KR20190098344A - 항염증 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쇠똥구리로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효 성분으로 하는 항염증 화장료 조성물에 관한 것으로, 리포폴리사카라이드에 의한 대식세포의 활성화 유도를 억제한다.

Description

항염증 화장료 조성물 {Anti-inflammatory cosmetic composition}

본 발명의 기술 분야는 항염증 화장료 조성물에 관한 것으로, 특히 쇠똥구리로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효 성분으로 하는 항염증 화장료 조성물에 관한 것이다.

한국공개특허 제10-2015-0141025호(2015.12.17 공개)는 애기뿔쇠똥구리와 같은 곤충으로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3을 유효 성분으로 하여 항주름 작용을 할 수 있는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3을 이용한 항주름 화장료 조성물에 관하여 개시되어 있다. 개시된 기술에 따르면, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3을 유효 성분으로 하여 주름과 피부 노화를 방지할 수 있다.

한국공개특허 제10-2015-0050631호(2015.05.11 공개)는 초기-염증성 인자(pro-inflammatory mediator)의 생성 및 발현 억제를 유도함으로써 염증으로 유발되는 피부질환의 예방 및 개선을 위한 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3을 함유하는 항염증 화장료 및 피부외용제 조성물에 관하여 개시되어 있다. 개시된 기술에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3을 합성하고, 합성된 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3이 포유류 정상세포에 대하여 세포독성을 갖지 않으며, 항염증을 갖는 것을 특징으로 한다.

종래의 기술에서는, 콜라겐의 경우에, 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서, 세포외 간질에 존재하며, 그의 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유 시)의 유도 등이 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광 노화에 의해 감소하며, 이것은 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 최근 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구가 발전되면서 피부에서 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다. 그리고 콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 유효성분들로는, 콜라겐 합성 촉진 물질로서, 예를 들어 레티노산(retinoicacid), TGF(transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 알려져 있다. 그러나 이러한 유효성분들은, 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량이 제한되어 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능을 개선하는 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

종래의 기술에서는, 생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성 산소의 경우에, 생체의 노화를 촉진시키거나, 암을 발생시키는 등 많은 문제의 원인이 된다. 따라서 활성 산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대한 개발 및 연구가 많이 이루어지고 있다. 여기서 항산화 물질은, 동물계나 식물계에 널리 분포되어 있고, 과일과 채소에 많은 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄 등이 알려져 있다. 그러나 천연에 존재하는 항산화 물질은, 피부 적용 시 실질적으로 충분한 효과를 기대할 수 없는 실정이다. 따라서 항산화력이 뛰어나고 가격이 저렴한 합성 항산화제가 많이 사용되고 있으나, 이 또한 인체 부작용 등의 안전성에 대한 우려로 그 사용이 제한된다.

종래의 기술에서는, 염증의 경우에, 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로서, 자외선이나 활성산소, 자유라디칼 등의 산화적 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다. 혈관 활성 폴리펩타이드인 키닌(kinin), 플라스민(plasmin), 보체 (complement) 등이 혈관 확장과 수축 및 주화성(chemotaxis) 작용을 하고, 그 외에 인터루킨-6(IL-6) 등과 같은 림포카인과 아라키돈산(arachidonic acid) 등이 염증 반응을 담당한다. 여기서 아라키돈산은 싸이클로옥시게나아제(cyclooxygenase) 혹은 리포옥시게 나아제(lipooxygenase)의 2가지 경로를 거쳐 염증 매개체인 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(lukotriene)들로 대사되어 다양한 염증 반응을 매개한다. 이에, 염증을 소실시키기 위해서 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 '항염제'라 한다. 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는, 비스테로이드 계통으로 플루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고, 스테로이드 계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone) 등이 있다. 또한, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손 등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이러한 물질은 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량이 제한되어 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

한국공개특허 제10-2015-0141025호 한국공개특허 제10-2015-0050631호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 전술한 바와 같은 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 쇠똥구리로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효 성분으로 하는 항염증 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하는 수단으로는, 본 발명의 한 특징에 따르면, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효성분으로 포함하는 항염증 화장료 조성물을 제공한다.

일 실시 예에서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 쇠똥구리로부터 분리된 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 리포폴리사카라이드에 의한 대식세포의 활성화 유도를 억제하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 자동화 고상 펩티드 합성기를 이용하여 98(%) 이상의 순도로 합성한 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 다이 설파이드 구조의 이량체 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 항염증 화장료 조성물은, 세포 배양, 세포 생존력에 대한 MTT 분석, 산화질소 생산량 측정, 서양 얼룩 분석, 그리고 iNOS, COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정을 거쳐 제조된 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 세포 배양은, 마우스 유래 대식세포와, 10 % FBS와 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여, 37 ℃ 및 5 % CO2에서 수행하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 MTT 분석은, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)에 대한 세포 독성을 MTT 방법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 MTT 분석은, 마우스 유래 대식세포를 96-웰 플레이트에 5 x 104 세포/ml로 도말하고, 1, 5, 10, 25, 50, 100μg/ml의 농도로 24시간 동안 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)로 처리하며, MTT 용액을 37 ℃ 및 5 % CO2에서 4시간 동안 배양한 다음에, 540nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 산화질소 생산량 측정은, 농도를 그리이스 시약으로 측정하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 산화질소 생산량 측정은, 마우스 유래 대식세포를 5 ㅧ 105 세포/ml의 DMEM 배지에서 배양하고, 6-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양하며, 배양물의 상청액을 얻은 후에, 그리이스 시약과 반응시켜 ELISA 리더로 540nm의 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 서양 얼룩 분석은, iNOS 단백질 발현 량을 결정하기 위해, DMEM 배지를 사용하여 마우스 유래 대식세포를 5 x 105 세포/ml 6웰에 접종하고, 5 % CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며, 세포를 1μg/ml LPS로 처리하고, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)로 5, 25, 50 또는 100μg/ml로 1시간 처리하며, 24시간 후, 배지를 제거하고 인산염 완충식염수로 2회 세척하고, 단백질을 용균완충액으로 추출하고 원심 분리하여 상청액을 얻으며, 상청액을 단백질정량실험으로 정량하고, 10% SDS-PAGE를 수행하며, 단백질을 니트로 셀룰로스 막으로 옮기고, 막을 5% 탈지유로 1시간 동안 블로팅한 다음에, 10분마다 완충액으로 3회 세척하며, 각 2차 항체를 1:1,000으로 희석하고 실온에서 2시간 반응시키며, 완충액으로 10분간 3회 세척한 후, 다빈치웨스턴이미징시스템을 이용하여 전개 및 정량을 수행하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 iNOS, COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정은, 정량 실시간 PCR에 사용되는 PCR 프라이머의 서열을 측정하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 항염증 화장료 조성물은, 화장수, 로션, 에센스, 젤, 연고 중 적어도 하나 또는 그 이상으로 제형되는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 화장수는, 유연 화장수와 수렴 화장수 중 어느 하나인 하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 0.1 내지 5 중량%로 함유되는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 유연 화장수는, 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 4.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 1.0중량%의 에탄올, 0.5중량%의 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르를 포함하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 수렴 화장수는, 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 구연산, 1.0중량%의 에탄올, 1.0중량%의 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 1.0중량%의 소르비톨을 포함하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 로션은, 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 7.0중량%의 스쿠알란, 2.0중량%의 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄, 1.5중량%의 트리에탄올아민, 0.5중량%의 글리세릴스테아레이트, 0.2중량%의 스테아릴글리시레티네이, 0.1중량%의 카르복시비닐폴리머, 0.1중량%의 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 에센스는, 0.5중량%의 코프리신, 5.0중량%의 솔비톨, 4.0중량%의 폴리옥시에틸렌글리콜 1500, 2.0중량%의 에탄올, 2.0중량%의 폴리옥시에틸렌소르비탄글리세린, 5.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 1.0중량%의 폴리옥시에틸렌 올레일 알코올 에테르, 0.3중량%의 올리브유, 0.2중량%의 히아루론산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 젤은, 0.5중량%의 코프리신, 7.0중량%의 에탄올, 3.0중량%의 글리세린, 3.0중량%의 프로필렌글리콜, 0.1중량%의 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 0.3중량%의 카르복시폴리머, 0.3중량%의 트리에탄올아민을 포함하는 것을 특징으로 한다.

일 실시 예에서, 상기 연고는, 3.0중량%의 코프리신, 1.0중량%의 세토스테아릴알코올, 3.0중량%의 자기유화형 모노스테아린산, 2.0중량%의 스테아린산, 5.0중량%의 밀납, 6.0중량%의 스쿠알란, 2.0중량%의 모노스테아린 글리세린, 1.0중량%의 모노스테아린산 소르비탄, 4.0중량%의 폴리솔베이트 80, 4.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 프로필렌글리콜을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 효과로는, 쇠똥구리로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효 성분으로 하는 항염증 화장료 조성물을 제공함으로써, 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성에 문제가 없으면서도 항염증에 탁월하다는 것이다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물 제조 시의 실험을 설명하는 도면이다.
도 2는 도 1에 있어서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 합성 절차를 나타낸 도면이다.
도 3은 도 1에 있어서 LPS 자극 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)에 의한 아질산염 생성 억제를 나타내는 도면이다.
도 4는 도 1에 있어서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 실시간 PCR을 나타내는 도면이다.
도 5는 도 1에 있어서 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 IκB-α, pIκB-α 단백질 발현율을 나타내는 도면이다.
도 6은 도 1에 있어서 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 NF-κB, pNF-κB 단백질 발현율을 나타내는 도면이다.
도 7은 도 1에 있어서 IkKα/β 대식세포에서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 pIkKα/β 단백질 발현율을 나타내는 도면이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시 예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시 예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시 예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.

본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다.

"제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결될 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 한편, 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.

단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.

이제 본 발명의 실시 예에 따른 항염증 화장료 조성물에 대하여 도면을 참고로 하여 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물 제조 시의 실험을 설명하는 도면이며, 도 2는 도 1에 있어서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 합성 절차를 나타낸 도면이며, 도 3은 도 1에 있어서 LPS 자극 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)에 의한 아질산염 생성 억제를 나타내는 도면이며, 도 4는 도 1에 있어서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 실시간 PCR을 나타내는 도면이며, 도 5는 도 1에 있어서 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 IκB-α, pIκB-α 단백질 발현율을 나타내는 도면이며, 도 6은 도 1에 있어서 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 NF-κB, pNF-κB 단백질 발현율을 나타내는 도면이며, 도 7은 도 1에 있어서 IkKα/β 대식세포에서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 pIkKα/β 단백질 발현율을 나타내는 도면이다.

도 1 내지는 도 7을 참조하면, 본 발명의 실시 예에 따른 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물 제조 시의 실험은, 세포 배양(cell culture)(S101), 세포 생존력에 대한 MTT 분석(S102), 산화질소 생산량 측정(S103), 서양 얼룩 분석(S104), 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정(S105)을 포함하여 이루어질 수 있다. 그리고 새로운 항염증 효능을 가지는 천연 제품에 대한 지속적인 탐색의 일환으로, 쇠똥구리에서 분리(또는, 파생)된 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 항염증 효과를 이하에서 검증하도록 한다.

본 발명의 실시 예에 따른 항염증 화장료 조성물은, 코프리신(coprisin) 펩티드 유도체(CopA3)를 유효성분으로 포함하여 이루어진다.

코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 쇠똥구리(copris tripartitus)로부터 유래한 것이다. 여기서, 코프리신은 쇠똥구리에서 분리되는 43개 아미노산으로 구성된 천연 펩티드이며, 쇠똥구리에서 분리(또는, 파생)된 코프리신, 디펜신(defensin)과 같은 펩티드들은 박테리아 면역에 대한 특성을 가지고 있다. 그리고 쇠똥구리는, 목초지에서 우분을 지하로 운반함으로써, 우분을 발생원으로 하는 파리의 발생 억제, 토양의 비옥화, 물리성 개선, 우분과 함께 배설된 가축 내부 기생충 방제, 쇠똥구리가 활동한 토양에서의 식물체 생장 촉진 등으로 생태계에 있어 매우 중요한 경제 곤충의 하나로 꼽히고 있다.

일 실시 예에서, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)에 의한 대식세포의 활성화 유도를 억제해 줄 수 있다.

일 실시 예에서, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는, 도 2에 도시된 비와 같이, 애니젠(AnyGen)(Kwang-ju, Korea)사에서 자동화된 고상 펩티드 합성기(Pioneer Applied Biosystems, Foster, CA)를 이용하여 98(%) 이상의 순도로 합성한 것을 사용할 수 있다. 이때, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 다이 설파이드 구조의 이량체 형태는, HPLC(high performance liquid chromatography; 고성능액체크로마토그래피) 및 ESI(electrospray ionization) 질량 분석에 의해 펩티드 용액을 분석함으로써 확인할 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에 필요한 화학제품으로는, FBS(fetal bovine serum)(HYCLONE, LOGAN, USA), LPS(lipopolysaccharide), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's mininlum essential medium), 그리이스 시약(Griess reagent), MTT(항종양 세포 독성)(SIGMA)시약, TRIzol™(tri-reagent), 엔자놀믹스(TOPscript™ RT DryMIX). 세포 배양균 등이 있으며, BD 팔콘(Falcon)(CA, USA)에서 구입한 것이다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에 필요한 항체로는, BD 바이오사이언스(Biosciences)(NJ, USA)로부터 수득한 항-유도성 NO 합성효소(iNOS) 항체, 케이맨화학(Cayman Chemical)(MI, USA)에서 구입한 항-COX-2 항체, 산타크로즈바이오텍(Santa Cruz Biotech)(CA, USA)에서 구입한 Anti-NFκB (H-286), 항IKKα / β, anti-β-actin (C4) 항체, 셀시그널링테크롤로지(Cell Signaling Technology)(MA, USA)에서 구입한 항-phospho-IκBα(Ser32), 항-IκBα(L35A5), 항-phospho-IKKα / β 항체 등이 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 세포 배양(S101)의 경우, 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입한 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)와, 10 % FBS와 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여, 37 ℃ 및 5 % CO2에서 세포 배양을 수행할 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 세포 생존력에 대한 MTT 분석(S102)의 경우, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)에 대한 세포 독성을 MTT 방법으로 측정할 수 있다. 이때, 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)를 96-웰 플레이트에 5 x 104 세포/ml로 도말하고, 1, 5, 10, 25, 50, 100μg/ml의 농도로 24시간 동안 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)로 처리할 수 있다. 그리고 MTT 용액을 37 ℃ 및 5 % CO2에서 4시간 동안 배양한 다음에, 540nm에서의 흡광도를 ELISA(enzyme-linked immunospecific assay) 판독기를 사용하여 측정할 수 있다. 대조군의 세포 생존율은 백분율로 나타낼 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 산화질소 생산량 측정(S103)의 경우, 농도를 그리이스 시약(Griess reagent)으로 측정할 수 있다. 이때, 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)를 5 ㅧ 105 세포/ml의 DMEM 배지에서 배양하고, 6-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양할 수 있다. 그리고 배양물의 상청액(supernatant)을 얻은 후에, 그리이스 시약(Griess reagent)과 반응시켜 ELISA 리더로 540nm의 흡광도를 측정하여 NO 생성률을 백분율로 표시할 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 서양 얼룩 분석(S104)의 경우, 유도성 NO 합성효소(iNOS) 단백질 발현 량을 결정하기 위해, DMEM 배지를 사용하여 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)를 5 x 105 세포/ml 6웰에 접종하고, 5 % CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양할 수 있다. 그리고 세포를 1μg/ml LPS로 처리하고, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)로 5, 25, 50 또는 100μg/ml로 1시간 처리할 수 있다. 그리고 24시간 후, 배지를 제거하고 인산염 완충식염수(PBS)로 2회 세척하고, 단백질을 용균완충액으로 추출하고 원심 분리하여 상청액을 얻을 수 있다. 그리고 상청액을 bradford assay(단백질정량실험)로 정량하고, 10% SDS-PAGE를 수행할 수 있다. 이에 개발된 단백질을 니트로 셀룰로스 막으로 옮기고, 막을 5% 탈지유로 1시간 동안 블로팅한 다음에, 10분마다 TBST(완충액)로 3회 세척할 수 있다. 그리고 각 2차 항체를 1:1,000으로 희석하고 실온에서 2시간 반응시킬 수 있다. 그리고 TBST로 10분간 3회 세척한 후, 다빈치웨스턴이미징시스템(Davinch Western™ imaging system)(Seoul, Korea)을 이용하여 전개 및 정량을 수행할 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정(S105)의 경우, 정량 실시간 PCR에 사용되는 PCR 프라이머의 서열을 살펴보면 아래의 표 1과 같다.

Gen	Primer	Sequence
iNOS	Sense	5′-ACATCGACCCGTCCACAGTAT-3′
	Antisense	5′-CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC-3′
COX-2	Sense	5′-TCCCTAAAGGAAAAGTGGGAC-3′
	Antisense	5′-GAGCGCATTAACCTCAGGACC-3′
IL-6	Sense	5′-CTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3′
	Antisense	5′-GCCTCCGACTTGTGAAGTGGT-3′
GAPDH	Sense	5′-TGACCACAGTCCATGCCATC-3′
	Antisense	5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 상술한 바와 같은 모든 실험(세포 배양(cell culture)(S101), 세포 생존력에 대한 MTT 분석(S102), 산화질소 생산량 측정(S103), 서양 얼룩 분석(S104), 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정(S105))을 3번 반복하여 통계 분석할 수 있다. 이때, 결과는 평균 ㅁ 표준 편차로 나타내고, 통계 분석은 분산 분석을 위해 SPSS(statistical package for social science) 프로그램을 사용하여 수행하고(p<0.05, 0.01), 다중 비교를 수행할 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제조 시에, 상술한 바와 같은 모든 실험을 3번 반복한 결과를 살펴보면 다음과 같다.

첫 번째로, 세포 생존 능력에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 효과의 경우, 도 3의 A에 도시된 바와 같이, 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 세포 독성을 측정하기 위해 MTT 분석을 사용하였으며, 이때 24시간 동안 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)(1, 5, 10, 25, 50, 100μg/ml)로 처리하여도 세포 생존율은 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다. 이에 이후의 실험에서, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 5 내지 100㎍/ml의 농도로 사용하였다.

두 번째로, LPS 자극된 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서의 NO 생성에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 효과의 경우, 유도성 NO 합성효소(iNOS)는 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 중요한 역할을 하는 NO를 합성해 준다. 이때, NO는 면역 체계에 대한 규제 효과를 가진다. 기 설정된 양보다 많이 존재하면 NO는 활성산소종(ROS)의 축적, 세포 사멸 및 조직 항상성의 파괴를 초래하므로, 기 설정된 양 이하로 존재하도록 해 준다. NO 생성에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 억제 효과를 조사하기 위해, 그리이스 시약을 사용하여 배지에서 아질산염의 축적을 측정할 수 있다. 세포를 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 존재 하에서 LPS로 24시간 동안 자극하며, 도 3의 B에 도시된 바와 같이, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3) 처리는 NO 생산을 용량 의존적으로 억제함을 알 수 있다(p<0.05).

세 번째로, LPS 자극 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서의 염증 유전자 조절에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 효과의 경우, 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 및 IL6의 mRNA 발현 수준에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 영향을 측정할 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 및 IL-6의 mRNA 발현은 LPS 자극된 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 유의하게 증가되었고, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)로 처리하면 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2, IL-6 mRNA 생성이 현저하게 나타남을 알 수 있다. 이러한 결과는 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 주로 대식세포 활성화의 억제제일 수 있는 전사 수준에서 NO 및 PGE2 생산을 조절함으로써 작용함을 시사한다.

네 번째로, LPS 자극된 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서의 NF-κB 경로에 대한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)의 효과의 경우, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는 STAT 경로에서 염증을 억제하는 것으로 나타났다. NF-κB 경로는 밝혀지지 않았지만, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 LPS 자극된 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 NF-kB의 인산화를 저해하는지의 여부를 조사하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 농도 의존적 방식으로 LPS 유도된 IκB-α 인산화와 분해를 억제한다는 것을 발견했다.

LPS는 도 6에 도시된 바와 같이, 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 60분 동안 처리한 후 세포질에서 핵으로의 p65의 전이를 유도하고, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는 p65 핵 전달을 유의하게 억제함을 알 수 있다. 이러한 결과는 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 LPS 유도된 IκB-α 인산화 및 분해를 차단함으로써, NF-κB 활성화를 억제함을 시사한다. 도 5에 도시된 바와 같이, LPS로 처리하면 IκBα 분해가 일어나고, 농도 의존적으로 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)에 의해 저해된다.

도 7에 도시된 바와 같이, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는 IkKα/β의 인산화를 억제하고, 이는 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 NFkB 경로를 억제한다는 것을 명확히 보여준다. 여기서, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 대식세포에서 IL-6 및 산화질소 및 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2 단백질의 수준을 감소시키고 NF-kB 경로에 의한 대식세포 활성화의 억제를 한다는 것을 발견했다. 이때, NF-kB는 LPS 처리 대식세포에서 신호 전달 경로의 필수 매개체로 알려져 있다.

이러한 보고와 일치하여 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는 IL-6과 유도성 NO 합성효소(iNOS), COX-2(도 4 참조), IκB 단백질 분해를 억제하고 인산화를 저해한다는 것을 발견했다(도 5 참조).

결론적으로, 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는 도 6에 도시된 바와 같이, LPS에 의해 유도된 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에서 NFkB 경로를 억제함으로써 염증 인자를 억제하였음을 알 수 있다. 이러한 사실은 IKK 단백질의 조절을 통해 분명히 입증되었다. 따라서 코프리신 펩티드 유도체(CopA3) 펩타이드는 의약품 및 화장품에 적용될 수 있다.

이하, 상술한 실험 예의 결과를 근거로 하여 본 발명에 따른 물질의 사용에 관해 구체적으로 설명하기 위해 제형 예를 설명하도록 한다. 여기서, 이러한 제형 예들은 어떠한 다른 비율과 형태로도 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하술하는 제형 예에 한정되는 것으로 해석되어서는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물의 제형으로는, 화장수, 로션(에멜젼), 에센스, 젤, 연고 등일 수 있다. 여기서, 화장수는, 유연 화장수와 수렴 화장수 중 어느 하나일 수 있다.

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물은. 전체 조성물에 대하여 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)가 0.1 내지 5 중량%를 함유할 수 있다.

<제형 예 1> 유연 화장수(skin toner)

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 2의 처방으로 유연 화장수를 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 유연 화장수는 전체 조성물에 대하여 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 4.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 1.0중량%의 에탄올, 0.5중량%의 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르를 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 향료, 방부제, 정제수를 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	0.5
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	4.0
에탄올	1.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	0.5
향료	기 설정된 적량
방부제	기 설정된 적량
정제수	기 설정된 적량

<제형 예 2> 수렴 화장수(astrigent)

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 3의 처방으로 수렴 화장수를 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 수렴 화장수는 전체 조성물에 대하여 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 구연산, 1.0중량%의 에탄올, 1.0중량%의 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 1.0중량%의 소르비톨을 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 향료, 방부제, 정제수를 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	0.5
글리세린	2.0
구연산	5.0
에탄올	1.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	1.0
소르비톨	1.0
향료	기 설정된 적량
방부제	기 설정된 적량
정제수	기 설정된 적량

<제형 예 3> 로션(에멀젼)

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 4의 처방으로 로션(에멀젼)을 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 로션(에멀젼)은 전체 조성물에 대하여 0.5중량%의 코프리신, 2.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 7.0중량%의 스쿠알란, 2.0중량%의 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄, 1.5중량%의 트리에탄올아민, 0.5중량%의 글리세릴스테아레이트, 0.2중량%의 스테아릴글리시레티네이, 0.1중량%의 카르복시비닐폴리머, 0.1중량%의 아르기닌을 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 향료, 방부제, 정제수를 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	0.5
글리세린	3.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
스쿠알란	7.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄	2.0
트리에탄올아민	1.5
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
향료	기 설정된 적량
방부제	기 설정된 적량
정제수	기 설정된 적량

<제형 예 4> 에센스

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 5의 처방으로 에센스를 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 에센스는 전체 조성물에 대하여 0.5중량%의 코프리신, 5.0중량%의 솔비톨, 4.0중량%의 폴리옥시에틸렌글리콜 1500, 2.0중량%의 에탄올, 2.0중량%의 폴리옥시에틸렌소르비탄글리세린, 5.0중량%의 1,3-부틸렌글리콜, 1.0중량%의 폴리옥시에틸렌 올레일 알코올 에테르, 0.3중량%의 올리브유, 0.2중량%의 히아루론산을 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 산화방지제, 향료, 방부제, 정제수를 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	0.5
솔비톨	5.0
폴리옥시에틸렌글리콜 1500	4.0
에탄올	2.0
폴리옥시에틸렌소르비탄글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
폴리옥시에틸렌 올레일 알코올 에테르	1.0
올리브유	0.3
히아루론산	0.2
산화방지제	기 설정된 적량
향료	기 설정된 적량
방부제	기 설정된 적량
정제수	기 설정된 적량

<제형 예 5> 젤(gel)

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 6의 처방으로 젤(gel)을 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 젤(gel)은 전체 조성물에 대하여 0.5중량%의 코프리신, 7.0중량%의 에탄올, 3.0중량%의 글리세린, 3.0중량%의 프로필렌글리콜, 0.1중량%의 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 0.3중량%의 카르복시폴리머, 0.3중량%의 트리에탄올아민을 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 산화방지제, 향료, 방부제, 정제수를 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	0.5
에탄올	7.0
글리세린	3.0
프로필렌글리콜	3.0
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.3
트리에탄올아민	0.3
산화방지제	기 설정된 적량
향료	기 설정된 적량
방부제	기 설정된 적량
정제수	기 설정된 적량

<제형 예 6> 연고

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 이용하여 하기 표 7의 처방으로 연고를 제조할 수 있다. 여기서, 단위는 중량%이다. 연고는 전체 조성물에 대하여 3.0중량%의 코프리신, 1.0중량%의 세토스테아릴알코올, 3.0중량%의 자기유화형 모노스테아린산, 2.0중량%의 스테아린산, 5.0중량%의 밀납, 6.0중량%의 스쿠알란, 2.0중량%의 모노스테아린 글리세린, 1.0중량%의 모노스테아린산 소르비탄, 4.0중량%의 폴리솔베이트 80, 4.0중량%의 글리세린, 5.0중량%의 프로필렌글리콜을 포함할 수 있으며, 또한 기 설정된 적량의 향료, 색소, 바세린을 더 포함할 수 있다.

성분명	함량(중량%)
코프리신	3.0
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형 모노스테아린산	3.0
스테아린산	2.0
밀납	5.0
스쿠알란	6.0
모노스테아린 글리세린	2.0
모노스테아린산 소르비탄	1.0
폴리솔베이트 80	4.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	5.0
향료	기 설정된 적량
색소	기 설정된 적량
바세린	기 설정된 적량

상술한 바와 같은 코프리신 펩티드 유도체를 이용한 항염증 화장료 조성물은, 쇠똥구리로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효 성분으로 함으로써, 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성에 문제가 없으면서도 항염증에 탁월함을 잘 알 수 있다.

이상, 본 발명의 실시 예는 상술한 장치 및/또는 운용방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 본 발명의 실시 예의 구성에 대응하는 기능을 실현하기 위한 프로그램, 그 프로그램이 기록된 기록 매체 등을 통해 구현될 수도 있으며, 이러한 구현은 앞서 설명한 실시 예의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가라면 쉽게 구현할 수 있는 것이다. 이상에서 본 발명의 실시 예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

S101: 세포 배양
S102: MTT 분석
S103: 산화질소 생산량 측정
S104: 서양 얼룩 분석
S105: iNOS, COX-2 및 IL-6 mRNA 발현 측정

Claims (5)

1. 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)를 유효성분으로 포함하는 항염증 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는,
   쇠똥구리로부터 분리된 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는,
   리포폴리사카라이드에 의한 대식세포의 활성화 유도를 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는,
   자동화 고상 펩티드 합성기를 이용하여 98(%) 이상의 순도로 합성한 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체(CopA3)는,
   다이 설파이드 구조의 이량체 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.

Images