KR20190108359A - 오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 마우스 유래 전이성 대장암 세포주인 CT26 세포에 있어서, 세포자멸사를 유도하고, 상엽-간엽 전환, 이동성 및 침윤성 같은 전이능력을 억제하는 효능을 보유하며, 대장암 전이 마우스 모델에서 폐로의 전이를 억제하는 전이성 대장암의 억제 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물 {INHIBITORY EFFECT OF GALLA RHOIS EXTRACT ON COLORECTAL METASTASIS}
본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 마우스 유래 전이성 대장암 세포주인 CT26 세포에 있어서, 세포자멸사를 유도하고, 상엽-간엽 전환, 이동성 및 침윤성 같은 전이능력을 억제하는 효능을 보유하며, 대장암 전이 마우스 모델에서 폐로의 전이를 억제하는 전이성 대장암의 억제 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
대장암은 대장에 생기는 악성종양으로, 세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC) 보고서에 따르면, 한국의 대장암 발병률은 10만 명당 45명으로 세계 1위이다. 중앙암등록본부에서 발표한 암등록 통계를 보면 2014년에 우리나라에서는 217,057건의 암이 발생했는데, 그 중 대장암은 26,978건으로 전체의 12.4%로 3위를 차지할 정도로 발병률이 높다. 대장암으로 인한 사망률 또한 암종별 사망자수의 4위를 차지할 정도로 높다.
대장암의 위험 요인으로는 육류 및 육가공품의 다량섭취와 같은 식습관의 서구화, 비만, 음주, 유전, 50세 이상의 연령 및 만성 염증성 대장 질환 등이 알려져 있다. 대장암의 증상으로는 배변 습관의 변화, 설사, 변비, 후중감, 점액변, 복부 불쾌감, 식욕 부진, 오심, 구토, 체중 감소 등이 존재한다.
대장암의 치료는 기본적으로 절제술을 하고 암의 병기에 따라 항암화학요법이나 방사선 치료를 적절히 병행한다. 하지만 근치적 절제술을 시행해도 20 ~ 50%에서 재발이 나타나고 절제술 후에 폐합병증, 문합부 누출, 장폐색, 배뇨장애, 항문 주위의 통증, 상처의 염증 등이 부작용으로 나타나기도 한다.
한편, 대장암의 전이는 암이 악성화 되면서 대장암 세포가 혈관이나 림프관을 타고 다른 장기로 전파되는 것이다. 대장암의 전이는 40 ~ 60% 환자에게서 발생하고, 주로 폐 또는 간으로 전이가 일어난다. 원격 전이가 발생할 경우 수술이 어려워 생존율이 매우 낮다. 따라서 한계와 부작용이 많은 현재의 치료법을 보완하고, 수술이 어렵고 예후가 좋지 않은 대장암의 전이 예방 및 치료를 위한 새로운 치료 가능성을 가진 물질을 발굴하기 위한 연구가 필요하다.
한편, 오배자(Galla Rhois)는 오배자면충이 옻나무과의 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 기생하여 만든 벌레집으로 문합(文蛤), 백충창(白蟲倉)이라고도 한다. 옻나무과에 속하는 낙엽성 교목인 붉나무의 잎에 생긴 벌레집을 말려서 사용한다. 벌레집이 생기는 과정은 다음과 같다. 9월 하순 벌레집에 구멍을 뚫고 나온 날개 있는 암벌레는 중간숙주인 선태류(Minum versicatum, M. trichomane)에 새끼벌레를 낳는다. 새끼벌레는 선태류의 즙을 빨아 먹고 자라서 흰 납으로 벌레집을 만들고 겨울을 난다. 다음해 봄에 번데기가 되고 4월 하순 번데기에서 나와 날개 있는 암벌레가 된다. 암벌레는 교미 후 붉나무의 가지에 날개 없는 암수컷의 새끼벌레를 낳고 죽는다. 날개 없는 암벌레는 어린잎에 옮겨가 기생하는데 이때에 벌레집이 자란다. 이때 그 크기가 본래의 5 배나 되기 때문에 오배자라는 이름이 붙었다고 한다. 이른 가을 벌레가 나가기 전에 벌레집을 따서 증기에 쪄서 벌레를 죽인 후 말린다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3∼7 ㎝, 폭 2∼5㎝, 두께 2 ㎜ 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 찐다. 주성분은 피로가롤 탄닌(pyrogallol tannin)이 50~70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산(gallic acid) 등이 있다.
오배자는 지혈, 항아나필락시스, 항균, 항바이러스, 항염 작용을 한다고 알려져 있으나, 전이성 대장암 억제에 관한 효과에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다.
이하, 선행기술을 살펴보면 대한민국 등록특허공보 제10-1008922호에는 조각자 가시 추출물을 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 대해 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1078002호에는 오배자 추출물을 함유하는 자가포식을 기전으로 한 비만 예방 및 치료용 조성물에 대해 개시되어 있다.
그러나 상기 선행기술들은 오배자 추출물을 이용한 대장암 전이 억제 및 치료에 관해서는 개시하고 있지 않다.
1. 대한민국 등록특허공보 제10-1420268호(2014.07.17.) 2. 대한민국 등록특허공보 제10-1078002호(2011.10.31.)
본 발명은 오배자 추출물이 대장암의 폐 전이를 억제하는 효능을 실험으로 증명한 것이며, 전이성 대장암 억제에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 오배자(Galla Rhois)추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물을 과제 해결을 위한 수단으로 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기한 과제를 보다 효과적으로 해결하기 위하여 오배자(Galla Rhois)추출물을 유효성분으로 한 CT26세포의 억제 및 치료용 약제학적 조성물을 과제 해결을 위한 또 다른 수단으로 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 붕해재, 희석제, 부형제 중 선택되는 약제학적으로 허용 가능한 염을 더 포함하는 것을 특징으로 한 CT26세포의 억제 및 치료용 약제학적 조성물.
본 발명에 따른 조성물은, 마우스 유래 전이성 대장암 세포주인 CT26 세포에 있어서, 세포자멸사를 유도하는 효능 및 상피-간엽 전환과 이동성·침윤성을 포함하는 전이능력을 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 대장암 전이 마우스 모델에서 대장암의 전이를 억제하는 효과가 있다.
도 1은 오배자 물 추출물이 마우스 유래 전이성 대장암 세포주 CT26 세포 및 인간 유래 대장암 세포주 HT29 세포의 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2는 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 및 HT29 세포에 미치는 영향을 현미경상으로 관찰한 사진이다.
도 3은 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 세포자멸사를 유도하는지를 Annexin V assay를 통해 확인한 그림이다.
도 4는 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 세포자멸사를 일으키는 경로를 Western blot analysis를 통해 알아본 그림이다.
도 5는 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 상피-간엽 전환(EMT) 관련 인자들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 Real-Time RT-PCR을 통해 알아본 그래프이다.
도 6은 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 이동성에 미치는 영향을 Wound healing assay를 통해 현미경상으로 관찰한 사진이다.
도 7은 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 침윤성에 미치는 영향을 Matrigel invasion assay를 통해 현미경상으로 관찰한 사진이다.
도 8은 오배자 물 추출물의 처리가 CT26 세포에서 이동성 및 침윤성 관련 인자들의 발현을 Real-Time RT-PCR로 실험하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 CT26 세포를 꼬리정맥주사를 통해 BALB/C 마우스의 폐로 전이시킨 동물 모델에서, 오배자 물 추출물의 투여로 나타나는 전이 억제 효과를 실험한 사진 및 그래프이다.
이하 본 발명을 도면과 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서 오배자 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 물을 이용하여 추출할 수 있다.
추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등 이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 대장암 치료용 조성물은 유효성분과 함께 추가로 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체를 첨가하여 약제로 제조할 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다.
본 발명의 오배자 추출물을 약제화하기 위한 제제는 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성병, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하고, 일반적으로 그 유효 용량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 1 내지 500 ㎎/㎏이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 1 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하며, 하루 2-3 회 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 오배자상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 약제혼합, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변화될 수 있다.
실시예 1. 오배자 추출물의 제조
오배자(Galla Rhois)는 2017년 10월 지리산에서 수확된 것을 선별하여 수세 및 60℃에서 건조하였다. 상기 건조된 오배자 시료를 균일하게 분쇄한 후 10배의 증류수를 가하고 순환추출장치를 이용하여 90℃에서 9시간동안 추출하였다. 그 후 상기 추출액을 0.4 μm로 여과한 후, 진공 증발 및 동결건조하여 오배자 추출물 시료를 준비하였다.
실험예 1. 세포 생존률 측정
세포 생존률 실험은 WST assay를 이용하여 측정하였다. 마우스 유래 전이성 대장암 세포인 CT26 2×103개/well을 96-well plate에 넣고 하룻밤 안정화시킨 후 오배자 물 추출물(GRWE)을 농도별로 처리한다. 5% CO2와 37℃의 환경으로 조절되는 세포 배양기에서 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium을 사용하여 24-72시간 동안 배양한 후 각 well의 배양액을 제거하고 새로운 세포 배양액 및 WST-8 시약을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨다. 흡광도를 측정하여 각 농도에서의 세포 생존율을 확인하였다 (도 1).
도 1을 참조하면, 오배자 물 추출물(GRWE) 농도의 전구간에서 CT26 세포 생존율이 감소하였음을 확인할 수 있다. 특히, CT26를 GRWE의 농도 40~100μg/ml로 처리하였을 때 CT26 세포 생존율이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있다. 또한, 오배자 물 추출물(GRWE) 농도의 전구간에서 HT29 세포 생존율이 감소하였음을 확인할 수 있다. 특히, HT29를 GRWE의 농도 40~100㎍/ml로 처리하였을 때 세포 생존율이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있다.
또한, 도 2를 참조하면, 현미경 상으로도 오배자 물 추출물 농도 의존적으로 CT26 및 HT29 세포의 밀도가 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
오배자 처리 24시간 후
오배자 농도 CT26 생존율(평균) HG29 생존율(평균)
20 ㎍/ml 0.8832 0.8752
40 ㎍/ml 0.8124 0.4721
60 ㎍/ml 0.8001 0.3088
80 ㎍/ml 0.7911 0.3575
100 ㎍/ml 0.6958 0.3821
오배자 처리 48시간 후
오배자 농도 CT26 생존율(평균) HG29 생존율(평균)
20 ㎍/ml 0.6124 0.8110
40 ㎍/ml 0.5736 0.4013
60 ㎍/ml 0.4066 0.1799
80 ㎍/ml 0.3847 0.1750
100 ㎍/ml 0.2723 0.1712
오배자 처리 72시간 후
오배자 농도 CT26 생존율(평균) HG29 생존율(평균)
20 ㎍/ml 0.6021 0.8095
40 ㎍/ml 0.2938 0.2857
60 ㎍/ml 0.2201 0.1869
80 ㎍/ml 0.1763 0.1713
100 ㎍/ml 0.1310 0.1654
상기 표 1 내지 3에서 오배자를 처리하지 않은 대조군의 대장암 세포의 생존수를 기준으로 하여 각각의 오배자 처리농도에 따른 24, 48 및 72시간 후의 대장암 세포의 상대적 생존율을 기재하였다.
그 결과, 표 1 내지 3에서 나타난 바와 같이, 오배자의 처리 농도가 높을수록 CT26세포 및 HG29세포의 성장이 감소하였으며, 이로부터 오배자가 대장암 치료 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 오배자 처리 72시간 후 20 ㎍/㎖에서 40%, 40 ㎍/㎖에서 70.9%, 60 ㎍/㎖에서 78%, 80 ㎍/㎖에서 82%, 100㎍/㎖에서 87%로 대장암 세포를 사멸시켰다.
이와 같이, 본 발명의 오배자 추출물은 우수한 CT26세포 및 HG29세포 사멸 활성을 가지며, 나아가 대장암 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 입증한다.
실험예 2. CT26 세포에서의 세포자멸사 유도 여부 확인
오배자 물 추출물 처리에 의한 CT26 세포의 생존율 감소가 세포자멸사 유도에 인한 것인지 확인하기 위해 Annexin V assay를 하였다. CT26 세포를 6-well plate에 5×105개/well만큼 넣고 하룻밤 안정화시킨 후에 오배자 물 추출물을 농도별로 24시간동안 처리하였다. 트립신으로 세포를 떼어내 세포수를 센 후 1×106개/ml의 세포를 MuseTM Annexin V & Dead Cell Reagent와 1:1의 비율로 섞어 20분간 실온에서 반응시킨다. MuseTM Cell Analyzer 기기로 자멸사된 세포를 측정한다 (도 3).
도 3를 참조하면, 오배자 물 추출물 농도 50~100㎍/ml에서 농도 의존적으로 세포 자멸사 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있다. 따라서 실험예 1의 세포 생존율 감소의 주요한 원인은 세포 독성이 아니라 세포 자멸사에 의한 것임을 알 수 있다.
실험예 3. CT26 세포에서의 세포자멸사 유도 경로 확인
CT26 세포를 6-well plate에 5×105개/well만큼 넣고 하룻밤 안정화시킨 후 오배자 물 추출물을 농도별로 24시간동안 처리하였다. PBS로 각 well의 배양액을 씻어내고 lysis buffer를 넣어서 세포를 용해시키면서 scraper을 사용하여 회수하여 13,000rpm으로 10분간 원심분리한다. 상층액을 따서 정량한 후 여기에 2X sample buffer를 첨가하여 95℃에서 5분간 가열하여 샘플링한다. 샘플을 SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동으로 크기별 분류를 하고 immunobilon-P transfer membrane에 옮긴다. Membrane을 0.1% PBST 용액에 5% skim milk가 함유된 buffer로 상온에서 1시간 30분동안 blocking하고, 1차 항체를 3시간 이상 반응시킨 후 0.1% PBST 용액으로 15분마다 1번씩 총 3번 씻어내었다. 2차 항체는 45분간 반응시키고 0.1% PBST 용액으로 1시간 이상 씻어낸 다음 ECL detection 용액을 사용하여 밴드를 확인하였다 (도 4).
도 4를 참조하면, 오배자 물 추출물이 세포 자가 사멸 관련 단백질(Caspase-3 및 PARP)의 활성도에 영향을 미침을 확인할 수 있다.
오배자 물 추출물 농도 의존적으로 Caspase-3가 활성화되고, PARP의 분절이 유도되며, 세포 자멸을 저해하는 단백질인 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 오배자 물 추출물은 세포 자멸사 유도 단백질의 발현을 촉진하여 세포 자멸을 촉진함을 확인할 수 있다.
실험예 4. CT26 세포에서 상피-간엽 전환 관련 인자들의 발현 정도 확인
CT26를 6-well plate에 5×105개/well만큼 넣고 하룻밤 안정화시킨 후 오배자 물 추출물을 세포생존율에 영향이 없는 농도로 24시간 처리한다. 상피-간엽 전환 관련 인자(E-cadherin, N-cadherin, vimentin, snail, slug, twist)의 mRNA 발현 정도를 real-time RT-PCR로 확인하였다 (도 5).
도 5를 참조하면, 오배자 물 추출물 농도 의존적으로 E-cadherin의 발현이 증가하고, N-cadherin의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 오배자 물 추출물 농도 의존적으로 vimentin, snail, slug 및 twist의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 특히, 오배자 물 추출물 5~10㎍/ml에서 E-cadherin의 발현이 증가하고, vimentin이 감소하는 양상이 현저하였음을 알 수 있다.
실험예 5. CT26 세포의 이동 능력에 미치는 영향 확인
이동 능력(migration)에 대한 오배자 물 추출물의 영향을 알아보기 위해 wound healing assay를 수행하였다. CT26 세포를 6-well plate에 1×106개/well만큼 넣고 하룻밤 안정화시킨 후 세포가 80-90% 증식하면 200 μl pipet tip을 이용하여 직선으로 스크래치를 내었다. PBS로 한번 씻어내고 FBS가 포함되지 않은 배양액으로 교체해준 다음 오배자 물 추출물을 농도별로 24시간동안 처리한다. 세포들의 이동 양상을 현미경으로 사진을 찍는다 (도 6).
도 6을 참조하면, 오배자 물 추출물 농도 의존적으로 CT26의 이동 능력이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6. CT26 세포의 침윤 능력에 미치는 영향 확인
침윤 능력(invasion)에 대한 오배자 물 추출물의 영향을 알아보기 위해 matrigel invasion assay를 수행하였다. 24-well plate의 well 안에는 FBS가 포함된 배양액을 넣고 그 위에 CT26 세포를 (2×106개) FBS가 포함되지 않은 배양액에 든 상태로 200 μl씩 matrigel-coated transwell chamber에 넣는다. 오배자 물 추출물을 처리하고 24시간 후 세포들의 침윤 양상을 Giemsa staining으로 염색하여 현미경으로 사진을 찍는다 (도 7).
도 7을 참조하면, 오배자 물 추출물 농도 의존적으로 CT26의 침윤능력이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. CT26 세포의 이동 및 침윤 능력 관련 인자의 발현 변화 확인
이동 및 침윤 능력에 관련된 인자인 MMPs의 mRNA 발현 정도를 알아보기 위해 real-time RT-PCR을 이용하여 확인하였다. CT26 세포를 6-well plate에 5×106개/well만큼 넣고 하룻밤 안정화 시켜서 오배자 물 추출물을 농도별로 24시간동안 처리한 다음 세포를 회수하여 RNA 추출 및 cDNA 합성을 거쳐 PCR 반응을 통해 mRNA 발현량을 확인하였다 (도 8).
도 8을 참조하면, 오배자 물 추출물 처리 후 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 감소하였음을 확인할 수 있다. 특히, 오배자 물 추출물 농도 5~10㎍/ml에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있다. 이에 근거하여 CT26 세포의 이동 및 침윤 능력이 감소했다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 8. CT26 세포의 BALB/c 마우스에서 폐로의 전이 억제 여부 확인
4주령 암컷 BALB/c 마우스를 구입하고 1주일 동안 실험환경에서 적응시켰다. 12시간 간격으로 낮과 밤을 조절해 주었으며 동물실험시설에서 자유 식이로 물과 먹이를 공급하였다. 모든 실험은 원광대에서 승인한 동물실험 윤리를 준수하였다 (WKU16-11). 배양한 CT26 세포를 회수한 후 1×106개만큼 1ml PBS에 넣는다. 세포를 pipetting한 후 200 μl씩 마우스 꼬리 정맥에 투여하여 실험적 폐전이 모델을 만든다. 오배자 물 추출물은 CT26 세포 주입 2시간 전에 구강으로 투여하고, 이후에는 하루에 한 번씩 실험 종료 시까지 구강으로 투여한다. 암 세포 주입 14일 후 마우스를 해부하여 폐를 절제하고 무게와 결절 수를 측정해서 전이 양상을 그래프로 나타내었다 (도 9).
도 9를 참조하면, 오배자 물 추출물 250mg/kg 및 500mg/kg를 14일간 구강 투여한 결과 농도 의존적으로 결절 수가 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, 사진으로 보아도 종양의 전이 양상이 급격이 감소되었음을 확인할 수 있다.
실험예 9. 오배자 추출물에 의한 급성독성 시험
본 발명에 이용된 오배자는 널리 약재로 이용되고 있어서 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 오배자 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 3.5 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 오배자 추출물은 모두 마우스에서 3.5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 3.5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

Claims (3)

  1. 오배자(Galla Rhois)추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물.
  2. 오배자(Galla Rhois)추출물을 유효성분으로 한 CT26세포의 억제 및 치료용 약제학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 붕해재, 희석제, 부형제 중 선택되는 약제학적으로 허용 가능한 염을 더 포함하는 것을 특징으로 한 CT26세포의 억제 및 치료용 약제학적 조성물.
KR1020180029779A 2018-03-14 2018-03-14 오배자 추출물을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료용 약제학적 조성물 KR20190108359A (ko)

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KR101078002B1 (ko) 2007-11-13 2011-10-31 주식회사 아이지에스 오배자 추출물을 함유하는 자가포식을 기전으로 한 비만 예방 및 치료용 조성물
KR101420268B1 (ko) 2012-08-17 2014-07-17 경희대학교 산학협력단 오배자 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물

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