KR101776862B1 - 자가포식이 억제되고 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조하는 방법 - Google Patents

자가포식이 억제되고 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제하는 단계를 포함하는 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류의 제조방법, 상기 방법으로 제조되어 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류, 상기 미세조류를 포함하는 바이오매스, 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 바이오디젤에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조할 수 있고, 상기 제조된 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용할 수 있으므로, 바이오 디젤의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

자가포식이 억제되고 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조하는 방법{Process for preparing microalgae inhibiting autophagy and comprising increased lipid and starch contents}
본 발명은 자가포식이 억제되고 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제하는 단계를 포함하는 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류의 제조방법, 상기 방법으로 제조되어 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류, 상기 미세조류를 포함하는 바이오매스, 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 바이오디젤에 관한 것이다.
최근 전세계적으로 화석에너지의 고갈과 지구온난화에 직면하여, 미국을 포함하는 선진국을 중심으로 환경 친화적인 바이오, 수소, 태양 등의 신재생에너지 활용 및 확산을 위한 정책 입안과 함께 이들 신재생에너지의 공급과 사용을 촉진하고 있다. 국내에서도 신재생에너지 개발에 많은 노력을 하고 있지만, 현재 연구단계에 머물고 있는 실정이다. 바이오 에너지는 재생가능하며, 이산화탄소를 고정함으로서 지구온난화 가속현상을 감소시킬 수 있는 장점이 있는데, 현재로서는 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오디젤 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
상기 바이오 에너지 중에서도, 가장 활발하게 연구가 진행되고 있는 것은 바이오디젤이다. 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화(transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 전환되어 생성되는데, 150℃의 인화점을 가지고 있어 경유(64℃)에 비해 불이 잘 붙지 않고, 낮은 온도에서 휘발성이 높은 휘발유(45℃)보다 안정적이기 때문에 비가연성 액체로 분류되며, 고온에서 불이 붙기 때문에 안정성이 더 높다고 할 수 있다. 또한, 경유와 달리 바이오디젤은 연소될때 발암물질 및 돌연변이를 일으키는 유해 가스 방출량이 적으며 기타 배출물이 현저하게 낮은 비독성 에너지로 알려져 있다.
이러한 바이오디젤은 미세조류를 이용하여 생물학적으로 생산할 수 있다고 알려져 있다. 미세조류는 식물에 비하여 태양에너지의 이용효율이 25배 높기 때문에, 사료 또는 비료의 용도로 사용되고 있으며, 특히 녹조류에 속하는 스피룰리나(Spirulina sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 두날리엘라(Dunaliella sp.), 노스톡(Nostoc sp.) 등은 건강식품으로도 이용되고 있다. 이러한 미세조류는 태양에너지의 이용효율이 우수하기 때문에, 지질의 함량이 우수한 미세조류는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있다. 이처럼 지질의 함량이 우수한 미세조류로는 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp.)이 알려져 있는데, 상기 미세조류는 정상적인 생활환경에서는 지질의 함량이 높지 않지만, 영양공급이 중단된 상태에서 일정시간이 경과하면, 세포내에 지질을 축적하는 특성을 나타낸다. 이러한 특성을 이용하여 상기 미세조류를 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있으나, 상기 미세조류의 지질함량을 증가시키기 위해서는 상기 미세조류를 배양하여 증식하는 제1공정과, 상기 증식된 미세조류에 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포내 지질함량을 증대시키는 제2공정이 수행되어야 하는데, 상기 제2공정에는 과다한 시간이 요구되기 때문에 아직까지는 바이오디젤의 산업적 생산에 사용되지 못하고 있으므로, 바이오디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 미국특허공개 제2012-0329099호에는 아이소아밀라제를 과발현시켜서 전분과 지질을 높은 수율로 생산하는 미세조류의 제조방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2014-0010898호에는 이산화탄소의 농도를 조절하면서 황을 결핍시키는 조건에서 미세조류를 배양하여, 상기 미세조류로부터 전분을 축적시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 아이소아밀라제가 과발현되는 미세조류에서는 상기 생산된 전분과 지질이 세포내 축적될 뿐만 아니라 외부로 배출되기 때문에, 세포내 축적되는 전분과 지질의 함량이 높지 않고, 이산화탄소의 농도를 조절하면서 황을 결핍시키는 조건에서 미세조류를 배양할 경우에는 미세조류가 사멸될 위험성이 있다는 단점이 있었다.
이러한 배경하에서, 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 예의 연구노력한 결과 미세조류를 자가포식이 유도되는 조건에서 배양하면서, 상기 자가포식의 유발을 억제할 경우, 그의 균체내 지질함량이 증대될 뿐만 아니라 전분함량도 함께 증가되므로, 이처럼 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 포함하는 바이오매스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 바이오디젤을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 바이오 디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 자가포식 과정에 주목하게 되었다. 자가포식(autophagy)이란, 특정 조건에서 세포의 생존이 위협받을 경우, 세포내 소기관의 일부를 재활용하는 과정으로서, 세포질 및 세포 내 기관들이 자가소화포(autophagosome)라는 이중-막-결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 자가소화포는 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용된다. 상기 자가포식 과정은 기아상태생존, 감염성 세균으로부터의 보호 및 신경붕괴조절과 같은 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 이는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다. 상기 자가포식 과정 중에서 생성되는 오토리소좀에는 다양한 성분의 지질이 포함되어 있으므로, 상기 오토리소좀에 포함된 물질을 재사용하지 않은 상태로 유지할 경우, 세포내 지질함량을 증대시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 이를 확인하고자, 미세조류의 일종인 클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)를 질소가 결핍된 배지에서 배양하여 자가포식을 유도하고, 상기 자가포식이 유도된 미세조류에 자가포식 저해제를 처리한 결과, 액포의 형성이 촉진되고, 상기 액포내 지방구의 생성 역시 현저히 증가됨을 확인하였다. 상기 자가포식 저해제는 세포내에서 PI3K 관련 신호전달을 억제함으로써 그의 효과를 나타낸다고 알려져 있으므로, 상기 PI3K 관련 신호전달이 억제된 변이주 미세조류를 제작하고, 상기 제작된 변이주 미세조류를 질소 공급배지 또는 질소 결핍배지에서 배양한 결과, 질소 공급배지에서 배양된 경우에는 지질의 생성이 억제되었으나, 질소 결핍배지에서 배양된 경우에는 지질의 생성이 증가됨을 확인하였다. 상기 변이된 미세조류의 특성을 분석한 결과, 세포증식이 억제되어 상대적으로 적은 수의 세포를 생성하지만, 세포의 크기는 증가되고, 세포의 형태는 원형에 가까우며, 광합성이 원활하게 수행되지 않고, 트리글리세라이드(TAG)를 높은 수준으로 생성하며, 세포내 전분함량이 증가되고, PI3P의 활성이 감소됨을 확인하였다. 또한, 구조적으로 자가소화포 유사구조체가 존재하지 않고, 지방구와 전분은 액포내에 존재함을 확인하였다.
이처럼, 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제할 경우, 균체내 지질과 전분의 함량이 증가하므로, 상기 방법으로 배양된 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 바이오디젤의 경제적인 생산에도 활용될 수 있을 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제하는 단계를 포함하는, 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "미세조류(microalgae)"란, "식물성 플랑크톤"이라고도 하고, 수생환경에서 생존하면서, 포자로 번식하며, 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 단세포성 원핵생물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 미세조류는 균체내에 지질을 축적할 수 있는 모든 종류의 미세조류가 될 수 있는데, 특히 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제할 경우 균체내에 지질을 축적할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 균체내에 지질을 축적할 수 있는 클로렐라 속(Chlorella sp.) 미세조류, 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류, 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) 미세조류, 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류, 보트리오코커스 속(Botryococcus sp.) 미세조류, 에틀리아 속(Ettlia sp.) 미세조류, 클라미도모나스 속(Chlamydomonas sp.) 미세조류 등이 될 수 있고, 다른 예로서 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제할 경우 균체내에 지질을 축적할 수 있는 클라미도모나스 속 미세조류가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 클라미도모나스 레인파티(Chlamydomonas reinfardtii) 균주가 될 수 있고, 또 다른 예로서 클라미도모나스 레인파티 CC124(Chlamydomonas reinfardtii CC124) 균주가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "자가포식(autophagy)"이란, "자가소화"라고도 하고, 세포내부에 필요 없는 물질이나 세포소기관을 이중막으로 둘러싸서 라이소좀으로 보내서 분해하고 재활용하는 세포기능을 의미한다. 상기 자가포식은 세포질 및 세포 내 기관들이 자가소화포(autophagosome)라는 이중-막-결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 자가소화포는 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용되는 과정에 의해 수행된다.
본 발명의 용어 "자가포식 유도조건"이란, 미세조류로부터 자가포식 과정의 발생을 유도하는 조건을 의미한다. 자가포식 과정은 탄소원의 결핍, 질소원의 결핍, 미량원소의 결핍, 외부환경 pH의 급격한 변화, 외부환경 염농도의 변화 등과 같이 세포의 생존이 어려운 조건에서 발생된다.
본 발명에 있어서, 상기 자가포식 유도조건은 미세조류로부터 자가포식의 발생을 유도하면서도, 상기 미세조류의 사멸이 유도되지는 않는 배양조건인 것으로 해석될 수 있는데, 구체적으로는 상기 자가포식 과정을 유도할 수 있는 조건 중에서 상기 미세조류의 사멸을 유도하지는 않는 질소원의 결핍 조건이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "자가포식 억제"란, 상기 자가포식 유도조건하에서도 미세조류의 자가포식 과정의 진행을 억제 또는 지체시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 자가포식을 억제하는 방법으로는 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 세포내 신호전달 체계를 저해하는 방법이 될 수 있는데, 일 예로서 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달 체계를 저해하는 방법이 될 수 있고, 다른 예로서 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달을 저해하는 자가포식 저해제를 상기 미세조류에 처리하거나 또는 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달에 관여하는 PI3K 촉매 서브유닛 제3형(PI3K catalytic subunit type 3) 단백질의 발현이 억제된 변이주 미세조류를 사용하는 방법이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달을 저해하는 자가포식 저해제인 와트마닌(wortmannin)을 미세조류에 처리하거나 또는 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달에 관여하는 PI3K 촉매 서브유닛 제3형 단백질을 코딩하는 VPS34 유전자에 대한 siRNA가 처리된 변이주 미세조류를 사용하는 방법이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 하기 염기서열을 갖는 VPS34 유전자에 대한 siRNA가 처리된 변이주 미세조류를 사용하였다.
amiFor: 5'-ctagtCTGCGACATAAACTTGTATGAtctcgctgatcggcaccatgggggtggtggtg atcagcgctaTCATTCAAGTTTATGTCGCAGg-3'(서열번호 1)
amiRev: 5'-ctagcCTGCGACATAAACTTGAATGAtagcgctgatcaccaccacccccatggtgccg atcagcgagaTCATACAAGTTTATGTCGCAGa-3'(서열번호 2)
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 미세조류를 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다.
상기 미세조류를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시켜야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 CO2와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미세조류 배양용 배지로는 NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 구연산, EDTA Na2, 암모늄 페릭 시트레이트 그린(Ammonium ferric citrate green), Na2CO3 및 트레이스 금속용액(H3BO3, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, Co(NO3)2.6H2O)을 포함하는 BG11 배지를 사용할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 30℃로 유지할 수 있다.
아울러, 광합성을 수행하는 상기 미세조류의 특성상 배양시 빛을 제공함이 바람직한데, 제공되는 빛의 양과 제공시간은 당업자가 필요에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 약 50 내지 100μmole/㎡/s의 광도조건으로 빛을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)를 질소 결핍배지에서 배양하여 자가포식을 유도하면서, 자가포식 저해제로 알려진 와트마닌(wortammanin)을 처리한 결과, 액포의 생성 및 지방구의 생성이 증가되고(도 1), 상기 자가포식 저해제에 의해 영향을 받는 세포내 신호전달 체계인 PI3K 관련 신호전달이 억제된 변이주 미세조류를 제작하고, 상기 제작된 변이주 미세조류를 질소 공급배지 또는 질소 결핍배지에서 배양한 결과, 질소 공급배지에서 배양된 경우에는 지질의 생성이 억제되었으나, 질소 결핍배지에서 배양된 경우에는 지질의 생성이 증가됨을 확인하였으며(도 2), 상기 변이주 미세조류의 특성을 분석한 결과, 트리글리세라이드(TAG)를 높은 수준으로 생성(도 3e)할 뿐만 아니라, 전분 함량 역시 높은 수준으로 증가됨(도 3f)을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 제조되어, 자가포식이 억제되지 않은 균주에 비하여, 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제공한다.
상기 방법으로 제조된 미세조류는 동일한 자가포식 유도조건에서 배양할 경우, 자가포식이 억제되지 않은 야생형 균주에 비하여, 균체내 지질 및 전분함량이 증대되는 특징을 갖는다. 이때, 균체내에서 함량이 증대되는 지질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 인지질이 될 수 있고, 다른 예로서, 인지질에 속하는 PA(phosphatidic acid), PE(phosphatidyl-ethanolamine), PS(phosphatidylserine) 등이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 트리글리세라이드(TAG)의 분해산물인 MG(monoacylglycerol), 스트레스 유도성 불포화지방산인 EA(eicosadienoic acid) 등이 될 수 있다. 특히, PA, PE, PS 등의 인지질은 자가포식이 억제되지 않은 야생형 미세조류에 비하여 현저히 높은 수준으로 변이주 미세조류에 포함되어 있으므로(도 6), 상기 인지질은 본 발명의 방법으로 제조된 미세조류를 종래의 방법으로 제조된 미세조류와 구별할 수 있는 주요 마커로서 사용될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 포함하는 바이오매스 및 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 바이오디젤을 제공한다.
본 발명의 용어 "바이오매스(biomass)"란, 광합성에 의하여 생성되는 다양한 조류(藻類) 및 식물 자원, 즉 나무, 풀, 농작물의 가지, 잎, 뿌리, 열매 등을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오매스는 스트레스 조건의 배지에서 배양되어 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류, 상기 미세조류를 포함하는 배양물, 배양분획물 등으로 해석될 수 있고, 상기 바이오매스는 바이오디젤의 제조원료로서 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 바이오디젤의 제조방법은 (a) 상기 바이오매스로부터 지질성분을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 지질에 메탄올을 가하고 알칼리 촉매하에서 반응시켜서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl)을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, FAME의 수율을 증가시키기 위하여 반응부산물인 글리세롤을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오디젤의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스로부터 지질성분을 수득하기 위하여는 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오매스에 포함된 미세조류를 건조시키고, 이를 물리적으로 파쇄하여 수득할 수도 있고, 상기 바이오매스에 유기용매를 가하여 미세조류로부터 지질성분을 추출할 수도 있다. 이때, 상기 용매로는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 헥산, DMSO(dimethyl sulfoxide), DMC(dimethyl carnonate) 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 바이오매스로부터 수득한 지질성분은 본 발명에서 제공하는 균체내 지질함량이 증대된 미세조류로부터 유래된 것이므로, PA(phosphatidic acid), PE(phosphatidyl-ethanolamine), PS(phosphatidylserine), MG(monoacylglycerol), EA(eicosadienoic acid) 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "바이오디젤(bio-diesel)"이란, 넓게는 식물성 기름을 원료로 해서 만든 무공해 연료를 통틀어 의미하고, 좁게는 콩기름 등의 식물성 기름을 원료로 사용하여 제조된 지방산메틸에스테르(FAME)를 의미한다. 상기 바이오디젤은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 대체로 중성지방에 알칼리 촉매와 함께 메탄올을 처리하여 제조될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 제조할 수 있고, 상기 제조된 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용할 수 있으므로, 바이오 디젤의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)로부터 자가포식을 유도하고, 자가포식 저해제를 처리한 경우, 지방구의 생성능을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, WT은 자가포식이 유도된 대조군의 미세조류를 나타내고, WT+R은 자가포식 유도후 라파마이신을 처리한 미세조류를 나타내며, WT+B는 자가포식 유도후 바필로마이신을 처리한 미세조류를 나타내고, WT+W는 자가포식 유도후 와트마닌을 처리한 미세조류를 나타낸다.
도 1b는 자가포식이 유도되지 않은 조건((+)48N) 또는 자가포식이 유도된 조건((-)48N)에서 배양된 야생형 클라미도모나스 속 미세조류(WT)에 라파마이신(R) 또는 와트마닌(W)의 처리에 따른 지방구의 함량(상단)과 이로부터 나타나는 녹색형광의 수준(하단)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 클라미도모나스 속 미세조류의 야생형 균주와 VPS34 유전자의 발현이 억제된 변이주를 질소 공급배지(+N) 또는 질소 결핍배지(-N)에서 배양한 경우, 지방구의 생성능을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, WT은 자가포식이 유도된 야생형 미세조류를 나타내고, T411은 VPS34 유전자의 발현이 억제된 변이주 미세조류를 나타낸다.
도 3a는 야생형 미세조류(WT), 빈 발현벡터가 도입된 형질전환 미세조류(Mock) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포수를 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 크기를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 종횡비(cell aspect ratio)를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3d는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 배양물의 색을 나타내는 사진이다.
도 3e는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 단위건조중량당 트리글리세라이드(TAG)의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3f는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포내 전분의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3g는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포내 총 단백질의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3h는 야생형 미세조류(WT), 빈 발현벡터가 도입된 형질전환 미세조류(Mock) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 단백질 단위 중량당 PI3P의 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 야생형 미세조류(WT)를 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, TEM 분석을 수행하여 세포내 구조를 분석한 결과는 나타내는 전자현미경 사진으로서, A는 자가소화포(autophagosome) 유사구조체를 나타내고, L은 지방구를 나타내며, S는 전분을 나타내고, V는 액포를 나타낸다.
도 4b는 변이주 미세조류(T411)를 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, TEM 분석을 수행하여 세포내 구조를 분석한 결과는 나타내는 전자현미경 사진이다.
도 5a는 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 5b는 라파마이신을 포함하는 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 5c는 질소 결핍배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 5d는 질소 결핍배지, 질소 공급배지 및 라파마이신이 포함된 질소 공급배지에서 배양된 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 5e는 질소 결핍배지, 질소 공급배지 및 라파마이신이 포함된 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 6a는 야생형 균주와 VPS34 유전자 발현억제 균주를 대상으로, 자가포식 유도에 따른 자가포식 조절과정에 관여하는 유전자의 발현수준 변화를 나타내는 히트맵 분석결과이다.
도 6b는 야생형 균주와 VPS34 유전자 발현억제 균주를 대상으로, 자가포식 유도에 따른 중성지방(TAG) 합성에 관여하는 유전자의 발현수준 변화를 나타내는 히트맵 분석결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미세조류의 지방구 생성에 미치는 자가포식 억제제의 효과
클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)를 TAP 배지에 접종하여 배양하고, 자가포식 현상을 유발시키기 위하여 상기 배지를 질소결핍 배지로 교체하였으며, 자가포식 저해제로 알려진 와트마닌(wortmannin)을 처리한 다음, BODIPY를 처리하여 지방구(lipid droplet, LD)를 녹색형광으로 염색하고, 클로로필α를 처리하여 액포(vacuole)를 적색형광으로 염색한 다음, 공초점 현미경으로 관찰하였다(도 1a). 이때, 대조군으로는 자가포식 저해제를 처리하지 않고 배양한 미세조류를 사용하였다.
도 1a는 클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)로부터 자가포식을 유도하고, 자가포식 저해제를 처리한 경우, 지방구의 생성능을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, WT은 자가포식이 유도된 대조군의 미세조류를 나타내고, WT+W는 자가포식 유도후 와트마닌을 처리한 미세조류를 나타내며, DIC는 DIC(differential interference contrast) 방법으로 촬영한 결과를 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, 자가포식이 유도된 대조군의 미세조류에 비하여, 자가포식 저해제를 처리한 경우에는 액포의 형성이 촉진될 뿐만 아니라 액포내 지방구의 생성 역시 현저히 증가됨을 확인하였다.
또한, 정상배지에서 배양하여 자가포식을 유도하지 않은 조건 또는 질소결핍 배지에서 배양하여 자가포식을 유도한 조건에서 상기 클라미도모나스 속 미세조류에 자가소화포(autophagosome) 생성억제제인 라파마이신(rapamycin) 또는 자가포식 저해제로 알려진 와트마닌(wortmannin)을 처리한 후, 동일한 방법을 수행하여, 지방구의 함량과 이로부터 나타나는 녹색형광의 수준을 비교하였다(도 1b).
도 1b는 자가포식이 유도되지 않은 조건((+)48N) 또는 자가포식이 유도된 조건((-)48N)에서 배양된 야생형 클라미도모나스 속 미세조류(WT)에 라파마이신(R) 또는 와트마닌(W)의 처리에 따른 지방구의 함량(상단)과 이로부터 나타나는 녹색형광의 수준(하단)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 자가포식이 유도되지 않은 경우에도 와트마닌은 세포내 지방축적을 유도하였으나, 라파마이신은 세포내 지방축적을 유도하지 않음을 확인하였다.
실시예 2: VPS34 유전자 발현이 억제된 변이주 미세조류의 특성 분석
자가포식 과정에 있어서, PI3K 관련 신호전달이 관여한다고 알려져 있으므로, 상기 PI3K 관련 신호전달에 관여하는 PI3K catalytic subunit type 3 단백질의 발현이 억제된 변이주 미세조류를 제작하고, 이의 특성을 분석하였다.
실시예 2-1: VPS34 유전자 발현이 억제된 변이주 미세조류의 제작
클라미도모나스 속 미세조류(Chlamydomonas reinfardtii CC124)에서 PI3K 관련 신호전달에 관여하는 PI3K catalytic subunit type 3 단백질을 코딩하는 VPS34 유전자의 발현을 억제하기 위하여 VPS34 유전자에 대한 siRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된, 변이주 미세조류인 T411 균주를 제작하였다. 상기 야생형 미세조류(W)와 변이주 미세조류(T411)를 각각 질소 공급배지(+N) 또는 질소 결핍배지(-N)에서 배양한 다음, 상기 실시예 1의 방법으로 형광염색하고, 그 결과를 공초점 현미경으로 확인하였다(도 2).
도 2는 클라미도모나스 속 미세조류의 야생형 균주와 VPS34 유전자의 발현이 억제된 변이주를 질소 공급배지(+N) 또는 질소 결핍배지(-N)에서 배양한 경우, 지방구의 생성능을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, WT은 자가포식이 유도된 야생형 미세조류를 나타내고, T411은 VPS34 유전자의 발현이 억제된 변이주 미세조류를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 질소 공급배지에서 배양된 경우에는 야생형 미세조류와 변이주 미세조류 모두 지질의 생성이 억제되었으나, 질소 결핍배지에서 배양된 경우에는 야생형 미세조류와 변이주 미세조류 모두 지질의 생성이 증가되었으며, 야생형 미세조류에 비하여 변이주 미세조류에서 지질의 생성량이 현저히 증가됨을 확인하였다.
실시예 2-2: VPS34 유전자 발현이 억제된 변이주 미세조류의 세포 특성 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 변이주 미세조류의 특성을 분석하기 위하여, 야생형 미세조류 또는 VPS34 유전자에 대한 siRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 빈 발현벡터가 도입된 형질전환 미세조류(Mock)과 다양한 세포특성(세포수, 세포크기, 세포 종횡비, 배양물의 색, 세포의 단위건조중량당 TAG의 비율, 전분함량, 총 단백질 함량 및 단위단백질당 PI3P의 활성)을 비교하였다(도 3a 내지 도 3h).
도 3a는 야생형 미세조류(WT), 빈 발현벡터가 도입된 형질전환 미세조류(Mock) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포수를 계수한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, 변이주 미세조류는 세포증식이 억제되어, 상대적으로 적은 수의 세포를 생성함을 확인하였다.
도 3b는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 크기를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3b에서 보듯이, 변이주 미세조류는 야생형 미세조류에 비하여 세포의 크기가 증가됨을 확인하였다.
도 3c는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 종횡비(cell aspect ratio)를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, 변이주 미세조류는 야생형 미세조류에 비하여 세포의 종횡비가 낮은 값을 나타내어, 상대적으로 원형에 더욱 가까운 형태를 나타냄을 확인하였다.
도 3d는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 배양물의 색을 나타내는 사진이다. 도 3d에서 보듯이, 질소 공급배지에서 배양할 경우에는 야생형 미세조류와 변이주 미세조류 배양물의 색이 동등한 수준의 녹색을 나타내어, 광합성이 원활하게 수행됨을 나타내었으나, 질소 결핍배지에서 배양할 경우에는, 야생형 미세조류와 변이주 미세조류의 배양물에서 나타나는 녹색이 감소되었고, 변이주 미세조류의 경우에는 야생형 미세조류 보다도 녹색이 더욱 감소되어 노란색을 나타내었으므로, 질소 결핍배지에서는 미세조류의 광합성이 원활하게 수행되지 않음을 알 수 있었다.
도 3e는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포의 단위건조중량당 트리글리세라이드(TAG)의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3e에서 보듯이, 변이주 미세조류는 야생형 미세조류에 비하여 TAG를 보다 높은 수준으로 생성하고, 이러한 특징은 질소 결핍배지에서 배양할 경우 더욱 현저히 나타남을 확인하였다.
도 3f는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포내 전분의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3f에서 보듯이, 변이주 미세조류는 야생형 미세조류에 비하여 세포내 전분함량이 보다 높은 수준을 나타내고, 이러한 특징은 질소 결핍배지에서 배양할 경우 더욱 현저히 나타남을 확인하였다.
도 3g는 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 세포내 총 단백질의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3g에서 보듯이, 질소 공급배지에서 배양한 경우에는 변이주 미세조류가 야생형 미세조류에 비하여 상대적으로 총 단백질 함량이 높은 수준을 나타내었으나, 질소 결핍배지에서 배양한 경우에는, 변이주 미세조류와 야생형 미세조류내 총 단백질의 함량이 동등한 수준을 나타냄을 확인하였다.
도 3h는 야생형 미세조류(WT), 빈 발현벡터가 도입된 형질전환 미세조류(Mock) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지((+)N) 또는 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 단백질 단위 중량당 PI3P의 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3h에서 보듯이, 전체적으로 질소 공급배지에서 배양한 경우보다는 질소 결핍배지에서 배양한 경우에, PI3P의 활성이 높은 수준을 나타내었고, 변이주 미세조류 보다는 야생형 미세조류에서 PI3P의 활성이 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: VPS34 유전자 발현이 억제된 변이주 미세조류의 구조적 특성 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 변이주 미세조류의 구조적 특성을 분석하기 위하여, 야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, 투과전자현미경(TEM)으로 세포내 구조를 분석한 후, 비교하였다(도 4a 및 4b).
도 4a는 야생형 미세조류(WT)를 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, TEM 분석을 수행하여 세포내 구조를 분석한 결과는 나타내는 전자현미경 사진으로서, A는 자가소화포(autophagosome) 유사구조체를 나타내고, L은 지방구를 나타내며, S는 전분을 나타내고, V는 액포를 나타낸다. 또한, 도 4b는 변이주 미세조류(T411)를 질소 결핍배지((-)N)에서 동일조건으로 배양한 다음, TEM 분석을 수행하여 세포내 구조를 분석한 결과는 나타내는 전자현미경 사진이다. 도 4a 및 4b에서 보듯이, 자가소화포 유사구조체는 야생형 미세조류에서만 관찰되었고, 변이주 미세조류에서는 관찰되지 않았으며, 지방구와 전분은 액포내에 존재함을 확인하였다.
실시예 2-4: 전사체 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류; 질소 공급배지 또는 질소 결핍배지에서의 배양; 및 자가소화포(autophagosome) 생성억제제인 라파마이신(rapamycin)의 처리여부의 3가지 조건을 상호 조합하여 각각의 배양물을 수득하고, 상기 수득한 각 배양물을 대상으로 일반 배양시보다도 2배 이상 발현수준이 증가된 전사체(transcript)를 분석하였다(도 5a 내지 5e).
도 5a는 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다. 도 5a에서 보듯이, 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류에서는 2,136개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었고, 질소 공급배지에서 배양된 야생형 미세조류에서는 2,544개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었으며, 13,061개의 전사체는 2배 이상 발현이 증가되지 않음을 확인하였다.
도 5b는 라파마이신을 포함하는 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다. 도 5b에서 보듯이, 라파마이신을 포함하는 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류에서는 1,331개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었고, 라파마이신을 포함하는 질소 공급배지에서 배양된 야생형 미세조류에서는 1,171개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었으며, 15,239개의 전사체는 2배 이상 발현이 증가되지 않음을 확인하였다.
도 5c는 질소 결핍배지에서 배양된 변이주 미세조류 또는 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다. 도 5c에서 보듯이, 질소 결핍배지에서 배양된 변이주 미세조류에서 3,274개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었고, 질소 결핍배지에서 배양된 야생형 미세조류에서 3,104개의 전사체가 2배 이상 발현이 증가되었으며, 11,363개의 전사체는 2배 이상 발현이 증가되지 않음을 확인하였다.
도 5d는 질소 결핍배지, 질소 공급배지 및 라파마이신이 포함된 질소 공급배지에서 배양된 야생형 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이고, 도 5e는 질소 결핍배지, 질소 공급배지 및 라파마이신이 포함된 질소 공급배지에서 배양된 변이주 미세조류에서 2배 이상 발현이 증가된 전사체를 분석한 결과를 나타내는 다이어그램이다. 도 5d 및 5e에서 보듯이, 동일한 조건에서 배양한 경우, 야생형 미세조류에 비하여 변이주 미세조류는 질소의 공급에 의하여 2배 이상 발현이 증가된 전사체의 수가 다소 증가하고, 질소가 공급되지 않은 경우에는 2배 이상 발현이 증가된 전사체의 수가 대폭 감소하였으나, 질소가 공급되더라도 라파마이신이 처리된 경우에는 2배 이상 발현이 증가된 전사체의 수가 현저히 감소됨을 확인하였다.
실시예 3: 히트맵 (Heat map) 분석
야생형 미세조류(WT) 또는 변이주 미세조류(T411)를 질소 공급배지(+N) 또는 질소 결핍배지(-N)에서 서로 동일한 조건으로 배양한 다음, 자가포식 조절과정에 관여하는 유전자(AMPK, ATG1, ATG12, ATG3, ATG4, ATG5, ATG7, ATG8, Cre02.g076900.v5.5, Cre10.g443550.v5.5 및 Cre16.g669800.v5.5), PI3K 서브유닛(VPS15, VPS30 및 VPS34) 및 중성지방(TAG) 합성에 관여하는 유전자(DGAT1, DGK, DGTT1, DGTT3, DGTT4 및 DGTT5)의 발현수준 변화를 히트맵 분석을 통해 확인하였다(도 6a 및 6b).
도 6a는 야생형 균주와 VPS34 유전자 발현억제 균주를 대상으로, 자가포식 유도에 따른 자가포식 조절과정에 관여하는 유전자의 발현수준 변화를 나타내는 히트맵 분석결과이다. 도 6a에서 보듯이, 자가포식 조절과정에 관여하는 유전자는 질소 결핍배지(-N)에서 배양할 경우, 야생형 미세조류(WT) 보다는 변이주 미세조류(T411)가 전체적으로 발현수준이 감소됨을 확인하였다. 특히, 자가포식 조절과정의 시작 단계에 작용하는 ATG1 및 ATG3 유전자는 매우 낮은 수준으로 발현수준이 감소됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, PI3K 서브유닛(VPS15, VPS30 및 VPS34)의 발현수준 역시 낮은 수준을 나타내었다.
상기 결과로부터, 변이주 미세조류(T411)를 질소 결핍배지(-N)에서 배양할 경우, 자가 포식과정 및 이에 관여하는 자가소화포(autophagosome)의 형성이 야생형 균주에 비하여 억제될 것으로 분석되었다.
도 6b는 야생형 균주와 VPS34 유전자 발현억제 균주를 대상으로, 자가포식 유도에 따른 중성지방(TAG) 합성에 관여하는 유전자의 발현수준 변화를 나타내는 히트맵 분석결과이다. 도 6b에서 보듯이, 중성지방(TAG) 합성에 관여하는 유전자는 질소 결핍배지(-N)에서 배양할 경우, 야생형 미세조류(WT) 보다는 변이주 미세조류(T411)가 전체적으로 발현수준이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, PI3K의 발현을 억제하는 균주는 자가포식이 유도된 경우에, 중성지방의 합성량이 증가함과 동시에 중성지방의 분해에 관여하는 자가소화포의 형성이 억제되어 자가포식과정이 억제됨으로써, 야생형 균주에 비하여 지질의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Process for preparing microalgae inhibiting autophagy and comprising increased lipid and starch contents <130> KPA150408-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amiFor <400> 1 ctagtctgcg acataaactt gtatgatctc gctgatcggc accatggggg tggtggtgat 60 cagcgctatc attcaagttt atgtcgcagg 90 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amiRev <400> 2 ctagcctgcg acataaactt gaatgatagc gctgatcacc accaccccca tggtgccgat 60 cagcgagatc atacaagttt atgtcgcaga 90

Claims (12)

  1. 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제하는 단계를 포함하는, 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 클로렐라 속 미세조류, 스티제오클로니움 속 미세조류 또는 클라미도모나스 속 미세조류인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자가포식 유도조건은 질소원의 결핍인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자가포식의 억제는 자가포식 저해제를 처리하여 수행하거나 또는 미세조류내 자가포식 과정에 관여하는 PI3K 관련 신호전달이 억제된 변이주 미세조류를 사용하여 수행하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자가포식 저해제는 와트마닌(wortammanin)인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 변이주 미세조류는 PI3K 관련 신호전달에 관여하는 PI3K 촉매 서브유닛 제3형(PI3K catalytic subunit type 3) 단백질의 발현이 억제된 미세조류인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 PI3K 촉매 서브유닛 제3형(PI3K catalytic subunit type 3) 단백질의 발현억제는 미세조류에 VPS34 유전자에 대한 siRNA를 처리하여 수행되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 siRNA는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되어, 자가포식이 억제되지 않은 야생형 미세조류에 비하여, 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류.
  10. 제9항의 균체내 지질 및 전분함량이 증대된 미세조류를 포함하는 바이오매스.
  11. 제10항의 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법.
  12. 미세조류를 자가포식 유도조건에서 배양하면서 자가포식을 억제하는 단계를 포함하는, 미세조류 균체내 지질 및 전분함량을 증대시키는 방법.
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