KR20190097154A - 병원성 약독화 세균 기반 단백질 전달 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

병원성 약독화 세균 기반 단백질 전달
본 발명은 재조합 병원성 약독화(attenuated) 그람-음성 세균 균주 및 대상체에서 암을 치료하는 방법에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
세균은 표적 세포 내로 단백질을 직접 주사하기 위해 다양한 메커니즘을 진화시켜 왔다1. 예르시니아 (Yersinia), 쉬겔라 (Shigella) 및 살모넬라 (Salmonella)2와 같은 세균에 의해 사용되는 타입 III 분비 시스템 (T3SS)은 소위 세균성 이펙터 단백질(bacterial effector protein)을 숙주 세포 내로 주입하는 나노-주사기와 같은 기능을 한다.
T3S는 혼성체 펩티드 및 단백질을 표적 세포 내로 전달하는데 이용되어 왔다. 이종 세균성 T3SS 이펙터는 연구 중인 세균이 유전학적으로 접근하기 어려운 경우에 (예컨대, 클라마이디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)) 전달되었다. 종종 리포터 단백질은 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) 아데닐레이트 사이클라제, 뮤린 DHFR 또는 인산화가능 (phosphorylatable) 태그와 같은, T3SS 의존적 단백질 전달을 위한 요건을 연구하기 위해 가능한 T3SS 분비 신호에 융합되었다. 펩티드 전달은 주로 백신접종의 목적으로 수행되었다. 이는 바이러스 에피토프, 세균 에피토프 (리스테리오리신 O) 뿐만 아니라 인간 암세포의 에피토프를 제시하는 펩티드를 포함한다. 몇몇 경우에, 기능성 진핵 단백질은 나노바디 (nanobodies)3, 핵 단백질 (Cre-재조합효소, MyoD)4,5 또는 Il10 및 IL1ra6을 사용한 것과 같이, 숙주 세포를 조절하기 위해 전달되었다. 각각의 경우에 하나 또는 다수의 내인성 이펙터 단백질이 여전히 인코딩(encoding)되기 때문에 상기에 언급된 시스템 중 어느 것도 단일-단백질 전달을 허용하지 않는다. 나아가, 사용된 벡터는 선택되는 단백질을 인코딩하는 다른 DNA 단편의 용이한 클로닝을 허용하는 방식으로 설계되지 않았고, 이는 시스템의 광범위한 응용을 방해한다.
표적 약물 전달을 가능케 하는 접근법은 큰 관심의 대상이다. 예를 들어, 종양 세포의 표면 구조를 인식하고, 최적의 경우에, 종양 세포에 선택적으로 결합하는 항체가 사용된다. 이러한 항체의 메커니즘을 개선하기 위해, 이들은 약물과 함께 포장된 치료제 또는 지질 소포에 접합될 수 있다. 이러한 소포의 문제점 중 하나는 활성 시약의 적절한 방출이다. 특히 세포 내 메커니즘이 표적되는 경우에, 치료 단백질 또는 펩티드의 전달은 더욱 더 복잡하다. 진핵 세포 내로 치료 단백질을 전달하는 문제를 해결하기 위해 많은 대안이 시도되었고, 그 중에는 "세포 침투성 펩티드" (CPP) 또는 유사한 기술뿐만 아니라 다양한 나노입자-기반 방법론이 있다. 이러한 모든 기술은 세포내이입 (endocytosis)을 통해 세포에 의해 흡수된 화물 (cargo)이 결국 리소좀에서 분해될 가능성이 있다는 낮은 효능의 단점을 갖는다. 나아가, 인체에서의 화물-담체의 안정성에 대한 요구와 표적 세포 내에서의 불안정화 및 유리에 대한 요구 사이의 갈등은 이러한 기술의 내재적 문제를 구성한다.
에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 슈도모나스 아에루지노사 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)를 포함하는, 다양한 세균이 말단 부위로부터 투여되는 경우 악성 고형 종양 내에서 복제되는 것으로 나타났다. 현재, 유일하게 바실러스 칼메트-게렝 (bacillus Calmette-Guerin) (BCG, 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis)로부터 유래)이 임상 시험에 사용되고 있다. BCG는 표재성 방광암을 치료하기 위해 투여되지만, 근본적인 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 예컨대, 세균 내부에서 생산된 화물을 암세포와 같은 세포 내부의 그의 작용 부위, 즉 세균의 외부에 전달할 수 있는 세균 균주의 개발은 여전히 중요한 과제로 남아 있다.
발명의 요약
본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 대상체에서 암을 치료하는 방법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 대상체에서 암을 치료하기 위한 이의 용도를 제공하고, 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 바이러스 단백질 및 가장 중요한 기능성 진핵 단백질의 타입 IV 이펙터뿐만 아니라, 다양한 타입 III 이펙터의 암세포 내로의, 예컨대 악성 고형 종양의 세포 내로의 전위를 가능케 한다.
본 발명은 증가된 이종 단백질 발현 및 분비 특성을 갖고 놀랍게도 생체 내에서 수 일 또는 수 주에 걸쳐서 이종 단백질을 안정하게 인코딩할 수 있는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류(upstream)의 RNA 온도센서 (thermosensor) 영역 내에서의 조절을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함하고, 상기 방법은 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 용도에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함하고, 상기 방법은 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 용도에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이고, 상기 방법은 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
유사하게, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 용도에 관한 것으로, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이다.
추가 양태에서, 본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하고, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하고, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하고, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이다.
도 1: T3SS 단백질 전달의 특성 분석. 주변 배지 (시험관 내 분비) 내로 (좌측) 또는 진핵 세포 내로 (우측) T3SS 의존적 단백질 분비의 도식적 표현. I은 타입 3 분비 시스템을 보여준다. II는 주변 배지 내로 분비된 단백질을 나타내고, III은 진핵 세포의 세포질 내로 막을 통해 전위된 단백질을 나타낸다 (VII). VI는 T3SS가 삽입된 2개의 세균막과 그 아래의 세균 세포질의 신장을 보여준다. IV는 YopE1-138 N-말단 절편 (V)에 부착된 융합 단백질이다.
도 2: 타입 III 분비-기반 전달 툴박스 (toolbox)의 설명. (A) YopE1 -138과의 융합 작제물을 생성하는데 사용된 클로닝 플라스미드 pBad_Si1 및 pBad_Si2의 벡터 지도. 샤페론 SycE 및 YopE1 -138-융합은 천연 Y. 엔테로콜리티카 프로모터의 제어하에 있다. 두 플라스미드는 pBad_Si1 상에 존재하는 아라비노스 유도성 EGFP의 존재하에서만 상이하다. (B) pBad_Si1 및 pBad_Si2 플라스미드 상에서 yopE1-138 단편에 바로 이어지는 다중 클로닝 부위.
도 3A 내지 Q: 본 연구에 사용된 Y. 엔테로콜리티카 균주. 상응하는 플라스미드 상에 인코딩된 T3SS 의존적 전달을 위한 배경 균주, 플라스미드 및 단백질에 대한 정보를 제공하는 본 연구에 사용된 Y. 엔테로콜리티카 균주의 목록. 또한, 상응하는 플라스미드, 골격 플라스미드 및 항생제 내성의 구성에 사용되는 올리고뉴클레오티드에 대한 정보가 제공된다.
도 4: 예르시니아 엔테로콜리티카 W227 병원성 플라스미드, pYV. 정확한 축적으로 그려진 균주 W227의 예르시니아 병원성 (pYV)의 69'673 bp 플라스미드. T3SS 이펙터 단백질, 복제 기원 및 비소 내성 (유전자 arsC, B, R 및 H에 의해 인코딩됨)이 표시된다:
I: 복제 기원, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT,
VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH,
XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, B, R 및 H.
도 5: 합성적 증가된 프로- 아폽토시스( apoptosis) 단백질의 전달. 프로-아폽토시스 단백질 t-BID 또는 BAX로부터 유래된 BH3 도메인의 단일 또는 템덤 반복으로 이루어진 단일 합성 단백질의 전달은 4T1 및 B16F10 암성 세포에서 증가된 아폽토시스를 유도한다. 4T1 (I) 또는 B16F10 (II) 세포를 pBad-MycHisA 상에 IV: YopE1 -138-tBID BH3 확장 도메인, V: YopE1 -138-링커-tBID BH3, VI: YopE1 -138-tBID BH3, VII: YopE1 -138-(tBID BH3)2, VIII: YopE1 -138-tBID BH3-BAX BH3 또는 IX: YopE1 -138-BAX BH3-tBID BH3을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정(MOI)을 각 균주에 대해 수행하고, 세포 수를 측정하고, 비-선형 회귀를 이용하여 IC50을 계산하였다. IC50 MOI가 표시된다 (III).
도 6: pYV -인코딩된 합성적 프로- 아폽토시스 단백질에 의한 아폽토시스의 유도. pYV 상에 인코딩되는 BID BH3 도메인의 단일 또는 텐덤 반복의 전달은 4T1 및 B16F10 암성 세포에서 아폽토시스 유도를 초래한다. 4T1 (I) 또는 B16F10 (II) 세포를 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + IV: pYV-YopE1 -138-BH3-Bid, 또는 V: + pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2 또는 VI로: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT pBad-MycHisA-YopE1 -138-(BH3-Bid)2로 3시간 동안 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (MOI)을 각 균주에 대해 수행하고, 세포 수를 측정하고, 비-선형 회귀를 이용하여 IC50 (III)을 계산하였다.
도 7: 4T1 유방암 동종이식 모델에서 i.v. 주사된 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T 의 종양 콜로니화. 종양 내 세균 수는 조직의 g당 콜로니 형성 단위 (CFU)로서 표시된다 (III). 감염 후 8일째 (I) 및 14일째 (II)에 종양 내 수를 평가하였다. 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 8: 4T1 유방암 동종이식 모델에서 i.v. 주사된 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T 의 생체분포. 혈액 (I), 비장 (II), 간 (III), 폐 (IV) 및 종양 (V) 내 세균 수는 조직의 g당 또는 혈액의 ml당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표시된다 (VI). 감염 후 14일째에 수를 평가하였다. 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다. *는 폐에서 발견된 거대 전이를 갖는 마우스를 나타낸다.
도 9: 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서 종양 진행의 지연. 종양 크기가 150-250 mm3에 도달한 후에 4T1 유방암 세포로 s.c 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 I: PBS 또는 II: 1*107 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT ΔHairpinI-VirF + pYV-YopE1 -138(BH3-Bid)2를 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하였다. 종양 부피를 캘리퍼로 다음 날 (III; 세균의 i.v. 주사 후 0 내지 9일째)에 걸쳐서 측정하였다. 0일째 종양 부피에 대해 표준화된, 상대적 종양 부피는 mm3으로 표시된다(IV). 평균은 기호로 표시되며, 표시된 오류 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 2원 분산분석 (2way ANOVA)으로 측정되고, *는 p 값 <0.05를 나타내고, **는 p 값 <0.005를 나타낸다.
도 10: 4T1 유방암 세포로 s.c 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 150-250 mm3에 도달한 후에 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스 마우스에 I: PBS 또는 II: 1*107 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하였다. 종양 부피를 캘리퍼로 다음 날 (III; 세균의 i.v. 주사 후 0 내지 9일째)에 걸쳐서 측정하였다. 0일째 종양 부피에 대해 표준화된, 상대적 종양 부피는 mm3으로 표시된다(IV). 평균은 기호로 표시되며, 표시된 오류 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 11: 주요 조절인자 VirF의 발현 제어에 의한 T3SS -기반 분비의 조절. A : YopE1-138-(tBID BH3)2를 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 균주를 이용한 시험관 내 분비 어세이 (37℃에서 수행됨). VirF의 발현은 그의 천연 프로모터 (I + II), 아라비노스-유도성 프로모터 (III + IV) 또는 온도-의존적 발현을 제어하는 그의 헤어핀 I 영역의 결실을 갖는 그의 천연 프로모터 (V)의 조절하에 있다. 분비 어세이을 아라비노스의 부재 (I, III 및 V) 또는 0.2% 아라비노스의 존재 (II 및 IV) 중 하나에서 수행하였다. 분비된 YopE1 -138-(tBID BH3)2를 YopE1 -138 영역을 인식하는 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 이용하여 검출하였다. B : YopE1 -138-뮤린 RIG1 Card 도메인을 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 균주를 이용한 시험관 내 분비 어세이 (37℃에서 수행됨). VirF의 발현은 그의 천연 프로모터 (I + II), 또는 온도-의존적 발현을 제어하는 그의 헤어핀 I 영역의 결실을 갖는 그의 천연 프로모터 (III)의 조절하에 있다. 분비 어세이을 아라비노스의 부재 (I, 및 III) 또는 0.2% 아라비노스의 존재 (II) 중 하나에서 수행하였다. 분비된 YopE1 -138-뮤린 RIG1 Card 도메인을 YopE1 -138 영역을 인식하는 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 이용하여 검출하였다.
도 12: 시험관 내 성장의 비교: II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, III: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd, IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBAD-MycHisA-asd, V: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBAD-MycHisA-asd (역방향), VI: pYV 상에 YopE1 -138-(tBID BH3)2를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 및 VII: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pYV-asd-YopE1 -138-(tBID BH3)2에 대한 시험관 내 성장 비교. 세균을 액체 배양액에 접종하고 3시간 동안 성장시켰다. 이어서, 모든 균주에 대해 OD600 (I)을 측정하였다.
도 13: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBad - MycHisA - asd 를 이용한 종양 콜로니화 및 pBad - MycHisA - asd 의 안정성: B16F10 흑색종 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 C57BL/6 마우스에 1*106 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBad-MycHisA-asd를 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 후 1일째 (I) 또는 4일째 (II)에, 혈액 (V), 비장 (VI), 간 (VII), 폐 (VIII) 및 종양 (IX)을 단리하고, 균질화하고, 연속 희석한 후 날리딕신산 (및 암피실린 부재, -IV)을 함유하는 LB-아가 플레이트, 또는 pBad-MycHisA-asd에 선택적인 암피실린 함유 (+IV) LB-아가 플레이트 상에 도말하였다. 각각의 시료에서 세균 수는 조직의 g당 또는 혈액의 ml당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표시된다 (III). 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 14: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBad - MycHisA - asd 를 이용한 종양 콜로니화 : 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 1*106 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pBad-MycHisA-asd를 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 후 지시된 시점에 (I), 종양을 단리하고, 균질화하고, 연속 희석한 후 날리딕신산을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 도말하였다. 종양 내 세균 수는 조직의 g당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표시된다 (II). 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 15: pYV의 유전적 안정성: 생체 내 고형 종양에서 천연 pYV 또는 pYV-asd의 안정성. 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 1*107 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2, III: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI - VirF + pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2 또는 IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pYV-asd-YopE1 -138-(tBID BH3)2를 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 후 9일째에, 종양을 단리하고, 균질화하고, 연속 희석한 후, 날리딕신산을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 도말하였다. 이들 플레이트 상에서 성장 후, 각각의 마우스로부터의 단일 콜로니를 pYV에 대해 선택적인, 아비산나트륨 (Sodium Arsenite) 함유 및 비함유 LB-아가 플레이트에서 재-선별하였다. 각 마우스에 대해, 아비산염을 함유하지 않는 플레이트에서 성장하는 콜로니의 수에 대한 아비산염 함유 아가 플레이트 상에서 성장하는 콜로니의 백분율이 표시된다 (I: %로 표시됨). 100%는 고형 종양으로부터 단리된 모든 콜로니가 여전히 pYV 플라스미드를 함유하고 있음을 나타낸다.
도 16: 종양 콜로니화 : 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 1*107 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2, III: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI - VirF + pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2 또는 IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT Δasd + pYV-asd-YopE1 -138-(tBID BH3)2로 i.v. 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 후 9일째에, 종양을 단리하고, 균질화하고, 연속 희석한 후, 날리딕신산을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 도말하였다. 종양 내 세균 수는 조직의 g당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표시된다 (I). 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 17: 세균성 T3SS-Rig1 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 인간 및 뮤린 Rig1 Card 도메인의 전달은 B16F10 IFN-수용체 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 수용체 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-인간 Rig1 Card 도메인, III: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (IV: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 (multimeric) ISRE에 의해 증강되는 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 조절하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (V: OD650)에 근거하여 평가하였다.
도 18: 세균성 T3SS-Rig1 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 인간 Rig1 Card 도메인의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-MycHis, III: YopE1 -138-인간 Rig1 Card 도메인을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (IV: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (V: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 19: 세균성 T3SS - Rig1 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달: 양성 대조군. B16F10 IFN-리포터 세포주를 자극하기 위해 IFN 감마를 사용하는 도 18과 동일한 실험에서의 양성 대조군. B16F10 리포터 세포를 뮤린 IFN 감마로 자극시켰다. IFN 감마의 적정을 세포에 첨가하였고 (I: U/ml로 표시됨), IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (II: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 20: 세균성 T3SS - Rig1 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. pYV 인코딩된 뮤린 Rig1 Card 도메인의 전달은 B16F10 암 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 Pyv 상에 II: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티 카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (III: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (IV: OD650)을 기초로 IFN 리포터 세포주에 세포 상등액을 첨가하여 평가하였다.
도 21: 세균성 T3SS - Rig1 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. pYV 인코딩된 뮤린 Rig1 Card 도메인의 전달은 4T1 암 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. 4T1 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pYV 상에 II: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT으로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (III: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (IV: OD650)을 기초로 IFN 리포터 세포주에 세포 상등액을 첨가하여 평가하였다.
도 22: 세균성 T3SS- STING 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티 카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-P. 아에루지노사 WspR (스톡 도메인으로 개조됨)을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT으로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (III: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (IV: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 23: 세균성 T3SS -STING 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 미처리로 남겨두거나 (I), 또는 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 III: YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, IV: YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질, V: YopE1 -138-아네모네 cGAS 또는 VI: YopE1 -138-MycHis를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VII: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VIII: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 24: 배양 상등액 내로 IRF3의 T3SS 의존적 분비. I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + YopE1 -138-뮤린 tBID BH3 및 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + YopE1 -138-뮤린 IRF3 Ser397Asp의 시험관 내 분비 실험. 총 세균 용해물 ("A") 및 침전된 배양 상등액 ("B")의 단백질 함량을 항-YopE 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 기재된 숫자는 해당 높이에서 kDa으로 분자량을 나타낸다.
도 25: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 면역 세포로의 전달- Rig1 및 STING 경로. 뮤린 Rig1 Card 도메인 및 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 RAW264.7 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW264.7 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, III: YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질, IV: YopE1 -138-아네모네 cGAS 또는 V: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VI: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VII: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 26: B16F10 유방암 동종이식 모델에서 i.v. 주사된 Y. 엔테로콜리티카 균주의 종양 콜로니화. 종양이 100-315 mm3의 크기에 도달하면 B16F10 흑색종 암세포로 s.c. 동종이식된 야생형 C57BL/6 마우스를 I: PBS, II: 1*107 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT, III: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT + pYV-YopE1 -138-뮤린 RIG1 CARDs1 -246 또는 IV: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT ΔHairpinI-VirF + pYV-YopE1 -138-뮤린 RIG1 CARDs1 -246으로 i.v. 감염시켰다. 종양 내 세균 수는 조직의 1g 당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표시된다 (V). 감염 후 5 또는 8일째 종양에서 계수를 평가하였다. 각각의 점은 개별 마우스를 나타낸다. 수평 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 27: 세균성 T3SS-RIG1을 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 인간 및 뮤린 Rig1 Card 도메인의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-인간 RIG1 CARD 도메인1 -245, III: YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, IV: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -229, V: YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VI: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VII: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 28: 세균성 T3SS-RIG1을 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 인간 및 뮤린 Rig1 Card 도메인의 전달은 RAW IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-인간 RIG1 CARD 도메인1 -245, III: YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, IV: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -229, V: YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VI: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VII: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 29: 세균성 T3SS-MDA5 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 뮤린 MDA5의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-뮤린 MDA51 -294, III: YopE1 -138-뮤린 MDA51-231을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (IV: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (V: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 30: 세균성 T3SS-MAVS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. MAVS CARD의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, III: YopE1 -138-인간 cGAS161-522, IV: YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VI: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 31: 세균성 T3SS - MAVS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. MAVS CARD의 전달은 RAW 대식세포 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW 대식세포 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, III: YopE1-138-인간 cGAS161 -522, IV: YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VI: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 32: 세균성 T3SS- STING 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티 카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-아네모네 cGAS, III: YopE1 -138-아네모네 cGAS60 -422, IV: YopE1 -138-인간 cGAS161 -522, V: YopE1 -138-리스테리아 CdaA101 -273, VI: YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, VII: YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VIII: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (IX: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 33: 세균성 T3SS -STING 경로를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 RAW 대식세포 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW 대식세포 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1 -138-아네모네 cGAS, III: YopE1 -138-아네모네 cGAS60 -422, IV: YopE1 -138-인간 cGAS161 -522, V: YopE1 -138-리스테리아 CdaA101 -273, VI: YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, VII: YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VIII: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (IX: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 34: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달 및 STING의 소분자 작용제와의 비교. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1-138-아네모네 cGAS, III: YopE1 -138-인간 cGAS161 -522, IV: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VI: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 35: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달 및 STING의 소분자 작용제와의 비교. 사이클릭 디뉴클레오티드의 전달은 B16F10 IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. B16F10 리포터 세포를 소분자 STING 작용제 2'3'-c-디-AM(PS)2 (Rp,Rp)로 처리하였다. 화합물의 적정 (I: 마이크로몰로 표시됨)을 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (II: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 36: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달 및 STING의 소분자 작용제와의 비교. 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 전달은 RAW IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 II: YopE1-138-아네모네 cGAS, III: YopE1 -138-인간 cGAS161 -522, IV: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VI: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 37: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달 및 STING의 소분자 작용제와의 비교. 사이클릭 디뉴클레오티드의 전달은 RAW IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. RAW 리포터 세포를 소분자 STING 작용제 2'3'-c-디-AM(PS)2 (Rp,Rp)로 처리하였다. 화합물의 적정 (I: 마이크로몰로 표시됨)을 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (II: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 38: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달 및 T3SS 의존성의 증거- RIG1 및 MAVS. YopE1 -138에 융합된 RIG1 CARD 도메인 또는 MAVS CARD의 전달은 RAW IFN-리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래하는데, 이는 엄격하게 T3SS 의존적이다. RAW 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 Δ HOPEMT, 또는 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT - yopB , 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 III: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, V: YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 IV: YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, VI: YopE1 -138-인간 MAVS CARDs1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT - yopB 로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (VII: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성 (VIII: OD650)을 기초로 평가하였다.
도 39: 종양 단리물로부터의 미정제 세포 혼합물에서 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달- RIG1. YopE1 -138에 융합된 RIG1 CARD 도메인의 전달은 미정제 종양 단리물에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. 종양의 부피가 >200 mm3에 도달하면, EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스를 희생시켰다. 종양을 으깨고, 소화시키고, 단일-세포 현탁액으로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 2개의 상이한 종양 유래의 이들 세포를 I 및 III: Y. 엔테 로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 II 및 IV: pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 인터페론 베타에 대한 ELISA를 이용하여 평가하였다 (VI: 피코그램/밀리리터). 점선은 미처리의 상응하는 종양을 나타내고, I/II 및 III/IV는 동일한 종양으로부터 유래한 각각의 세포이다.
도 40: EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면, EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 PBS를 종양 내로 주사하였다. PBS의 첫 번째 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하고, 0일, 1일, 5일, 6일, 10일 및 11일째에 처리를 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (I: -11일째 내지 세균의 첫 번째 주사 후 80일째). 상대적 종양 부피 (해당 일자의 종양 부피를 0일째에 종양 부피로 나눈 값)는 mm3으로서 각 마우스에 대해 형질전환된 log-2를 나타낸다 (II).
도 41: EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 7.5*107의 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 종양 내로 주사하였다. 세균의 첫 번째 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하고, 0일, 1일, 5일, 6일, 10일 및 11일째에 처리를 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (I: -11일째 내지 세균의 첫 번째 주사 후 80일째). 상대적 종양 부피 (해당 일자의 종양 부피를 0일째에 종양 부피로 나눈 값)는 mm3으로서 각 마우스에 대해 형질전환된 log-2를 나타낸다 (II).
도 42: EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 7.5*107의 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 종양 내로 주사하였다. 세균의 첫 번째 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하고, 0일, 1일, 5일, 6일, 10일 및 11일째에 처리를 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (I: -11일째 내지 세균의 첫 번째 주사 후 80일째). 상대적 종양 부피 (해당 일자의 종양 부피를 0일째에 종양 부피로 나눈 값)는 mm3으로서 각 마우스에 대해 형질전환된 log-2를 나타낸다 (II).
도 43: EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 7.5*107의 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-인간 cGAS161-522를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 종양 내로 주사하였다. 세균의 첫 번째 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하고, 0일, 1일, 5일, 6일, 10일 및 11일째에 처리를 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (I: -11일째 내지 세균의 첫 번째 주사 후 80일째). 상대적 종양 부피 (해당 일자의 종양 부피를 0일째에 종양 부피로 나눈 값)는 mm3으로서 각 마우스에 대해 형질전환된 log-2를 나타낸다 (II).
도 44: 첫 번째 완전 치료 후 EMT6 유방암 세포로 반대쪽 측면에 s.c. 재감염된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스를 7.5*107의 II: Y. pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246을 인코딩하는 엔테로콜리티카 dHOPEMT, III: pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-인간 cGAS161-522를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 종양 내로 상기에 기술된 바와 같이 처리하였다 (도 40-43). 세균의 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하였다. 0일, 1일, 5일, 6일, 10일 및 11일째에 처리를 수행하였다. 완전한 종양 퇴행을 갖는 마우스 (또는 I: 대조군으로서 나이브 (naive) 마우스)의 반대쪽 옆구리에 EMT6 유방암 세포를 s.c. 동종이식하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (IV: 세균의 첫 번째 주사 후 80일째까지). 절대적 종양 부피를 각 마우스에 대해 mm3으로 표시한다 (V).
도 45: EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb /C 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 80-250 mm3에 도달하면 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에 I: PBS, 또는 5*106의 II: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT, III: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2, IV: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT ΔHairpinI-VirF pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2, V: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT ΔHairpinI-VirF Δasd pYV-asd-YopE1 -138-(tBID BH3)2를 i.v.로 주사하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하고, 모든 마우스를 d-1에 데스페랄 (Desferal)로 i.p. 처리하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일차에 걸쳐서 측정하였다 (VI: 첫 번째 세균 주사 후 0일째 내지 15일째). 중간 종양 부피를 mm3으로 표시한다 (VII).
도 46: B16F10 흑색종 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 C57BL /6 마우스에서의 종양 진행. 종양 크기가 60-130 mm3에 도달하면 B16F10 흑색종 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 C57BL/6 마우스에 I: PBS, 또는 7.5*107의 II: Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT, III: a pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT, IV: pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-인간 cGAS161 -522를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT를 종양 내로 주사하였다. 세균의 첫 번째 종양 내 주사 당일을 0일째로 정의하고, 0일, 1일, 2일, 3일, 6일 및 9일째에 처리를 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다 (V: 일). 중간 종양 부피를 mm3으로 표시한다 (VI).
도 47: B16F10 흑색종 마우스 동종이식 모델에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp . 팔레아크티카 ( palearctica )의 생체분포: 신체적 외양에 대한 점수화. I: 일자, II: 점수가 매겨진 마우스의 분획, III: Y. 엔테로콜리티카 MRS40 wt, IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T. 화살표는 2Х105 세균의 i.v. 주사 일자를 나타낸다.
도 48: B16F10 흑색종 마우스 동종이식 모델에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp . 팔레아크티카의 생체분포: 행동에 대한 점수화. I: 일자, II: 점수가 매겨진 마우스의 분획, III: Y. 엔테로콜리티카 MRS40 wt, IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T. 화살표는 2Х105 세균의 i.v. 주사 일자를 나타낸다.
도 49: B16F10 흑색종 마우스 동종이식 모델에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp . 팔레아크티카의 생체분포: 마우스의 체중. 마우스의 체중을 세균의 i.v 감염 후 매일 평가하였다. I: 일자, II: 체중 (g), III: Y. 엔테로콜리티카 MRS40 wt, IV: Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T. 화살표는 2Х105 세균의 i.v. 주사 일자를 나타낸다.
도 50: B16F10 흑색종 마우스 동종이식 모델에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp . 팔레아크티카의 생체분포: Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T의 생체분포. 지시된 시점에서 장기 내 수를 장기 균질화, 연속 희석 및 생성된 콜로니 형성 단위 (CFU)의 계수에 의해 평가하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하고, 모든 마우스를 d-1에 데스페랄로 i.p. 처리하였다. I: Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T, II: 조직의 g당 또는 혈액의 ml당 CFU, III: 1일째, IV: 4일째, V: 혈액, VI: 비장, VII: 간, VIII: 폐, IX: 종양. *는 눈에 보이지 않는 종양을 갖는 마우스를 나타낸다.
도 51: B16F10 흑색종 마우스 동종이식 모델에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp . 팔레아크티카의 생체분포: Y. 엔테로콜리티카 MRS40 wt의 생체분포. 지시된 시점에서 장기 내 수를 장기 균질화, 연속 희석 및 생성된 콜로니 형성 단위 (CFU)의 계수에 의해 평가하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하고, 모든 마우스를 d-1에 데스페랄로 i.p. 처리하였다. I: Y. 엔테로콜리티카 MRS40 wt, II: 조직의 g당 또는 혈액의 ml당 CFU, III: 1일째, IV: 4일째, V: 혈액, VI: 비장, VII: 간, VIII: 폐, IX: 종양.
도 52: 세균성 T3SS를 통한 타입 I 인터페론 반응을 유도하는 단백질의 전달-세균성 T3SS 전달된 MAVS는 내인성 MAVS와 독립적으로 작동한다. MAVS CARD의 T3SS를 통한 전달은 MAVSKO RAW 대식세포 IFN-리포터 (루시퍼라제) 세포주에서 타입 I IFN 유도를 초래한다. MAVSKO RAW 대식세포 리포터 세포를 I: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 II: Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT - yopB , III: pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 Δ HOPEMT 또는 IV: pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT - yopB 로 감염시켰다. 세포에 첨가된 세균의 적정 (V: MOI로 표시됨)을 각 균주에 대해 수행하였고, IFN 자극을 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에 있는 루시퍼라제의 활성 (VI: RLU-상대적 발광 단위)을 기초로 평가하였다.
본 발명은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 및 대상체에서 악성 고형 종양과 같은 암을 치료하는 방법에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
본 명세서를 이해할 목적으로, 다음의 정의가 적용될 것이며, 적절하다면 언제나, 단수로 사용된 용어는 또한 복수형을 포함할 것이고 그 반대도 마찬가지이다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "그람-음성 세균 균주"에는 다음의 세균이 포함된다: 아에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida), 아에로모나스 히드라필라 (Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 베로니이 (Aeromonas veronii), 언에어로로믹소박터 데할로게나스 (Anaeromyxobacter dehalogenans), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 파라퍼투시스 (Bordetella parapertussis), 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 버크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei), 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei), 클라마이디아 뮤리다룸 (Chlamydia muridarum), 클라마이디아 트라치모아티스 (Chlamydia trachmoatis), 클라마이도필라 아보르투스 (Chlamydophila abortus), 클라마이도필라 뉴모니아에 (Chlamydophila pneumoniae), 크로모박테리움 비올라세움 (Chromobacterium violaceum), 시트로박터 로덴티움 (Citrobacter rodentium), 데설포비브리오 불가리스 (Desulfovibrio vulgaris), 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda), 엔도조이코모나스 엘리시콜라 (Endozoicomonas elysicola), 에르위니아 아밀로보라 (Endozoicomonas amylov ora), 에스케리치아 알베르티이 (Escherichia albertii), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 라우소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis), 메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti), 믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus), 판토에아 아클로메란스 (Pantoea agglomerans), 포토박테리움 담셀라에 (Photobacterium damselae), 포토라브두스 루미네센스 (Photorhabdus luminescens), 포토라브두스 템퍼레이트 (Photorabdus temperate), 슈도알테로모나스 스폰지아에 (Pseudoalteromonas spongiae), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플레코글로시시다 (Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 시린가에 (Pseudomonas syringae), 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum), 리조비움 (Rhizobium) sp, 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enteric) 및 다른 살모넬라 sp, 쉬겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri) 및 다른 쉬겔라 sp, 소달리스 글로시니디우스 (Sodalis glossinidius), 비브리오 알지노리티쿠스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 아주레우스 (Vibrio azureus), 비브리오 캄펠리이 (Vibrio campellii), 비브리오 카리브벤씨쿠스 (Vibrio caribbenthicus), 비브리오 하르베이 (Vibrio harvey), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 타스마니엔시스 (Vibrio tasmaniensis), 비브리오 투비아쉬이 (Vibrio tubiashii), 잔토모나스 악소노포디스 ( Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 오리자에 (Xanthomonas oryzae), 예르시니아 엔토로콜리티카 (Yersinia enterolitica), 에르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis)가 포함된다. 본 발명의 바람직한 그람-음성 세균 균주는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 및 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae)의 패밀리로 구성되는 그람-음성 세균 균주이다. 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 시험관 내 및/또는 생체 내, 바람직하게는 생체 내에서 세균성 T3SS에 의한 이종 단백질의 진핵 세포 전달에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주"는 벡터와 같은 뉴클레오티드 분자로 유전적으로 형질전환된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 이러한 재조합 그람-음성 세균 균주의 병원성은 일반적으로 분비 시스템 기구의 일부인, 하나 이상의 세균성 단백질에 의해 운반되는 병원성 활성을 갖는 세균성 이펙터 단백질의 결실에 의해 약독화된다. 이러한 이펙터 단백질은 분비 시스템 기구에 의해 숙주 세포 내로 전달되어 다양한 숙주 단백질 및 세포 기구에 대해 이들의 병원성 활성을 발휘한다. 다양한 분비 시스템 유형에 의해 운반되고 숙주 조절 분자의 기능을 조절하는 생화학적 활성의 거대 레퍼토리를 나타내는 많은 상이한 이펙터 단백질이 알려져 있다. 본원에 사용된 재조합 그람-음성 세균 균주의 병원성은 균주가 시데로포아 (siderophore)를 생산하지 않도록, 예컨대 시테로포어의 생산에 결함이 있도록 정상적으로 또는 때때로 그람-음성 세균 균주에 의해 생산된 시데로포어의 결핍에 의해 추가적으로 약독화될 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서 균주가 시데로포아를 생산하지 않도록, 예컨대 시테로포어의 생산에 결함이 있도록 정상적으로 또는 때때로 그람-음성 세균 균주에 의해 생산된 시데로포어가 결핍인 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 사용되고, 더욱 바람직하게는 균주가 시데로포아를 생산하지 않도록, 예컨대 시테로포어의 생산에 결함이 있도록, 특히 예르시니아박틴 (Yersiniabactin)의 생산에 결함이 있도록 정상적으로 또는 때때로 그람-음성 세균 균주에 의해 생산된 시데로포어가 결핍인 예르시니아 균주, 특히 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF 또는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd가 사용된다. 예르시니아박틴의 생산에 결함이 있는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T는 WO02077249에 기술되어 있고 벨기에 미생물 통합수집 기구 (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM)에 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라, 2001년 9월 24일자로 기탁되어 기탁번호 LMG P-21013을 부여 받았다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 바람직하게는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의 시데로포어를 생산하지 않으며, 예컨대 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의 시데로포어의 생산에 결함이 있고, 더욱 바람직하게는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 어떠한 시데로포어도 생산하지 않는다.
본원에서 호환적으로 사용되는, 용어 "시데로포어", "철 시데로포어" 또는 "철 킬레이터"는 철에 대해 높은 친화도를 갖는 화합물, 예컨대 철에 대해 높은 친화도를 갖는 소 화합물을 지칭한다.
그람-음성 세균의 시데로포어는, 예컨대 살모넬라, 에스케리치아, 클렙시엘라, 쉬겔라, 세라티아에 의해 합성되는 엔테로박틴 및 디히드록시벤조일세린 (그러나 모든 엔테로박테리아에 의해 사용됨), 슈도모나스에 의해 합성되는 피오베르딘 (Pyoverdin), 비브리오에 의해 합성되는 비브리오박틴, 아시네토박터에 의한 아시네토박틴 및 아시네토페린 (Acinetoferrin), 예르시니아에 의해 합성되는 예르시니아박틴 및 아에로박틴, 버크홀데리아에 의해 합성되는 오르니박틴, 살모넬라에 의해 합성되는 살모첼린 (Salmochelin), 에스케리치아, 쉬겔라, 살모넬라 및 예르시니아에 의해 합성되는 아에로박틴, 보르데텔라에 의해 합성되는 알칼리긴 (Alcaligin), 비브리오에 의해 합성되는 비수카베린 (Bisucaberin)이다.
시데로포어에는 히드록사메이트, 카테콜레이트 및 혼합 리간드 시데로포어가 포함된다. 몇몇 시데로포어는 현재까지 주로 철 과부하를 치료할 목적으로, 인간에의 사용에 대해 승인을 받았다. 바람직한 시데로포어는 데페록사민 (Deferoxamine) (데스페리옥사민 B, 데스페록사민 B, DFO-B, DFOA, DFB 또는 데스페랄로도 알려짐), 데스페리옥사민 E, 데페라시록스 (엑스자이드, 데시록스, 데프리젯, 데시페르) 및 데페리프론 (페리프록스)이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "성장에 필수적인 내인성 단백질"은 이들 없이는 그람-음성 세균 균주가 성장할 수 없는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 단백질을 지칭한다. 성장에 필수적인 내인성 단백질은, 예컨대 아미노산 생산에 필수적인 효소, 펩티도글리칸 생합성에 관여하는 효소, LPS 생합성에 관여하는 효소, 뉴클레오티드 합성에 관여하는 효소 또는 번역 개시 인자이다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 생산에 필수적인 효소"는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 아미노산 생산에 관련되고 이들 없이는 그람-음성 세균 균주가 성장할 수 없는 효소를 지칭한다. 아미노산 생산에 필수적인 효소는, 예컨대 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 (asd), 글루타민 신세타제 (glnA), 트립토파닐 tRNA 신세타제 (trpS) 또는 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 (glyA), 또는 트랜스케톨라제 1 (tktA), 트랜스케톨라제 2 (tktB), 리불로스-포스페이트 3-에피머라제 (rpe), 리보스-5-포스페이트 이소머라제 A (rpiA), 트랜스알돌라제 A (talA), 트랜스알돌라제 B (talB), 포스포리보실피로포스페이트 신타제 (prs), ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (hisG), 히스티딘 생합성 이관능성 단백질 HisIE (hisI), 1-(5-포스포리보실)-5-[(5-포스포리보실아미노)메틸리덴아미노] 이미다졸-4-카르복사미드 이소머라제 (hisA), 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 서브유닛 HisH (hisH), 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 서브유닛 HisF (hisF), 히스티딘 생합성 이관능성 단백질 HisB (hisB), 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (hisC), 히스티디놀 데히드로게나제 (hisD), 3-데히드로퀴네이트 신타제 (aroB), 3-데히드로퀴네이트 데히드라타제 (aroD), 시키메이트 (Shikimate) 데히드로게나제 (NADP(+)) (aroE), 시키메이트 키나제 2 (aroL), 시키메이트 키나제 1 (aroK), 3-포스포시키메이트 1-카르복시비닐트랜스퍼라제 (aroA), 코리스메이트 (Chorismate) 신타제 (aroC), P-단백질 (pheA), T-단백질 (tyrA), 방향족-아미노산 아미노트랜스퍼라제 (tyrB), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroG), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroH), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroF), 퀴네이트/시키메이트 데히드로게나제 (ydiB), ATP-의존적 6-포스포프럭토키나제 이소자임 1 (pfkA), ATP-의존적 6-포스포프럭토키나제 이소자임 2 (pfkB), 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 클래스 2 (fbaA), 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 클래스 1 (fbaB), 트리오스포스페이트 이소머라제 (tpiA), 피루베이트 키나제 I (pykF), 피루베이트 키나제 II (pykA), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 A (gapA), 포스포글리세레이트 키나제 (pgk), 2,3-비스포스포글리세레이트-의존적 포스포글리세레이트 뮤타제 (gpmA), 2,3-비스포스포글리세레이트-비의존적 포스포글리세레이트 뮤타제 (gpmM/yibO), 잠재적 포스포글리세레이트 뮤타제 (ytjC/gpmB), 에놀라제 (eno), D-3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 (serA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 (serC), 포스포세린 포스파타제 (serB), L-세린 데히드라타제 1 (sdaA), L-세린 데히드라타제 2 (sdaB), 이화 (catabolic) L-쓰레오닌 데히드라타제 (tdcB), 생합성 (biosynthetic) L-쓰레오닌 데히드라타제 (ilvA), L-세린 데히드라타제 (tdcG), 세린 아세틸트랜스퍼라제 (cysE), 시스테인 신타제 A (cysK), 시스테인 신타제 B (cysM), 베타-시스타치오나제 (malY), 시스타치오닌 베타-리아제 (metC), 5-메틸테트라히드로프테로일트리글루타메이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 (metE), 메치오닌 신타제 (metH), S-아데노실메치오닌 신타제 (metK), 시스타치오닌 감마-신타제 (metB), 호모세린 O-석시닐트랜스퍼라제 (metA), 5'-메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다제 (mtnN), S-리보실호모시스테인 리아제 (luxS), 시스타치온 베타 리아제, 시스타치온 감마 리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (glyA), 글리신 히드록시메틸트랜스퍼라제 (itaE), 3-이소프로필말레이트 데히드라타제 작은 서브유닛 (leuD), 3-이소프로필말레이트 데히드라타제 큰 서브유닛 (leuC), 3-이소프로필말레이트 데히드로게나제 (leuB), 생합성 L-쓰레오닌 데히드라타제 (ilvA), 아세토락테이트 신타제 이소자임 3 큰 서브유닛 (ilvI), 아세토락테이트 신타제 이소자임 3 작은 서브유닛 (ilvH), 아세토락테이트 신타제 이소자임 1 작은 서브유닛 (ilvN), 아세토락테이트 신타제 이소자임 2 작은 서브유닛 (ilvM), 케놀-산 리덕토이소머라제 (NADP(+)) (ilvC), 디히드록시-산 데히드라타제 (ilvD), 분지쇄-아미노산 아미노트랜스퍼라제 (ilvE), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 1 (thrA), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 2 (metL), 2-이소프로필말레이트 신타제 (leuA), 글루타메이트-피루베이트 아미노트랜스퍼라제 (alaA), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspC), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 1 (thrA), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 2 (metL), 리신-민감성 아스파르토키나제 3 (lysC), 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 (asd), 2-케토-3-데옥시-갈락토네이트 알돌라제 (yagE), 4-히드록시-테트라히드로디피콜리네이트 신타제 (dapA), 4-히드록시-테트라히드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 2,3,4,5-테트라히드로피리딘-2,6-디카르복실레이트 N-석시닐트랜스퍼라제 (dapD), 석시닐-디아미노피멜리에이트 데석시닐라제 (dapE), 디아미노피멜리에이트 에피머라제 (dapF), 잠정적 리아제 (yjhH), 아세틸오르니틴/석시닐디아미노피멜리에이트 아미노트랜스퍼라제 (argD), 시트레이트 신타제 (gltA), 아코니테이트 히드라타제 B (acnB), 아코니테이트 히드라타제 A (acnA), 미보고의 (uncharactrized) 잠정적 아코니테이트 히드라타제 (ybhJ), 이소시트레이트 데히드로게나제 (icd), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspC), 글루타메이트-피루베이트 아미노트랜스퍼라제 (alaA), 글루타메이트 신타제 [NADPH] 큰 사슬 (gltB), 글루타메이트 신타제 [NADPH] 작은 사슬 (gltD), 글루타민 신세타제 (glnA), 아미노산 아세틸트랜스퍼라제 (argA), 아세틸글루타메이트 키나제 (argB), N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제 (argC), 아세틸오르니틴/석시닐디아미노피멜리에이트 아미노트랜스퍼라제 (argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제 (argE), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 사슬 F (argF), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 사슬 I (argI), 아르기니노석시네이트 신타제 (argG), 아르기니노석시네이트 리아제 (argH), 글루타메이트 5-키나제 (proB), 감마-글루타밀 포스페이트 리덕타제 (proA), 피롤린-5-카르복실레이트 리덕타제 (proC), 오르니틴 시클로데아미나제, 류신-tRNA 리가제 (leuS), 글루타민-tRNA 리가제 (glnS), 세린-tRNA 리가제 (serS), 글리신-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (glyS), 글리신-tRNA 리가제 알파 서브유닛 (glyQ), 티로신-tRNA 리가제 (tyrS), 쓰레오닌-tRNA 리가제 (thrS), 페닐알라닌-tRNA 리가제 알파 서브유닛 (pheS), 페닐알라닌-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (pheT), 아르기닌-tRNA 리가제 (argS), 히스티딘-tRNA 리가제 (hisS), 발린-tRNA 리가제 (valS), 알라닌-tRNA 리가제 (alaS), 이소류신-tRNA 리가제 (ileS), 프롤린-tRNA 리가제 (proS), 시스테인-tRNA 리가제 (cysS), 아스파라긴-tRNA 리가제 (asnS), 아스파르테이트-tRNA 리가제 (aspS), 글루타메이트-tRNA 리가제 (gltX), 트립토판-tRNA 리가제 (trpS), 글리신-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (glyS), 메치오닌-tRNA 리가제 (metG), 리신-tRNA 리가제 (lysS)이다. 바람직한 아미노산 생산에 필수적인 효소는 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS이고, asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS가 더욱 바람직하고, asd가 가장 바람직하다.
용어 "성장에 필수적인 아미노산 생산에 결함이 있는 그람-음성 세균 균주" 및 "영양요구성 변이체"는 본원에서 호환적으로 사용되고 적어도 하나의 외인성으로 제공된 필수 아미노산 또는 이의 전구체의 부재하에서는 성장할 수 없는 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 균주가 생산하는데 결함이 있는 아미노산은, 예컨대 아스파르테이트, 메소-2,6-디아미노피멜산, 방향족 아미노산 또는 류신-아르기닌이다. 이러한 균주는, 예컨대 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 유전자 (Δasd)의 결실에 의해 생성될 수 있다. 이러한 영양요구성 변이체는 외인성 메소-2,6-디아미노피멜산의 부재하에서는 성장할 수 없다. 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 유전자의 결실과 같은 돌연변이가 본원에서 본 발명의 성장에 필수적인 아미노산 생산에 결함이 있는 그람-음성 세균 균주에 바람직하다.
용어 "진핵 세포 표면 또는 세포외 기질에 결합하는 부착 단백질 생산에 결함이 있는 그람-음성 세균 균주"는 상응하는 야생형 균주에 의해 발현되는 부착 단백질에 비해 적어도 하나의 부착 단백질을 발현하지 않는 변이체 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 부착 단백질은, 예컨대 필리/핌브리에 (pili/fimbriae) 또는 비-핌브리에 어드헤신 (adhesin)과 같은 확장된 중합체성 부착 분자를 포함할 수 있다. 핌브리에 어드헤신은 타입-1 필리 (예컨대, FimH 어드헤신 보유 E. coli Fim-pili), P-pili (예컨대, E. coli 유래 PapG 어드헤신 보유 Pap-pili), 타입 4 필리 (예컨대, P. 아에루지노사 유래 필린 (pilin) 단백질) 또는 컬리(curli) (S. 엔테리카 유래 CsgA 어드헤신 보유 Csg 단백질)을 포함할 수 있다. 비-핌브리에 부착에는 Y. 엔테로콜리티카 유래 YadA, BpaA (B. 슈도말레이), Hia (H. 인플루엔자), BadA (B. 헨셀라에), NadA (N. 메닝지티디스) 또는 UspA1 (M. 카타르랄리스)와 같은 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신뿐만 아니라, AIDA-1 (E. coli)과 같은 다른 오토트랜스포터 어드헤신과, Y. 엔테로콜리티카 유래 InvA 또는 인티민 (Intimin) (E. coli) 또는 Dr-패밀리 또는 Afa-패밀리의 구성원 (E. coli)과 같은 다른 어드헤신/인베이신 (invasin)이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 YadA 및 InvA는 Y. 엔테로콜리티카 유래 단백질을 지칭한다. 오토트랜스포터 YadA7은 피브로넥틴뿐만 아니라 다양한 형태의 콜라겐에 결합하지만, 인베이신 InvA8은 진핵 세포막에서 β-인테크린에 결합한다. 만약 그람-음성 세균 균주가 Y. 엔테로콜리티카 균주라면, 이 균주는 바람직하게는 InvA 및/또는 YadA에 결함이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 패밀리"는 토양, 물, 식물, 및 동물에서 발견되는 그람-음성균, 막대-모양의 통성 혐기성 세균의 패밀리를 포함하고, 척추동물에서 병원균으로 빈번히 발생한다. 이 패밀리의 세균은 유사한 생리학을 공유하고 각 게놈의 기능적 요소 및 유전자 내에서 보존성을 입증한다. 옥시다제 음성일 뿐만 아니라, 이 패밀리의 모든 구성원은 글루코스 발효기이며 대부분 질산염 환원제이다.
본 발명의 엔테로박테리아세아에 세균은 이 패밀리로부터의 임의의 세균일 수 있고, 구체적으로 다음의 속을 포함하는 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 에스케리치아 , 쉬겔라, 에드와드시엘라 , 살모넬라, 시트로박터 , 클렙시엘라 , 엔테로박터, 세라티아, 프로테우스, 에르위니아 , 모르가넬라 , 프로비덴시아 , 또는 예르시니아. 보다 구체적인 구현에에서, 세균은 에스케리치아 콜라이 , 에스케리치아 블라타에, 에스케리치아 페르구소니이 , 에스케리치아 헤르마니이 , 에스케리치아 부 네리스 , 살모넬라 엔테리카 , 살모넬라 본고리 , 쉬겔라 디센테리아에 , 쉬겔라 플렉스네리 , 쉬겔라 보이디이 , 쉬겔라 손네이 , 엔테로박터 아에로게네스 , 엔테로박터 게르고비아에 , 엔테로박터 사카자키이 , 엔테로박터 클로아카에, 엔테로박터 아글로머란스 , 클렙시엘라 뉴모니아에 , 클렙시엘라 옥시토카 , 세라티아 마르세센스 , 예르시니아 슈도투베르쿨로시스 , 예르시니아 페스티스 , 예르시니아 엔테로콜리티카 , 에르위니아 아밀로보라 , 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 프로테우스 펜네리, 프로테우스 하우세리 , 프로비덴시아 알칼리파시엔스 , 또는 모르가넬라 모르가니이 종의 세균이다.
바람직하게는 그람-음성 세균 균주는 속 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라, 쉬겔라, 슈도모나스, 클라마이디아 , 에르위니아 , 판토에아 , 비브리오, 버크홀데리아 , 랄스토니아, 잔토모나스 , 크로모박테리움 , 소달리스 , 시트로박터 , 에드와르드시엘라 , 리조비아에 , 아에로모나스 , 포토라브두스 , 보르데텔라 및 데설포비브 리오로 구성된 군으로부터, 더욱 바람직하게는 속 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라, 및 슈도모나스로 구성된 군으로부터, 가장 바람직하게는 속 예르시니아 및 살모넬라로 구성된 군으로부터 선택되고, 특히 예르시니아이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "예르시니아 (Yersinia)"는 예르시니아 엔테로콜리티카 , 예르시니아 슈도투베르쿨로시스 및 예르시니아 페스티스를 비롯한, 모든 종의 예르시니아를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "살모넬라 (Salmonella)"는 살모넬라 엔테리 카 및 S. 본고리를 비롯한, 모든 종의 살모넬라를 포함한다. 살모넬라 엔테리카가 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이 "프로모터"는 전사 단위의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다. "프로모터 영역"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합하고 하류 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 조절 영역이다. 프로모터 영역 내에서 전사 개시 부위 (편리하게 뉴클리아제 S1과의 맵핑에 의해 정의됨), 뿐만 아니라 잠정적 -35 영역 및 Pribnow 박스와 같은 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 발견될 것이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 DNA 영역과 같은 2개 뉴클레오티드 사이의 관계를 설명할 때 단순히 이들이 기능적으로 서로 관련되어 있고 이들이 동일한 핵산 단편 위에 위치하고 있음을 의미한다. 프로모터가 유전자의 전사를 제어하고 유전자와 동일한 핵산 단편 위에 위치하는 경우 프로모터는 구조적 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 프로모터는 상기 그람-음성 세균 균주에서 기능적이고, 즉 프로모터는 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있고, 즉 프로모터는 추가의 유전적 조작 또는 추가 단백질의 발현 없이 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있다. 또한, 기능적 프로모터는 세균성 T3SS에 대해 당연히 반대로-조절되지 않아야 한다.
본원에 사용된 용어 "여분의-염색체 유전적 요소"는 병원성 플라스미드와 같은 본 발명의 그람-음성 세균 균주에 의해 내생적으로 보유되거나 그람-음성 세균 균주가 형질전환되고 병원성 플라스미드와 같이 염색체 내로 또는 내생적으로 보유된 염색체 이외의 유전적 요소 내로 일시적 또는 안정적으로 통합되는 외인성 유전적 요소인 염색체 이외의 유전적 요소를 지칭한다. 이러한 여분의-염색체 유전적 요소는 발현 벡터와 같은 벡터, 병원성 플라스미드와 같이 상동 재조합 또는 염색체 내로 또는 내생적으로 보유된 염색체 이외의 유전적 요소 내로의 다른 통합을 위한 벡터, 병원성 플라스미드와 같이 상동 재조합 또는 염색체 내로 또는 내생적으로 보유된 염색체 이외의 유전적 요소 내로의 다른 통합을 위한 DNA 단편 또는 병원성 플라스미드와 같이 염색체 내로 또는 내생적으로 보유된 염색체 이외의 유전적 요소 내로의 부위 특이적 삽입을 가이드하는 RNA 요소, 예컨대 CRISPR/Cas9 및 관련 가이드 RNA일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "RNA 온도센서 영역"은 관련 유전자의 유전자 발현을 조절하는, 온도-민감성 비-코딩 RNA 서열을 지칭한다. 일반적으로 RNA 온도센서 영역은 저해적 (repressive) 온도에서 안정하게 형성되고 허용적 (permissive) 온도에서는 불안정하며, 리보솜 결합 부위와 같이 번역에 필수적인 RNA 서열을 차폐하는, RNA 헤어핀 루프로서 이차 구조를 형성함으로써 기능을 하고, 이러한 방식은 번역에 필수적인 그러한 RNA 서열과 관련된 유전자의 발현을 조절한다.
본원에 사용된 용어 "RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부"는 스템-루프 (stem-loop) 구조를 초래하는 분자내 염기-쌍에 의해 형성된 RNA 이차 구조를 지칭한다. 일반적으로 동일한 RNA 가닥 내에서, 분자내 염기-쌍은 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부로 인해 형성된다.
AraC/XylS 패밀리로도 언급되는, 본원에 사용된 용어 "AraC-타입 DNA 결합 단백질"은 나선-회전-나선 모티프(helix-turn-helix motif)를 통해 DNA에 결합하는 세균성 전사 조절 단백질을 지칭한다. AraC-타입 DNA 결합 단백질의 대부분의 구성원은 양성 전사 조절자이고, 2개의 나선-회전-나선 서브도메인을 함유하는 100개 잔기 스트레치에 걸쳐서 연장되는 최소 DNA 결합 도메인을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, AraC-타입 DNA 결합 단백질에는 다음이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다: VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, AraC, XylS, ExsA, PerA, MmsR, RhaS, TcpN, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, MarA, CafR, FapR 및 InvF. 병원성 관련 메커니즘의 조절에 관여하는 AraC-타입 DNA 결합 단백질, 예컨대 VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, TcpN, CafR, FapR 및 InvF가 바람직하다. VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD 및 InvF와 같이 3개 유형의 분비 시스템 활성의 조절에 관여하는 AraC-타입 DNA 결합 단백질이 더욱 바람직하고, VirF 및/또는및 LcrF가 가장 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "전달"은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 유래 단백질의 진핵 세포로의 운반을 지칭하고, 이는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에서 이종 단백질을 발현시키고, 이러한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주로부터 발현된 단백질(들)을 분비하고, 이러한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 분비된 단백질(들)을 진핵 세포의 세포질 내로 전위시키는 단계를 포함한다. 따라서, 본원에서 호환적으로 사용되는 용어 "전달 신호" 또는 "분비 신호"는 그람-음성 세균 균주의 분비 및 전위 시스템에 의해 인식될 수 있고 그람-음성 세균 균주 유래 단백질의 진핵 세포로의 전달을 지시하는 폴리펩티드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호"는 재조합 그람-음성 세균 균주에서 기능적인 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 지칭하는데, 이는 재조합 그람-음성 세균 균주에서 발현된 이종 단백질이 타입 III, 타입 IV 또는 타입 VI 분비 시스템과 같은 분비 시스템에 의해 이러한 재조합 그람-음성 세균 균주로부터 분비되게 하거나 또는 타입 III, 타입 IV 또는 타입 VI 분비 시스템과 같은 분비 시스템에 의해 진핵 세포의 세포질 내로 이러한 재조합 그람-음성 세균 균주에 의해 전위되게 한다. 본원에 사용된 용어 "세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호"는 또한 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호의 단편, 즉 전달 신호의 더 짧은 버전, 예컨대 자연적으로 발생하는 전달 신호와 같은 전달 신호의 최대 10개, 바람직하게는 최대 20개, 더욱 바람직하게는 최대 50개, 더욱 더 바람직하게는 최대 100개, 특히 최대 140개 아미노산을 포함하는 전달 신호의 단편을 포함한다. 따라서, 예컨대 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 DNA 서열과 같은 뉴클레오티드 서열은 전장의 전달 신호 또는 이의 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 단편은 통상 최대 30개, 바람직하게는 최대 60개, 더욱 바람직하게는 최대 150개, 더욱 더 바람직하게는 최대 300개, 특히 최대 420개 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 "분비"는 이종 단백질이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 세포막을 가로질러 외부로 운반되는 것을 지칭한다. 단백질의 "전위 (translocation)"는 이종 단백질이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주로부터 진핵 세포의 원형질막을 가로질러 이러한 진핵 세포의 세포질 내로 운반되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "분비 시스템 기구의 일부인, 세균성 단백질"은 세균성 타입 3 분비 시스템 (T3SS), 타입 4 분비 시스템 (T4SS) 및 타입 6 분비 시스템 (T6SS), 바람직하게는 T3SS의 필수 구성요소를 구성하는 세균성 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질이 없는 경우, 분비 시스템 및 전위되는 세균성 이펙터 단백질의 모든 다른 구성요소가 여전히 인코딩되고 생산된다고 하더라도 각각의 분비 시스템은 숙주 세포로의 단백질 전위에 비-기능적이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세균성 이펙터 단백질"은 분비 시스템에 의해, 예컨대 분비 시스템 기구의 일부인 세균성 단백질에 의해 숙주 세포 내로 운반되는 세균성 단백질을 지칭한다. 이러한 이펙터 단백질은 분비 시스템에 의해, 이들이 예컨대 다양한 숙주 단백질 및 세포 기구에 대해 병원성 활성을 발휘하는 숙주 세포 내로 전달된다. 다양한 분비 시스템 유형에 의해 운반되고, 숙주 조절 분자의 기능을 조정하는 생화학적 활성의 거대 레퍼토리를 나타내는 다수의 상이한 이펙터 단백질이 알려져 있다. 분비 시스템에는 타입 3 분비 시스템 (T3SS), 타입 4 분비 시스템 (T4SS) 및 타입 6 분비 시스템 (T6SS)이 포함된다. 일부 이펙터 단백질 (예컨대, 쉬겔라 플렉스네리 IpaC)이 또한 분비 시스템 기구의 일부이고 단백질 전위를 가능케 하는, 세균성 단백질의 부류에 속한다. 일반적으로 본원에 사용된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 타입 3 분비 시스템 (T3SS), 타입 4 분비 시스템 (T4SS) 및/또는 타입 6 분비 시스템 (T6SS), 바람직하게는 타입 3 분비 시스템 (T3SS)의 필수 구성요소를 구성하는 세균성 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "세균성 T3SS의 필수 구성요소를 구성하는 세균성 단백질"은 자연적으로 인젝티좀 (injectisome), 예컨대 주사 니들 (injection needle)을 형성하거나 다르게는 진핵 세포 내로 단백질을 전위하는 그의 기능에 필수적인 단백질을 지칭한다. 인젝티좀을 형성하거나 다르게는 진핵 세포 내로 단백질을 전위하는 그의 기능에 필수적인 단백질에는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 다음이 포함된다: SctC, YscC, MxiD, InvG, SsaC, EscC, HrcC, HrcC (세크레틴), SctD, YscD, MxiG, Prg, SsaD, EscD, HrpQ, HrpW, FliG (외부 MS 고리 단백질), SctJ, YscJ, MxiJ, PrgK, SsaJ, EscJ, HrcJ, HrcJ, FliF (내부 MS 고리 단백질), SctR, YscR, Spa24, SpaP, SpaP, SsaR, EscR, HrcR, HrcR, FliP (소수의 배출 장치 단백질), SctS, YscS, Spa9 (SpaQ), SpaQ, SsaS, EscS, HrcS, HrcS, FliQ (소수의 배출 장치 단백질), SctT, YscT, Spa29 (SpaR), SpaR, SsaT, EscT, HrcT, HrcT, FliR (소수의 배출 장치 단백질), SctU, YscU, Spa40, SpaS, SpaS, SsaU, EscU, HrcU, HrcU, FlhB (배출 장치 스위치 단백질), SctV, YscV, MxiA, InvA, SsaV, EscV, HrcV, HrcV, FlhA (주요 배출 장치 단백질), SctK, YscK, MxiK, OrgA, HrpD (부속 세포질 단백질), SctQ, YscQ, Spa33, SpaO, SpaO, SsaQ, EscQ, HrcQA+B, HrcQ, FliM + FliN (C 고리 단백질), SctL, YscL, MxiN, OrgB, SsaK, EscL, Orf5, HrpE, HrpF, FliH (Stator), SctN, YscN, Spa47, SpaL, InvC, SsaN, EscN, HrcN, HrcN, FliI (ATPase), SctO, YscO, Spa13, SpaM, InvI, SsaO, Orf15, HrpO, HrpD, FliJ (Stalk), SctF, YscF, MxiH, PrgI, SsaG, EscF, HrpA, HrpY (니들 필라멘트 단백질), SctI, YscI, MxiI, PrgJ, SsaI, EscI, rOrf8, HrpB, HrpJ, (내부 막대 단백질), SctP, YscP, Spa32, SpaN, InvJ, SsaP, EscP, Orf16, HrpP, HpaP, FliK (니들 길이 조절자), LcrV, IpaD, SipD (친수성 전위자, 니들 팁 단백질), YopB, IpaB, SipB, SseC, EspD, HrpK, PopF1, PopF2 (소수성 전위자, 기공 단백질), YopD, IpaC, SipC, SseD, EspB (소수성 전위자, 기공 단백질), YscW, MxiM, InvH (Pilotin), SctW, YopN, MxiC, InvE, SsaL, SepL, HrpJ, HpaA (게이트키퍼).
본원에 사용된 바와 같이 용어 "T6SS 이펙터 단백질" 또는 "세균성 T6SS 이펙터 단백질"은 진핵 세포 또는 세균의 세포질 내로 T6S 시스템에 의해 자연적으로 주입되는 단백질과, 예컨대 진핵 막 내로의 전위 기공을 형성할 수 있는 T6S 시스템에 의해 자연적으로 분비되는 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "T4SS 이펙터 단백질" 또는 "세균성 T4SS 이펙터 단백질"은 진핵 세포의 세포질 내로 T4S 시스템에 의해 자연적으로 주입되는 단백질과, 예컨대 진핵 막 내로의 전위 기공을 형성할 수 있는 T4S 시스템에 의해 자연적으로 분비되는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T3SS 이펙터 단백질" 또는 "세균성 T3SS 이펙터 단백질"은 진핵 세포의 세포질 내로 T3S 시스템에 의해 자연적으로 주입되는 단백질과, 예컨대 진핵 막 내로 전위 기공을 형성할 수 있는 T3S 시스템에 의해 자연적으로 분비되는 단백질 (기공-형성 전위자 (pore-forming tranlocator) (예컨대, 예르시니아 YopB 및 YopD) 및 예르시니아 LcrV과 같은 tip-단백질 포함)을 지칭한다. 바람직하게는 진핵 세포의 세포질 내로 T3S 시스템에 의해 자연적으로 주입되는 단백질이 사용된다. 이러한 병원성 인자는 병원체의 이익을 위해 진핵 세포를 마비시키거나 재프로그램할 것이다. T3S 이펙터는 거대 레퍼토리의 생화학적 활성을 나타내고 중요한 숙주 조절 분자의 기능을 조절하며 AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA 패밀리 단백질, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "악성 고형 종양에 축적하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주" 또는 "재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 악성 고형 종양에 축적한다"라는 용어는 악성 고형 종양 내에서 복제함으로써 악성 고형 종양 내부에 이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 세균 수를 증가시키는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 놀랍게도 대상체에의 투여 후 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 악성 고형 종양에 특이적으로 축적하고, 즉 악성 종양이 존재하는 장기에 특이적으로 축적하는 것으로 나타났고, 이때 악성 고형 종양이 전혀 존재하지 않는 장기에서의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 세균 수는 낮거나 검출가능하지 않다.
예르시니아와 같이 세포외 거주 세균의 경우, 이 세균은 대부분 종양 세포 사이에 형성된 세포 사이의 공간 내에 축적한다. 살모넬라와 같은 세포내 성장 세균은 대부분 종양 세포를 침범하여 그러한 세포 내부에 거주하지만, 세포외 축적이 여전히 일어날 수 있다. 악성 고형 종양 내부에 축적된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 세균 수는, 예컨대 종양 조직 g당 104 내지 109 세균의 범위일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 비정상적인 세포가 통제 없이 분열하고 근처 조직을 침범할 수 있는 질병을 지칭한다. 암세포는 또한 혈액과 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 전파될 수 있다. 몇 가지 주요 유형의 암이 있다. 암종은 내부 장기를 연결하거나 덮는 피부 또는 조직에서 개시하는 암이다. 육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 개시하는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액-형성 조직에서 개시하고, 많은 수의 비정상적인 혈액 세포가 생성되어 혈액에 유입되는 암이다. 림프종 및 다발성 골수종은 면역 체계의 세포에서 개시하는 암이다. 중추신경계 암은 뇌 및 척수의 조직에서 개시하는 암이다. 본원에 사용된 용어 "암"은 고형 종양, 즉 육종, 암종, 및 림프종과 같은 악성 고형 종양 및 백혈병과 같은 비-고형 종양 (혈액의 암)을 포함한다. 악성 고형 종양이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "악성 고형 종양" 또는 "악성 고형 종양 징후"는 일반적으로 낭종이나 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성 (암이 아님), 또는 악성 (암)일 수 있다. 악성 고형 종양은 본 발명의 방법으로 치료된다. 상이한 유형의 악성 고형 종양은 그들을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 악성 고형 종양의 예시는 육종, 암종, 및 림프종이다. 백혈병 (혈액의 암)은 일반적으로 악성 고형 종양을 형성하지 않는다 (NIH의 국립암연구서에 따른 정의). 악성 고형 종양에는 간, 대장, 대장직장 (colorectum), 피부, 유방, 췌장, 자궁경부, 자궁체부 (corpus uteri), 방광, 담낭, 신장, 후두, 입술, 구강, 식도, 난소, 전립선, 위, 정소, 갑상선 또는 폐와 같은 상이한 조직 유형에서 유래할 수 있는 비정상적 세포 덩어리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 따라서 악성 고형 간, 대장, 대장직장, 피부, 유방, 췌장, 자궁경부, 자궁체부, 방광, 담낭, 신장, 후두, 입술, 구강, 식도, 난소, 전립선, 위, 정소, 갑상선 또는 폐 종양을 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 바람직한 악성 고형 종양은 피부, 유방, 간, 췌장, 방광, 전립선 및 대장으로부터 유래하는 악성 고형 종양이고, 따라서 악성 고형 피부, 유방, 간, 췌장, 방광, 전립선 및 대장 종양을 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 동등하게 바람직한 악성 고형 종양은 간세포 암종과 같이 간암과 연관된 악성 고형 종양이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "진핵 세포에 대해 병원성인 세균성 이펙터 단백질"은 분비 시스템에 의해 숙주 세포 내로 운반되며 그곳에서 다양한 숙주 단백질 및 세포 기구에 대해 그들의 병원성 활성을 발휘하는 세균성 이펙터 단백질을 지칭한다. 다양한 분비 시스템 유형에 의해 운반되고, 숙주 조절 분자의 기능을 조절하는 거대 레퍼토리의 생화학적 활성을 나타내는 다수의 상이한 이펙터 단백질이 알려져 있다. 분비 시스템에는 타입 3 분비 시스템 (T3SS), 타입 4 분비 시스템 (T4SS) 및 타입 6 분비 시스템 (T6SS)이 포함된다. 중요하게는, 진핵 세포에 대해 병원성인 일부 이펙터 단백질 (예컨대, 쉬겔라 플렉스네리 IpaC)이 또한 분비 시스템 기구의 일부인, 세균성 단백질의 부류에 속한다. 진핵 세포에 대해 병원성인 세균성 이펙터 단백질이 또한 분비 기구의 기능에 필수적인 경우에, 이러한 단백질은 이 정의로부터 제외된다. 진핵 세포에 대해 병원성인 T3SS 이펙터 단백질은 Y. 엔테로콜리티카 YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT 또는 쉬겔라 플렉스네리 OspF, IpgD, IpgB1 또는 살모넬라 엔테리카 SopE, SopB, SptP 또는 P. 아에루지노사 ExoS, ExoT, ExoU, ExoY 또는 E. coli Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ와 같은 단백질을 지칭한다. 진핵 세포에 대해 병원성인 T4SS 이펙터 단백질은 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) LidA, SidC, SidG, SidH, SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, YlfA, YlfB, VipA, VipF, VipD, VpdA, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, Ceg10, Ceg23, Ceg29 또는 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae) BepA, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF BepG 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) VirD2, VirE2, VirE3, VirF 또는 H. 파일로리 (H. pylori) CagA 또는 보르데텔라 퍼투시스 독소와 같은 단백질을 지칭한다. 진핵 세포에 대해 병원성인 T6SS 이펙터 단백질은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) VgrG 단백질 (예컨대, VgrG1)과 같은 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "진핵 세포에 대해 병원성인 T3SS 이펙터 단백질" 또는 "진핵 세포에 대해 병원성인 세균성 T3SS 이펙터 단백질"은 진핵 세포의 세포질 내로 T3S 시스템에 의해 자연적으로 주입되는 단백질과, 예컨대 진핵 세포 내로의 전위 기공을 형성할 수 있는 T3S 시스템에 의해 자연적으로 분비되는 단백질을 지칭하고, 이들은 진핵 세포에 대한 병원성 인자이고, 즉 병원체의 이익을 위해 진핵 세포를 마비시키거나 재프로그램하는 단백질을 지칭한다. 이펙터는 거대 레퍼토리의 생화학적 활성을 나타내고 식세포작용 (phagocytosis) 및 액틴 세포골격, 염증성 신호전달, 아폽토시스, 세포내이입 (endocytosis) 또는 분비 경로2 ,9와 같은 중요한 숙주 조절 메커니즘의 기능을 조절하며, AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA 단백질 패밀리, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA,, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA를 포함한다.
진핵 세포에 대해 병원성이고, 예컨대 Y. 엔테로콜리티카로부터 결실/변이될 수 있는 예르시니아의 T3SS 이펙터 유전자는 YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (YopJ로도 명명됨), 및 YopT이다10. 진핵 세포에 대해 병원성인 각각의 이펙터 유전자는 쉬겔라 플렉스네리 (예컨대, OspF, IpgD, IpgB1), 살모넬라 엔테리카 (예컨대, SopE, SopB, SptP), P. 아에루지노사 (예컨대, ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) 또는 E. coli (예컨대, Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ)로부터 결실/변이될 수 있다. 이들 유전자의 핵산 서열은 예컨대 Genebank Database (NC_002120 GI:10955536으로부터의 yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT; AF386526.1 GI:18462515로부터의 S. 플렉스네리 이펙터 단백질; NC_016810.1 GI:378697983 또는 FQ312003.1 GI:301156631로부터의 S. 엔테리카 이펙터; AE004091.2 GI:110227054 또는 CP000438.1 GI:115583796으로부터의 P. 아에루지노사 이펙터 및 NC_011601.1 GI:215485161로부터의 E. coli 이펙터 단백질)에서 당해 분야의 숙련자에게 이용가능하다.
본 발명의 목적을 위하여, 유전자는 소문자로 표기되고 단백질과 구별되게 이텔릭체로 표시된다. (소문자 및 이텔릭체로 표기된) 유전자가 세균 종 이름 (예컨대, E. coli)에 이어지는 경우, 이들은 상응하는 세균 종에서 상응하는 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, YopE는 yopE 유전자에 의해 인코딩되는 이펙터 단백질을 지칭한다. Y . 엔테로콜리티카 yopE는 yopE 유전자에서 돌연변이를 갖는 Y. 엔테로콜리티카를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", "단백질", "폴리펩티드성" 및 "펩티드성"은 인접한 잔기의 알파-아미노기와 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 호환적으로 사용된다. 적어도 10개 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 바람직하다.
본 발명에 따르면, "이종 단백질"은 자연 발생적인 단백질 또는 이의 일부를 포함하고 또한 인공적으로 조작된 단백질 또는 이의 일부를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 단백질"은 그것이 융합될 수 있는 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편 이외의 단백질 또는 이의 일부를 지칭한다. 구체적으로, 본원에 사용된 바와 같이 이종 단백질은 단백질체 (proteome)에 속하지 않는 단백질 또는 이의 일부, 즉 예컨대, 단백질체에 속하지 않는, 본 발명에 의해 제공되고 사용되는 특정 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 전체 천연 단백질 전량 (complement), 즉 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 속의 특정 세균 균주의 전체 천연 단백질 전량을 지칭한다. 일반적으로 이종 단백질은 인간 기원을 비롯한 동물 기원이다. 바람직하게는 이종 단백질은 인간 단백질 또는 이의 일부이다. 더욱 바람직하게는 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein), 세포 신호전달 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 프로테아제, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물 및 나노바디, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히 바람직하게는 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 안키린 반복 단백질, 리포터 단백질, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 및 안키린 반복 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 이종 단백질이 더욱 더 바람직하다. 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질 또는 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 특히 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이 가장 바람직하고, 동물과 같이, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 인간 이종 단백질 또는 인간 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 인간 단백질이 바람직하다. 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질은 바람직하게는 타입 I 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이고, 더욱 바람직하게는 타입 I 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 인간 단백질이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 서로에게 독립적으로 프레임 내 융합된 동일하거나 상이한 2개의 이종 단백질을 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 서로에게 독립적으로 프레임 내 융합된 동일하거나 상이한 3개의 이종 단백질을 인코딩하는 3개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 발현된 이종 단백질은 일반적으로 1과 150 kD 사이, 바람직하게는 1과 120 kD 사이, 더욱 바람직하게는 1과 100 kDa 사이, 가장 바람직하게는 10과 80 kDa 사이의 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 이종 단백질의 일부는 이종 단백질의 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 이종 단백질의 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 이종 단백질의 1개 또는 2개 도메인, 더욱 바람직하게는 이종 단백질의 2개 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질의 반복된 도메인 또는 상이한 이종 단백질의 2개 이상의 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단백질의 동일한 기능 부류에 속하는 이종 단백질"은 동일한 기능을 갖는 이종 단백질, 예컨대 효소 활성을 갖는 이종 단백질, 예컨대 세포 주기 조절과 같은 동일한 경로에서 작용하는 이종 단백질, 또는 동일한 부류의 세균성 이펙터 단백질에 속하는 것과 같이 공통의 특정한 특성을 공유하는 이종 단백질을 지칭한다. 단백질의 기능적 부류는, 예컨대 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자로 작용하는 단백질, 안키린 반복 단백질, 세포 신호전달 단백질, 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 프로테아제, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물 및 나노바디, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 또는 진핵 세포에 대한 병원성을 확립하는 생물학적 과정에서 공동으로 작용하는 바이러스 단백질이다.
본 발명에 따르면, "이종 단백질의 도메인"은 자연 발생적인 단백질의 도메인을 포함하고 또한 인공적으로 조작된 단백질의 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 단백질의 도메인"은 T3SS 이펙터 단백질의 도메인 이외의 이종 단백질의 도메인 또는 융합 단백질을 달성하도록 융합될 수 있는 그의 N-말단 단편을 포함하는 도메인 이외의 도메인을 지칭한다. 구체적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 이종 단백질의 도메인은 단백질체에 속하지 않는 이종 단백질의 도메인, 즉 예컨대 단백질체에 속하지 않는, 본 발명에 의헤 제공되고 사용되는 특정 재조합 그람-음성 세균 균주의 전체 천연 단백질 전량, 즉 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 속의 특정 세균 균주의 전체 천연 단백질 전량을 지칭한다. 일반적으로, 이종 단백질의 도메인은 인간 기원을 비롯한 동물 기원이다. 바람직하게는, 이종 단백질의 도메인은 인간 단백질의 도메인다. 더욱 바람직하게는, 이종 단백질의 도메인은 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 안키린 반복 단백질, 세포 신호전달 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 프로테아제, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물 및 나노바디, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 도메인이다. 특히 바람직하게는 이종 단백질의 도메인은 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 안키린 반복 단백질, 리포터 단백질, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 도메인이다. 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 및 안키린 반복 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 이종 단백질의 도메인이 더욱 더 바람직하다. 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 동물 단백질과 같이, 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질의 도메인이 가장 바람직하고, 이종 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 인간 단백질의 도메인이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이종 단백질의 반복 도메인"은 이종 단백질의 도메인의 몇몇 반복으로 구성된 융합 단백질을 지칭하고, 여기서 이들 도메인은 서로에게 직접 융합될 수 있거나 또는 가변 링커, 예컨대 1개와 30개 사이, 바람직하게는 2개와 15개 사이, 더욱 바람직하게는 3개와 10개 사이 아미노산의 링커가 이들 도메인 사이에 도입될 수 있다. 바람직하게는 동일한 반복 도메인 또는 80% 초과, 통상 85% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 더욱 더 바람직하게는 95% 초과, 특히 96% 초과, 더욱 특히 97% 초과, 더 더욱 특히 98% 초과, 가장 특히는 99% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 반복 도메인이 사용된다. 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 동일한 도메인이 또한 바람직하다. 바람직하게는 2개의 반복 도메인, 더욱 바람직하게는 2개의 동일한 반복 도메인 또는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 2개의 반복 도메인이 본원에 언급된 바와 같은 융합 단백질에 포함된다. 2개보다 많은, 예컨대 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 반복 도메인이 또한 본 발명에 의해 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "상이한 이종 단백질의 2개 이상의 도메인"은 상이한 이종 단백질의 적어도 2개 도메인, 예컨대 80% 이하, 바람직하게는 60% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종 단백질의 적어도 2개 도메인의 하나 또는 수 개의 반복으로 구성된 융합 단백질을 지칭하고, 여기서 이들 도메인은 서로에게 직접 융합될 수 있거나 또는 가변 링커, 예컨대 1개와 30개 사이, 바람직하게는 2개와 15개 사이, 더욱 바람직하게는 3개와 10개 사이 아미노산의 링커가 이들 도메인 사이에 도입될 수 있다. 바람직하게는 상이한 이종 단백질의 2개 도메인이 본원에 언급된 바와 같은 융합 단백질에 포함된다. 2개보다 많은, 예컨대 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 반복 도메인이 또한 본 발명에 의해 고려된다.
재조합 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되는 이종 단백질의 도메인은 일반적으로 1-50 kDa 사이, 바람직하게는 1-30 kDa 사이, 더욱 바람직하게는 1-20 kDa 사이, 가장 바람직하게는 1-10 kDa 사이의 분자량을 갖는다.
본 발명에 따르면, "IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질"에는 cGAS, STING, TRIF, TBK1, IKKepsilon, IRF3, TREX1, VPS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, IPS-1/MAVS/Cardif/VISA, Trim25, Trim32, Trim56, Riplet, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSm14A, LRRFIP1, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, IFNAR1, IFNAR2, TYK2, JAK1, ISGF3, IL10R2, IFNLR1, IFNGR1, IFNGR2, JAK2, STAT4, 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소 (사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제), 예컨대 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS 또는 이의 단편이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, "타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질"에는 cGAS, STING, TRIF, TBK1, IKKepsilon, IRF3, TREX1, VPS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, IPS-1/MAVS/Cardif/VISA, Trim25, Trim32, Trim56, Riplet, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSm14A, LRRFIP1, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소 (사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제), 예컨대 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS 또는 이의 단편이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.
타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 바람직한 단백질은 cGAS, STING, TRIF, TBK1, IKKepsilon, IRF3, TREX1, VPS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, IPS-1/MAVS/Cardif/VISA, Trim25, Trim32, Trim56, Riplet, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, LSm14A, LRRFIP1, DHX29, DHX15, 및 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소, 예컨대 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제로부터 선택된다.
타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 더욱 바람직한 단백질은 cGAS (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q8N884), RIG1 (인간 단백질의 경우 Uniprot. O95786), MDA5 (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q9BYX4), IPS-1/MAVS (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q7Z434), IRF3 (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q14653), IRF7 (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q92985), IRF9 (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q00978) 및 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소, 예컨대 WspR (P. 아에루지노사 단백질의 경우 Uniprot. Q9HXT9), DncV (V. 콜레라 단백질의 경우 Uniprot. Q9KVG7), DisA 및 DisA-유사 (B. 세레우스 단백질의 경우 Uniprot. Q812L9), CdaA (L. 모노사이토게네스 단백질의 경우 Uniprot. Q8Y5E4), CdaS (B. 서브틸리스 단백질의 경우 Uniprot. O31854 또는 서열번호: 114에서와 같은 구성적 활성 L44F 돌연변이) 및 cGAS (인간 단백질의 경우 Uniprot. Q8N884) 또는 이들 단백질의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제로 구성된 군으로부터 선택된다.
IPS-1/MAVS/Cardif/VISA는 N-말단 CARD 도메인을 함유하고 인간 서열에 대해 "Q7Z434" 및 뮤린 서열에 대해 "Q8VCF0"의 Uniprot (www.uniprot.org) 식별자를 갖는 진핵 미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질을 지칭한다. 용어 "IPS-1/MAVS", "MAVS/IPS-1" 및 "MAVS"는 본원에서 호환적으로 사용되고 N-말단 CARD 도메인을 함유하고 인간 서열에 대해 "Q7Z434" 및 뮤린 서열에 대해 "Q8VCF0"의 Uniprot (www.uniprot.org) 식별자를 갖는 진핵 미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질을 지칭한다.
일부 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 CARD 도메인 함유 단백질 또는 이의 단편 및 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소, 예컨대 사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질의 단편은 일반적으로 25개와 1000개 사이의 아미노산, 바람직하게는 50개와 600개 사이의 아미노산, 더욱 바람직하게는 100개와 400개 사이의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 100개와 362개 사이의 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에서 IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질의 단편은 일반적으로 25개와 1000개 사이의 아미노산, 바람직하게는 50개와 600개 사이의 아미노산, 더욱 바람직하게는 100개와 400개 사이의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 100개와 362개 사이의 아미노산, 특히 100개와 246개 사이의 아미노산을 함유하는 IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질의 N-말단 단편을 포함하거나, 또는 N-말단 아미노산의 아미노산 1과 아미노산 160 사이를 함유하는 아미노산 서열의 결실, 바람직하게는 N-말단 아미노산 1-59 또는 N-말단 아미노산 1-160을 함유하는 아미노산 서열의 결실을 갖는 IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질의 N-말단을 포함하고, 여기서 IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질의 N-말단 단편은 일반적으로 25개와 1000개 사이의 아미노산, 바람직하게는 50개와 600개 사이의 아미노산, 더욱 바람직하게는 100개와 400개 사이의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 100개와 362개 사이의 아미노산을 함유한다.
IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질을 함유하는 CARD 도메인의 단편은 일반적으로 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-500 중 임의의 아미노산 서열, 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-400 중의 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-300 중 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-294 중 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-246 중 임의의 아미노산 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질 함유 CARD 도메인의 단편은 인간 CARD 도메인의 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 294 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 246 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 245 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 229 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 228 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 218 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 217 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 100 이하를 포함하는 아미노산 서열, 및 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 101 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 더욱 구체적으로는 인간 CARD 도메인의 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 245 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 228 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 217 이하를 포함하는 아미노산 서열, 및 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 100 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유한다.
일부 바람직한 구현예에서, IFN 반응 또는 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질을 함유하는 CARD 도메인의 단편은 인간 CARD 도메인의 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 294의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 246의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 245의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 229의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 228의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 218의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 217의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 101의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 더욱 구체적으로는 인간 CARD 도메인의N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 245의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 228의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 217의 아미노산 서열 및 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유한다.
사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제와 같은 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소의 단편은 일반적으로 인간 cGAS의 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-600 중 임의의 아미노산 서열, 바람직하게는 N-말단 아미노산 50 내지 N-말단 아미노산 100-550 중 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 100-530 중 임의의 아미노산 서열, 특히 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 146 내지 N-말단 아미노산 507의 아미노산 서열 또는 N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열, 더욱 특히는 N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, cGAS의 단편은 특히 적어도 N-말단 아미노산 60 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 422 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 146 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 507 이하를 포함하는 아미노산 서열, 및 적어도 N-말단 아미노산 161 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 522 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, cGAS의 단편은 더욱 특히는 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 422의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 146 내지 N-말단 아미노산 507의 아미노산 서열, 및 N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 522의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG1, MDA5, 및 MAVS/IPS-1 또는 이의 단편 및 cGAS 및 이의 단편을 포함하는 CARD 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되고, 특히 RIG1 및 이의 단편을 포함하는 CARD 도메인, MAVS/IPS-1 및 이의 단편, 및 cGAS 및 이의 단편을 포함하는 CARD 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 단백질의 단편이 특히 바람직하다. 더욱 바람직한 이 구현예에서, RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1을 포함하는 CARD 도메인은 RIG-1 또는 이의 단편, 바람직하게는 1-500, 더욱 바람직하게는 1-250, 더욱 더 바람직하게는 1-150 아미노산을 함유하는 단편의 경우에, 자연 발생적인 CARD 도메인(들) 및 추가적으로 자연 발생적인 CARD 도메인(들) 이후에 자연 발생적인 헬리케이즈 도메인을 포함하는, C-말단 아미노산을 포함하거나 (여기서 자연 발생적인 헬리케이즈 도메인 또는 이의 단편은 기능적이지 않으며, 즉 CARD 도메인에 결합하지 않음거나, MAVS/IPS-1 또는 이의 단편, 바람직하게는 1-500, 더욱 바람직하게는 1-250, 더욱 더 바람직하게는 1-150 아미노산을 함유하는 단편의 경우에, 하류 C-말단 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, cGAS 및 이의 단편은 일반적으로 자연 발생적인 신타제 도메인 (NTase 코어 및 C-말단 도메인; 65에 개시되고 인간 단백질의 경우 Uniprot. Q8N884로 등재된 인간 cGAS의 아미노산 160-522)을 포함하고, 바람직하게는 cGAS 및 이의 단편은 자연 발생적인 신타제 도메인을 포함하지만, 일부 또는 완전한 N-말단 도메인의 결실, 바람직하게는 완전한 N-말단 나선 연장 (helical extension)의 결실 (N-말단 나선 연장; 65에 개시되고 인간 단백질의 경우 Uniprot. Q8N884로 등재된 인간 cGAS의 아미노산 1-160)을 갖는다. 일부 또는 완전한 N-말단 도메인의 결실은 바람직하게는 아미노산 1-59의 결실이다.
일부 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG-I-유사 수용체 (RLR) 패밀리 (예컨대, RIG1 및 MDA5) 및 이의 단편, 항바이러스 신호전달 및 타입 I IFN 유도에 관여하는 단백질을 함유하는 다른 CARD 도메인 (예컨대, MAVS/IPS-1) 및 이의 단편, 및 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소, 예컨대 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS, 및 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제로 구성된 군으로부터 선택되고, STING의 자극을 초래한다.
일부 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG1, MDA5, LGP2, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 RIG1, WspR, DncV, DisA-like, 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질은 RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 더 바람직하게는 RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA-like, CdaA, 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 특히 RIG1, MAVS/IPS-1 및cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 단백질의 단편이 특히 바람직하다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1의 단편은 일반적으로 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-500 중 임의의 아미노산 서열, 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-400 중 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-300 중 임의의 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, RIG1의 단편은 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 246 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 245 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 229 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 228 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 218 이하를 포함하는 아미노산 서열, 및 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 217 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유하고; MAVS/IPS-1의 단편은 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 100 이하를 포함하는 아미노산 서열 및 적어도 N-말단 아미노산 1 및 N-말단 아미노산 101 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산을 함유한다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, RIG1의 단편은 보다 구체적으로 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 246의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 245의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 229의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 228의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 218의 아미노산 서열, 및 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 217의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유하고; MAVS/IPS-1의 단편은 보다 구체적으로 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100의 아미노산 서열 및 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 101의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, cGAS의 단편은 일반적으로 인간 cGAS의 N-말단 아미노산 1 내지 N-말단 아미노산 100-600 중 임의의 아미노산 서열, 바람직하게는 N-말단 아미노산 50 내지 N-말단 아미노산 100-550 중 임의의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 100-530 중 임의의 아미노산 서열, 구체적으로 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 146 내지 N-말단 아미노산 507의 아미노산 서열 또는 N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열, 더욱 구체적으로 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열, 또는 N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 530의 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, cGAS의 단편은 특히 적어도 N-말단 아미노산 60 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 422 이하를 포함하는 아미노산 서열, 적어도 N-말단 아미노산 146 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 507 이하를 포함하는 아미노산 서열, 및 적어도 N-말단 아미노산 161 및 N-말단 아미노산 N-말단 아미노산 522 이하를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 바람직한 이 구현예에서, cGAS의 단편은 보다 구체적으로 N-말단 아미노산 60 내지 N-말단 아미노산 422의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 146 내지 N-말단 아미노산 507의 아미노산 서열, N-말단 아미노산 161 내지 N-말단 아미노산 522의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유한다.
더욱 더 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질인 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질은 인간 RIG1 CARD 도메인1 -245 (서열번호: 37), 인간 RIG1 CARD 도메인1 -228 (서열번호: 128), 인간 RIG1 CARD 도메인1 -217 (서열번호: 129), 뮤린 RIG1 CARD 도메인1 -246 (서열번호: 38), 뮤린 RIG1 CARD 도메인1 -229 (서열번호: 110), 뮤린 RIG1 CARD 도메인1 -218 (서열번호: 111), 인간 MAVS CARD 도메인1 -100 (서열번호: 116), 뮤린 MAVS CARD 도메인1 -101 (서열번호: 130), N. 벡텐시스 cGAS (서열번호: 43), 인간 cGAS161-522 (서열번호: 115), 뮤린 cGAS146 -507 (서열번호: 131) 및 N. 벡텐시스 cGAS60 -422 (서열번호: 117)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질은 인간 RIG1 CARD 도메인1 -245, (서열번호: 37), 인간 RIG1 CARD 도메인1 -228 (서열번호: 128), 인간 RIG1 CARD 도메인1 -217 (서열번호: 129), 인간 MAVS CARD 도메인1 -100 (서열번호: 116), 및 인간 cGAS161 -522 (서열번호: 115)로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 특히 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질은 인간 RIG1 CARD 도메인1 -245, 뮤린 RIG1 CARD 도메인1 -246, 뮤린 RIG1 CARD 도메인1-229, 뮤린 RIG1 CARD 도메인1 -218, 인간 MAVS1 -100, N. 벡텐시스 cGAS, 인간 cGAS161-522 및 N. 벡텐시스 cGAS60-422로 구성된 군으로부터 선택된다.
RIG-1-유사 수용체 (RLR) 패밀리는 RIG1, MDA5 및 LGP2로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 바람직한 이종 단백질은 CARD 도메인 함유 단백질 RIG1 및 MDA5, 특히 CARD 도메인 함유 단백질 RIG1이다. 타입 I IFN 유도에 관여하는 다른 CARD 도메인 함유 단백질은 MAVS/IPS-1로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG1의 CARD 도메인, MDA5의 CARD 도메인, 및/또는 MAVS/IPS-1의 CARD 도메인, 및 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS와 이들의 단편을 포함하는 단백질의 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 RIG1의 CARD 도메인 및/또는 MAVS/IPS-1의 CARD 도메인, 및 WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, 및 cGAS 또는 이의 단편을 포함하는 단백질의 그룹으로부터 선택된다.
일부 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG1의 CARD 도메인, MDA5의 CARD 도메인, MAVS/IPS-1의 CARD 도메인, WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 RIG1의 CARD 도메인, WspR, DncV, DisA-like, 및 cGAS로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 하나 이상의 (예컨대, 2개, 3개 또는 4개) CARD 도메인을 포함하고, 바람직하게는 하나 이상의 (예컨대, 2개, 3개 또는 4개) RIG1, MDA5, 및/또는 MAVS/IPS-1의 CARD 도메인, 바람직하게는 RIG1 및/또는 MAVS/IPS-1의 CARD 도메인을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 RIG1 또는 MDA5, 특히 RIG1의 CARD 도메인 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질은 효소적 기능이 없는 타입 I IFN 반응 유도 단백질 또는 효소적 기능이 있는 타입 I IFN 반응 유도 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 포함되는 효소적 기능이 없는 타입 I IFN 반응 유도 단백질은 일반적으로 적어도 하나의 CARD 도메인, 바람직하게는 2개의 CARD 도메인을 포함한다. CARD 도메인은 일반적으로 6개 내지 7개의 알파-나선의 다발, 바람직하게는 소수성 코어 및 하전된 잔기로 구성된 외면을 갖는 6개 내지 7개의 역평행 알파 나선의 배열로 구성된다. 본 발명에 포함되는 효소적 기능이 있는 타입 I IFN 반응 유도 단백질은 일반적으로 STING의 자극을 초래하는 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소 (사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제) 또는 이의 도메인, 바람직하게는 디-아데닐레이트-사이클라제 (DAC), 디-구아닐레이트-사이클라제 (DGC) 또는 GMP-AMP-사이클라제 (GAC) 또는 이들의 도메인을 포함한다.
본 발명에 따르면, "아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질"에는 Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apaf1, 카스파제 9, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP 패밀리, LC8, PP2B, 14-3-3 단백질, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, 카스파제8, 카스파제2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIPs, FKHR, GSK3, CDKs 및 INK4-패밀리 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))와 같은 이들의 저해제, 및 Cip1/Waf1/Kip1-2-패밀리 (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2)이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는 Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, 카스파제9, 카스파제3, 카스파제6, 카스파제7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, 카스파제8, 카스파제2, RIP, RAIDD, FKHR, CDKs 및 INK4-패밀리 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))와 같은 이들의 저해제, 가장 바람직하게는 BIM, Bid, 절두된 (truncated) Bid, FADD, 카스파제 3 (및 이의 서브유닛), Bax, Bad, Akt, CDKs 및 INK4-패밀리 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))와 같은 이들의 저해제가 사용된다11 - 13. 추가적으로, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질에는 DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid 및 tBid, Egl-1, Bcl-Gs, 시토크롬 C, 베클린 (Beclin), CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 8이 포함된다.
아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질에는 프로-아폽토시스 단백질, 항-아폽토시스 단백질, 아폽토시스-예방 경로의 저해제 및 프로-생존 신호전달 또는 경로의 저해제로 구성된 군으로부터 선택된다. 프로-아폽토시스 단백질은 Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, 시토크롬 C, FADD, 카스파제 패밀리, 및 CDKs 및 INK4-패밀리 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))와 같은 이들의 저해제로 구성된 군으로부터 선택되거나 또는 Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, 시토크롬 C, FADD, 및 카스파제 패밀리로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, Smac/Diablo, FADD, 카스파제 패밀리, CDKs 및 INK4-패밀리 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))와 같은 이들의 저해제가 바람직하다. Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, Smac/Diablo, FADD, 카스파제 패밀리가 동일하게 바람직하다.
항-아폽토시스 단백질은 Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, IAP 패밀리 및 Bfl-1로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 및 Bfl-1이 바람직하다.
아폽토시스-예방 경로의 저해제는 Bad, Noxa 및 Cdc25A로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. Bad 및 Noxa가 바람직하다.
프로-생존 신호전달 또는 경로의 저해제는 PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. PTEN, ROCK, PP2A 및 PHLPP가 바람직하다.
일부 구현예에서, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 이종 단백질은 BH3-단독 단백질, 카스파제 및 아폽토시스의 사멸 수용체 제어의 세포내 신호전달 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. BH3-단독 단백질이 바람직하다.
BH3-단독 단백질은 Bad, BIM, Bid 및 tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. Bad, BIM, Bid 및 tBid가, 특히 tBid가 바람직하다.
카스파제는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 카스파제 3, 카스파제 8 및 카스파제 9가 바람직하다.
아폽토시스의 사멸 수용체 제어의 세포내 신호전달 단백질은 FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, 14-3-3 패밀리, FLIP, DFF40 및 45, PEA-15, SODD로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. FADD 및 TRADD가 바람직하다.
일부 구현예에서, 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 2개의 이종 단백질은 그람-음성 세균 균주에 의해 구성되는데, 이때 하나의 단백질은 프로-아폽토시스 단백질이고 다른 하나의 단백질은 아폽토시스-예방 경로의 저해제이거나, 또는 하나의 단백질은 프로-아폽토시스 단백질이고 다른 하나의 단백질은 프로-생존 신호전달 또는 경로의 저해제이다.
본 발명에 포함되는 프로-아폽토시스 단백질은 일반적으로 알파 나선 구조, 바람직하게는 양친매성 나선으로 둘러싸인 소수성 나선을 가지며, 일반적으로 BH1, BH2, BH3 또는 BH4 도메인의 적어도 하나를 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 BH3 도메인을 포함한다. 일반적으로 본 발명에 포함되는 프로-아폽토시스 단백질은 효소적 활성을 갖지 않는다.
본 발명에 포함되는 항-아폽토시스 단백질은 일반적으로 알파 나선 구조, 바람직하게는 양친매성 나선으로 둘러 싸인 소수성 나선을 가지며, 상이한 BH1, BH2, BH3 및 BH4 도메인의 조합, 바람직하게는 BH1 및 BH2 도메인이 존재하는 상이한 BH1, BH2, BH3 및 BH4 도메인의 조합, 더욱 바람직하게는 BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1-BH2 또는 BH3-BH1-BH2 (N-말단에서 C-말단으로)을 포함한다. 나아가, 적어도 하나의 BIR 도메인을 함유하는 단백질이 또한 포함된다.
본 발명에 포함되는 아폽토시스-예방 경로의 저해제는 알파 나선 구조, 바람직하게는 양친매성 나선으로 둘러 싸인 소수성 나선을 가지며, 일반적으로 하나의 BH3 도메인을 포함한다.
BH1, BH2, BH3 또는 BH4 도메인은 각각 일반적으로 약 5 내지 약 50개 사이 아미노산 길이이다. 따라서, 일부 구현예에서 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 이종 단백질은 약 5 내지 약 200개, 바람직하게는 약 5 내지 약 150개, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 100개, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 50개, 특히 약 5 내지 약 25개 아미노산 길이인 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 이종 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 이종 단백질의 2개 도메인, 바람직하게는 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질의 2개의 반복, 더욱 바람직하게는 2개의 동일한 반복 도메인 또는 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 상이한 단백질의 2개 도메인, 가장 바람직하게는 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질의 2개의 동일한 반복 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 이종 단백질의 2개 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 하나는 프로-아폽토시스 단백질의 도메인이고 다른 하나는 아폽토시스-예방 경로의 저해제인 단백질의 도메인이거나, 또는 하나는 프로-아폽토시스 단백질의 도메인이고 다른 도메인은 프로-생존 신호전달 또는 경로의 저해제인 단백질의 도메인이다.
특히 바람직한 이종 단백질은 아폽토시스 유도자 tBID의 BH3 도메인, 더욱 특히는 서열번호: 29 내지 32, 바람직하게는 서열번호: 31 또는 서열번호: 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 BH3 도메인이다.
아폽토시스 조절자 BAX의 BH3 도메인, 더욱 특히는 서열번호: 33 내지 36, 바람직하게는 서열번호: 35 또는 서열번호: 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 BAX 도메인이 동일하게 바람직하다. 인간 및 뮤린 서열은 서열번호로 제공되지만, 모든 다른 종의 tBID 및 BAX BH3 도메인이 동일하게 포함된다.
일부 구현예에서, 이종 단백질의 반복 도메인은 BH3 도메인, 바람직하게는 아폽토시스 유도자 tBID의 반복 BH3 도메인, 더욱 바람직하게는 서열번호: 29 내지 32 또는 서열번호: 25 또는 서열번호: 19로 구성되는 아폽토시스 유도자 tBID의 반복 BH3 도메인, 더욱 더 바람직하게는 아폽토시스 유도자 tBID의 2개의 반복 BH3 도메인, 가장 바람직하게는 서열번호: 29 내지 32 또는 서열번호: 25 또는 서열번호: 19로 구성되는 아폽토시스 유도자 tBID의 2개의 반복 BH3 도메인, 특히 서열번호: 27로 구성되는 아폽토시스 유도자 tBID의 2개의 반복 BH3 도메인이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 그람-음성 세균 균주 및/또는 벡터는 BH3 도메인의 2개의 반복 도메인, 더욱 바람직하게는 아폽토시스 유도자 tBID의 2개의 반복 BH3 도메인을 인코딩하는 제2 DNA 서열을 포함한다. 2개의 반복 도메인은 1-30개 아미노산 길이, 바람직하게는 2-15개 아미노산, 더욱 바람직하게는 3-10개 아미노산 길이의 링커에 의해 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 상이한 이종 단백질의 2개 이상의 도메인은 단백질의 동일한 기능 부류에 속하는 이종 단백질의 도메인이고, 바람직하게는 2개 이상의 도메인의 상이한 이종 단백질은 아폽토시스 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질의 부류로부터의 상이한 이종 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 상이한 이종 단백질의 2개 이상의 도메인은 아폽토시스 유도자 tBID의 BH3 도메인 및 아폽토시스 조절자 BAX의 BH3 도메인, 특히 서열번호: 24 및 28의 서열로 구성되는 융합된 BH3 도메인이다. 상이한 이종 단백질의 2개 도메인은 1-30개 아미노산 길이, 바람직하게는 2-15개 아미노산, 더욱 바람직하게는 3-10개 아미노산 길이의 링커로 연결될 수 있다.
또 다른 특히 바람직한 이종 단백질은 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질의 도메인, 더욱 특히는 서열번호: 37, 38, 110, 111, 128, 129로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 RIG1의 CARD 도메인, 서열번호: 44 내지 47, 112, 113, 바람직하게는 서열번호: 112 또는 113으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 MDA5의 CARD 도메인, 또는 서열번호: 116, 48 내지 49, 바람직하게는 서열번호: 116으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 MAVS/IPS-1의 CARD 도메인, 전장의 cGAS, 예컨대 N. 벡텐시스 cGAS (서열번호: 43), 인간 cGAS161-522 (서열번호: 115), N. 벡텐시스 cGAS60 -422 (서열번호: 117) 또는 뮤린 cGAS146-507 (서열번호: 131)이다. 서열번호: 37, 38, 110, 111, 128, 129로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 RIG1의 CARD 도메인, 서열번호: 116, 48 내지 49, 바람직하게는 서열번호: 116으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 MAVS/IPS-1을 포함하는 CARD 도메인, 및 전장의 cGAS, 예컨대 N. 벡텐시스 cGAS (서열번호: 43), 인간 cGAS161 -522 (서열번호: 115), N. 벡텐시스 cGAS60 -422 (서열번호: 117) 또는 뮤린 cGAS146-507 (서열번호: 131)이 가장 바람직하다.
일부 구현예에서, 이종 단백질은 전구-약물 전환 효소이다. 이들 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 전구-약물 전환 효소를 발현하고, 바람직하게는 이를 발현하고 분비한다. 본원에 언급된 바와 같은 전구약물 전환 효소는 비-독성 전구약물을 독성 약물로 전환하는 효소, 바람직하게는 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 티미딘 키나제, 베타-갈락토시다제, 카르복실에스터라제, 니트로리덕타제, 카르복시펩티다제 및 베타-글루쿠로니다제로 구성된 군으로부터 선택되는 효소, 더욱 바람직하게는 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 티미딘 키나제, 및 베타-갈락토시다제로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로테아제 절단 부위"는 아미노산 서열 내, 예컨대 단백질 또는 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 특정 아미노산 모티프를 지칭하고, 이는 상기 아미노산 모티프를 인식하는 특정 프로테아제에 의해 절단된다. 검토를 위해 14를 참조한다. 프로테아제 절단 부위의 예시는 엔테로키나제 (경쇄), 엔테로펩티다제, 사전절단 (prescission) 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제 (HRV 3C), TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, FactorXa 프로테아제 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 절단되는, 아미노산 모티프이다.
다음의 아미노산 모티프가 각각의 프로테아제에 의해 인식된다:
-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: 엔테로키나제 (경쇄) / 엔테로펩티다제
-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: 사전절단 프로테아제/인간 리노바이러스 프로테아제 (HRV 3C)
-TEV 프로테아제 (토바코 에치 바이러스)에 의해 인식되는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser 및 Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser에 기초한 변형된 모티프 (여기서 X는 임의의 아미노산임)
-Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: TVMV 프로테아제
-Ile-(Glu 또는 Asp)-Gly-Arg: FactorXa 프로테아제
-Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: 트롬빈.
본원에 사용된 바와 같은 프로테아제 절단 부위에 유비퀴틴이 포함된다. 따라서 일부 바람직한 구현예에서, 유비퀴틴은 프로테아제 절단 부위로 사용되고, 즉 뉴클레오티드 서열은 프로테아제 절단 부위로서 유비퀴틴을 인코딩하고, 이는 N-말단 부위에서 특정 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제에 의해 절단되고, 예컨대 이는 융합 단백질이 전달된 세포에서 내인적으로 N-말단 부위에서 탈유비퀴틴화 효소로 불리는 특정 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 유비퀴틴은 한 그룹의 내인성 유비퀴틴-특이적 C-말단 프로테아제 (탈유비퀴틴화 효소, DUBs)에 의해 그의 C-말단에서 프로세싱된다. DUBs에 의한 유비퀴틴의 절단은 유비퀴틴의 가장 C-말단 (G76 후)에서 일어나는 것으로 추정된다.
"개인", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유류이다. 포유류에는 영장류 (인간 및 비-인간 영장류 포함) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "돌연변이"는 본원에서 일반적인 용어로 사용되고 단일 염기쌍 및 다중 염기쌍 둘 다의 변화를 포함한다. 이러한 돌연변이는 치환, 프레임-쉬프트 돌연변이, 결실, 삽입 및 절단을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "핵 위치화 신호"는 진핵 세포의 핵 내로의 도입을 위해 단백질을 표시하는 아미노산 서열을 지칭하고 바람직하게는 바이러스 핵 위치화 신호, 예컨대 SV40 거대 T-항원 유래 NLS (PPKKKRKV)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "다중 클로닝 부위"는 AclI, HindIII, SspI, MluCI, Tsp509I, PciI, AgeI, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, SpeI, BsrI, BmrI, BglII, AfeI, AluI, StuI, ScaI, ClaI, BspDI, PI-SceI, NsiI, AseI, SwaI, CspCI, MfeI, BssSI, BmgBI, PmlI, DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, NdeI, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, XcmI, BstXI, PflMI, BccI, NcoI, BseYI, FauI, SmaI, XmaI, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, MspI, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, BtgI, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, SbfI, Bpu10I, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, StyI, BcgI, PvuI, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, BfaI, BspCNI, XhoI, EarI, AcuI, PstI, BpmI, DdeI, SfcI, AflII, BpuEI, SmlI, AvaI, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, HgaI, AatII, ZraI, Tth111I PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, PleI, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, MboI, Sau3AI, DpnII BfuCI, DpnI, BsaBI, TfiI, BsrDI, Nb.BsrDI, BbvI, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, NaeI, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP1I, HhaI, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, MwoI, NheI, BmtI, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, TseI, ApeKI, Bsp1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, HaeIII, PhoI, FseI, SfiI, NarI, KasI, SfoI, PluTI, AscI, EciI, BsmFI, ApaI, PspOMI, Sau96I, NlaIV, KpnI, Acc65I, BsaI, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, RsaI, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, HpaI, PmeI, HincII, BsiHKAI, ApoI, NspI, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-CeuI, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, TaqαI, NruI, Hpy188I, Hpy188III, XbaI, BclI, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, DraI, PspXI, BsaWI, BsaAI, EaeI, 바람직하게는 XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI과 같은, 제한 엔도뉴클리아제에 의한 절단을 위해 몇몇 제한 부위를 함유하는 짧은 DNA 서열을 지칭힌다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "다중 클로닝 부위"는 또한 게이트웨이 (Gateway) 클로닝 전략에서와 같은 재조합 이벤트에 또는 깁슨 (Gibbson) 어셈블리 또는 토포 (topo) 클로닝과 같은 방법에 사용되는 짧은 DNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "야생형 균주" 또는 "그람-음성 세균 균주의 야생형"은 자연 발생적인 변형체 또는 벡터의 사용을 허용하는 유전적 변형, 예컨대 제한 엔도뉴클리아제 또는 항생제 내성 유전자 내 결실 돌연변이를 함유하는 자연 발생적인 변형체를 지칭한다. 이들 균주는 염색체 DNA뿐만 아니라 일부 경우에는 (예컨데 Y. 엔테로콜리티카, S. 플렉스네리) 비변형된 병원성 플라스미드를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "예르시니아 야생형 균주"는 자연 발생적인 변형체 (예컨대, Y. 엔테로콜리티카 E40) 또는 벡터의 사용을 허용하는 유전적 변형, 예컨대 제한 엔도뉴클리아제 또는 항생제 내성 유전자 내 결실 돌연변이를 함유하는 자연 발생적인 변형체 (예컨대, Y. 엔테로콜리티카 MRS40, Y. 엔테로콜리티 카 E40의 암피실린 민감성 유도체)를 지칭한다. 이들 균주는 염색체 DNA뿐만 아니라 비변형된 병원성 플라스미드 (pYV로 불림)를 함유한다.
Y. 엔테로콜리티카 아종 팔레아르크티카는 저-병원성 Y. 엔테로콜리티카 균주를 지칭하는데, 이는 아종 엔테로콜리티카의 더 높은 병원성 균주와 대조적이다 15, 16. Y . 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카는, Y. 엔테로콜리티카 subsp. 엔 테로콜리티카에 비해, 고-병원성 유전자군 (high-pathogenicity island, HPI)이 결여된다. 이 HPI는 예르시니아박틴 (yersiniabactin)이라 불리는 철 시데로포어를 인코딩한다17. Y . 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카에서 예르시니아박틴의 결여는 이 아종을 덜 병원성으로 만들고, 예컨대 간 또는 비장에서 지속적인 감염을 위해 유도된 전신적으로 접근가능한 철에 의존적으로 만든다17. 철은, 예컨대 환자에서 철분 과다를 치료하는데 사용되는 철 킬레이터인, 데페록사민으로의 전처리에 의해 개인에서 세균에 접근가능하게 만들 수 있다18.
용어 "포함하다"는 일반적으로 포함의 의미를 사용되는데, 즉 하나 이상의 특징 또는 구성요소의 존재를 허용한다는 것이다.
용어 "약"은 특정된 값의 값 ± 10%의 범위를 지칭한다. 예를 들어, 문구 "약 200"은 200의 ± 10%, 또는 180 내지 220을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공하고, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공하고, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내의 RNA 내에서의 조절을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공하고, 상기 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질은 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공하고, 상기 방법은 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 본 발명은 대상체에서 악성 고형 종양 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공하고, 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 악성 고형 종양 내에 축적되고, 방법은 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 진핵 세포에 대해 병원성인 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질의 생산에 결함이 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 뉴클레오티드 분자, 예컨대 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함하는 벡터로 형질전환된다:
프로모터;
상기 프로모터에 작동가능하게 연결된, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
상기 제1 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 뉴클레오티드 분자, 예컨대 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함하는 벡터로 형질전환된다:
세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
상기 제1 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열.
바람직하게는, 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편의 3' 말단에 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열에 상동인 뉴클레오티드 서열에 의해 그의 3' 말단에 인접한다. 더욱 바람직하게는, 그의 3' 말단에서 상동성 단백질에 인접한 이 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편의 3' 말단에서 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 10 kbp 내에 있는 뉴클레오티드 서열에 상동이다. 특히, 그의 3' 말단에서 상동성 단백질에 인접한 이 뉴클레오티드 서열은 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편과 동일한 오페론 내의 뉴클레오티드 서열에 상동이다. 이 구현예에서, 형질전환은 일반적으로 융합된 뉴클레오티드 서열이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 내인성 병원성 플라스미드 또는 염색체 상에, 바람직하게는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 상동 재조합에 의해 삽입되도록 수행되고, 융합된 뉴클레오티드 서열은, 예컨대 염색체 병원성 유전자군의 내인성 병원성 플라스미드 또는 염색체의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는 융합된 뉴클레오티드 서열은 내인성 병원성 플라스미드의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 이 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편, 바람직하게는 이의 단편을 포함하고, 이는 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드에서, 바람직하게는 내인성 병원성 플라스미드 상에서, 상동 부위에서의 상동 재조합을 제공하며, 뉴클레오티드 서열이 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 전달 신호의 3' 말단에 프레임 내 배치되는 것을 유도한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 또는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는, 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동이거나 이와 동일하고, 또는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호의 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동이거나 이와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 뉴클레오티드 분자, 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드 분자로 형질전환되고, 여기서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 인코딩된다. 바람직하게는, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 서열의 뉴클레오티드 또는 이의 단편과 상동이거나 이와 동일한 뉴클레오티드 서열은 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 위치한다. 더욱 바람직하게는, 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편의 3' 말단에서 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열에 상동인 뉴클레오티드 서열에 의해 그의 3' 말단에서 인접한다. 더욱 더 바람직하게는, 그의 3' 말단에서 상동성 단백질에 인접한 이 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편의 3' 말단에서 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 10 kbp 이내에 있는 뉴클레오티드 서열에 상동이다. 특히, 그의 3' 말단에서 상동성 단백질에 인접한 이 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에 상동이고 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드 상에서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편과 동일한 오페론 내에 있다. 이 구현예에서, 형질전환은 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 염색체 또는 내인성 병원성 플라스미드에 의해 인코딩되는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호의 3' 말단에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 내인성 병원성 플라스미드 또는 염색체 상에, 바람직하게는 내인성 병원성 플라스미드 상에 삽입되도록 수행되고, 이때 전달 신호에 융합된 이종 단백질이 발현되고 분비된다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 포함한다. 일반적으로 내인성 병원성 플라스미드 상에서 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 유전자는 결실된 염색체 유전자에 의해 인코딩되는 바와 동일한 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩한다. 바람직하게는 내인성 병원성 플라스미드 상에 위치한 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자는 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자를 포함한다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자는 내인성 병원성 플라스미드 pYV 상에 위치하고 바람직하게는 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자를 포함한다. 성장에 필수적인 내인성 효소, 내인성 프로모터 및 내인성 전사 종결자를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 내인성 병원성 플라스미드, 예컨대 pYV 상에서 orf155 (SycO)의 개시의 상류의 122 bp에 위치한다. 성장에 필수적인 내인성 효소, 내인성 프로모터 및 내인성 전사 종결자를 코딩하는 유전자는 일반적으로 Y. 엔테로콜리티카 W227O3 (Genbank: AF102990.1)의 병원성 플라스미드인 pYVe227에서가 아닌, Y. 엔테로콜리티카 MRS40 및 E40 균주의 병원성 플라스미드인 pYVe40에서 발견되는 삽입 서열을 대체한다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 내인성 병원성 플라스미드는 pYV (예르시니아 병원성 플라스미드)이다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, 삽입용 내인성 위치는 이펙터 단백질이 다른 곳에서 인코딩되는 위치인, SpiI 또는 SpiII (살모넬라 병원성 유전자군의 경우)로 불리는 유전자 클러스터 중 하나 또는 별법으로 살모넬라 병원성 플라스미드 (SVPs) 중 하나이다.
바람직하게는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세균성 이펙터 단백질의 천연 부위에, 예컨대 병원성 인자의 천연 부위에서, 바람직하게는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, YopE 또는 또 다른 Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT)의 천연 부위, 바람직하게는 YopE의 천연 부위에, 또는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, SpiI, SpiII 내에서 인코딩되거나 또는 다른 곳에서 인코딩되는 이펙터 단백질의 천연 부위, 바람직하게는 SpiI or SpiII 내에서 인코딩되는 이펙터 단백질의 천연 부위, 더욱 바람직하게는 SopE 또는 SteA의 천연 부위에서 내인성 병원성 플라스미드 상에 삽입된다. 바람직하게는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 병원성 플라스미드 상에 존재하는 세균성 이펙터 단백질의 천연 프로모터에, 예컨대 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 하기에 요약된 바와 같은 예르시니아 비룰론 (virulon) 유전자로부터의 천연 프로모터에, 더욱 바람직하게는 천연 YopE 프로모터 또는 다른 Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT) 프로모터에, 바람직하게는 천연 YopE 프로모터에, 또는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, SpiI 또는 SpiII 병원성 유전자군 유래 또는 하기에 요약된 바와 같이 다른 곳에서 인코딩된 이펙터 단백질로부터의 천연 프로모터에, 더욱 바람직하게는 천연 SopE, InvB 또는 SteA 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 포함하고, 상기 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 유전자는 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자, 펩티도글리칸 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, LPS 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, 뉴클레오티드 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 번역 개시 인자를 코딩하는 유전자로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 포함하고, 상기 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자는 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자이고, 아미노산 생산에 필수적인 효소는 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 (asd), 글루타민 신세타제 (glnA), 트립토파닐 tRNA 신세타제 (trpS) 또는 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 (glyA), 또는 트랜스케톨라제 1 (tktA), 트랜스케톨라제 2 (tktB), 리불로스-포스페이트 3-에피머라제 (rpe), 리보스-5-포스페이트 이소머라제 A (rpiA), 트랜스알돌라제 A (talA), 트랜스알돌라제 B (talB), 포스포리보실피로포스페이트 신타제 (prs), ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (hisG), 히스티딘 생합성 이관능성 단백질 HisIE (hisI), 1-(5-포스포리보실)-5-[(5-포스포리보실아미노)메틸리덴아미노] 이미다졸-4-카르복사미드 이소머라제 (hisA), 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 서브유닛 HisH (hisH), 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 서브유닛 HisF (hisF), 히스티딘 생합성 이관능성 단백질 HisB (hisB), 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (hisC), 히스티디놀 데히드로게나제 (hisD), 3-데히드로퀴네이트 신타제 (aroB), 3-데히드로퀴네이트 데히드라타제 (aroD), 시키메이트 데히드로게나제 (NADP(+)) (aroE), 시키메이트 키나제 2 (aroL), 시키메이트 키나제 1 (aroK), 3-포스포시키메이트 1-카르복시비닐트랜스퍼라제 (aroA), 코리스메이트 신타제 (aroC), P-단백질 (pheA), T-단백질 (tyrA), 방향족-아미노산 아미노트랜스퍼라제 (tyrB), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroG), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroH), 포스포-2-데히드로-3-데옥시헵토네이트 알돌라제 (aroF), 퀴네이트/시키메이트 데히드로게나제 (ydiB), ATP-의존적 6-포스포프럭토키나제 이소자임 1 (pfkA), ATP-의존적 6-포스포프럭토키나제 이소자임 2 (pfkB), 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 클래스 2 (fbaA), 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 클래스 1 (fbaB), 트리오스포스페이트 이소머라제 (tpiA), 피루베이트 키나제 I (pykF), 피루베이트 키나제 II (pykA), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 A (gapA), 포스포글리세레이트 키나제 (pgk), 2,3-비스포스포글리세레이트-의존적 포스포글리세레이트 뮤타제 (gpmA), 2,3-비스포스포글리세레이트-비의존적 포스포글리세레이트 뮤타제 (gpmM/yibO), 추정의 포스포글리세레이트 뮤타제 (ytjC/gpmB), 에놀라제 (eno), D-3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 (serA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 (serC), 포스포세린 포스파타제 (serB), L-세린 데히드라타제 1 (sdaA), L-세린 데히드라타제 2 (sdaB), 이화 L-쓰레오닌 데히드라타제 (tdcB), 생합성 L-쓰레오닌 데히드라타제 (ilvA), L-세린 데히드라타제 (tdcG), 세린 아세틸트랜스퍼라제 (cysE), 시스테인 신타제 A (cysK), 시스테인 신타제 B (cysM), 베타-시스타치오나제 (malY), 시스타치오닌 베타-리아제 (metC), 5-메틸테트라히드로프테롤리트리글루타메이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 (metE), 메치오닌 신타제 (metH), S-아데노실메치오닌 신타제 (metK), 시스타치오닌 감마-신타제 (metB), 호모세린 O-석시닐트랜스퍼라제 (metA), 5'-메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다제 (mtnN), S-리보실호모시스테인 리아제 (luxS), 시스타치온 베타 리아제, 시스타치온 감마 리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (glyA), 글리신 히드록시메틸트랜스퍼라제 (itaE), 3-이소프로필말레이트 데히드라타제 작은 서브유닛 (leuD), 3-이소프로필말레이트 데히드라타제 큰 서브유닛 (leuC), 3-이소프로필말레이트 데히드로게나제 (leuB), 생합성 L-쓰레오닌 데히드라타제 (ilvA), 아세토락테이트 신타제 이소자임 3 큰 서브유닛 (ilvI), 아세토락테이트 신타제 이소자임 3 작은 서브유닛 (ilvH), 아세토락테이트 신타제 이소자임 1 작은 서브유닛 (ilvN), 아세토락테이트 신타제 이소자임 2 작은 서브유닛 (ilvM), 케놀-산 리덕토이소머라제 (NADP(+)) (ilvC), 디히드록시-산 데히드라타제 (ilvD), 분지쇄-아미노산 아미노트랜스퍼라제 (ilvE), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 1 (thrA), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 2 (metL), 2-이소프로필말레이트 신타제 (leuA), 글루타메이트-피루베이트 아미노트랜스퍼라제 (alaA), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspC), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 1 (thrA), 이관능성 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제 2 (metL), 리신-민감성 아스파르토키나제 3 (lysC), 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 (asd), 2-케토-3-데옥시-갈락토네이트 알돌라제 (yagE), 4-히드록시-테트라히드로디피콜리네이트 신타제 (dapA), 4-히드록시-테트라히드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 2,3,4,5-테트라히드로피리딘-2,6-디카르복실레이트 N-석시닐트랜스퍼라제 (dapD), 석시닐-디아미노피멜리에이트 데석시닐라제 (dapE), 디아미노피멜리에이트 에피머라제 (dapF), 잠정적 리아제 (yjhH), 아세틸오르니틴/석시닐디아미노피멜리에이트 아미노트랜스퍼라제 (argD), 시트레이트 신타제 (gltA), 아코니테이트 히드라타제 B (acnB), 아코니테이트 히드라타제 A (acnA), 미보고의 잠정적 아코니테이트 히드라타제 (ybhJ), 이소시트레이트 데히드로게나제 (icd), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspC), 글루타메이트-피루베이트 아미노트랜스퍼라제 (alaA), 글루타메이트 신타제 [NADPH] 큰 사슬 (gltB), 글루타메이트 신타제 [NADPH] 작은 사슬 (gltD), 글루타민 신세타제 (glnA), 아미노산 아세틸트랜스퍼라제 (argA), 아세틸글루타메이트 키나제 (argB), N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제 (argC), 아세틸오르니틴/석시닐디아미노피멜리에이트 아미노트랜스퍼라제 (argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제 (argE), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 사슬 F (argF), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 사슬 I (argI), 아르기니노석시네이트 신타제 (argG), 아르기니노석시네이트 리아제 (argH), 글루타메이트 5-키나제 (proB), 감마-글루타밀 포스페이트 리덕타제 (proA), 피롤린-5-카르복실레이트 리덕타제 (proC), 오르니틴 시클로데아미나제, 류신-tRNA 리가제 (leuS), 글루타민-tRNA 리가제 (glnS), 세린-tRNA 리가제 (serS), 글리신-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (glyS), 글리신-tRNA 리가제 알파 서브유닛 (glyQ), 티로신-tRNA 리가제 (tyrS), 쓰레오닌-tRNA 리가제 (thrS), 페닐알라닌-tRNA 리가제 알파 서브유닛 (pheS), 페닐알라닌-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (pheT), 아르기닌-tRNA 리가제 (argS), 히스티딘-tRNA 리가제 (hisS), 발린-tRNA 리가제 (valS), 알라닌-tRNA 리가제 (alaS), 이소류신-tRNA 리가제 (ileS), 프롤린-tRNA 리가제 (proS), 시스테인-tRNA 리가제 (cysS), 아스파라긴-tRNA 리가제 (asnS), 아스파르테이트-tRNA 리가제 (aspS), 글루타메이트-tRNA 리가제 (gltX), 트립토판-tRNA 리가제 (trpS), 글리신-tRNA 리가제 베타 서브유닛 (glyS), 메치오닌-tRNA 리가제 (metG), 리신-tRNA 리가제 (lysS)로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 아미노산 생산에 필수적인 효소는 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS이고, asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS이 더욱 바람직하고, asd가 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함한다. 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절은 RNA 온도센서 영역 내에서의 결실, 삽입, 또는 치환일 수 있다. 결실 또는 삽입은 일반적으로 하나 또는 수 개, 바람직하게는 약 30개와 약 100개 사이의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 40개와 약 60개 사이의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 포함한다. 치환은 일반적으로 하나 또는 수 개, 바람직하게는 약 3개와 약 30개 사이의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 3개와 약 15개 사이의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절은 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 결실, 바람직하게는 약 30개와 약 100개 사이의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 40개와 약 60개 사이의 뉴클레오티드의 결실이다. 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질 및 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역은 일반적으로 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 포함되는 내인성 병원성 플라스미드 상에 위치한다. AraC-타입 DNA 결합 단백질은 바람직하게는 VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD 및 InvF로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, AraC-타입 DNA 결합 단백질은 VirF 및 LcrF로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 엔테롤리티카이고 AraC-타입 DNA 결합 단백질은 VirF이다.
바람직하게는 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절은 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 헤어핀, 바람직하게는 헤어핀 I을 방해하는 조절을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절은 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부, 바람직하게는 헤어핀 I의 일부를 제거하는 결실을 포함한다. RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부를 제거하는 결실은 일반적으로 약 30개와 약 100개 사이의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 40개와 약 60개 사이의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 엔테롤리티카이고 결실은 virF (여기서 -1은 virF 코딩 서열의 ATG 개시 코돈에서 A 상류의 1 염기임)의 코딩 서열 상류의 위치 -111 내지 -57에서 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 속 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 및 슈도모나스로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 속 예르시니아 및 살모넬라로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 균주, 더욱 바람직하게는 예르시니아 엔테로콜 리티카 균주이다. 예르시니아 엔테로콜리티카 E40 (O:9, 생물형 2)19 또는 20에 기술된 바와 같은 이의 암피실린 민감성 유도체, 예컨대 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 (Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 MRS40으로도 명명됨)이 가장 바람직하다. Y . 엔테로콜리티카 E40 및 20에 기술된 바와 같은 그의 유도체 Y. 엔테로콜리 티카 MRS40은 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 E40 및 15,17,21에 기술된 바와 같은 그의 유도체 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 MRS40과 동일하다. 또한, 바람직하게는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 살모넬라 균주, 더욱 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 균주이다. 영국 공중 보건 배양 수집기구 (Public health England culture collection) (NCTC 13347)에 의해 기술된 바와 같은 살모넬라 엔테리카 혈청형 타이피뮤리움 SL1344가 가장 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 시데로포어를 생산하지 않는, 예컨대 시데로포어 생산에 결함이 있는, 바람직하게는 시데로포어를 생산하지 않는, 예컨대 임의의 시데로포어 생산에 결함이 있는 균주이다. 이러한 균주는 예를 들어 15,17,20,21에 기술된 바와 같은 예르시니아박틴을 생산하지 않는 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 MRS40이고 이 균주가 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 세균성 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편, 바람직하게는 진핵 세포에 대해 병원성인 세균성 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편을 포함하는 세균성 T3SS 이펙터 단백질이고, 상기 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 샤페론 결합 부위를 포함할 수 있다. 샤페론 결합 부위를 포함하는 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 본 발명의 전달 신호로서 특히 유용하다. 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspH1,VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAO1, HopPtoD2, HopU1, GALA 단백질 패밀리, AvrBs2, AvrD1, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, 및 AvrXv3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT로 구성된 군으로부터 선택되고, 이의 가장 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 IpgB1, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, 특히 YopE 또는 이의 N-말단 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
동일하게 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAO1, HopU1, GALA 단백질 패밀리, AvrBs2, AvrD1, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, 및 AvrXv3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 동일하게 더욱 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT로 구성된 군으로부터 선택되고, 이의 동일하게 가장 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 IpgB1, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, 및 YopT, 특히 SopE, SteA, 또는 YopE 또는 이의 N-말단 단편, 더욱 특히는 SteA 또는 YopE 또는 이의 N-말단 단편, 가장 특히는 YopE 또는 이의 N-말단 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 세균성 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 상기 이의 N-말단 단편은 세균성 T3SS 이펙터 단백질의 적어도 처음 10개, 바람직하게는 적어도 처음 20개, 더욱 바람직하게는 적어도 처음 100개 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 샤페론 결합 부위를 포함한다.
샤페론 결합 부위를 포함하는, 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편은 샤페론 결합 부위 및 T3SS 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 단편의 다음 조합을 포함하고: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycD-YopD. SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF이 더욱 바람직하다. SycE 샤페론 결합 부위를 포함하는 YopE 또는 이의 N-말단 단편, 예컨대 본원에서 YopE1 -138로 지정되고 서열번호: 2로 나타낸 바와 같은, YopE 이펙터 단백질의 N-말단 138개 아미노산을 함유하는 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편, 또는 InvB 샤페론 결합 부위를 포함하는 SopE 또는 이의 N-말단 단편, 예컨대 본원에서 각각 SopE1 -81 또는 SopE1 -105로 지정되고 서열번호: 6 및 7로 나타낸 바와 같은, SopE 이펙터 단백질의 N-말단 81개 또는 105개 아미노산을 함유하는 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 균주이고 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 YopE 이펙터 단백질 또는 N-말단 부분, 바람직하게는 Y. 엔테로콜리티카 YopE 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 부분을 포함한다. 바람직하게는 SycE 결합 부위는 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 부분 내에 포함된다. 이러한 연결에서, YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편은 N-말단 12, 16, 18, 52, 53, 80 또는 138개 아미노산을 포함할 수 있다22 - 24. 예컨대 Forsberg 및 Wolf-Watz25에 기술되고 본원에서 YopE1 -138로 지정되고 서열번호: 2로 나타낸 바와 같은, N-말단 138개 아미노산을 함유하는 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 살모넬라 균주이고 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 SopE 또는 SteA 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 부분, 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 SopE 또는 SteA 이펙터 단백질 또는 이의 N-말단 부분을 포함한다. 바람직하게는 샤페론 결합 부위는 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 부분 내에 포함된다. 이러한 연결에서, SopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편은 N-말단 81개 또는 105개 아미노산을 포함할 수 있다. 예컨대 서열번호: 7로 기술되는, 이펙터 단백질의 N-말단 105개 아미노산을 함유하는 SopE 이펙터 단백질의 전장 SteA (서열번호: 5) 및 N-말단 단편이 가장 바람직하다.
당업자는 단백질을 전달할 수 있는 이펙터 단백질의 폴리펩티드 서열을 확인하는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 이러한 하나의 방법이 Sory 등19에 기술되어 있다. 간략히는, 예컨대 Yop 단백질의 다양한 부분으로부터의 폴리펩티드 서열은 보르데텔라 퍼투시스 사이클로리신 (cyclolysin)의 칼모듈린-활성화 아데닐레이트 사이클라제 도메인 (또는 Cya)과 같은 리포터 효소에 프레임 내 융합될 수 있다. Yop-Cya 혼성 단백질의 진핵 세포의 세포질 내로의 전달은 cAMP의 축적을 초래하는 감염된 진핵 세포 내 사이클라제 활성의 출현으로 표시된다. 이러한 접근법을 이용함으로써, 당업자는, 바람직하다면, 단백질을 전달할 수 있는, 최소 서열 요건, 즉 최단 길이의 연속적인 아미노산 서열을 결정할 수 있다 (예컨대 19 참조). 따라서, 본 발명의 바람직한 전달 신호는 단백질을 전달할 수 있는 T3SS 이펙터 단백질의 적어도 최소 서열의 아미노산 서열로 구성된다.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는, 더욱 바람직하게는 진핵 세포에 대해 병원성인 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는, 더욱 더 바람직하게는 적어도 하나의 T3SS 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는, 가장 바람직하게는 적어도 하나의 진핵 세포에 대해 병원성인 T3SS 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 진핵 세포에 대해 병원성인 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 4개, 특히 적어도 5개, 더욱 특히 적어도 6개, 가장 특히 모든 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있다. 일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 생성된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 세균성 이펙터 단백질을 덜 생산하거나 또는 세균성 이펙터 단백질을 비-병원성 약독화 그람-음성 세균 야생형 균주에 비해, 즉 세균성 이펙터 단백질을 정상적으로 생산하는 그람-음성 세균 야생형 균주에 비해 더 적은 수준으로 생산하도록 또는 생성된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 더 이상 진핵 세포에 대해 병원성인 어떠한 기능적 세균성 이펙터 단백질도 생산하지 않도록, 진핵 세포에 대해 병원성인 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 4개, 특히 적어도 5개, 더욱 특히 적어도 6개, 가장 특히 모든 기능적 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 변이체 그람-음성 세균 균주, 즉 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는, 예컨대 진핵 세포에 대해 병원성인 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는 이러한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주, 예컨대 변이체 예르시니아 균주는 적어도 하나의 돌연변이를 적어도 하나의 이펙터-인코딩 유전자 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 이펙터-인코딩 유전자에는 예르시니아 균주가 고려되는 한, YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ 및 YopT가 포함된다. 바람직하게는, 이러한 이펙터-인코딩 유전자에는 살모넬라 균주가 고려되는 한, AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP가 포함된다. 가장 바람직하게는, 모든 이펙터-인코딩 유전자는 결실된다. 당업자는 이들 T3SS 이펙터 유전자 내에 돌연변이를 생성하기 위해 임의의 수의 표준 기법을 이용할 수 있다. Sambrook 등은 이러한 표준 기법을 기술하고 있다. Sambrook 등26 참조.
본 발명에 따르면, 돌연변이는 이러한 이펙터 유전자의 발현이 파괴되도록 이펙터-인코딩 유전자의 프로모터 영역 내에서 생성될 수 있다.
돌연변이는 또한 인코딩된 이펙터 단백질의 촉매 활성이 파괴되도록 이펙터-인코딩 유전자의 코딩 영역 내에 생성될 수 있다. 이펙터 단백질의 "촉매 활성"은 일반적으로 이펙터 단백질의 항-표적 세포 기능, 즉 독성을 지칭한다. 이러한 활성은 이펙터 단백질의 촉매 도메인 내 촉매 모티프에 의해 결정된다. 이펙터 단백질의 촉매 도메인 및/또는 촉매 모티프를 확인하는 접근법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 27,28 참조.
따라서, 본 발명의 바람직한 하나의 돌연변이는 전체 촉매 도메인의 결실이다. 바람직한 또 하나의 돌연변이는 촉매 도메인이 이러한 "프레임쉬프트된 (frameshifted)" 유전자로부터 발현되는 단백질 생성물 내에 존재하지 않도록 이펙터-인코딩 유전자 내 프레임쉬프트 돌연변이이다. 가장 바람직한 돌연변이는 이펙터 단백질의 전체 코딩 영역의 결실을 갖는 돌연변이이다. 이펙터 단백질의 촉매 모티프 내에 생성되어 소정의 이펙터 단백질의 촉매 활성의 파괴를 초래하는, 작은 결실 또는 염기쌍 치환과 같은, 다른 돌연변이가 또한 본 발명에 의해 고려된다.
기능적 세균성 이펙터 단백질의 유전자에 생성되는 돌연변이는 다수의 방법에 의해 특정 균주 내로 도입될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 돌연변이된 유전자를 대립형질 교환을 통해 균주 내로 도입할 수 있는 "자살" 벡터 내로 돌연변이된 유전자를 클로닝하는 것을 포함한다. 이러한 "자살" 벡터의 예시가 29에 기술되어 있다.
이러한 방식으로, 다수의 유전자에 생성된 돌연변이는 그람-음성 세균 균주 내로 연속적으로 도입되어 다중변이체 (polymutant), 예컨대 6중 (sixtuple) 변이체 재조합 균주를 유발할 수 있다. 이들 돌연변이된 서열이 도입되는 순서는 중요하지 않다. 어떤 경우에는, 이펙터 유전자의 전부가 아닌 단지 일부만을 변이시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은 6중-변이체 예르시니아 이외의 다중변이체 예르시니아, 예컨대 2중-변이체, 3중-변이체, 4중-변이체 및 5중-변이체를 추가로 고려한다. 단백질을 전달하기 위한 목적을 위해, 본 발명의 변이체 균주의 분비 및 전위 시스템은 손상되지 않을 필요가 있다.
본 발명의 바람직한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 생성된 예르시니아가 더 이상 어떠한 기능적 이펙터 단백질도 생산하지 않도록 모든 이펙터-인코딩 유전자가 변이되는 6중-변이체 예르시니아 균주이다. 이러한 6중-변이체 예르시니아 균주는 Y. 엔테로콜리티카의 경우에 ΔyopH,O,P,E,M,T로 지정된다. 예시로서, 이러한 6중-변이체는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 균주로부터 생산되어 Y. 엔 테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, (본원에서 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레 아르크티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T 또는 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T로도 명명됨)를 생성하고, 이는 바람직하다. 예르시니아박틴의 생산에 결함이 있는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T는 WO02077249에 기술되어 있고 벨기에 미생물 통합 수집기구 (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM)에 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라, 2001년 9월 24일자로 기탁되어 기탁번호 LMG P-21013을 부여 받았다.
내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자 (HairpinI-virF) 상류의 헤어핀 I의 결실과 같은 RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부를 제거하는 내인성 병원성 플라스미드 pYV 상에 결실을 포함하는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, 예컨대 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF (본원에서 또한 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF로도 명명됨)가 더욱 바람직하다. asd를 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 asd를 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드 pYV (pYV-asd)를 포함하는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, 예컨대 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd (본원에서 또한 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd로도 명명됨)가 동일하게 바람직하다. 상기에 기술된 바와 같은 두 변형 모두를 포함하는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd (본원에서 또한 Y . 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd로 명명됨)이 특히 바람직히다. 특히 바람직한 균주는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF (Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF로도 명명됨), Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd (본원에서 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd로도 명명됨) 또는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd (본원에서 또한 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd로도 명명됨)이고, 이들은 모든 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 균주에서와 같이, 시데로포어의 생산에 결함이 있는, 바람직하게는 시데로포어를 생산하지 않는, 예컨대 임의의 시데로포어의 생산에 결함이 있다. 따라서, Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF (Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카 ΔyopH,O,P,E,M,T ΔHairpinI-VirF로도 명명됨), Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd (본원에서 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd pYV-asd로도 명명됨) 또는 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아르크티카ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd (본원에서 또한 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ΔHairpinI-VirF pYV-asd로도 명명됨)이 동일하게 특히 바람직한 균주이다.
그람-음성 세균 균주를 형질전환하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터와 같은 뉴클레오티드 분자는 당업자에게 공지된 바와 같이 사용되는 그람-음성 세균 균주에 의존적일 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 뉴클레오티드 분자는 발현 벡터 (내인성 병원성 플라스미드의 합성 또는 달리 생성된 변형된 버전 포함), 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터 및 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 DNA 단편과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예컨대, 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 발현 벡터는, 예컨대 pUC, pBad, pACYC, pUCP20 및 pET 플라스미드이다. 예컨대 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터는, 예컨대 pKNG101이다. 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 DNA 단편은, 예컨대 람다-레드 유전적 조작 (lambda-red genetic engineering)과 같은, 예컨대 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 사용되는 방법을 지칭한다. 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터 또는 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 DNA 단편은, 예컨대 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 삽입할 수 있다. 따라서, 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터 또는 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 DNA 단편이 사용되는 경우, 내인성 프로모터는 내인성 세균 DNA (염색체 또는 플라스미드 DNA) 상에 인코딩될 수 있고 각각의 뉴클레오티드 서열만이 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 조작 벡터 또는 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 DNA 단편에 의해 제공될 것이다. 대안적으로, 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터 또는 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 뉴클레오티드 서열과 같은 뉴클레오티드 분자가 사용되는 경우, 내인성 프로모터 및 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호는 내인성 세균 DNA (염색체 또는 플라스미드 DNA) 상에 인코딩될 수 있고 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은 뉴클레오티드 분자만이 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 벡터 또는 염색체 또는 병원성 플라스미드 삽입용 뉴클레오티드 서열과 같은 뉴클레오티드 분자에 의해 제공될 것이다. 따라서, 프로모터는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 형질전환에 사용되는 벡터에 반드시 포함될 필요는 없고, 즉 본 발명의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 프로모터를 포함하지 않는 벡터로 형질전환될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 뉴클레오티드 분자, 예컨대 본 발명의 벡터는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 또는 이의 단편을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
상기 제1 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열.
바람직한 벡터, 예컨대 예르시니아에 바람직한 발현 벡터는 pBad_Si_1 및 pBad_Si_2로 구성된 군으로부터 선택된다. pBad_Si2를 정제된 pYV40로부터 YopE 및 SycE를 위한 내인성 프로모터를 함유하는 SycE-YopE1 -138 단편을 pBad-MycHisA (Invitrogen)의 KpnI/HindIII 부위 내로 클로닝하여 제작하였다. 추가 변형은 소화에 의한 pBad-MycHisA의 NcoI/BglII 단편의 제거, 클레노우 단편 처리 및 재결찰을 포함한다. 또한 YopE1 -138의 3' 말단에 다음 절단 부위를 부가하였다: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si은 pBad_Si2와 동일하지만 아라비노스 유도성 프로모터의 제어하에서 NcoI/BglII 부위에서 pEGFP-C1 (Clontech)로부터 증폭된 EGFP를 인코딩한다. T3SS 신호 서열에의 융합으로서 이종 단백질을 인코딩하는 내인성 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV의 변형된 버전의 사용이 동일하게 바람직하다.
바람직한 벡터, 예컨대 살모넬라에 바람직한 발현 벡터는 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269로 구성된 군으로부터 선택된다. 상응하는 내인성 프로모터 및 SteA1-20 단편 (pSi_266), 전장 SteA 서열 (pSi_267), SopE1 -81 단편 (pSi_268) 또는 SopE1-105 단편 (pSi_269)을 함유하는 플라스미드 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269를 S. 엔테리카 SL1344 게놈 DNA로부터 증폭하고 pBad-MycHisA (Invitrogen)의 NcoI/KpnI 부위 내로 클로닝하였다.
뉴클레오티드 분자, 예컨대 본 발명의 벡터는 3' 종결 서열과 같은 다른 서열 요소 (정지 코돈 및 폴리 A 서열 포함), 또는 본 발명의 벡터를 수용한 형질전환체의 선택을 가능케 하는 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 분자, 예컨대 본 발명의 벡터는 다수의 공지된 벡터에 의해 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 내로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 벡터를 도입하기 위한 형질전환 방법에는 전기천공, 칼슘 포스페이트 매개 형질전환, 컨쥬게이션, 또는 이들의 조합이 포함되지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴클레오티드 분자, 예컨대 벡터는 표준 전기천공 과정에 의해 제1 세균 균주 내로 형질전환될 수 있다. 이어서, 이러한 뉴클레오티드 분자, 예컨대 벡터는 "동원 (mobilization)"으로도 불리는 과정인, 컨쥬게이션에 의해 제1 세균으로부터 목적하는 균주 내로 형질전환될 수 있다. 형질전환체 (즉, 벡터를 수용한 그람-음성 세균 균주)는, 예컨대 항생제를 이용해 선택될 수 있다. 이러한 기법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 19 참조.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 세균성 이펙터 단백질에 작동가능하게 연결된 프로모터는 각각의 균주 또는 호환되는 세균 균주의 T3SS 이펙터 단백질의 천연 프로모터, 또는 예컨대 예르시니아 , 에스케리치아 , 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 발현 벡터에 사용되는 프로모터, 예컨대 pUC 및 pBad일 수 있다. 이러한 프로모터는 T7 프로모터, Plac 프로모터 또는 아라비노스 유도성 Ara-bad 프로모터이다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 프로모터는 예르시니아 비룰론 (virulon) 유전자로부터 유래할 수 있다. "예르시니아 비룰론 유전자"는, 이의 발현이 온도 및 표적 세포와의 접촉 둘 다에 의해 제어되는, 예르시니아 pYV 플라스미드 상의 유전자를 지칭한다. 이러한 유전자에는 분비 기구의 요소를 코딩하는 유전자 (Ysc 유전자), 전위자 (translocator)를 코딩하는 유전자 (YopB, YopD, 및 LcrV), 제어 요소를 코딩하는 유전자 (YopN, TyeA 및 LcrG), T3SS 이펙터 샤페론을 코딩하는 유전자 (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO 및 SycT), 및 이펙터를 코딩하는 유전자 (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT 및 YopP/YopJ), 뿐만 아니라 VirF 및 YadA와 같은 다른 pYV 인코딩된 단백질이 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 T3SS 기능적 이펙터 인코딩 유전자의 천연 프로모터이다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 프로모터는 YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM 및 YopP/YopJ중 어느 하나로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 YopE 또는 SycE로부터일 수 있다. YopE 프로모터가 가장 바람직하다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, 프로모터는 SpiI 또는 SpiII 병원성 유전자군으로부터이거나 다른 곳에서 인코딩되는 이펙터 단백질로부터일 수 있다. 이러한 유전자에는 분비 기구의 요소를 코딩하는 유전자, 전위자를 코딩하는 유전자, 제어 요소를 코딩하는 유전자, T3SS 이펙터 샤페론을 코딩하는 유전자, 및 이펙터를 코딩하는 유전자뿐만 아니라, SPI-1 또는 SPI-2에 의해 인코딩되는 다른 단백질이 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 T3SS 기능적 이펙터를 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, 프로모터는 이펙터 단백질 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 SopE, InvB 또는 SteA이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 인공적으로 유도가능한 프로모터, 예컨대 아라비노스 유도가능 프로모터이고, 이것이 바람직하다. 이 경우에, 아라비노스가 일반적으로 세균에 제공되고 그 후에 전달되는 단백질의 세균성 발현을 유도할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 프로테아제 절단 부위를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프로테아제 절단 부위는 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이의 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자 상에 위치한다. 기능적 및 일반적으로 적용가능한 절단 부위의 생성은 전위 후 전달 신호의 절단을 가능케 한다. 전달 신호가 표적 세포 내에서 전위된 단백질의 정확한 위치화 및/또는 기능을 방해할 수 있기 때문에 전달 신호와 관심 단백질 사이에 프로테아제 절단 부위의 도입은 진핵 세포 내로 거의 천연의 단백질의 전달을 제공한다. 바람직하게는, 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제 (경쇄), 엔테로펩티다제, 사전절단 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제 3C, TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, FactorXa 프로테아제 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 또는 그의 촉매 도메인에 의해 절단되는 아미노산 모티프, 더욱 바람직하게는 TEV 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프이다. 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제 (경쇄), 엔테로펩티다제, 사전절단 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제 3C, TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, FactorXa 프로테아제, 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제, 소위 탈유비퀴틴화 효소, 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 또는 이의 촉매 도메인에 의해 절단되는 아미노산 모티프가 동일하게 바람직하다. TEV 프로테아제에 의해 또는 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프가 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명의 추가 구현예에서, 이종 단백질은 프로테아제에 의해 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호로부터 절단된다. 바람직한 절단 방법은:
a) 프로테아제가 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 이종 단백질로서 프로테아제를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 진핵 세포 내로 전위되고; 또는
b) 프로테아제가 진핵 세포에서 구성적으로 또는 일시적으로 발현되는, 방법이다.
일반적으로 진핵 세포 내로 원하는 단백질을 전달하는데 사용되는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주와 진핵 세포 내로 프로테아제를 전위하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 상이하다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 표지 분자 또는 표지 분자에 대한 수용부위 (acceptor site)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 표지 분자 또는 표지 분자에 대한 수용부위를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 융합된다. 바람직한 표지 분자 또는 표지 분자에 대한 수용부위는 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 쿠마린, 쿠마린 리가제 수용부위, 리소루핀 (resorufin), 리수로핀 (resurofin) 리가제 수용부위, FlAsH/ReAsH 염료 (life technologies)와 함께 사용되는 테트라-시스테인 모티프로 구성된 군으로부터 선택된다. 리소루핀 및 리수로핀 리가제 수용부위 또는 EGFP가 가장 바람직하다. 표지 분자 또는 표지 분자에 대한 수용부위의 사용은 표지 분자의 관심 이종 단백질에의 부착을 초래할 것이고, 이는 그 후에 그대로 진핵 세포 내로 전달될 것이고, 예컨대 생존 세포 현미경에 의한 단백질의 추적을 가능케 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 펩티드 태그를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 펩티드 태그를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 융합된다. 바람직한 펩티드 태그는 Myc-태그, His-태그, Flag-태그, HA 태그, Strep 태그 또는 V5 태그로 구성된 그룹 또는 이들 그룹 중 2개 이상의 태그의 조합으로부터 선택된다. Myc-태그, Flag-태그, His-태그 및 조합된 Myc-및 His-태그가 가장 바람직하다. 펩티드 태그의 사용은, 예컨대 항-태그 항체를 사용하는 면역형광 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 태그된 단백질의 추적을 가능케 할 것이다. 또한, 펩티드 태그의 사용은 배양 상등액 내로의 분비 후 또는 진핵 세포 내로의 전위 후 원하는 단백질의 친화성 정제를 가능케 하고, 두 경우 모두 상응하는 태그에 적합한 정제 방법 (예컨대, His-태그와 함께 사용되는 금속-킬레이트 친화성 정제 또는 Flag-태그와 함께 사용되는 항-Flag 항체 기반 정제)을 이용한다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 핵 위치화 신호 (NLS)를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵 위치화 신호 (NLS)를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 융합되고, 상기 추가 뉴클레오티드 서열은 핵 위치화 신호 (NLS)를 인코딩한다. 바람직한 NLS는 SV40 거대 T-항원 NLS 및 이의 유도체30 뿐만 아니라 다른 바이러스 NLS로 구성된 군으로부터 선택된다. SV40 거대 T-항원 NLS 및 이의 유도체가 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 다중 클로닝 부위를 포함한다. 다중 클로닝 부위는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 및/또는 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치한다. 하나 또는 하나보다 많은 다중 클로닝 부위가 벡터에 포함될 수 있다. 바람직한 다중 클로닝 부위는 XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI로 구성된 제한 효소의 그룹으로부터 선택된다. XbaI, XhoI, BstBI 및 HindIII가 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 발현된 융합 단백질은 또한 "융합 단백질" 또는 "혼성 단백질", 즉 전달 신호 및 이종 단백질의 융합 단백질 또는 혼성체로도 불린다. 융합 단백질은 또한, 예컨대 전달 신호 및 2개 이상의 상이한 이종 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에서 상기에 기술한 바와 같은 이종 단백질을 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을, 예컨대 악성 고형 종양을 치료하는 방법을 고려한다. 단백질은 대상체에 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 시점에 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 세포 내로 전달, 즉 전위될 수 있거나, 이후에, 예컨대 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 부위에 도달한 후 및/또는 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 부위에 도달해서 상기에 기술된 바와 같이 복제한 후에 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 세포 내로 전달, 즉 전위될 수 있다. 전달 시점은, 예컨대 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에서 이종 단백질을 발현하는데 사용된 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 첫 번째 경우에, 세균성 이펙터 단백질의 구성적 프로모터 또는, 더욱 바람직하게는, 내인성 프로모터 중 하나가 이종 단백질을 구동할 수 있다. 지연된 단백질 전달의 경우, 인공적으로 유도가능한 프로모터, 예컨대 아라비노스 유도가능 프로모터가 이종 단백질을 구동할 수 있다. 이 경우, 아라비노스는 일단 세균이 원하는 부위에 도착하고 축적되면 대상체에 투여될 것이다. 그 후에 아라비노스는 전달된 단백질의 세균성 발현을 유도할 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 암을 치료하는 방법은:
i) 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계;
ii) 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하여 암세포를 i)의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되고 암세포 내로 전위되는 단계; 및 선택적으로
iii) 이종 단백질이 암세포 내부에서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호로부터 절단되도록 융합 단백질을 절단하는 단계를 포함하고,
상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
이종 단백질을 전달하기 위한 암세포는 일반적으로 육종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 중추신경계 암, 및 악성 고형 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 비-고형 종양으로부터 선택된 암으로부터의 암세포이고, 악성 고형 종양에는 간, 대장, 대장직장, 피부, 유방, 췌장, 자궁경부, 자궁체부, 방광, 담낭, 신장, 후두, 입술, 구강, 식도, 난소, 전립선, 위, 정소, 갑상선 또는 폐와 같은 다양한 조직 유형에서 유래할 수 있는 비정상적 세포 덩어리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 따라서 악성 고형 간, 대장, 대장직장, 피부, 유방, 췌장, 자궁경부, 자궁체부, 방광, 담낭, 신장, 후두, 입술, 구강, 식도, 난소, 전립선, 위, 정소, 갑상선 또는 폐 종양을 포함한다. 바람직하게는 이종 단백질을 전달하기 위한 암세포는 악성 고형 종양이다.
따라서, 바람직한 일 구현예에서, 암은 악성 고형 종양이고 방법은:
i) 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계;
ii) 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하여 악성 고형 종양 세포를 i)의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로, 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되고 악성 고형 종양 세포 내로 전위되는 단계; 및 선택적으로
iii) 이종 단백질이 악성 고형 종양 세포 내부에서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호로부터 절단되도록 융합 단백질을 절단하는 단계를 포함하고,
상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, 각각 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 이종 단백질을 포함하는 적어도 2개의 융합 단백질은 본 발명의 방법에 의해 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되고 진핵 세포, 예컨대 암세포 내로 전위된다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 당해 분야에 공지된 방법 (예컨대, FDA, 생물학적 분석 매뉴얼 (BAM), 챕터 8: 예르시니아 엔테로콜리티카)에 따라 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 발현되도록 배양될 수 있다. 바람직하게는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는, 예컨대 28℃에서 뇌 심장 주사 브로쓰에서 배양될 수 있다. T3SS 및, 예컨대 YopE/SycE 프로모터 의존적 유전자의 발현 유도를 위해, 세균을 37℃에서 성장시킬 수 있다.
일 구현예에서, 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 세포는 i)의 2개의 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주와 접촉되고, 여기서 제1 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 제1 이종 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질을 발현하고, 제2 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호 및 제2 이종 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 발현하며, 그로써 제1 및 제2 융합 단백질은 악성 고형 종양 세포 내로 전위된다. 이 구현예는, 예컨대 2개의 상이한 혼성 단백질을 단일 세포 내로 전달하여 이들의 기능적 상호작용을 해소하기 위한 유효한 방법으로서 2개 세균 균주로의 암세포, 예컨대 악성 고형 종양 세포의 동시-감염을 제공하였다.
당업자는 또한 융합 단백질의 전달이 성공적인지를 결정하기 위해 다수의 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합된 태그 (예컨대, Myc-태그)를 인식하는 항체를 사용하는 면역형광을 통해 검출될 수 있다. 측정은 또한 19에 기재된 바와 같은 분석과 같이, 전달되는 단백질의 효소적 활성에 기초할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 포함하고 임의로 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 대상체에서 암, 예컨대 악성 고형 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균은 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 약제학적 조성물로서 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 배합될 수 있다. 투여되는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 또는 약제학적 조성물의 단위 투약 형태는, 예를 들어, 약 105 내지 약 109 세균/ml, 바람직하게는 약 106 내지 약 108 세균/ml, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 108 세균/ml, 가장 바람직하게는 약 108 세균/ml의 양으로 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균을 함유할 수 있다.
본원에서 호환적으로 사용되는 "대상체를 치료하기에 충분한 양" 또는 "유효량"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 치료되는 상태를 유의미하게 긍정적으로 변경할만큼 충분히 높지만, 심각한 부작용을 회피할만큼 충분히 낮은 (합리적 이힉/유해 비율로), 세균 또는 세균들의 양이다. 세균의 유효량은 달성되는 특정 목표, 치료되는 대상체의 연령 및 신체 상태, 치료 기간, 병용 요법의 특성 및 사용된 특정 세균에 따라 달라질 것이다. 따라서 세균의 유효량은 원하는 효과를 제공할, 최소량일 것이다. 일반적으로 약 105 내지 약 109 세균, 예컨대 약 105 내지 약 109 세균/m2 체표면, 바람직하게는 약 106 내지 약 108 세균, 예컨대 약 106 내지 약 108 세균/m2 체표면, 더욱 바람직하게는 약 107 내지 약 108 세균, 예컨대 약 107 내지 약 108 세균/m2 체표면, 가장 바람직하게는 108 세균, 예컨대 108 세균/m2 체표면의 양이 대상체에 투여된다.
악성 고형 종양과 같은 암을 치료하기 위해 대상체, 예컨대 인간에 투여하기 위한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 단일 용량은 일반적으로 총 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균의 약 104 내지 약 1010 세균, 예컨대 약 104 세균/m2 체표면 내지 약 1010 세균/m2 체표면, 바람직하게는 약 105 내지 약 109 세균, 예컨대 약 105 내지 약 109 세균/m2 체표면, 더욱 바람직하게는 약 106 내지 약 108 세균, 예컨대 약 106 내지 약 108 세균/m2 체표면, 더욱 더 바람직하게는 약 107 내지 약 108 세균, 예컨대 약 107 내지 약 108 세균/m2 체표면, 가장 바람직하게는 108 세균, 예컨대 108 세균/m2 체표면이다.
약제학적 담체로 제공할 수 있는 물질의 예시는 당류, 예컨대 락토스, 글루코스, 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화 트라가칸쓰; 말트; 젤라틴; 탈크; 스테아르산; 마그네슘 스테아레이트; 칼슘 설페이트; 칼슘 카보네이트; 식물성유, 예컨대 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마 (theobroma) 오일; 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 아가; 알긴산; 발열원제거수; 등장 식염수; 크랜베리 추출물 및 인산염 완충액; 탈지분유; 또한 약제학적 제제에 사용되는 기타 비-독성 상용 물질, 예컨대 비타민 C, 에스트로겐 및 에크나시아 (echinacea)이다. 소디움 라우릴 설페이트와 같은 습유제 및 윤활제, 뿐만 아니라 착색제, 향료, 윤활제, 부형제, 정제화제, 안정화제, 항산화제 및 보존제가 또한 존재할 수 있다.
대상체에 대한 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균의 투여 방식은 정맥내, 종양내, 복강내 및 경구 (per-oral) 투여로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명이 임의의 특정한 투여 방식으로 한정되는 것은 아니지만, 세균 또는 약제학적 조성물의 정맥내 또는 종양내 투여가 바람직하다.
투여 경로에 따라서, 세균을 포함하는 활성 성분은 효소, 산 및 상기 유기체를 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적 상태의 작용으로부터 상기 유기체를 보호하기 위해 물질 내에 코팅될 필요가 있을 수 있다. 비경구 투여 이외에 의해 세균을 투여하기 위하여, 이들은 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅되거나 이와 함께 투여되어야 한다. 예를 들어, 세균은 효소 저해제 또는 리포좀과 함께 동시-투여될 수 있다. 효소 저해제에는 췌장 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFP) 및 트라실롤 (trasylol)이 포함된다. 리포좀은 수중유중수적형 (water-in-oil-in-water) P40 에멀젼뿐만 아니라 락토바실러스와 같은 세균 또는 이들의 부산물을 숙주 대상체의 내부 표적으로 운반하는 통상적이고 특이적으로 설계된 리포좀을 포함한다.
하나의 세균이 단독으로 또는 제2의 다른 세균과 함께 투여될 수 있다. 임의의 수의 상이한 세균이 함께 사용될 수 있다. "함께 (in conjunction with)"는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 함께를 의미한다. 조성물은 또한 정제, 알약 또는 캡슐, 예를 들어 본 발명의 세균 또는 약제학적 조성물을 포함하는 냉동-건조된 캡슐 또는 DMSO 또는 글리세롤을 함유하는 본 발명의 세균 또는 약제학적 조성물의 냉동 용액의 형태로 투여될 수 있다. 다른 바람직한 적용 형태는 본 발명의 세균 또는 약제학적 조성물의 동결건조된 캡슐의 제조를 포함한다. 또 다른 바람직한 적용 형태는 본 발명의 세균 또는 약제학적 조성물의 열 건조된 캡슐의 제조를 포함한다.
투여되는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 또는 약제학적 조성물은 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사가능 사용에 적합한 형태는 무균 (monoseptic) 또는 멸균 수성 용액 (수용액인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 무균 또는 멸균이어야 하고 용이한 주사가능성 (syringability)이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 한다. 담체는 용매 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이들의 혼합물 및 식물성유를 함유하는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에 당류 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 대상체에 시데로포어와 함께 동시-투여된다. 이러한 구현예가 바람직하다. 동시-투여되는 시데로포어는 히드록사메이트, 카테콜레이트 및 혼합 리간드 시데로포어를 포함하는 시데로포어이다. 바람직한 시데로포어는 데페록사민 (데스페리옥사민 B, 데스페록사민 B, DFO-B, DFOA, DFB 또는 데스페랄로도 공지됨), 데스페리옥사민 E, 데페라시록스 (엑스자이드, 데시록스, 데프리젯, 데시페르) 및 데페리프론 (페리프록스)이고, 데페록사민이 더욱 바람직하다. 데페록사민은 방선균 (Actinobacteria) 스트렙토마이세스 필로수스 (Streptomyces pilosus)에 의해 생산되는 세균성 시데로포어이고, 예컨대 Novartis Pharma Schweiz AG (Switzerland)로부터 상업적으로 이용가능하다.
시데로포어와의 동시-투여는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 투여 후일 수 있다. 바람직하게는 시데로포어는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 투여 전에 투여되고, 더욱 바람직하게는 대상체에 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주의 투여 적어도 1시간, 바람직하게는 적어도 6시간, 더욱 바람직하게는 적어도 12시간, 특히는 적어도 24시간 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 대상체는 세균 성장을 허용하기 위해 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주로의 감염 24시간 전에 데스프레옥사민으로 사전 처리된다. 일반적으로 시데로포어는 체중 1 kg당 약 0.5×10-5 Mol 내지 약 1×10-3 Mol, 더욱 바람직하게는 약 1×10-5 Mol 내지 약 1×10-4 Mol 바람직하게는 약 3.5×10-5 Mol 내지 약 1.1×10-4 Mol의 단일 용량으로 동시-투여된다. 일반적으로 데스페록사민은 체중 1 kg당 약 20 mg 내지 약 60 mg, 바람직하게는 약 20 mg 내지 약 60 mg의 단일 용량으로 동시-투여된다.
본원에 기술된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 또는 약제학적 조성물의 투약 섭생은, 당업자에게 공지된 바와 같이, 달성하고자 하는 특정 목표, 치료되는 대상체의 연령 및 신체 상태, 치료 기간, 병용 요법의 특성 및 사용된 특정 세균에 따라 달라질 것이다. 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주는 일반적으로 1-20일마다, 바람직하게는 1-10일마다, 더욱 바람직하게는 1-7일마다의 단일 용량으로 구성된 투약 섭생에 따라 대상체에 투여된다. 투여 기간은 일반적으로 약 20 내지 약 60일, 바람직하게는 약 30-40일이다. 대안적으로 투여 기간은 일반적으로 약 8 내지 약 32주, 바람직하게는 약 8 내지 약 24주, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 약 16주이다.
추가 구현예에서 본 발명은 바람직하게는 인간에서 악성 고형 종양과 같은 암을 치료하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 본원에 기술된 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주 또는 약제학적 조성물, 및 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 담체, 포장, 또는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 용기를 포함하고, 각각의 용기(들)은 본원에 기술된 방법에 사용되는 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 테스트 튜브를 포함한다. 다른 구현예에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성된다.
실시예
실시예 1:
A) 재료 및 방법
세균 균주 및 성장 조건. 본 연구에 사용된 균주를 도 3A 내지 M에 열거하였다. 플라스미드 정제 및 클로닝에 사용된 E. coli Top10, 및 컨쥬게이션에 사용된 E. coli Sm10 λ pir, 뿐만 아니라 pKNG101을 증식시키는데 사용된 E. coli BW1961031을 37℃에서 LB 아가 플레이트 및 LB 브로쓰에서 통상적으로 성장시켰다. 발현 벡터를 선별하기 위해 암피실린을 200 μg/ml (예르시니아) 또는 100 μg/ml (E. coli)의 농도로 사용하였다. 자살 벡터를 선별하기 위해 스트렙토마이신을 100 μg/ml의 농도로 사용하였다. Y . 엔테로콜리티카 MRS40 (O:9, 생물형 2)20 비-암피실린 내성 E40-유도체19 및 이의 유래 균주를 실온에서 BHI (Brain Heart Infusion; Difco)에서 통상적으로 성장시켰다. 모든 Y. 엔테로콜리티카 균주에 날리딕산 (nalidixic acid)을 첨가하고 (35 μg/ml) 모든 Y. 엔테로콜리티카 asd 균주에 100 μg/ml의 메소-2,6-디아미노피멜산 (mDAP, Sigma Aldrich)을 추가로 보충하였다. S . 엔테리카 SL1344를 37℃에서 LB 아가 플레이트 및 LB 브로쓰에서 통상적으로 성장시켰다. 암피실린을 S. 엔테리카 내 발현 벡터의 선별을 위해 100 μg/ml의 농도로 사용하였다.
Y. 엔테로콜리티카 의 유전적 조작. Y . 엔테로콜리티카의 유전적 조작은 기술되어 있다32 , 33. 간략히는, pYV 플라스미드 내 또는 염색체상에서 유전자의 변형 또는 결실을 위한 변이유발자 (mutator)를 주형으로서 정제된 pYV40 플라스미드 또는 게놈 DNA를 사용하는 2-단편 중첩 PCR로 작제하여, 각각의 유전자의 결실 또는 변형된 부분의 양측에 200-250 bp의 인접 (flanking) 서열을 초래한다. 생성된 단편을 E. coli BW1961031 내 pKNG10129에 클로닝하였다. 서열 확인된 플라스미드를 E. coli Sm10 λ pir 내로 형질전환시켰고, 이로부터 플라스미드는 상응하는 Y. 엔테로콜리티카 균주 내로 동원된다. 통합된 벡터를 운반하는 변이체를 선별 과정 없이 수 세대 동안 증식시켰다. 그 후에 수크로스를 사용해 벡터를 상실한 클론을 선별하였다. 마지막으로 변이체를 콜로니 PCR로 확인하였다. 특정 변이유발자 (pSi_408, pSi_419)를 표 III에 열거한다.
플라스미드의 제작. 플라스미드 pBad_Si2 또는 pBad_Si1 (도 2)을 YopE의 N-말단 138개 아미노산 (서열번호: 2)과의 융합 단백질의 클로닝을 위해 사용하였다. pBad_Si2를 pBad-MycHisA (Invitrogen)의 KpnI/HindIII 부위 내로 정제된 pYV40로부터의 YopE 및 SycE에 대한 내인성 프로모터를 함유하는 SycE-YopE1 -138 단편을 클로닝하여 제작하였다. 추가적인 변형은 소화에 의한 pBad-MycHisA의 NcoI/BglII 단편의 제거, 클레노우 (Klenow) 단편 처리 및 재결찰 (relegation)을 포함한다. 양방향 전사 종결자 (BBa_B1006; iGEM foundation)를 KpnI 절단 및 클레노우 처리된 (pBad_Si2) 또는 BglII 절단 부위 (pBad_Si1) 내로 클로닝하였다. 나아가, YopE1 -138의 3' 말단에 다음 절단 부위를 부가하였다: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (도 2 B). pBad_Si1은 pBad_Si2와 동일하지만 아라비노스 유도성 프로모터 하에서 NcoI/BglII 부위에서 pEGFP-C1 (Clontech)로부터 증폭된 EGFP를 인코딩한다. 상응하는 내인성 프로모터 및 SteA1 -20 단편 (pSi_266), 전장의 SteA 서열 (pSi_267), SopE1 -81 단편 (pSi_268) 또는 SopE1 -105 단편 (pSi_269)을 함유하는 플라스미드 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269를 S. 엔테리카 SL1344 게놈 DNA로부터 증폭하고 pBad-MycHisA (Invitrogen)의 NcoI/KpnI 부위 내로 클로닝하였다.
전장의 유전자 또는 이의 단편을 하기 표 I에 열거된 특정 프라이머로 증폭하였고 플라스미드 pBad_Si2 내로 또는 z-BIM (서열번호: 16)의 경우에는 pBad_Si1 내로 YopE1 -138에 대한 융합으로 클로닝하였다 (하기 표 II 참조). SteA 또는 SopE에의 융합을 위해, 합성 DNA 작제물을 KpnI/HindII으로 절단하고 각각 pSi_266, pSi_267, pSi_268 또는 pSi_269에 클로닝하였다. 세균 종의 유전자의 경우에, 정제된 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다 (S. 플렉스네리 M90T, 살모넬라 엔 테리카 subsp. 엔테리카 혈청형 타이피뮤리움 SL1344, 바르토넬라 헨셀라에 ATCC 49882). 인간 유전자의 경우, 달리 지시하지 않는 한 범용 cDNA 라이브러리 (Clontech)를 사용하였다 (도 3A 내지 M, 제브라피쉬 유전자를 cDNA 라이브러리 (M. Affolter의 친절한 기증)로부터 증폭하였다). 결찰된 플라스미드를 E. coli Top10 내에 클로닝하였다. 서열분석된 플라스미드를 표준 E. coli 전기천공에 대한 설정을 사용하여 목적하는 Y. 엔테로콜리티카 또는 S. 엔테리카 균주 내로 전기천공하였다.
[표 1]
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Figure pct00002
Figure pct00003
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[표 II] : 클로닝된 융합 단백질
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[표 III]: 유전적 변형을 위한 변이유발자
Figure pct00012
Yop 분비. 배양액을 BHI-Ox (분비-허용 조건)34 중에서 37℃로 이동시켜 yop 레귤론 (regulon)의 유도를 수행하였다. 탄소원 글루코스를 첨가하였다 (4 mg/ml).
총 세포 및 상등액 분획을 4℃에서 10분간 20,800 g로 원심분리에 의해 분리하였다. 세포 펠렛을 총 세포 분획으로 취하였다. 상등액 중의 단백질을 마지막 1시간 동안 4℃에서 트리클로로아세트산 10% (w/v)으로 침전시켰다. 원심분리 (20,800 g로 15분간) 및 상등액의 제거 후, 생성된 펠렛을 빙냉 아세톤으로 밤새 세척하였다. 시료를 다시 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠렛을 공기-건조시키고 1× SDS 로딩 염료에 재현탁하였다.
분비된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였고; 각 경우에, 3×108 세균에 의해 분비된 단백질을 각 레인에 로딩하였다. 12.5% SDS-PAGE 겔을 사용하는 면역블롯팅에 의해 특정 분비된 단백질의 검출을 수행하였다. 총 세포 내 단백질의 검출을 위해, 달리 지시되지 않는 한, 2×108 세균을 각 레인에 로딩하였고, 단백질을 면역블롯팅에 의한 검출 전에 12.5% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다.
YopE에 대한 래트 단일클론 항체 (MIPA193-13A9; 1:1000, 35)를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 항혈청을 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 대해 밤새 2회 사전-흡수시켜 배경 신호를 감소시켰다. ECL 화학발광 기질 (LumiGlo, KPM)을 이용한 발색 전에, 래트 항체에 대해 지시되고 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase)에 접합된 이차 항체 (1:5000; Southern biotech)를 사용해 검출을 수행하였다.
세포 배양 및 감염. HeLa Ccl2 및 B16F10 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민 (cDMEM)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 배양하였다. 4T1 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. Y . 엔테로콜리티카를 실온에서 밤새 첨가제와 함께 BHI에서 성장시키고, 신선한 BHI 중에 OD600 0.2로 희석하고, 추가 30분간 또는 EGFP의 경우에는 1시간 동안 37℃ 수조 교반기로의 온도 변화 전에 실온에서 2시간 동안 성장시켰다. 마지막으로, 세균을 원심분리 (6000 rcf, 30초)로 수집하고 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM으로 1회 세척하였다. 마지막으로, 세균을 원심분리 (6000 rcf, 30 sec)로 수집하고 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM으로 1회 세척하였다. 96-웰 (면역형광용) 또는 6-웰 (웨스턴 블롯팅용)에 접종된 세포를 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM 중에서 지시된 MOI로 감염시켰다. 세균 첨가 후, 플레이트를 1750 rpm에서 1분간 원심분리하고 37℃에서 지시된 기간 동안 놓아 두었다. 지시된 경우 세포외 세균을 겐타미이신 (100 mg/ml)으로 사멸하였다. 면역형광 분석의 경우, 감염 어세이를 4% PFA 고정에 의해 중단하였다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 Phospho-safe 용해 완충제 (Novagen)를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 얼음 중의 인큐베이션 후, 세포를 원심분리 (16 000 rcf, 25분, 4℃)하였다. 상등액을 수집하고, 항-액틴 (Millipore), 항-Bid (Cell Signaling), 항-Myc (Santa Cruz), 항-카스파제-3 p17 (Cell Signaling) 및 항-Ink4C (Cell Signaling) 항체를 사용하는 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 전에 Bradford BCA 어세이 (Pierce)에 의해 총 단백질 함량을 분석하였다.
감염된 세포로부터 T3SS 전위된 단백질의 웨스턴 블롯팅. 6-웰 플레이트 내 HeLa 세포를 상기에 기술된 바와 같이 MOI 100으로 감염시켰다. TEV 프로테아제 전위 Y. 엔테로콜리티카 균주와의 동시-감염 경우에, 균주의 OD600을 설정하고 2개의 세균 현탁액을 세포에 첨가하기 전에 1:1 (달리 지시되지 않는 경우)의 비율로 튜브에서 혼합하였다. 감염 말기에, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 동일한 부피의 빙냉 PBS 중에 긁어 모아 수집하였다. 원심분리 (16 000 rcf, 5분, 4℃) 후, 펠렛을 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche complete, Roche)이 보충된 0.002% 디지토닌 중에 용해시켰다. 용해된 펠렛을 얼음 상에서 5분간 인큐베이션한 후 원심분리하였다 (16,000 rcf, 25분, 4℃). 상등액을 수집하고 항-Myc (Santa Cruz, 9E11) 또는 항-Ink4C (Cell Signaling) 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 전에 Bradford BCA 어세이 (Pierce)에 의해 총 단백질 함량을 분석하였다.
자동화 현미경 및 영상 분석. 영상을 ImageXpress Micro (Molecular devices, Sunnyvale, USA)로 자동적으로 획득하였다. 항-Myc 염색 강도의 정량을 MetaXpress (Molecular devices, Sunnyvale, USA)를 사용하여 수행하였다. 핵 영역을 제외한 세포 내 영역 및 세균을 함유하는 영역을 수동적으로 선택하고 (40 픽셀 영역의 원) 평균 강도를 기록하였다.
B16-F10 및 4T1 종양 동종이형 마우스 모델의 생체분포
모든 동물 실험은 승인되었고 (라이센스 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) 현지 가이드라인 (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) 및 스위스 동물 보호법 (Tierschutz-Gesetz)에 따라 수행되었다. 6주령의 C57Bl/6 및 BALB/c 마우스를 Janvier Labs으로부터 주문하였다. 적어도 1주의 적응 후, 마우스를 이소풀루란을 사용해 마취시키고 100 ul의 B16-F10 또는 4T1 세포 (1×105-1×106 세포)를 각각 C57Bl/6 및 BALB/c의 옆구리에 피하 주사하였다. 실험 전반에 걸쳐서, 마우스의 행동 및 신체적 외양에 대해 점수를 매기고, 표면 온도 및 체중을 측정하였다.
일단 종양이 발생하면, 마우스에 i.p. 주사를 통해 8 mg/ml의 데스페랄 용액 (10 ml/kg)을 투여하였다. 다음 날, 마우스를 꼬리 정맥 내로의 주사에 의해 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 또는 Y. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔHOPEMT (2×105, 1×106 또는 1×107 세균)로 감염시켰다. 마우스에 i.v. 투여된 접종물을 희석 도말에 의해 확인하였다. 일부 실험에서, 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비를 매일 측정함으로써 주시하였다. 종양 부피를 0.523×길이×너비2로 결정하였다. 감염 후 각각의 날에, 마우스를 CO2 흡입으로 희생시켰다. 혈액 시료를 심장으로부터의 흡인을 통해 즉시 분리하였다. 간, 비장, 폐 및 종양을 분리하여 이들의 무게를 측정하였다. 장기 및 종양을 균질화하였다. 각 시료 내 CFU를 날리딕산 (35 ug/ml)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 연속 희석의 스폿팅에 의해 결정하였다.
직접적인 타입 I 인터페론 활성화 어세이. 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 제어하에서 분비된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 또는 분비된 Lucia 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 뮤린 B16F10 흑색종 세포, 뮤린 RAW264.7 야생형 또는 MAVS 넉아웃 대식세포를 InvivoGen (B16-Blue ISG, RAW-Blue ISG, RAW-Lucia ISG 및 RAW-Lucia ISG-KO-MAVS)으로부터 구매하였다. 성장 조건 및 타입 I IFN 어세이를 InvivoGen에 의해 제공된 프로토콜로부터 개조하였다. 간략히는, 150 μl 시험 배지 (B16-Blue ISG 세포의 경우 RPMI + 2 mM L-글루타민 + 10% FCS; RAW-Blue, RAW-Lucia 및 RAW-Lucia KO-MAVS ISG 세포의 경우 DMEM + 2 mM L-글루타민 + 10% FCS) 중의 12'500 B16-Blue ISG 세포 또는 30'000 RAW-Blue, RAW-Lucia 또는 RAW-Lucia KO-MAVS ISG 세포를 평평한 바닥의 96-웰 플레이트 (NUNC 또는 Corning)의 각 웰에 접종하였다. 다음 날, 세포를 원하는 감염 다중도 (MOI, 시험 배지 중에 희석됨)의 웰당 15 μl를 첨가하여 평가할 세균 균주로 감염시켰다. 2시간의 인큐베이션 (37℃ 및 5% CO2) 후, 세균을 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 ug/ml)을 함유하는 시험 배지를 첨가하여 사멸하였다. 인큐베이션을 20-24시간 동안 지속하였다. SEAP 및 루시퍼라제를 각각 QUANTI-BlueTM 및 QUANTI-LucTM 프로토콜 (InvivoGen)에 따라 검출하였다. SEAP 검출을 위해: 20 μl의 세포 상등액을 180 μl의 검출 시약 (QUANTI-BlueTM, InvivoGen)과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고 SEAP 활성을 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용해 650 nm에서 OD를 판독함으로써 측정하였다. 양성 대조군으로서 시험 배지 중에 각각의 농도로 희석된 뮤린 IFNγ (스톡: 1'000'000 U/ml)를 사용하였다. 루시퍼라제 검출을 위해: 20 μl의 세포 상등액에 50 μl 검출 시약 (QUANTI-LucTM, InvivoGen)을 불투명 플레이트 (ThermoScientific)에 첨가하였다. 형광을 플레이트 판독기 (BioTek)를 사용해 즉시 측정하였다.
간접적인 타입 I 인터페론 활성화 어세이. 뮤린 B16F10 또는 4T1 세포를 상기에 기술된 바와 같이 총 4시간 동안 평가될 세균 균주의 지시된 다중 감염도 (MOI)로 감염시켰다. 그 후에 세포 상등액을 I-ISG54 프로모터 (다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성됨; InvivoGen로부터 구매, B16-Blue ISG 세포)의 제어하에서 분비된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP)를 안정적으로 발현하는 뮤린 B16F10 흑색종 세포로 옮겼다. 성장 조건 및 타입 I IFN 어세이를 InvivoGen에 의해 제공된 프로토콜로부터 개조하였다. 간략히는, 웰당 150 μl의 시험 배지 (RPMI + 2 mM L-글루타민 + 10% FCS) 중의 12'500 B16-Blue ISG 세포를 평평한 바닥의 96-웰 플레이트 (NUNC)에 접종하였다. 다음 날, 전체 배지를 제거하고 미리 감염된 B16F10 또는 4T1의 세포 상등액 100 ul를 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 20-24시간 동안 인큐베이션하였다. SEAP를 QUANTI-BlueTM 프로토콜 (InvivoGen)에 따라 검출하였다. 20 μl의 세포 상등액을 180 μl의 검출 시약 (QUANTI-BlueTM, InvivoGen)과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고 SEAP 활성을 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용해 650 nm에서 OD를 판독함으로써 측정하였다.
종양 내 처리 시 B16F10 종양 동종이식 마우스 모델에서의 종양 진행 연구. 모든 동물 실험은 책임 있는 기관에 의해 승인되었고 현지 가이드라인 및 동물 보호법에 따라 수행되었다. 5-7주령의 암컷 C57Bl/6 마우스를 Charles River (L'Arbresles)로부터 주문하였다. 적어도 1주의 적응 후, 마우스를 이소풀루란을 사용해 마취시키고 200 μL의 RPMI 1640 중의 1×106 B16-F10 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 일정한 간격으로, 마우스의 행동 및 신체적 외양에 대해 모니터링하고, 체중을 측정하였다.
종양 부피가 60-130 mm3에 도달하면 (0일째로 정의됨) 처리를 개시하였다. 마우스를 0, 1, 2, 3, 6 및 9일째에 이소풀루란 마취 하에서 종양 내 주사 (투여당 50 ul PBS 중의 7.5×107 세균)에 의해 평가될 세균 균주로 감염시켰다. 마우스에 종양 내로 투여되는 접종물을 희석 도말에 의해 확인하였다. 대조군으로서, 마우스에 내독소-무함유 PBS만을 주사하였다. 마지막 세균 처리 24시간 전에 (8일째) 마우스에 i.p. 주사를 통해 8 mg/ml 데스페랄 용액 (10 ml/kg)을 투여하였다. 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비의 측정에 의해 주시하였다. 종양 부피를 0.5×길이×너비2로 결정하였다. 1500 mm3을 초과하는 종양 부피를 인간 종료점으로 정의하였다.
종양 내 처리 시 EMT -6 종양 동종이식 마우스 모델에서의 종양 진행 및 재감염 ( rechallenge )의 연구. 모든 동물 실험은 책임 있는 기관에 의해 승인되었고 현지 가이드라인 및 동물 보호법에 따라 수행되었다. 5-7주령의 암컷 BALB/c (BALB/cByJ) 마우스를 Charles River (L'Arbresles)로부터 주문하였다. 적어도 1주의 적응 후, 마우스를 이소풀루란을 사용해 마취시키고 200 μL의 RPMI 1640 중의 1×106 EMT-6 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 일정한 간격으로, 마우스의 행동 및 신체적 외양에 대해 모니터링하고, 체중을 측정하였다.
종양 부피가 60-130 mm3에 도달하면 (0일째로 정의됨) 처리를 개시하였다. 마우스를 0, 1, 5, 6, 10 및 11일째에 이소풀루란 마취 하에서 종양 내 주사 (투여당 50 ul PBS 중의 7.5×107 세균)에 의해 평가될 세균 균주로 감염시켰다. 마우스에 종양 내로 투여되는 접종물을 희석 도말에 의해 확인하였다. 대조군으로서, 마우스에 내독소-무함유 PBS만을 주사하였다. 마지막 세균 처리 24시간 전에 (10일째) 마우스에 i.p. 주사를 통해 8 mg/ml 데스페랄 용액 (10 ml/kg)을 투여하였다. 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비의 측정에 의해 주시하였다. 종양 부피를 0.5×길이×너비2로 결정하였다. 1500 mm3을 초과하는 종양 부피를 인간 종료점으로 정의하였다. 처리 개시 후 54일째에 완전한 종양 퇴행을 나타내는 마우스를 이소풀루란으로 마취하고 200 μL의 RPMI 1640 중의 1×106 EMT-6 세포를 첫 번째 종양 세포 주사에 대해 반대편 (좌측) 옆구리에 피하 주사하였다. 대조군으로서, 이전에 EMT-6 세포로 이식되지 않은 나이브 (naive) 마우스를 포함시켰다. 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비의 측정에 의해 주시하였다. 종양 부피를 0.5×길이×너비2로 결정하였다. 1500 mm3을 초과하는 종양 부피를 인간 종료점으로 정의하였다.
종양 내 처리 시 EMT -6 종양 동종이식 마우스 모델에서 종양 진행의 연구. 모든 동물 실험은 책임 있는 기관에 의해 승인되었고 현지 가이드라인 및 동물 보호법에 따라 수행되었다. 5-6주령의 암컷 BALB/c (BALB/cByJ) 마우스를 Charles River (L'Arbresles)로부터 주문하였다. 적어도 1주의 적응 후, 마우스를 이소풀루란을 사용해 마취시키고 200 μL의 RPMI 1640 중의 1×106 EMT-6 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 일정한 간격으로, 마우스의 행동 및 신체적 외양에 대해 모니터링하고, 체중을 측정하였다.
종양 부피가 80-250 mm3에 도달하면 (0일째로 정의됨) 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 무작위화 24시간 전에 (D-1), 마우스에 i.p. 주사를 통해 8 mg/ml 데스페랄 용액 (10 ml/kg)을 투여하였다. 0일째, 마우스에 이소풀루란 마취 하에서 정맥 내 주사 (투여당 100 ul PBS 중의 5×106 세균)에 의해 평가될 세균 균주를 투여하였다. 마우스에 정맥 내로 투여되는 접종물을 희석 도말에 의해 확인하였다. 대조군으로서, 마우스에 내독소-무함유 PBS만을 주사하였다. 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비의 측정에 의해 주시하였다. 종양 부피를 0.5×길이×너비2로 결정하였다. 1500 mm3을 초과하는 종양 부피를 인간 종료점으로 정의하였다.
종양 세포 단리물의 감염 시 IFNβ 분비의 측정. 모든 동물 실험은 승인되었고 (라이센스 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) 현지 가이드라인 (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) 및 스위스 동물보호법 (Tierschutz-Gesetz)에 따라 수행되었다. 6주령의 BALB/c 마우스를 Janvier Labs로부터 주문하였다. 1주의 적응 후, 마우스를 이소풀루란을 사용해 마취시키고 100 ul의 EMT-6 세포 (1×106 세포)를 마우스의 옆구리 내로 피하 주사하였다. 실험 전반에 걸쳐서, 마우스의 행동 및 신체적 외양에 대해 점수를 매기고, 표면 온도 및 체중을 측정하였다. 종양 진행을 디지털 캘리퍼를 사용해 종양 길이 및 너비를 매일 측정함으로써 주시하였다. 종양 부피를 0.5×길이×너비2로 결정하였다. 어세이 당일에, 종양을 분리하고, 1-2 mm의 작은 조각으로 자르고, 1-1.5시간 동안 소화하고 70 μm 나일론 메쉬를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이 미정제 세포 단리물의 세포 수를 결정하고 웰당 300'000 세포를 성장 배지 (DMEM + L-글루타민 + 비-필수 아미노산 + 10% FCS) 중의 평평한 바닥 24-웰 플레이트 (Corning)에 접종하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 인큐베이션 후, 세포를 세균 적정 (상이한 MOI, 성장 배지로 희석됨)의 웰당 100 μl를 첨가하여 평가될 세균 균주로 감염시켰다. 1시간의 인큐베이션 (37℃ 및 5% CO2) 후, 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 ug/ml)을 함유하는 성장 배지를 첨가하여 세균을 사멸하였다. 인큐베이션을 추가 3시간 동안 지속하였다. 플레이트를 원심분리하여 웰 바닥에 모든 세포를 수집하고 상등액을 제조사의 지침에 따라 LumiKine™ Xpress 뮤린 IFN-β ELISA (Invivogen)에 의해 IFNβ 농도에 대해 분석하였다.
B) 결과
YopE 융합 단백질의 타입 3 분비에 기초한 단백질 전달 시스템
Y. 엔테로콜리티카 T3SS 이펙터 YopE (서열번호: 1)의 가장 N-말단은 이종 단백질을 전위하는데 충분한 분비 신호를 함유하지만22, 그의 샤페론 (SycE)에 대한 샤페론-결합 부위 (CBS)는 포함하지 않는다36. 이것이 다른 이종 T3S 기질의 전위에 대해 최상의 결과를 제공하는 것으로 나타났기 때문에24, 본 발명자들은 YopE의 N-말단 138개 아미노산 (서열번호: 2)을 전달되는 단백질에 융합되는 것으로 선택하였다. YopE의 이들 N-말단 138개 아미노산은 CBS를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 또한 SycE의 동시발현을 결정하였다. 정제된 Y. 엔테로콜리티카 pYV40 병원성 플라스미드로부터 클로닝된 SycE-YopE1 -138 단편은 YopE의 내인성 프로모터 및 그의 샤페론 SycE를 함유한다 (도 2). 따라서, SycE 및 임의의 YopE1 -138 융합 단백질은 RT에서의 성장으로부터 37℃로의 신속한 온도 변화에 의해 유도된다. 37℃에서의 배양 시간은 세균 내에 존재하는 융합 단백질의 양에 영향을 미칠 것이다. 다중 클로닝 부위 (MCS)를 YopE1 -138의 말단 (도 2의 B)에 부가하고 이어서 Myc 및 6xHis 태그 및 정지 코돈을 부가하였다.
배경 균주를 신중히 선택하였다. 먼저, 내인성 이펙터의 전위를 제한하기 위해, 본 발명자들은 모든 공지의 이펙터, Yop H, O, P, E, M 및 T가 결실된 Y. 엔 테로콜리티카 균주를 사용하였다 (ΔHOPEMT로 명명됨)37. 또한, 본 발명자들은 종종 외인성 메소-2,6-디아미노피멜산의 부재하에서는 성장할 수 없는 영양요구성 변이체를 사용하였다38. 이 균주는 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 유전자 (Δasd)가 결실되었고, 스위스 안전국 (Swiss safety agency)에 의해 생물안정성 수준 1로 분류되었다 (A010088/2로 개정). 또한, 본 발명자들은 부착 단백질 YadA 및/또는 InvA를 결실시켜 배경 균주의 더 큰 선택을 제공하였다. yadA 또는 yadA/invA 균주의 사용은 유도된 배경 신호전달을 감소시키지만39, 전달된 단백질 양 역시 영향을 받는다40.
진핵 세포로의 융합 단백질의 전위 후 YopE 1 -138 부속물 (appendage)의 제거
세균 전달의 경우, YopE1 -138 단편은 큰 이점을 가지지만, 융합 단백질 기능 및/또는 위치화를 방해할 수 있다. 따라서, 단백질 전달 후 이의 제거는 최적일 것이다. 이를 위해, 본 발명자들은 YopE1 -138과 융합 파트너 (전사 조절자 ET1-Myc (서열번호: 9 및 11)44 및 인간 INK4C (서열번호: 8 및 서열번호: 10)) 사이에 2개의 TEV 절단 부위 (ENLYFQS)41- 43를 도입하였다. 제시된 방법의 장점을 유지하기 위해, 본 발명자들은 또한 또 다른 Y. 엔테로콜리티카 균주에서 YopE1 -138 (서열번호: 12)에 TEV 프로테아제 (S219V 변형체; 45)를 융합하였다. 헬라 세포를 한 번에 두 균주 모두로 감염시켰다. 단백질의 전위된 분획만의 분석을 가능케 하기 위해, 감염된 HeLa 세포를 세균을 용해하지 않는 것으로 알려진 (46;) 디지토닌으로 2시간 동안 p.i.로 용해시켰다. 웨스턴 블롯 분석에 따르면 세포가 상응하는 균주로 감염된 경우에만 YopE1 -138-2xTEV-절단-부위-ET1-Myc 또는 YopE1 -138-2xTEV-절단-부위-Flag-INK4C-Myc의 존재가 나타났다. 정제된 TEV 프로테아제를 이용한 이 세포-용해물의 밤새 소화 시, 이동된 밴드가 관찰될 수 있다. 이 밴드는 TEV 절단 부위의 N-말단 나머지를 갖는 ET1-Myc 또는 Flag-INK4C에 상응하고, 이는 대부분 단 하나의 세린일 가능성이 있다. TEV 프로테아제를 전달하는 균주로의 세포의 동시-감염 시, 동일한 절단된 ET1-Myc 또는 Flag-INK4C 단편이 보이게 되고, 이는 T3SS를 통해 전달된 TEV 프로테아제가 기능적이고 단일 세포가 두 세균 균주로 감염되었음을 나타낸다. 절단이 완전하지는 않지만, 전위된 단백질의 대부분은 감염 후 2시간째에 이미 절단되고 심지어 정제된 TEV 프로테아제를 이용한 밤새 소화에도 더 나은 절단율을 나타내지 않는다. 보고된 바와 같이, TEV 프로테아제 의존적 절단은 융합 단백질에 의존적인 최적화를 요구할 수 있다47 , 48. 따라서 전위 후 YopE1 -138 부속물의 TEV 프로테아제 의존적 제거는 최초로, 단 하나의 N-말단 아미노산에 의해 아미노산 조성이 변화하는, 거의 천연의 이종 단백질의 T3SS 단백질 전달을 제공한다.
YopE 단편의 TEV 프로테아제 의존적 절단에 대한 대안적인 접근법은 관심 융합 단백질 내로의 유비퀴틴 통합으로 구성된다. 실제로, 유비퀴틴의 한 그룹의 내인성 유비퀴틴-특이적 C-말단 프로테아제 (탈유비퀴틴화 효소, DUBs)에 의해 그의 C-말단에서 프로세싱된다. 절단이 유비퀴틴의 가장 C-말단 (G76 이후)에서 일어나는 것으로 추정되기 때문에, 관심 단백질은 추가 아미노산 서열이 없어야 한다. 이 방법을 YopE1 -138-유비퀴틴-Flag-INK4C-MycHis 융합 단백질에 대해 시험하였다. YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis-발현 세균으로 감염된 대조군 세포에서, YopE1 -138-Flag-INK4C-MycHis에 상응하는 밴드가 발견되었고, 이는 융합 단백질의 효율적인 전위를 나타낸다. 세포를 YopE1 -138-유비퀴틴-Flag-INK4C-MycHis-발현 세균으로 1시간 동안 감염시켰을 때, Flag-INK4C-MycHis의 크기에 상응하는 추가 밴드가 가시화되었고, 이는 융합 단백질의 일부가 절단되었음을 나타낸다. 이 결과는 융합 단백질 내로의 유비퀴틴의 도입이 외인성 프로테아제의 요구 없이 YopE1 -138 단편의 절단을 가능케 함을 보여준다.
진핵 세포에 대한 병원성 활성을 갖는 세균 이펙터 단백질의 결실/돌연변이에 의한 병원성 약독화
Y. 엔테로콜리티카의 경우에, 문헌 [YopH, O, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopHΔ1-352, yopOΔ65-558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135])37에 상세히 기재된, "예르시니아 외부 단백질 (Yersinia outer proteins)" (Yops)로 불리는, 6개 내인성 이펙터 단백질의 제거에 의해 병원성이 감소되었다. 이들 Yops는 완전한 타입 3 분비 시스템 (T3SS)뿐만 아니라 다른 병원성 작용자 (player)가 인코딩되는, 약 70 kbp 크기 플라스미드인, "예르시니아 병원성 플라스미드" (pYV) 상에 인코딩된다 (도 4). YopH, O, P, E, M 및 T는 6개의 이펙터 단백질로서, 이들은 면역 체계를 조절하고 완충하기 위해 세균성 유형의 3개 분비 시스템에 의해 숙주 세포에 전달된다. 각각의 Yop는 숙주 세포에서 특별한 생화학적 활성을 갖는다. YopT는 Rho GTPases의 C-말단 시스테인을 절단하고 그로써 막에 GTPases를 고정시키는 이소프레닐 그룹을 제거한다. 잘못된 위치화 (mislocalization)로 인한 Rho의 불활성화는 대식세포 및 호중구와 같은 면역 세포에 의한 식균작용 (phagocytosis)을 회피한다49. 동일한 경로에서, YopE는 Rho GTPases에 대한 GTPase 활성화 단백질 (GAP)로 작용하여 이들을 불활성화시킨다. 이는 식균작용의 감소 및 면역 세포에 의한 IL-1 베타의 방출 감소를 초래한다49. 나아가, YopO는 구아니딘 뉴클레오티드 억제제 (GDI)로 작용하여, Rho GTPases를 불활성화시킨다. YopO는 또한 액틴 세포골격에서 아직 정의되지 않은 방식으로 작용하는 세린/쓰레오닌 키나제 도메인을 갖는다49. YopH는 국소 부착 키나제 (Focal adhesion kinase, Fak), 팍실린 및 기타와 같은 국소 부착 단백질에 작용하는 티로신 포스파타제이고, 따라서 대식세포 및 호중구에 의한 식균 작용을 강력히 방지한다49. Y . 슈도투베르쿨로시스 또는 Y. 페스티스에서 YopJ로 명명된, YopP는 면역 세포에서 MAPK/NFkB 경로를 비활성화시켜, 세균의 존재에 의해 자극되는 면역 세포로부터의 TNFa 및 IL-8 방출을 방지하는 것으로 나타났다. 또한, YopP는 면역 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났는데, 이는 그의 활성화된 상태에서 세포를 아폽토시스로부터 보호하는, MAPK 경로에서의 효과와 관련이 있을 수 있다49. YopM의 역할은 아직 완전히 명확하지는 않지만, 리보좀 S6 키나제 1 (RSK1) 및 단백질 키나제 C-유사 2 (PRK2)와 연관된 것으로 나타났다. YopM은 RSK1의 인산화를 자극하여 표적, 예컨대 세포주기 진행에 영향을 줄 수 있는 것처럼 보인다49. 이러한 Yops 중 하나 또는 수개를 제거함으로써, 면역 체계에 대한 세균의 방어 메커니즘은 상당히 영향을 받는다50. 각각의 yops의 돌연변이를 각각의 영역에 대한 PCR 및 시험관 내 분비 어세이에 의해 확인하였다. SDS-PAGE 및 쿠마시-블루 염색에 의한 시험관 내 분비 어세이에 의해 전장의 YopH,O,M 및 YopE의 부재를 확인하였다.
나아가, asd (아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제)에 결실을 갖는 Y. 엔테로콜리티카 균주를 제작하였다. asd에서의 돌연변이는 메소-디아미노-피멜산의 부가 없이 성장 능력의 완전한 손실을 초래한다. 이는 각각의 플라스미드 상의 asd의 존재에 기초하여 무-항생제 플라스미드 유지 시스템의 생성을 가능케 한다. 유사한 방식으로, 다른 영양요구성 변이체가 사용될 수 있다.
증강된 프로- 아폽토시스 세균의 생성
프로-아폽토시스 단백질의 전달을 최적화하기 위하여, 상이한 프로-아폽토시스 단백질로 형질전환된 균주를 표 IV에 따라 생성하였다.
[표 IV]: 상이한 프로- 아폽토시스 단백질로 형질감염된 균주
Figure pct00013
전달된 단백질을 신호전달에 필요한 필수 도메인 (예컨대, t-BID의 BH3 도메인 (서열번호: 19))으로 단축하는 것은 세포 사멸의 효능을 증가시킬 수 있다 (도 5). 이론에 구속됨이 없이, 이러한 효능의 증가는 전달된 단백질의 더 작은 크기로 인해 단백질 생산량 증가 및 T3SS를 통한 후속 전달과 관련이 있을 가능성이 있다. YopE 부분과 tBID의 BH3 도메인 (서열번호: 23) 사이에 링커의 도입뿐만 아니라 4개의 추가 아미노산에 의한 BH3 도메인의 확장 (서열번호: 22)은 효능을 감소시켰다 (도 5).
또한, 이러한 필수 도메인의 반복을 갖는 합성 화물 (synthetic cargo) (예컨대, tBID의 BH3 도메인 (서열번호: 27)) 또는 이들 필수 도메인의 조합 (예컨대, t-BID의 BH3 도메인 및 BAX의 BH3 도메인 (서열번호: 24 및 28))을 생성하였다. 놀랍게도, 동일하거나 상이한 BH3 도메인의 탠덤 반복 (tandem repeat)은 암성 세포주 (4T1 및 B16F10 세포 포함, 도 5)에서 증가된 아폽토시스 유도를 초래하는 것으로 나타났다. 이러한 세포의 50%를 사멸하기 위해 요구되는 진핵 세포당 세균의 수 (MOI)를 지칭하는, IC50 (최대 억제 농도의 절반)은 단일 tBID BH3 도메인에 비해 tBID BH3 도메인의 탠덤 반복의 전달 시 감소하는 것으로 나타났다 (도 5). t-BID의 제2 BH3 도메인으로 융합됨에 따라 단백질 크기가 증가하기 때문에, 이러한 결과는 놀라운 것이다. 이로 인해, YopE1 -138-tBID BH3 (서열번호: 19 및 25)에 비해 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)의 발현 및 전달 수준의 감소가 예상될 것이고, 최대한 동등한 수준에 도달할 것이다. 세포 사멸 활성의 증가에 도달하기 위해, 융합된 tBID BH3 도메인은 T3SS에 의한 진핵 세포 내로의 전달 시 나란히 동시에 작용해야 한다. YopE1 -138-(tBID BH3)2 작제물 내 단 하나의 tBID BH3 도메인이 기능적일 경우에는, 기껏해야 YopE1 -138-tBID BH3과 동일한 효능이 기대될 수 있다.
생체 내 연구를 위한 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)의 유전적 안정성을 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 상동 재조합에 의해 YopE의 고유 위치 및 천연 YopE 프로모터 하에서 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV에 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)를 클로닝하였다 (변이유발자 플라스미드 pSI_408 및 pSI_419 사용). 이러한 변이유발자는 통합이 일어나게 될, 각각의 유전자 부위에 상응하는 양측에서 200-250 bp의 서열이 인접하는, 원하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 이러한 플라스미드를 E. coli Sm10 λ pir 내로 형질전환시키고, 이로부터 플라스미드는 상응하는 Y. 엔테로콜리티카 균주 내로 동원되었다. 통합된 벡터를 운반하는 변이체는 선택 압력 없이 수 세대 동안 증식시켰다. 그 후에 수크로스를 사용하여 벡터를 상실한 클론을 선별하였다. 마지막으로 변이체를 콜로니 PCR로 동정하였다. T3SS ("예르시니아 외부 단백질", Yops로 불림)에 의한 운반을 위한 내인성 단백질은 T3SS 기구를 더 인코딩하는, 예르시니아 병원성 플라스미드 (pYV)로 명명된, 70 kb 플라스미드 상에서 Y. 엔테로콜리티카에 의해 인코딩된다.
YopE의 고유 위치 및 천연 YopE 프로모터 하에서 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV 상에 YopE1 -138-(tBID BH3) (서열번호: 19 및 25) 또는 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)를 인코딩하는 예르시니아 균주를 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력에 대해 평가하였다 (4T1 및 B16F10 세포 포함, 도 6). 이러한 세포의 50%를 사멸하기 위해 요구되는 진핵 세포당 세균의 수 (MOI)를 지칭하는, IC50 (최대 억제 농도의 절반)을, 두 단백질이 모두 YopE의 고유 위치 및 천연 YopE 프로모터 하에서 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV 상에서 인코딩되는 경우, 단일 tBID BH3 도메인에 비해 tBID BH3 도메인의 탠덤 반복의 전달 시 감소하는 것으로 나타났다 (도 6). 이는 이들 단백질의 발현 플라스미드 매개 전달로부터의 결과와 일치한다 (도 5). 다시 말해, 단백질 크기가 t-BID의 제2 BH3 도메인이 융합됨으로써 증가되기 때문에 이러한 발견은 놀라운 것이다. 이로 인해, YopE1 -138-tBID BH3 (서열번호: 19 및 25)에 비해 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)의 발현 및 전달 수준의 감소가 예상될 것이고, 최대한 동등한 수준에 도달할 것이다. 세포 사멸 활성의 증가에 도달하기 위해, 융합된 tBID BH3 도메인은 T3SS에 의한 진핵 세포 내로의 전달 시 나란히 동시에 작용해야 한다. YopE1 -138-(tBID BH3)2 작제물 내 단 하나의 tBID BH3 도메인이 기능적일 경우에는, 기껏해야 YopE1 -138-tBID BH3과 동일한 효능이 기대될 수 있다. 나아가, YopE의 고유 위치 및 천연 YopE 프로모터 하에서 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV 상에 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)를 인코딩하는 예르시니아 균주를 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 이들의 능력에 대해 YopE1 -138-(tBID BH3)2의 발현 플라스미드 (pBad-MycHisA 기초) 유래 전달과 비교하였다. pYV (1-6 카피가 보고됨)에 비해 더 높은 pBad-MycHisA의 카피수 (20-25 카피)와 일치하여, YopE1-138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27)의 pBad-MycHisA에 기초한 전달은 4T1 및 B16F10 세포에서 IC50 값을 약간 감소시켰다 (도 6).
흑색종의 뮤린 모델에서 생체분포 연구
종양 특이적 비히클로서 T3SS 이펙터와 같은 주요 병원성 결정인자에서 돌연변이(들)을 갖는 그람-음성 세균을 검증하기 위해, 잘 확립된 B16F10 흑색종 모델 (ATCC No. CRL-6475)을 사용하는 뮤린 동종이식 종양 연구를 수행하였다. s.c. 종양이 특정 크기 (약 100-200 mm3)에 도달하면, 마우스에 2×105 cfu Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 또는 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T를 i.v. 감염시켰다. 세균의 성장을 허용하기 위해, 마우스를 감염 24시간 전에 데스프레옥사민 (desfreoxamine)으로 사전 처리하였다. 야생형 (wt) Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 균주로 감염된 마우스는 신체적 외모 및 행동에 대한 점수가 증가되었고 (도 47-48) 감염의 처음 48시간에 걸쳐서 상당한 체중 감소를 나타내었으며 (도 49), 이는 감염 후 2일째에 이미 이 그룹의 마우스 모두를 희생시키게 하였다. 반대로, 병원성 약독화된 Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T 균주로 감염된 마우스는 감염 후 4일째에도 여전히 유의미한 체중 감소를 보이지 않았고 신체적 외모 및 행동에 대해 평점을 받았다 (도 47- 49). 야생형 (wt) 균주 (Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40)로 감염된 마우스에서는 살아있는 세균이 평가된 모든 장기에서 검출되었고, 또한 혈액에서도 발견되었다 (도 51). 야생형 세균이 악성 고형 종양에 존재하는 것으로 나타났지만, 동일하게 높거나 더 높은 수치가 다른 장기에서 발견되었고, 비장에서 가장 높았다 (도 51). 매우 대조적으로, Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T로 감염된 마우스에서는, 살아있는 세균이 주로 감염 후 1일째에 악성 고형 종양에서 발견되었으며, 비장, 간 및 폐에서는 낮은 세균 수가 관찰되었다. 특히, 감염 후 4일째에, 악성 고형 종양 내 세균 수는 몇 배나 증가하였지만, (108 cfu/g 종양 조직 초과에 도달함), 평가된 모든 다른 장기에서 세균 수는 검출 한계 이하로 떨어졌다 (도 50). 따라서, Y. 엔테로콜리티카 subsp. 팔레아크티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T는 감염 후 4일째에 비장 또는 간에 비해 악성 고형 종양 부위에서 약 (최소한) 백만 배의 이율로 축적하였다 (검출 한계에 대한 비율로 계산하는 경우).
B16F10 흑색종 보유 마우스의 외측 꼬리 정맥 내로의 정맥 내 투여 후 5일 또는 8일째에 고형 종양의 g당 세균의 유사하게 높은 수가 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT, Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT + pYV-YopE1 -138-뮤린 RIG1 CARDs 또는 Y. 엔테로콜리티카 dHOPEMT ΔHairpinI-VirF + pYV-YopE1 -138-뮤린 RIG1 CARDs에서 측정되었다 (도 26). 이러한 결과는, 이종 단백질 화물 및 T3SS 조절에 영향을 미치는 추가 돌연변이 (VirF)가 뮤린 모델에서 고형 종양의 세균 콜로니화에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
상기 결과는 악성 고형 종양을 특이적으로 표적하는 세균 비히클을 생성하기 위해 주요 병원성 결정인자의 돌연변이에 의한 병원성 약독화를 위한 이러한 전략을 검증한다.
세균 투여 후 14일째까지 생체 내 종양 특이적 성장의 검증
유전적으로 변형된 Y. 엔테로콜리티카에 의한 종양 콜로니화의 실험을 동계 뮤린 동종이식 모델 (4T1 유방암 모델)에서 반복하였고 세균 콜로니화가 2주에 걸쳐 이루어졌다. 이번에는, 마우스를 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T의 1*106 콜로니 형성 단위 (CFU)로 감염시켰다. 감염 후 초기에는 B16F10 모델과 유사한 결과를 얻었지만, 본 발명자들은 종양 콜로니화가 감염 후 8일째 및 14일째까지 일관되게 발견됨을 더 보여줄 수 있었다 (도 7). 나아가, 콜로니화는 평가된 모든 다른 장기에서 매우 낮은 수의 세균이 검출되면서 여전히 매우 특이적이다 (도 8). 이러한 발견은 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T가 종양의 지속적인 콜로니화를 확립함으로써 면역 체계에 의한 소거를 방지할 수 있음을 나타낸다.
종양 진행을 지연시키는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 의 효능
생체 내에서 종양에 전달된 YopE1 -138-(tBID BH3)2의 영향을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 4T1 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에서 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 YopE의 고유 위치 및 천연 YopE 프로모터 하에서 예르시니아 병원성 플라스미드 pYV 상에 YopE1 -138-(tBID BH3)2를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 균주를 평가하였고, 이는 전달되는 단백질의 양을 증가시키기 위해 VirF 상류의 헤어핀 I 영역의 결실에 의해 더욱 최적화된다. 종양 크기가 150-250 mm3에 도달하면, 마우스를 PBS 또는 1*107 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI-VirF pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2로 i.v. 감염시켰다. 세균의 i.v. 감염 당일을 0일째로 정의하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자 (세균의 i.v. 감염 후 0일째 내지 9일째)에 걸쳐서 측정하였다. 종양 크기에 있어 임의의 초기 이질성을 보완하기 위해 종양 부피를 0일째 종양 부피로 표준화하였다. Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI-VirF pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2로의 처리는 세균 투여 후 8일, 9일, 및 10일째에서 통계적으로 유의미한 종양 감소를 보이면서, 종양 부피 진행에 영향을 미쳤다 (도 9). 중요하게는, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 단독은 4T1 뮤린 암 모델에서 종양 진행에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 10). 상기 발견은 이러한 세균 및 이들의 T3SS가 종양 진행을 방해하기 위해 사용될 수 있음을 강조한다.
AraC -타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내 결실을 갖는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT
대부분의 공지된 예르시니아 병원성 유전자는 진핵 숙주의 외부에서는 발현되지 않으며 숙주 환경 내로의 진입 후에만 유도된다. 이러한 병원성 유전자의 발현은 숙주 내로의 진입과 관련된 온도의 갑작스런 증가에 의해 유도된다. 구체적으로, T3SS와 같은 pYV 인코딩된 병원성 인자 및 이의 이펙터 단백질 (Yop's)은 이러한 방식으로 조절된다. 실온 (20-25℃)에서 T3SS의 조절에 필요한 유전자, T3SS 형성 그 자체 및 전달된 이펙터는 발현되지 않으며, 온도가 37℃로 증가하는 경우에만, 발현이 유도된다. pYV-인코딩된 병원성 유전자 (yadA 및 T3SS 관련 유전자)의 대부분의 발현은 온도에 의해 유도되고 Y. 엔테로콜리티카에서 AraC-타입 DNA-결합 단백질 VirF를 요구한다 (다른 예르시니아 종에서는 LcrF). LcrF 발현의 온도조절은 더 높은 온도에서 mRNA 내 RNA 스템-루프 (stem-loop)의 용해를 통해 일어나는 것으로 생각되고, 이는 용해되지 않는 경우 리보좀 결합 부위를 격리하고, 그로써 전위를 방해한다51. 반대로, Y. 엔테로콜리티카에서 VirF의 전사는 주로 온도에 의존적인 것으로 나타났다52. 보다 최근의 연구는 YmoA로 불리는 열불안정성 조절자가 연루된 더 복잡한 양상을 보여주지만51, LcrF 상류의 RNA 온도센서는 주로 LcrF의 온도 조절을 담당하는 것으로 나타났고, 따라서 온도 의존적 병원성 유전자이다.
천연 YopE 프로모터 하에서 pYV로부터 발현된 이종 화물의 분비 수준을 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 VirF 상류의 Y. 엔테로콜리티카에서 이들 RNA 헤어핀 중 하나를 결실시키고자 하였다. 이러한 RNA 스템-루프의 중요성은 Y. 엔테로콜리티카에서 명확하게 나타나지 않았고 온도 유도가 오히려 전사의 변화에 기인하였지만, 본 발명자들은 Y. 엔테로콜리티카 VirF 상류의 헤어핀 I51을 동정하였다. 그 후에 본 발명자들은 상동 재조합에 의해 헤어핀 I의 일부 (51에서와 같이 -111 내지 -57)를 제거하고 시험관 내 분비 어세이에서 pYV 인코딩된 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27) 또는 YopE1 -138-뮤린 RIG-1 CARD2 단백질 (서열번호: 38) (각각 YopE의 고유 부위에서)의 분비능을 평가하였다 (도 11). 놀랍게도, Y. 엔테로콜리티카에서 VirF 상류의 헤어핀 영역 I의 일부의 결실은 시험관 내에서 이종 단백질의 분비를 증가시켰고 (도 11의 A 및 B), 이는 VirF의 전사가 온도조절의 주요 요인으로 생각되었던, Y. 엔테로콜리티카에 대한 이전 보고52와는 대조적이다.
T3SS의 발현 및 T3SS에 의한 단백질 전달을 인공적으로 유도할 수 있기 위하여, 본 발명자들은 또 다른 균주에서 pYV 상의 VirF의 내인성 프로모터를 pBad-MycHisA로부터 공지된 바와 같이 아라비노스 유도성 프로모터로 대체하였다. VirF의 프로모터 대체에 추가적으로, 본 발명자들은 상류에 (역방향으로) 완전한 araC 유전자를 도입하였다. 그 후에 본 발명자들은 시험관 내 분비 어세이로 아라비노스의 부재 또는 존재하에서 YopE1 -138-(tBID BH3)2 (서열번호: 27) (pYV 인코딩됨; YopE의 고유 위치에서)의 분비능을 평가하였다 (도 11의 A). 아라비노스의 첨가 시에만, 이종 단백질은 T3SS에 의해 분비되는 것으로 나타났고, 이는 아라비노스에 의한 VirF의 발현 조절과 일치한다.
이종 화물의 증가된 안정성을 갖는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT (시험관 내 및 생체 내)
Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T는 본 발명의 뮤린 실험에서는 고형 종양을 표적하는데 매우 특이적인 균주인 것으로 나타났지만, 세포독성 단백질의 T3SS-의존적 전달은 암세포에 대한 세포 배양에 효과적인 것으로 나타났다. 이들 두 특성을 조합하기 위해, 생체 내에서 수일 또는 수주에 걸쳐 세포독성 화물을 안정하게 인코딩하기 위해 고형-종양 콜로니화 세균은 최적으로 조작될 필요가 있다. 규제 요건으로 인해, 세균에서 외래 플라스미드의 유지를 위한 전통적인 항생제 내성의 사용은 선호되지 않는다. 이에 본 발명자들은 뮤린 동종이식 연구에서 무-항생제 내성 플라스미드 유지 시스템을 평가하였다. 이 시스템은 필수 유전자 (예컨대, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, asd)의 염색체 결실에 기초하고 세균 성장을 유지하기 위해 이종 플라스미드 상에 동일한 유전자를 코딩한다. 플라스미드 유지를 위한 asd 결실의 보완은 이전에도 있었지만53, 수일에 걸친 재현성 및 지속성의 어려움이 보고된바 있다54. 본 발명자들은 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T에서의 사용을 위해 이 시스템을 개조하였는데, 본 발명자들은 염색체에서 인코딩되는 asd를 추가적으로 결실시켰고 (Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd 생성), 이어서 이를 중간 카피수 플라스미드, pBad-MycHisA (pBad-MycHisA-asd)로 되돌려 놓았다. asd 유전자를 Y. 엔테로콜리티카 8081로부터 클로닝하고, 그의 내인성 프로모터 및 전사 종결자를 갖는 pBad-MycHisA의 PciI 부위 내로, 정방향 및 역방향으로 각각, 삽입하였다. 생성된 균주 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd + pBad-MycHisA-asd (정방향 또는 역방향 asd)의 성장 거동을 배양 플라스크 중에서 (BHI 배지) 야생형 및 모균주 Y. 엔테로콜리티카 Δ yopH,O,P,E,M,T Δasd 균주와 시험관 내에서 비교하였다 (도 12). 두 방향 모두에서, pBad-MycHisA-asd는 asd의 결실 시 관찰되는 표현형을 구제하였다 (도 12). 반대로, B16F10 흑색종 마우스 모델뿐만 아니라 4T1 모델에서, 본 발명자들은 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd + pBad-MycHisA-asd가 고형 종양을 충분히 콜로니화하지 않음을 확인하였고 (도 13 및 14) 단리된 몇몇 콜로니로부터 본 발명자들은 pBad-MycHisA-asd 플라스미드를 회수할 수 없었다. 또한, B16F10 흑색종 마우스 모델로부터 단리된 콜로니는 암피실린 함유 플레이트에서의 성장에 대해 입증되었고, 이는 암피실린 내성을 코딩하는 pBad-MycHisA-asd 플라스미드의 존재에 우호적일 것이다. i.v. 감염 후 4일째에, 단리된 콜로니의 소수 분획만이 암피실린 내성을 나타내었다 (도 13). 이는 pBad-MycHisA-asd의 손실을 반영하지만, 또한 암피실린 내성 유전자만의 손실 또는 암피실린에 의한 사멸을 회피하기에 충분히 신속하게 암피실린 내성 유전자의 발현을 재개함에 있어서의 어려움과 관련이 있을 수 있다. 임의의 경우에, B16F10 흑색종 마우스 모델뿐만 아니라 4T1 모델에서 관찰된 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd + pBad-MycHisA-asd로의 종양 콜로니화는 고형 종양 내에서 세균 수의 신속한 감소를 나타내고, 이는 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T와 대조적이다. 따라서, 염색체 asd의 결실 및 pBad-MycHisA 상의 보완은 생체 내에서 세균 능력 (fitness)에 급격한 감소를 초래한다. 이러한 관찰은 asd의 불균형한 수준 시 생존능의 감소에 대한 보고와 일치한다54.
T3SS에 의한 운반을 위한 내인성 단백질 ("예르시니아 외부 단백질", Yops)은 70 kb 플라스미드 상에서 Y. 엔테로콜리티카에 의해 인코딩된다. 예르시니아 병원성 플라스미드로 명명된 (pYV), 이 플라스미드는 T3SS 기구를 더 인코딩한다. 본 발명자들은 4T1 뮤린 동종이식 모델에서 pYV 플라스미드의 안정성을 평가하였다. 본 발명자들은 마우스의 감염 후 9일 또는 10일째에 수집된 균주로부터 pYV를 성공적으로 단리하였다 (도 15). 본 발명자들은 또한 생체 내 고형 종양에서 8일간의 성장 후 단리된 세균 균주의 T3SS 존재 및 기능을 확인하는 시험을 수행하였다. 이에 본 발명자들은 생체 내 전달을 위한 이종 화물을 인코딩하기 위해 선택 벡터로서 pYV를 고려한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 마우스의 4T1 고형 종양에서 9-10일간의 성장 후에 pYV 플라스미드를 운반하는 세균 콜로니의 비율이 이질적임을 확인하였다 (도 15). pYV의 본질적인 불안정성 외에도, 균주 Y. 엔테 로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T는 생체 내에서 병원성을 증가시키는 Yop's의 선택적 이점을 상실하였다.
pYV를 안정화시키고 이에 따라 pYV 상에서 인코딩된 이종 화물을 안정화시키기 위해, 본 발명자들은 pYV 상에서 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T에서 사용하기 위한 "asd"-시스템을 개조하였다. 본 발명자들은 염색체에서 인코딩되는 asd를 제거하였고 (그 결과 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd가 생성됨), 그 후에 이를 pYV 상에 되돌려 놓았다 (pYV-asd로 명명). asd 유전자를 Y. 엔테로콜리티카 8081로부터 클로닝하고 (Y. 엔테로콜리티카 subsp. 엔테로콜리티카 8081; NCBI 참조 서열: NC_008800.1) 그의 내인성 프로모터 및 전사 종결자와 함께 pYV 상에 상동 재조합에 의해 (SycO 이전의 자연 삽입 영역 내로) 삽입하였다. 생성된 균주 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd + pYV-asd의 성장 거동을 배양 플라스크에서 (BHI 배지) 야생형 및 모체 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd 균주와 시험관 내에서 비교하였다 (도 12). pYV-asd는 asd의 결실 시 관찰된 표현형을 구제할 수 있지만 (도 12), 이 구제는 완전하지 않았고 약간의 시험관 내 성장 감소가 관찰될 수 있었다. 대조적으로, 생체 내 동계 4T1 뮤린 암 모델에서, 본 발명자들은 Y. 엔테로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd + pYV-asd가 효율적으로 고형 종양을 콜로니화시킴을 발견하였다 (도 16). 놀랍게도, 주사 후 9-10일째에 고형 종양으로부터 분리된 모든 콜로니는 pYV 플라스미드를 함유하는 것으로 확인되었다 (아비산염 함유 성장 플레이트에서의 선별; 아비산염 내성은 pYV 상에 arsRBC 유전자의 존재와 관련됨55) (도 15). 따라서, 놀랍게도 pYV-asd는 Y. 엔테 로콜리티카 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd 균주 배경에서 수일 및 수주에 걸쳐서 세균을 콜로니화함으로써 고형 종양에서 발현되는 이종 단백질을 인코딩하는 생체 내 안정한 벡터인 것으로 나타났다.
종양 진행을 지연시키는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 의 효능 및 안정성 증가뿐만 아니라 VirF 활성 변경의 영향
4T1 세포를 이용한 실험과 유사한 실험 (도 9 및 10)을, 야생형 Balb/C 마우스에 EMT6 유방암 세포가 s.c. 동종이식되고 종양 크기가 약 80-250 mm3에 도달하면 세균의 단일 i.v. 투여가 처리된, EMT6 유방암 마우스 모델에서 수행하였다. 세균의 i.v. 주사 당일을 0일째로 정의하고, d0 하루 전에 데스페랄을 모든 마우스에 i.p 주사하였다. Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로의 처리는 식염수 용액과 비교해 종양 진행에 영향을 미치지 않았다. Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2는 종양 진행에 약간의 영향을 나타내었는데, 이는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI - VirF pYV-YopE1 -138-(tBID BH3)2의 사용에 의해 증강되었다 (도 45). 상기 결과는 이러한 세균 및 이들의 T3SS가 종양 진행을 간섭하는데 사용될 수 있고 VirF 활성의 조작이 생체 내 투여 시 세균성 T3SS 활성을 조절하는데 사용될 수 있음을 강조한다. 또한, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT ΔHairpinI-VirF Δasd pYV-asd-YopE1 -138-(tBID BH3)2의 사용은 종양 진행에 대한 영향을 더욱 강화시켰고 (도 45), 전신 투여 시 증가된 유전적 안정성을 강조한다.
타입 I IFN 반응의 유도를 위해 세균성 T3SS를 통한 RIG-1-유사 수용체 경로 유발 단백질 (triggering protein)의 전달
세포질 핵산은 세포질 내에서 병원체-유래 RNA를 검출하는 RIG-1-유사 수용체 (RLR) 패밀리 구성원으로서 수용체에 의해 감지된다56. RIG-1 및 MDA5는 특정 뉴클레오티드를 감지하는 2개의 N-말단 CARD 도메인 및 중앙 (DExD/H) 헬리케이즈 도메인으로 구성된다56. 자극성 RNA에의 결합은 올리고머를 형성 (및 MDA5의 경우 필라멘트 형성56)하도록 비고정 K63-연결된 유비퀴틴 사슬과의 후속 결합을 위해 그의 CARDs를 유리시키는 RIG-I (및 MDA5)에서의 구조적 재배치를 유도한다56. RIG-I 및 MDA5의 올리고머화된 CARD 도메인은 MAVS의 CARD 도메인과 상호작용을 한다. 이 상호작용은 MAVS의 단일 CARD 도메인의 중합체화를 촉진하고, 이는 궁극적으로 타입 I IFN 유전자의 유도를 초래하는 하류 신호전달을 유도한다56.
본 발명자들은 T3SS에 의한 전달을 위해 N-말단 세균 분비 신호, 특히 YopE1 -138 (서열번호: 37 및 38)에 융합된 인간 또는 뮤린 기원의 RIG-1의 2개 N-말단 CARD 도메인을 발현하는 세균 균주를 생성하였다. 융합 단백질 YopE1 -138-RIG-1 CARD2의 전달을 표준 시험관 내 분비 어세이로 평가하였고 전달된 단백질의 기능성을 타입 I IFN 유도에 대한 리포터 세포주에 대해 평가하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 B16F10 흑색종 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하며, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강되는 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-RIG-1 CARD2 단백질을 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)로 감염시켰다. RIG-1의 뮤린 및 인간 N-말단 CARD 도메인은 리포터 세포주에서 용량-의존적 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났지만 (도 17), 세균 배경 균주 (Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT)는 이러한 반응을 유도할 수 없었다 (도 17). 인간 및 뮤린 RIG-1 CARD 도메인은 뮤린 리포터 세포주에서 유사한 타입 I IFN 반응을 유도하였고 (도 17), 이는 높은 서열 동일성 (76%) 및 유사성 (88.5%)과 일치한다.
따라서, 세균의 N-말단 분비 신호에의 융합은 세균에서 발현된 인간 및 뮤린 YopE1-138-RIG-1 CARD2 단백질의 성공적인 전달을 유도하였고 진핵 세포 내에서 RIG-1 CARD 도메인의 중첩 및 기능을 방해하지 않았다. 이는 YopE-융합 RIG1 CARD 도메인이 여전히 스스로 다량체화할 수 있고 MAVS의 다량체화를 유도할 수 있음을 의미하고, 이는 놀라운 것이다.
이 B16F10 타입 I IFN 리포터 세포주를 사용하는 추가 실험에서, 본 발명자들은 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT를, pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2) 상에 YopE1 -138-MycHis 또는 YopE1 -138-인간 Rig1 CARD2를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT와 비교하였다. 다시 말해, 인간 RIG-1 CARD 도메인의 전달은 용량 의존적 타입 I IFN 반응을 유도하였지만, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 또는 YopE1 -138-MycHis를 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT는 타입 I IFN 반응에 아무런 영향을 미치지 않았다 (도 18). 동일한 어세이에서, 본 발명자들은 RIG-1 CARD 도메인을 전달하는 세균의 IFN 유도 잠재능을 양성 대조군, 뮤린 인터페론 감마 (IFNγ)와 비교하였다. 매우 놀랍게도, RIG-1 CARD 도메인의 세균 전달은 타입 I IFN 유도에 대한 양성 대조군, IFNγ에 의해 수득된 반응과 유사하게 리포터 세포주의 최대 반응을 유도할 수 있었다 (도 18 및 19).
추가 실험에서 본 발명자들은 4T1 뮤린 유방암 세포 또는 야생형 B16F10 흑색종 세포를 감염시켰고, 4시간 후에 아마도 IFN을 함유하는 상등액을 B16F10 타입 I IFN 리포터 세포주 상으로 옮겼다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 Y. 엔테로 콜리티카 ΔHOPEMT를, 내인성 병원성 플라스미드 (pYV) 상에 YopE1 -138-뮤린 Rig1 CARD2를 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT와 비교하였다. pYV 인코딩된 뮤린 RIG-1 CARD 도메인의 전달은 용량 의존적 타입 I IFN 반응을 유도하였지만, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT는 야생형 B16F10 (도 20) 또는 4T1 세포 (도 21)에서는 타입 I IFN 반응에 아무런 영향을 미치지 않았다.
추가 실험에서, 다양한 길이의 뮤린 RIG-1 CARDs로 구성된 여러 가지 버전을 타입 I IFN 반응을 유도하는 이들의 잠재능에 대해 평가하였다. RIG-1의 CARD 도메인은 아미노산 1-172 (뮤린 서열, Uniprot Nr. Q6Q899)에 의해 인코딩될 것으로 예상된다. 본 발명자들은 B16F10 흑색종 IFN 리포터 세포뿐만 아니라 RAW 대식세포 IFN 리포터 세포에서 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1-229, 및 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 평가하였다 (도 27- 28). YopE1-138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246, YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -229 및 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1-218은 동일하게 활성인 것으로 나타났다.
후속 실험에서 본 발명자들은 세균에 의해 전달된 MDA5의 효능을 평가하였다. 본 발명자들은 다양한 길이의 뮤린 MDA5 CARDs로 구성된 여러가지 버전을 클로닝하고 이들을 B16F10 IFN 리포터 세포에 대해 타입 I IFN 반응을 유도하는 이들의 잠재력에 대해 평가하였다. MDA5의 CARD 도메인은 아미노산 1-190 (뮤린 서열, Uniprot Nr. Q8R5F7)에 의해 인코딩될 것으로 예상된다. 본 발명자들은 B16F10 흑색종 IFN 리포터 세포에서 YopE1 -138-뮤린 MDA5 CARD 도메인1 -294 및 YopE1 -138-뮤린 MDA5 CARD 도메인1 -231을 평가하였다. 모든 변형체는 활성인 것으로 나타났다 (도 29). 놀랍게도, 단백질이 2개의 N-말단 CARD 도메인 및 특정 뉴클레오티드를 감지하는 중앙 (DExD/H) 헬리케이즈 도메인으로 구성된 매우 유사한 생물학적 기능 및 단백질 구조를 공유함56에도 불구하고, 전달된 MDA5 CARDs의 활성은 RIG-1 CARDs보다 훨씬 덜 강력한 것으로 나타났다.
타입 I IFN 반응의 유도를 위해 세균성 T3SS를 통한 cGAS /STING 경로 유발 단백질의 전달
cGAS/STING 경로에서, 세포질 이중-가닥 DNA는 효소 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS)에의 결합에 의해 검출된다. dsDNA 결합 시, cGAS는 활성화되고 사이클릭 CDN 2차 메신저, 사이클릭 GMP-AMP (cGAMP)를 생산한다. 그 후에 cGAMP는 소포체 (endoplasmic reticulum) 수용체 단백질 STING (IFN 유전자의 자극기)에 직접 결합한다. cGAMP의 결합 시, STING은 활성화되고 타입 I IFN 및 다른 동시-조절 유전자의 전사를 초래하는 신호전달 경로를 유도한다57. 인간 cGAS는 2',3' cGAMP (2'-5' 및 3'-5' 포스포디에스테르 결합 함유)를 생산하지만, 다른 CDNs는 다양한 수준에서 뮤린 또는 인간 STING을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 3',3' cGAMP (예컨대, 비브리오 콜레라 DncV 또는 일부 진핵생물 cGAS에 의해 생산됨), 사이클릭 디-AMP (예컨대, 다양한 그람-음성 종의 CdaA 또는 DisA에 의해 생산됨) 또는 사이클릭 디-GMP (예컨대, 슈도모나스 아에루지노사 WspR에 의해 생산됨)를 포함한다57,58. 야생형 인간 STING (및 뮤린 STING)는 2',3' cGAMP, 3',3' cGAMP, 사이클릭 디-AMP 및 사이클릭 디-GMP를 인식하지만, 몇몇 천연 인간 STING 변형체는 이들 작용제와 다르게 반응한다59.
세균에 의한 단백질의 전달 시 cGAS/STING 경로를 활성화하기 위해, 본 발명자들은 T3SS를 통해 Y. 엔테로콜리티카에 의해 발현되고 전달되는 사이클릭 디-GMP 생산 P. 아에루지노사 WspR을 클로닝하였다. WspR의 활성을 증가시키기 위해, 그의 GGDEF 도메인 (디구아닐레이트 사이클라제화된 도메인)만을 사용하였고 상류 스톡 도메인 (stalk domain)을 효모 유래 GCN4의 류신-지퍼 모티프로 대체하였다. WspR의 이량체화는 그의 활성에 요구되는 것으로 알려져 있고 GCN4의 류신 지퍼는 평행한 코일형-코일 (coiled-coils)을 형성하고, 그로써 강력한 이량체화 모듈로 작용하는 것으로 나타났다. GCN4 모티프를 GGDEF와 나선형 스톡 사이에 천연 링커를 포함하는 WspR의 GGDEF 도메인에 융합하여 야생형 WspR에 상응하는 도메인-간 가요성을 허용하였다60.
융합 단백질 YopE1 -138-GCN4 류신 지퍼-WspR GGDEF 도메인 (간단히: YopE1-138-WspR) (서열번호: 39)의 전달을 리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도에 대해 평가하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 B16F10 흑색종 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하고, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성된, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-WspR 단백질을 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)으로 감염시켰다. GCN4 류신 지퍼 모티프에 융합된 P. 아에루지노사 WspR GGDEF 도메인은 리포터 세포주에서 용량 의존적으로 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났지만 (도 22), 세균 배경 균주 (Y. 엔테 로콜리티카 ΔHOPEMT)는 이러한 반응을 유도할 수 없었다 (도 22).
따라서, 세균의 N-말단 분비 신호에의 융합은 세균에서 발현된 YopE1 -138-GCN4 류신 지퍼 (yeast)-WspR GGDEF (P. 아에루지노사) 단백질의 성공적인 전달을 유도하였고 진핵 세포 내에서 이러한 삼분된 (tri-partite) 단백질의 중첩 및 기능을 방해하지 않았다. 이는 YopE-융합된 GCN4 류신 지퍼-WspR GGDEF이 여전히 이량체화할 수 있고, 그로써 활성 GGDEF 도메인을 초래함을 의미하고, 이는 놀라운 것이다.
추가 실험에서, 본 발명자들은 V. 콜레라 DncV (3',3' cGAMP 생산)57, 바실러스 세레우스 DisA-유사 단백질 (사이클릭 디-AMP 생산)61 및 진핵 아네모네 (네마토스텔라 벡텐시스) cGAS (3',3' cGAMP 생산)57를 클로닝하였고, 이는 세균에 의한 발현 및 전위를 위한, 외부 자극의 부재 시 활성인 것으로 보고되었다. DisA 타입 사이클라제는 일반적으로 옥타머를 형성하는데61, 이는 N-말단 YopE 융합 및 세균 전달과 호환되지 않을 수 있다. B. 세레우스 DisA-유사 (PDB 코드 2fb5)를 고전적 DisA 단백질의 디아데닐레이트 사이클라제 (DAC)에 대한 구조적 유사성을 토대로 동정하였지만61, 흥미롭게도 다량체화에 요구되는 다른 DisA 단백질로부터 알려진 모든 나선형이 결여된다. 이에 본 발명자들은 B. 세레우스로부터의 가능한 단량체 활성 DisA-유사 단백질 (PDB 코드 2fb5; 잔기 76-205)을 이용하기로 결정하였다.
융합 단백질 YopE1 -138-V. 콜레라 DncV (서열번호: 41), YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 (서열번호: 42) 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS (서열번호: 43)의 전달을 리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도에 대해 평가하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 B16F10 흑색종 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하고, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성된, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS를 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)으로 감염시켰다. YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS는 모두 리포터 세포주에서 용량-의존적으로 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났지만 (도 23), 세균 배경 균주 (Y. 엔테로콜리티카 Δ HOPEMT) 또는 YopE1 -138-MycHis를 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT는 이러한 반응을 유도할 수 없었다 (도 23). 3',3' cGAMP 생산 아네모네 (네마토스텔라 벡텐시스) cGAS가 가장 높은 활성을 보였지만, V. 콜레라 DncV (3',3' cGAMP 생산) 및 바실러스 세레우스 DisA-유사 단백질 (사이클릭 디-AMP 생산)은 타입 I IFN 반응을 유사하게 활성화시키는 것으로 나타났다.
따라서, 세균의 N-말단 분비 신호에의 융합은 세균에서 발현된 YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS 단백질의 성공적인 전달을 유도하였고 진핵 세포에서 이들 단백질의 중첩 및 기능을 방해하지 않았으며, 이는 예측할 수 없는 것이었다.
대안적으로, RLR 또는 cGAS/STING 의존적 신호전달의 하류 중앙 전사 인자인62, 뮤린 IRF3을 세균에 의한 발현 및 운반을 위해 클로닝하였다. 활성화의 부재 시, IRF-3은 세포질에서의 잠재적인 형태이다. RIG-1, MDA5 또는 STING과 같은 상류 수용체의 활성화 시에만, IRF-3은 TBK1 및 IKKε을 통해 인산화되고 그로써 활성화된다. IRF-3의 인산화는 이량체화, 핵으로의 전위, 및 동시-활성화제와의 연합을 유도한다62. IRF3의 구성적 활성 버전을 달성하기 위해, 본 발명자들은 가장 중요한 인산화 부위 중 하나 (뮤린 IRF3에서 Ser397)를 Asp로 대체하였다62.
융합 단백질 YopE1 -138-뮤린 IRF3 Ser397Asp (서열번호: 40)의 전달을 시험관 내 분비 어세이로 평가하였는데, 여기서 주변 액체로의 단백질 분비가 인위적으로 유도된다. TCA 기초 단백질 침전 후, 항-YopE 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 분비된 단백질 양을 결정하였다 (도 24). YopE1 -138-뮤린 tBID BH3을 인코딩하는 ΔHOPEMT 균주는 분비된 분획에서 강력한 밴드 (15-20 kDa에서)를 초래한 반면, 더 적은 수준이긴 하지만, YopE1 -138-뮤린 IRF3 Ser397Asp (50-75 Da에서) 또한 분비되는 것으로 나타났다 (도 24). 총 세균 세포 분획 분석에 따르면 YopE1 -138-뮤린 tBID BH3 및 YopE1 -138-뮤린 IRF3 Ser397Asp의 발현 수준은 비교할 만하지만, YopE1-138-뮤린 IRF3 Ser397Asp는 분해 밴드의 패턴을 나타내었다 (도 24).
면역 세포에서 타입 I IFN 반응의 유도를 위해 세균성 T3SS를 통한 cGAS/STING 및 RIG-1-유사 수용체 경로 유발 단백질의 전달.
융합 단백질 YopE1 -138-뮤린 RIG-1 CARD2, YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS의 전달을 면역 리포터 세포주에서 타입 I IFN 유도에 대해 평가하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 RAW264.7 대식세포 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하고, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성된, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-뮤린 RIG-1 CARD2, YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, YopE1-138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS를 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)으로 감염시켰다. YopE1 -138-뮤린 RIG-1 CARD2, YopE1 -138-V. 콜레라 DncV, 및 YopE1 -138-아네모네 cGAS는 모두 이 면역 리포터 세포주에서 용량-의존적으로 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났지만 (도 25), 세균 배경 균주 (Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT)는 이러한 반응을 유도할 수 없었다 (도 25). YopE1 -138-뮤린 RIG-1 CARD2는 가장 높은 활성을 나타내었고, 그 다음이 3',3' cGAMP 생산 아네모네 (네마토스텔라 벡텐시스) cGAS 및 V. 콜레라 DncV (3',3' cGAMP 생산)이었다. 바실러스 세레우스 DisA-유사 단백질 (사이클릭 디-AMP 생산)은 단지 약하게 타입 I IFN 반응을 활성화시키는 것으로 나타났다.
추가 실험의 경우, 본 발명자들은 세균에 의한 발현 및 전위를 위해 인간 cGAS 아미노산 161-522 (Uniprot Nr. Q8N884 및 서열번호: 115; 2',3' cGAMP 생산)57을 클로닝하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 B16F10 흑색종 및 뮤린 RAW 대식세포 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하고, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성된, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-인간 cGAS161 -522를 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)으로 감염시켰고 리포터 세포주에서 용량-의존적으로 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났으며, 뿐만 아니라 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-아네모네 cGAS, YopE1 -138-아네모네 cGAS60 -422, YopE1 -138-리스테리아 CdaA101-273, YopE1 -138-V. 콜레라 DncV 또는 YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질을 전위하는 세균 균주의 다양한 양 (MOI)으로 감염시켰다 (도 32- 33). YopE1 -138-인간 cGAS161-522를 이용한 경우에 가장 강력한 활성화가 관찰되었고, 이어서 YopE1 -138-아네모네 cGAS, YopE1 -138-아네모네 cGAS60 - 422이었다. 흥미롭게도, 더 짧은 아네모네 cGAS60-422 변형체는 약간 더 활성이었다. YopE1 -138-리스테리아 CdaA101 -273, YopE1 -138-V. 콜레라 DncV 또는 YopE1 -138-B. 세레우스 DisA-유사 단백질 또한, cGAS 단백질보다는 더 약한 수준이지만, 용량-의존적 IFN 활성화를 발휘하였다 (도 32-33).
타입 I IFN 반응의 유도를 위해 세균성 T3SS를 통한 MAVS의 전달
세포질 핵산은 세포질 내에서 병원체-유래 RNA를 검출하는 RIG-1-유사 수용체 (RLR) 패밀리 구성원으로서 수용체에 의해 감지된다56. RIG-1 및 MDA5는 특정 뉴클레오티드를 감지하는 2개의 N-말단 CARD 도메인 및 중앙 (DExD/H) 헬리케이즈 도메인으로 구성된다56. 자극성 RNA에의 결합은 올리고머를 형성56 (및 MDA5의 경우 필라멘트 형성56)하도록 비고정 K63-연결된 유비퀴틴 사슬과의 후속 결합을 위해 그의 CARDs를 유리시키는 RIG-I (및 MDA5)에서의 구조적 재배치를 유도한다. RIG-I 및 MDA5의 올리고머화된 CARD 도메인은 MAVS의 CARD 도메인과 상호작용을 한다. 이 상호작용은 MAVS의 단일 CARD 도메인의 중합체화를 촉진하고, 이는 궁극적으로 타입 I IFN 유전자의 유도를 초래하는 하류 신호전달을 유도한다56.
본 발명자들은 T3SS에 의한 전달을 위해 N-말단 세균 분비 신호, 특히 YopE1 -138에 융합된 인간 기원의 MAVS의 N-말단 CARD 도메인을 발현하는 세균 균주 (Y. 엔 테로콜리티카 ΔHOPEMT에 기초함)를 생성하였다. 융합 단백질 YopE1 -138-MAVS CARD의 전달을 표준 시험관 내 분비 어세이로 평가하였고 전달된 단백질의 기능성을 타입 I IFN 유도에 대한 리포터 세포주에 대해 평가하였다. 타입 I IFN 자극을 위한 뮤린 B16F10 흑색종 또는 뮤린 RAW 대식세포 리포터 세포는 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성을 기초로 하며, 이는 다량체 ISRE에 의해 증강되는 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는, I-ISG54 프로모터의 제어하에 있다. 리포터 세포를 pBadMycHisA 유래 플라스미드 (pBad_Si2)로부터 발현하고 YopE1 -138-인간 MAVS CARD 단백질을 전위하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT의 다양한 양 (MOI)로 감염시켰다. MAVS의 뮤린 N-말단 CARD 도메인은 리포터 세포주에서 용량-의존적으로 타입 I IFN 반응을 유도하는 것으로 나타났지만 (도 30-31), 세균 배경 균주 (Y. 엔테로콜리티 카 ΔHOPEMT)는 이러한 반응을 유도할 수 없었다 (도 30- 31). 인간 cGAS 및 뮤린 RIG-1 CARD 도메인은 뮤린 리포터 세포주에서 이와 유사한 방식으로 유도하였고 (도 30-31), RIG-1은 가장 높은 활성화 잠재력을 보였고, 이어서 MAVS 및 cGAS 순이었다.
따라서, 세균의 N-말단 분비 신호에의 융합은 세균에서 발현된 인간 YopE1 -138-MAVS CARD 단백질의 성공적인 전달을 유도하였고 진핵 세포 내에서 MAVS CARD 도메인의 중첩 및 기능을 방해하지 않았다. 이는 YopE-융합된 MAVS CARD 도메인이 여전히 스스로 다량체화할 수 있고 MAVS의 다량체화를 유도할 수 있음을 의미하며, 이는 놀라운 것이다. 더욱 놀랍게도, MAVS CARD만이 IFN 하류 신호전달을 유도하지 못한 것으로 나타났는데64, 여기서 본 발명자들은 YopE-융합된 MAVS CARD 도메인이 타입 I IFN 경로를 강력하게 활성화시키는 것을 발견하였다.
나아가, MAVS의 C-말단 막횡단 도메인은 DNA 형질감염 시 MAVS 기능에 필수적인 것으로 나타났고 MAVS CARD 도메인만이 형질감염된 DNA 작제물로부터 발현되는 경우 비활성인 것으로 나타났다66. 더욱이, 형질감염된 DNA로부터 발현될 때 또는 정제된 단백질로서 타입 I IFN 반응을 활성화시키는 능력을 갖는64 ,66, 막횡단 영역에 융합된 MAVS CARD는 내인성 MAVS에 의존하는 것으로 나타났으며, 이는 응집되어 활성화되기 시작했다64. 본 발명자들은 MAVS KO 세포주를 사용하여 세균에 의해 전달된 YopE-융합된 MAVS CARD가 미토콘드리아 상에 존재하는 내인성 MAVS 없이 활성임을 보여줄 수 있다 (도 52). 이 YopE-융합된 MAVS CARD는 다량체화할 수 있고 막횡단 도메인 없이, 나아가 내인성 MAVS 없이, 하류 파트너를 활성화시킬 수 있으며, 이는 놀라운 것이다.
시험관 내에서 타입 I IFN 반응의 유도를 위한 소분자 STING 작용제의 벤치마킹 (Benchmarking)
사이클릭 디뉴클레오티드는 STING 경로의 익히 공지된 작용제로서, 타입 I IFN 신호전달의 하류 유도를 초래한다. STING 작용제는 문헌에 기술되어 있고59 면역 세포에 주로 작용하는 것으로 밝혀졌으며, 수지상 세포에서 가장 높은 활성을 보였다59. 대조적으로, RLR 신호전달은 더욱 보편적으로 발현되는 것으로 나타났다63. 이에 본 발명자들은 면역 세포 (RAW 대식세포 IFN 리포터 세포) 및 비-면역 세포 (B16F1 흑색종 IFN 리포터 세포)에서 인터페론 유도 잠재력에 대해 Y. 엔테로콜 리티카 ΔHOPEMT 세균 전달 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소 (YopE1 -138-아네모네 cGAS 및 YopE1 -138-인간 cGAS) 또는 세균 전달 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218을 소분자 STING 작용제 2'3'-c-디-AM(PS)2 (Rp,Rp) (Aduro Biotech로부터의 ADU-S100과 유사)와 비교하였다. 면역 세포에서, 유사한 활성화 잠재력이 소분자 STING 작용제 2'3'-c-디-AM(PS)2 (Rp,Rp), 및 모든 3개의 단백질을 전달하는 시험된 세균 균주 (YopE1 -138-아네모네 cGAS, YopE1 -138-인간 cGAS 또는 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 - 218)에 대해 관찰되었지만, 단백질을 전달하지 않는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 세균은 매우 약한 활성화 잠재력을 나타내었다 (도 34- 37). 비-면역 세포 (암세포, 흑색종)에서, 세균에 의해 전달된 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -218, 세균에 의해 전달된 YopE1 -138-아네모네 cGAS 및 YopE1 -138-인간 cGAS는 동일하게 작동하였고 거의 소분자 STING 작용제보다 성능이 뛰어났으며, 이는 STING에 비해 RLR의 더 편재하는 존재를 강조한다 (도 34-37).
세균에 의해 전달된 RIG1 CARD 도메인 또는 MAVS CARD의 엄격한 T3SS -의존성
엄격한 T3SS 의존적 운반을 증명하기 위해, 진핵 세포 막 내로 전위 기공을 형성하는 T3SS 단백질 중 하나를 결실시켰다 (YopB). YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 발현하는 이렇게 yopB 결실된 세균 (Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT - yopB 로 불림)의 잠재력을 RAW 대식세포 IFN 리포터 세포주에서 평가하였고, 또한 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 발현하는 yopB 발현 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 세균과 비교하였다 (도 38). YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1 -100을 발현하는 yopB-야생형 세균은 타입 I IFN 반응의 용량-의존적 활성화를 나타내었지만, 동일한 단백질을 발현하는 yopB-의존적 균주는 전달될 단백질을 발현하지 않는 배경 세균 균주에 의해 유도되는 배경 수준 이상으로 이러한 반응을 유도하지 못했다 (도 38). 이는 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 YopE1 -138-인간 MAVS CARD1-100이 모두 표적 진핵 세포 내로 T3SS 니들을 통해 운반됨을 입증한다.
미정제 (crude) 종양 단리물에서 타입 I IFN 반응의 유도
타입 I IFN 반응이 종양 미세환경 내에서 개시될 수 있음을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 인터페론 베타에 대한 ELISA에 이어서 세균 균주로 생체 외에서 감염된 미정제 종양 단리물에 대한 분석을 수행하였다. EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스를 종양이 부피에 도달하면 희생시켰다. 종양을 으깨고, 소화시키고, 단일-세포 현탁액으로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 2개의 상이한 종양 유래의 이들 세포를 비감염 상태로 놔두거나 (도 39에서 점선) Y. 엔 테로콜리티카 ΔHOPEMT, 또는 pBadMycHisA 유래 플라스미드 상에 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246을 인코딩하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT로 감염시켰다. YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246은 2개의 상이한 종양의 미정제 종양 단리물에서 인터페론 베타의 용량-의존적 분비를 유도하였다 (도 39). 이는 세균에 의해 전달된 RIG1 CARD 도메인이 암세포, 면역 세포 및 종양 미세환경 내 모든 다른 세포로 구성된 혼합 세포 집단에서 인터페론 생산을 유도할 수 있음을 입증한다.
종양 진행의 지연에서 RIG1 CARDs 또는 cGAS를 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 의 효능
생체 내에서 종양에 전달된 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 및 YopE1 -138-인간 cGAS의 영향을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 EMT6 유방암 세포로 s.c. 동종이식된 야생형 Balb/C 마우스에서 연구를 수행하였다. 종양의 크기가 약 60-130 mm3에 도달하면 마우스에 PBS (도 40) 또는 7.5*107 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + YopE1 -138 뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + YopE1 -138 인간 cGAS를 종양 내로 (it) 주사하였다. 세균의 첫 번째 주사 당일을 0일째로 정의하였다. 마우스에 이를 d0, d1, d5, d6, d10 및 d11에 주사하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다. Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 단독으로의 처리는 종양 부피 진행에 영향을 미쳤는데, 4/14 마우스가 완전한 종양 퇴행을 나타내었다 (도 41). RIG1 CARDS 또는 cGAS인, 타입 I IFN 반응을 유도하는 단백질을 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT는 종양 진행에 더 현저한 영향을 초래하는 것으로 나타났는데, 각각의 8/14 (RIG1 CARDs) 또는 8/15 (cGAS) 마우스는 완전하고 지속적인 종양 퇴행을 나타내었다 (도 42- 43). 상기 결과는 이러한 세균 및 이들의 T3SS가 종양 진행에 대한 매우 유의미한 간섭에 사용될 수 있고 타입 I IFN 유도 단백질의 전달이 원발성 종양의 퇴행을 유도하는데 매우 적합함을 강조한다.
완전한 종양 퇴행을 갖는 마우스를 초기 종양 동종이식 후 65일째까지 추가로 관찰하고, 이어서 65일째에 EMT6 유방암 세포를 반대측 옆구리에 재감염시켜 이들 암세포에 대한 면역-매개성 기억 및 전신 활성을 평가하였다. 이러한 재감염 연구에서, 아무런 추가적인 치료도 투여하지 않았고 마우스의 반대측 옆구리에서 종양 진행을 간단히 관찰하고 나이브 마우스 (EMT6 유방암 세포에 대한 사전 노출은 없지만, 연령과 같은 모든 다른 매개변수는 동일함)와 비교하였다. 나이브 마우스에서는 s.c. 동종이식된 종양 세포가 종양 성장을 초래하였지만, 완전한 퇴행을 갖는 반대측 옆구리에 EMT6 종양으로 미리 처리된 모든 마우스는 종양 성장으로부터 보호된 것으로 나타났다 (도 44). 놀랍게도, 반대측 옆구리에의 세균 처리에 의해 유도된 이전의 완전한 퇴행을 갖는 마우스에서의 종양은 수일간 성장하기 시작하여 최대 >100 mm3의 부피 (2차 이식 후 대략 10일째에 최대 부피를 가짐)에 도달하였고 그 후 수축되었다 (도 44). 이러한 지연기는 완전히 탑재되기 전에 수일을 요구하는 적응성 면역 체계 반응의 표시일 수 있다.
생체 내에서 종양 세포에 전달된 YopE1 -138-뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 및 YopE1-138-인간 cGAS의 영향을 평가하기 위한 추가 실험에서, 본 발명자들은 B16F10 흑색종 암세포로 s.c 동종이식된 야생형 C57BL/6 마우스에서 연구를 수행하였다. 종양의 크기가 약 75 mm3에 도달하면 마우스에 PBS 또는 7.5*107 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT, Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT + YopE1 -138 뮤린 Rig1 Card 도메인1 -246 또는 Y. 엔테로콜리티카 Δ+ YopE1 -138 인간 cGAS를 종양 내 (it) 주사하였다. 세균의 첫 번째 주사 당일을 0일째로 정의하였다. 마우스에 이를 d0, d1, d2, d3, d6 및 d9에 주사하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용해 이후 일자에 걸쳐서 측정하였다. Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT 단독으로의 처리는 종양 부피 진행에 영향을 미쳤는데, 1/15 마우스가 완전한 종양 퇴행을 나타내었다 (도 46). RIG1 CARDS 또는 cGAS인, 타입 I IFN 반응을 유도하는 단백질을 전달하는 Y. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT는 종양 진행에 더 현저한 영향을 초래하는 것으로 나타났는데, 각각의 5/15 (RIG1 CARDs) 또는 8/15 (cGAS) 마우스는 완전하고 지속적인 종양 퇴행을 나타내었다 (도 46). 상기 결과는 이러한 세균 및 이들의 T3SS가 종양 진행에 대한 매우 유의미한 간섭에 사용될 수 있고 타입 I IFN 유도 단백질의 전달이 원발성 종양의 퇴행을 유도하는데 매우 적합함을 강조한다. 놀랍게도, 특히 YopE1 -138-인간 cGAS를 전달하는 세균의 경우에, 최초 투여 직후에 종양 부피의 증가를 PBS 처리 대조군과 비교하여 관찰하였고, 타입 I IFN 유도 cGAS 단백질의 세포 내 전달에 의해 유도되는 종양 내로의 백혈구 유입 (슈도-진행)에 의해 유도될 수 있다.
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YopE1-138 - z-BIM <400> 16 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Asp Thr Ser Arg Glu Gln Thr Leu Ala Asn Gly Pro Ala Ser Gln Gly 145 150 155 160 Ser Gly Glu Ser Thr Gly Gly Gly Val Val Leu Pro Ala Gly His Phe 165 170 175 Asp Phe Pro Gln Pro Gly Glu Gly Asp Pro Leu Arg Gly Gly Ile Ser 180 185 190 Met Ser Asn Asn Gln Ser Arg Ser Pro Met Asn Arg Thr Phe Ser Arg 195 200 205 Ser Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Val Asp Ser Asp Ser Val Pro Gly Ser 210 215 220 Pro Leu Met Pro Asn Ile Ser Glu Ala Gln Asp Gly Gln Asn Asp Glu 225 230 235 240 Val Trp Leu Ser Glu His Ser His Gln His Leu Gln Met Ala Ala Pro 245 250 255 Val Ala Ala Leu Pro Pro Glu Met Val Val Ala Arg Glu Leu Arg Arg 260 265 270 Ile Gly Asp Glu Phe Asn Arg Leu Tyr Cys Glu Ala Gly Ala Gly Val 275 280 285 Asn Gln Leu Arg Ala Pro Asn Glu His Ala Ile Val Leu Trp Met Asn 290 295 300 Val Ile Ile Gly Arg Leu Val His Phe Phe Leu Arg Arg Arg 305 310 315 <210> 17 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - human Bid <400> 17 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 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Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His 290 295 300 Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile 305 310 315 320 Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met 325 330 335 Asp <210> 18 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - human t-Bid <400> 18 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gly Asn 130 135 140 Arg Ser Ser His Ser Arg Leu Gly Arg Ile Glu Ala Asp Ser Glu Ser 145 150 155 160 Gln Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly 165 170 175 Asp Ser Met Asp Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala 180 185 190 Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn Arg Asp 195 200 205 Leu Ala Thr Ala Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg Asp Met 210 215 220 Glu Lys Glu Lys Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys 225 230 235 240 Val Ala Ser His Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr 245 250 255 Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala 260 265 270 Arg Asn Gly Met Asp 275 <210> 19 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine BID BH3 part <400> 19 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu 130 135 140 Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu 145 150 155 160 Met Asp His <210> 20 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine Bax BH3 part <400> 20 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Lys Lys Leu Ser 130 135 140 Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 145 150 155 <210> 21 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized murine tBid <400> 21 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser 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Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu 130 135 140 Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu 145 150 155 160 Met Asp His Asn Ile Gln Pro 165 <210> 23 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-10 Aa linker - Y. enterocolitica codon optimized murine tBid BH3 part <400> 23 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu 130 135 140 Ala Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala 145 150 155 160 Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His 165 <210> 24 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized murine Bax BH3 part- Y. enterocolitica codon optimized murine tBid BH3 part <400> 24 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp 145 150 155 160 Ser Gly Ala Phe Asp Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His 165 170 175 Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His 180 185 <210> 25 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine BID BH3 part (ready for insertion of further domains) <400> 25 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly 145 150 155 160 Asp Glu Met Asp His 165 <210> 26 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine Bax BH3 part (ready for insertion of further domains) <400> 26 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp 145 150 155 160 Ser <210> 27 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - (Y. enterocolitica codon optimized murine BID BH3 part)2 <400> 27 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly 145 150 155 160 Asp Glu Met Asp His Gly Ala Phe Asp Ala Glu Glu Ile Ile His Asn 165 170 175 Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His 180 185 190 <210> 28 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - (Y. enterocolitica codon optimized murine BID BH3 part)(Y. enterocolitica codon optimized murine Bax BH3 part) <400> 28 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly 145 150 155 160 Asp Glu Met Asp His Gly Ala Phe Asp Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys 165 170 175 Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 180 185 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp 1 5 10 15 Glu Met Asp His 20 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His 1 5 10 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp 1 5 10 15 Ser Met Asp Arg 20 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Asn <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Asn <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human RIG-1 two CARD domains (Aa. 1-245) <400> 37 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys 145 150 155 160 Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg 165 170 175 Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro 180 185 190 Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu 195 200 205 Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr 210 215 220 Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu 225 230 235 240 Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe 245 250 255 Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys 260 265 270 Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys 275 280 285 Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser 290 295 300 Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu 305 310 315 320 Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp 325 330 335 Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln 340 345 350 Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu Asn Ser 355 360 365 Cys Pro Pro Ser Glu Val Ser Asp Thr Asn Leu Tyr Ser Pro Phe Lys 370 375 380 Pro Arg Asn 385 <210> 38 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine RIG-1 two CARD domains (Aa. 1-246) <400> 38 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys 145 150 155 160 Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu 165 170 175 Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro 180 185 190 Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser 195 200 205 Glu Gly Trp Phe Gln 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enterocolitica codon optimized P. aeruginosa WspR (Aa. 172-347) <400> 39 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Arg Met 130 135 140 Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His 145 150 155 160 Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Asn Ser Asp Gly 165 170 175 Leu Thr Gly Leu Ser Asn Arg Arg His Phe Asp Glu Tyr Leu Glu Met 180 185 190 Glu Trp Arg Arg Ser Leu 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Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Glu 130 135 140 Thr Pro Lys Pro Arg Ile Leu Pro Trp Leu Val Ser Gln Leu Asp Leu 145 150 155 160 Gly Gln Leu Glu Gly Val Ala Trp Leu Asp Glu Ser Arg Thr Arg Phe 165 170 175 Arg Ile Pro Trp Lys His Gly Leu Arg Gln Asp Ala Gln Met Ala Asp 180 185 190 Phe Gly Ile Phe Gln Ala Trp Ala Glu Ala Ser Gly Ala Tyr Thr Pro 195 200 205 Gly Lys Asp Lys Pro Asp Val Ser Thr Trp Lys Arg Asn Phe Arg Ser 210 215 220 Ala Leu Asn Arg Lys Glu Val Leu Arg Leu Ala Ala Asp Asn Ser Lys 225 230 235 240 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Cholerae DncV (M3toL413) <400> 41 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Trp Asn Phe His Gln Tyr Tyr Thr Asn Arg Asn Asp Gly Leu Met Gly 145 150 155 160 Lys Leu Val Leu Thr Asp Glu Glu Lys Asn Asn Leu Lys Ala Leu Arg 165 170 175 Lys Ile Ile Arg Leu Arg Thr Arg Asp Val Phe Glu Glu Ala Lys Gly 180 185 190 Ile Ala Lys Ala Val Lys Lys Ser Ala Leu Thr Phe Glu Ile Ile Gln 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine MDA5 two CARD domains (minimal: Aa 1-190) <400> 44 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe 145 150 155 160 Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His 165 170 175 Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu 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Lys Pro Thr 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys 245 250 255 Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu 260 265 270 Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val 275 280 285 Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser 290 295 300 Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe 305 310 315 320 Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp Ala Leu Phe 325 330 335 Gln Glu Leu Thr Gly Gly Gly Cys Pro Glu Asp Asn Thr Asp Leu Ala 340 345 350 Asn Ser Ser His Arg Asp Gly Pro Ala Ala Asn Glu Cys Leu Leu Pro 355 360 365 Ala Val Asp Glu Ser Ser Leu Glu Thr Glu Ala Trp Asn Val Asp Asp 370 375 380 Ile Leu Pro Glu Ala Ser Cys Thr Asp Ser Ser Val Thr Thr Glu Ser 385 390 395 400 Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Phe Asp Glu Ser Leu 405 410 415 Gly His Asn Ser Asn Met Gly Arg Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser Asp 420 425 430 Ser Asp Glu Ser Val Ile Gln Thr Lys Arg Val Ser Pro Glu Pro Glu 435 440 445 Leu Gln Leu Arg Pro Tyr Gln Met Glu 450 455 <210> 46 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human MDA5 two CARD domains (minimal: Aa 1-190) <400> 46 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Asn Gly Tyr Ser Thr Asp Glu Asn Phe Arg Tyr Leu Ile Ser Cys Phe 145 150 155 160 Arg Ala Arg Val Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln Arg Thr Val 180 185 190 Ala Thr Ser Gly Asn Met Gln Ala Val Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu 195 200 205 Glu Lys Gly Val Trp His Leu Gly Trp Thr Arg Glu Phe Val Glu Ala 210 215 220 Leu Arg Arg Thr Gly Ser Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Met Asn Pro Glu 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Phe Glu Asn Ala His Asp Glu Tyr 245 250 255 Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu 260 265 270 Val Arg Asp Val Leu Asp Lys Cys Met Glu Glu Glu Leu Leu Thr Ile 275 280 285 Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ala Glu Asn Asn Gly Asn Glu Ser 290 295 300 Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe 305 310 315 320 Ser Ala Phe Leu Asn Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn 325 330 <210> 47 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human MDA5 two CARD domains (extended: Aa 1-314) <400> 47 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Asn Gly Tyr Ser Thr Asp Glu Asn Phe Arg Tyr Leu Ile Ser Cys Phe 145 150 155 160 Arg Ala Arg Val Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln Arg Thr Val 180 185 190 Ala Thr Ser Gly Asn Met Gln Ala Val Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu 195 200 205 Glu Lys Gly Val Trp His Leu Gly Trp Thr Arg Glu Phe Val Glu Ala 210 215 220 Leu Arg Arg Thr Gly Ser Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Met Asn Pro Glu 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Phe Glu Asn Ala His Asp Glu Tyr 245 250 255 Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu 260 265 270 Val Arg Asp Val Leu Asp Lys Cys Met Glu Glu Glu Leu Leu Thr Ile 275 280 285 Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ala Glu Asn Asn Gly Asn Glu Ser 290 295 300 Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe 305 310 315 320 Ser Ala Phe Leu Asn Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asn Glu Leu Val 325 330 335 Gln Glu Leu Thr Gly Ser Asp Cys Ser Glu Ser Asn Ala Glu Ile Glu 340 345 350 Asn Leu Ser Gln Val Asp Gly Pro Gln Val Glu Glu Gln Leu Leu Ser 355 360 365 Thr Thr Val Gln Pro Asn Leu Glu Lys Glu Val Trp Gly Met Glu Asn 370 375 380 Asn Ser Ser Glu Ser Ser Phe Ala Asp Ser Ser Val Val Ser Glu Ser 385 390 395 400 Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Leu Asp Glu Ser Leu 405 410 415 Gly His Asn Ser Asn Met Gly Ser Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser Asp 420 425 430 Ser Asp Glu Glu Asn Val Ala Ala Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Leu 435 440 445 Gln Leu Arg Pro Tyr Gln Met Glu 450 455 <210> 48 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human MAVS CARD domain (minimal: Aa 1-77) <400> 48 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Pro 130 135 140 Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Ser Asn 145 150 155 160 Phe Cys Asn Val Asp Val Val Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Cys Leu 165 170 175 Thr Ala Arg Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Thr Cys Thr Leu Ser Gly 180 185 190 Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg Arg Pro 195 200 205 Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Leu Arg 210 215 <210> 49 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine MAVS CARD domain (minimal: Aa 1-77) <400> 49 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg 130 135 140 <210> 50 <211> 1675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutator sequence for generation of YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine RIG-1 two CARD domains (Aa. 1-246) integrated on the pYV plasmid <400> 50 gaatagacag cgaaagttgt tgaaataatt gagtgatagc ttgttcaaat gaatacattt 60 gatctcctaa tagttagata aaatatcaac ttaaccaaag cactctcggc agaccatcaa 120 ttttagccta taatttttag tttttatttt gtctaatata acaacaaaaa cagcagcggt 180 tttttatata accaccggct attttcccac taagataacc ttgttttaat agccaaggga 240 ataaatagtc atgaaaatat catcatttat ttctacatca ctgcccctgc cggcatcagt 300 gtcaggatct agcagcgtag gagaaatgtc tgggcgctca gtctcacagc aaaaaagtga 360 tcaatatgca aacaatctgg ccgggcgcac tgaaagccct cagggttcca gcttagccag 420 ccgtatcatt gagaggttat catcaatggc ccactctgtg attggattta tccaacgcat 480 gttctcggag gggagccata aaccggtggt gacaccagca ctcacgcctg cacaaatgcc 540 aagccctacg tctttcagtg atagtatcaa gcaacttgct gctgagacgc tgccaaaata 600 catgcagcag ttgagtagct tggatgcaga gacgctgcag aaaaatcatg accagttcgc 660 cacgctcgag tctagaatga ccgccgaaca acgccaaaat ctgcaagcct ttcgcgatta 720 tattaaaaaa attctggatc cgacctatat tctgagctat atgagcagct ggctggaaga 780 tgaagaagtg caatatattc aagccgaaaa aaataataaa ggtccgatgg aagccgccag 840 cctgtttctg caatatctgc tgaaactgca aagcgaaggt tggtttcaag cctttctgga 900 tgccctgtat catgccggtt attgtggtct gtgtgaagcc attgaaagct gggattttca 960 aaaaattgaa aaactggaag aacatcgcct gctgctgcgc cgcctggaac cggaatttaa 1020 agccaccgtg gatccgaatg atattctgag cgaactgagc gaatgtctga ttaatcaaga 1080 atgtgaagaa attcgccaaa ttcgcgatac caaaggtcgc atggccggtg ccgaaaaaat 1140 ggccgaatgt ctgattcgca gcgataaaga aaattggccg aaagtgctgc aactggccct 1200 ggaaaaagat aatagcaaat ttagcgaact gtggattgtg gataaaggtt ttaaacgcgc 1260 cgaaagcaaa gccgatgaag atgatggtgc cgaagccagc agcattcaaa tttttattca 1320 agaagaaccg gaatgtcaaa atctgagcca aaatccgggt ccgccgagcg aagccagcag 1380 caataatctg catagcccgc tgaaaccgcg caattaatat ggataaaaac aagggggtag 1440 tgtttccccc tttttctatc aatattgcga atatcttcgt ccctgatctt tcaggggcga 1500 atcgtttttt agcatgctca ttgttagaat ttctgactta tctctcttct gtattactac 1560 tcatactctg gaaaatcctg agcatttata tctatggatt gatgcagcac tcgagaaatc 1620 aaaatatcat tgctaagcgt tatatagtat ataccgtgct ttttatactg aaaac 1675 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_285 <400> 51 cataccatgg gagtgagcaa gggcgag 27 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_286 <400> 52 ggaagatctt tacttgtaca gctcgtccat 30 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_287 <400> 53 cggggtacct caactaaatg accgtggtg 29 <210> 54 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_288 <400> 54 gttaaagctt ttcgaatcta gactcgagcg tggcgaactg gtc 43 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_387 <400> 55 cgtatctaga atggactgtg aggtcaacaa 30 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_391 <400> 56 cgtatctaga ggcaaccgca gca 23 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_389 <400> 57 gttaaagctt tcagtccatc ccatttctg 29 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_436 <400> 58 cgtatctaga atgccccgcc cc 22 <210> 59 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_437 <400> 59 gttaaagctt ctacccaccg tactcgtcaa t 31 <210> 60 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_438 <400> 60 cgtatctaga atgtctgaca cgtccagaga g 31 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_439 <400> 61 gttaaagctt tcatcttctt cgcaggaaaa ag 32 <210> 62 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_463 <400> 62 cagtctcgag gaaagcttgt ttaaggggc 29 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_464 <400> 63 cagtttcgaa ttagcgacgg cgacg 25 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_476 <400> 64 gttaaagctt ttacttgtac agctcgtcca t 31 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_494 <400> 65 cgtatctaga atggccgagc cttg 24 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_495 <400> 66 gttaaagctt ttattgaaga tttgtggctc c 31 <210> 67 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_504 <400> 67 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatgccccg 60 cccc 64 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_505 <400> 68 gttaaagctt cccaccgtac tcgtcaattc 30 <210> 69 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_508 <400> 69 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatggccga 60 gccttg 66 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_509 <400> 70 gttaaagctt ttgaagattt gtggctccc 29 <210> 71 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_511 <400> 71 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgtgagcaa 60 gggcgag 67 <210> 72 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_512 <400> 72 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtccgccgaa 60 aaaaaaacgt aaagttgtga gcaagggcga g 91 <210> 73 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_513 <400> 73 gttaaagctt ttaaacttta cgtttttttt tcggcggctt gtacagctcg tccat 55 <210> 74 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_515 <400> 74 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgattataa 60 agatgatgat gataaaatgg ccgagccttg 90 <210> 75 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_677 <400> 75 ttactattcg aagaaattat tcataatatt gcccgccatc tggcccaaat tggtgatgaa 60 atggatcatt aagcttggag ta 82 <210> 76 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_678 <400> 76 tactccaagc ttaatgatcc atttcatcac caatttgggc cagatggcgg gcaatattat 60 gaataatttc ttcgaatagt aa 82 <210> 77 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_682 <400> 77 ttactactcg agaaaaaact gagcgaatgt ctgcgccgca ttggtgatga actggatagc 60 taagcttgga gta 73 <210> 78 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_683 <400> 78 tactccaagc ttagctatcc agttcatcac caatgcggcg cagacattcg ctcagttttt 60 tctcgagtag taa 73 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_580 <400> 79 catgccatgg atttatggtc atagatatga cctc 34 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_612 <400> 80 cggggtacca tgaggtagct tatttcctga taaag 35 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_613 <400> 81 cggggtacca taattgtcca aatagttatg gtagc 35 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_614 <400> 82 catgccatgg cggcaaggct cctc 24 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_615 <400> 83 cggggtacct ttatttgtca acactgccc 29 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_616 <400> 84 cggggtacct gcggggtctt tactcg 26 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_585 <400> 85 cagtctcgag atgcagatct tcgtcaagac 30 <210> 86 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_586 <400> 86 gttaaagctt gctagcttcg aaaccaccac gtagacgtaa gac 43 <210> 87 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_588 <400> 87 cagtttcgaa gattataaag atgatgatga taaaatggcc gagccttg 48 <210> 88 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 733 <400> 88 ttactactcg agggtgccat cgatgccgaa gaaattattc ataatattgc ccg 53 <210> 89 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 735 <400> 89 tactccttcg aattaatgat ccatttcatc accaatttg 39 <210> 90 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 736 <400> 90 ttactactcg agggtgccat cgatgccaaa aaactgagcg aatgtctgcg 50 <210> 91 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 738 <400> 91 tactccttcg aattagctat ccagttcatc accaatg 37 <210> 92 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 734 <400> 92 tactccttcg aaggcaccat gatccatttc atcaccaatt tgg 43 <210> 93 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 725 <400> 93 ttactattcg aagaaattat tcataatatt gcc 33 <210> 94 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 726 <400> 94 tactccaagc ttacggttga atattatgat ccatttcatc accaatttgg 50 <210> 95 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 727 <400> 95 ttactattcg aagccggtgg tgccgaagaa attattcata atattgccc 49 <210> 96 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 728 <400> 96 tactccaagc ttaatgatcc atttcatca 29 <210> 97 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 737 <400> 97 tactccttcg aaggcaccgc tatccagttc atcaccaatg 40 <210> 98 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 2xTEVsite - EGFP <400> 98 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly 145 150 155 160 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 165 170 175 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 180 185 190 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 195 200 205 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 210 215 220 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 225 230 235 240 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 245 250 255 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 260 265 270 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 275 280 285 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 290 295 300 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 305 310 315 320 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 325 330 335 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 340 345 350 Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 355 360 365 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 370 375 380 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 385 390 <210> 99 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2xTEVsite - NLS - EGFP <400> 99 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly Gln Ser Pro Pro Lys Lys Lys 145 150 155 160 Arg Lys Val Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro 165 170 175 Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val 180 185 190 Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys 195 200 205 Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val 210 215 220 Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His 225 230 235 240 Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val 245 250 255 Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg 260 265 270 Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu 275 280 285 Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu 290 295 300 Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln 305 310 315 320 Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp 325 330 335 Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly 340 345 350 Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser 355 360 365 Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu 370 375 380 Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr 385 390 395 400 Lys <210> 100 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2xTEVsite - EGFP - NLS <400> 100 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly 145 150 155 160 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 165 170 175 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 180 185 190 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 195 200 205 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 210 215 220 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 225 230 235 240 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 245 250 255 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 260 265 270 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 275 280 285 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 290 295 300 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 305 310 315 320 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 325 330 335 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 340 345 350 Asp Asn His Tyr Leu Ser 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106 catgtctaga ccctcagcat aataacgact c 31 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 600 <400> 107 catgacatgt tggcgtttct cgcc 24 <210> 108 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 601 <400> 108 catgacatgt attaacctca gccctgacta taag 34 <210> 109 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiple cloning site of pBad_Si_1 and pBad_Si_2 <400> 109 gttcgccacg ctcgagtcta gattcgaaaa gcttgggccc gaacaaaaac tcatctcaga 60 agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt aaacggtctc 120 cagcttggct gttttggc 138 <210> 110 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine RIG1 CARD domains (Aa. 1-229) <400> 110 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys 145 150 155 160 Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu 165 170 175 Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro 180 185 190 Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser 195 200 205 Glu Gly Trp Phe Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Tyr His Ala Gly Tyr 210 215 220 Cys Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys Ile Glu 225 230 235 240 Lys Leu Glu Glu His Arg Leu Leu Leu Arg Arg Leu Glu Pro Glu Phe 245 250 255 Lys Ala Thr Val Asp Pro Asn Asp Ile Leu 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Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys 145 150 155 160 Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu 165 170 175 Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro 180 185 190 Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser 195 200 205 Glu Gly Trp Phe Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Tyr His Ala Gly Tyr 210 215 220 Cys Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys Ile Glu 225 230 235 240 Lys Leu Glu Glu His Arg Leu Leu Leu Arg Arg Leu Glu Pro Glu Phe 245 250 255 Lys Ala Thr Val Asp Pro Asn Asp Ile Leu Ser Glu Leu Ser Glu Cys 260 265 270 Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Arg Gln Ile Arg Asp Thr Lys 275 280 285 Gly Arg Met Ala Gly Ala Glu Lys Met Ala Glu Cys Leu Ile Arg Ser 290 295 300 Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Val Leu Gln Leu Ala Leu Glu Lys Asp 305 310 315 320 Asn Ser Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Asp Lys Gly Phe Lys Arg 325 330 335 Ala Glu Ser Lys Ala Asp Glu Asp Asp Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ile 340 345 350 Gln Ile Phe Ile Gln Glu Glu Pro 355 360 <210> 112 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine MDA5 (Aa. 1-294) <400> 112 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe 145 150 155 160 Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His 165 170 175 Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile 180 185 190 Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu 195 200 205 Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala 210 215 220 Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys 245 250 255 Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu 260 265 270 Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val 275 280 285 Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser 290 295 300 Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg 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Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser 130 135 140 Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe 145 150 155 160 Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His 165 170 175 Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile 180 185 190 Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu 195 200 205 Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala 210 215 220 Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr 225 230 235 240 Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys 245 250 255 Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu 260 265 270 Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val 275 280 285 Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser 290 295 300 Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe 305 310 315 320 Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp Ala Leu Phe 325 330 335 Gln Glu Leu Thr Gly Gly Gly Cys Pro Glu Asp Asn Thr Asp Leu Ala 340 345 350 Asn Ser Ser His Arg Asp Gly Pro Ala Ala Asn Glu Cys Leu Leu Pro 355 360 365 Ala Val Asp Glu Ser 370 <210> 114 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138- Y. enterocolitica codon optimized B. subtilis CdaS L44F constitutive active version <400> 114 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser 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Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gly Ala 130 135 140 Ser Lys Leu Arg Ala Val Leu Glu Lys Leu Lys Leu Ser Arg Asp Asp 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ala Ala Gly Met Val Lys Gly Val Val Asp His Leu Leu 165 170 175 Leu Arg Leu Lys Cys Asp Ser Ala Phe Arg Gly Val Gly Leu Leu Asn 180 185 190 Thr Gly Ser Tyr Tyr Glu His Val Lys Ile Ser Ala Pro Asn Glu Phe 195 200 205 Asp Val Met Phe Lys Leu Glu Val Pro Arg Ile Gln Leu Glu Glu Tyr 210 215 220 Ser Asn Thr Arg Ala Tyr Tyr Phe Val Lys Phe Lys Arg Asn Pro Lys 225 230 235 240 Glu Asn Pro Leu Ser Gln Phe Leu Glu Gly Glu Ile Leu Ser Ala Ser 245 250 255 Lys Met Leu Ser Lys Phe Arg Lys Ile Ile Lys Glu Glu Ile Asn Asp 260 265 270 Ile Lys Asp Thr Asp Val Ile Met Lys Arg Lys Arg Gly Gly Ser Pro 275 280 285 Ala Val Thr Leu Leu Ile Ser Glu Lys Ile Ser Val Asp Ile Thr Leu 290 295 300 Ala Leu Glu Ser Lys Ser Ser Trp Pro Ala Ser Thr Gln Glu Gly Leu 305 310 315 320 Arg Ile Gln Asn Trp Leu Ser Ala Lys Val Arg Lys Gln Leu Arg Leu 325 330 335 Lys Pro Phe Tyr Leu Val Pro Lys His Ala Lys Glu Gly Asn Gly Phe 340 345 350 Gln Glu Glu Thr Trp Arg Leu Ser Phe Ser His Ile Glu Lys Glu Ile 355 360 365 Leu Asn Asn His Gly Lys Ser Lys Thr Cys Cys Glu Asn Lys Glu Glu 370 375 380 Lys Cys Cys Arg Lys Asp Cys Leu Lys Leu Met Lys Tyr Leu Leu Glu 385 390 395 400 Gln Leu Lys Glu Arg Phe Lys Asp Lys Lys His Leu Asp Lys Phe Ser 405 410 415 Ser Tyr His Val Lys Thr Ala Phe Phe His Val Cys Thr Gln Asn Pro 420 425 430 Gln Asp Ser Gln Trp Asp Arg Lys Asp Leu Gly Leu Cys Phe Asp Asn 435 440 445 Cys Val Thr Tyr Phe Leu Gln Cys Leu Arg Thr Glu Lys Leu Glu Asn 450 455 460 Tyr Phe Ile Pro Glu Phe Asn Leu Phe Ser Ser Asn Leu Ile Asp Lys 465 470 475 480 Arg Ser Lys Glu Phe Leu Thr Lys Gln Ile Glu Tyr Glu Arg Asn Asn 485 490 495 Glu Phe Pro Val Phe Asp Glu Phe 500 <210> 116 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138- Y. enterocolitica codon optimized human MAVS CARD (Aa. 1-100) <400> 116 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Pro 130 135 140 Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Ser Asn 145 150 155 160 Phe Cys Asn Val Asp Val Val Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Cys Leu 165 170 175 Thr Ala Arg Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Thr Cys Thr Leu Ser Gly 180 185 190 Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg Arg Pro 195 200 205 Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Leu Arg Gly Cys Glu Leu Val 210 215 220 Asp Leu Ala Asp Glu Val Ala Ser Val Tyr Glu Ser Tyr Gln Pro Arg 225 230 235 240 Thr Ser <210> 117 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138- Y. enterocolitica codon optimized Anemonae (N. vectensis) cGAS (Aa. 60-422) (Ensembl: A7SFB5.1) <400> 117 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gln Pro 130 135 140 Phe Pro Lys Gly Asp Leu Glu Thr Leu Arg Arg Phe Ser Val Thr Asp 145 150 155 160 Val Lys Ile Ser Lys Gln Ser Thr Lys Trp Ala Lys Lys Met Ala Asp 165 170 175 Lys His Leu Glu Ile Ile Arg Lys His Cys Lys Thr Asn Ser Ile Lys 180 185 190 Leu Phe Asn His Phe Glu Tyr Thr Gly Ser Phe Tyr Glu His Leu Lys 195 200 205 Thr Ile Asp Ala Asp Glu Leu Asp Ile Met Val Ala Leu Ser Ile Lys 210 215 220 Met Asp Glu Leu Glu Val Glu Gln Val Thr Pro Gly Tyr Ala Gly Leu 225 230 235 240 Lys Leu Arg Asp Thr Pro Ser Asn Arg Asn Lys Tyr Asn Asp Leu Thr 245 250 255 Ile Ala Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Leu Ser Pro Glu Lys Val Ser Arg 260 265 270 Trp Phe Phe Ser Leu Val Gln Lys Ala Val Asn Thr Tyr Lys Asp Glu 275 280 285 Ile Pro Gln Thr Glu Val Lys Leu Thr Asp Asn Gly Pro Ala Thr Thr 290 295 300 Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Gly Asp Lys Pro Gln Glu Lys Asn Arg 305 310 315 320 Arg Leu Ser Ile Asp Leu Val Pro Ala Leu Leu Phe Lys Asp Lys Thr 325 330 335 Lys Pro Ala Gly Asp Asp Leu Arg Ala Trp His Tyr Val Ala Lys Thr 340 345 350 Ile Pro Lys Gly Ala Arg Leu Lys Glu Pro Leu Pro Phe Arg Ser Glu 355 360 365 Leu Leu Trp Arg Gln Ser Phe Ser Leu Lys Glu Lys His Leu Met Asp 370 375 380 Lys Leu Asp Lys Asp Asp Asn Gly Cys Arg Arg Glu Met Val Arg Ile 385 390 395 400 Val Lys Thr Ile Val Lys Lys Asp Pro Thr Leu Ala Gln Leu Ser Ser 405 410 415 Tyr His Ile Lys Thr Ala Phe Leu Gln Tyr Asn Phe Ser Asp Val Lys 420 425 430 Leu Asp Trp Glu Gly Lys Lys Leu Ala Glu Arg Phe Leu His Phe Leu 435 440 445 Glu Phe Leu Arg Asp Arg Val Lys Asp Lys Thr Leu Asn Asn Tyr Phe 450 455 460 Ile Thr Asp Leu Asn Leu Leu Asp Asp Leu Asn Asp Ser Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Ile Ala Asn Arg Leu Asp Lys Ile Ile Gln Asn Glu Thr Glu Arg 485 490 495 Ala Lys Ile Phe Thr Thr Gln Arg Gln 500 505 <210> 118 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138- Y. enterocolitica codon optimized Listeria CdaA (Aa. 101-273) <400> 118 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Tyr Gly 130 135 140 Ser Arg Ile Glu Arg Glu Gln His His Leu Ile Glu Ser Ile Glu Lys 145 150 155 160 Ser Thr Gln Tyr Met Ala Lys Arg Arg Ile Gly Ala Leu Ile Ser Val 165 170 175 Ala Arg Asp Thr Gly Met Asp Asp Tyr Ile Glu Thr Gly Ile Pro Leu 180 185 190 Asn Ala Lys Ile Ser Ser Gln Leu Leu Ile Asn Ile Phe Ile Pro Asn 195 200 205 Thr Pro Leu His Asp Gly Ala Val Ile Ile Lys Gly Asn Glu Ile Ala 210 215 220 Ser Ala Ala Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Asp Ser Pro Phe Leu Ser Lys 225 230 235 240 Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu Gly Ile Ser Glu Val Thr 245 250 255 Asp Ser Ile Thr Ile Val Val Ser Glu Glu Thr Gly Gly Ile Ser Leu 260 265 270 Thr Lys Gly Gly Glu Leu Phe Arg Asp Val Ser Glu Glu Glu Leu His 275 280 285 Lys Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val Thr Val Thr Ala Lys Lys Pro Ser 290 295 300 Ile Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly Lys Ser Glu 305 310 315 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1010 <400> 119 cacatgtcta gacaaccgtt tccgaaaggt gatctg 36 <210> 120 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1012 <400> 120 atcccaagct tattggcgtt gggtggtaaa aattttg 37 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1021 <400> 121 cacatgtcta gaatgaccgc cgaacaacgc 30 <210> 122 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1022 <400> 122 catgaagctt acggacccgg attttggctc 30 <210> 123 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1023 <400> 123 catgaagctt acggttcttc ttgaataaaa atttgaatg 39 <210> 124 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1024 <400> 124 catgaagctt attgcagcac tttcggccaa ttt 33 <210> 125 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1025 <400> 125 cacatgtcta gaatgagcat tgtgtgtagc gc 32 <210> 126 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1026 <400> 126 catgaagctt agctttcatc cacggccgg 29 <210> 127 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer No. 1027 <400> 127 catgaagctt aattaccggt ttggcgcagc 30 <210> 128 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human RIG1 CARD domains (Aa. 1-228) <400> 128 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys 145 150 155 160 Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg 165 170 175 Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro 180 185 190 Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu 195 200 205 Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr 210 215 220 Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu 225 230 235 240 Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe 245 250 255 Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys 260 265 270 Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys 275 280 285 Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser 290 295 300 Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu 305 310 315 320 Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp 325 330 335 Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln 340 345 350 Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu Asn Ser 355 360 365 Cys Pro 370 <210> 129 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized human RIG1 CARD domains (Aa. 1-217) <400> 129 Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser Val 1 5 10 15 Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser Gln 20 25 30 Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser Ser 50 55 60 Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu Gly 65 70 75 80 Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met Pro 85 90 95 Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu Thr 100 105 110 Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr Leu 115 120 125 Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr Thr 130 135 140 Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr 145 150 155 160 Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg Glu 165 170 175 Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro Met 180 185 190 Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu Glu 195 200 205 Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr Ser 210 215 220 Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu Lys 225 230 235 240 Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe Lys 245 250 255 Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys Leu 260 265 270 Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys Gly 275 280 285 Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser Asp 290 295 300 Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu Arg 305 310 315 320 Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val 325 330 335 Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln Ile 340 345 350 Phe Tyr Gln Glu Asp Pro 355 <210> 130 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine MAVS CARD domain (Aa. 1-101) <400> 130 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr 130 135 140 Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Arg Asp Asn His Ser Lys 145 150 155 160 Phe Cys Cys Val Asp Val Leu Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Ser Cys Leu 165 170 175 Thr Ala Ser Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Ser Tyr Arg Gln Ile Gly 180 185 190 Asn Arg Asp Thr Leu Trp Gly Leu Phe Asn Asn Leu Gln Arg Arg Pro 195 200 205 Gly Trp Val Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Gln Ile Cys Glu Leu Pro 210 215 220 Gly Leu Ala Asp Gln Val Thr Arg Val Tyr Gln Ser Tyr Leu Pro Pro 225 230 235 240 Gly Thr Ser <210> 131 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138- Y. enterocolitica codon optimized murine cGAS (Aa. 146-507) <400> 131 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Pro 130 135 140 Asp Lys Leu Lys Lys Val Leu Asp Lys Leu Arg Leu Lys Arg Lys Asp 145 150 155 160 Ile Ser Glu Ala Ala Glu Thr Val Asn Lys Val Val Glu Arg Leu Leu 165 170 175 Arg Arg Met Gln Lys Arg Glu Ser Glu Phe Lys Gly Val Glu Gln Leu 180 185 190 Asn Thr Gly Ser Tyr Tyr Glu His Val Lys Ile Ser Ala Pro Asn Glu 195 200 205 Phe Asp Val Met Phe Lys Leu Glu Val Pro Arg Ile Glu Leu Gln Glu 210 215 220 Tyr Tyr Glu Thr Gly Ala Phe Tyr Leu Val Lys Phe Lys Arg Ile Pro 225 230 235 240 Arg Gly Asn Pro Leu Ser His Phe Leu Glu Gly Glu Val Leu Ser Ala 245 250 255 Thr Lys Met Leu Ser Lys Phe Arg Lys Ile Ile Lys Glu Glu Val Lys 260 265 270 Glu Ile Lys Asp Ile Asp Val Ser Val Glu Lys Glu Lys Pro Gly Ser 275 280 285 Pro Ala Val Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Glu Glu Ile Ser Val Asp 290 295 300 Ile Ile Leu Ala Leu Glu Ser Lys Gly Ser Trp Pro Ile Ser Thr Lys 305 310 315 320 Glu Gly Leu Pro Ile Gln Gly Trp Leu Gly Thr Lys Val Arg Thr Asn 325 330 335 Leu Arg Arg Glu Pro Phe Tyr Leu Val Pro Lys Asn Ala Lys Asp Gly 340 345 350 Asn Ser Phe Gln Gly Glu Thr Trp Arg Leu Ser Phe Ser His Thr Glu 355 360 365 Lys Tyr Ile Leu Asn Asn His Gly Ile Glu Lys Thr Cys Cys Glu Ser 370 375 380 Ser Gly Ala Lys Cys Cys Arg Lys Glu Cys Leu Lys Leu Met Lys Tyr 385 390 395 400 Leu Leu Glu Gln Leu Lys Lys Glu Phe Gln Glu Leu Asp Ala Phe Cys 405 410 415 Ser Tyr His Val Lys Thr Ala Ile Phe His Met Trp Thr Gln Asp Pro 420 425 430 Gln Asp Ser Gln Trp Asp Pro Arg Asn Leu Ser Ser Cys Phe Asp Lys 435 440 445 Leu Leu Ala Phe Phe Leu Glu Cys Leu Arg Thr Glu Lys Leu Asp His 450 455 460 Tyr Phe Ile Pro Lys Phe Asn Leu Phe Ser Gln Glu Leu Ile Asp Arg 465 470 475 480 Lys Ser Lys Glu Phe Leu Ser Lys Lys Ile Glu Tyr Glu Arg Asn Asn 485 490 495 Gly Phe Pro Ile Phe Asp Lys Leu 500

Claims (29)

  1. 세균성 이펙터 단백질(bacterial effector protein)로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화(attenuated) 그람-음성 세균 균주로서, 여기서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이종 단백질이 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  2. 제1항에 있어서, IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이고, 여기서 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 이종 단백질이 RIG-I-유사 수용체 (RLR) 패밀리, 항바이러스 신호전달 및 타입 I IFN 유도에 관여하는 단백질을 함유하는 다른 CARD 도메인, 및 STING의 자극을 초래하는, WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, CdaS 및 cGAS로 구성된 군으로부터 선택되는 사이클릭-디-AMP, 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-디-GAMP 사이클라제와 같은 사이클릭 디뉴클레오티드 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  3. 제1항에 있어서, IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이고, 여기서 타입 I IFN 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질이 RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA 및 DisA-유사, CdaA, 및 cGAS 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  5. 제4항에 있어서, 상기 병원성 약독화 재조합 그람-음성 세균 균주가 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질 생산에 결함이 있는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 유전자가 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자, 펩티도글리칸 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, LPS 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, 뉴클레오티드 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 번역 개시 인자를 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자는 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자이고, 여기서 아미노산 생산에 필수적인 효소가 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 (asd)인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 (Yersinia) 균주인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 병원성 플라스미드 상에 위치하는 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자가 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자를 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  10. 제9항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자, 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자가 내인성 병원성 플라스미드 상의 orf155 (SycO)의 개시의 상류의(upstream) 122 bp에 위치하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  12. 제11항에 있어서, 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절이 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부를 제거하는 결실을 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, AraC-타입 DNA 결합 단백질이 VirF인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 엔테롤리티카 (Yersinia enterolitica)인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  15. 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주로서, 여기서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 염색체 유전자의 결실 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 성장에 필수적인 상기 내인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 내인성 병원성 플라스미드를 추가로 포함하는, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  16. 제15항에 있어서, 상기 병원성 약독화 재조합 그람-음성 세균 균주가 적어도 하나의 세균성 이펙터 단백질을 생산하는데 결함이 있는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 단백질을 코딩하는 유전자가 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자, 펩티도글리칸 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, LPS 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, 뉴클레오티드 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 번역 개시 인자를 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자가 아미노산 생산에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자이고, 여기서 아미노산 생산에 필수적인 효소가 아스파르테이트-베타-세미알데히드 데히드로게나제 (asd)인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 병원성 플라스미드 상에 위치하는 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자가 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자를 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  21. 제20항에 있어서, 성장에 필수적인 내인성 효소를 코딩하는 유전자, 그의 내인성 프로모터 및 그의 내인성 전사 종결자가 내인성 병원성 플라스미드 상의 orf155 (SycO)의 개시의 상류의 122 bp에 위치하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  23. 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 프레임 내 융합된 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주로서, 여기서 세균성 이펙터 단백질로부터의 전달 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절을 추가로 포함하는, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 온도센서 영역 내에서의 조절이 내인성 AraC-타입 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 상류의 RNA 헤어핀 구조 또는 이의 일부를 제거하는 결실을 포함하는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, AraC-타입 DNA 결합 단백질이 나선-회전-나선 모티프 (helix-turn-helix motif)를 통해 DNA에 결합하는 세균성 전사 조절 단백질인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, AraC-타입 DNA 결합 단백질이 VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, AraC, XylS, ExsA, PerA, MmsR, RhaS, TcpN, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, MarA, CafR, FapR 및 InvF로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 엔테롤리티카이고 AraC-타입 DNA 결합 단백질이 VirF인 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 단백질이 인터페론 (IFN) 반응의 유도 또는 조절에 관여하는 단백질, 아폽토시스(apoptosis) 또는 아폽토시스 조절에 관여하는 단백질, 세포 주기 조절인자, 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein), 세포 신호전달 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 프로테아제, 작은 GTPases, GPCR 관련 단백질, 나노바디 융합 작제물 및 나노바디, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 상기 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주가 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여되는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 재조합 병원성 약독화 그람-음성 세균 균주.
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