocytes) 및 중간엽(mesenchymal) 줄기 세포들에 대한 강한 화학주성 활성을 가지므로 반월상연골 복원을 위한 후보이다. PDGF는 반월의 세포 활성을 향상시키고 그리고 이것의 발현은 무혈관 영역의 병변에서 감소된다. 구체적으로, PDGF-BB는 가장 강한 미토겐(mitogen)으로 알려져 있고 그리고 이는 PDGFRβ를 자동-인산화(auto-phosphorylates)한다. 이 수용체는 세포 성장의 목표 된 조작을 위해 세포-기질 상호작용에 관련된다.
본 개시의 일 실시예에서, 공유 결합(linkage) 또는 정전기적 상호작용들에 의한 헤파린의 표면 고정화는 스캐폴드들로부터 초기에 터지면서 방출된 성장 인자를 극복하기 위한 접근법이었다. 헤파린은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, basic fibroblast growth factor), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β, transforming growth factor-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 혈소판-유래 성장 인자-BB(PDGF-BB)와 같은 다양한 성장 인자들에 대한 강한 묶음(binding) 친화력이 있다. 일 실시예에서, 헤파린 고정화에 의해 PDGF 결합된 스캐폴드들의 반월상연골 파열 영역 안으로의 삽입은 반월상연골 파열을 매개하는 세포들을 모집한다. 일 실시예에서, 본 개시는 PDGF 고정화를 위해 탈세포화된 반월상연골을 임상적으로 적용가능한 스캐폴드로 사용하고 그리고 반월상연골 파열들의 복원을 매개하도록 내인성 세포들을 모집하는 이의 능력을 테스트하였다.
다른 실시예에서, PDGF 및 다른 성장 인자들은 헤파린에의 공유 결합 또는 정전기적 상호작용들을 통해 스캐폴드에 고정될 수 있고, 이는 이것의 지속적인 방출로 이끈다. 본 개시의 일 실시예에서, 발명자들은 PDGF-BB 고정화를 위해 쉽게 이용할 수 있고 그리고 임상적으로 적용가능한 스캐폴드로 헤파린-결합된 탈세포화된 반월상연골을 사용하였고 그리고 이 스캐폴드의 반월상연골 파열들의 복원을 매개하도록 내인성 세포들을 모집하는 능력을 보여주었다.
예시 2
무세포성 반월상연골 인공물
본 기술분야의 숙련된 기술자에게 알려진 바와 같이, 반월상연골 파열들은 가장 흔한 무릎 부상 중 하나이고; 그리고 반월의 손상들에 대한 특정 치료들이 현재 존재하지만, 치료 옵션들은 반월상연골 복원 또는 재생을 야기하지 않는다. 몇몇의 경우들에서, 환자를 치료하기 위해 부분 반월상연골절제술 또는 완전 반월상연골절제술이 수행된다. 이 치료들은 종종 환자에게 골관절염, 및/또는 상처 조직들을 야기한다.
다양한 실시예들에서, 발명자들은 통합적인 반월상연골 치유를 위해 화학주성-무세포성 반월상연골 인공물을 개발함으로써 이 문제를 해결하였다. 일 실시예에서, 발명자들은 숙주 세포 침윤을 위해 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드(DMS, decellularized meniscus scaffold)를 특정하였다. 탈세포화된 천연 반월상연골 조직은 손상된 사람 반월상연골의 복원을 위한 유망한 생물학적 스캐폴드이다. 이는 천연 반월상연골과 비교하여 유사한 생물학적 및 기계적 특징을 가진다. 또한, 이상적인 스캐폴딩(scaffolding)은 또한 무혈관 영역에서 복원을 시작하기 위해 새로운 세포들의 집단을 모집하기 위해 화학주성 인자를 포함해야 한다. DMS 구조는 숙주 세포들로부터 DMS로의 효과적인 세포 침윤 및 이동을 위해 변경되었다.
일 실시예에서, 세포 모집에 대한 PDFG 코팅된 DMS의 효과 및 체외에서 진행되는 반월상연골 복구가 시험되었다. PDGF-BB(혈소판-유래 성장 인자-BB)는 중간엽 세포들에 대한 강한 화학주성 성장 인자로 잘 알려져 있다. 반월상연골 조직들을 체외에서 진행되는 손상 모델에 사용하여, 성장 인자에 의해 DMS로 모집된 세포들이 특정 세포-표면 마커들을 사용하여 식별되었다. 이동한 세포들의 수 및 새롭게 합성된 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)이 분석되었다. PDGF-BB 코팅이 손상된 반월상연골에 대한 DMS 적용을 개선시키는 정도를 결정하기 위해 생체역학적 특성들이 테스트되었다.
일 실시예에서, PDGF-코팅된 DMS는 반월상연골 통합 치유에서 효능을 위해 동물 모델을 사용하여 테스트되었다. 합성물(composite)은 토끼 반월상연골 결함 모델에서 테스트되었다. 결과 측정들에는 조직학적 및 생체역학적 파라미터들이 포함될 수 있다.
본 개시의 전반에 걸쳐 개시되어 여기에 설명된 바와 같이, 발명자들은 화학주성 성장 인자로 코팅된 무세포성 스캐폴드를 사용하여 통합적인 반월상연골 치유를 위한 새로운 치료적 접근법을 개발하고자 하였다. 스캐폴드는 관련된 결과 측정들을 사용하여 체외 및 체내에서 시험되었다. 성장 인자 향상된 천연 스캐폴드는 외인성 세포들을 사용하는 것과 관련된 어려움들 없이 쉽게 제조될 수 있고 그리고 반월상연골 파열들에 대한 복원을 향상시키고 그리고 OA의 발병으로 인한 만성 통증 및 장애 예방에 대한 주요한 충족되지 않은 요구를 다루기 위해 그것 자체가 빠른 임상적 전환을 준다.
예시 3
중요성
반월상연골의 주 몸체는 섬유연골성 반월모양(semilunar)의 구조이고, 이는 경골(tibia) 및 대퇴골(femur) 사이 관절의 주변 측면에 위치한다. 두개의 전방 및 후방 뿔들(horns)은 경골 고평부(tibial plateau)와 함께 연결되어 있다. 반월상연골은 경골 고평부에서 섬유연골 인공물 삽입(enthesis)을 통해 약화되는 압축 및 인장-후프(hoop) 압박들(stresses)을 변환하여 완충 작용을 제공한다.
반월상연골 파열들은 무릎 관절의 가장 흔한 손상이다. 정상적인 반월상연골 뿐만 아니라, 발달상 비정상적인 반월상연골(menisci)도 또한, 특히 원반 모양의(discoid) 반월상연골들은 파열에 대해 증가된 위험에 있다. 안정적인 원반 모양의 반월상연골도 반월상연골 파열의 물리적 증상들이 나타날 수 있다. 많은 경우들은 만성 ACL 불충분 및 급성 ACL 파열과 같은 전방십자인대(ACL, anterior cruciate ligament) 손상들과 관련이 있다. 다른 손상 패턴들은 성별, 연령, 몸 무게, 및 손상 메커니즘과 같은 다른 위험 요소들과 관련될 수 있다. 반월상연골의 바깥에서 삼분의 일은 이것의 혈관분포 및 혈액으로부터 전구 세포들의 모집으로 인해 잠재적인 치유 능력을 가짐에도 불구하고, 중간 및 이너 영역들은 무혈관이고 그리고 그러므로 가장 낮은 치유의 가능성을 가진다. 무혈관 영역의 복원은 상주 세포들의 증식을 필요로 하는 것으로 보이며 그리고 적절한 반월상연골 생체역학적 기능을 회복시키기 위해 섬유아세포(fibrochondrocytic) 분화가 필수적이다 (도 1). 반월상연골 파열들, 특히 이너 써드에서 발생하는 가장 일반적인 형태들은, 일반적으로 자연적으로 치유되지 않으며 그리고 무릎 관절염(OA)의 발병에 대한 주요 위험 요소를 나타낸다. 반월상연골 복원에 대한 전략들은 따라서 OA와 관련된 장애 및 통증을 예방하는데 필수적이다. 전반적인 낮은 세포질의 분화된 반월상연골 세포들과 반월상연골 전구체, 밀집된 ECM, 낮은 혈관분포, 및 염증 환경이 반월상연골 손상 부분에 존재하고, 모두 반월상연골 치유 및 재생의 실패에 기여한다.
반월상연골의 복잡한 구조로 인해, 반월상연골에 관한 많은 연구들-외인성 세포들을 사용한 반월상연골-유사 분화에 관한 많은 연구들이 도전되었다 (도 1). 일 실시예에서, 전기방사 스캐폴드에, 사람 반월상연골 세포들과 같은, 분화된 세포들의 적용이 연구되었다. 특정 성장 인자의 선택은 사용되는 특정 세포 타입에 따라 다르다. 골수, 윤활막, 윤활 액(synovial fluid), 지방 조직, 반월상연골, 및 다른 근원들로부터 유래된 다른 타입들의 중간엽 줄기 세포들은 섬유 연골 형성 분화를 유도하기 위해 성장 인자들과 조합하여 사용될 수 있다. 반월상연골 치유를 위해 사용되는 때 전구 세포들은 이종 개체군으로 진화할 필요가 있고 그리고 동시에 프로콜라겐 I, 및 IIa를 합성한다. 또한, 반월상연골은, 가장 중요하게는 혈관화가 있고 그리고 없고에 따라, 뚜렷한 영역 특성들을 갖는다.
스캐폴드의 선택은 또한 반월상연골 복원에 적용하는데 대단히 중요하다. 파열들의 타입들, 및 부분 또는 전체 교체에 사용되는지에 따라 다양한 타입들의 스캐폴드들이 고려될 수 있다. 동일한 원 재료를 사용하더라도, 스캐폴드는 다른 모양, 기계적 특성, 및 크기로 만들어질 수 있다. 따라서, 스캐폴드 디자인에서 많은 요소들이 고려되어야 한다. 이상적으로, 반월상연골 복원을 위한 스캐폴드는 안정적인 하중-전달 기능을 위해 천연 반월상연골과 유사한 섬유-연골성 구조를 가져야한다.
이러한 고려들에 기초하여, 손상된 영역으로의 세포들의 이동 및 섬유연골성 결합 조직을 생성하기 위한 적절한 분화는 성공적인 반월상연골 치유에 요구되는 주요 과정들인 것으로 보인다 (도 2). 이 연구의 동기는 어떤 외인성 세포들 없이 오직 화학주성 성장 인자가 스캐폴드에 적용될 수 있고 그리고 손상된 영역으로 이동할 것으로 예상되는 내인성 세포들이 치유 과정들을 수행한다는 것이다. PDGF는 전구 세포들에 대한 강한 화학주성 효과를 가진다. 따라서 발명자들은 내인성 세포 이동에 의한 반월상연골 손상의 치유를 위한 이 접근법의 가능성을 결정하기 위해 스캐폴드로서 탈세포화된 반월상연골과 함께 PDGF 적용을 조사하였다.
예시 4
반월상연골 파열들을 치료하기 위한 스캐폴드
스캐폴드들은 조직 공학의 분야에 알려진 바와 같이 천연 조직들의 탈세포화에 의해 준비되었다. 대부분의 재료들은 히드로겔(hydrogels)로 재구성되었고 그리고 교차-결합 후 스캐폴드들과 같은 충전재들 또는 스펀지로 적용되었다. 그러나, 반월상연골은 조밀하고 그리고 복합적인 콜라겐 기질로 구성된다. 또한, 압축 및 인장-후프와 같은 여러 기계적 압박들이 무릎 반월상연골에 영향을 미친다. 일 실시예에서, 반월상연골 유래 인공물은 손상된 반월상연골의 치유를 촉진하기 위해 매우 실현가능한 출발 물질인 것으로 밝혀졌다. 무세포성 시트는 반월상연골 파열들에 특정 적용을 위해 보바인 반월상연골로부터 개발되었고 (도 3), 여기서 천연 조직 구조는 효과적인 탈세포화로 유지되었다.
예시 5
화학주성 성장 인자와 DMS의 결합
헤파린은 매우 황산화된 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)으로, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, basic fibroblast growth factor), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β, transforming growth factor-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 혈소판-유래 성장 인자-BB (PDGF-BB)와 같은 다양한 성장 인자들에 대한 강한 묶음 친화력이 있다. 헤파린의 카복시기(carboxyl) 그룹은 DMS의 아민(amine) 그룹들과 묶일 수 있다 (도 4). 이 합성물은 성장 인자를 유지하고 그리고 통제된 방출을 허용할 수 있었고, 이는, 경사적으로, 인접한 천연 반월상연골로부터 손상된 영역으로 상주 세포들을 모집할 수 있었다. 이 고정화 시스템을 사용하여, 성장 인자 투여량 및 방출 역학은 최적화되었고, 화학주성 성장 인자에 의해 모집된 세포들의 표현형은 특성화되었고, 그리고 이 합성물을 손상된 반월상연골 안으로 삽입한 후의 치유 과정이 이해되었다.
예시 6
반월상연골 복원 및 재생
조직 공학에 의한 인공물들은 일반적으로 스캐폴드, 외인성 세포들, 및 성장 인자로 구성된다. 그러나, 외인성 세포들의 사용은 수술 전에 충분한 양의 세포들을 채취해야 하는 과제들 및 살아있는 세포를 포함하는 구조물을 준비하고 그리고 사용하는 복잡한 실행계획에 의해 제한된다. 본 개시는 천연 반월상연골로부터 유래된 화학주성-무세포성 스캐폴드를 사용하여 새로운 치료적 접근법을 제공하고, 이는 반월상연골의 복원 및 재생의 목적에 유용할 것이다. 일 실시예에서, 본 개시의 일 혁신은 반월상연골 파열들 안으로의 삽입을 위해 특별히 형성되고 그리고 외인성 세포들을 모집하여 치유를 유도하기 위해 화학주성 성장 인자와 결합된, 천연 생체재료의 사용에 있다. 이 접근법은 또한 외인성 세포들의 사용과 관련된 도전들을 피하고 그리고 안전한 것으로 알려진 물질들 및 방법들을 사용하므로 높은 전환 가능성이 있다.
예시 7
PDGF-BB 결합 및 방출
탈세포화를 위한 방법의 적용 후, DNA 내용은 천연 보바인 반월상연골 조직과 비교하여 상당히 감소되었다 (도 5 A, B). 헤파린 결합의 효능을 평가하기 위해, 톨루이딘 블루 분석이 헤파린 검출에 적용되었다 (도 5 C). 헤파린 결합은 톨루이딘 블루 묶음을 크게 증가시켰다 (도 5 D).
도 6은 PDGF-BB 결합 및 방출에 대한 실험 데이터를 개시한다. 헤파린-코팅된 DMS에 바운드 된 PDGF-BB의 양은 총 200 ng PDGF-BB의 86.72 %였고 그리고 비 헤파린-코팅된 DMS는 76.82%였다. 그 다음의 최초 24시간 동안 초기 방출은 헤파린-코팅된 DMS로부터 6.22 % 대비 비 헤파린-코팅된 DMS로부터 13.76%, 그 다음의 16-일 동안 24시간 당 약 0.61 ng의 후속 지속된 방출이 있었다 (도 6). 16일에, PDGF의 총 양의 11.22%가 헤파린 코팅된 것으로부터 방출되었고 이에 대비하여 헤파린 없는 DMS로부터 26.11%가 방출되었다. 또한, 헤파린 있는 그리고 없는 DMS 사이에 2, 4, 8, 12, 및 16일에서 방출된 양들의 상당한 차이들이 있었다. 일 실시예에서, 발명자들은 헤파린 코팅된 DMS로부터 PDGF의 지속적인 방출이 30일까지 연속되는 것을 발견하였다.
PDGFRβ 양성 세포들은 반월상연골의 혈관 영역에는 풍부하지만 그러나 사람 반월상연골의 무혈관 영역에는 매우 드물다는 것이 발견되었다 (도 7 A, B). 그러나, PDGF 코팅된 스캐폴드와 함께 보바인 반월상연골 절편들의 실험적인 파열들의 치료 후, PDGFRβ 양성 세포들이 무혈관 영역에서 증가하였다. 또한, 반월상연골의 외인성 세포들은 PDGF 코팅된 스캐폴드로의 직접 세포 이동을 보여주었다 (도 7 C, D).
DAPI 비교 이미지들에 기초하여, PDGF-DMS는 절편 안으로 오직 DMS만 삽입된 것과 비교하여 결함 영역의 경계선 근처의 상주 세포들을 모집하였다 (도 8 B,C). 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색의 이미지들은 이동한 세포들로부터 새롭게 생성된 ECM을 보여주었다 (도 8 E, F). PDGF에 의해 모집된 세포들은 반월상연골 조직과 DMS 사이의 경계선을 따라 정렬되었다 (도 8C). PDGF로 코팅되지 않은 DMS의 삽입은 세포 모집으로 야기하지 않았다. 피크로시리우스 레드 염색은 이동한 세포들이 DMS 및 천연 반월상연골을 연결하는 ECM을 새롭게 합성했음을 보여주었다 (도 8F). 이 예비 데이터들은 PDGF가 외인성 세포들을 결함 영역으로 모집하는 것이 가능하고 그리고 이 세포들은 새로운 ECM을 생성한다는 것을 제안한다. 이 결과들은 PDGF 결합된 DMS가 임의의 공학에 의한 외인성 세포 배양에 대한 요구 없이 자가(autologous) 세포들을 모집할 수 있는, 화학주성 인공물을 제공할 가능성이 있음을 설명한다.
50ng/ml PDGF로 코팅된 또는 결합된 DMS는 비-결합된 DMS와 비교했을 때 결함 경계선에 모집된 상당히 증가된 세포들의 수를 보여주었다. 200ng/ml PDGF로 더 높은 세포 수들까지 모집되었다 (도 9.A). 새롭게 생성된 ECM은 DMS의 내부 공간을 채우고 있었다 (도 9.B). 200ng/ml 그룹은 DMS의 콜라겐 섬유들이 수평으로 정렬 됐음에도 불구하고 세포 침윤된 콜라겐 섬유들의 방향들은 숙주 조직으로 향하는 것을 보여주었다 (도 9.C). 인장 테스트는 2 및 4주 후에 PDGF 그룹들에서 영률이 상당히 증가하는 것을 보여주었다 (도 10).
예시 8
DMS 통합적인 치유 접근법
숙주 세포 침윤을 위한 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드(DMS)의 최적화: DMS는 숙주 조직으로부터 DMS로의 효과적인 세포 침윤을 위한 표면 변형에 의해, 그리고 DMS에 화학주성 성장 인자의 고정화로 인해 최적화되었다.
DMS는 탈세포화 과정에 의한 세포들, 프로테오글리칸(proteoglycan), 및 GAG의 제거로 인해 스캐폴드 내에 미세 공간들을 가지고 그리고 이는 모집된 세포들의 부착을 허용할 수 있다.
DMS에 PDGF-BB 고정화는 헤파린 결합에 의해 최적화되었다 (도 11). 헤파린은 PDGF 묶임 부분을 갖는다. DMS에 결합된 헤파린은 PDGF-BB을 묶어 지속적인 방출을 야기한다. 상이한 헤파린 및 PDGF 농도 하에서, 방출된 PDGF는 ELISA 키트 (PeproTech, Inc.)를 사용하여 최대 4주 동안 정량화된다. 최적화된 결과는 4-6주 동안 지속적인 방출이 이어지는 초기 치료된 PDGF-BB로부터의 90 % 초과의 묶음 효능을 포함한다.
PDGF-코팅된 DMS 안으로 이동한 세포들의 정량화 및 특성화: 일 실시예에서, 이 연구들의 목적은 이동한 세포들을 정량화하고 그리고 표현형화 하는 것이다. 신선한(fresh) 보바인 무릎 조인트들이 구해지고 그리고 온전한 반월상연골을 제거한 후, 무혈관 영역으로부터 절편들이 준비된다. 절편들은 DMEM 기본 배지와 함께 3일 동안 배양되었다. 이 때, 파열-같은 결함들이 #11 사이즈 (40mm) 메스를 사용하여 생성되었고 그리고 원통형의 결함들이 3 mm 펀치에 의해 생성되었다 (도 12). PDGF가 있거나 또는 없는 PDGF-결합된 DMS가 결함 영역 안으로 삽입되었다. 결함 틈을 닫기 위해, 6-0 사이즈 비흡수성 나일론 봉합사로 봉합이 수행되었다. 절편들은 2 및 4주 동안 DMEM 기본 배지에서 배양하고 그리고 파라핀에 넣어 놓았다. 천연 조직과 DMS 사이의 경계로 이동한 세포들의 수 및 DAPI 염색된 섹션들의 스캐폴드 내에 있는 세포들의 수는 정량화 된다.
트리크롬(Trichrome), 및 피크로시리우스 레드와 같은 ECM 염색들은 천연 반월상연골과 스캐폴드 사이의 경계 그리고 심지어 스캐폴드 안의 ECM 형성 및 구조를 평가하기 위해 생체 외 배양 후 적용된다. 방향성 콜라겐 섬유들은 또한 피크로시리우스 레드 염색에 의해 검출될 수 있다. 이미지-분석 프로그램(ImageJ, Ver.1.50c4)을 사용하여, 이동한 세포의 수 및 새롭게 합성된 ECM 영역의 면적이 정량화될 수 있고 그리고 Mann-Whitney, T-테스트(95% 또는 99%, 신뢰 구간)에 의해 통계적으로 분석될 수 있다. 일 실시예에서, PDGF는 세포성, 복구 조직의 구조, 및 사프라인-O 염색의 강도를 증가시켰다.
일 실시예에서, 섬유아세포(fibroblastic) 대 연골세포 마커들의 관점에서 세포들의 표현형은 장기적인 (4주) 배양 후에 결정되었다. 면역조직화학은 섬유 형성(fibrogenic) 마커들로서 SCX, 테나신(tenascin)-C, 콜라겐 타입 1 그리고 연골 발생(chondrogenic) 마커들로서 Sox9, COMP, 콜라겐 타입 2에 대해 수행되었다. 이 분석은 PDGF가 화학주성 인자 뿐만 아니라 적절한 세포 분화도 촉진시키는지 여부를 다룰 수 있다. 연골 세포 분화의 정도가 충분하지 않아야 하고, PDGF 및 TGF-β3와의 DMS의 하이브리드 타입 결합이 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 생체역학적 특성들이 시험되었다. 12 mm 직경 보바인 반월상연골 절편의 중간에 8mm의 파열을 만든 후, PDGF가 있고 그리고 없는 6mm 직경의 DMS가 삽입되고 봉합된다. 생체 외 배양 2 및 4주 후, 인장 테스트가 수행된다. 견본들은 강력-글루를 사용하여 상부 및 하부 1,000N 로드 셀(Instron Universal Testing Machine) 사이에 고정된다 (도 13). 장력을 적용하기 전에, 고정된 절편들에서 봉합사들은 잘린다. 장력은 1 mm/분의 장력 속도로 측정된다. 각 그룹 (n=8-12)의 값들은 Mann-Whitney, T-테스트 (95% 또는 99%, 신뢰 구간)에 의해 통계적으로 비교된다. 이동한 세포들은 반월상연골 절편 및 삽입된 DMS 사이의 상호연결성을 향상시킬 수 있는 새로운 ECM을 생산할 수 있다.
동물 모델에서 반월상연골 통합적인 치유를 위해 체외에서 진행에 최적화된 PDGF-결합된 DMS의 시험: 반월상연골 결함 모델은 골격상으로 성숙한 (2.8-3.3 kg; 4-4.5 달) 암컷 뉴질랜드 흰 토끼들 (n=8)로 확립되고, 일반적으로 사용되는 전방 측면 접근법을 따른다. PDGF 결합된 DMS (1mm 직경)는 1mm 뚫린 결함 안으로 삽입된다. 틈을 닫기 위해, 6-0 사이즈 비-흡수성 나일론 봉합사로 봉합이 수행되었다.
4 및 8주에, 동물들을 안락사 시켰고 그리고 반월상연골 표본들은 H&E 조직학을 위해 채취되었다. DMS 안으로의 세포 침윤 및 이동한 세포들로부터의 ECM 합성이 분석되었다. 새롭게 생산된 콜라겐들은 트리크롬(trichrome) 염색에 의해 연구되었다. 생체역학적 특성들에 대해, 미세-압흔(micro-indentation) 테스트가 수행된다. 0.8mm 직격의 볼 인덴터(ball indenter)(압흔을 위한 SMAC)는 삽입된 DMS 및 숙주 조직 사이의 영역에 1N 미만으로 로드될 것이다. 이 미세 로딩에 의해, DMS 삽입된 샘플과 PDGF 결합된 DMS 삽입된 샘플들 사이의 변형 패턴이 비교된다. 이 연구들의 성공적인 완료는 본 접근법을 추가로 검증하였고 그리고 대형 동물 모델에서의 시험 및 임상 시험 준비를 위한 스캐폴드의 최적화 및 표준화 단계를 설정한다.
예시 9
방법들 및 결과들
일 실시예에서, 발명자들은 내인성 세포 이동을 유도하여 반월상연골 파열들의 통합적인 치유를 매개함에 있어 PDGF-코팅된 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드의 가능성을 시험하였다.
반월상연골 절편들: 신선한 보바인 반월상연골(내측 및 외측)는 18-30 개월 된 동물들 (Animal Technologies Inc., Tyler, TX)의 정상 무릎들로부터 획득되었다. 무릎들은 동물들이 도축된 동일한 날에 채취되고 그리고 그 다음 날 실험실에 도착하기 위해 얼음으로 운송되었다. 반월상연골 절편들을 준비하기 위해, 무혈관 (안쪽 삼분의 이)이 메스로 절제되었고 그리고 대략 20mm 폭의 블록들로 절단되었다. 조직 블록들은 1% PSF와 함께 DMEM으로 3회 세척되었고 그리고 10% 송아지 혈청 (CS, calf serum) (Omega Scientific Inc., Tarzana, CA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-젠타마이신 (PSG, Penicillin-Streptomycin-Gentamycin) (Life Technologies)과 함께 DMEM에 3일 동안 배양되었다.
탈세포화된 반월상연골 스캐폴드 및 성장 인자 결합의 준비: 디스크 형태의 절편(6-mm 직경 및 1-mm 두께)들은 표준 바늘들을 사용하여 수평으로 뚫린 보바인 반월상연골 블록들로부터 획득되었다. 탈세포화를 위해, 절편들은 순차적으로 12시간 동안 DNAse/RNAse-없는 물, 12시간 동안 0.05% 트립신(trypsin)-EDTA와 함께 진탕배양기(shaking incubator)(37℃에서 300 rpm)에 배양되었고, 1시간 동안 식염수, 24시간 동안 2% 수성 트리톤(Triton) X-100 및 1.5% 과산화아세트산 혼합, 그리고 4시간 동안 2% 콜라게나아제로 3회 세척한다. 이 순차적 화학 처리를 완료한 후, 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드들(DMS)은 매일 배지 교체들과 함께 72시간 동안 증류된 DNAse/RNAse-없는 물로 세척되었고 그리고 사용할 때까지 4 ℃에서 0.1 % PSG로 PBS에 저장하였다. DNA 내용 분석은 천연 반월상연골이 7.75ng/mg 조직 건조 중량 그리고 탈세포화된 DMS는 1.71 ng/mg (p=0.0014)을 가짐을 보여주었다.
PDGF-BB를 DMS에 고정시키기 위해, 헤파린은 DMS에 결합되었다. 헤파린 나트륨 염 0.1% (wt/v) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)은 헤파린의 카복시기 그룹을 활성화하기 위해 25mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)(Thermo Scientific) 및 10mM N-하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide) (Sigma-Aldrich)를 포함하는 0.05M 2-모르폴리노에탄설폰산(MES, 2-morpholinoethane sulfuric acid)(Sigma-Aldrich) 버퍼 (pH 5.5)에 용해되었다. 헤파린 용액의 일 ml 분액(aliquots)은 각 DMS에 첨가되었고 그리고 실온에서 4시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양되었다. 헤파린 결합된 DMS는 0.1M Na2HPO4 및 증류된 물로 3회 헹구어졌다. 톨루이딘 블루 분석은 EDC 교차-결합에 의해 헤파린 결합된 DMS가 오직 헤파린 용액(p <0.0001)에 담구어진 DMS보다 33.77 배 더 높다는 것을 보여주었다.
헤파린-결합된 DMS는 재조합된 사람 PDGF-BB (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ)와 함께 4 ℃에서 12 시간 동안 200ng/ml 농도로 배양되었다. PDGF-BB 고정화 후, DMS는 PBS로 3회 세척되고 그리고 4 ℃에서 저장되었다.
헤파린 결합된 DMS로부터 PDGF-BB의 방출 역학: 헤파린-결합된 DMS(10 mm 직경)는 PBS 첨가된 1ml의 0.1% NaN3 안의 총 양 200ng의 PDGF-BB와 함께 12 시간 동안 4 ℃에서 배양되었다. 비-결합된 PDGF-BB를 제거하기 위해, 스캐폴드는 0.1% BSA 및 0.1% NaN3와 함께 PBS로 구성된 500μl의 방출 배지로 세척되었다. 세척 후, 상청액은 채취되었고 그리고 측정된 PDGF-BB 양을 비-흡수된 PDGF-BB로 보았고 그리고 스캐폴드에 결합된 PDGF-BB의 양(결합된 PDGF-BB의 총 양 = 200 ng - 나머지 상청액으로부터 비-결합된 PDGF-BB의 양)을 계산하는데 사용되었다. 방출된 PDGF-BB를 측정하기 위해, 복제 PDGF-BB-결합된 DMS가 37 ℃에서 멸균 1.5ml 튜브들에 있는 1ml 방출 배지에 16일 동안 150 rpm에서 부드럽게 흔들면서 놓여 졌다. 각 시점에서, 모든 배지가 새로운 방출 배지로 교체되었다. 채취된 상청액들은 원심 분리되어 -80 ℃에서 저장되었다. 각 샘플로부터의 방출 배지 안의 PDGF-BB의 누적 양은 사람 PDGF-BB ELISA (Peprotech Inc)를 사용하여 분석되었다.
DMS에 심어진(seeded) 무혈관 세포의 체외에서 진행되는 배양: 백만개의 사람 무혈관 반월상연골 세포들(조직 은행들에서 획득된, 33세 남성 및 39세 여성의 분리된 정상 무릎 관절들)은 트렌스-웰 플레이트(trans-well plates)(12 멀티-웰 플레이트(12 multi-well plate))의 각 DMS(3 mm 직경, 6 mm 높이)에 심어졌다. DMS의 표면에 50 μl 세포 현탁액(cell suspension)을 2회 순차적으로 적용한 후, 트렌스-웰 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 3시간 동안 배양하고 그리고 기초 배양 배지 또는 PDGF-BB (50 ng/ml) 배지가 첨가되었다. 세포-심어진 DMS는 3일 마다 배지 교체와 함께 2주 동안 배양되었다.
DMS는 세포들이 DMS 안으로 침투하고 그리고 새로운 글리코사미노글리칸 (GAG, glycosaminoglycan)을 생성하는지 여부를 결정하기 위해 DAPI 및 사프라닌-O 염색을 위해 처리되었다. PDGF-BB의 생물학적 활성을 확인하기 위해, 항-PDGFRβ (Ab107169, 1 : 200 희석, Abcam) 항체가 적용되었고 그리고 항-토끼 IgG (A-11008, 1 : 500 희석, Life Technologies)에 의해 검출되었다.
생체 외 반월상연골 절편들의 배양: 반월상연골 절편의 중간 세그먼트에서 전체 두께의 방사형(radical) 파열이 멸균 블레이드(blade)로 생성되었다. 6mm 직경의 DMS가 결함에 삽입되었다. 삽입하는 동안, DMS의 섬유 배향은 반월상연골의 중간 파트의 것과 동일하게 유지되었다. 절편들은 3일 마다 배지 교체와 함께 2 및 4주 동안 배양되었다.
조직학적 및 면역조직화학적 분석: 절편들 (그룹 당 n=5)은 Z-픽스(Z-fix) (Anatech, Battle Creek MI)에 고정되었다. 파라핀-넣어 놓은 섹션들 (5-7 μm)은 세포 계수를 위해 DAPI (H-1500 Vector Laboratories, Inc.)로 염색되었다. 경계선에서의 세포들의 백분율은 절편 내의 총 세포들의 수들로 계산되고 그리고 통제된 절편들(control explants)과 통계적으로 비교되었다. 섹션들은 프로테오글리칸들(proteoglycans)을 검출하기 위해 사프라닌-O로 그리고 콜라겐 섬유 정렬 및 삽입된 DMS 및 손상된 절편들 사이의 상호연결성을 검출하기 위해 피크로시리우스 레드로 염색되었다. PDGFRβ 양성 세포들은 결합된 DMS로부터 PDGF-BB 활성을 확인하기 위해 계수되었다. PDGF-BB의 생물학적 활성을 확인하기 위해, 항-PDGF 수용체 베타 (anti-PDGF receptor beta) (Ab107169, 1:200 희석, Abcam), 콜라겐 타입 1a1 (Ab34710, 1:500 희석, Abcam), 콜라겐 타입 2a1 (II-II6B3, 1:50 희석, DSHB), 및 아그레칸 (L0101, 1:50 희석, OWL) 항체가 적용되었고 그리고 항-토끼 IgG (A-11008, 1:500 희석, Life Technologies) 또는 항-쥐 DAB (anti-mouse DAB) (MP-7420, 1:20 희석, Vector Laboratories)에 의해 검출되었다.
생체역학적 테스팅: DMS, 헤파린-결합된 (HEP) DMS, 50ng/ml PDGF-BB 코팅된 HEP-DMS, 100ng/ml PDGF 코팅된 HEP-DMS, 및 200ng/ml PDGF 코팅된 HEP-DMS를 포함하는, 다양한 타입들의 DMS와 손상된 반월상연골 절편들의 영률은 인장 테스트 (그룹 당 n=8-12)에 의해 정량화되었다. 각 절편은 500N 로드 셀과 함께 단축 시험 기계(uniaxial testing machine) (Instron® Universal Testing Machine, 3342 Single Column Model, Norwood, MA)의 두 끝의 그립들에 올려지고(mounted) 그리고 고정되었고 그리고 대기 조건(ambient condition)들 하에서 20 cm의 표점 거리에서 1mm/분의 크로스헤드(crosshead) 속도에서의 고장을 시험하였다. 영률은 응력-변형 곡선의 선형 세그먼트의 기울기에서 계산되었다.
통계적 분석: 데이터는 각 3회 수행된, 적어도 3 내지 4회 반복 실험들로부터, 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM, standard error of mean)를 나타낸다. PDGF 방출 정량에서의 차이들의 통계적 상당성은 다중 비교를 위해 2-방법 ANOVA를 사용하여 결정되었다. 인장 시험에서, Mann-Whitney 시험이 사용되었다. 조직학적 점수들 및 값들, DNA 내용, 및 톨루이딘 블루 정량화의 차이들은 짝을 이루지 않은 t 테스트에 의해 분석되었다. *=p<0.05 (95% CI, 신뢰 구간(confidence interval)), **=p<0.01 (99% CI), ***=p<0.001 (99.9% CI), ****=p<(99.99% CI)와 함께한 결과들은 통계적으로 상당한 것으로 고려되었다.
PDGF 활성 및 세포 이동: 정상 반월상연골 조직의 PDGFRβ 양성 세포들은 주로 혈관 영역에 있다 (도 14A). PDGF 결합은 결함 영역에서의 이동한 세포들 중 PDGFRβ 양성 세포들의 수를 증가시켰다 (도 14). PDGF 결합된 DMS (92.32±2.536%)는 오직 DMS 삽입된 그룹 (49.61±5.967%), 및 오직 결함이 있는 반월상연골 그룹 (21.53±7.267%) 보다 항-PDGFRβ의 양성 세포들이 상당히 높았다. PDGF-코팅된 DMS의 반월상연골 파열들 안으로의 삽입은 보바인 반월상연골 세포들의 결함 영역으로의 이동을 이끌었다 (도 15). DAPI 양성 계수는 PDGF-코팅된 DMS (58.90±3.051 %)가 PDGF와 결합되지 않은 DMS (32.25±2.754%) 보다 결함 영역에 대해 상당히 높은 세포 밀도를 유도함을 밝혀냈다.
손상된 반월상연골 절편들에서의 ECM 형성: 사프라닌-O (n=3-9) 및 피크로시리우스 레드 (n=4-8) 염색의 조직형태학적(histomorphometric) 분석에서, PDGF 결합된 DMS는 DMS 안으로의 GAG 확산 및 DMS와 손상된 절편들 사이의 조직 통합을 유도했다 (도 20). 또한, PDGF 결합은 DMS 안으로의 세포 통합을 촉진시켰다. PDGF-HEP 결합된 DMS (2주 후 36.49±1.55%, 4주 후 46.88±1.673%) 그룹 내의 사프라닌-O 양성 영역은 오직 DMS 삽입된 반월상연골 절편 (2주 후 2.69±0.75%, 4주 후 0.33±0.30%) 보다 상당히 높았다. PDGF 결합된 DMS 삽입된 절편들(2주 후 68.05±5.779%, 4주 후 68.45±3.709%)의 통합적인 백분율은 오직 DMS 삽입된 절편들 (2주 후 2.313±2.313%, 4주 후 38.70±6.981%)보다 상당히 높았다.
DMS 삽입 후 손상된 반월상연골 절편들의 기계적 특성들: 도 17에 도시된 바와 같이, 인장 특성들은 2 및 4주 동안 배양 후 오직 DMS 또는 200ng/ml의 PDGF-BB와 함께 결합된 DMS가 삽입된 절편들 사이에서 비교되었다. PDGF-BB-결합된 DMS가 삽입된 절편들(2주 후 0.73 MPa, 4주 후 0.89 MPa)은 오직 DMS 삽입된 절편들 (2주 후 0.25 MPa, 4주 후 0.17 MPa) 보다 상당히 높은 영률(Young's moduli)을 보여주었다 (도 17).
결론적으로, PDGF 코팅된 스캐폴드는 PDGFRβ 발현을 증가시키고 그리고 내인성 반월상연골 세포들의 결함 영역으로의 그리고 스캐폴드 안으로의 이동을 촉진시켰다. 천연 반월상연골 및 스캐폴드 사이의 공간을 연결하는 새로운 기질이 형성되었고 그리고 이는 생체역학적 특정들의 개선과 관련이 있었다. PDGF 코팅된 스캐폴드는 반월상연골 파열들의 치유에 전환적인 접근법으로 유명해질 것이다.
예시 10
반월상연골 파열들의 통합적인 치유
일 실시예에서, 발명자들은 PDGF가 사람 관절 연골 세포 및 골수 중간엽 줄기 세포(bone marrow mesenchymal stem cells)(MSC)에 강한 화학주성 활성을 보여준다는 것을 이전에 개시하였다. Y Mishima and M Lotz, J Orthop Res. 2008 Oct; 26(10):1407-12, 그 전체 개시는 여기에서 통합하여 참조된다. PDGF가 반월의 세포 활성에 인핸서(enhancer)로 잘 알려져 있음에도 불구하고, 이것의 스캐폴드로의 결합은 손상된 반월상연골의 복원을 시작하기 위해 세포들을 모집하는데 필수적이어야만 한다. 본 개시는 반월상연골 파열들에 대한 치료적 접근을 위한 탈세포화된 반월상연골 시트에 관한 것이다. 일 실시예에서, 발명자들은 외인성 세포 이동에 의한 통합적인 치유를 매개하는 PDGF-코팅된 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드의 가능성을 시험하였다.
신선한 보바인 반월상연골은 화학적으로 탈세포화되었다. 둥근 시트들은 탈세포화된 조직들로부터 제조되었다. 헤파린은 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드 (DMS)와 공유적으로 결합되었다. PDGF-BB는 헤파린 결합된 DMS에의 묶임 의해 고정화되었다. 체외에서 진행되는 PDGF 방출 역학은 ELISA에 의해 분석되었다. DMS는 손상된 반월상연골 절편들 안으로 이식되었고 그리고 2 및 4주 동안 배양되었다. DMS 및 손상된 절편 사이의 경계에서 이동한 세포들의 수들은 DAPI 염색된 섹션들에서 계수되었고 그리고 PDGFRβ 발현 세포들은 면역조직화학적(immunohistochemical) 염색 후에 계수되었다. 새롭게 생성된 ECM 및 콜라겐 섬유 정렬은 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색된 섹션들에서 검출되었다. 절편들은 또한 인장 특성들을 위해 테스트되었다.
PDGF 방출 역학은 헤파린이 없는 DMS로부터의 26.1 % 방출과 비교하여 16-일 째에 11.2 % 방출과 함께, 헤파린 접합된 DMS에서 지속적인 느린 방출을 보여주었다. PDGF 처리된 DMS의 반월상연골 파열들 안으로의 삽입은 보바인 반월상연골 세포들의 결함 영역으로의 이동을 이끈다 (도 18 A-D). 이동한 세포들은 결함 영역에서 새로운 ECM을 생성하였다. 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색은 DMS 및 손상된 절편들 사이의 조직 통합을 보여주었다. 또한, 더 높은 농도의 PDGF는 DMS 안으로의 세포 통합을 촉진시켰다 (도 18E). PDGF 코팅된 DMS 처리된 손상된 절편들의 인장 특성들은 PDGF 없는 DMS 보다 상당히 높았다 (도 18F).
헤파린 접합된 DMS는 천천히 방출되는, PDGF의 강력한 고정화를 보여주었다. PDGF 코팅된 DMS는 내인성 반월상연골 세포들의 결함 영역으로 및 스캐폴드 안으로의 이동을 촉진시켰다. 천연 반월상연골과 스캐폴드 사이의 공간을 연결하는 새로운 기질이 형성되었고 그리고 이것은 개선된 생체역학적 특성들과 관련이 있었다. PDGF 코팅된 DMS는 반월상연골 파열들의 치유를 위한 유망한 접근법이다. 요약하면, 이 결과들은 반월상연골 파열들의 치료를 위한 신규하고, 실현 가능하고 그리고 효율적인 접근법을 제공한다.
예시 11
세포 이동 및 ECM 형성
결함 영역이 봉합되었지만 그러나 4주까지 DMS의 삽입 없는 손상된 반월상연골 절편들의 배양은 어떤 세포 이동 또는 결함 영역의 섬유 연결성(fibrous connectivity)을 보여주지 않았다 (도 16). 헤파린 또는 PDGF와 결합되지 않은 삽입 DMS는 비록 DMS가 결함 영역으로 채워졌지만 결함 영역으로의 세포 이동을 보여주지 않았다.
PDGF 처리된 DMS의 반월상연골 파열들 안으로의 삽입은 결함 영역으로의 보바인 반월상연골 세포들의 이동을 이끌었다 (도 16). 반월상연골 조직 및 삽입된 DMS 사이의 경계에서 세포들의 정렬이 있었다. 대부분의 모집된 세포들은 결함 공간에 있었지만 그러나 일부 세포들은 DMS의 외부 표면으로 이동했다. DAPI 염색된 섹션들의 세포 계수는 PDGF 결합된 DMS (58.90 ± 3.051 %)가 PDGF와 결합되지 않은 DMS (32.25 ± 2.754 %)보다 결함 영역에 상당히 높은 세포 밀도를 유도함을 밝혀냈다.
동일한 반월상연골 절편들로부터의 섹션들은 PDGFRβ 항체로 또한 염색되었다. 결과들은 PDGF 코팅된 DMS가 절편들에 걸쳐 PDGFRβ 양성 세포들의 수의 상당한 증가를 유도함을 보여주었다 (도 8). 200ng/ml의 PDGF 결합된 DMS (92.32 ± 2.536 %)는 오직 DMS 삽입된 그룹 (49.61 ± 5.967 %), 및 오직 결함이 있는 반월상연골 그룹 (21.53±7.267%) 보다 결함 영역의 이동한 세포들 중 항-PDGFRβ의 양성 세포들이 상당히 높았다. PDGF 코팅된 DMS의 이 생물학적 활성은 배양된 절편들로부터 분리된 RNA의 PCR에 의해 확인되었다.
손상된 반월상연골 절편들의 ECM 형성은 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색에 의해 연구되었다. 사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색은 DMS 및 손상된 절편들 사이의 조직 통합을 보여주었다. 또한, 더 높은 농도의 PDGF는 DMS로의 세포 통합을 촉진시켰다.
손상된 반월상연골 절편들의 기계적 특징들 또한 연구되었다. 인장 특성은 2 및 4주 후에 오직 DMS 삽입된 절편들 및 200ng/ml의 PDGF 결합된 DMS 삽입된 절편들 사이에 비교되었다. 각 시점에서 PDGF 결합된 DMS가 삽입된 절편 (2주 후 0.73 MPa, 4주 후 0.89 MPa)은 오직 DMS 삽입된 절편 (2주 후 0.25 MPa, 4주 후 0.17 MPa) 보다 상당히 높았다.
일 실시예에서, 헤파린 결합된 DMS와의 PDGF-BB 묶임은 무혈관 구역에서 PRGFRβ 발현을 증가시켰다. 이 증가는 반월상연골 결함에서 PDGF-BB 묶임 DMS에 가까운 세포 이동을 만들었다. 　 PDGF/PDGFR 신호 연구는 내피(endothelial) 전구 세포들, 또는 중간엽 줄기 세포에서의 상호작용을 보여주었다. 체외에서 진행되는 무혈관 영역에서 대단히 중요한, PDGF-BB에 대한 반응에서 국소 변이에 관한 제한이 역시 있었다. 이것은 PDGF-BB 고정된 DMS가 PDGFRβ 발현의 증가를 유도할 수 있고 그리고 천연 조직의 반월의 결함 영역 근처의 세포 이동 및 증식을 이끄는 최초의 연구이다. 일 실시예에서, PDGF-BB 처리 후 초기 시점에서, VEGFA 발현이 증가되었다.
일 실시예에서, 여기에 개시된 데이터들 및 결과들은 헤파린 결합된 DMS가 천천히 방출된, PDGF의 강력한 고정화를 보였다는 것을 보여준다. PDGF 코팅된 DMS는 내인성 반월상연골 세포들의 결함 영역으로 그리고 스캐폴드 안으로의 이동을 촉진시켰다. 천연 반월상연골과 스캐폴드 사이의 공간을 연결하는 새로운 기질이 형성되었고 그리고 이것은 개선된 생체역학적 특성들과 관련이 있었다. PDGF 코팅된 DMS는 반월상연골 파열들의 치유를 위한 새로운 그리고 유망한 접근법이다.
예시 12
DMS-삽입된 반월상연골 파열들의 세포 이동 및 ECM 형성
결함 영역이 봉합되었지만 그러나 2주까지 DMS의 삽입 없는 손상된 반월상연골 절편들의 배양은 어떤 세포 이동 또는 결함 영역의 섬유 연결성을 보여주지 않았다 (도 15b). 헤파린 또는 PDGF와 결합되지 않은 DMS의 삽입은 결함 영역이 비록 DMS로 채워졌지만 결함 영역으로의 세포 이동을 보여주지 않았다 (도 15c).
반월상연골 파열들 안으로 PDGF-BB-결합된 DMS의 삽입은 반월상연골 세포들의 결함 영역으로의 이동을 이끌었다 (도 15d). 반월상연골 조직과 삽입된 DMS 사이의 경계에서 세포들의 정렬이 있었다. 대부분의 모집된 세포들은 결함 공간에 있었지만 그러나 몇몇의 세포들은 DMS의 외부 표면으로 이동했다.
DAPI 염색된 섹션들의 세포 계수는 PDGF-BB-결합된 DMS (58.90 ± 3.051 %)가 PDGF와 결합되지 않은 DMS (32.25 ± 2.754 %)보다 결함 영역에 상당히 높은 세포 밀도를 유도함을 밝혀냈다.
동일한 반월상연골 절편들로부터의 섹션들은 PDGFRβ 항체로 또한 염색되었다. PDGFRβ 발현은 사람 반월상연골의 혈관 영역의 대부분의 세포들에서 관찰되었다. 그러나 외인성 PDGF-BB는 무혈관 영역에서 PDGFRβ을 유도하였다. 또한, 외인성 PDGFRβ 유전자 발현은 무혈관 영역의 PDGF-BB 처리에 의해 증가되었다. 배양된 보바인 반월상연골에서, PDGF-BB-코팅된 DMS는 절편들에 걸쳐 PDGFRβ 양성 세포들의 수의 상당한 증가를 유도하였다 (도 15d). PDGF-BB-결합된 DMS (92.32 ± 2.536 %)는 DMS 삽입된 그룹 (49.61 ± 5.967 %), 및 DMS 없이 봉합된 반월상연골 그룹 (21.53±7.267%) 보다 결함 영역의 이동한 세포들 중 PDGFR-양성 세포들의 상당히 많은 수들을 유도하였다.
예시 13
손상된 반월상연골 절편들에서의 ECM 형성
사프라닌-O 및 피크로시리우스 레드 염색은 DMS 및 손상된 절편들 사이의 조직 통합을 보여주었다 (도 24a-l). 2주 (34.491±1.55%) 및 4주-배양 (46.88±1.673%) 후 PDGF-BB-결합된 DMS 그룹에서의 이미지 분석에 의해 평가된 사프라닌-O 양성 영역은 2주 (2.69±0.75%) 및 4주-배양 (0.33±0.31%) 후 DMS 그룹에서 보다 상당히 높았다 (도 24m). 2주 (68.1±5.78%) 및 4주-배양 (68.45±3.71%) 후 PDGF-BB-결합된 DMS 그룹의 삽입된 DMS와 손상된 보바인 반월상연골 절편 사이의 상호연결성 영역은 2주 (2.31±2.31%) 및 4주-배양 (38.7±6.98%) 후 DMS 그룹에서 보다 상당히 높았다 (도 24n).
예시 14
성장 인자 결합된 스캐폴드
여기에 개시된 다양한 실시예들에서, 본 개시는 반월상연골 파열들의 복원을 촉진하는 외인성 세포들을 모집하기 위해 임상(clinic)에 쉽게 적용될 수 있는 성장 인자-결합된 스캐폴드를 제공한다. 일 실시예에서, DMS는 생체적합성 물질이고 그리고 임상적 용도로 쉽게 제조될 수 있기 때문에 스캐폴드로서 선택되었다.
콜라겐, 젤라틴, 탈회골기질(demineralized bone matrix), 및 합성고분자(synthetic polymer)와 같은 천연 고분자들을 포함하는 성장 인자-결합된 스캐폴드에 관한 선행 연구들은 세포 모집 및 조직 복원을 위한 성장 인자 고정화의 실현 가능성을 보여주었다. 임상 적용에서의 반월상연골 복원을 위한 스캐폴드들은 내인성 세포 모집을 촉진할 뿐만 아니라 무릎 관절의 부러짐(shear) 및 압축 응력(compressive stresses)을 막기(resist) 위한 기계적 특성들 또한 필요로 한다.
DMS는 사람 반월상연골과 유사한 기계적 특성을 갖는, 스캐폴드로서 사용되었으나 그러나 반월상연골에서의 내인성 세포 모집을 위한 성장 인자 고정된 DMS에 관한 연구는 없다. 탈세포화 동안 밀집된 보바인 반월상연골은 후속 세포 침윤을 촉진하기 위해 단백질 분해 효소(proteolytic enzyme) 처리에 의해 변형되었다.
PDGF-결합된 DMS는 무혈관 영역의 세포들에서 증가된 PRGFRβ 발현에 의해 입증된 바와 같이 반월상연골 절편들 안으로의 삽입 후 생물학적으로 활성화되었다. 이것은 반월상연골 결함에서 PDGF-BB-결합된 DMS로의 세포 이동과 관련이 있었다. 이전 연구들은 PDGF/PDGFR 신호가 내피 전구 세포들, 또는 중간엽 줄기 세포에서의 표현형 정의 및 기능 조절에 관여함을 보여주었다. PDGFβ 수용체 양성 세포들은 줄기/전구 집단들을 포함하거나 또는 나타내는 것으로 보고되었고 그리고 현재 결과들은 이 반월상연골에서의 세포 집단들이 PDGF에 의해 모집 및/또는 활성화됨을 나타낸다. 다능성(multipotent) 반월상연골 전구 세포들은 건강한 반월상연골보다 OA 또는 병든 반월상연골에서 보다 유주성(migratory)이다.
본 개시는 PDGF-BB에 의해 고정된 DMS가 반월의 결함 안으로의 세포 이동을 자극한다는 것을 최초로 보여준 것으로 여겨진다. 모집된 세포들은 또한 새로운 세포외 기질을 생성하고 그리고 새롭게 방출된 ECM과 함께 PDGF 코팅된 DMS와 결함 영역 사이의 상호연결성을 증가시켰다. PDGF는 화학주성일 뿐만 아니라 GAG 및 콜라겐들과 같은 섬유연골 기질 성분들의 합성을 또한 향상시킨다. 새로운 ECM에 의해 향상된 상호연결성은 초기 인장 영률과 같은 생체역학적 특성을 증가시켰다.
PDGF-BB 처리 후 초기 시점들에서, PDGFRβ 및 VEGFA 유전자 발현들은 무혈관 반월상연골 조직 및 세포들에서 증가되었다 (도 6 및 7). VEGF-매개 신생혈관증식(neovascularization)은 손상된 조직들의 치유에 필수적이다. 배양된 반월의 세포들에서, 혈관 반월의 세포들의 VEGF는 무혈관 반월의 세포들보다 높았다. 또한, VEGF는 반월상연골의 손상된 영역들 주변에서 주로 검출되었다. PDGF-BB 처리에 의한 무혈관 세포들에서의 VEGF 발현은 무혈관 영역에서의 반월상연골 치유 과정을 조절할 수 있다.
막들(membranes)의 실험적인 반월상연골 발열들 안으로의 삽입에 관한 연구들이 보고되었다. 콜라게나아제-방출 나노 섬유질(nanofibrous) 스캐폴드의 삽입은 밀집된 반월상연골 절편을 느슨하게 하여 세포 침윤의 향상을 보여주었다. 그러나, 초기 시점에는 스캐폴드에 의해 차지 되는 가장자리에는 통합이 없었다. 멀티 라미네이티드(laminated)-콜라겐의 생체재료는 숙주 반월의 요소들과 함께 세포 재증식에 대해 전도성(conductive)이 있었으나 그러나 연구들은 충분한 기계적 특성들을 나타낼 필요가 있다.
예시 15
배향에 의한 DMS 최적화
도 25에 도시된 바와 같이, 일 실시예에서, DMS 최적화는 DMS의 콜라겐 섬유 배향을 반월상연골 결함에서 콜라겐 배향과 함께 정렬하기 위해 수행되었다. 보바인 반월상연골은 혈관 (도 25c, 25d) 및 무혈관 (도 25a, 25d) 영역들로부터 분리되었다. 6-mm 표준 바늘을 사용하여, 원통형의 조직 조각들은 수직 방향 (도 25a, 도 25c) 또는 수평 방향 (도 25b,25d)으로 수집되었다. 그리고, 1-mm 두께의 디스크-형태의 스캐폴드는 각 조각으로부터 슬라이스 되었고 그리고 탈세포화되었다. DMS 준비 후, 미세한 구조는 수직 및 수평 섹션들 사이의 상당히 다른 형태를 보여주었다. 수평으로 뚫린 조직 조각들은 더 나은 세포 이동 및 침윤을 위한 이너-섬유 네트워크를 보여주었다.
예시 16
추가적인 구멍들을 생성하여 DMS 최적화
도 26에 도시된 바와 같이, 세포 이동 및 침윤을 촉진하기 위해 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드의 밀집된 콜라겐 기질에서 구멍들을 생성하기 위해 DMS의 추가적인 최적화가 수행되었다. DMS 스캐폴드는 밀집된 콜라겐 섬유 네트워크를 포함한다. 세포 이동 및 침윤을 촉진하기 위해, 구멍들은 콜라게나아제 소화, 기계적인 뚫림, 또는 레이저 적용을 사용하여 생성된다. 도 26은 세포 침윤에서의 DMS의 콜라게나아제 소화의 효과를 도시한다. 콜라게나아제의 짧은 처리가 선택되었다 (3-4 시간 동안 2% wt/v). 2M 윤활액 중간엽 줄기 세포들은 각 DMS 6-mm 직경의 디스크에 배양되었고, 이는 뒤이어 DAPI 염색 (10x)되었다. 결과들은 콜라게나아제와 함께 짧은 처리 후 증가된 세포 침윤을 보여주었다 (도 26).
예시 17
PDGF-결합된 DMS는 세포 이동 및 증식을 유도한다
도 27 및 28에 도시된 바와 같이, PDGF-결합된 DMS는 세포 이동 및 증식을 유도한다. PDGF 결합된 DMS는 보바인 반월상연골 절편의 실험적인 결함 안으로 삽입되었다. 2주-생체 외 배양 후, 세포 이동 및 침윤에 대한 면역-형광(immuno-fluorescence)검사가 수행되었다. 양성 액틴(actin) 염색 (레드)는, 라멜리포듐(lamellipodia)을 나타내고 그리고 세포 이동의 방향을 지시한다. KI67 (그린, 도 27) 양성 염색은 증식하는 세포들을 지시한다. 이 결과들은 PDGF 결합된 DMS가 더 많은 세포 이동 및 침윤을 유도한다는 것을 입증한다 (100x 공초점 이미지)
위에 설명된 다양한 방법들 및 기술들은 발명을 수행하기 위한 많은 방식들을 제공한다. 물론, 설명된 모든 목적들 또는 장점들이 여기에 설명된 어떤 특정 실시예에 따라 필수적으로 달성될 필요는 없음이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 그 분야의 기술자들은 여기에 교시되거나 또는 제안된 다른 목적들 또는 장점들을 달성하기 위해 필수적이지 않고 일 장점 또는 장점들의 그룹을 달성하거나 또는 활용하는 면에서 방법들이 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 유리하고 그리고 불리한 대안들이 여기에 언급되어 있다. 일부 바람직한 실시예들은 구체적으로 하나, 다른 또는 여러 유리한 특징들을 포함하고, 구체적으로 다른 것들은 하나, 다른 또는 여러 불리한 특징들을 배제하고, 여전히 다른 것들은 구체적으로 하나, 다른 또는 여러 유리한 특징들을 포함하여 본 불리한 특징을 완화시킨다.
더욱이, 숙련된 기술자는 다른 실시예들로부터 다양한 특징들의 적용가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 위에서 논의된 다양한 요소들, 특징들 및 단계들은, 각 이러한 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 알려진 동등물들 또한, 여기서 설명된 원리들에 따라 방법들을 수행하기 위해 이 분야의 통상의 기술자 중 하나에 의해 혼합 및 매칭될 수 있다. 다양한 요소들, 특징들 및 스텝들 중, 다양한 실시예들에서 일부는 구체적으로 포함되고 그리고 다른 것들은 구체적으로 제외될 것이다.
비록 발명이 특정 실시예들 및 예시들의 맥락에서 개시되었지만, 이것은 본 기술분야의 기술자들에게 발명의 실시예들이 구체적으로 개시된 실시예를 넘어 다른 대안적인 실시예들로 및/또는 사용들 및 변형들 및 이의 동등물로 확장되는 것으로 이해될 것이다.
많은 변형들 및 대안 요소들이 본 발명의 실시예들에 개시되어 있다. 여전히 추가적인 변형들 및 대안 요소들이 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 이 변형들 중, 제한 없이, 독창적인 구성들을 위한 구성 모듈들의 선택이 있고 그리고 진단되고, 예측되고 또는 치료될 수 있는 질병 및 다른 임상 상태들이 그것과 함께 있다. 발명의 다양한 실시예들은 이들의 변형들 또는 요소들 중 어떤 것을 구체적으로 포함하거나 또는 제외할 수 있다.
몇몇의 실시예들에서, 발명의 특정 실시예들을 설명하고 그리고 청구하기 위해 사용되는 농도, 반응 조건, 등과 같은, 성분들의 양들, 특성들을 나타내는 숫자들은 몇몇의 경우들에서 “약(about)”이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 그래서, 몇몇의 실시예들에서, 기재된 설명 및 첨부된 청구범위들에 제시된 수치 파라미터들은 특정 실시예에 의해 획득될 것으로 생각되는 원하는 특징들에 따라 달라지는 근사치들이다. 몇몇의 실시예들에서, 수치 파라미터들은 보고된 유효 숫자들의 수에 비추어 그리고 일반적인 반올림 기술들을 적용하여 해석되어야 한다. 발명의 몇몇의 실시예들의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위들 및 파라미터들은 근사치들임에도 불구하고, 구체적인 예시들에 제시된 수치 값들은 실행 가능한 한 정확하게 보고되었다. 발명의 일부 실시예들에 제시된 수치 값들은 각각의 테스팅 측정들에서 발생되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인되는 특정 오차들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에서, 발명 (특히 그 다음의 청구범위들의 특정 맥락에서)의 특정 실시예를 설명하기 위한 맥락에 사용된 용어 “일(a),” “일(an),” “상기(the)” 및 유사한 언급들은 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 여기에 설명된 값들의 범위들은 단지 범위 내에 포함되는 각 개별 값을 개별적으로 참조하는 방법의 약칭의 역할을 하기 위한 것으로 의도되었다. 여기서 다르게 지시되지 않는 한, 각 개별적인 값은 여기에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 여기에 설명된 모든 방법들은 여기에 다르게 지시되거나 또는 맥락에 의해 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 여기의 특정 실시예들과 관련하여 제공된 임의의 또는 모든 예시들, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, “와 같은(such as)”)의 사용은 단지 발명을 더 명확하게 하기 위한 것이고 그리고 다르게 청구되지 않는 한 발명의 범위에 제한을 두는 것이 아니다. 명세서의 어떠한 언어도 발명의 실시예 필수적인 임의의 청구되지-않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
여기 발명에 개시된 대안적인 요소들 또는 실시예들의 그룹핑들은 제한으로서 해석되지 않는다. 각 그룹 멤버는 개별적으로 또는 그룹의 다른 멤버들 또는 여기에서 발견된 다른 요소들과 임의의 조합으로 언급되고 그리고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버들은 편의성 및/또는 특허성의 이유들로 그룹에 포함되고, 또는 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 발생할 때, 명세서는 변형된 그룹을 포함하는 것으로 여기에 간주되고 따라서 첨부된 청구항들에 사용된 모든 마쿠쉬 그룹들의 쓰여진 설명들을 충족한다.
발명을 수행하기 위해 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함하여, 본 발명의 바람직한 실시예들이 여기에 설명된다. 바람직한 실시예들에 대한 변형들은 앞서 말한 설명을 읽으면 본 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백해질 것이다. 숙련된 기술자들은 이러한 변형들을 적용할 수 있고, 그리고 본 발명은 여기에 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시될 수 있는 것으로 고려된다. 그래서, 본 발명의 많은 실시예들은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 것과 같이 여기에 첨부된 청구범위에 인용된 대상 문제의 모든 변형들 및 동등물들을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변형들에서 위에-설명된 요소들의 임의의 조합은 여기에 다르게 지시되거나 또는 맥락에 의해 명백하게 모순되지 않는 한 본 발명에 의해 포함된다.
더욱이, 본 명세서에 걸쳐 특허들 및 인쇄된 간행물에 대한 수많은 참조들이 이루어졌다. 상기 인용된 참조들 및 인쇄된 간행물들 각각은 그 전문이 여기에 참조에 의해 개별적으로 통합된다.
끝으로, 여기에 개시된 발명의 실시예들은 본 발명의 원리들을 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형들은 발명의 범위 내에 있을 수 있다. 그리고, 예시의 방식으로, 그러나 제한은 아닌, 본 발명의 대안적인 구성들은 여기에서 교시되는 것에 따라 활용될 수 있다. 그래서, 본 발명의 실시예들은 도시되고 그리고 설명된 것과 같이 정확하게 제한되지 않는다.

Claims (70)

  1. 스캐폴드로서,
    탈세포화된 반월상연골(meniscus) 조직을 포함하고,
    상기 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합되는,
    스캐폴드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1을 포함하는 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된,
    스캐폴드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)인,
    스캐폴드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB 또는 PDGF-AB 중 적어도 하나인,
    스캐폴드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 줄기 세포들을 더 포함하는,
    스캐폴드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 반월상연골 세포들을 더 포함하는,
    스캐폴드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 콜라겐 섬유들을 포함하고, 그리고 상기 콜라겐 섬유 배향(orientation)은 반월상연골 결함과 매치(matched)되는,
    스캐폴드.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 구멍들(pores)을 포함하는,
    스캐폴드.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 구멍들은 콜라게나아제(collagenase) 소화, 기계적인 뚫림, 또는 레이저 적용 중 적어도 하나에 의해 상기 탈세포화된 반월상연골 조직에 생성되는,
    스캐폴드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    스캐폴드.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 20일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    스캐폴드.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    스캐폴드.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 강도는, 상기 헤파린 및 상기 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 큰,
    스캐폴드.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 강도는, 상기 헤파린 및 상기 성장 인자와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 큰,
    스캐폴드.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 큰,
    스캐폴드.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 상기 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된,
    스캐폴드.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 시트 형태인,
    스캐폴드.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 삼 차원 형태인,
    스캐폴드.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 의료용 드레싱에 있는,
    스캐폴드.
  20. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 포유동물로부터 비롯된,
    스캐폴드.
  21. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 조직은 사람으로부터 비롯된,
    스캐폴드.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 멸균 상태에 있고 그리고 멸균 용기에 포장된,
    스캐폴드.
  23. 대상의 조직 손상에서 복원 또는 치료 중 적어도 하나의 방법으로서:
    탈세포화된 반월상연골(meniscus) 조직을 포함하는 스캐폴드를 제공하는 단계; 및
    파열 위에 상기 스캐폴드를 이식(implanting)하여 상기 조직 손상을 복원 또는 치료 중 적어도 하나를 하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 스캐폴드는 헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된,
    방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 조직 손상은 상기 조직의 파열인,
    방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 조직은 반월상연골 조직인,
    방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1을 포함하는 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된,
    방법.
  27. 제 23 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)인,
    방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB 또는 PDGF-AB 중 적어도 하나인,
    방법.
  29. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 상기 반월상연골 조직의 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집하는,
    방법.
  30. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 효과적인 세포 침윤(infiltration) 및 숙주 세포들로부터 상기 스캐폴드로의 이동에 최적화된,
    방법.
  31. 제 23 항에 있어서,
    무세포성 스캐폴드는 관절경(arthroscopic) 수술에 의해 상기 반월상연골 파열 위에 이식되는,
    방법.
  32. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 10일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    방법.
  33. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 20일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    방법.
  34. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 투여 후 적어도 30일의 기간 동안 1차 역학으로 상기 성장 인자를 방출하는,
    방법.
  35. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 강도는, 상기 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 두배 더 큰,
    방법.
  36. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 강도는, 상기 헤파린 및 PDGF와 공유 결합이 없이, 유사한 탈세포화된 반월상연골 조직의 인장 강도에 비해 적어도 세배 더 큰,
    방법.
  37. 제 23 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 인장 탄성률은 0.6 영률(MPa)보다 큰,
    방법.
  38. 제 23 항에 있어서,
    PDGF는 상기 스캐폴드의 10 ng/mL 내지 1 mg/mL 사이로 구성된,
    방법.
  39. 제 23 항에 있어서,
    상기 조직의 상기 파열의 복원 또는 치료 중 적어도 하나의 방법은 이차 치료 요법을 더 포함하는,
    방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 이차 치료 요법은 휴식, 얼음, 압박, 증가(elevation) 또는 물리 치료 중 적어도 하나를 포함하는 비-수술적 치료를 포함하는,
    방법.
  41. 제 39 항에 있어서,
    상기 이차 치료 요법은 수술적 복원, 부분 반월상연골절제술(meniscectomy) 또는 완전 반월상연골절제술 중 적어도 하나를 포함하는 수술적 치료를 포함하는,
    방법.
  42. 제 23 항에 있어서,
    상기 대상은 포유동물인,
    방법.
  43. 제 23 항에 있어서,
    상기 대상은 사람인,
    방법.
  44. 키트로서:
    헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 스캐폴드를 포함하는 멸균 용기; 및
    상기 키트를 사용하기 위한 지침;
    을 포함하는,
    키트.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1을 포함하는 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된,
    키트.
  46. 제 44 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)인,
    키트.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB 또는 PDGF-AB 중 적어도 하나인,
    키트.
  48. 제 44 항에 있어서,
    상기 키트는 상기 스캐폴드를 손상된 반월상연골 안으로 전달하기 위한 수단을 더 포함하는,
    키트.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 전달하기 위한 수단은 의료용 글루(glue), 의료용 봉합사들(sutures), 의료용 스테이플스(staples), 또는 의료용 앵커들 중 적어도 하나인,
    키트.
  50. 제 44 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드인,
    키트.
  51. 제 44 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된,
    키트.
  52. 제 44 항에 있어서,
    무세포성 스캐폴드는 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집하는,
    키트.
  53. 제 44 항에 있어서,
    상기 헤파린 결합은 상기 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 하는,
    키트.
  54. 제 53 항에 있어서,
    상기 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어나는,
    키트.
  55. 장치로서:
    헤파린 및 성장 인자와 공유적으로 결합된 무세포성 스캐폴드를 포함하고,
    상기 장치는 조직들의 복원을 위한,
    장치.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 베타), VEGF(혈관 내피 성장 인자), CTGF(결합 조직 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), 및 CCL20, CXCL3, CXCL6, CCL3, CCL3L1을 포함하는 다른 케모카인(chemokine)들로 구성된 그룹에서 선택된,
    장치.
  57. 제 55 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)인,
    장치.
  58. 제 55 항에 있어서,
    상기 무세포성 스캐폴드는 생물학적 무세포성 스캐폴드인,
    장치.
  59. 제 55 항에 있어서,
    상기 무세포성 스캐폴드는 탈세포화된 천연 반월상연골 조직으로부터 유래된,
    장치.
  60. 제 55 항에 있어서,
    상기 무세포성 스캐폴드는 천연 반월상연골과 비교하여 유사한 생물학적 및 기계적 특징을 가지는,
    장치.
  61. 제 55 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 무혈관 영역에 복원이 개시되도록 새로운 세포들의 집단을 모집하는,
    장치.
  62. 제 55 항에 있어서,
    상기 무세포성 스캐폴드는 효과적인 세포 침윤(infiltration) 및 숙주 세포들로부터 상기 스캐폴드로의 이동에 최적화된,
    장치.
  63. 제 55 항에 있어서,
    상기 장치는 상기 성장 인자의 느린 방출을 가능하게 하는,
    장치.
  64. 제 55 항에 있어서,
    상기 느린 방출은 30일까지의 기간 동안 일어나는,
    장치.
  65. 세포 이동을 유도하는 방법으로서:
    하나 이상의 성장 인자들의 상기 고정화를 위해 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드를 제공하는 단계; 및
    상기 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드로 세포 이동을 유도하는 단계;
    를 포함하는,
    방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 성장 인자들은 PDGF인,
    방법.
  67. 제 65 항에 있어서,
    헤파린은 고정화를 위해 사용되는,
    방법.
  68. 제 65 항에 있어서,
    상기 탈세포화된 반월상연골 스캐폴드는 대상에 직접 이식되는,
    방법.
  69. 제 65 항에 있어서,
    대상은 포유동물인,
    방법.
  70. 제 65 항에 있어서,
    대상은 사람인,
    방법.
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