KR20190120876A - 헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 및 화학적 추출을 포함하는 아스타잔틴의 제조방법 - Google Patents

헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 및 화학적 추출을 포함하는 아스타잔틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 단계, 물리적 세포벽 파쇄 단계 및 화학적 추출 단계를 포함하는 아스타잔틴의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus plvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 제조방법은 효율적이며 친환경적이고, 안정성이 증대된 아스타잔틴의 추출을 가능하게 한다. 아스타잔틴의 장기간 보관을 가능하게 하며, 안정성 보존 효과가 뛰어나므로, 상업적으로도 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 에너지를 많이 소모하는 공정인 미세조류 바이오매스 건조 과정을 거치지 않은 바이오매스(wet biomass)를 추출 공정에 바로 적용할 수 있으며, 화학적 추출 공정은 이온성 액체를 활용하여 용매 재활용이 가능할 뿐 아니라 상온 및 상압에서 적용 가능하여, 전체 공정에 투입되는 에너지 저감 효과를 기대할 수 있다.

Description

헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 및 화학적 추출을 포함하는 아스타잔틴의 제조방법{Method for Preparing Astaxanthin Comprising Biological Pretreatment and Chemical Extraction of Haematococcus pluvialis}
본 발명은 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 단계, 물리적 세포벽 파쇄 단계 및 화학적 추출 단계를 포함하는 아스타잔틴의 제조방법에 관한 것이다.
지구 온난화에 따라 온실 가스 처리 기술의 필요성이 증가하고 있다. 이에 따라 미세조류를 이용한 이산화탄소의 생물학적 전환 기술의 연구가 전 세계적으로 이루어지고 있다. 특히 미세조류는 고부가가치 산물을 다수 생산하므로 이산화탄소 저감 공정에 경제성을 부여한다. 미세조류로부터 생산된 고부가가치 산물은 하부 공정(downstream process)을 거쳐 추출 및 분리되며, 상업적으로 의약품, 건강기능식품, 화장품 등에 널리 활용된다. 특히 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 추출 가능한 카로테노이드인 아스타잔틴(astaxanthin)은 항산화 효과가 매우 우수하고, 생체 활성이 있는 3S, 3S' form이므로 인체에 사용 가능하여 1kg에 시장 가격이 2500-7000 달러로 그 경제적 효과가 매우 우수하다. 아스타잔틴의 전 세계 시장은 2014년에 4억 47백만 달러로 추산되며, 이는 합성과 자연산 아스타잔틴을 모두 합한 규모이다(Shah, M., Mahfuzur, R., Liang, Y., Cheng, J. J., & Daroch, M. (2016). Astaxanthin-producing green microalga Haematococcus pluvialis: from single cell to high value commercial products. Frontiers in plant science, 7, 531.). 아스타잔틴 생산량을 극대화하기 위해 헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 특성 및 배양 공정, 아스타잔틴 생산을 위한 하부 공정에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.
헤마토코쿠스 세포는 영양분이 풍부하고 낮은 광 조건에서는 세포 분열이 주로 일어나며 이 때 세포는 운동성이 있는 flagellate 형태이다. 그러나 영양분이 고갈되고 높은 광 스트레스를 받을 때 세포는 운동성을 잃고 단단한 포자(cyst) 구조를 형성한다. 이 때 산화 스트레스에 대한 방어 메커니즘으로서 헤마토코쿠스 세포 내부에 항산화성이 높은 카로테노이드인 아스타잔틴을 2차 대사산물로서 축적한다. 이 때 카로테노이드와 클로로필 b는 보통 생장기(growth stage)에서 0.2 정도이나, 유도기(induction stage)에서 점차 카로테노이드 함량이 증가한다.
헤마토코쿠스 세포 내에 존재하는 대부분의 아스타잔틴은 fatty acid ester 형태로 존재하며 palmitic(16:0), oleic(18:1), 혹은 linoleic(18:2)산과 함께 mono- 혹은 diester 형태로 존재한다. 이러한 형태는 높은 극성을 가진 아스타잔틴 분자가 세포 내의 무극성인 lipid droplet 안에 존재할 수 있도록 돕는다. 헤마토코쿠스 포자 안에 아스타잔틴은 70%가 monoesters, 25%가 diesters, 그리고 오직 5% 만이 free form으로 존재한다(Solovchenko, A. E. (2015). Recent breakthroughs in the biology of astaxanthin accumulation by microalgal cell. Photosynth. Res. 125, 437-449. doi: 10.1007/s11120-015-0156-3.).
유도 공정 시 헤마토코쿠스 세포는 포자 구조를 형성하고, 아스타잔틴을 세포 내부에 축적하게 되며, 세포벽 구조 또한 발달한다. 헤마토코쿠스 포자 세포의 세포벽은 3중으로 구성되어 있는데, 가장 외부에 acetolysis에 저항성을 가진 algaenan으로 이루어진 trilaminar sheath, 만노오스와 셀룰로오스의 균일한 조성으로 이루어진 secondary wall, 그리고 만노오스와 셀룰로오스의 불균일한 조성으로 이루어진 tertiary wall로 이루어져 있다(Hagen, C., Siegmund, S., & Braune, W. (2002). Ultrastructural and chemical changes in the cell wall of Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyta) during aplanospore formation. European Journal of Phycology, 37(2), 217-226.). 이러한 단단한 세포벽 구성은 헤마토코쿠스로부터 아스타잔틴의 추출을 방해한다.
이 때 주변 환경 조건이 생장에 적합해지면 세포는 포자 구조에서 다시 flagellate 상태로 돌아가기 위해 발아 과정을 겪게 되는데(gametogenesis), 이 gametocyst로부터 분열되어 방출된 zooid는 운동성을 가진다(Damiani, M. C., Leonardi, P. I., Pieroni, O. I., & Cαceres, E. J. (2006). Ultrastructure of the cyst wall of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae): wall development and behaviour during cyst germination. Phycologia, 45(6), 616-623.). 이러한 세포 분열 과정은 세포 내 아스타잔틴을 포함한 대사산물의 분해를 수반하며 새로 분열하여 생성된 flagellate 세포들을 방출하기 위해 단단한 세포벽 구조가 일시적으로 분해된다.
아스타잔틴 함유 바이오매스 생산 공정 후 하부 공정으로서 수확, 세포 파쇄, 탈수가 진행된다. Cysewski와 Lorenz의 연구에 따르면, 상업적인 헤마토코쿠스로부터 아스타잔틴 생산 공정은 일반적으로 바이오매스 건조, 세포 파쇄(craking, milling), 그리고 아스타잔틴 추출 공정(초임계 추출) 순으로 이루어진다(Cysewski, G.R., Lorenz, R.T. (2004). Industrial production of microalgal cell-mass and secondary products - species of high potential. Haematococcus. In: Richmond, A. (Ed.), Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology. Blackwell science, Oxford, UK, pp. 281-288.). 바이오매스 수확은 sedimentation(자연 침강) 후 원심 분리 공정으로 이루어지고, 바이오매스 건조는 Freeze dryer(동결건조기)나 Spray dryer(중온건조장치) 공정으로 이루어지고, 이후 산, 염기 등을 이용한 화학적 처리와 homogenization(Grima, E.M., Fernandez, G.G.A., Medina, A.R., 2004. Downstream processing of cell mass and products. In: Richmond, A. (Ed.), Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology. Blackwell science, Oxford, UK, pp. 215-251.), ultrasonication, ball milling(Razon, L. F., and Tan, R. R. (2011). Net energy analysis of the production of biodiesel and bio gas from the microalgae: Haematococcus pluvialis and Nannochloropsis. Appl. Energ. 88, 3507-3514. doi: 10.1016/j.apenergy.2010.12.052.) 등 물리적 처리, 그리고 화학적/물리적 동시 처리 등을 가해 세포벽을 파쇄한 후 화학적 추출 혹은 초임계 추출법 등으로 아스타잔틴을 추출한다.
기존에 미세조류로부터 바이오 디젤 등 유용 물질을 추출하기 위해 chloroform, methanol, hexane 등 유기 용매가 널리 사용되어 왔다. 그러나 이러한 유기 용매는 인체에 유해하므로 최근에는 100℃ 이하에서 녹는 성질을 가지며 휘발성이 없고, 열 안정성이 있으며 재사용이 가능하고 화학적으로 합성하여 원하는 성질을 구현할 수 있는 유기 염(organic salt)인 이온성 액체가 새로운 "녹색(환경 친화적) 용매"로 주목 받고 있다(Kim, Y. H., Choi, Y. K., Park, J., Lee, S., Yang, Y. H., Kim, H. J., Park, T J., Kim, Y. H., Lee, S. H. (2012). Ionic liquid-mediated extraction of lipids from algal biomass. Bioresource technology, 109, 312-315.).
헤마토코쿠스 세포 내에서 아스타잔틴은 에스테르화 된 형태로 주로 존재하여, 소수성(hydrophobic)이 강하므로 식물성 오일에 쉽게 용해된다. 상업적으로 카로테노이드는 오일 성분에 현탁된 형태로 판매된다. 카로테노이드의 일종인 루테인에 관한 선행 연구에서 free form인 루테인은 열, 빛, 산화 스트레스에 약하나(Krinsky, N.I., Yeum, K.-J., (2003). Carotenoid-radical interactions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305, 754-760.), 에스테르화 된 루테인은 좀 더 안정하다. 상업적으로 판매되는 루테인은 vegetable oil에 suspension 형태로 판매된다. Lavecchia 과 Zuorro는 sunflower 및 rice bran oil에 현탁된 루테인이 20℃에서 각각 155일, 85일 동안 안정화되어 보관될 수 있다는 것을 밝혔다. 이 때 보관 온도가 4℃로 낮아지면 보관 가능기간은 각각 659일, 247일로 늘어난다(Lavecchia, R., Zuorro, A. (2008). Shelf stability of lutein from marigold (Tagetes erecta L.) flowers in vegetable oils. Chem. Eng. Trans. 14, 199-204.).
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 기존에 연구된 아스타잔틴 추출 기술에 덧붙여 1차적으로 물리적으로 세포벽을 파쇄하고 2차적으로 이온성 액체와 식물성 오일의 상 분리를 이용한 화학적인 아스타잔틴 추출물 생산 기술을 제공하여 궁극적으로 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스로부터 고부가가치 산물인 아스타잔틴을 액상 수준에서 효과적으로 추출 및 분리하고 장기간 보관을 위한 안정화 기술을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus plvialis)로부터 에너지 효율적이며 친환경적이고, 생산물의 안정성(stability)이 증대된 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하고, 성숙한 포자 형태로 발아를 유도하는 단계; (b) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스를 유기 용매에 혼합하고, 물리적인 세포벽 파쇄 처리하는 단계; 및 (c) 상기 물리적 세포벽 파쇄 처리한 헤마토코쿠스 플루비알리스에 이온성 액체 및 식물성 오일을 처리한 다음, 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus plvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 제조방법은 효율적이며 친환경적이고, 안정성이 증대된 아스타잔틴의 추출을 가능하게 한다. 아스타잔틴의 장기간 보관을 가능하게 하며, 안정성 보존 효과가 뛰어나므로, 상업적으로도 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 에너지를 많이 소모하는 공정인 미세조류 바이오매스 건조 과정을 거치지 않은 바이오매스(wet biomass)를 추출 공정에 바로 적용할 수 있으며, 화학적 추출 공정은 이온성 액체를 활용하여 용매 재활용이 가능할 뿐 아니라 상온 및 상압에서 적용 가능하여, 전체 공정에 투입되는 에너지 저감 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 헤마토코쿠스 바이오매스 배양 및 바이오매스 처리, 수확, 아스타잔틴 추출 등 개략적인 공정 흐름에 대한 정보를 제공한다.
도 2는 발전소 연소 가스 및 태양광을 이용한 미세조류 배양 공정에서 유도기 동안 세포 생장 곡선이다.
도 3은 Bead beating 법을 이용한 물리적 세포벽 파쇄를 통한 아스타잔틴 추출 실험에 대한 결과이다. 도 3A는 포자 발아 처리를 한 샘플(실험군)과 그렇지 않은 샘플(대조군) 간 추출된 아스타잔틴의 농도 및 추출 효율을 나타낸 것이고, 도 3B는 물리적 세포 파쇄 처리에 따른 세포벽 표면의 손상을 관찰하기 위한 전자현미경 사진이다.
도 4는 High Pressure Homogenizer 법 물리적 세포 파쇄 처리를 통한 아스타잔틴 추출 실험에 대한 결과이다. 도 4A 내지 도 4C는 고압 파쇄 처리 횟수 조건 당 아스타잔틴 수율과 추출 효율을 나타낸 것이고, 도 4D는 물리적 세포 파쇄 처리에 따른 세포벽 표면의 손상을 관찰하기 위한 전자현미경 사진이다.
도 5는 Ball Mill 법 물리적 세포 파쇄 처리를 통한 아스타잔틴 추출 실험에 대한 결과이다. 도 5A 내지 5D는 파쇄 처리 시간 조건 당 아스타잔틴 수율과 추출 효율을 나타낸 것이고, 도 5E는 물리적 세포 파쇄 처리에 따른 세포벽 표면의 손상을 관찰하기 위한 전자현미경 사진이다.
도 6은 이온성 액체를 이용한 조 추출물(crude extract)로부터 아스타잔틴의 연속 분리 공정의 효율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 분리한 헤마토코쿠스 아스타잔틴 식물성 오일 추출물의 안정성을 장기간동한 테스트한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus plvialis) 바이오매스로부터 카로테노이드인 아스타잔틴(Astaxanthin)의 에너지 효율적이며 친환경적이고 생산물의 안정성(stability)이 증대된 추출 방법을 제시한다. 이를 달성하기 위해 기존에 사용되던 고에너지 소모형 건조 공정 대신 젖은 바이오매스로부터 생물학적 전처리 및 물리적 처리를 통한 에너지 효율적인 세포벽 파쇄 방법 및 이온성 액체와 친수성 용매 그리고 식물성 오일을 사용한 친환경적이고 장기간의 보관 기간 동안 안정성이 증대된 저에너지소모형 헤마토코쿠스 아스타잔틴 추출물 생산 방법을 제시한다(도 1). 이를 위해 옥외 배양 공정에서 적용 가능한 생물학적 세포벽 약화 처리 및 물리적 파쇄 공정 최적화, 화학적 추출 공정 최적화, 그리고 생산된 식물성 오일에 분산된 헤마토코쿠스 아스타잔틴 추출물의 안정성 평가를 통한 미세조류를 이용한 아스타잔틴 생산의 하부 공정(downstream process) 최적화 기술을 제공한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하고, 성숙한 포자 형태로 발아를 유도하는 단계; (b) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스를 유기 용매에 혼합하고, 물리적인 세포벽 파쇄 처리하는 단계; 및 (c) 상기 물리적 세포벽 파쇄 처리한 헤마토코쿠스 플루비알리스에 이온성 액체 및 식물성 오일을 처리한 다음, 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 아스타잔틴의 제조방법은 (a) 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하고, 성숙한 포자 형태로 발아를 유도하는 단계를 포함한다.
상기 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양은 자가영양 조건에서 배기가스를 공급하며 옥외 광생물반응기에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 광생물반응기를 이용한 대규모의 배양공정 조건에서 생물학적 전처리를 이용하여 헤마토코쿠스 세포의 세포벽을 약화시킨 후 바이오매스를 회수하였다. 회수한 바이오매스 슬러지는 함수율이 약 70~80% 정도 되며, 하부 공정(downstream process)에서 바이오매스 건조 공정에 에너지를 대량으로 소모하기 때문에(Halim, R., Gladman, B., Danquah, M. K., & Webley, P. A. (2011). Oil extraction from microalgae for biodiesel production. Bioresource technology, 102(1), 178-185.) wet biomass 상태로 추출 공정을 그대로 진행하였다.
상기 헤마토코쿠스 플루비알리스의 발아 유도는 1mM KNO3의 영양 조건, 150μE/m2/s의 광 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 광생물반응기에서 배양을 마친 헤마토코쿠스 세포에 대해 바이오매스 회수 전 1mM KNO3를 포자 발아(cyst germination)를 위한 영양원 150μE/m2/s의 광 조건으로 3일 이상 배양하여 cyst의 flagellate로의 전환을 유도하였다. 이 과정에서 단단한 세포벽 구조가 약화되며, 이러한 생물학적인 전처리를 통해 세포벽의 물리적 파쇄에 대해 추출 효율 증대 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 포자 발아 처리로 인해 아스타잔틴 함량에서 손실이 있었으나, 물리적 파쇄 처리 단계에서 아스타잔틴 추출 효율이 증가하였다. 이를 통해 비록 포자 발아 처리로 인해 아스타잔틴 생분해가 일어나 세포 내 절대적인 아스타잔틴 함량이 감소하더라도 전체적인 추출 공정에 소모되는 에너지를 고려하였을 때 에너지 효율이 더 높음을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양 및 발아 유도 단계 후, 1차적으로 고체 및 액체 분리, 2차적으로 원심분리를 통해 농축된 슬러지 상태의 바이오매스를 얻는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아스타잔틴의 제조방법은 (b) 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스를 유기 용매에 혼합하고, 물리적인 세포벽 파쇄 처리하는 단계를 포함한다.
상기 유기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 함수율이 높은 바이오매스에 친수성(hydrophilic) 유기 용매인 에탄올(ethanol)을 혼합한 후, 물리적인 세포벽 파쇄 공정을 수행하였다.
본 발명에 있어서, 상기 물리적 세포벽 파쇄 처리는 Bead beating(비드비팅) 법, High pressure homogenizer(고압 분산기) 법 및 Ball mill(볼 밀) 법으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, Ball mill 법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 세포 상태를 고려한 배양일 및 아스타잔틴 추출 효율을 비교해 보았을 때, 80일 배양 시 아스타잔틴 함량은 가장 높았으나 세포벽 구조의 발달로 인해 추출 효율이 떨어졌으며, 포자 발아 처리를 하였을 때 생물학적 세포벽 분해로 인해 아스타잔틴 함량이 줄어들더라도 추출 효율 면에서 더 우수함을 확인하였다. 특히, Ball mill 처리 시 9시간 이상 처리하였을 때 세포벽 파쇄 효과가 우수함을 알 수 있었다. Ball mill 처리법은 scale-up이 용이할 뿐 아니라 대용량의 바이오매스 처리가 가능하므로 향후 대규모 공정 적용 시 더 유리할 것으로 판단된다.
본 발명에 있어서, 상기 아스타잔틴의 제조방법은 (c) 물리적 세포벽 파쇄 처리한 헤마토코쿠스 플루비알리스에 이온성 액체 및 식물성 오일을 처리한 다음, 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 물리적 처리를 거친 헤마토코쿠스 바이오매스 추출물에 대하여 아스타잔틴 분리 및 안정성 증가를 위해 화학적 추출 기술을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 이온성 액체는 1-ethyl-3-methylimidazolium ethyl sulfate(1-에틸-3-메틸이미다졸늄 에틸 설페이트)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 식물성 오일은 콩 오일, 카놀라 오일, 포도씨 오일, 올리브 오일 및 옥수수 오일로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 콩 오일(soybean oil)을 이용한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물성 오일이 분리된 유기 용매를 상기 (b) 및 (c) 단계에 재사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 상온, 상압에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유기 용매인 에탄올에 분산된 바이오매스는 물리적 세포 파쇄 공정을 거치며 아스타잔틴이 추출된다. 그러나 이 추출물(crude extract)은 세포 잔해가 섞여 있을 뿐 아니라 아스타잔틴 안정성 또한 떨어진다. 이러한 추출물에서 세포 잔해를 제거하고 아스타잔틴을 분리하고 안정성을 증가시키기 위해 이온성 액체를 이용하여 유기 용매로부터 아스타잔틴을 분리하여 분산재인 식물성 오일에 아스타잔틴을 분산시켰다. 이온성 액체는 유기 용매에 비해 휘발성이 낮아 독성이 적고 재활용이 가능하여 친환경적인 용매로 주목 받고 있다. 이러한 추출 과정은 상온 및 상압에서 진행되므로, 열에 의해 쉽게 분해되는 아스타잔틴 추출 공정에 적용하였을 때 아스타잔틴 수율 면에서 효과적이다. 유기 용매층과 오일층은 친수성/소수성 작용으로 인해 상분리가 일어나서 여타 에너지 투입 없이 자연 침강법으로 아스타잔틴이 분산된 오일층을 수득할 수 있다. 또한 이온성 액체가 혼합된 유기 용매는 회수 및 재활용이 가능하다. 오일층을 분리한 후 유기 용매층에 다시 추출물(crude extract) 및 식물성 오일을 혼합하여 재활용할 수 있다. 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴은 주로 에스테르 형태로 존재하므로 소수성이 높아 오일층에 잘 용해되며 장기간동안 분해되지 않고 안정성을 유지한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 발명에 사용된 균주는 Haematococcus pluvialis NIES-144로서 National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan으로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 배지는 NIES-C 및 NIES-N 배지이며 이의 구성성분을 하기 표 1에 나타내었다.
NIES-C NIES-N
성분 함량(/L) 성분 함량(/L)
Ca(NO3)2 0.15 g CaCl2·2H2O 0.13 g
KNO3 0.10 g KCl 0.07 g
Na2Glycerophosphate·5H2O
(무기 인산염 버퍼로 대체)		 0.05 g Na2Glycerophosphate·5H2O
(무기 인산염 버퍼로 대체)		 0.05 g
MgSO4·7H2O 0.04 g MgSO4·7H2O 0.04 g
Thiamine 0.01 ㎎ Thiamine 0.01 ㎎
Biotin 0.10 ㎍ Biotin 0.10 ㎍
Vitamin B12 0.01 ㎍ Vitamin B12 0.01 ㎍
PIV metal solution
(per liter)
Na2EDTA 1 g
FeCl3·6H2O 0.196 g
MnCl2·4H2O 0.036 g
ZnSO4·7H2O 0.022 g
CoCl2·6H2O 4 ㎎
Na2MoO4·2H2O 2.5 ㎎		 3 ㎖ PIV metal solution
(per liter)
Na2EDTA 1 g
FeCl3·6H2O 0.196 g
MnCl2·4H2O 0.036 g
ZnSO4·7H2O 0.022 g
CoCl2·6H2O 4 ㎎
Na2MoO4·2H2O 2.5 ㎎		 3 ㎖
또한 자가 영양 조건에서 H. pluvialis 대량 배양 공정의 옥외 배양 조건은 아래에 나타내었다.
- NIES-C 배지: autotrophic medium(자가영양배지, 목적: 생장)
- NIES-N 배지: autotrophic medium(자가영양배지, 목적: 영양 결핍 스트레스를 통한 아스타잔틴 축적 유도)
- 가스 공급: 옥외 배양 공정을 위해 한국 지역난방공사 판교지사에서 배출되는 배기가스를 사용하였으며, 이 때 CO2 농도는 약 3~6%로 관찰됨.
- 주입 유량: 0.1 vvm(vessel volume per minute)
- 배양 온도: 23±3℃
- 광주기: (대략적으로) 명암주기 12 : 12
- 반응기 종류: 5L 부피의 기포탑(bubble column) 형식의 공기 방울을 이용하여 교반하는 관형(tubular)의 투명한 광 생물 반응기
- 생장 시 광조건: 50~70 μE/m2/s
- 유도기 시 광조건: 300~500 μE/m2/s
- 세포 생장 상태에 따른 추출 효율 관찰을 위한 바이오매스 수확 날짜: 각각 아스타잔틴 축적 유도(induction) 후 40일, 60일, 80일
- 세포벽 생분해를 위한 포자 발아 조건: 150 μE/m2/s(광조건), 1 mM KNO3 첨가(영양원)
- 물리적 세포 파쇄 조건
1) Bead beating(Tissue Layser II, Qiagen, Germany)
처리조건: Frequency 30 Hz with glass bead, 처리시간: 3시간(대조군, 완전한 세포벽 파쇄 조건), 1시간(실험군, 불충분한 세포벽 파쇄 조건)
바이오매스/용매 혼합 조건: 1 mg biomass/1 ml Ethanol
2) High Pressure Homogenizer(EmulsiFlex C5, Avestin, Canada)
처리조건: 10000~12000 psi with 5 L/min flow rate, 처리시간: (반복추출) 4 회, 8회, 12회
바이오매스/용매 혼합 조건: 1 g biomass/1 L Ethanol
3) Ball Milling(Korea Furnace Development Co. Ltd, Korea)
처리조건: 200 rpm with zirconia bead 1 mm(20 g) and 5 mm(l0 g), 처리시간: 3 hr, 6 hr, 9 hr, 12 hr
바이오매스/용매 혼합 조건: 10 mg biomass/100 ml Ethanol
- 헤마토코쿠스 추출물로부터 아스타잔틴 분리 조건
추출물(물리적 처리를 끝낸 바이오매스/유기용매 혼합물):이온성 액체: 식물성 오일 비 1:1:2
오일층 분리 후 유기용매/이온성 액체:식물성 오일 비 1:1
- 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴 보관 조건: 냉암소 (4℃ 냉장보관), 상온 조건 (25℃)에서 LED 광 노출, 상온 조건에서 광 노출 없는 암조건
실시예 1: 물리적 세포 파쇄 공정 최적화를 위한 발전소 배기가스 및 태양광을 이용한 옥외 배양에서 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양공정
먼저, 한국 지역난방공사 판교지사 발전소에서 배출되는 배기가스로 자가 영양 조건에서 광생물 반응기를 이용하여 미세조류 헤마토코쿠스를 배양한다. 이 때 사용되는 반응기는 광 투과 비닐로 제작된 기포탑(bubble column) 형태의 반응기이며, 공급 가스 유량은 0.1 vvm로 일정하게 지속적으로 가스를 공급한다. 2차 대사산물을 생산하는 아스타잔틴 유도기(induction phase)에서 배양 기간이 길어질수록 세포 내 아스타잔틴 함량은 증가하나, cyst 세포의 세포벽 구조가 단단하게 발달되어 추출 과정에 어려움을 겪게 된다. 그러므로 세포 발아를 이용한 생물학적 전처리 공정은 배양 기간에 따른 세포 상태를 고려하며 이루어져야 한다.
유도기(induction phase)에서 헤마토코쿠스 플루비알리스 생물학적 세포 생장 상태는 바이오매스의 아스타잔틴 함량뿐 아니라 물리적 파쇄 공정에 영향을 주는 세포벽 상태를 좌우하므로 최적의 바이오매스 수확 및 생물학적 포자 발아 조건에 대해 연구하였다. 바이오매스 수확 날짜는 각각 40일, 60일, 그리고 80일째 되는 날로 선정하였다(도 2). 그리고 생물학적 포자 발아가 세포벽 약화에 주는 영향을 관찰하기 위해 세포 발아 유도를 진행하였다. 3일 동안 광 생물 반응기에 배양 중인 헤마토코쿠스 플루비알리스 세포에 대해 바이오매스 회수 전에 각각 광 조건 150μE/m2/s, 영양 조건 1mM KNO3을 주어 세포 발아 유도를 진행했다. 포자 발아가 일어나는 동안에는 세포가 영양원을 흡수하며 물질 대사가 2차 대사산물 축적에서 세포 생장으로 전환되므로 아스타잔틴을 포함한 카로테노이드 함량이 감소하고 클로로필 함량이 증가한다.
이러한 광 및 영양 조건을 이용한 생물학적 세포 발아에 의한 세포 변화를 확인하기 위해 아스타잔틴 함량 변화 및 카로테노이드/클로로필 b 변화를 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
배양일 Astaxanthin contents (%) Cartenoid/Chlorophyll ratio
세포 발아 처리 Control Treatment Control Treatment
40 days 3.1 2.78 8.16 5.72
60 days 3.9 3.76 8.97 6.80
80 days 4.2 3.95 12.54 10.34
유도기가 오랜 기간 진행된(80일) 세포일수록 아스타잔틴 함량이 높았으나 생물학적 세포 발아 유도에서 그 효율이 낮았다. 유도기가 가장 짧은(40일) 세포는 광 및 영양 조건이 주어졌을 때 cyst가 flagellate로 돌아가는 발아 효율이 높았으나 아스타잔틴 함량이 낮았다. 모든 배양일 조건에서(40일, 60일, 80일) 볼 수 있듯이 아스타잔틴의 절대적인 함량은 포자 발아 처리로 인해 감소한다. 아스타잔틴 함량은 포자 발아 처리를 하지 않았을 때와 비교하여 각각 10.66%(40일), 5.93%(60일), 6.49%(80일) 감소했다.
포자 발아 처리를 끝낸 바이오매스는 자연 침강법을 이용하여 1차적으로 고-액 분리를 거친다. 이 후 2차적으로 원심분리를 해서 200배 이상 농축하여 슬러지 상태의 바이오매스를 얻는다. 이 상태에서 물리적 세포 파쇄 공정을 위해 친수성 유기 용매인 에탄올에 바이오매스를 혼합하여 분산시킨다.
실시예 2: 물리적 파쇄 공정 최적화
Bead beating(대조군), High Pressure Homogenizer, Ball Milling 방법을 이용하여 포자 발아 처리를 한 바이오매스(실험군)와 그렇지 않은 바이오매스(대조군) 간 아스타잔틴 추출 효율을 비교하였다. 생물학적 세포벽 약화 처리가 추출 효율 향상에 효과가 있는지 관찰하기 위해 물리적 처리 시간을 달리 하여 각각 아스타잔틴 추출 효율을 비교하였다. 또한 물리적 처리 시간이 세포 파쇄에 주는 영향을 확인하기 위해 전자현미경(Scanning Electron Microscope)으로 세포벽 표면의 손상 정도를 관찰하였다(도 3B, 도 4D 및 도 5E).
세포 발아 유도 처리를 진행한 세포와 그렇지 않은 세포에 대해 Bead beating 법을 이용하여 각각 물리적 세포벽 파쇄 처리를 진행하였다. 생물학적 세포벽 약화 처리가 아스타잔틴 추출 효율에 주는 영향을 확인하기 위해 처리 시간은 1시간(불충분한 처리) 동안 진행되었고, 대조군으로서 3시간(충분한 처리) 동안 물리적 세포 파쇄 처리를 진행하여 결과를 비교하였다(도 3). 도 3A에 각각 유기 용매에 추출된 아스타잔틴 농도(mg/L) 및 3시간 처리 조건과 비교하여 1시간동안 처리하였을 때 추출된 아스타잔틴 농도를 비교한 추출 효율을 나타내었다.
실시예 1에서 서술한 바와 같이 포자 발아 처리로 인해 아스타잔틴 함량에서 손실이 있었으나, 1시간 처리 조건에서 아스타잔틴 추출 효율은 3시간 처리 조건과 비교하였을 때 각각 97.3%(40일), 94%(60일), 90.3%(80일)로 증가하였다. 이를 통해 비록 포자 발아 처리로 인해 아스타잔틴 생분해가 일어나 세포 내 절대적인 아스타잔틴 함량이 감소하더라도 전체적인 추출 공정에 소모되는 에너지를 고려하였을 때 에너지 효율이 더 높음을 도출할 수 있었다.
물리적 파쇄 공정 대량화를 위해 High pressure homogenizer 및 Ball mill 법을 이용하여 세포벽 파쇄 처리 최적화를 진행하였다. 모든 조건에서 포자 발아 처리를 한 바이오매스에서 추출 효율이 더 우수했다.
도 4에 High Pressure Homogenizer 법 물리적 세포 파쇄 처리를 통한 아스타잔틴 추출 실험에 대한 결과를 나타내었다. 앞의 실험에서 진행된 바와 같이 생물학적 포자 발아 처리를 가했을 때와 그렇지 않을 때 각각 추출된 아스타잔틴 농도를 측정하여 Bead beating 법으로 완전히 추출하였을 때(3시간 처리)의 아스타잔틴 농도를 대조군으로 하여 추출 효율을 비교하였다. 적정량의 용매와 바이오매스를 혼합하여 High Pressure Homogenizer에 일정한 유량으로 투입하였고, 여러 번 연속적으로 고압 파쇄 처리를 가해 추출 효율을 비교하였다. 처리 횟수는 각각 4회, 8회, 12회이다.
도 5에 Ball Mill 법 물리적 세포 파쇄 처리를 통한 아스타잔틴 추출 실험에 대한 결과를 나타내었다. 앞의 실험에서 진행된 바와 같이 생물학적 포자 발아 처리를 가했을 때와 그렇지 않을 때 각각 추출된 아스타잔틴 농도를 측정하여 Bead beating 법으로 완전히 추출하였을 때(3시간 처리)의 아스타잔틴 농도를 대조군으로 하여 추출 효율을 비교하였다. 적정량의 용매와 바이오매스, zirconia bead를 혼합하여 Ball Mill 장비를 이용하여 파쇄 처리를 가해 추출 효율을 비교하였다. 처리 시간은 각각 3시간, 6시간, 9시간, 12시간이다.
High pressure homogenizer 처리 시 추출 효율은 12회 연속 처리 조건에서 각각 96.2%(40일), 95.2%(60일), 96%(80일)로 완전히 추출되었음을 알 수 있다(도 4). Ball milll 처리 시 추출 효율은 12시간 처리 조건에서 각각 97.7%(40일), 98.9%(60일) 97.4%(80일)이었으며 9시간 처리 시 98%(40일), 97%(60일), 95.1%(80일)로 더 적은 처리 시간으로도 완전히 물리적인 파쇄가 이루어졌음을 확인할 수 있다(도 5).
아스타잔틴 생산 공정에서 세포 배양 공정은 공정 운영 시간의 대다수를 차지하며, 공정 운영 기간이 줄어들수록 경제성 측면에서 유리하기 때문에 생산성을 유지하며 공정 운영 기간을 줄이는 것이 중요하다. 이에 따라 배양에 소요되는 시간을 고려하였을 때 각 물리적 처리 조건에서 추출된 아스타잔틴 수율을 기반으로 아스타잔틴 생산성을 추론할 수 있다.
High pressure homogenizer 처리 시 12회 연속 처리 조건에서 아스타잔틴 수율을 기반으로 추산한 생산성은 각각 2.04mg/L/day(40일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.99mg/L/day), 2.01mg/L/day(60일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.95mg/L/day), 1.85mg/L/day(80일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.78mg/L/day)이며, Ball mill 처리 시 아스타잔틴 수율을 기반으로 추산한 생산성은 9시간 처리 조건에서 2.08mg/L/day(40일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 2.04mg/L/day), 2.05mg/L/day(60일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.91mg/L/day), 1.84mg/L/day(80일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.72mg/L/day)이며, 12시간 처리 조건에서 2.07mg/L/day(40일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 2.04mg/L/day), 2.09mg/L/day(60일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.92mg/L/day), 1.88mg/L/day(80일, 포자 발아 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.78mg/L/day)로 나타났다.
세포 상태를 고려한 배양일 및 아스타잔틴 추출 효율을 비교해 보았을 때, 80일 배양 시 아스타잔틴 함량은 가장 높았으나 세포벽 구조의 발달로 인해 추출 효율이 떨어졌으며, 포자 발아 처리를 하였을 때 생물학적 세포벽 분해로 인해 아스타잔틴 함량이 줄어들더라도 추출 효율 면에서 더 우수했다. 특히 Ball mill 처리 시 9시간 이상 처리하였을 때 세포벽 파쇄 효과가 우수함을 알 수 있었다. Ball mill 처리법은 scale-up이 용이할 뿐 아니라 대용량의 바이오매스 처리가 가능하므로 향후 대규모 공정 적용 시 더 유리할 것으로 판단된다.
실시예 3: 이온성 액체를 이용한 아스타잔틴 분리 연구
물리적 파쇄 처리를 통해 바이오매스로부터 유기 용매에 아스타잔틴 및 세포 잔해가 혼합되어 있는 조 추출물(crude extract)을 얻을 수 있다. 물리적 세포 파쇄 처리를 거친 헤마토코쿠스 바이오매스의 유기 용매 추출물은 아스타잔틴을 포함한 세포 잔해 및 불순물이 다수 섞여 있으므로 이온성 액체인 [Emim][EtSO4] (1-Ethyl-3-methylimidazolium ethyl sulfate)에 혼합한다. 이후 이 혼합물에 식물성 오일인 콩 오일(soybean oil)을 1:1 비율로 섞는다. 이 때 현탁액의 층 분리가 일어나 이온성 액체, 에탄올, 바이오매스 잔해는 아래에 가라앉고 카로테노이드는 오일층인 식물성 오일에 섞여 위로 떠오른다. 이러한 층 분리는 별도의 처리 없이 상온, 상압 조건에서 일어나며 식물성 오일과 카로테노이드의 혼합물은 밀도 차에 의해 유기용매 및 이온성 액체로부터 손쉽게 분리할 수 있다.
이때 이온성 액체를 이용하였을 때 유기 용매와 바이오매스 혼합물에 대해 반복적으로 추출 공정을 진행할 수 있어 고가의 용매인 이온성 액체를 재사용할 수 있다. 이 재사용 공정을 여러 번 테스트하였고, 각 횟수 당 아스타잔틴 회수율을 첫 분리 공정과 비교하여 효율을 비교하였다. 재사용 횟수가 늘어날수록 아스타잔틴 추출 효율은 감소하여 2번째 추출 시 첫 추출과 비교하였을 때 아스타잔틴 회수율은 74%, 3번째에 62%, 4번째에 56%로 나타났다(도 6).
일련의 이 공정은 상온, 상압에서 진행되므로 열에 의한 아스타잔틴의 손실을 최소화할 수 있으며 공정에 사용되는 에너지를 저감할 수 있다.
실시예 4: 아스타잔틴 안정성 연구
아스타잔틴은 열, 광 및 산화 스트레스에 의해 분해되므로 아스타잔틴을 장기간 보관하기 위해 free form보다 더 안정한 화학적 형태인 에스테르화 상태로 보관하며 안정제인 식물성 오일에 분산된 형태로 보관한다.
아스타잔틴의 안정성 비교를 위해 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴과 유기 용매에 추출된 아스타잔틴의 장기간 보관 기간 동안 아스타잔틴 분해 속도를 측정하였다. 또한 보관 조건에 따른 아스타잔틴 안정성을 비교하기 위해 광 및 온도 조건에 따른 아스타잔틴 분해 속도를 측정하였다. 액체-액체 추출을 통해 얻은 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴에 대해 유기 용매에 분산된 아스타잔틴과 비교하여 안정성 실험을 진행하였다.
식물성 오일에 현탁된 헤마토코쿠스 추출물과 유기 용매인 에탄올에 현탁된 헤마토코쿠스 추출물(대조군)을 각각 상온에서 LED 광에 노출하였을 때, 상온에서 암조건에 보관하였을 때, 그리고 냉암소에 보관하였을 때의 조건에서 아스타잔틴 분해 속도를 측정하여 각 조건에서 아스타잔틴 안정성 보존 효과를 평가하였다. 각 조건에서 아스타잔틴 분해 반응의 반응 속도 상수와 반감기를 측정하였고, 이를 통해 용매에 따른 아스타잔틴 안정성 유지 효과를 평가하였다(도 7).
아스타잔틴의 분해가 1차 반응 속도식을 따른다고 가정하였을 때, 반응 속도 상수 k와 반감기(τ)를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 1차 반응 속도식 및 반감기는 아래 식을 따른다(Chen, C. Y., Hsieh, C., Lee, D. J., Chang, C. H., & Chang, J. S. (2016). Production, extraction and stabilization of lutein from microalga Chlorella sorokiniana MB-1. Bioresource technology, 200, 500-505.).
Figure pat00001
(1)
이 때 t는 보관 날짜(day), C0는 t=0일 때 아스타잔틴 농도, k는 1차 반응 속도 상수이다.
Figure pat00002
(2)
용매
에탄올 식물성 오일
보관조건 LED, 상온 Dark, 상온 냉장고 LED, 상온 Dark, 상온 냉장고
분해속도상수 k 0.0027 0.0023 0.0019 0.0016 0.0013 0.0012
반감기(day) 260.73 302.67 360.70 427.44 524.63 598.72
유기 용매에 분산된 아스타잔틴은 식물성 오일에 비해 안정도가 낮았으며, LED 광에 노출되었을 때 아스타잔틴의 분해가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 특히 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴은 냉장 보관하였을 때 반감기가 598일로 가장 길었다. 이러한 긴 반감기는 아스타잔틴이 free form이 아닌 에스테르화 된 형태로 추출되었고 별도의 saponication 공정을 거치지 않았기 때문에 그 화학적 구조의 안정성이 증가된 것으로 추측할 수 있다.
본 실시예를 통해 식물성 오일에 현탁된 헤마토코쿠스 추출물은 상온 및 암조건에서 아스타잔틴 안정성 보존 효과가 뛰어나며, 이는 상업적으로도 적용 가능할 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(Astaxanthin)의 제조방법:
    (a) 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하고, 성숙한 포자 형태로 발아를 유도하는 단계;
    (b) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스를 유기 용매에 혼합하고, 물리적인 세포벽 파쇄 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 물리적 세포벽 파쇄 처리한 헤마토코쿠스 플루비알리스에 이온성 액체 및 식물성 오일을 처리한 다음, 식물성 오일에 분산된 아스타잔틴을 추출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 헤마토코쿠스 플루비알리스의 배양은 자가영양 조건에서 배기가스를 공급하며 옥외 광생물반응기에서 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 헤마토코쿠스 플루비알리스의 발아 유도는 1mM KNO3의 영양 조건, 150μE/m2/s의 광 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 후, 1차적으로 고체 및 액체 분리, 2차적으로 원심분리를 통해 농축된 슬러지 상태의 바이오매스를 얻는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 물리적 세포벽 파쇄 처리는 Bead beating(비드비팅) 법, High pressure homogenizer(고압 분산기) 법 및 Ball mill(볼 밀) 법으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 이온성 액체는 1-ethyl-3-methylimidazolium ethyl sulfate(1-에틸-3-메틸이미다졸늄 에틸 설페이트)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 식물성 오일은 콩 오일, 카놀라 오일, 포도씨 오일, 올리브 오일 및 옥수수 오일로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 식물성 오일이 분리된 유기 용매를 상기 (b) 및 (c) 단계에 재사용하는 것을 특징으로 하는 아스타잔틴의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 상온, 상압에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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