KR20190125102A - 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지질 생성을 억제하고, 지방 분해 촉진 활성을 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체와 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating obesity comprising isotretinoin-peptide conjugate as an effective ingredient}
본 발명은 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
비만은 음식물로 섭취한 에너지가 에너지 소비와 균형을 이루지 못하는 경우, 잉여의 에너지가 체지방으로 축적됨으로써 체내에 지방 조직이 과다하게 존재하는 상태를 의미한다. 비만이 오랜 시간 지속되는 경우, 당뇨병, 고지혈증, 심장병 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발될 수 있다. 이러한 비만은 약물요법과 운동요법, 정신요법 등을 병행하여 치료될 수 있다. 하지만, 현재 약물요법에서 사용되는 약물은 두통, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용뿐만 아니라, 심혈관계에도 심각한 부작용을 유발하는 문제점이 존재한다.
한편, 이소트레티노인(isotretinoin, 13-cis-retinoic acid)은 체내에서 매우 적은 양으로 발견되는 레티노이드계 화합물이다. 상기 이소트레티노인은 여드름, 암 또는 피부질환의 치료를 위해 사용될 수 있고, 특히 피지 분비나, 면포 및 모공의 과다각화증을 억제하며, 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해 항균 효과를 나타내어 결정낭성 여드름의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 이소트레티노인은 편평세포암종과 같은 특정 피부암이나, 할리퀸 어린선, 층판비늘증 등과 같은 피부 질환의 치료제로도 사용될 수 있다.
상기 이소트레티노인은 물에 대한 용해도가 매우 낮아 공복 상태에서의 생체이용률이 낮다. 따라서 상기 이소트레티노인의 흡수율을 높이기 위해서는 반드시 음식물과 함께 섭취할 필요가 있다.이에 물에 대한 용해도가 낮은 이소트레티노인을 가용화하기 위해 유기 용매를 첨가하고 있으나, 이는 피부염, 피부건조와 같은 부작용을 유발할 수 있는 한계가 존재한다.
따라서 경구 투여 시에도 생체 내 이용율을 높임과 동시에 부작용을 최소화 할 수 있도록 이소트레티노인의 물리 화학적 성질을 개량할 필요성이 여전히 존재하는 실정이다.
본 발명은 비만이나 비만과 관련된 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유효하게 이용될 수 있는 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러 본 발명의 다른 측면은 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 단독의 이소트레티노인에 비해 물에 대한 용해도가 높아서 공복의 상태에서도 잘 흡수될 수 있을 뿐만 아니라,
생체 내에 흡수되어 지방의 생성을 억제하고 지방의 분해를 촉진하는 활성을 나타내는바, 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 분자량 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 및 도 3은 각각 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 분해 관련 세포신호전달 경로 활성 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 생성 관련 세포신호전달 경로 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 이소트레티노인-펩타이드 결합체로 인해 세포 내 지방 분해가 촉진된 효과를 세포 내 지방 염색을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 이소트레티노인-펩타이드 결합체에 의한 지방세포 내에서 유리 글리세롤 방출 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 및 도 8은 각각 지방조직에서 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 분해 관련 세포신호전달 경로 활성 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 및 도 10은 지방 조직에서 각각 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 생성 관련 세포신호전달 경로 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 및 도 12는 각각 지방조직에서 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 분해 관련 세포신호전달 경로 활성 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 및 도 14는 이소트레티노인-펩타이드 결합체에 의한 지방조직 내에서 유리 글리세롤 방출 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 이소트레티노인-펩타이드 결합체에 의한 지방조직 내에서 지방의 크기를 나타내는 도면이다.
도 16 및 도 17은 각각 지방조직에서 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 지방 분해 관련 세포신호전달 경로 활성 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함한다.
상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 이소트레티노인과 수용성 펩타이드가 화학적으로 결합된 구조를 갖는다.
상기 이소트레티노인은 13-시스-레티노산으로, 하기 화학식 1의 화학 구조를 갖는다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기와 같이 이소트레티노인에 수용성 펩타이드가 결합됨으로써, 물에 대한 용해도가 매우 낮은 이소트레티노인의 물에 대한 용해도를 현저하게 증가시킬 수 있는 효과가 부여될 수 있다.
상기 수용성 펩타이드는, 펩타이드 결합에 의하여 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬(side chain)을 갖는 아미노산이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 수용성 펩타이드의 제작은 본 기술분야에 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 의해 달성될 수 있다(Merrifield R.B., J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-54 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co. Rockford, 111(1984)).
상기 수용성 펩타이드는 2개 내지 30개, 예를 들면 5개 내지 20개, 예를 들면 8개 내지 15개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다. 수용성 펩타이드를 구성하는 아미노산의 개수가 2개 미만인 경우 이소트레티노인의 수용해도를 충분히 높일 수 없고, 수용성 펩타이드를 구성하는 아미노산의 개수가 30개 초과인 경우 이소트레티노인의 흡수율을 저하시킬 수 있는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 수용성 펩타이드는 상기 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산의 비율이 50% 내지 100%, 예를 들면 80% 내지 100%일 수 있고, 상기 수용성 펩타이드는 소수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산의 비율이 0% 내지 50%, 예를 들면 0% 내지 20%일 수 있다. 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 이소트레티노인의 물에 대한 용해도를 충분히 높일 수 없다.
상기 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 시스테인(Cys), 셀레노시스테인(Sec), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 소수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산은 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소루이신(Ile), 루이신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 트립토판(Trp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
특히, 상기 수용성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산은 이소트레티노인 단백질에 결합되어 수용성을 증가시키는데 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들 또는 단편들일 수 있으며, 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 또한 상기 서열번호 1의 아미노산은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 수용성 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 수용성 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 수용성 펩타이드란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 수용성 펩타이드를 의미한다.
상기 수용성 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 부여하기 위하여, 상기 수용성 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있다. 상기 수용성 펩타이드의 화학적 안정성은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 수용성 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방세포 및 지방조직 내에 투여되어 AMPK-α1(Activated protein kinase-α1), ACOX1, CPT1(Carnitine palmitoyltransferase I), HSL(hormone-sensitive lipase), ATGL (Adipose triglyceride lipase) 및 PLIN1(Perilipin 1) 유전자와 상기 유전자들에 의해 암호화되는 단백질을 과발현 시키고, C/EBPa(Ccaat-enhancer-binding protein) 유전자와 상기 유전자들에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 억제 시킨다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 지방세포 및 지방조직 내에 투여된 경우, AMPK-α1, ACOX1, CPT1, HSL, ATGL 및 PLIN1 유전자의 발현을 증가시켰으며, C/EBPa 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 4, 도 9 내지 도 12). 뿐만 아니라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 지방세포 및 지방조직 내에 투여된 경우, AMPK-α1, CPT1 및 ATGL의 단백질의 발현을 증가시켰으며, HSL 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다(도 7, 도 8, 도 16 및 도 17 참고).
따라서 상기와 같은 활성을 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 비만 및 비만 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
상기 비만은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)를 의미한다. 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방 산화 촉진 유전자와 상기 유전자들에 의해 암호화되는 단백질과, 지방 분해 촉진 유전자와 상기 유전자들에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 현저하게 증가시킬 뿐만 아니라, 지방세포 축적에 관여하는 유전자의 발현을 감소시켜, 에너지 불균형을 조절하거나 과다한 체지방을 가진 상태를 벗어나도록 함으로써, 상기 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 비만 관련 질환은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition)로 인하여 유도될 수 있는 질환으로, 비만의 예방 또는 치료를 통해 상기 비만 관련 질환으로부터 발생한 증상을 완화 또는 개선 시킬 수 있다.
상기 비만 관련 질환은 고혈압, 당뇨, 증가된 혈장 인슐린 농도, 인슐린 내성, 고지혈증, 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 비만관련 위식도 역류, 동맥경화증, 과콜레스테롤 혈증, 요산과다혈증, 하부등 통증, 심장비대 및 좌심실 비대, 지방이영양증, 비알콜성 지방간염, 심혈관 질환, 다낭성 난소 증후군 등 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 펩타이드 이소트레티노인 결합체를 지방세포에 투여한 경우, 지방세포의 염색이 감소된 것을 통해 지방세포의 크기가 줄어드는 것을 확인하였고, 이소트레티노인 단독으로 투여한 경우와 비교하여서도, 지방세포의 배양액 내 방출된 유리-글리세롤의 양이 증가된 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참고). 또한 지방세포의 크기 감소 및 유리-글리세롤의 방출량 감소의 효과는 지방조직에서도 동일하게 발휘되는 것을 확인하였다(도 13 내지 도 15 참고).
상기 약학적 조성물은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자 등과 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체에서 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 비만 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 비만을 효과적으로 예방 또는 치료하기 위하여, 운동요법, 정신요법 등과 병행될 수 있다. 이와 같이, 상기 약학적 조성물을 이용한 약물요법과 운동 또는 정신요법을 병행하는 경우 비만의 예방 또는 치료 효과가 극대화 될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg, 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 100 mg 투여할 수 있다.
2. 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품
본 발명의 또 다른 측면은 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 상기 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 상기 "1. 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 " 항목에서 설명한 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하여 비만 및 비만 관련 질환의 예방 또는 개선의 용도로 사용할 수 있고, 이에 대해서는 상기 "1. 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 "항목의 설명을 원용하고, 이하에서는 비만 및 비만 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 비만의 예방 또는 개선은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)이 발생을 사전에 방지하거나, 상기 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)으로부터 발생하는 증상을 완화시키거나 개선시킬 수 있는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 총 조성물 중량에 대하여 15 중량% 이하, 예를 들면 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 포함하는 것 외에 특별한 제한 없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등일 수 있고, 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등일 수 있으며, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당이나 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품은 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으고, 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.
[제조예 1] 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 제조
펩타이트 반응기에 탈보호된 서열번호 1의 펩타이드(1 mmol)와 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣고, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) 270 ㎎(2.0 equiv.), (벤조트리아졸-1-일 옥시)트리피롤리디노 포스트포니움 헥사플르오르포스포네이트(PyBOP) 1.04 g (2.0 equiv.) 및 이소트레티노인 277 ㎎(2.0 equiv.)을 첨가하고 30분간 반응시켰다. 이후, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 388 ㎎(3 equiv.)을 더 첨가하여 상온에서 2 내지 4시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 디에틸에테르 10 ㎖(10 mmol)를 사용하여 재결정시킨 뒤, 여과하여 서열번호 1의 펩타이드와 이소트레티노인이 결합된 결합체(이하, '이소트레티노인-펩타이드 결합체'라 함)를 제조하였다.
서열번호 아미노산 서열
1 Iso-Arg- Arg-Leu-Ile-AspArg-Thr-Asn-Ala-Asn-His-Heu-Val-Glu
[준비예 1] 전-지방세포 배양 및 지방세포로의 분화 유도
전-지방세포인 3T3-L1 세포를 2 X 104 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후, 밤새 배양하였다. 그 뒤, 상기 세포는 분화 성분(10 mg/ml 인슐린, 0.1 μM 덱타메타손 및 0.5 μM IBMX 포함) 및 10 % FBS가 포함되어 있는 DMEM 배지(이하 '분화 배지'라 함)에서 2일동안 배양시켜 지방세포로의 분화를 유도하였다. 그런 다음 상기 분화된 지방세포는 1 mg/ml 인슐린 및 10 % FBS가 포함되어 있는 DMEM 배지(이하, '배양 배지'라 함)에서 배양시켰고, 상기 배양 배지는 2일 간격으로 교체하였다.
[준비예 2] 지방조직(adipose tissue) 채취 및 배양
9주령 BL/6 마우스의 복부에서 지방조직을 채취한 뒤, 100 mm X 15 mm 배양 접시에 넣고, 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 상기 지방조직은 동일한 중량을 가지도록 분할 하여 24-웰 플레이트에 옮긴 뒤, 이하 실험예에서 사용하였다.
[실험예 1] 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 물성 확인
[1-1] 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 분자량 분석
상기 제조예 1에서 제조된 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 구조에 대해 확인하기 위해 3200 QTRAP LC/MS/MS 시스템(Applied Biosystems, Forster, CA, 미국)을 이용하여, 분자량을 측정하는 실험을 수행하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 약 1989.3 Da 정도의 분자량을 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체가 합성되었음을 알 수 있다.
[1-2] 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 용해도 분석
상기 제조예 1에서 제조된 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 용해도를 확인하기 위해 옥탄올 물 분배 계수 (logPOW) 값을 측정하였다.
상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 농도별로 수포화 옥탄올에 완전히 용해시켜 시료 용액을 준비하였다. 상기 시료 용액에 수포화 옥탄올 및 옥탄올 포화수를 가한 뒤, 상온을 유지하면서 진탕하였다. 그 뒤, 충분히 혼합된 상기 용액이 옥탄올 층과 수층으로 분리될 수 있도록 원심분리하였다. 그런 다음, 피펫을 사용하여 옥탄올 층의 중앙에서 옥탄올을 채취하고, 주사기를 사용하여 수층에서 물을 채취하였다. 옥탄올층 및 수층에서 각각 채취된 시료의 농도를 정량하고, 아래의 식을 통해 logPOW 값을 계산하였다.
logPOW = log CO/CW
(여기서, C0는 옥탄올에서 채취된 이소트레티노인 펩타이드 결합체의 농도이고, CW는 수층에서 채취된 이소트레티노인 펩타이드 결합체의 농도이다.)
그 결과, 이소트레티노의 옥탄올 물 분배 계수는 4.2인 반면, 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 옥탄올 물 분배 계수는 -2.17이었다.
상기 결과를 통해 본 발명의 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 이소트레티노인에 수용성 펩타이드가 결합됨으로써, 이소트레티노인이 단독으로 존재하는 경우에 비하여 수용해도가 향상됨을 알 수 있다.
[실험예 2] 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로 활성 효과 확인
지방세포에서, 상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로의 활성 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위하여, 지방산 산화(Fatty acid oxidation) 촉진 및 지방 분해 촉진과 관련된 유전자의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 준비예 1에서 분화된 지방세포에 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 50 μM 및 100 μM의 농도로 투여한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로는 TNFα를 사용하였다. 상기 배양된 지방세포의 전체 RNA(Total RNA)는 Qiagen RNeasy kit를 이용해 추출하였다. 추출된 전체 RNA는 cDNA로의 합성을 위하여, 3 ㎍ RNA와 2 ㎍ 랜덤 헥사머(Random hexamer)를 DEPC가 처리된 물에 넣고 65 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 반응물에는 최종 볼륨이 20 ㎕가 될 수 있도록 5 x 첫번째 스트랜드 버퍼(first strand buffer), 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 및 역전사 효소를 포함시켰다. 그런 다음 42 ℃에서 1시간 동안 반응시키고, 다시 95 ℃에서 5분간 가열한 뒤, 증류수 20 ㎕을 가하는 과정을 통해 최종적으로 40 ㎕의 cDNA를 얻었다.
지방산 산화 촉진 및 지방 분해 유전자의 발현 정도를 확인하기 위해 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한 유전자의 발현 정도를 수치화 하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
유전자 프라이머 서열(5'-> 3') 서열번호
CPT1a 정방향 CGTACCAAGTAGCCAAGGCA 2
역방향 CAGGAACGCACAGTCTCAGT 3
ACOX1 정방향 CCGCCGAGAGATCGAGAAC 4
역방향 CAGTTGCCTGGTGAAGCAAG 5
HSL 정방향 GGACACACACACACCTG 6
역방향 CCCTTTCGCAGCAACTTTAG 7
ATGL 정방향 TCGTGGATGTTGGTGGAGCT 8
역방향 TGTGGCCTCATTCCTCCTA 9
PLIN1 정방향 AAGGATCCTGCACCTCACAC 10
역방향 CCTCTGCTGAAGGGTTATCG 11
AMPKα 정방향 TCACCGGACATAAAGTGGCT 12
역방향 TGATGATGTGAGGGTGCCTG 13
β-actin 정방향 CGTGGGCCGCCCTAGGCA 14
역방향 TTGGCTTAGGGTTCAGGGGG 15
도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 지방산 산화 촉진 관련 유전자에 해당하는 CPT1a 및 ACOX1과, 지방 분해를 촉진하는 유전자인 HSL, ATGL 및 PLIN1은 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 처리하였을 때 발현이 증가하였다.상기 결과를 통해 본 발명에 따른 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방세포 내 축적된 지방을 매우 효과적으로 분해할 수 있도록 지방 분해 또는 지방산 산화 촉진 관련 유전자의 활성을 높이는 것을 알 수 있다.
[실험예 3] 지방 생성 촉진 세포신호전달 경로 활성 효과 확인
이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방 생성을 촉진하는 세포신호전달 경로를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 지방 생성 촉진과 관련된 유전자인 C/EBPa의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
이소트레티노인-펩타이드 결합체의 투여 및 중합효소연쇄반응은 상기 실험예 2와 동일하게 수행하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단, 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.
유전자 프라이머 서열(5'-> 3') 서열번호
C/EBPa 정방향 TCGGTGGACAAGAACAGCAA 16
역방향 CCTTGACCAAGGAGCTCTCA 17
GAPDH 정방향 GGAGCCAAAAGGGTCATCAT 18
역방향 GTGATGGCATGGACTGTGGT 19
도 4에서 보는 바와 같이, 지방세포 내 지방 축적과 관련된 유전자에 해당하는 C/EBPa는 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여하였을 때 발현이 감소하였다.상기 결과를 통해 본 발명에 따른 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방세포 내 지방의 생성을 현저하게 억제하고, 지방의 생성이 억제됨으로써 지방 축적의 감소를 유도함을 알 수 있다.
[실험예 4] 지방세포 내 지방 분해 효과 확인
이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방세포 내에 축적된 지방을 분해하는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 준비예 1에서 9일동안 분화시킨 지방세포에 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 50 μM 및 100 μM의 농도로 투여한 뒤, 24시간 후 하기와 같은 방법으로 오일 레드 O 염색 어세이를 수행하였다.
상기 지방세포를 PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데히드를 10분간 처리하여 고정시켰다. 고정된 세포들는 증류수로 세척한 후 60% 이소프로파놀로 5 내지 10분간 배양되었다. 그 뒤, 상기 배양된 지방세포는 오일 레드 용액[1% Oil Red in isopropanol was diluted in dH2O in ratio of 6:4 (vol/vol)]으로 30분간 염색 시키고, PBS로 세척시켰다. 염색이 완료된 세포들은 광학 현미경으로 관찰한 뒤, 증류수로 다시 한번 세척하고 100% 이소프로파놀을 1 ml 넣고 4 ℃에서 섞어주었다. 다음날 정량화를 위해 510 nm에서 값을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 이소트리티노인 펩타이드 결합체를 투여한 경우 지방세포 내 지방의 염색이 감소되었다.
상기 결과를 통해 융합 단백질은 지방세포 내 축적되어 있던 지방의 분해를 촉진시키고, 지방 생성을 억제시킴으로써 지방세포 내 지방의 감소를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 5] 지방세포 내 지방 분해 활성 효과 확인
지방세포 내에 저장된 중성지방은 에너지 생산 또는 세포신호전달 등을 위하여 지방산과 글리세롤로 분해된다. 따라서 유리 글리세롤 방출양의 측정을 통해 지방세포에 축적된 중성지방의 분해 효과를 평가하였다.
구체적으로, 상기 준비예 1에서 분화된 지방세포의 배양액을 배양 배지로 교체하면서, 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 각각 1 μM 및 10 μM의 농도로 투여하였다. 투여 후 8일째 배양액을 수거한 뒤, 글리세롤 컬러리메트릭 어세이 키트(glycerol colorimetric assay kit, cayman, 미국)를 이용하여 글리세롤 어세이를 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여한 경우, 이소트레티노인-펩타이드 결합체의 투여 농도에 의존적으로 지방세포 내에 축적된 지방의 분해대사산물인 글리세롤이 배양액으로 더 많이 방출되었다.
상기 결과를 통해 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방세포에 축적된 중성지방의 분해를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 6] 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로 활성 효과 확인
상기 이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로의 활성 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위하여, 지방산 산화(Fatty acid oxidation) 촉진 및 지방 분해 촉진과 관련된 단백질의 발현 및 인산화 정도를 확인하였다.
상기 준비예 2의 지방조직에 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 50 μM 및 100 μM의 농도로 투여하고 48시간 동안 배양한 뒤, 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 지방조직은 RIPA 버퍼[12 ㎜ EDTA, 137 ㎜ NaCl, 20 ㎜ Tris-HCl(pH 8.0), 1 ㎜ Na3VO4(Sigma-Aldrich, 미국) 10 ㎜ NaF(Sigma), 1 ㎜ PMSF(Sigma), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제 칵테일(Roche, 독일)]를 이용하여 용해시켰으며, 세포 용해물은 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, CPT1a, ATGL, AMPKα 및 p- HSL 항체를 이용해 웨스턴 블럿을 수행하고, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, CPT1a, ATGL, AMPKα 단백질은 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여하는 경우 농도에 의존적으로 발현이 증가되었고, HSL의 경우에는 단백질의 인산화 정도가 증가되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방조직 내 축적된 지방을 매우 효과적으로 분해할 수 있도록 지방의 분해나 지방산의 산화 촉진과 관련된 단백질의 발현을 증가시키고, 지방 분해와 관련된 단백질의 인산화 정도를 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
[실험예 7] 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로 활성 효과 확인
지방조직에서, 이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방 분해 촉진 세포신호전달 경로의 활성 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위하여, 지방산 산화(Fatty acid oxidation) 촉진 및 지방 분해 촉진과 관련된 유전자의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
상기 실험예 6과 동일한 방식으로 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 지방 조직에 투여하고, 상기 실험예 2와 동일한 방법 전체 RNA 추출 및 중합효소 연쇄 반응을 수행하여, 그 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다.
도 9 및 도 10에서 보는 바와 같이, 지방조직 내에 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여하였을 때 지방산 산화 촉진 관련 유전자인 PGC1a, CPT1 및 ACOX1의 발현이 대조군에 비하여 증가되었다.
또한, 도 11 및 도 12에서 보는 바와 같이, 지방조직 내에 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여하였을 때 지방 분해 촉진 관련 유전자인 HSL, ATGL, PLIN1 및 Leptin과 이와 같은 유전자의 발현을 증가시키는 AMPK1a 유전자의 발현이 대조군에 비하여 증가하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방조직 내에서도 지방을 매우 효과적으로 분해할 수 있도록 지방 분해 또는 지방산 산화 촉진 관련 유전자의 활성을 높이는 것을 알 수 있다.
[실험예 8] 지방조직 내 지방 분해 활성 효과 확인
지방조직에서도 이소트레티노인-펩타이드 결합체에 의해 중성지방의 분해가 유도되는지 여부에 대하여, 유리 글리세롤 방출양을 측정하였다.
상기 상기 준비예 2의 지방조직에 이소트레티노인 단독으로 10 μM의 농도로 투여하고, 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 50 μM 및 100 μM의 농도로 투여하고 48시간 동안 배양한 뒤, 실험예 5와 동일한 방식으로 유리 글리세롤 방출양을 측정하고, 그 결과는 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여한 경우 지방조직 내에 축적된 지방의 분해대사산물인 글리세롤이 배양액으로 더 많이 방출되었다.
또한 도 14에서 보는 바와 같이, 이소트레티노인 단독으로 투여한 경우에 비하여, 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여한 경우 지방조직 내에 축적된 지방의 분해대사산물인 글리세롤이 배양액으로 20% 이상 더 많이 방출되었다.
상기 결과를 통해 이소트레티노인-펩타이드 결합체는 지방조직에 축적된 중성지방의 분해를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 9] 지방조직 내 지방 분해 효과 확인
이소트레티노인-펩타이드 결합체에 따른 지방조직 내 지방 분해 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 8에서 사용된 지방조직에 대해 H&E 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 지방조직을 절단하여 파라핀 슬라이드에 부착하고, 50 ℃ 에서 건조시켰다. 건조된 지방 조직이 부착된 슬라이드를 자일렌 1, 2 및 3에 각각 5분씩 넣고, 파라핀을 제거(de-paraffinize)시켰다. 그 뒤, 100% 에탄올에 2분 동안 넣고, 90%, 80% 및 70% 에탄올에 각각 순차적으로 넣어 재수화(re-hydration) 시켰다. 재수화된 슬라이드는 헤마톡실린 용액(hematoxylin solution)에 넣어 염색한 후, tapping water를 실시하고 에오신 Y(eosin Y)를 이용하여 염색하였다. 그 뒤, 90%, 80% 및 70% 에탄올에 순차적으로 넣어준 후 자일렌 3, 2, 1에 넣은 뒤 자일렌 기반의 마운팅 매체(mounting media)를 통해 마운팅 하는 과정을 수행하였다. 마운팅된 슬라이드는 잘 말린 뒤 광학현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 투여한 지방조직 내 세포의 크기가 현저하게 작아진 것을 확인하였다.
[실험예 10] 지방조직 내 지방 분해 촉진 활성 효과 확인
이소트레티노인-펩타이드 결합체가 지방조직 내에 지방 분해 촉진 활성이 있는지 여부를 면역조직화학(immunohistochemistry)를 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 8에서와 같이 배양된 지방조직을 절단하여 파라핀 슬라이드에 부착하고, 50 ℃ 에서 건조시켰다. 건조된 슬라이드를 자일렌 1, 2 및 3에 각각 5분씩 넣고, 파라핀을 제거(de-paraffinize)시켰다. 그 뒤, 100% 에탄올에 2분 동안 넣은 뒤, 90%, 80% 및 70% 에탄올에 각각 순차적으로 넣어 재수화(re-hydration) 시켰다. 다음으로, TRS 버퍼에 상기 슬라이드를 넣고 마이크로 웨이브 5분을 가한 뒤, 흐르는 물에서 버퍼를 15분간 식혀주었다. 그 뒤, 상기 슬라이드를 넣고 마이크로 웨이브를 3분 가한 뒤, 흐르는 물에서 버퍼를 15분간 식혀주었다. 그런 다음, PBS로 상기 슬라이드를 세척하고 내부의 페록시다아제(endogenous peroxidase)를 비활성화 시키고 세척한 뒤 차단 용액(blocking solution)으로 1시간 동안 차단 후, 1차 항체인 p-HSL 및 ATGL과 밤새 배양시켰다. 시각화를 위하여, 형광이 결합되어 있는 2차 항체와 2시간 동안 배양 및 DAPI와 20분간 배양시키고 마운팅 시킨 뒤 형광 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 16 및 도 17에서 보는 바와 같이, 지방조직 내에서도 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 처리한 경우 HSL의 인산화 정도가 증가하였으며, 지방 분해 촉진 관련 단백질인 ATGL의 발현이 대조군에 비하여 증가하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<110> CAREGEN CO., LTD. <120> A composition for preventing or treating obesity comprising isotretinoin-peptide conjugate as an effective ingredient <130> 2018DPA2596 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn His Leu Val Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1a forward primer <400> 2 cgtaccaagt agccaaggca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1a reverse primer <400> 3 caggaacgca cagtctcagt 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACOX1 forward primer <400> 4 ccgccgagag atcgagaac 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACOX1 reverse primer <400> 5 cagttgcctg gtgaagcaag 20 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL forward primer <400> 6 ggacacacac acacctg 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL reverse primer <400> 7 ccctttcgca gcaactttag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL forward primer <400> 8 tcgtggatgt tggtggagct 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL reverse primer <400> 9 tgtggcctca ttcctccta 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLIN1 forward primer <400> 10 aaggatcctg cacctcacac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLIN1 reverse primer <400> 11 cctctgctga agggttatcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha forward primer <400> 12 tcaccggaca taaagtggct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha reverse primer <400> 13 tgatgatgtg agggtgcctg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 14 cgtgggccgc cctaggca 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 15 ttggcttagg gttcaggggg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa forward primer <400> 16 tcggtggaca agaacagcaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa reverse primer <400> 17 ccttgaccaa ggagctctca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 18 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 19 gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims (11)

  1. 이소트레티노인과 수용성 펩타이드가 화학적으로 결합된 구조를 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 아미노산이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자인 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 8개 내지 30개의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬(side chain)을 가지는 아미노산의 비율이 50% 내지 100% 이고, 및
    상기 수용성 펩타이드는 소수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 가지는 아미노산의 비율이 0% 내지 50%인 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 친수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 가지는 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 시스테인(Cys), 셀레노시스테인(Sec), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 소수성을 나타낼 수 있는 곁사슬을 갖는 아미노산은 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소루이신(Ile), 루이신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 트립토판(Trp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 AMPK-α1(Activated protein kinase -α1), ACOX1, CPT1(Carnitine palmitoyltransferase I), HSL(hormone-sensitive lipase), ATGL (Adipose triglyceride lipase) 및 PLIN1(Perilipin 1) 유전자의 발현을 증가시키고,
    C/EBPa(Ccaat-enhancer-binding protein) 유전자의 발현을 감소시키는 것인 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 AMPK-α1, ACOX1, CPT1, ATGL 및 PLIN1로부터 코팅된 단백질의 발현을 증가시키고,
    HSL(Hormone-Sensitive Lipase)로부터 코딩된 단백질의 인산화를 증가시키는 것인 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 이소트레티노인과 수용성 펩타이드가 화학적으로 결합된 구조를 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 비만 관련 질환은 비만으로 인해 유도된 고혈압, 당뇨, 증가된 혈장 인슐린 농도, 인슐린 내성, 고지혈증, 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 비만관련 위식도 역류, 동맥경화증, 과콜레스테롤 혈증, 요산과다혈증, 하부등 통증, 심장비대 및 좌심실 비대, 지방이영양증, 비알콜성 지방간염, 심혈관 질환 및 다낭성 난소 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학 조성물.
  11. 이소트레티노인과 수용성 펩타이드가 화학적으로 결합된 구조를 갖는 이소트레티노인-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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CA2618951A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Schering Corporation Mcp1 fusions
MX2016015464A (es) 2014-06-02 2017-03-27 Sun Pharmaceutical Ind Ltd Composicion farmaceutica oral de isotretinoina.
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