CN110325545B - 基于减毒细菌的蛋白递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株及其在治疗受试者癌症的方法中的用途。

Description

基于减毒细菌的蛋白递送
技术领域
本发明涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株及其在治疗受试者癌症的方法中的用途。
背景技术
细菌已经进化形成了不同的机制来将蛋白直接注射到靶细胞中1。被如耶尔森氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌2的细菌使用的III型分泌系统(T3SS)的功能类似于将所谓的细菌效应蛋白注射到宿主细胞中的纳米注射器。
T3S已经被用来将杂合肽和蛋白递送到靶细胞中。异源细菌T3SS效应子已经被传递，以防所研究的细菌难以通过遗传学获得(如沙眼衣原体)。通常将报告蛋白融合到可能的T3SS分泌信号从而研究对T3SS依赖性蛋白递送的需求，例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸环化酶、鼠DHFR或可磷酸化标签。肽递送主要以疫苗接种为目的进行。这包括病毒表位、细菌表位(李斯特菌溶血素O)以及代表人类癌细胞表位的肽。在少数情况下，递送功能性真核蛋白来调节宿主细胞，如递送纳米抗体3、核蛋白(Cre重组酶，MyoD)4,5或Il10和ILlra6。上述系统均不允许单蛋白递送，因为在每种情况下，均会编码一个或多个内源效应蛋白。此外，使用的载体未以能简单克隆编码所选蛋白的其他DNA片段的方式设计，阻碍了这种系统的广泛应用。
允许靶向药物递送的方法非常令人感兴趣。例如，使用识别肿瘤细胞表面结构，并且在最佳情况下，选择性结合肿瘤细胞的抗体。为了改善这种抗体的机制，可将它们与治疗剂或与包装了药物的脂质囊泡缀合。这种囊泡的难题之一是活性试剂的恰当释放。更加复杂的是治疗性蛋白或肽的递送，特别是当靶向的是细胞内机制时。已经尝试了许多替代方法来解决将治疗性蛋白递送至真核细胞中的问题，其中包括“细胞穿透肽”(CPP)或类似技术，以及各种基于纳米颗粒的方法学。所有这些技术均具有效率低的缺点，并且细胞通过内吞作用摄取的运载物(cargo)可能最终在溶酶体中降解。此外，运载物-载体在人体内的稳定性需求与靶细胞内不稳定和释放的需求之间的矛盾构成了这种技术的固有问题。当从远端部位施用时，多种细菌均已显示可在恶性实体肿瘤内复制，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和双歧杆菌(Bifidobacteria)。目前，只有卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG，来自牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis))用于临床实践。BCG被施用以治疗浅表性膀胱癌，而其潜在分子机制仍然大部分未知。能够例如将细菌内产生的运载物递送至细胞(如癌细胞)内的其作用部位(即细菌外)的细菌菌株的开发仍然是主要的挑战。
发明内容
本发明涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株及其在治疗受试者癌症的方法中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了重组减毒革兰氏阴性细菌菌株及其用于治疗受试者癌症的用途，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株允许各种III型效应子，以及IV型效应子、病毒蛋白和最重要的功能性真核蛋白转运到癌细胞中，例如恶性实体瘤的细胞中。
本发明提供了一种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其具有增加的异源蛋白表达和分泌特性，并且令人惊讶地其能够在体内数天或甚至数周内稳定地编码异源蛋白。
在第一方面，本发明涉及一种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。
在另一方面，本发明涉及一种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器(RNAthermosensor)区域内的调整。
在另一方面，本发明涉及一种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白。
在另一方面，本发明涉及用于在治疗受试者的癌症的方法中的使用的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括给受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株用于制造治疗受试者的癌症的药物的用途，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。
另一方面，本发明涉及用于在治疗受试者的癌症的方法的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括给受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株用于制造治疗受试者的癌症的药物的用途，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整。
在另一方面，本发明涉及用于在治疗受试者的癌症的方法的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括给受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
本发明同样涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株用于制造治疗受试者的癌症的药物的用途，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含重组减毒革兰氏阴性细菌菌株和药学上可接受的载体，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含重组减毒革兰氏阴性细菌菌株和药学上可接受的载体，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含重组减毒革兰氏阴性细菌菌株和药学上可接受的载体，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白。
附图说明
图1：T3SS蛋白递送的表征。蛋白以T3SS依赖性的方式分泌到周围介质中(体外分泌)(左侧)或真核细胞中(右侧)的示意图。I：示出了3型分泌系统。II表示分泌到周围介质中的蛋白，III表示通过膜被转运到真核细胞的胞质溶胶中(VII)的蛋白。VI示出了其中插入了T3SS的两层细菌膜的延伸和下面的细菌胞质溶胶。IV是与YopE1-138N-末端片段(V)连接的融合蛋白。
图2：基于III型分泌的递送工具盒的描述。(A)用于与YopE1-138产生融合构建体的克隆质粒pBad_Si1和pBad_Si2的载体图谱。分子伴侣SycE和YopE1-138-融合体在天然小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)启动子之下。两种质粒的不同之处仅在于pBad_Si1上存在阿拉伯糖诱导型EGFP。(B)pBad_Si1和pBad_Si2质粒上紧接YopE1-138片段之后的多克隆位点。
图3A至Q：在本研究中使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株。本研究中使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株的列表，其提供了关于背景菌株、质粒和在相应质粒上编码的用于T3SS依赖性递送的蛋白的信息。此外，提供了关于用于构建相应质粒的寡核苷酸、骨架质粒和抗生素抗性的信息。
图4：小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)W227毒力质粒——pYV。按比例绘制的菌株W227的69’673bp的耶尔森氏菌毒力质粒(pYV)。T3SS效应蛋白、复制起点和砷抗性(由基因arsC、B、R和H编码)表示如下：I：复制起点，II：yopO，III：yopP，IV：yopQ，V：yopT，VI：sycT，VII：yopM，VIII：yopD，IX：yopB，X：sycD，XII：yopH，XIII：sycH，XIV：sycE，XV：yopE，XVI：yadA，XVII-XVXX：arsC、B、R和H。
图5：合成的增加的促细胞凋亡蛋白的递送。由源自促细胞凋亡蛋白t-BID或BAX的单个BH3结构域或其串联重复组成的单个合成蛋白的递送导致4T1和B16F10癌细胞中细胞凋亡诱导增强。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopHOPEMT感染4T1(I)或B16F10(II)细胞，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopHOPEMT在pBad-MycHisA上编码IV：YopE1-138-tBID BH3延伸结构域、V：YopE1-138-接头-tBID BH3、VI：YopE1-138-tBID BH3、VII：YopE1-138-(tBID BH3)2、VIII：YopE1-138-tBID BH3-BAX BH3或IX：YopE1-138-BAX BH3-tBID BH3。对于每种菌株，对向细胞中加入的细菌进行滴定(MOI)，确定细胞计数并使用非线性回归计算IC50。示出了IC50MOI(III)。
图6：由pYV编码的合成的促细胞凋亡蛋白诱导细胞凋亡。在pYV上编码的单个或串联重复的BID BH3结构域的递送导致4T1和B16F10癌细胞中的细胞凋亡诱导。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+IV：pYV-YopE1-138-BH3-Bid，或V：+pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2或VI：用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT pBad-MycHisA-YopE1-138-(BH3-Bid)2感染4T1(I)或B16F10(II)细胞3小时。对于每种菌株，对向细胞中加入的细菌进行滴定(MOI)，确定细胞计数并使用非线性回归计算IC50(III)。
图7：静脉注射的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T在4T1乳腺癌同种异体移植模型中的肿瘤定殖。肿瘤中的细菌计数以每克组织的菌落形成单位(CFU)表示(III)。在感染后第8天(I)和第14天(II)评估肿瘤中的计数。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图8：静脉注射的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T在4T1乳腺癌同种异体移植模型中的生物分布。血液(I)、脾(II)、肝(III)、肺(IV)和肿瘤(V)中的细菌计数以每克组织或每ml血液的菌落形成单位(CFU)表示(VI)。在感染后第14天评估计数。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。*表示在肺上发现大转移瘤的小鼠。
图9：通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中肿瘤发展的延迟。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用I：PBS或II：1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMTΔHairpinI-virF+pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2静脉注射通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(III；静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。相对肿瘤体积(相对于第0天的肿瘤体积标准化)以mm3表示(IV)。平均值用符号表示，所示的误差线表示平均值的标准误差。用双向ANOVA测量统计显著性，*表示p值<0.05，**表示p值<0.005。
图10：通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用I：PBS或II：1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT静脉注射通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(III；静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。相对肿瘤体积(相对于第0天的肿瘤体积标准化)以mm3表示(IV)。平均值用符号表示，所示的误差线表示平均值的标准误差。
图11：通过控制主调节子VirF的表达来调节基于T3SS的分泌。A：用递送YopE1-138-(tBID BH3)2的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT菌株进行的体外分泌测定(在37℃下进行)。VirF的表达受以下启动子的控制：其天然启动子(I+II)、阿拉伯糖诱导型启动子(III+IV)或其控制温度依赖性表达的其发夹I区缺失的天然启动子(V)。在不存在阿拉伯糖(I、III和V)或存在0.2％阿拉伯糖(II和IV)的情况下进行分泌测定。使用识别YopE1-138区域的抗体用Western印迹检测分泌的YopE1-138-(tBID BH3)2。B：用递送YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT菌株进行的体外分泌测定(在37℃下进行)。VirF的表达受以下启动子的控制：其天然启动子(I+II)或其控制温度依赖性表达的其发夹I区缺失的天然启动子(III)。在不存在阿拉伯糖(I和III)或存在0.2％阿拉伯糖(II)的情况下进行分泌测定。使用识别YopE1-138区域的抗体用Western印迹检测YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的分泌。
图12：体外生长的比较：II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT、III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd、IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBAD-MycHisA-asd、V：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBAD-MycHisA-asd(反向方向)、VI：在pYV上编码YopE1-138-(tBID BH3)2的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT和VII：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pYV-asd-YopE1-138-(tBID BH3)2的体外生长的比较。将细菌接种在液体培养基中并使其生长3小时。随后，确定所有菌株的OD600(I)。
图13：用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBad-MycHisA-asd进行肿瘤定殖，和pBad-MycHisA-asd的稳定性：用1*106个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBad-MycHisA-asd静脉注射通过皮下注射B16F10黑素瘤细胞而被同种异体移植的野生型C57BL/6小鼠。在静脉注射细菌后的第1天(I)或第4天(II)，分离血液(V)、脾(VI)、肝脏(VII)、肺(VIII)和肿瘤(IX)，均质化，连续稀释并涂布在含有萘啶酸的LB-琼脂平板(不含氨苄青霉素，-IV)或对pBad-MycHisA-asd具有选择性的含有氨苄青霉素的LB-琼脂平板(+IV)上。各样品中的细菌计数以每克组织或每ml血液的菌落形成单位(CFU)表示(III)。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图14：用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBad-MycHisA-asd进行肿瘤定殖：用1*106个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pBad-MycHisA-asd静脉注射通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。在静脉注射细菌后的指定日期(I)，分离肿瘤、均质化、连续稀释并涂布在含有萘啶酸的LB琼脂平板上。肿瘤中的细菌计数以每克组织的菌落形成单位(CFU)表示(II)。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图15：pYV的遗传稳定性：天然pYV或pYV-asd在实体瘤中的体内稳定性。用1*107个II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2、III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔhairpinI-virF+pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2或IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pYV-asd-YopE1-138-(tBID BH3)2静脉注射通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。在静脉注射细菌后的第9天，分离肿瘤、均质化、连续稀释并涂布在含有萘啶酸的LB琼脂平板上。在这些平板上生长后，在含有和不含亚砷酸钠(对pYV具有选择性)的LB-琼脂平板上重新挑选来自个体小鼠的单菌落。对于每只小鼠，表示了在含亚砷酸盐的琼脂平板上生长的菌落与在不含亚砷酸盐的平板上生长的菌落数的百分比(I：表示为％)。100％表示来自实体瘤的所有分离的菌落都仍然含有pYV质粒。
图16：肿瘤定殖：用1*107个II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2、III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔhairpinI-virF+pYV-YopE1-138-(tBIDBH3)2或IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔasd+pYV-asd-YopE1-138-(tBID BH3)2静脉注射通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。在静脉注射细菌后的第9天，分离肿瘤、均质化、连续稀释并涂布在含有萘啶酸的LB琼脂平板上。肿瘤中的细菌计数以每克组织的菌落形成单位(CFU)表示(I)。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图17：通过细菌T3SS-Rig1途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。人和鼠RIG1 Card结构域的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-人Rig1 Card结构域、III：YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(IV：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(V：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图18：通过细菌T3SS-Rig1途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。人Rig1 Card结构域的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-MycHis、III：YopE1-138-人Rig1Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(IV：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(V：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图19：通过细菌T3SS-Rig1途径递送I型干扰素应答诱导蛋白：阳性对照。在与图18相同的实验中使用IFNγ刺激B16F10 IFN-报告细胞系进行的阳性对照。用鼠IFNγ刺激B16F10报告细胞。向细胞中加入IFNγ的滴定(IV：表示为U/ml)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(II：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图20：通过细菌T3SS-Rig1途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。pYV编码的鼠RIG1Card结构域的递送导致B16F10癌症细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pYV上编码II：YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(III：表示为MOI)，并基于分泌的碱性磷酸酶的活性通过向IFN报告细胞系添加细胞上清液来评估IFN刺激(V：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图21：通过细菌T3SS-Rig1途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。pYV编码的鼠RIG1Card结构域的递送导致4T1癌症细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pYV上编码II：YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染4T1细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(III：表示为MOI)，并基于分泌的碱性磷酸酶的活性通过向IFN报告细胞系添加细胞上清液来评估IFN刺激(V：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图22：通过细菌T3SS–STING途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。环状二核苷酸生成酶的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-铜绿假单胞菌WspR(具有调整的茎结构域)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(III：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(IV：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图23：通过细菌T3SS–STING途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。环状二核苷酸生成酶的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。B16F10报告细胞未经处理(I)或用II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码III：YopE1-138-霍乱弧菌DncV、IV：YopE1-138-蜡样芽孢杆菌(B.cereus)DisA样蛋白、V：YopE1-138-Anemonae cGAS或VI：YopE1-138-MycHis的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VII：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VIII：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图24：以T3SS依赖性的方式向培养上清液中分泌IRF3。I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138-鼠tBID BH3和II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138-鼠IRF3Ser397Asp的体外分泌实验。使用抗-YopE抗体通过Western印迹分析总细菌裂解物(“A”)和沉淀的培养物上清液(“B”)的蛋白含量。所写的数字表示相应高度处的分子量(以kDa计)。
图25：通过细菌T3SS向免疫细胞递送I型干扰素应答诱导蛋白——Rig1和STING途径。鼠RIG1 Card结构域和环状二核苷酸生成酶的递送导致RAW264.7IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-霍乱弧菌DncV、III：YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白、IV：YopE1-138-AnemonaecGAS或V：YopE1-138-鼠RIG1 Card结构域的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染RAW264.7报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VI：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VII：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图26：静脉注射的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株在B16F10乳腺癌同种异体移植模型中的肿瘤定殖。一旦肿瘤的大小达到100-315mm3，则用以下静脉注射通过皮下注射B16F10黑素瘤癌细胞而被同种异体移植的野生型C57BL/6小鼠：I：PBS、II：1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、III：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT+pYV-YopE1-138–鼠RIG1 CARDs1-246或IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMTΔHairpinI-virF+pYV-YopE1-138-鼠RIG1 CARDs1-246。肿瘤中的细菌计数以每克组织的菌落形成单位(CFU)表示(V)。在感染后第5天或第8天评估肿瘤中的计数。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图27：通过细菌T3SS–RIG1递送I型干扰素应答诱导蛋白。人和鼠RIG1 CARD结构域的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-人RIG1 CARD结构域1-245、III：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、IV：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-229、V：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VI：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VII：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图28：通过细菌T3SS–RIG1递送I型干扰素应答诱导蛋白。人和鼠RIG1 CARD结构域的递送导致RAW IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-人RIG1 CARD结构域1-245、III：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、IV：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-229、V：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染RAW细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VI：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VII：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图29：通过细菌T3SS–MDA5途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。鼠MDA5的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-鼠MDA51-294、III：YopE1-138-鼠MDA51-231的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(IV：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(V：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图30：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白。MAVS CARD的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、III：YopE1-138-人cGAS161-522、IV：YopE1-138-人MAVS CARD1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VI：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图31：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白。MAVS CARD的递送导致RAW巨噬细胞IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、III：YopE1-138-人cGAS161-522、IV：YopE1-138-人MAVS CARD1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染RAW巨噬报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VI：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图32：通过细菌T3SS–STING途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。环状二核苷酸生成酶的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-Anemonae cGAS、III：YopE1-138-Anemonae cGAS60-422、IV：YopE1-138-人cGAS161-522、V：YopE1-138-Listeria CdaA101-273、VI：YopE1-138-霍乱弧菌DncV、VII：YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VIII：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(XI：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图33：通过细菌T3SS–STING途径递送I型干扰素应答诱导蛋白。环状二核苷酸生成酶的递送导致RAW巨噬细胞IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-Anemonae cGAS、III：YopE1-138-Anemonae cGAS60-422、IV：YopE1-138-人cGAS161-522、V：YopE1-138-利斯特氏菌CdaA101-273、VI：YopE1-138-霍乱弧菌DncV、VII：YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染RAW巨噬报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VIII：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(IX：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图34：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白，并与小分子STING激动剂进行比较。环状二核苷酸生成酶的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-AnemonaecGAS、III：YopE1-138-人cGAS161-522、IV：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染B16F10报告细胞。进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VI：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图35：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白，并与小分子STING激动剂进行比较。环状二核苷酸的递送导致B16F10 IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用小分子STING激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)处理B16F10报告细胞。进行化合物的滴定(V：表示为微摩尔)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(II：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图36：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白，并与小分子STING激动剂进行比较。环状二核苷酸生成酶的递送导致RAW IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码II：YopE1-138-AnemonaecGAS、III：YopE1-138-人cGAS161-522、IV：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染RAW报告细胞。进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(VI：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图37：通过细菌T3SS–MAVS递送I型干扰素应答诱导蛋白，并与小分子STING激动剂进行比较。环状二核苷酸的递送导致RAW IFN报告细胞系中的I型IFN诱导。用小分子STING激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)处理RAW报告细胞。进行化合物的滴定(V：表示为微摩尔)，并且基于分泌的碱性磷酸酶的活性评估IFN刺激(II：OD650)，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图38：通过细菌T3SS递送I型干扰素应答诱导蛋白并证明T3SS依赖性——RIG1和MAVS。与YopE1-138融合的RIG1 CARD结构域或MAVS CARD的递送导致RAW IFN-报告细胞系中的I型IFN诱导，其严格依赖于T3SS。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT-yopB，或在pBadMycHisA衍生质粒上编码III：YopE1-138-鼠RIG1CARD结构域1-246、V：YopE1-138-人MAVS CARD1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT或在pBadMycHisA衍生质粒上编码IV：YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、VI：YopE1-138-人MAVSCARDs1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT-yopB感染RAW报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(VII：表示为MOI)，并且基于分泌的lucia荧光素酶的活性评估IFN刺激(VIII：OD650)，所述lucia荧光素酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
图39：在来自肿瘤分离物的粗细胞混合物中，I型干扰素应答诱导蛋白通过细菌T3SS递送——RIG1。与YopE1-138融合的RIG1 CARD结构域的递送导致粗肿瘤分离物中的I型IFN诱导。当肿瘤达到>200mm3的体积时，处死通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将肿瘤捣碎、消化并作为单细胞悬浮液接种到24孔板中。用I和III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或II和IV：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染来自两个不同肿瘤的这种细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并使用关于干扰素β的ELISA评估IFN刺激(VI：皮克/毫升)。虚线表示未处理的相应肿瘤，I/II和III/IV是来源于相同肿瘤的各细胞。
图40：通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则用PBS肿瘤内注射通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将第一次肿瘤内注射PBS的那一天定义为第0天，在第0天、第1天、第5天、第6天、第10天和第11天进行治疗。在随后的几天(I：第一次注射细菌后的第-11天至第80天)用测径器测量肿瘤体积。对于每只小鼠，相对肿瘤体积(相应日期的肿瘤体积除以第0天的肿瘤体积)(以mm3计)表示为log-2转化后的(II)。
图41：通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则用7.5*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT肿瘤内注射通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将第一次肿瘤内注射细菌的那一天定义为第0天，在第0天、第1天、第5天、第6天、第10天和第11天进行治疗。在随后的几天(I：第一次注射细菌后的第-11天至第80天)用测径器测量肿瘤体积。对于每只小鼠，相对肿瘤体积(相应日期的肿瘤体积除以第0天的肿瘤体积)(以mm3计)表示为log-2转化后的(II)。
图42：通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则用7.5*107个在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT肿瘤内注射通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将第一次肿瘤内注射细菌的那一天定义为第0天，在第0天、第1天、第5天、第6天、第10天和第11天进行治疗。在随后的几天(I：第一次注射细菌后的第-11天至第80天)用测径器测量肿瘤体积。对于每只小鼠，相对肿瘤体积(相应日期的肿瘤体积除以第0天的肿瘤体积)(以mm3计)表示为log-2转化后的(II)。
图43：通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则用7.5*107个在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-人cGAS161-522的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT肿瘤内注射通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将第一次肿瘤内注射细菌的那一天定义为第0天，在第0天、第1天、第5天、第6天、第10天和第11天进行治疗。在随后的几天(I：第一次注射细菌后的第-11天至第80天)用测径器测量肿瘤体积。对于每只小鼠，相对肿瘤体积(相应日期的肿瘤体积除以第0天的肿瘤体积)(以mm3计)表示为log-2转化后的(II)。
图44：第一次完全消退后在对侧以皮下注射的方式用EMT6乳腺癌细胞再激发的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则如上所述(图40-43)用7.5*107个II：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、III：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-人cGAS161-522的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT肿瘤内处理通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将肿瘤内注射细菌的那一天定义为第0天。在对侧侧腹上以皮下注射的方式用EMT6乳腺癌细胞对具有完全肿瘤消退的小鼠(或I：作为对照的空白小鼠)进行同种异体移植。在随后的几天(IV：直至第一次注射细菌后的第80天)用测径器测量肿瘤体积。每只小鼠的绝对肿瘤体积表示(V)为mm3。
图45：通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到80-250mm3，则用I：PBS，或5*106个II：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、III：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2、IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMTΔHairpinI-virF pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2、V：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMTΔHairpinI-virFΔasd pYV-asd-YopE1-138-(tBID BH3)2静脉注射通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天，所有小鼠在d-1用得斯芬(desferal)腹膜内(i.p.)处理。在随后的几天(VI：第一次注射细菌后的第0天至第15天)用测径器测量肿瘤体积。肿瘤体积中位数表示(VII)为mm3。
图46：通过皮下注射B16F10黑素瘤细胞而被同种异体移植的野生型C57BL/6小鼠中的肿瘤发展。一旦肿瘤的大小达到60-130mm3，则用I：PBS，或7.5*107个II：小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、III：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、IV：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-人cGAS161-522的小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT肿瘤内注射通过皮下注射B16F10黑素瘤细胞而被同种异体移植的野生型C57BL/6小鼠。将第一次肿瘤内注射细菌的那一天定义为第0天，在第0天、第1天、第2天、第3天、第6天和第9天进行治疗。在随后的几天(V：天数)用测径器测量肿瘤体积。平均肿瘤体积表示(VI)为mm3。
图47：小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种(小肠结肠炎耶尔森氏菌subsp.palearctica)在B16F10黑素瘤小鼠同种异体移植模型中的生物分布：对外观评分。I：天数，II：具有评分的小鼠的比例，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40野生型，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T。箭头表示静脉注射2x105个细菌的日期。
图48：小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种在B16F10黑素瘤小鼠同种异体移植模型中的生物分布：对行为评分。I：天数，II：具有评分的小鼠的分数，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40野生型，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T。箭头表示用2x105个细菌静脉注射感染的日期。
图49：小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种在B16F10黑素瘤小鼠同种异体移植模型中的生物分布：小鼠的体重。用细菌静脉注射感染后每日评估小鼠的体重。I：天数，II：以克表示的体重，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40野生型，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T。箭头表示用2x105个细菌静脉注射感染的日期。
图50：小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种在B16F10黑素瘤小鼠同种异体移植模型中的生物分布：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T的生物分布。通过器官均质化、连续稀释并计数所得菌落形成单位(CFU)来评估所示时间的器官中的计数。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天，所有小鼠在第-1天用得斯芬腹膜内(i.p.)处理。I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T、II：
每克组织或每ml血液的CFU，III：第1天，IV：第4天，V：血液，VI：脾，VII：肝，VIII：肺，IX：肿瘤。*表示无可见肿瘤的小鼠。
图51：小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种在B16F10黑素瘤小鼠同种异体移植模型中的生物分布：小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40野生型的生物分布。通过器官均质化、连续稀释并计数所得菌落形成单位(CFU)来评估所示时间的器官中的计数。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天，所有小鼠在第-1天用得斯芬腹膜内(i.p.)处理。I：小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40野生型，II：每克组织或每ml血液的CFU，III：第1天，IV：第4天，V：血液，VI：脾，VII：肝，VIII：肺，IX：肿瘤。
图52：通过细菌T3SS递送I型干扰素应答诱导蛋白——细菌T3SS递送的MAVS不依赖于内源MAVS而起作用。通过T3SS的MAVS CARD的递送导致MAVSKO RAW巨噬细胞IFN报告(荧光素酶)细胞系中的I型IFN诱导。用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT，或II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT-yopB、III：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-人MAVSCARD1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT或IV：在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-人MAVS CARD1-100小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT-yopB感染MAVSKO RAW巨噬报告细胞。对每种菌株进行添加到细胞中的细菌的滴定(V：表示为MOI)，并且基于荧光素酶的活性评估IFN刺激(VI：RLU-相对发光单位)，所述荧光素酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。
具体实施方式
本发明涉及重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，及其在治疗受试者的癌症(例如恶性实体肿瘤)的方法中的用途。
为了解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数使用的术语还将包括复数，反之亦然。应该理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。
如本文所用的术语“革兰氏阴性细菌菌株”包括以下细菌：杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、Anaeromyxobacter dehalogenans、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachmoatis)、流产衣原体(Chlamydophila abortus)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、寻常型脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、Endozoicomonas elysicola、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、艾伯替埃希氏菌(Escherichia albertii)、大肠杆菌、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、陆地光杆状菌(Photorabdus temperate)、海绵假交替单胞菌(Pseudoalteromonas spongiae)、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、根瘤菌菌种(Rhizobium sp)、肠道沙门氏菌和其他沙门氏菌菌种、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和其他志贺氏菌菌种、Sodalis glossinidius、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、天青弧菌(Vibrio azureus)、坎氏弧菌(Vibrio campellii)、Vibrio caribbenthicus、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、塔斯马尼亚弧菌(Vibrio tasmaniensis)、塔式弧菌(Vibrio tubiashii)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)。本发明优选的革兰氏阴性细菌菌株是由肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)包含的革兰氏阴性细菌菌株。本发明的革兰氏阴性细菌菌株通常用于在体外和/或体内，优选体内，通过细菌T3SS将异源蛋白递送到真核细胞中。
如本文所用的术语“重组减毒革兰氏阴性细菌菌株”是指用核苷酸分子(例如载体)遗传转化的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株。这种重组革兰氏阴性细菌菌株的毒力通常通过使具有毒力活性的细菌效应蛋白缺失而减弱，所述细菌效应蛋白由作为分泌系统一部分的一种或多种细菌蛋白转运。这种效应蛋白通过分泌系统被递送到宿主细胞中，在宿主细胞中它们对各种宿主蛋白和细胞系统发挥其毒力活性。已知有许多不同的调节宿主调控分子功能的效应蛋白，其通过各种分泌系统类型被转运并显示出大量的生物化学活性。此外，本文使用的重组革兰氏阴性细菌菌株的毒力可以通过如下方法减弱：使通常或偶尔由革兰氏阴性细菌菌株产生的铁载体(siderophore)缺乏，从而使该菌株不产生铁载体，例如在铁载体的产生方面有缺陷。因此，在一个优选实施方案中，使用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其缺乏通常或偶尔由革兰氏阴性细菌菌株产生的铁载体，从而使该菌株不产生铁载体，例如在铁载体的产生方面有缺陷。更优选地，使用耶尔森氏菌菌株，特别是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T、小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF或小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd，所述菌株缺乏通常或偶尔由革兰氏阴性细菌菌株产生的铁载体，从而使该菌株不产生铁载体，例如在铁载体的产生方面有缺陷，尤其是在耶尔森氏菌素(Yersiniabactin)的产生方面有缺陷。在产生耶尔森氏菌素方面有缺陷的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T描述于WO02077249中，并于2001年9月24日根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)保藏在比利时协调微生物保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms，BCCM)，保藏号为LMG P-21013。重组减毒革兰氏阴性细菌菌株优选不产生至少一种，优选至少两种铁载体，例如，在至少一种、优选至少两种铁载体的产生方面有缺陷，更优选地，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株不产生任何铁载体。
术语“铁载体”、“含铁铁载体(iron siderophore)”或“铁螯合剂(ironchelator)”在本文中可互换使用，是指对铁具有高亲和力的化合物，例如，对铁有高亲和力的小化合物。
革兰氏阴性细菌的铁载体是例如由沙门氏菌、埃希氏菌、克雷伯氏菌、志贺氏菌、沙雷氏菌合成的肠杆菌素和二羟基苯甲酰丝氨酸(但被所有肠杆菌属使用)，由假单胞菌合成的脓菌素(Pyoverdin)，由弧菌合成的弧菌素(Vibriobactin)，由不动杆菌合成的不动菌素(Acinetobactin)和Acinetoferrin，由耶尔森氏菌合成的耶尔森氏菌素和产气菌素(Aerobactin)，由伯克氏菌合成的Ornibactin，由沙门氏菌合成的沙门菌螯铁蛋白(Salmochelin)，由埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和耶尔森氏菌合成的产气菌素，由博德特氏菌(Bordetella)合成的Alcaligin，由弧菌合成的Bisucaberin。
铁载体包括异羟肟酸盐、儿茶酚盐和混合配体铁载体。目前已有几种铁载体被批准用于人类，主要目的是治疗铁超载。优选的铁载体是去铁胺(Deferoxamine)(也称为去铁敏B(desferrioxamine B)、去铁胺B(desferoxamine B)、DFO-B、DFOA、DFB或得斯芬)、去铁敏E(Desferrioxamine E)、地拉罗司(Deferasirox)(Exjade、Desirox、Defrijet、Desifer)和去铁酮(Deferiprone)(Ferriprox)。
本文使用的术语“生长所必需的内源蛋白”是指重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的蛋白，在没有那些蛋白的情况下，革兰氏阴性细菌菌株无法生长。生长所必需的内源蛋白为例如氨基酸产生所必需的酶、参与肽聚糖生物合成的酶、参与LPS生物合成的酶、参与核苷酸合成的酶或翻译起始因子。
本文所用的术语“氨基酸产生所必需的酶”是指与重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的氨基酸产生有关的酶，在没有那些酶的情况下，革兰氏阴性细菌菌株复发生长。氨基酸产生所必需的酶是例如天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(asd)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、色氨酰tRNA合成酶(trpS)或丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)或转酮醇酶1(Transketolase 1)(tktA)、转酮酶醇2(tktB)、核酮糖-磷酸3-差向异构酶(rpe)、核糖-5-磷酸异构酶A(rpiA)、转醛醇酶A(Transaldolase A)(talA)、转醛醇酶B(talB)、磷酸核糖焦磷酸合酶(prs)、ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、组氨酸生物合成双功能蛋白HisIE(hisI)、1-(5-磷酸核糖基)-5-[(5-磷酸核糖基氨基)亚甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺异构酶(hisA)、咪唑甘油磷酸合酶亚基HisH(hisH)、咪唑甘油磷酸合酶亚基HisF(hisF)、组氨酸生物合成双功能蛋白HisB(hisB)、组氨醇-磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇脱氢酶(hisD)、3-脱氢喹啉合酶(aroB)、3-脱氢喹啉脱水酶(aroD)、莽草酸脱氢酶(NADP(+))(aroE)、莽草酸激酶2(aroL)、莽草酸激酶1(aroK)、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶(aroA)、分支酸(Chorismate)合酶(aroC)、P-蛋白(pheA)、T-蛋白(tyrA)、芳香族氨基酸氨基转移酶(tyrB)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroG)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroH)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroF)、奎宁酸/莽草酸脱氢酶(ydiB)、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1(pfkA)、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2(pfkB)、2类果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)、1类果糖二磷酸醛缩酶(fbaB)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、丙酮酸激酶I(pykF)、丙酮酸激酶II(pykA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、2,3-双磷酸甘油酸依赖性磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、2,3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶(gpmM/yibO)、可能的磷酸甘油酸变位酶(ytjC/gpmB)、烯醇酶(eno)、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)、磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)、L-丝氨酸脱水酶1(sdaA)、L-丝氨酸脱水酶2(sdaB)、分解代谢的L-苏氨酸脱水酶(tdcB)、生物合成的L-苏氨酸脱水酶(ilvA)、L-丝氨酸脱水酶(tdcG)、丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、半胱氨酸合酶A(cysK)、半胱氨酸合酶B(cysM)、β-胱硫醚酶(malY)、胱硫醚β-裂解酶(metC)、5-甲基四氢蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(metE)、甲硫氨酸合酶(metH)、S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)、胱硫醚γ-合酶(metB)、高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、5'-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(mtnN)、S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(luxS)、胱硫醚β裂解酶、胱硫醚γ裂解酶、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)、甘氨酸羟甲基转移酶(itaE)、3-异丙基苹果酸脱水酶小亚基(leuD)、3-异丙基苹果酸脱水酶大亚基(leuC)、3-异丙基苹果酸脱氢酶(leuB)、生物合成的L-苏氨酸脱水酶(ilvA)、乙酰乳酸合酶同工酶3大亚基(ilvI)、乙酰乳酸合酶同工酶3小亚基(ilvH)、乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基(ilvN)、乙酰乳酸合酶同工酶2小亚基(ilvM)、酮酸还原异构酶(NADP(+))(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1(thrA)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶2(metL)、2-异丙基苹果酸合酶(leuA)、谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(alaA)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1(thrA)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶2(metL)、赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3(lysC)、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、2-酮-3-脱氧-半乳糖醛酸醛缩酶(yagE)、4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、二氨基庚二酸表异构酶(dapF)、推定的裂解酶(Putative lyase)(yjhH)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶B(acnB)、乌头酸水合酶A(acnA)、未表征的推定的乌头酸水合酶(ybhJ)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(alaA)、谷氨酸合酶[NADPH]大链(gltB)、谷氨酸合酶[NADPH]小链(gltD)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、氨基酸乙酰转移酶(argA)、乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶链F(argF)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I(argI)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂解酶(argH)、谷氨酸5-激酶(proB)、γ-谷氨酰基磷酸还原酶(proA)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(proC)、鸟氨酸环脱氨酶、亮氨酸-tRNA连接酶(leuS)、谷氨酰胺-tRNA连接酶(glnS)、丝氨酸-tRNA连接酶(serS)、甘氨酸-tRNA连接酶β亚基(glyS)、甘氨酸-tRNA连接酶α亚基(glyQ)、酪氨酸-tRNA连接酶(tyrS)、苏氨酸-tRNA连接酶(thrS)、苯丙氨酸-tRNA连接酶α亚基(pheS)、苯丙氨酸-tRNA连接酶β亚基(pheT)、精氨酸-tRNA连接酶(argS)、组氨酸-tRNA连接酶(hisS)、缬氨酸-tRNA连接酶(valS)、丙氨酸-tRNA连接酶(alaS)、异亮氨酸-tRNA连接酶(ileS)、脯氨酸-tRNA连接酶(proS)、半胱氨酸-tRNA连接酶(cysS)、天冬酰胺-tRNA连接酶(asnS)、天冬氨酸-tRNA连接酶(aspS)、谷氨酸-tRNA连接酶(gltX)、色氨酸-tRNA连接酶(trpS)、甘氨酸-tRNA连接酶β亚基(glyS)、甲硫氨酸-tRNA连接酶(metG)、赖氨酸-tRNA连接酶(lysS)。优选的氨基酸产生所必需的酶是tktA、rpe、prs、aroK、tyrB、aroH、fbaA、gapA、pgk、eno、tdcG、cysE、metK、glyA、asd、dapA/B/D/E/F、argC、proC、leuS、glnS、serS、glyS/Q、tyrS、thrS、pheS/T、argS、hisS、valS、alaS、ileS、proS、cysS、asnS、aspS、gltX、trpS、glyS、metG、lysS，更优选的是asd、glyA、leuS、glnS、serS、glyS/Q、tyrS、thrS、pheS/T、argS、hisS、valS、alaS、ileS、proS、cysS、asnS、aspS、gltX、trpS、glyS、metG、lysS，最优选的是asd。
术语“在产生生长所必需的氨基酸方面有缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”和“营养缺陷型突变体”在本文中可互换使用，并且指在缺乏至少一种外源提供的必需氨基酸或其前体的情况下不能生长的革兰氏阴性菌株。该菌株在产生方面有缺陷的氨基酸是例如天冬氨酸、内消旋-2,6-二氨基庚二酸、芳香族氨基酸或亮氨酸-精氨酸。这种菌株可以通过例如天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因的缺失(Δasd)而形成。这种营养缺陷型突变体在不存在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸的情况下不能生长。对于本发明的在产生生长所必需的氨基酸方面有缺陷的革兰氏阴性细菌菌株，本文优选天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因的突变，例如，缺失。
术语“在产生与真核细胞表面或细胞外基质结合的粘附蛋白方面有缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”是指突变型革兰氏阴性细菌菌株，与由相应野生型菌株表达的粘附蛋白相比，其不表达至少一种粘附蛋白。粘附蛋白可以包括，例如，延伸的聚合物粘附分子(extended polymeric adhesion molecules)，如纤毛(pili)/菌毛(fimbriae)或非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括1型纤毛(例如带有FimH粘附素的大肠杆菌Fim-纤毛)、P-纤毛(如来自大肠杆菌的带有PapG粘附素的Pap-纤毛)、4型纤毛(如来自例如铜绿假单胞菌的菌毛蛋白)或curli(来自肠道沙门氏菌的具有CsgA粘附素的Csg蛋白)。非菌毛粘附素包括三聚体自转运粘附素，例如YadA(来自小肠结肠炎耶尔森氏菌)、BpaA(类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei))、Hia(流感嗜血杆菌(H.influenzae))、BadA(汉逊氏嗜血菌(B.henselae))、NadA(脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis))或UspA1(粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis))以及其它自转运粘附素，例如AIDA-1(大肠杆菌)以及其他粘附素/侵袭素，例如InvA(来自小肠结肠炎耶尔森氏菌)或Intimin(大肠杆菌)或Dr-家族或Afa-家族的成员(大肠杆菌)。如本文所用的术语YadA和InvA指来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白。自转运蛋白YadA7与不同形式的胶原蛋白以及纤连蛋白结合，而侵袭素InvA8与真核细胞膜中的β-整合蛋白结合。如果革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，则该菌株优选对InvA和/或YadA缺陷。
如本文所用，术语“肠杆菌科”包含存在于土壤、水、植物和动物中的革兰氏阴性、杆状、兼性厌氧菌科，其常常作为脊椎动物的病原体。该科的细菌具有相似的生理学特征，并且在各自基因组的功能元件和基因内具有保守性。除了氧化酶阴性之外，该科的所有成员都是葡萄糖发酵剂，并且大部分是硝酸盐还原剂。
本发明的肠杆菌科细菌可以是来自该科的任意细菌，具体包括但不限于以下属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、摩根氏菌属(Morganella)、普罗威登氏菌属(Providencia)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。在更具体的实施方案中，细菌是大肠杆菌、痢疾埃希氏菌(Escherichiablattae)、福氏埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫尔曼埃希氏菌(Escherichiahermanii)、Escherichia vuneris、肠道沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌(Salmonellabongori)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、索氏志贺菌(Shigella sonnei)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、日沟维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假结核耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、普罗威登斯菌加利福尼亚菌(Providencia alcalifaciens)或摩根摩根菌(Morganella morganii)菌种。
优选地，革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、衣原体属、欧文氏菌属、泛菌属、弧菌属、伯克霍尔德氏菌属、青枯菌属、黄单胞菌属、色杆菌属、Sodalis属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、根瘤菌属、气单胞菌属、光杆菌属、博德特氏菌属和脱硫弧菌属，更优选地，选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属，最优选地，选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属和沙门氏菌属，特别是耶尔森氏菌。
如本文所用的术语“耶尔森氏菌属”包括耶尔森氏菌属的所有菌种，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌和小鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌。
如本文所用的术语“沙门氏菌”包括沙门氏菌的所有菌种，包括肠道沙门氏菌和布氏沙门氏菌(S.bongori)。优选的是肠道沙门氏菌。
本文所用的“启动子”是指调节转录单元表达的核酸序列。“启动子区”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的调节区。在启动子区内将存在转录起始位点(通过用核酸酶S1定位很方便地确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)例如假定的-35区域和Pribnow盒。当描述两个核苷酸(例如DNA)区域之间的关系时，术语“可操作地连接”仅仅意味着它们在功能上彼此相关，并且它们位于相同的核酸片段上。如果启动子控制结构基因的转录，并且其位于与该基因相同的核酸片段上，则该启动子与结构基因可操作地连接。通常启动子在所述革兰氏阴性细菌菌株中具有功能，即启动子能够表达本发明的融合蛋白，即启动子能够表达本发明的融合蛋白而无需进一步的基因工程化或其他蛋白的表达。此外，功能性启动子不得天然地反向调节细菌T3SS。
本文使用的术语“染色体外遗传元件”是指除了染色体之外的遗传元件，其是由本发明的革兰氏阴性细菌菌株内源性地携带的(如毒力质粒)，或者其是转化革兰氏阴性细菌菌株的外源遗传元件，并且其被瞬时地或稳定地整合到染色体中或整合到除染色体之外被内源性地携带的遗传元件(如毒力质粒)中。这种染色体外遗传元件可能是载体，如表达载体；用于同源重组或以其他方式整合到染色体中或整合到除染色体之外被内源性地携带的遗传元件(如毒力质粒)中的载体；用于同源重组或以其他方式整合到染色体中或整合到除染色体之外被内源性地携带的遗传元件(如毒力质粒)中的DNA片段；或指导位点特异性插入到染色体中或插入到除染色体之外被内源性地携带的遗传元件(如毒力质粒)中的RNA元件，例如CRISPR/Cas9和相关的指导RNA。
本文使用的术语“RNA热传感器区域”是指温度敏感性非编码RNA序列，其调节相关基因的基因表达。通常，RNA热传感器区域通过形成二级结构成为RNA发夹环而起作用，所述RNA发夹环在抑制温度下稳定形成并且在允许的(permissive)温度下不稳定，并且它掩盖了翻译所必需的RNA序列，例如核糖体结合位点，以这种方式调节与翻译所必需的RNA序列相关的基因的表达。
本文使用的术语“RNA发夹结构或其部分”是指RNA二级结构，其是通过导致导致茎-环结构的分子内碱基配对而形成的。分子内碱基配对(通常在相同RNA链内)是由于互补核苷酸序列或其部分而形成的。
本文使用的术语“AraC型DNA结合蛋白”(也称为AraC/XylS家族)是指通过螺旋-转角-螺旋基序结合DNA的细菌转录调节蛋白。AraC型DNA结合蛋白的大多数成员是阳性转录调节子，并且其特征在于含有两个螺旋-转角-螺旋亚结构域，延伸超过100个残基的最小DNA结合结构域。AraC型DNA结合蛋白特别包括但不是限于：VirF、LcrF、YbtA、Rns、MxiE、AraC、XylS、ExsA、PerA、MmsR、RhaS、TcpN、HrpX、HrpB、GadX、HilC、HilD、MarA、CafR、FapR和InvF。优选的是参与调节毒力相关机制的AraC型DNA结合蛋白，如VirF、LcrF、YbtA、Rns、MxiE、ExsA、PerA、HrpX、HrpB、GadX、HilC、HilD、TcpN、CafR、FapR和InvF。更优选的是参与调节三型分泌系统活性的AraC型DNA结合蛋白，如VirF、LcrF、MxiE、ExsA、PerA、HrpX、HrpB、GadX、HilC、HilD和InvF，最优选的是VirF和/或LcrF。
本文使用的术语“递送”是指蛋白从重组减毒革兰氏阴性细菌菌株向真核细胞的输送，包括以下步骤：使异源蛋白在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株中表达，使表达的蛋白从该重组减毒革兰氏阴性细菌菌株分泌，并使由该重组减毒革兰氏阴性细菌菌株分泌的蛋白转运到真核细胞的胞质溶胶中。因此，术语“递送信号”或“分泌信号”在本文可互换使用，是指可以被革兰氏阴性细菌菌株的分泌和转运系统识别，并引导蛋白从革兰氏阴性细菌菌株向真核细胞的递送的多肽序列。
本文使用的术语“来自细菌效应蛋白的递送信号”是指来自在重组革兰氏阴性细菌菌株中具有功能的细菌效应蛋白的递送信号，即，其允许在重组革兰氏阴性细菌菌株中表达的异源蛋白通过分泌系统(如III型、IV型或VI型分泌系统)从该重组革兰氏阴性细菌菌株中分泌，或通过分泌系统(如III型、IV型或VI型分泌系统)被该重组革兰氏阴性细菌菌株转运到真核细胞的细胞溶质中。本文使用的术语“来自细菌效应蛋白的递送信号”还包含来自细菌效应蛋白的递送信号的片段，即递送信号的较短形式，例如，包含递送信号(例如天然存在的递送信号)的多达10个，优选多达20个，更优选多达50个，甚至更优选多达100个，特别是多达140个氨基酸的递送信号。因此，编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列(例如DNA序列)可以编码全长递送信号或其片段，其中所述片段通常包含通常多达30个，优选多达60个，更优选多达150个，甚至更优选多达300个，特别是多达420个核酸。
如本文所用，蛋白的“分泌”是指异源蛋白穿过重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的细胞膜向外输送。蛋白的“转运(translocation)”是指来自重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的异源蛋白穿过真核细胞的质膜输送到该真核细胞的胞质溶胶中。
如本文使用的术语“作为分泌系统的一部分的细菌蛋白”是指构成细菌3型分泌系统(T3SS)、4型分泌系统(T4SS)和6型分泌系统(T6SS)，优选T3SS的必需组件的细菌蛋白。在没有这种蛋白的情况下，即使仍然编码并产生分泌系统的所有其他组件和待转运的细菌效应蛋白，相应的分泌系统也不具有将蛋白转运到宿主细胞中的功能。
如本文所用的术语“细菌效应蛋白”是指通过分泌系统(例如通过作为分泌系统的一部分的细菌蛋白)被转运到宿主细胞中的细菌蛋白。这种效应蛋白通过分泌系统被递送到宿主细胞中，在宿主细胞中它们对各种宿主蛋白和细胞装置发挥例如毒力活性。已知有许多不同的调节宿主调控分子功能的效应蛋白，其通过各种分泌系统类型被转运并显示出大量的生物化学活性。分泌系统包括3型分泌系统(T3SS)、4型分泌系统(T4SS)和6型分泌系统(T6SS)。一些效应蛋白(如福氏志贺氏菌IpaC)也属于作为分泌系统装置的一部分的细菌蛋白类，并且允许蛋白转运。本文所用的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株通常包含构成细菌3型分泌系统(T3SS)、4型分泌系统(T4SS)和/或6型分泌系统(T6SS)，优选3型分泌系统(T3SS)的必需组件的细菌蛋白。如本文所用的术语“构成细菌T3SS的必需组件的细菌蛋白”是指天然形成注射体(injectisome)(例如，注射针)的蛋白，或者是对于其将蛋白转运到真核细胞中的功能而言所必需的蛋白。形成注射体的蛋白或对于其将蛋白转运到真核细胞中的功能而言所必需的蛋白包括但不限于：SctC、YscC、MxiD、InvG、SsaC、EscC、HrcC、HrcC(分泌素(Secretin))、SctD、YscD、MxiG、Prg、SsaD、EscD、HrpQ、HrpW、FliG(外MS环蛋白)、SctJ、YscJ、MxiJ、PrgK、SsaJ、EscJ、HrcJ、HrcJ、FliF(内MS环蛋白)、SctR、YscR、Spa24、SpaP、SpaP、SsaR、EscR、HrcR、HrcR、FliP(小型输出装置蛋白(Minor export apparatusprotein))、SctS、YscS、Spa9(SpaQ)、SpaQ、SsaS、EscS、HrcS、HrcS、FliQ(小型输出装置蛋白)、SctT、YscT、Spa29(SpaR)、SpaR、SsaT、EscT、HrcT、HrcT、FliR(小型输出装置蛋白)、SctU、YscU、Spa40、SpaS、SpaS、SsaU、EscU、HrcU、HrcU、FlhB(输出装置开关蛋白(Exportapparatus switch protein))、SctV、YscV、MxiA、InvA、SsaV、EscV、HrcV、HrcV、FlhA(大型输出装置蛋白(Major export apparatus protein))、SctK、YscK、MxiK、OrgA、HrpD(辅助细胞溶质蛋白)、SctQ、YscQ、Spa33、SpaO、SpaO、SsaQ、EscQ、HrcQA+B、HrcQ、FliM+FliN(C环蛋白)、SctL、YscL、MxiN、OrgB、SsaK、EscL、Orf5、HrpE、HrpF、FliH(固定子(Stator))、SctN、YscN、Spa47、SpaL、InvC、SsaN、EscN、HrcN、HrcN、FliI(ATPase)、SctO、YscO、Spa13、SpaM、InvI、SsaO、Orf15、HrpO、HrpD、FliJ(杆(Stalk))、SctF、YscF、MxiH、PrgI、SsaG、EscF、HrpA、HrpY(针丝蛋白)、SctI、YscI、MxiI、PrgJ、SsaI、EscI、rOrf8、HrpB、HrpJ、(内棒蛋白)、SctP、YscP、Spa32、SpaN、InvJ、SsaP、EscP、Orf16、HrpP、HpaP、FliK(针长调节子)、LcrV、IpaD、SipD(亲水性转运子，针尖蛋白)、YopB、IpaB、SipB、SseC、EspD、HrpK、PopF1、PopF2(疏水性转运子，孔蛋白)、YopD、IpaC、SipC、SseD、EspB(疏水性转运子，孔蛋白)、YscW、MxiM、InvH(Pilotin)、SctW、YopN、MxiC、InvE、SsaL、SepL、HrpJ、HpaA(Gatekeeper)。
如本文所用的术语“T6SS效应蛋白”或“细菌T6SS效应蛋白”是指由T6S系统天然注入到真核细胞或细菌的胞质溶胶中的蛋白，以及由T6S系统天然分泌的可能例如形成进入真核细胞膜的转运孔的蛋白。如本文所用的术语“T4SS效应蛋白”或“细菌T4SS效应蛋白”是指被T4S系统天然地注入到真核细胞的胞质溶胶中的蛋白，以及被T4S系统天然分地泌的可能例如形成进入真核细胞膜的转运孔的蛋白。
如本文所用的术语“T3SS效应蛋白”或“细菌T3SS效应蛋白”是指由T3S系统天然注入到真核细胞的胞质溶胶中的蛋白，以及由T3S系统天然分泌的可能例如形成进入真核细胞膜的转运孔的蛋白(包括成孔转运子(如耶尔森氏菌YopB和YopD)和尖端蛋白(tip-protein)如耶尔森氏菌LcrV)。优选地，使用由T3S系统被天然注入真核细胞的胞质溶胶中的蛋白。这些毒力因子会使真核细胞瘫痪或重新编程，使病原体受益。T3S效应子显示出大量的生物化学活性，并调节重要宿主调控分子的功能，并且包括AvrA、AvrB、AvrBs2、AvrBS3、AvrBsT、AvrD、AvrD1、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2、AvrXv3、CigR、EspF、EspG、EspH、EspZ、ExoS、ExoT、GogB、GtgA、GtgE、GALA蛋白家族、HopAB2、HopAO1、HopI1、HopM1、HopN1、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、HopU1、HsvB、IcsB、IpaA、IpaB、IpaC、IpaH、IpaH7.8、IpaH9.8、IpgB1、IpgB2、IpgD、LcrV、Map、OspC1、OspE2、OspF、OspG、OspI、PipB、PipB2、PopB、PopP2、PthXo1、PthXo6、PthXo7、SifA、SifB、SipA/SspA、SipB、SipC/SspC、SipD/SspD、SlrP、SopA、SopB/SigD、SopD、SopE、SopE2、SpiC/SsaB、SptP、SpvB、SpvC、SrfH、SrfJ、Sse、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、SseI/SrfH、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SspH1、SspH2、SteA、SteB、SteC、SteD、SteE、TccP2、Tir、VirA、VirPphA、VopF、XopD、YopB、YopD YopE、YopH、YopJ、YopM、YopO、YopP、YopT、YpkA。
如本文所用的术语“在恶性实体肿瘤中积聚的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株”或“重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在恶性实体肿瘤中积聚”是指重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在恶性实体肿瘤内复制，从而增加了该重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在恶性实体肿瘤内的细菌计数。令人惊讶的是，已经发现，在向受试者施用之后，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在恶性实体肿瘤中特异性地积聚，即，在存在恶性肿瘤的器官中特异性地积聚，其中在不存在恶性实体肿瘤的器官中重组减毒革兰氏阴性菌菌株的细菌计数低或不可检测。
对于细胞外驻留细菌(如耶尔森氏菌)，细菌主要在肿瘤细胞之间形成的细胞间隙内积聚。细胞内生长细菌(如沙门氏菌)将主要侵袭肿瘤细胞并在这些细胞内驻留，但细胞外积聚仍可能发生。积聚在恶性实体肿瘤内的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的细菌计数可以是例如在每克肿瘤组织104至109个细菌的范围内。
本文使用的术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂并且可以侵入附近组织的疾病。癌细胞还可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。有几种主要的癌症类型。上皮癌(carcinoma)是从皮肤或排列或覆盖内部器官的组织中开始的癌症。肉瘤(sarcoma)是从骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织开始的癌症。白血病是从血液形成组织(例如骨髓)开始的癌症，并且导致产生大量异常血细胞并进入血液。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是从免疫系统细胞开始的癌症。中枢神经系统癌症是从脑和脊髓组织开始的癌症。本文中使用的术语“癌症”包括实体瘤，即恶性实体瘤，例如肉瘤、上皮癌和淋巴瘤，和非实体瘤，例如白血病(血液癌症)。恶性实体瘤是优选的。
本文所用的术语“恶性实体肿瘤”或“恶性实体肿瘤指征”是指组织的异常肿块，其通常不包含囊肿或液体区域。实体肿瘤可能是良性的(非癌症)或恶性的(癌症)。用本发明的方法治疗恶性实体肿瘤。不同类型的恶性实体肿瘤以形成它们的细胞类型命名。恶性实体肿瘤的实例是肉瘤、上皮癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不形成恶性实体肿瘤(根据NIH国家癌症研究所的定义)。恶性实体肿瘤包括但不限于细胞的异常肿块，所述细胞可能源自不同组织类型，例如肝、结肠、结直肠、皮肤、乳腺、胰腺、子宫颈、子宫体、膀胱、胆囊、肾、喉、唇、口腔、食道、卵巢、前列腺、胃、睾丸、甲状腺或肺，因此恶性实体肿瘤包括恶性实体肝肿瘤、结肠肿瘤、结直肠肿瘤、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫体肿瘤、膀胱肿瘤、胆囊肿瘤、肾肿瘤、喉肿瘤、唇肿瘤、口腔肿瘤、食道肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、睾丸肿瘤、甲状腺肿瘤或肺肿瘤。可以用本发明的方法治疗的优选恶性实体肿瘤是源自皮肤、乳腺、肝、胰腺、膀胱、前列腺和结肠的恶性实体肿瘤，因此优选的恶性实体肿瘤包括恶性实体皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤和结肠肿瘤。可以用本发明的方法治疗的同样优选的恶性实体肿瘤是与肝癌相关的恶性实体肿瘤，如肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)。
如本文所用的术语“对真核细胞有毒力的细菌效应蛋白”是指通过分泌系统被转运到宿主细胞中并在宿主细胞中对各种宿主蛋白和细胞系统发挥其毒力活性的细菌效应蛋白。已知有许多不同的调节宿主调控分子功能的效应蛋白，其通过各种分泌系统类型被转运并显示出大量的生物化学活性。分泌系统包括3型分泌系统(T3SS)、4型分泌系统(T4SS)和6型分泌系统(T6SS)。重要的是，一些对真核细胞有毒力的效应蛋白(如福氏志贺氏菌IpaC)也属于作为分泌系统的一部分的细菌蛋白类。如果对真核细胞有毒力的细菌效应蛋白对于分泌系统的功能而言也是重要的，那么这种蛋白就被排除在这个定义之外。对真核细胞有毒力的T3SS效应蛋白是指蛋白如小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE、YopH、YopJ、YopM、YopO、YopP、YopT或福氏志贺氏菌OspF、IpgD、IpgB1或肠道沙门氏菌SopE、SopB、SptP或铜绿假单胞菌ExoS、ExoT、ExoU、ExoY或大肠杆菌Tir、Map、EspF、EspG、EspH、EspZ。对真核细胞有毒力的T4SS效应蛋白是指蛋白如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)LidA、SidC、SidG、SidH、SdhA、SidJ、SdjA、SdeA、SdeA、SdeC、LepA、LepB、WipA、WipB、YlfA、YlfB、VipA、VipF、VipD、VpdA、VpdB、DrrA、LegL3、LegL5、LegL7、LegLC4、LegLC8、LegC5、LegG2、Ceg10、Ceg23、Ceg29或汉斯巴尔通体(Bartonella henselae)BepA、BepB、BepC、BepD、BepE、BepF BepG或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)VirD2、VirE2、VirE3、VirF或幽门螺杆菌(H.Pylori)CagA或百日咳博德特氏菌百日咳毒素。对真核细胞有毒力的T6SS效应蛋白是指蛋白如霍乱弧菌VgrG蛋白(如VgrG1)。
如本文所用的术语“对真核细胞有毒力的T3SS效应蛋白”或“对真核细胞有毒力的细菌T3SS效应蛋白”是指由T3S系统天然注入到真核细胞的胞质溶胶中的蛋白，以及由T3S系统天然分泌的可能例如形成进入真核细胞膜的转运孔的蛋白，其是真核细胞的毒力因子，即，是指使真核细胞麻痹或重编程以使病原体受益的蛋白。效应因子显示出大量的生物化学活性，并调节关键宿主调节系统的功能，例如，吞噬作用和肌动蛋白细胞骨架、炎症信号、细胞凋亡、内吞作用或分泌途径2,9，并且包括AvrA、AvrB、AvrBs2、AvrBS3、AvrBsT、AvrD、AvrD1、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2、AvrXv3、CigR、EspF、EspG、EspH、EspZ、ExoS、ExoT、GogB、GtgA、GtgE、GALA蛋白家族、HopAB2、HopAO1、HopI1、HopM1、HopN1、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、HopU1、HsvB、IcsB、IpaA、IpaH、IpaH7.8、IpaH9.8、IpgB1、IpgB2、IpgD、LcrV、Map、OspC1、OspE2、OspF、OspG、OspI、PipB、PipB2、PopB、PopP2、PthXo1、PthXo6、PthXo7、SifA、SifB、SipA/SspA、SlrP、SopA、SopB/SigD、SopD、SopE、SopE2、SpiC/SsaB、SptP、SpvB、SpvC、SrfH、SrfJ、Sse、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、SseI/SrfH、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SspH1、SspH2、SteA、SteB、SteC、SteD、SteE、TccP2、Tir、VirA、VirPphA、VopF、XopD、YopE、YopH、YopJ、YopM、YopO、YopP、YopT、YpkA。
对真核细胞有毒力并且可以从例如小肠结肠炎耶尔森氏菌中缺失/突变的耶尔森氏菌的T3SS效应基因是YopE、YopH、YopM、YopO、YopP(也称为YopJ)和YopT10。对真核细胞有毒力的各自的效应基因可以从福氏志贺菌(例如OspF、IpgD、IpgB1)、肠道沙门氏菌(例如SopE、SopB、SptP)、铜绿假单胞菌(例如ExoS、ExoT、ExoU、ExoY)或大肠杆菌(例如Tir、Map、EspF、EspG、EspH、EspZ)缺失/突变。这些基因的核酸序列是本领域技术人员可获得的，例如在基因库数据库中获得(来自NC_002120GI:10955536的yopH、yopO、yopE、yopP、yopM、yopT；来自AF386526.1GI:18462515的福氏志贺氏菌效应蛋白；来自NC_016810.1GI:378697983或FQ312003.1GI:301156631的肠道沙门氏菌效应子；来自AE004091.2GI:110227054或CP000438.1GI:115583796的铜绿假单胞菌效应子以及来自NC_011601.1GI:215485161的大肠杆菌效应蛋白)。
出于本发明的目的，基因用斜体小写字母表示以区别于蛋白。如果基因(由斜体小写字母表示)在细菌菌种名称(如大肠杆菌)之后，则它们指相应细菌菌种中相应基因的突变。例如，YopE是指由yopE基因编码的效应蛋白。小肠结肠炎耶尔森氏菌yopE代表在yopE基因中具有突变的小肠结肠炎耶尔森氏菌。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”、“多肽的”和“肽的”可互换使用以表示一系列氨基酸残基，其通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。优选的是氨基酸序列包含至少10个氨基酸，更优选至少20个氨基酸的蛋白。
根据本发明，“异源蛋白”包括天然存在的蛋白或其部分，并且还包括人工工程化的蛋白或其部分。如本文所使用的，术语“异源蛋白”是指可以与其融合的T3SS效应蛋白或其N-末端片段以外的蛋白或其部分。具体而言，本文所用的异源蛋白是指一种蛋白或其部分，其不属于由本发明提供并使用的特定重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的蛋白组(即完整天然蛋白集合)，例如，其不属于耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属的特定细菌菌株的蛋白组(即完整天然蛋白集合)。通常，异源蛋白是动物来源(包括人来源)的。优选地，异源蛋白是人蛋白或其部分。更优选地，所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节子、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报告蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。特别优选地，所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节子、锚蛋白重复蛋白、报告蛋白、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。甚至更特别优选的是选自由以下组成的组的异源蛋白：参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节子和锚蛋白重复蛋白。最优选的是参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白或参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，特别是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，如参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的动物(优选人)异源蛋白，或参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的人蛋白。参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白优选为参与诱导或调节I型干扰素(IFN)应答的蛋白，更优选为参与诱导或调节I型干扰素(IFN)应答的人蛋白。
在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含两个核苷酸序列，其编码相同或两种不同的异源蛋白，并彼此独立地与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3’末端框内融合。
在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含三个核苷酸序列，其编码相同或三种不同的异源蛋白，并彼此独立地与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3’末端框内融合。
由重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达的异源蛋白的分子量通常在1至150kD之间，优选1至120kD之间，更优选1至100kDa之间，最优选10至80kDa之间。
在一些实施方案中，异源蛋白的一部分包含异源蛋白的结构域。因此，在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含编码异源蛋白的结构域的核苷酸序列。优选地，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含编码异源蛋白的一个或两个结构域，更优选异源蛋白的两个结构域的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含一个核苷酸序列，其编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或更多个结构域，并与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3’末端框内融合。
如本文所用的术语“属于相同功能类别的蛋白的异源蛋白”是指具有相同功能的异源蛋白，例如，具有酶活性的异源蛋白、以相同途径(例如，细胞周期调控)起作用的异源蛋白或者具有相同特定特征(例如，属于同一类细菌效应蛋白)的异源蛋白。功能类别的蛋白有例如参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、作为细胞周期调节子起作用的蛋白、锚蛋白重复蛋白、细胞信号传导蛋白、参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、报告蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子或病毒蛋白，其在建立对真核细胞的毒力的生物过程中共同起作用。
根据本发明，“异源蛋白的结构域”包括天然存在的蛋白的结构域，并且还包括人工工程化的蛋白的结构域。如本文所用，术语“异源蛋白的结构域”是指T3SS效应蛋白的结构域之外的异源蛋白的结构域，或包含T3SS效应蛋白的N-末端片段的结构域(异源蛋白的结构域可以与其融合以得到融合蛋白)之外的结构域。具体而言，本文所用的异源蛋白结构域是指不属于由本发明提供并使用的特定重组革兰氏阴性细菌菌株的蛋白组(即完整天然蛋白补体)的异源蛋白结构域，例如，不属于耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属的特定细菌菌株的蛋白组(即，完整天然蛋白集合)的异源蛋白结构域。通常，异源蛋白的结构域是动物来源的，包括人类来源。优选地，异源蛋白的结构域是人蛋白的结构域。更优选地，异源蛋白的结构域选自由以下组成的组的蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、细胞周期调节子、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报告蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。特别优选地，异源蛋白的结构域选自由以下组成的组的蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、细胞周期调节子、锚蛋白重复蛋白、报告蛋白、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。甚至更特别优选的是选自由以下组成的组的异源蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白、细胞周期调节子和锚蛋白重复蛋白。最优选的是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，如参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的动物蛋白的结构域，优选参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的人异源蛋白的结构域。
本文所用的术语“异源蛋白的重复结构域”是指由异源蛋白结构域的几个重复组成的融合蛋白，其中这些结构域可以彼此直接融合，或者其中可以在结构域之间引入可变接头，例如1至30个氨基酸，优选2至15个氨基酸，更优选3至10个氨基酸的接头。优选地，使用重复的相同结构域，或氨基酸序列同一性超过80％，通常超过85％，优选超过90％，甚至更优选超过95％，特别是超过96％，更特别超过97％，甚至更特别超过98％，最特别超过99％的重复的结构域。同样优选的是氨基酸同一性为100％的相同结构域。优选地，本文提及的融合蛋白包含两个重复结构域，更优选两个重复的相同结构域，或氨基酸序列同一性超过90％，优选超过95％，最优选为100％的两个重复结构域。本发明还涵盖两个以上，例如三个、四个、五个或六个重复结构域。
本文所用的术语“不同异源蛋白的两个或更多个结构域”是指由不同异源蛋白的至少两个结构域(例如氨基酸序列同一性为80％或更少，优选60％或更少，更优选40％或更少的异源蛋白的至少两个结构域)的一个或几个重复组成的融合蛋白，其中这些不同的结构域可以彼此直接融合，或者其中可以在结构域之间引入可变接头，例如1至30个氨基酸，优选2至15个氨基酸，更优选3至10个氨基酸的接头。优选地，本文提及的融合蛋白包含了不同异源蛋白的两个结构域。本发明还涵盖不同异源蛋白的两个以上，例如三个、四个、五个或六个结构域。
由重组革兰氏阴性细菌菌株表达的异源蛋白的结构域的分子量通常在1-50kD之间，优选1-30kD之间，更优选1-20kDa之间，最优选1-10kDa之间。
根据本发明，“参与诱导或调节IFN应答的蛋白”包括但不限于cGAS、STING、TRIF、TBK1、IKKepsilon、IRF3、TREX1、VPS34、ATG9a、DDX3、LC3、DDX41、IFI16、MRE11、DNA-PK、RIG1、MDA5、LGP2、IPS-1/MAVS/Cardif/VISA、Trim25、Trim32、Trim56、Riplet、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TANK、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、PKR、TLR3、TLR7、TLR9、DAI、IFI16、IFIX、MRE11、DDX41、LSm14A、LRRFIP1、DHX9、DHX36、DHX29、DHX15、Ku70、IFNAR1、IFNAR2、TYK2、JAK1、ISGF3、IL10R2、IFNLR1、IFNGR1、IFNGR2、JAK2、STAT4、环状二核苷酸生成酶(环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶)如WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS或其片段。
根据本发明，“参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白”包括但不限于cGAS、STING、TRIF、TBK1、IKKepsilon、IRF3、TREX1、VPS34、ATG9a、DDX3、LC3、DDX41、IFI16、MRE11、DNA-PK、RIG1、MDA5、LGP2、IPS-1/MAVS/Cardif/VISA、Trim25、Trim32、Trim56、Riplet、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TANK、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、PKR、TLR3、TLR7、TLR9、DAI、IFI16、IFIX、MRE11、DDX41、LSm14A、LRRFIP1、DHX9、DHX36、DHX29、DHX15、Ku70、环状二核苷酸生成酶(环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶)如WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS或其片段。
参与诱导或调节I型IFN应答的优选的蛋白选自由以下组成的组：cGAS、STING、TRIF、TBK1、IKKepsilon、IRF3、TREX1、VPS34、ATG9a、DDX3、LC3、DDX41、IFI16、MRE11、DNA-PK、RIG1、MDA5、LGP2、IPS-1/MAVS/Cardif/VISA、Trim25、Trim32、Trim56、Riplet、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TANK、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、PKR、LSm14A、LRRFIP1、DHX29、DHX15和环状二核苷酸生成酶例如环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶，其选自由以下组成的组：WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS或其片段。
参与诱导或调节I型IFN应答的更优选的蛋白选自由以下组成的组：cGAS(如人蛋白的Uniprot.Q8N884)、RIG1(如人蛋白的Uniprot.O95786)、MDA5(如人蛋白的Uniprot.Q9BYX4)、IPS-1/MAVS(如人蛋白的Uniprot.Q7Z434)、IRF3(如人蛋白的Uniprot.Q14653)、IRF7(如人蛋白的Uniprot.Q92985)、IRF9(如人蛋白的Uniprot.Q00978)和环状二核苷酸生成酶例如环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶，其选自由以下组成的组：WspR(如铜绿假单胞菌蛋白的Uniprot.Q9HXT9)、DncV(如霍乱弧菌蛋白的Uniprot.Q9KVG7)、DisA和DisA样(如蜡样芽孢杆菌蛋白的Uniprot.Q812L9)、CdaA(如单核细胞增生利斯特氏菌蛋白的Uniprot.Q8Y5E4)、CdaS(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)蛋白的Uniprot.O31854或如Seq ID No.114所示的组成型活性L44F突变)和cGAS(如人蛋白的Uniprot.Q8N884)或这些蛋白的片段。
IPS-1/MAVS/Cardif/VISA是指包含N-末端CARD结构域的真核线粒体抗病毒信号蛋白，对于人类序列，其Uniprot(www.uniprot.org)标识符为“Q7Z434”，对于鼠序列为“Q8VCF0”。术语“IPS-1/MAVS”、“MAVS/IPS-1”和“MAVS”在本文中可互换使用，并且是指包含N-末端CARD结构域的真核线粒体抗病毒信号蛋白，对于人类序列，其Uniprot(www.uniprot.org)标识符为“Q7Z434”，对于鼠序列为“Q8VCF0”。
在一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：含CARD结构域的蛋白或其片段和环状二核苷酸生成酶例如环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶或其片段。
参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的异源蛋白的片段通常含有25至1000个氨基酸，优选50至600个氨基酸，更优选100至400个氨基酸，甚至更优选100至362个氨基酸。在一些实施方案中，参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的异源蛋白的片段包含参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的异源蛋白的N-末端片段，其通常含有25至1000个氨基酸，优选50至600个氨基酸，更优选100至400个氨基酸，甚至更优选100至362个氨基酸，特别是100至246个氨基酸，或者包含参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的异源蛋白的N-末端片段，其缺失了含有N-末端氨基酸的第1位氨基酸1至第160位氨基酸之间的氨基酸序列，优选地缺失了含有N-末端第1-59位氨基酸或N-末端第1-160位氨基酸的氨基酸序列，并且其中，参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的异源蛋白的N-末端片段通常含有25至1000个氨基酸，优选50至600个氨基酸，更优选100至400个氨基酸，甚至更优选100至362个氨基酸。
参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的含有CARD结构域的异源蛋白的片段通常含有从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-500位氨基酸的氨基酸序列，优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-400位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100300位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-294位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-246位氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的含有CARD结构域的异源蛋白的片段含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含人CARD结构域的至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第294位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第246位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第229位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第218位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第101位氨基酸的氨基酸序列，更具体地，选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，参与诱导或调节IFN应答或I型IFN应答的含有CARD结构域的异源蛋白的片段含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：从N-末端第1位氨基酸至N-末端第294位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第246位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第229位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第218位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第101位氨基酸的氨基酸序列，更具体地，选自由以下组成的组的氨基酸序列：人CARD结构域的从N-末端第1位氨基酸至N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列和从N-末端第1位氨基酸至N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列。
环状二核苷酸生成酶(例如环-二-AMP、环-二-GMP和环-二-GAMP环化酶)的片段通常包含人cGAS的从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-600位氨基酸的氨基酸序列，优选从N-末端第50位氨基酸至N-末端任意第100-550位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第60位氨基酸至N-末端任意第100-530位氨基酸的氨基酸序列，特别是从N-末端第60位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列，从N-末端第146位氨基酸至N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列，或从N-末端第161位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列，更特别是从N-末端第161位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，cGAS的片段特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含至少N-末端第60位氨基酸和不超过N-末端第422位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第146位氨基酸和不超过N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第161位氨基酸和不超过N-末端第522位氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，cGAS的片段更特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：从N-末端第60位氨基酸至N-末端第422位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第146位氨基酸至N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列和从N-末端第161位氨基酸至N-末端第522位氨基酸的氨基酸序列。
在更优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：包含CARD结构域的RIG1、MDA5和MAVS/IPS-1或其片段和cGAS及其片段，特别是选自由以下组成的组：包含CARD结构域的RIG1及其片段、包含CARD结构域的MAVS/IPS-1及其片段和cGAS及其片段。这些蛋白的片段是特别优选的。在该更优选的实施方案中，包含CARD结构域的RIG1、MDA5、MAVS/IPS-1包含天然存在的CARD结构域，并且另外地，在RIG-1或其片段的情况下，在天然存在的CARD结构域之后包含C-末端氨基酸，所述C-末端氨基酸包含天然存在的解旋酶结构域或其片段，优选含有1-500个，更优选1-250个，甚至更优选1-150个氨基酸的片段，其中天然存在的解旋酶结构域或其片段不起作用，即不结合CARD结构域，或者，在MAVS/IPS-1的情况下，包含下游C-末端序列或其片段，优选包含1-500个，更优选1-250个，甚至更优选1-150个氨基酸的片段。在这些实施方案中，cGAS及其片段通常包含天然存在的合酶结构域(NTase核心和C-末端结构域；如65中所述的和如人蛋白Uniprot.Q8N884的人cGAS的第160-522位氨基酸)，优选地，cGAS及其片段包含天然存在的合酶结构域，但缺失部分或完整的N-末端结构域，优选缺失完整的N-末端螺旋(heclical)延伸(N-末端螺旋延伸；如65中所述的和如人蛋白Uniprot.Q8N884的人cGAS的第1-160位氨基酸)。部分或完整N-末端结构域的缺失优选是第1-59位氨基酸的缺失。
在一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：RIG-I样受体(RLR)家族(如RIG1和MDA5)及其片段、参与抗病毒信号传导和I型IFN诱导的其他含有CARD结构域的蛋白(如MAVS/IPS-1)及其片段和导致STING刺激的环状二核苷酸生成酶例如环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶，其选自由以下组成的组：WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS及其片段。
在一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：RIG1、MDA5、LGP2、MAVS/IPS-1、WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS或其片段，更优选地，选自由以下组成的组：RIG1、WspR、DncV、DisA样和cGAS或其片段。
在一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白选自由以下组成的组：RIG1、MDA5、MAVS/IPS-1、WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA和cGAS或其片段，甚至更优选地，选自由以下组成的组：RIG1、MDA5、MAVS/IPS-1、WspR、DncV、DisA样、CdaA和cGAS或其片段，特别是选自由以下组成的组：RIG1、MAVS/IPS-1和cGAS或其片段。这些蛋白的片段是特别优选的。
在该更优选的实施方案中，RIG1、MDA5、MAVS/IPS-1的片段通常含有从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-500位氨基酸的氨基酸序列，优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-400位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-300位氨基酸的氨基酸序列。
在该更优选的实施方案中，RIG1的片段含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第246位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第229位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第218位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列；并且，MAVS/IPS-1的片段含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第1位氨基酸和不超过N-末端第101位氨基酸的氨基酸序列。
在该更优选的实施方案中，RIG1的片段更特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：从N-末端第1位氨基酸至N-末端第246位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第245位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第229位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第228位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第1位氨基酸至N-末端第218位氨基酸的氨基酸序列和从N-末端第1位氨基酸至N-末端第217位氨基酸的氨基酸序列；并且，MAVS/IPS-1的片段更特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：从N-末端第1位氨基酸至N-末端第100位氨基酸的氨基酸序列和从N-末端第1位氨基酸至N-末端第101位氨基酸的氨基酸序列。
在该更优选的实施方案中，cGAS的片段通常含有人cGAS的从N-末端第1位氨基酸至N-末端任意第100-600位氨基酸的氨基酸序列，优选从N-末端第50位氨基酸至N-末端任意第100-550位氨基酸的氨基酸序列，更优选从N-末端第60位氨基酸至N-末端任意第100-530位氨基酸的氨基酸序列，特别是从N-末端第60位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列，从N-末端第146位氨基酸至N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列，或从N-末端第161位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列，更特别是从N-末端第60位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列，或从N-末端第161位氨基酸至N-末端第530位氨基酸的氨基酸序列。
在该更优选的实施方案中，cGAS的片段特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：包含至少N-末端第60位氨基酸和不超过N-末端第422位氨基酸的氨基酸序列、包含至少N-末端第146位氨基酸和不超过N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列和包含至少N-末端第161位氨基酸和不超过N-末端第522位氨基酸的氨基酸序列。
在该更优选的实施方案中，cGAS的片段更特别地含有选自由以下组成的组的氨基酸序列：从N-末端第60位氨基酸至N-末端第422位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第146位氨基酸至N-末端第507位氨基酸的氨基酸序列、从N-末端第161位氨基酸至N-末端第522位氨基酸的氨基酸序列。
在甚至更优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白选自由以下组成的组：人RIG1 CARD结构域1-245(SEQ ID NO：37)、人RIG1 CARD结构域1-228(SEQ ID NO：128)、人RIG1 CARD结构域1-217(SEQ ID NO：129)、鼠RIG1 CARD结构域1-246(SEQ ID NO：38)、鼠RIG1 CARD结构域1-229(SEQ ID NO：110)、鼠RIG1 CARD结构域1-218(SEQ ID NO：111)、人MAVSCARD结构域1-100(SEQ ID NO：116)、鼠MAVS CARD结构域1-101(SEQ ID NO：130)、新星海葵(N.vectensis)cGAS(SEQ ID NO：43)、人cGAS161-522(SEQ ID NO：115)、鼠cGAS146-507(SEQ IDNO：131)和新星海葵新星海葵cGAS60-422(SEQ ID NO：117)。
在一个特别优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白选自由以下组成的组：人RIG1 CARD结构域1-245(SEQ ID NO：37)、人RIG1 CARD结构域1-228(SEQ ID NO：128)、人RIG1 CARD结构域1-217(SEQ ID NO：129)、人MAVS CARD结构域1-100(SEQ ID NO：116)和人cGAS161-522(SEQ ID NO：115)。
在更特别的一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白选自由以下组成的组：人RIG1 CARD结构域1-245、鼠RIG1 CARD结构域1-246、鼠RIG1 CARD结构域1-229、鼠RIG1CARD结构域1-218、人MAVS1-100、新星海葵cGAS、人cGAS161-522和新星海葵cGAS60-422。
RIG-I样受体(RLR)家族包含选自由以下组成的组的蛋白：RIG1、MDA5和LGP2。参与诱导或调节I型IFN应答的优选异源蛋白是含有CARD结构域的蛋白RIG1和MDA5的，特别是含有CARD结构域的蛋白RIG1。参与I型IFN诱导的其他含有CARD结构域的蛋白包括选自由以下组成的组的蛋白：MAVS/IPS-1。
在一些优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自下组：包含RIG1的CARD结构域、MDA5的CARD结构域和/或MAVS/IPS-1的CARD结构域的蛋白和WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS及其片段，优选地选自下组：包含RIG1的CARD结构域和/或MAVS/IPS-1的CARD结构域的蛋白和WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA和cGAS或其片段。
在一些优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：RIG1的CARD结构域、MDA5的CARD结构域、MAVS/IPS-1的CARD结构域、WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS，更优选地，选自由以下组成的组：RIG1的CARD结构域、WspR、DncV、DisA样和cGAS。
在一些优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白包含一个或多个(例如，两个、三个或四个)CARD结构域，优选包含RIG1、MDA5和/或MAVS/IPS-1的(优选RIG1和/或MAVS/IPS-1的)一个或多个(例如，两个、三个或四个)CARD结构域。在更优选的实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白包括RIG1或MDA5(特别是RIG1)的CARD结构域。
在一些实施方案中，参与诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：不具有酶功能的I型IFN应答诱导蛋白或具有酶功能的I型IFN应答诱导蛋白。本发明包括的不具有酶功能的I型IFN应答诱导蛋白通常包含至少一个CARD结构域，优选两个CARD结构域。CARD结构域通常由六至七个α-螺旋的束，优选六至七个反平行α螺旋的排列(其具有疏水核心和由带电残基组成的外表面)组成。本发明包括的具有酶功能的I型IFN应答诱导蛋白通常包含环状二核苷酸生成酶(环状-二-AMP、环状-二-GMP和环状-二-GAMP环化酶)或导致STING刺激的其结构域，优选二-腺苷酸-环化酶(DAC)、二-甘油酸-环化酶(DGC)或GMP-AMP-环化酶(GAC)或其结构域。
根据本发明，“参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白”包括但不限于Bad、Bcl2、Bak、Bmt、Bax、Puma、Noxa、Bim、Bcl-xL、Apaf1、半胱天冬酶9、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶10、DFFA、DFFB、ROCK1、APP、CAD、ICAD、CAD、EndoG、AIF、HtrA2、Smac/Diablo、Arts、ATM、ATR、Bok/Mtd、Bmf、Mcl-1(S)、IAP家族、LC8、PP2B、14-3-3蛋白、PKA、PKC、PI3K、Erk1/2、p90RSK、TRAF2、TRADD、FADD、Daxx、半胱天冬酶8、半胱天冬酶2、RIP、RAIDD、MKK7、JNK、FLIPs、FKHR、GSK3、CDKs及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))、以及Cip1/Waf1/Kip1-2-家族(p21(Cip1/Waf1)、p27(Kip1)、p57(Kip2)。优选地，使用Bad、Bmt、Bcl2、Bak、Bax、Puma、Noxa、Bim、Bcl-xL、半胱天冬酶9、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、Smac/Diablo、Bok/Mtd、Bmf、Mcl-1(S)、LC8、PP2B、TRADD、Daxx、半胱天冬酶11、半胱天冬酶2、RIP、RAIDD、FKHR、CDKs及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))，最优选地，使用BIM、Bid、截短型Bid、FADD、半胱天冬酶3(及其亚基)、Bax、Bad、Akt、CDKs及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))11-13。此外，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白包括DIVA、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bid和tBid、Egl-1、Bcl-Gs、细胞色素C(Cytochrome C)、Beclin、CED-13、BNIP1、BNIP3、Bcl-B、Bcl-W、Ced-9、A1、NR13、Bfl-1、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶8。
参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白选自由以下组成的组：促细胞凋亡蛋白、抗细胞凋亡蛋白、细胞凋亡预防途径的抑制剂和促存活信号转导或途径的抑制剂。促细胞凋亡蛋白包含选自由以下组成的组的蛋白：Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Apaf1、Smac/Diablo、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin1、Egl-1和CED-13、细胞色素C、FADD、半胱天冬酶家族和CDKs及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))，或选自由以下组成的组的蛋白：Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Egl-1、Apaf1、Smac/Diablo、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin 1、Egl-1和CED-13、细胞色素C、FADD和半胱天冬酶家族。优选的是Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Egl-1、Apaf1、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin 1、Egl-1和CED-13、Smac/Diablo、FADD、半胱天冬酶家族、CDKs及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))。同样优选的是Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Apaf1、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin 1、Egl-1和CED-13、Smac/Diablo、FADD、半胱天冬酶家族。
抗细胞凋亡蛋白包括选自由以下组成的组的蛋白：Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-B、Bcl-W、Mcl-1、Ced-9、A1、NR13、IAP家族和Bfl-1。优选的是Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-B、Bcl-W、Mcl-1、Ced-9、A1、NR13和Bfl-1。
细胞凋亡预防途径的抑制剂包括选自由以下组成的组的蛋白：Bad、Noxa和Cdc25A。优选的是Bad和Noxa。
促存活信号转导或途径的抑制剂包含选自由以下组成的组的蛋白：PTEN、ROCK、PP2A、PHLPP、JNK、p38。优选的是PTEN、ROCK、PP2A和PHLPP。
在一些实施方案中，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白选自由以下组成的组：BH3-only蛋白、半胱天冬酶和控制细胞凋亡的死亡受体的细胞内信号转导蛋白。BH3-only蛋白是优选的。
BH3-only蛋白包含选自由以下组成的组的蛋白：Bad、BIM、Bid和tBid、Puma、Bik/Nbk、Bod、Hrk/Dp5、BNIP1、BNIP3、Bmf、Noxa、Mcl-1、Bcl-Gs、Beclin 1、Egl-1和CED-13。优选的是Bad、BIM、Bid和tBid，特别是tBid。
半胱天冬酶包含选自由以下组成的组的蛋白：半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10。优选的是半胱天冬酶3、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9。
控制细胞凋亡的死亡受体的细胞内信号转导蛋白包括选自由以下组成的组的蛋白：FADD、TRADD、ASC、BAP31、GULP1/CED-6、CIDEA、MFG-E8、CIDEC、RIPK1/RIP1、CRADD、RIPK3/RIP3、Crk、SHB、CrkL、DAXX、14-3-3家族、FLIP、DFF40和45、PEA-15、SODD。优选的是FADD和TRADD。
在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌菌株包含两种参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白，其中一种蛋白是促细胞凋亡蛋白，另一种蛋白是细胞凋亡预防途径的抑制剂，或者其中一种蛋白是促细胞凋亡蛋白，另一种蛋白是促存活信号转导或途径的抑制剂。
本发明所涵盖的促细胞凋亡蛋白通常具有α螺旋结构，优选被两亲性螺旋包围的疏水性螺旋，并且通常包含BH1、BH2、BH3或BH4结构域中的至少一种，优选包含至少一个BH3结构域。通常，本发明所涵盖的促细胞凋亡蛋白不具有酶活性。
本发明所涵盖的抗细胞凋亡蛋白通常具有α螺旋结构，优选被两亲性螺旋包围的疏水性螺旋，并且包含不同BH1、BH2、BH3和BH4结构域的组合，优选其中存在BH1和BH2结构域的不同BH1、BH2、BH3和BH4结构域的组合，更优选BH4-BH3-BH1-BH2、BH1-BH2、BH4-BH1-BH2或BH3-BH1-BH2(从N-末端至C-末端)。此外，还涵盖了含有至少一个BIR结构域的蛋白。
本发明所涵盖的细胞凋亡预防途径的抑制剂通常具有α螺旋结构，优选被两亲性螺旋包围的疏水性螺旋，并且通常包含一个BH3结构域。
BH1、BH2、BH3或BH4结构域的长度各自通常为约5至约50个氨基酸。因此，在一些实施方案中，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白选自由以下组成的组：长度为约5至约200，优选约5至约150，更优选约5至约100，最优选约5至约50，特别是约5至约25个氨基酸的参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白。
在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白的两个结构域，优选参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白的两个重复结构域，更优选两个相同的重复结构域，或者参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的不同蛋白的两个结构域，最优选参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白的两个相同的重复结构域。在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白的两个结构域，其中一个是促细胞凋亡蛋白的结构域，另一个是作为细胞凋亡预防途径抑制剂的蛋白的结构域，或者其中一个是促细胞凋亡蛋白的结构域，另一个结构域是作为促存活信号转导或途径抑制剂的蛋白的结构域。
特别优选的异源蛋白是细胞凋亡诱导剂tBID的BH3结构域，更特别是包含选自由以下组成的组的序列的BH3结构域：SEQ ID NO：29-32，优选SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。同样优选的是细胞凋亡调节剂BAX的BH3结构域，更具体地是包含选自由以下组成的组的序列的BAX结构域：SEQ ID NO：33-36，优选SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。人和鼠序列在各SEQ ID NO中给出，但所有其他物种的tBID和BAX BH3结构域同样包括在内。
在一些实施方案中，异源蛋白的重复结构域是BH3结构域，优选细胞凋亡诱导剂tBID的重复BH3结构域，更优选由SEQ ID NO：29-32或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：19所包含的细胞凋亡诱导剂tBID的重复BH3结构域，甚至更优选细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域，最优选由SEQ ID NO：29-32或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：19所包含的细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域，特别是由SEQ ID NO：27序列所包含的细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域。因此，在优选的实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株和/或载体包含第二DNA序列，其编码BH3结构域的两个重复结构域，更优选细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域。两个重复结构域可以通过1-30个氨基酸长度，优选2-15个氨基酸，更优选3-10个氨基酸长的接头连接。
在一些实施方案中，不同异源蛋白的两个或更多个结构域是属于相同功能类别的蛋白的异源蛋白的结构域，优选地，两个或更多个结构域的不同异源蛋白是来自参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白类别的不同异源蛋白。在一个优选的实施方案中，不同异源蛋白的两个或更多个结构域是细胞凋亡诱导剂tBID的BH3结构域和细胞凋亡调节剂BAX的BH3结构域，特别是由SEQ ID NO：24和28的序列所包含的融合的BH3结构域。不同异源蛋白的两个结构域可以通过1-30个氨基酸长度，优选2-15个氨基酸，更优选3-10个氨基酸长的接头连接。
另一种特别优选的异源蛋白是参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白的结构域，更特别是RIG1的CARD结构域(其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：37、38、110、111、128、129)、MDA5的CARD结构域(其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：44-47、112、113，优选SEQ ID NO：112或113)或MAVS/IPS-1的CARD结构域(其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：116、48-49，优选SEQ ID NO：116)、全长cGAS例如新星海葵cGAS(SEQ IDNO：43)、人cGAS161-522(SEQ ID NO：115)、新星海葵cGAS60-422(SEQ ID NO：117)或鼠cGAS146-507(SEQ ID NO：131)。最特别是RIG1的CARD结构域(其包含选自由以下组成的组的序列：SEQID NO：37、38、110、111、128、129)、MAVS/IPS-1的CARD结构域蛋白(其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：116、48-49，优选SEQ ID NO：116)和全长cGAS例如新星海葵cGAS(SEQ ID NO：43)、人cGAS161-522(SEQ ID NO：115)、新星海葵cGAS60-422(SEQ ID NO：117)或鼠cGAS146-507(SEQ ID NO：131)。
在一些实施方案中，异源蛋白是前药转化(pro-drug converting)酶。在这些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达(优选表达并分泌)前药转化酶。本文所涉及的前药转化酶包括将无毒前药转化为有毒药物的酶，优选选自由以下组成的组的酶：胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷激酶、β-半乳糖苷酶、羧酸酯酶、硝基还原酶、羧肽酶和β-葡糖醛酸糖苷酶(beta-glucuronidase)，更优选选自由以下组成的组的酶：胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷激酶和β-半乳糖苷酶。
如本文所用的术语“蛋白酶切割位点”是指氨基酸序列内(例如蛋白或融合蛋白的氨基酸序列内)的特定氨基酸基序，其被识别该氨基酸基序的特定蛋白酶切割。请参阅14。蛋白酶切割位点的实例是被选自由以下组成的组的蛋白酶切割的氨基酸基序：肠激酶(轻链)、肠肽酶、脱落蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶(HRV 3C)、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa蛋白酶和凝血酶。
以下氨基酸基序被相应的蛋白酶识别：
-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys：肠激酶(轻链)/肠肽酶
-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro：PreScission蛋白酶/人鼻病毒蛋白酶(HRV3C)
-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser和基于Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser(其中X是任意氨基酸)的修饰基序，其被TEV蛋白酶(烟草蚀刻病毒)识别
-Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser：TVMV蛋白酶
-Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg：因子Xa蛋白酶
-Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser：凝血酶。
本文所用的蛋白酶切割位点涵盖泛素。因此，在一些优选的实施方案中，泛素被用作蛋白酶切割位点，核苷酸序列编码泛素作为蛋白酶切割位点，其可以在N-末端位点处被特异性泛素处理蛋白酶切割，例如其可以在融合蛋白已被递送至那里的细胞中在N-末端位点处被称为去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme)的特异性泛素处理蛋白酶内源性地切割。泛素在其C-末端被一组内源的泛素特异性C-末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)处理。DUB对泛素的切割应该精确发生在泛素的C-末端(G76后)。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类动物(包括人类和非人灵长类动物)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在优选的实施方案中，受试者是人。
术语“突变”在本文中用作通用术语，并且包括单个碱基对和多个碱基对的变化。这种突变可以包括取代、移码突变、缺失、插入和截短。
如本文所用的术语“核定位信号”是指对蛋白进行标记以输入到真核细胞的细胞核中的氨基酸序列，并且优选包括病毒核定位信号，例如SV40大T-抗原衍生的NLS(PPKKKRKV)。
如本文所用的术语“多克隆位点”是指短DNA序列，其含有多个限制性位点用于被限制性内切核酸酶切割，所述限制性内切核酸酶例如AclI、HindIII、SspI、MluCI、Tsp509I、PciI、AgeI、BspMI、BfuAI、SexAI、MluI、BceAI、HpyCH4IV、HpyCH4III、BaeI、BsaXI、AflIII、SpeI、BsrI、BmrI、BglII、AfeI、AluI、StuI、ScaI、ClaI、BspDI、PI-SceI、NsiI、AseI、SwaI、CspCI、MfeI、BssSI、BmgBI、PmlI、DraIII、AleI、EcoP15I、PvuII、AlwNI、BtsIMutI、TspRI、NdeI、NlaIII、CviAII、FatI、MslI、FspEI、XcmI、BstXI、PflMI、BccI、NcoI、BseYI、FauI、SmaI、XmaI、TspMI、Nt.CviPII、LpnPI、AciI、SacII、BsrBI、MspI、HpaII、ScrFI、BssKI、StyD4I、BsaJI、BslI、BtgI、NciI、AvrII、MnlI、BbvCI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、SbfI、Bpu10I、Bsu36I、EcoNI、HpyAV、BstNI、PspGI、StyI、BcgI、PvuI、BstUI、EagI、RsrII、BsiEI、BsiWI、BsmBI、Hpy99I、MspA1I、MspJI、SgrAI、BfaI、BspCNI、XhoI、EarI、AcuI、PstI、BpmI、DdeI、SfcI、AflII、BpuEI、SmlI、AvaI、BsoBI、MboII、BbsI、XmnI、BsmI、Nb.BsmI、EcoRI、HgaI、AatII、ZraI、Tth111I PflFI、PshAI、AhdI、DrdI、Eco53kI、SacI、BseRI、PleI、Nt.BstNBI、MlyI、HinfI、EcoRV、MboI、Sau3AI、DpnII BfuCI、DpnI、BsaBI、TfiI、BsrDI、Nb.BsrDI、BbvI、BtsI、Nb.BtsI、BstAPI、SfaNI、SphI、NmeAIII、NaeI、NgoMIV、BglI、AsiSI、BtgZI、HinP1I、HhaI、BssHII、NotI、Fnu4HI、Cac8I、MwoI、NheI、BmtI、SapI、BspQI、Nt.BspQI、BlpI、TseI、ApeKI、Bsp1286I、AlwI、Nt.AlwI、BamHI、FokI、BtsCI、HaeIII、PhoI、FseI、SfiI、NarI、KasI、SfoI、PluTI、AscI、EciI、BsmFI、ApaI、PspOMI、Sau96I、NlaIV、KpnI、Acc65I、BsaI、HphI、BstEII、AvaII、BanI、BaeGI、BsaHI、BanII、RsaI、CviQI、BstZ17I、BciVI、SalI、Nt.BsmAI、BsmAI、BcoDI、ApaLI、BsgI、AccI、Hpy166II、Tsp45I、HpaI、PmeI、HincII、BsiHKAI、ApoI、NspI、BsrFI、BstYI、HaeII、CviKI-1、EcoO109I、PpuMI、I-CeuI、SnaBI、I-SceI、BspHI、BspEI、MmeI、TaqαI、NruI、Hpy188I、Hpy188III、XbaI、BclI、HpyCH4V、FspI、PI-PspI、MscI、BsrGI、MseI、PacI、PsiI、BstBI、DraI、PspXI、BsaWI、BsaAI、EaeI，优选XhoI、XbaI、HindIII、NcoI、NotI、EcoRI、EcoRV、BamHI、NheI、SacI、SalI、BstBI。本文使用的术语“多克隆位点”进一步指用于重组事件(例如Gateway克隆策略)或用于例如Gibbson组装或topo克隆之类的方法的短DNA序列。
本文所用的术语“野生型菌株”或“野生型革兰氏阴性细菌菌株”是指天然存在的变体，或者含有允许使用载体的遗传修饰(例如限制性内切核酸酶或抗生素抗性基因的缺失突变)的天然存在的变体。这些菌株含有染色体DNA以及在某些情况下(如小肠结肠炎耶尔森氏菌、福氏志贺氏菌)含有未修饰的毒力质粒。
本文所用的术语“耶尔森氏菌野生型菌株”是指天然存在的变体(如小肠结肠炎耶尔森氏菌E40)，或者含有允许使用载体的遗传修饰(例如限制性内切核酸酶或抗生素抗性基因的缺失突变)的天然存在的变体(如小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS 40——小肠结肠炎耶尔森氏菌E40的氨苄青霉素敏感性衍生物)。这些菌株含有染色体DNA以及未修饰的毒力质粒(称为pYV)。
小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种是指低致病性的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，它与较高毒力的小肠结肠炎耶尔森氏菌亚种菌株形成对比15,16。与小肠结肠炎耶尔森氏菌enterocolitica亚种相比，小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种缺乏高致病性岛(high-pathogenicity island，HPI)。该HPI编码被称为耶尔森氏菌素的含铁铁载体17。小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种中耶尔森氏菌素的缺乏使该亚种的致病性降低，并且依赖于引入的全身可及的铁，以用于例如肝或脾中的持续感染17。在个体中可以使铁可到达细菌，例如通过用去铁胺(一种用于治疗患者铁过载的铁螯合剂)预处理18。
术语“包含”通常以包括的含义使用，也就是说允许存在一个或多个特征或组件。
术语“约”是指值±特定值的10％的范围。例如，短语“约200”包括200的±10％，或180至220。
在一方面，本发明提供了重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。
在另一方面，本发明提供了重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整(modulation)。
在另一方面，本发明提供了重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白。
另一方面，本发明提供了如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其用于治疗受试者的癌症的方法中，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。优选地，本发明提供了如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其用于治疗受试者的恶性实体肿瘤癌症的方法中，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在恶性实体肿瘤中积聚，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
在一些实施方案中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在对真核细胞有毒力的至少一种细菌效应蛋白的产生方面有缺陷。
在本发明的一个实施方案中，用核苷酸分子(例如载体)转化重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌效应蛋白的递送信号的第一核苷酸序列，其可操作地与所述启动子连接；
编码异源蛋白的第二核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列的3’末端框内融合。
在本发明的一个实施方案中，用核苷酸分子(例如载体)转化重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一核苷酸序列；
编码异源蛋白的第二核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列的3’末端框内融合。
优选地，编码异源蛋白的核苷酸序列在其3’末端侧接一条核苷酸序列，该核苷酸序列与染色体的核苷酸序列或内源毒力质粒在来自细菌效应蛋白的递送信号的3’末端的核苷酸序列或其片段同源。更优选地，在同源蛋白的3’末端侧接的该核苷酸序列与染色体上或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号的3’末端的10kbp内的核苷酸序列或其片段同源。具体地，在3’末端侧接同源蛋白的该核苷酸序列与染色体或内源毒力质粒上与来自细菌效应蛋白的递送信号相同的操纵子内的核苷酸序列或其片段同源。在该实施方案中，通常进行转化，使得融合的核苷酸序列通过同源重组插入重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的内源毒力质粒或染色体上，优选插入内源毒力质粒上，并且融合的核苷酸序列与内源毒力质粒或染色体的启动子，例如染色体致病岛的启动子可操作地连接。优选地，融合的核苷酸序列与内源毒力质粒的启动子可操作地连接。在该实施方案中，核苷酸序列包含来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段，优选其片段，其在染色体或在内源毒力质粒(优选内源毒力质粒)的同源位点处提供同源重组，以使核苷酸序列放置在染色体或内源毒力质粒递送信号(其与内源启动子可操作地连接)的3’末端的框内。
在本发明的另一个实施方案中，用核苷酸分子(优选DNA核苷酸分子)转化重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列和与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列，或者与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的片段的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列，其中来自细菌效应蛋白或其片段的递送信号在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的染色体上或内源毒力质粒上编码。优选地，与来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列位于编码异源蛋白的核苷酸序列的5’末端。更优选地，编码异源蛋白的核苷酸序列在其3’末端侧接一条核苷酸序列，该核苷酸序列与染色体或内源毒力质粒在来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端处的核苷酸序列同源。甚至更优选地，在3’末端侧接同源蛋白的该核苷酸序列与染色体上或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号的3’末端的10kbp内的核苷酸序列或其片段同源。具体地，在3’末端侧接同源蛋白的该核苷酸序列与染色体上或内源毒力质粒上与来自细菌效应蛋白的递送信号相同的操纵子内的核苷酸序列或其片段同源。在该实施方案中，进行转化，使得编码异源蛋白的核苷酸序列插入在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的内源毒力质粒或染色体上，优选内源毒力质粒上，在来自由染色体或内源毒力质粒编码的细菌效应蛋白的递送信号的3’末端处，其中与递送信号融合的异源蛋白被表达并分泌。
在本发明的一个实施方案中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。通常，内源毒力质粒上编码生长所必需的内源蛋白的基因编码由缺失的染色体基因编码的生长所必需的相同内源蛋白。优选地，位于内源毒力质粒上的编码生长所必需的内源酶的基因包含其内源启动子及其内源转录终止子。在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，编码生长所必需的内源酶的基因位于内源毒力质粒pYV上，并且优选包含其内源启动子及其内源转录终止子。编码生长所必需的内源酶的基因、内源启动子和内源转录终止子优选位于内源毒力质粒(例如pYV)上的orf155起点(SycO)的上游122bp处。编码生长所必需的内源酶的基因、内源启动子和内源转录终止子通常取代pYVe40(小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40和E40菌株的毒力质粒)中发现的插入序列，而非pYVe227(小肠结肠炎耶尔森氏菌W227O3的毒力质粒)(Genbank：AF102990.1)中的。
在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，内源毒力质粒是pYV(plasmid of Yersinia Virulence)。在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，用于插入的内源位置是以下之一：被称为SpiI或SpiII(沙门氏菌致病岛)的基因簇、其中效应蛋白在其他地方编码的位置或者是沙门氏菌毒力质粒(Salmonellavirulence plasmid，SVP)。
优选地，将与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合的编码异源蛋白的核苷酸序列插入在内源毒力质粒的细菌效应蛋白的天然位点处，例如毒力因子的天然位点处，优选地，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，插入在YopE或另一Yop(YopH、YopO、YopP、YopM、YopT)的天然位点处，优选在YopE的天然位点处，或者，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，插入在SpiI、SpiII内编码的或他处编码的效应蛋白的天然位点处，优选在SpiI或SpiII内编码的效应蛋白的天然位点处，更优选地在SopE或SteA的天然位点处。优选地，将与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合的编码异源蛋白的核苷酸序列可操作地与内源毒力质粒上存在的细菌效应蛋白的天然启动子连接，例如，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，与如下所述来自耶尔森氏菌virulon基因的天然启动子连接，更优选地，与天然YopE启动子或另一种Yop(YopH、YopO、YopP、YopM、YopT)启动子连接，优选与天然YopE启动子连接，或者，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，与如下所述来自SpiI或SpiII致病岛或来自他处编码的效应蛋白的天然启动子连接，更优选地与天然SopE、InvB或SteA启动子连接。
在本发明的一个实施方案中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因，其中，编码生长所必需的内源蛋白的基因选自编码氨基酸产生所必需的酶的基因、编码参与肽聚糖生物合成的酶的基因、编码参与LPS生物合成的酶的基因、编码参与核苷酸合成的酶的基因和编码翻译起始因子的基因。
在本发明的一个实施方案中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因，并且其中，编码生长所必需的内源蛋白的基因是编码氨基酸产生所必需的酶的基因，其中，氨基酸产生所必需的酶选自由以下组成的组：天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(asd)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、色氨酰tRNA合成酶(trpS)或丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)或转酮醇酶1(Transketolase 1)(tktA)、转酮酶醇2(tktB)、核酮糖-磷酸3-差向异构酶(rpe)、核糖-5-磷酸异构酶A(rpiA)、转醛醇酶A(Transaldolase A)(talA)、转醛醇酶B(talB)、磷酸核糖焦磷酸合酶(prs)、ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、组氨酸生物合成双功能蛋白HisIE(hisI)、1-(5-磷酸核糖基)-5-[(5-磷酸核糖基氨基)亚甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺异构酶(hisA)、咪唑甘油磷酸合酶亚基HisH(hisH)、咪唑甘油磷酸合酶亚基HisF(hisF)、组氨酸生物合成双功能蛋白HisB(hisB)、组氨醇-磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇脱氢酶(hisD)、3-脱氢喹啉合酶(aroB)、3-脱氢喹啉脱水酶(aroD)、莽草酸脱氢酶(NADP(+))(aroE)、莽草酸激酶2(aroL)、莽草酸激酶1(aroK)、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶(aroA)、分支酸(Chorismate)合酶(aroC)、P-蛋白(pheA)、T-蛋白(tyrA)、芳香族氨基酸氨基转移酶(tyrB)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroG)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroH)、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶(aroF)、奎宁酸/莽草酸脱氢酶(ydiB)、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1(pfkA)、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2(pfkB)、2类果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)、1类果糖二磷酸醛缩酶(fbaB)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、丙酮酸激酶I(pykF)、丙酮酸激酶II(pykA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、2,3-双磷酸甘油酸依赖性磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、2,3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶(gpmM/yibO)、可能的磷酸甘油酸变位酶(ytjC/gpmB)、烯醇酶(eno)、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)、磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)、L-丝氨酸脱水酶1(sdaA)、L-丝氨酸脱水酶2(sdaB)、分解代谢的L-苏氨酸脱水酶(tdcB)、生物合成的L-苏氨酸脱水酶(ilvA)、L-丝氨酸脱水酶(tdcG)、丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、半胱氨酸合酶A(cysK)、半胱氨酸合酶B(cysM)、β-胱硫醚酶(malY)、胱硫醚β-裂解酶(metC)、5-甲基四氢蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(metE)、甲硫氨酸合酶(metH)、S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)、胱硫醚γ-合酶(metB)、高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、5'-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(mtnN)、S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(luxS)、胱硫醚β裂解酶、胱硫醚γ裂解酶、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)、甘氨酸羟甲基转移酶(itaE)、3-异丙基苹果酸脱水酶小亚基(leuD)、3-异丙基苹果酸脱水酶大亚基(leuC)、3-异丙基苹果酸脱氢酶(leuB)、生物合成的L-苏氨酸脱水酶(ilvA)、乙酰乳酸合酶同工酶3大亚基(ilvI)、乙酰乳酸合酶同工酶3小亚基(ilvH)、乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基(ilvN)、乙酰乳酸合酶同工酶2小亚基(ilvM)、酮酸还原异构酶(NADP(+))(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1(thrA)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶2(metL)、2-异丙基苹果酸合酶(leuA)、谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(alaA)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1(thrA)、双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶2(metL)、赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3(lysC)、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、2-酮-3-脱氧-半乳糖醛酸醛缩酶(yagE)、4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、二氨基庚二酸表异构酶(dapF)、推定的裂解酶(Putative lyase)(yjhH)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶B(acnB)、乌头酸水合酶A(acnA)、未表征的推定的乌头酸水合酶(ybhJ)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(alaA)、谷氨酸合酶[NADPH]大链(gltB)、谷氨酸合酶[NADPH]小链(gltD)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、氨基酸乙酰转移酶(argA)、乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶链F(argF)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I(argI)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂解酶(argH)、谷氨酸5-激酶(proB)、γ-谷氨酰基磷酸还原酶(proA)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(proC)、鸟氨酸环脱氨酶、亮氨酸-tRNA连接酶(leuS)、谷氨酰胺-tRNA连接酶(glnS)、丝氨酸-tRNA连接酶(serS)、甘氨酸-tRNA连接酶β亚基(glyS)、甘氨酸-tRNA连接酶α亚基(glyQ)、酪氨酸-tRNA连接酶(tyrS)、苏氨酸-tRNA连接酶(thrS)、苯丙氨酸-tRNA连接酶α亚基(pheS)、苯丙氨酸-tRNA连接酶β亚基(pheT)、精氨酸-tRNA连接酶(argS)、组氨酸-tRNA连接酶(hisS)、缬氨酸-tRNA连接酶(valS)、丙氨酸-tRNA连接酶(alaS)、异亮氨酸-tRNA连接酶(ileS)、脯氨酸-tRNA连接酶(proS)、半胱氨酸-tRNA连接酶(cysS)、天冬酰胺-tRNA连接酶(asnS)、天冬氨酸-tRNA连接酶(aspS)、谷氨酸-tRNA连接酶(gltX)、色氨酸-tRNA连接酶(trpS)、甘氨酸-tRNA连接酶β亚基(glyS)、甲硫氨酸-tRNA连接酶(metG)、赖氨酸-tRNA连接酶(lysS)。优选的氨基酸产生所必需的酶是tktA、rpe、prs、aroK、tyrB、aroH、fbaA、gapA、pgk、eno、tdcG、cysE、metK、glyA、asd、dapA/B/D/E/F、argC、proC、leuS、glnS、serS、glyS/Q、tyrS、thrS、pheS/T、argS、hisS、valS、alaS、ileS、proS、cysS、asnS、aspS、gltX、trpS、glyS、metG、lysS，更优选的是asd、glyA、leuS、glnS、serS、glyS/Q、tyrS、thrS、pheS/T、argS、hisS、valS、alaS、ileS、proS、cysS、asnS、aspS、gltX、trpS、glyS、metG、lysS，最优选的是asd。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包括位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整。位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整可以是RNA热传感器区域内的缺失、插入或取代。缺失或插入通常包含一个或几个，优选约30个至约100个核苷酸，更优选约40个至约60个核苷酸的缺失或插入。取代通常为一个或几个，优选约3个至约30个核苷酸，更优选约3个至约15个核苷酸的取代。优选地，位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因的上游的RNA热传感器区域内的调整是位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因的上游的RNA热传感器区域内的缺失，优选约30至约100个核苷酸，更优选约40至约60个核苷酸的缺失。内源AraC型DNA结合蛋白和位于编码AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域通常位于重组减毒革兰氏阴性细菌菌株所包含的内源毒力质粒上。内源AraC型DNA结合蛋白优选地选自由以下组成的组：VirF、LcrF、MxiE、ExsA、PerA、HrpX、HrpB、GadX、HilC、HilD和InvF。更优选地，内源AraC型DNA结合蛋白选自由以下组成的组：VirF和LcrF。在一些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌，内源AraC型DNA结合蛋白是VirF。优选地，位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整包括干扰位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA发夹，优选发夹I的调整。更优选地，位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整包含缺失，其去除了位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因的上游的RNA发夹结构或其部分，优选发夹I的一部分。去除RNA发夹结构或其部分的缺失通常包含约30至约100个核苷酸，优选约40至约60个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，重组毒力减毒的革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterolitica)，所述缺失包含位于virF的编码序列的上游第-111至-57位核苷酸(其中-1是virF编码序列的ATG起始密码子的A的上游1个碱基)的缺失。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属。在一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属和沙门氏菌属。优选地，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，更优选是小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株。最优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌E40(O：9，生物型2型)19或其氨苄青霉素敏感性衍生物，如20中所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40(也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40)。小肠结肠炎耶尔森氏菌E40以及如20中所述的其衍生物小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40等同于小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种E40以及如15,17,21中所述的其衍生物小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40。同样优选地，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，更优选是肠道沙门氏菌菌株。最优选的是如英格兰公共卫生部培养物保藏中心(Public health England culture collection)记载的鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型SL1344(NCTC 13347)。
在本发明的一些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是不产生铁载体的菌株，例如，在铁载体的产生方面有缺陷，优选不产生多种铁载体，例如在任何铁载体的产生方面均有缺陷的菌株。这种菌株例如是如15,17,20,21中所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40，其不产生耶尔森氏菌素并且其是优选的。
在本发明的一个实施方案中，来自细菌效应蛋白的递送信号包括细菌效应蛋白或其N-末端片段，优选对真核细胞具有毒性的细菌效应蛋白或其N-末端片段。
在本发明的一个实施方案中，来自细菌效应蛋白的递送信号是细菌T3SS效应蛋白，其包含细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段，其中T3SS效应蛋白或其N-末端片段可包含伴侣蛋白结合位点。包含伴侣蛋白结合位点的T3SS效应蛋白或其N-末端片段特别可用作本发明的递送信号。优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE、SopE2、SptP、YopE、ExoS、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SseJ、Sse、SrfH、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、OspI、IpaH、SspH1、VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、XopD、AvrRpt2、HopAO1、HopPtoD2、HopU1、GALA蛋白家族、AvrBs2、AvrD1、AvrBS3、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpm1、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopD和AvrXv3。更优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE、SptP、YopE、ExoS、SopB、IpgB1、IpgD、YopJ、YopH、EspF、OspF、ExoS、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT，其中最优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：IpgB1、SopE、SopB、SptP、OspF、IpgD、YopH、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT，特别是YopE或其N-末端片段。
同样优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE、SopE2、SptP、SteA、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SifB、SseJ、Sse、SrfH、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、OspI、IpaH、VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、AvrRpt2、HopAO1、HopU1、GALA蛋白家族、AvrBs2、AvrD1、YopO、YopP、YopE、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpm1、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopD和AvrXv3。同样更优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE、SptP、SteA、SifB、SopB、IpgB1、IpgD、YopJ、YopH、EspF、OspF、ExoS、YopO、YopP、YopE、YopT，其中同样最优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：IpgB1，SopE，SopB，SptP，SteA，SifB，OspF，IpgD，YopH，YopO，YopP，YopE和YopT，特别是SopE、SteA或YopE或其N-末端片段，更特别是SteA或YopE或其N-末端片段，最特别是YopE或其N-末端片段。
在一些实施方案中，来自细菌效应蛋白的递送信号由包含细菌效应蛋白或其N-末端片段的核苷酸序列编码，其中其N-末端片段包括细菌T3SS效应蛋白的至少前10个，优选至少前20个，更优选至少前100个氨基酸。
在一些实施方案中，来自细菌效应蛋白的递送信号由包含细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段的核苷酸序列编码，其中细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段包含伴侣蛋白结合位点。
优选的包含伴侣蛋白结合位点的T3SS效应蛋白或其N-末端片段包括以下伴侣蛋白结合位点和T3SS效应蛋白或其N-末端片段的组合：SycE-YopE、InvB-SopE、SicP-SptP、SycT-YopT、SycO-YopO、SycN/YscB-YopN、SycH-YopH、SpcS-ExoS、CesF-EspF、SycD-YopB、SycD-YopD。更优选的是SycE-YopE、InvB-SopE、SycT-YopT、SycO-YopO、SycN/YscB-YopN、SycH-YopH、SpcS-ExoS、CesF-EspF。最优选的是包含SycE伴侣蛋白结合位点的YopE或其N-末端片段，如含有YopE效应蛋白的N-末端138个氨基酸的YopE效应蛋白的N-末端片段(本文称为YopE1-138，如SEQ ID NO：2所示)，或者包含InvB伴侣蛋白结合位点的SopE或其N-末端片段，如含有SopE效应蛋白的N-末端81个或105个氨基酸的SopE效应蛋白的N-末端片段(本文分别称为SopE1-81或SopE1-105，如SEQ ID NO：6和7所示)。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性菌株是耶尔森氏菌菌株，并且来自细菌效应蛋白的递送信号包含YopE效应蛋白或N-末端部分，优选小肠结肠炎耶尔氏菌YopE效应蛋白或其N-末端部分。优选地，YopE效应蛋白的N-末端部分内包含SycE结合位点。就此而言，YopE效应蛋白的N-末端片段可以包含N-末端12、16、18、52、53、80或138个氨基酸22-24。最优选的是含有YopE效应蛋白的N-末端138个氨基酸的YopE效应蛋白的N-末端片段，如Forsberg和Wolf-Watz25所述，在本文中被称为YopE1-138，并且如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性菌株是沙门氏菌菌株，并且来自由核苷酸序列编码的细菌效应蛋白的递送信号包含SopE或SteA效应蛋白或其N-末端部分，优选肠道沙门氏菌SopE或SteA效应蛋白或其N-末端部分。优选地，SopE效应蛋白的N-末端部分内包含伴侣蛋白结合位点。就此而言，SopE效应蛋白的N-末端片段可以包含N-末端81或105个氨基酸。最优选的是全长SteA(SEQ ID NO：5)和含有效应蛋白的N-末端105个氨基酸的SopE效应蛋白的N-末端片段，例如如SEQ ID NO：7所记载的。
本领域技术人员熟悉鉴定能够递送蛋白的效应蛋白的多肽序列的方法。例如，Sory等人19描述了一种这种方法。简言之，来自例如Yop蛋白的各个部分的多肽序列可以与报告酶框内融合，所述报告酶例如百日咳博德特氏菌环溶素的钙调蛋白激活的腺苷酸环化酶结构域(或Cya)。通过在受感染的真核细胞中出现环化酶活性(其导致cAMP积聚)来指示Yop-Cya杂合蛋白向真核细胞的胞质溶胶中的递送。通过采用这种方法，如果需要，本领域技术人员可以确定能够递送蛋白的最小序列要求，即最短长度的连续氨基酸序列，参见例如19。因此，本发明优选的递送信号至少由能够递送蛋白的T3SS效应蛋白的最小氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其在产生至少一种细菌效应蛋白方面有缺陷，更优选地，其在产生至少一种对真核细胞具有毒性的细菌效应蛋白方面有缺陷，甚至更优选的，其在产生至少一种T3SS效应蛋白方面有缺陷，最优选地，其在产生至少一种对真核细胞具有毒性的T3SS效应蛋白方面有缺陷。在一些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在产生对真核细胞有毒性的至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，甚至更优选至少四种，特别是至少五种，更特别是至少六种，最特别是所有细菌效应蛋白方面有缺陷。在一些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株在产生对真核细胞有毒性的至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，甚至更优选至少四种，特别是至少五种，更特别是至少六种，最特别是所有功能性细菌效应蛋白方面有缺陷，使得与非减毒革兰氏阴性细菌野生型菌株相比，即，与正常产生细菌效应蛋白的革兰氏阴性细菌野生型菌株相比，所得重组减毒革兰氏阴性细菌菌株产生更少的细菌效应蛋白或在更低程度上产生细菌效应蛋白，或者使得所得重组减毒革兰氏阴性细菌菌株不再产生任何对真核细胞有毒力的功能性细菌效应蛋白。
根据本发明，这种突变的革兰氏阴性细菌菌株，即在产生至少一种细菌效应蛋白方面有缺陷，例如，在产生对真核细胞有毒力的至少一种细菌效应蛋白方面有缺陷的这种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，例如，这种突变的耶尔森氏菌菌株，可通过向至少一种效应子编码基因中引入至少一种突变而产生。优选地，就耶尔森氏菌菌株而言，这种效应子编码基因包括YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、YopP/YopJ和YopT。优选地，就沙门氏菌菌株而言，这种效应子编码基因包括AvrA、CigR、GogB、GtgA、GtgE、PipB、SifB、SipA/SspA、SipB、SipC/SspC、SipD/SspD、SlrP、SopB/SigD、SopA、SpiC/SsaB、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、SseI/SrfH、SopD、SopE、SopE2、SspH1、SspH2、PipB2、SifA、SopD2、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SteC、SteA、SteB、SteD、SteE、SpvB、SpvC、SpvD、SrfJ、SptP。最优选地，所有效应子编码基因均被缺失。本领域技术人员可以采用任意数量的标准技术以在这些T3SS效应基因中产生突变。Sambrook等人一般性地描述了这种技术。参见Sambrook等人26。
根据本发明，可以在效应子编码基因的启动子区产生突变，从而消除这种效应基因的表达。
也可以在效应基因的编码区中产生突变，使得编码的效应蛋白的催化活性被消除。效应蛋白的“催化活性”通常指效应蛋白的抗靶细胞功能，即毒力。这种活性受效应蛋白催化结构域中的催化基序控制。鉴定效应蛋白的催化结构域和/或催化基序的方法为本领域技术人员所熟知。参见例如27,28。
因此，本发明的一个优选突变是整个催化结构域的缺失。另一个优选的突变是效应子编码基因中的移码突变，使得由这种“移码的”基因表达的蛋白产物中不存在催化结构域。最优选的突变是效应蛋白的整个编码区缺失的突变。本发明还考虑了其他突变，例如在效应蛋白的催化基序中产生的小缺失或碱基对取代，导致给定效应蛋白的催化活性的破坏。
可以通过许多方法将功能性细菌效应蛋白基因中产生的突变导入到特定菌株中。一种所述方法涉及将突变基因克隆到“自杀”载体中，该“自杀”载体能够通过等位基因交换(allelic exchange)将突变序列引入到菌株中。这种“自杀”载体的实例如29所述。
以这种方式，可以将多基因中产生的突变相继引入到革兰氏阴性细菌菌株中，产生多重突变，例如六突变重组菌株。引入这些突变序列的顺序并不重要。在某些情况下，可能只需要突变一些而非全部的效应基因。因此，本发明还考虑了除了六突变耶尔森氏菌以外的多突变耶尔森氏菌，例如双突变、三突变、四突变和五突变菌株。出于递送蛋白的目的，本发明突变菌株的分泌和转运系统需要是完整的。
本发明优选的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是六突变耶尔森氏菌菌株，其中所有效应子编码基因均发生突变，使得所得耶尔森氏菌不再产生任何功能性效应蛋白。这种六突变耶尔森氏菌菌株被命名为小肠结肠炎耶尔森氏菌的ΔyopH,O,P,E,M,T。作为一个实例，可以从小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40菌株产生这种六突变体，得到优选的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T(本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T)。在产生耶尔森菌素方面有缺陷的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T描述于WO02077249中，并于2001年9月24日根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约保藏在比利时协调微生物保藏中心，保藏号为LMG P-21013。
更优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T，其包含内源毒力质粒pYV上去除了RNA发夹结构或其部分的缺失，例如位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因的上游的发夹I的缺失，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF(也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF)。同样优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T，其包含编码asd的染色体基因的缺失，并且包含内源毒力质粒pYV(所述内源毒力质粒pYV包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码asd的基因)(pYV-asd)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd)。特别优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd，其包括如上所述的两种修饰(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd)。特别优选的菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF(也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF)、小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd)或小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd)，其在铁载体的产生方面有缺陷，优选不产生铁载体，例如，在任何铁载体的产生方面都有缺陷，正如所有小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种的情况一样。因此，同样优选的菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF(也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种ΔyopH,O,P,E,M,TΔHairpinI-virF)、小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd pYV-asd)或小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd(在本文也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasdΔHairpinI-virF pYV-asd)。
可以根据本发明使用以转化革兰氏阴性细菌菌株的核苷酸分子(如载体)可能取决于如本领域技术人员已知的所使用的革兰氏阴性菌株。可以根据本发明使用的核苷酸分子(如载体)包括表达载体(包括合成的或以其他方式产生的内源毒力质粒的修饰形式)、用于染色体或毒力质粒插入的载体和用于染色体或毒力质粒插入的核苷酸序列(例如DNA片段)。可用于例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株的表达载体是例如pUC、pBad、pACYC、pUCP20和pET质粒。可用于例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株的用于染色体或毒力质粒插入的载体是例如pKNG101。用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段是指用于例如耶尔森氏菌、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株中使用的方法，如λ-红色基因工程(lambda-red genetic engineering)。用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段可以插入本发明的核苷酸序列，使得例如与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合的编码异源蛋白的核苷酸序列与重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的内源启动子可操作地连接。因此，如果使用用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段，则内源启动子可以在内源细菌DNA(染色体或质粒DNA)上编码，并且用于染色体或毒力质粒插入的工程化载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段将仅提供各自的核苷酸序列。或者，如果使用用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的核苷酸分子(例如核苷酸序列)，则内源启动子和来自细菌效应蛋白的递送信号可以在内源细菌DNA(染色体或质粒DNA)上编码，用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的核苷酸分子(例如核苷酸序列)将仅提供编码异源蛋白的核苷酸分子(例如核苷酸序列)。因此，用于转化重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的载体未必需要包含启动子，即，本发明的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株可以用不包含启动子的载体转化。
在一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列(例如载体)按5’至3’方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一核苷酸序列；
编码异源蛋白的第二核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列的3’末端框内融合。
用于耶尔森氏菌的优选载体(例如优选表达载体)选自由以下组成的组：pBad_Si_1和pBad_Si_2。通过将含有来自纯化的pYV40的针对YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE1-138片段克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的KpnI/HindIII位点中来构建pBad_Si2。另外的修饰包括通过消化去除pBad-MycHisA的NcoI/BglII片段、Klenow片段处理和再连接。进一步在YopE1-138的3’末端添加以下切割位点：XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII)。pBad_Si1与pBad_Si2相同，但在阿拉伯糖诱导型启动子下在NcoI/BglII位点中编码从pEGFP-C1(Clontech)扩增的EGFP。同样优选的是使用内源耶尔森氏菌毒力质粒pYV的修饰形式，其以与T3SS信号序列的融合体的形式编码异源蛋白。
用于沙门氏菌的优选载体(例如优选表达载体)选自由以下组成的组：pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269。含有相应内源启动子和SteA1-20片段(pSi_266)、全长SteA序列(pSi_267)、SopE1-81片段(pSi_268)或SopE1-105片段(pSi_269)的质粒pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269从肠道沙门氏菌SL1344基因组DNA扩增并克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的NcoI/KpnI位点中。
本发明的核苷酸分子(例如载体)可以包含其他序列元件，例如3’终止序列(包括终止密码子和poly A序列)，或允许选择已接受本发明载体的转化体的赋予药物抗性的基因。
可通过许多已知方法将本发明的核苷酸分子(例如载体)转化到重组减毒革兰氏阴性细菌菌株中。为了本发明的目的，用于引入载体的转化方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转化、缀合(conjugation)或其组合。例如，可以通过标准电穿孔程序将核苷酸分子(例如载体)转化到第一细菌菌株中。随后，可以通过缀合(conjugation)(该过程也称为“动员(mobilization)”)将该核苷酸分子(例如载体)从第一细菌菌株转移至所需菌株中。可以例如用抗生素来选择转化体(即已经摄取载体的革兰氏阴性细菌菌株)。这些技术在本领域中是众所周知的。参见例如19。
根据本发明，与本发明的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的细菌效应蛋白可操作地连接的启动子可以是相应菌株或兼容性细菌菌株的T3SS效应蛋白的天然启动子，或可在例如耶尔森氏菌、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株中使用的表达载体中使用的启动子，例如pUC和pBad。这种启动子是T7启动子、Plac启动子或阿拉伯糖诱导型Ara-bad启动子。
如果重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则启动子可以来自耶尔森氏菌virulon基因。“耶尔森氏菌virulon基因”是指耶尔森氏菌pYV质粒上的基因，其表达受到温度和与靶细胞接触的控制。这种基因包括编码分泌系统的元件的基因(Ysc基因)、编码转运子(translocator)的基因(YopB、YopD和LcrV)、编码控制元件的基因(YopN、TyeA和LcrG)、编码T3SS效应子伴侣的基因(SycD、SycE、SycH、SycN、SycO和SycT)和编码效应子的基因(YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、YopT和YopP/YopJ)以及编码其他pYV编码的蛋白的基因如VirF和YadA。
在本发明的优选实施方案中，启动子是T3SS功能性效应子编码基因的天然启动子。如果重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则启动子选自YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM和YopP/YopJ中的任一种。更优选地，启动子来自YopE或SycE。最优选的是YopE启动子。
如果重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子可以来自SpiI或SpiII致病岛或来自在其他地方编码的效应蛋白。这种基因包括编码分泌系统的元件的基因、编码转运子的基因、编码控制元件的基因、编码T3SS效应子伴侣的基因和编码效应子的基因以及编码由SPI-1或SPI-2编码的其他蛋白的基因。在本发明的优选实施方案中，启动子是T3SS功能性效应子编码基因的天然启动子。如果重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子选自效应蛋白中的任意一种。更优选地，启动子来自SopE、InvB或SteA。
在一些实施方案中，启动子是人工诱导型启动子，例如，阿拉伯糖诱导型启动子，它是优选的。在这种情况下，通常向细菌提供阿拉伯糖，然后诱导待递送蛋白的细菌表达。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列。蛋白酶切割位点通常位于核苷酸分子(其包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合)上在编码异源蛋白的核苷酸序列和编码递送信号的核苷酸序列之间。功能性和普遍适用的切割位点的产生允许在转运后切掉递送信号。由于递送信号会干扰靶细胞内转运蛋白的正确定位和/或功能，因此在递送信号和目标蛋白之间引入蛋白酶切割位点提供了几乎天然的蛋白至真核细胞的递送。优选地，蛋白酶切割位点是被选自由以下组成的组的蛋白酶或其催化结构域切割的氨基酸基序：肠激酶(轻链)、肠肽酶、脱落蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa蛋白酶和凝血酶，更优选被TEV蛋白酶切割的氨基酸基序。同样优选的蛋白酶切割位点是被选自由以下组成的组的蛋白酶或其催化结构域切割的氨基酸基序：肠激酶(轻链)、肠肽酶、脱落蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa蛋白酶、泛素加工蛋白酶(称为去泛素化酶)和凝血酶。最优选的是被TEV蛋白酶或被泛素加工蛋白酶切割的氨基酸基序。
因此，在本发明的另一个实施方案中，异源蛋白被蛋白酶从来自细菌效应蛋白的递送信号上切割下来。优选的切割方法是如下方法，其中：
a)通过本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株将蛋白酶转运至真核细胞中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和作为异源蛋白的蛋白酶；或者
b)使蛋白酶在真核细胞中组成性(constitutively)表达或瞬时表达。
通常，用于将所需蛋白递送至真核细胞中的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株与将蛋白酶转运至真核细胞中的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是不同的。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码标记分子或标记分子的受体位点的另一核苷酸序列。编码标记分子或标记分子的受体位点的另一核苷酸序列通常与编码异源蛋白的核苷酸序列的5'末端或3'末端融合。优选的标记分子或标记分子的受体位点选自由以下组成的组：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、香豆素(coumarin)、香豆素连接酶受体位点、试卤灵(resorufin)、试卤灵连接酶受体位点、与FlAsH/ReAsH染料一起使用的四半胱氨酸基序(生命技术公司)。最优选的是试卤灵和试卤灵连接酶受体位点或EGFP。标记分子或标记分子的受体位点的使用将导致标记分子与目标异源蛋白的连接，然后被如此递送到真核细胞中，并能够通过例如活细胞显微镜检查来追踪蛋白。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码肽标签的另一核苷酸序列。编码肽标签的另一核苷酸序列通常与编码异源蛋白的核苷酸序列的5'末端或3'末端融合。优选的肽标签选自由以下组成的组：Myc-标签、His-标签、Flag-标签、HA标签、Strep标签或V5标签，或这些组中的两个或更多个标签的组合。最优选的是Myc-标签、Flag-标签、His-标签和Myc-标签和His-标签的组合。肽标签的使用将导致带标签的蛋白的可追溯性，例如通过使用抗标签抗体通过免疫荧光或Western印迹。此外，肽标签的使用允许在分泌到培养物上清液中之后或在转运到真核细胞中之后，对所需蛋白进行亲和纯化，在两种情况下均使用适合相应标签的纯化方法(例如，金属螯合物亲和纯化与His-标签一起使用，或，基于抗-Flag抗体的纯化与Flag-标签一起使用)。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含编码核定位信号(NLS)的另一核苷酸序列。编码核定位信号(NLS)的另一核苷酸序列通常与编码异源蛋白的核苷酸序列的5'末端或3'末端融合，其中所述另一核苷酸序列编码核定位信号(NLS)。优选的NLS选自由以下组成的组：SV40大T抗原NLS及其衍生物30以及其他病毒NLS。最优选的是SV40大T抗原NLS及其衍生物。
在本发明的一个实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株包含多克隆位点。多克隆位点通常位于编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端和/或位于编码异源蛋白的核苷酸序列的5'末端或3'末端。载体可以包含一个或不止一个多克隆位点。优选的多克隆位点选自由以下组成的限制酶组：XhoI、XbaI、HindIII、NcoI、NotI、EcoRI、EcoRV、BamHI、NheI、SacI、SalI、BstBI。最优选的是XbaI、XhoI、BstBI和HindIII。
由本发明的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达的融合的蛋白也称为“融合蛋白”或“杂合蛋白”，即递送信号与异源蛋白的融合蛋白或杂合体。融合蛋白还可以包含例如递送信号和两种或更多种不同的异源蛋白。
本发明涉及治疗受试者的癌症(例如治疗恶性实体瘤)的方法，包括将如上所述的异源蛋白递送到癌细胞(例如恶性实体瘤的细胞)中。蛋白可以在向受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株之时被递送(即，转运)至癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的细胞)中，或者可以在后来的时间，例如在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株已经到达癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的部位)和/或已经到达癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的部位)并且如上所述进行了复制之后被递送(即，转运)至癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的细胞)中。可以通过例如用于在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株中表达异源蛋白的启动子来调节递送的时间。在第一种情况下，细菌效应蛋白的组成型启动子，或更优选的内源启动子可能驱动异源蛋白。在迟延蛋白递送的情况下，人工诱导型启动子(例如阿拉伯糖诱导型启动子)可驱动异源蛋白。在这种情况下，一旦细菌已经到达所需部位并在所需部位积聚，则将向受试者施用阿拉伯糖。然后阿拉伯糖将诱导待递送的蛋白的细菌表达。
因此，在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括：
i)培养如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株；
ii)通过使癌细胞与i)的重组减毒革兰氏阴性菌株接触，向受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和异源蛋白，并且所述融合蛋白被转运到癌症细胞中；并且任选地
iii)切割融合蛋白，使异源蛋白在癌细胞内与细菌效应蛋白的递送信号切割开来，
其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
用于递送异源蛋白的癌细胞通常是来自癌症的癌细胞，所述癌症选自非实体瘤和恶性实体肿瘤，所述非实体瘤选自由肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、中枢神经系统癌症组成的组，所述恶性实体瘤包括但不限于细胞的异常肿块，所述细胞可能源自不同组织类型，例如肝、结肠、结直肠、皮肤、乳腺、胰腺、子宫颈、子宫体、膀胱、胆囊、肾、喉、唇、口腔、食道、卵巢、前列腺、胃、睾丸、甲状腺或肺，因此恶性实体肿瘤包括恶性实体肝肿瘤、结肠肿瘤、结直肠肿瘤、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫体肿瘤、膀胱肿瘤、胆囊肿瘤、肾肿瘤、喉肿瘤、唇肿瘤、口腔肿瘤、食道肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、睾丸肿瘤、甲状腺肿瘤或肺肿瘤。优选地，用于递送异源蛋白的癌细胞是恶性实体瘤。
因此，在一个优选的实施方案中，癌症是恶性实体瘤，并且该方法包括
i)培养如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株；
ii)通过使恶性实体瘤的细胞与i)的重组减毒革兰氏阴性菌株接触，向受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和异源蛋白，并且所述融合蛋白被转运到恶性实体肿瘤的细胞中；并且任选地
iii)切割融合蛋白，从而使异源蛋白在恶性实体肿瘤的细胞内与来自细菌效应蛋白的递送信号上切割开来，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
在一些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达至少两种融合蛋白，所述融合蛋白各自包含来自细菌效应蛋白的递送信号和异源蛋白，并且所述融合蛋白通过本发明的方法被转运到真核细胞(例如癌症细胞)中。
可以培养重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，从而根据本领域已知的方法(例如FDA、Bacteriological Analytical Manual(BAM)，第8章：小肠结肠炎耶尔森氏菌)表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和异源蛋白。优选地，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株可以在例如28℃下在脑心浸液培养基中培养。为了诱导T3SS和例如YopE/SycE启动子依赖性基因的表达，可以使细菌在37℃下生长。
在一个实施方案中，使癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的细胞)与两种i)的重组减毒革兰氏阴性菌株接触，其中第一重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和第一异源蛋白，第二重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含来自细菌效应蛋白的递送信号和第二异源蛋白，从而使第一和第二融合蛋白被转运到恶性实体肿瘤的细胞中。该实施方案提供了用两种细菌菌株共感染癌症细胞(例如恶性实体肿瘤的细胞)作为有效的方法，以将例如两种不同的杂合蛋白递送至单一细胞中以解决其功能性相互作用。
本领域技术人员还可以使用多种测定法来确定融合蛋白的递送是否成功。例如，可以使用识别融合标签(如Myc-标签)的抗体通过免疫荧光法来检测融合蛋白。测定也可以基于被递送的蛋白的酶活性，例如19所述的测定。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，任选地包含合适的药学上可接受的载体。因此，本发明还提供了一种包含如本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的药物组合物，其用于治疗受试者的癌症(例如恶性实体肿瘤)的方法。
可以将重组减毒革兰氏阴性细菌与合适的药学上可接受的载体一起配制为药物组合物，以便以足以治疗受试者的量方便和有效的施用。待施用的重组减毒革兰氏阴性细菌或药物组合物的单位剂量形式可以例如含有以下量的重组减毒革兰氏阴性细菌：每毫升约105至约109个细菌，优选每毫升约106至约108个细菌，更优选每毫升约107至约108个细菌，最优选每毫升约108个细菌。
本文中可互换使用的“足以治疗受试者的量”或“有效量”意指在合理的医疗判断范围内，足够高以显著正向地改变待治疗的病况，但又足够低以避免严重副作用(以合理的利益/风险比)的细菌的量。细菌的有效量将根据待实现的具体目标、所治疗受试者的年龄和身体状况、治疗持续时间、同时进行的治疗的性质和所用的具体细菌而变化。因此，细菌的有效量将是提供所需效果的最小量。通常向受试者施用的量为约105至约109个细菌，例如约105至约109个细菌/m2体表面积，优选约106至约108个细菌，例如约106至约108个细菌/m2体表面积，更优选约107至约108个细菌，例如约107至约108个细菌/m2体表面积，最优选108个细菌，例如108个细菌/m2体表面积。
向受试者(例如向人类)施用以治疗癌症(例如恶性实体肿瘤)的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的单剂量通常是约104至约1010个细菌，例如约104个细菌/m2体表面积至约1010个细菌/m2体表面积，优选约105至约109个细菌，例如约105至约109个细菌/m2体表面积，更优选约106至约108个细菌，例如约106至约108个细菌/m2体表面积，甚至更优选约107至约108个细菌，例如约107至约108个细菌/m2体表面积，最优选108个细菌，例如108个细菌/m2体表面积的总重组减毒革兰氏阴性细菌。
可以用作药物载体的物质的实例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶(tragancanth)；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙；碳酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；琼脂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；蔓越莓提取物和磷酸盐缓冲溶液；脱脂奶粉；以及药物制剂中使用的其他无毒兼容性物质，例如维生素C、雌激素和紫锥菊(echinacea)。还可以存在润湿剂和润滑剂(例如月桂基硫酸钠)以及着色剂、调味剂、润滑剂、赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。
向受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌的方式可以选自由以下组成的组：静脉内、肿瘤内、腹膜内和经口服施用。尽管本发明不打算限于任何特定的应用模式，但优选细菌或药物组合物的静脉内或肿瘤内施用。
取决于施用途径，可能需要将包含细菌的活性成分包裹在材料中以保护所述生物体免受可使所述生物体失活的酶、酸和其他自然条件的作用的影响。为了通过除了肠胃外施用以外的方式施用细菌，应使其被材料涂覆或者与材料一起施用以防止失活。例如，细菌可以与酶抑制剂共同施用或者在脂质体中施用。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(diisopropylfluorophosphate，DFP)和特雷西洛(trasylol)。脂质体包括水包油包水P40乳剂以及将细菌(如乳酸杆菌)或其副产物转运至宿主受试者内部靶标的常规和特别设计的脂质体。
可以单独施用一种细菌，或将一种细菌与第二种不同的细菌联合施用。可联合使用任意数量的不同细菌。“与......联合”是指基本上同时或相继地一起。组合物也可以以片剂、丸剂或胶囊的形式施用，例如包含本发明的细菌或药物组合物的冷冻干燥胶囊，或如含有DMSO或甘油的本发明的细菌或药物组合物的冷冻溶液。另一种优选的应用形式涉及本发明的细菌或药物组合物的冻干胶囊制剂。还有另一种优选的应用形式涉及本发明的细菌或药物组合物的热干胶囊制剂。
待施用的重组减毒革兰氏阴性细菌或药物组合物可通过注射施用。适于注射使用的形式包括单菌(monoseptic)或无菌水溶液(水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是单菌或无菌的，并且必须是流动的，达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须稳定。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。在分散体的情况下，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过维持所需粒度来维持适当的流动性。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
在本发明的一些实施方案中，将重组减毒革兰氏阴性细菌菌株与铁载体共同施用于受试者。这些实施方案是优选的。可以共同施用的铁载体是包括异羟肟酸盐(hydroxamate)、儿茶酚盐(catecholate)和混合配体铁载体在内的铁载体。优选的铁载体是去铁胺(也称为去铁敏B、去铁胺B、DFO-B、DFOA、DFB或得斯芬)、去铁敏E、地拉罗司(Exjade、Desirox、Defrijet、Desifer)和去铁酮(Ferriprox)，更优选的是去铁胺。去铁胺是一种由Actinobacteria Streptomyces pilosus生产的细菌铁载体，可以从例如Novartis Pharma Schweiz AG(瑞士)商购获得。
铁载体共施用可以在施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株之前、同时或之后进行。优选地，在施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株之前施用铁载体，更优选地，在向受试者施用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株之前至少1小时，优选至少6小时，更优选至少12小时，特别是至少24小时施用铁载体。在一个具体的实施方案中，在用重组减毒革兰氏阴性细菌菌株感染之前24小时，用去铁胺预处理受试者，以允许细菌生长。通常，铁载体以每千克体重约0.5×10-5Mol至约1×10-3Mol，更优选约1×10-5Mol至约1×10-4Mol，优选约3.5×10-5Mol至约1.1×10-4Mol的单剂量共同施用。通常，去铁胺以每千克体重约20mg至约60mg，优选约20mg至约60mg的单剂量共同施用。
本文所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株或药物组合物的施用剂量方案将根据待实现的具体目标、所治疗受试者的年龄和身体状况、治疗持续时间、同时进行的治疗的性质和所用的具体细菌而变化，如技术人员所知。通常根据由以下组成的剂量方案将重组减毒革兰氏阴性细菌菌株施用于受试者：每1-20天，优选每1-10天，更优选每1-7天一次剂量。施用期通常为约20至约60天，优选约30-40天。或者，施用期通常为约8至约32周，优选约8至约24周，更优选约12至约16周。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症(例如恶性实体肿瘤)，优选人的癌症(例如恶性实体肿瘤)的试剂盒。该试剂盒通常将包含本文所述的重组减毒革兰氏阴性菌株或药物组合物，以及使用该试剂盒的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括载体(carrier)、包装或容器，该容器被分隔以容纳一个或多个容器(例如小瓶、管等)，每个容器包括要在本文所述的方法中使用的单独的要素之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在其他实施方案中，容器由多种材料形成，例如玻璃或塑料。
实施例
实施例1
A)材料和方法
细菌菌株和生长条件。本研究中使用的菌株列于图3A至M中。用于质粒纯化和克隆的大肠杆菌Top10，和用于缀合的大肠杆菌Sm10λpir，以及用于繁殖pKNG101的大肠杆菌BW1961031在LB琼脂平板上和LB培养基中在37℃下常规生长。使用浓度为200μg/ml(耶尔森氏菌)或100μg/ml(大肠杆菌)的氨苄青霉素来选择表达载体。使用浓度为100μg/ml的链霉素来选择自杀载体。小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40(O：9，生物型2型)20(一种非氨苄青霉素抗性的E40-衍生物)19及其衍生菌株在室温下在脑心浸液(BHI；Difco)上常规生长。向所有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株添加萘啶酮酸(35μg/ml)，并且所有小肠结肠炎耶尔森氏菌asd菌株均额外补充100μg/ml内消旋-2,6-二氨基庚二酸(mDAP，Sigma Aldrich)。肠道沙门氏菌SL1344在LB琼脂平板和LB培养液中在37℃下常规生长。使用浓度为100μg/ml的氨苄青霉素来选择肠道沙门氏菌中的表达载体。
小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传操作。已经描述了小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传操作32,33。简言之，使用纯化的pYV40质粒或基因组DNA作为模板，通过2-片段重叠PCR构建修饰或缺失pYV质粒中或染色体上的基因的变异体(mutator)，在相应基因的缺失或修饰部分的两侧得到200–250bp的侧接序列。将所得片段克隆入大肠杆菌BW1961031中的pKNG10129中。将经序列验证的质粒转化到大肠杆菌Sm10λpir中，质粒从其中被动员到相应的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中。携带整合载体的突变体在没有选择压力的情况下繁殖数代。然后使用蔗糖来选择已经失去载体的克隆。最后通过菌落PCR鉴定突变体。表III列出了特定的变异体(pSi_408、pSi_419)。
质粒的构建。使用质粒pBad_Si2或pBad_Si1(图2)来克隆具有YopE的N-末端138个氨基酸(SEQ ID NO：2)的融合蛋白。通过将含有来自纯化的pYV40的针对YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE1-138片段克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的KpnI/HindIII位点中来构建pBad_Si2。另外的修饰包括通过消化去除pBad-MycHisA的NcoI/BglII片段、Klenow片段处理和再连接。将双向转录终止子(BBa_B1006；iGEM foundation)克隆到被KpnI切割并被Klenow处理的位点(pBad_Si2)或被BglII切割的位点(pBad_Si1)中。进一步在YopE1-138的3’末端添加以下切割位点：XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII)(图2B)。pBad_Si1与pBad_Si2相同，但在阿拉伯糖诱导型启动子下在NcoI/BglII位点中编码从pEGFP-C1(Clontech)扩增的EGFP。含有相应内源启动子和SteA1-20片段(pSi_266)、全长SteA序列(pSi_267)、SopE1-81片段(pSi_268)或SopE1-105片段(pSi_269)的质粒pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269从肠道沙门氏菌SL1344基因组DNA扩增并克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的NcoI/KpnI位点中。
用下表I中列出的特异性引物扩增全长基因或其片段，并将其作为与YopE1-138的融合物克隆到质粒pBad_Si2中，或者在z-BIM(SEQ ID NO：16)的情况下，克隆到pBad_Si1中(参见下表II)。为了与SteA或SopE融合，用KpnI/HindII切割合成的DNA构建体，并将其分别克隆到pSi_266、pSi_267、pSi_268或pSi_269中。对于细菌菌种的基因，使用纯化的基因组DNA作为模板(福氏志贺氏菌M90T、肠道沙门氏菌鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型SL1344亚种(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium SL1344)、汉斯巴尔通体ATCC 49882)。对于人类基因，如果没有另外说明，则使用通用cDNA文库(Clontech)(图3A至M)，从cDNA文库(M.Afeolter的馈赠)扩增斑马鱼基因。将连接的质粒克隆入大肠杆菌Top10中。使用标准大肠杆菌电穿孔的设置，将测序后的质粒电穿孔到所需小肠结肠炎耶尔森氏菌或肠道沙门氏菌中。
表I(引物Nr.Si_:序列)
Seq_Id_No_51:引物No.:Si_285
CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_52:引物No.:Si_286
GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
Seq_Id_No_53:引物No.:Si_287
CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG
Seq_Id_No_54:引物No.:Si_288
GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC
Seq_Id_No_55:引物No.:Si_387
CGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAA
Seq_Id_No_56:引物No.:Si_391
CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA
Seq_Id_No_57:引物No.:Si_389
GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg
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CGTAtctagaATGCCCCGCCCC
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GTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAAT
Seq_Id_No_60:引物No.:Si_438
CGTAtctagaATGTCTGACACGTCCAGAGAG
Seq_Id_No_61:引物No.:Si_439
GTTAAAGCTTTCATCTTCTTCGCAGGAAAAAG
Seq_Id_No_62:引物No.:Si_463
CAGTctcgaggaaagcttgtttaaggggc
Seq_Id_No_63:引物No.:Si_464
cagtTTCGAAttagcgacggcgacg
Seq_Id_No_64:引物No.:Si_476
GTTAAAGCTTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
Seq_Id_No_65:引物No.:Si_494
CGTAtctagaATGGCCGAGCCTTG
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GTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCC
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CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATGCCCCGCCCC
Seq_Id_No_68:引物No.:Si_505
GTTAAAGCTTCCCACCGTACTCGTCAATtc
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CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_70:引物No.:Si_509
GTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCc
Seq_Id_No_71:引物No.:Si_511
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGTGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_72:引物No.:Si_512
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTCCGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_73:引物No.:Si_513
GTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCGTCCAT
Seq_Id_No_74:引物No.:Si_515
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_75:引物No.:Si_677
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAAATTGGTGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTA
Seq_Id_No_76:引物No.:Si_678
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGCGGGCAATATTATGAATAATTTCTTCGAATAGTAA
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TTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGATGAACTGGATAGCTAAGCTTGGAGTA
Seq_Id_No_78:引物No.:Si_683
TACTCCAAGCTTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGCGGCGCAGACATTCGCTCAGTTTTTTCTCGAGTAGTAA
Seq_Id_No_79:引物No.:Si_580
catgccatggatttatggtcatagatatgacctc
Seq_Id_No_80:引物No.:Si_612
CGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaag
Seq_Id_No_81:引物No.:Si_613
CGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagc
Seq_Id_No_82:引物No.:Si_614
catgccatggCGGCAAGGCTCCTC
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cggggtaccTTTATTTGTCAACACTGCCC
Seq_Id_No_84:引物No.:Si_616
cggggtaccTGCGGGGTCTTTACTCG
Seq_Id_No_85:引物No.:Si_585
CAGTctcgagATGCAGATCTTCGTCAAGAC
Seq_Id_No_86:引物No.:Si_586
GTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGAC
Seq_Id_No_87:引物No.:Si_588
cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_88:引物No.733
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCG
Seq_Id_No_89:引物No.735
TACTCCTTCGAATTAATGATCCATTTCATCACCAATTTG
Seq_Id_No_90:引物No.736
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCG
Seq_Id_No_91:引物No.738
TACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATG
Seq_Id_No_92:引物No.734
TACTCCTTCGAAGGCACCATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
Seq_ID_No_93:引物No.725:
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC
Seq_ID_No_94:引物No.726:
TACTCCAAGCTTACGGTTGAATATTATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
Seq_ID_No_95:引物No.727:
TTACTATTCGAAGCCGGTGGTGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCC
Seq_ID_No_96:引物No.728:
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCA
Seq_ID_No_97:引物No.737:
TACTCCTTCGAAGGCACCGCTATCCAGTTCATCACCAATG
Seq_ID_No_101:引物No.869:
gatcgtcgacTTAAGTTCAATGGAGCGTTTAATATC
Seq_ID_No_102:引物No.870:
ctttgactggcgagaaacgcTCTTAACATGAGGCTGAGCTC
Seq_ID_No_103:引物No.871:
GAGCTCAGCCTCATGTTAAGAgcgtttctcgccagtcaaag
Seq_ID_No_104:引物No.872:
gatagcccccgagcctgtGCACTTTGTCATTAACCTCAGC
Seq_ID_No_105:引物No.873:
GCTGAGGTTAATGACAAAGTGCacaggctcgggggctatc
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catgtctagaCCCTCAGCATAATAACGACTC
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catgacatgtTGGCGTTTCTCGCC
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catgacatgtATTAACCTCAGCCCTGACTATAAG
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cacatgtctagaCAACCGTTTCCGAAAGGTGATCTG
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atccCAagctTATTGGCGTTGGGTGGTAAAAATTTTG
Seq_ID_No_121:引物No.1021:
cacatgtctagaATGACCGCCGAACAACGC
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catgaagcttaCGGACCCGGATTTTGGCTC
>Seq_ID_No_123:引物No.1023:
catgaagcttaCGGTTCTTCTTGAATAAAAATTTGAATG
Seq_ID_No_124:引物No.1024:
catgaagcttaTTGCAGCACTTTCGGCCAATTT
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cacatgtctagaATGAGCATTGTGTGTAGCGC
Seq_ID_No_126:引物No.1026:
catgaagcttaGCTTTCATCCACGGCCGG
Seq_ID_No_127:引物No.1027:
catgaagcttaATTACCGGTTTGGCGCAGC
表II：克隆的融合蛋白
/>
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/>
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表III：用于遗传修饰的变异体
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/>
Yop分泌。通过将培养物移至37℃下BHI-Ox中(允许分泌的条件)来进行yop调节子的诱导34。加入葡萄糖(4mg/ml)作为碳源。
通过在4℃下以20 800g离心10分钟来分离总细胞和上清液部分。将细胞沉淀物作为总细胞部分。上清液中的蛋白用终浓度为10％(w/v)的三氯乙酸在4℃下沉淀1小时。离心(20 800g，15分钟)并除去上清液后，将所得沉淀物用冰冷丙酮洗涤过夜。将样品再次离心，弃去上清液，将沉淀物风干并重悬于1x SDS上样染料中。
通过SDS-PAGE分析所分泌的蛋白；在每种情况下，每条泳道加载由3×108个细菌分泌的蛋白。使用12.5％SDS-PAGE凝胶进行Western印迹来检测具体的分泌蛋白。对于检测总细胞中的蛋白，如果没有另外说明，则每条泳道加载2×108个细菌，并在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，然后通过Western印迹检测。
使用抗YopE的大鼠单克隆抗体(MIPA193-13A9；1:1000，35)进行Western印迹。抗小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd的抗血清过夜预吸附两次，以减少背景染色。用抗大鼠抗体并与辣根过氧化物酶缀合的二抗(1:5000；Southern biotech)进行检测，然后用ECL化学发光底物(LumiGlo，KPM)显色。
细胞培养和感染。将HeLa Ccl2和B16F10细胞在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)(cDMEM)中培养。将4T1细胞在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌在具有添加剂的BHI中生长过夜，在新鲜BHI中稀释至OD600为0.2，在室温下生长2小时，然后温度转移至37℃水浴振荡器中再持续30分钟，或在递送EGFP的情况下持续1小时。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。接种于96孔板(用于免疫荧光)或6孔板(用于蛋白印迹)的细胞以指定的MOI在补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中感染。加入细菌后，将平板以1750rpm离心1分钟并置于37℃保持指定时间段。如果显示，则用庆大霉素(100mg/ml)杀死细胞外细菌。对于免疫荧光分析，通过4％PFA固定来终止感染测定。对于western印迹分析，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并加入Phospho-safe裂解缓冲液(Novagen)以裂解细胞。在冰上孵育后，将细胞离心(16 000rcf，25分钟，4℃)。收集上清液，并通过Bradford BCA测定(Pierce)来分析总蛋白含量，然后使用抗-Actin(Millipore)、抗-Bid(Cell Signaling)、抗-Myc(Santa Cruz)、抗-半胱天冬酶-3p17(Cell Signaling)和抗-Ink4C(CellSignaling)抗体进行SDS PAGE和Western印迹。
来自感染细胞的被T3SS转运的蛋白的Western印迹。如上所述，以100的MOI感染6孔板中的HeLa细胞。在与转运TEV蛋白酶的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株共同感染的情况下，设定菌株的OD600，并将两种细菌悬液以1:1的比例(如果未另外指出)在管中混合，然后加入到细胞中。在感染结束时，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并通过刮擦收集在小体积的冰冷PBS中。离心(16000rcf，5分钟，4℃)后，将沉淀溶解在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Rochecomplete，Roche)的0.002％毛地黄皂苷中。将溶解的沉淀在冰上孵育5分钟，然后离心(16000rcf，25分钟，4℃)。收集上清液，并通过Bradford BCA测定(Pierce)来分析总蛋白含量，然后使用抗-Myc(Santa Cruz，9E11)或抗-Ink4C(Cell Signaling)抗体进行SDS PAGE和Western印迹。
自动显微镜和图像分析。使用ImageXpress Micro(Molecular devices，Sunnyvale，USA)自动获取图像。使用MetaXpress(Molecular devices，Sunnyvale，USA)进行抗-Myc染色强度的定量。手动选择除核区域和含细菌区域之外的细胞内的区域(面积为40个像素的圆圈)并记录平均强度。
B16-F10和4T1肿瘤同种异体移植小鼠模型中的生物分布
所有动物实验均获得批准(许可证1908；KantonalesBasel-Stadt)并根据当地指南(Tierschutz-Verordnung，Basel-Stadt)和瑞士动物保护法(Tierschutz-Gesetz)进行。从Janvier实验室订购6周龄的C57Bl/6和BALB/c小鼠。在适应至少一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将100μl B16-F10或4T1细胞(1×105-1×106个细胞)分别皮下注射到C57Bl/6和BALB/c的侧腹中。在整个实验中，对小鼠的行为和外观进行评分，并测量表面温度以及体重。
一旦肿瘤形成，则通过腹膜内注射向小鼠施用8mg/ml的得斯芬溶液(10ml/kg)。第二天，通过注射到尾静脉中，用小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40或小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔHOPEMT(2×105、1×106或1×107个细菌)感染小鼠。通过稀释铺板法验证静脉施用于小鼠的接种物。在一些实验中，肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.523×长×宽2。在感染后的相应日期，通过CO2吸入处死小鼠。立即通过抽吸从心脏分离血液样本。分离肝、脾、肺和肿瘤并确定它们的重量。对器官和肿瘤进行均质化。通过将连续稀释物点样到含有萘啶酮酸(35ug/ml)的LB琼脂平板上来测定每个样品中的CFU。
直接I型干扰素活化测定。从InvivoGen(B16-Blue ISG、RAW-Blue ISG、RAW-LuciaISG和RAW-Lucia ISG-KO-MAVS)购买鼠B16F10黑素瘤细胞、鼠RAW264.7野生型或MAVS敲除巨噬细胞，其在I-ISG54启动子(其由多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成)的控制下稳定地表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)或分泌的Lucia荧光素酶。生长条件和I型IFN测定法改编自InvivoGen提供的方案。简而言之，在平底96孔板(NUNC或Corning)中每孔接种150μl测试培养基(对于B16-Blue ISG细胞为RPMI+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS；对于RAW-Blue、RAW-Lucia和RAW-Lucia KO-MAVS ISG细胞为DMEM+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中的12'500个B16-Blue ISG细胞或30'000个RAW-Blue、RAW-Lucia或RAW-Lucia KO-MAVS ISG细胞。第二天，通过每孔加入15μl所需的感染复数(MOI，在测试培养基中稀释)而用待评估的细菌菌株感染细胞。孵育2小时(37℃和5％CO2)后，通过加入含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的测试培养基杀死细菌。继续孵育20-24小时。按照QUANTI-BlueTM和QUANTI-LucTM方案(InvivoGen)分别检测SEAP和荧光素酶。对于SEAP检测：将20μl细胞上清液与180μl检测试剂(QUANTI-BlueTM，InvivoGen)一起孵育。将平板在37℃孵育，并通过使用酶标仪(Molecular Devices)读取650nm处的OD来测量SEAP活性。使用在试验培养基中稀释至各自浓度的鼠IFNγ(原液：1’000’000U/ml)作为阳性对照。对于荧光素酶检测：在不透明板(ThermoScientific)中向20μl细胞上清液中加入50μl检测试剂(QUANTI-LucTM，InvivoGen)。使用读板器(BioTek)立即测量发光。
间接I型干扰素活化测定。如上所述，用指定感染复数(MOI)的待评估细菌菌株感染鼠B16F10或4T1细胞共4小时。然后将细胞上清液转移到在I-ISG54启动子(其由多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成)控制下稳定表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的鼠B16F10黑素瘤细胞(购自InvivoGen，B16-Blue ISG细胞)中。生长条件和I型IFN测定法改编自InvivoGen提供的方案。简而言之，在平底96孔板(NUNC)中每孔接种150μl测试培养基(RPMI+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中的12’500个B16-Blue ISG细胞。第二天，除去整个培养基并加入100μl先前感染的B16F10或4T1的细胞上清液。将平板在37℃和5％CO2下孵育20-24小时。按照QUANTI-BlueTM方案(InvivoGen)检测SEAP。将20μl细胞上清液与180μl检测试剂(QUANTI-BlueTM，InvivoGen)一起孵育。将平板在37℃孵育，并通过使用酶标仪(Molecular Devices)读取650nm处的OD来测量SEAP活性。
肿瘤内治疗后B16F10肿瘤同种异体移植小鼠模型中肿瘤发展的研究。所有动物实验均经主管部门批准，并根据当地指南和动物保护法进行。从Charles River(L'Arbresles)订购5-7周龄雌性C57Bl/6小鼠。在适应至少一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将200μL的RPMI 1640中1x106个B16-F10细胞皮下注射到小鼠的右侧腹中。定期检查小鼠的行为和外观，并测量体重。
一旦肿瘤的体积达到60-130mm3(定义为第0天)，则开始治疗。在第0、1、2、3、6和9天，在异氟烷麻醉下，通过肿瘤内注射给小鼠施用待评估的细菌菌株(每次施用50μl PBS中的7.5×107个细菌)。通过稀释铺板法验证肿瘤内施用于小鼠的接种物。作为对照，仅向小鼠注射不含内毒素的PBS。在最后一次细菌治疗之前24小时(第8天)，通过腹膜内注射给小鼠施用8mg/ml的得斯芬溶液(10ml/kg)。肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.5x长x宽2。肿瘤体积超过1500mm3被定义为人道终点。
肿瘤内治疗后EMT-6肿瘤同种异体移植小鼠模型中肿瘤发展和再激发的研究。所有动物实验均经主管部门批准，并根据当地指南和动物保护法进行。从Charles River(L'Arbresles)订购5-7周龄雌性BALB/c(BALB/cByJ)小鼠。在适应至少一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将200μL的RPMI 1640中1x106个EMT-6细胞皮下注射到小鼠的右侧腹中。定期检查小鼠的行为和外观，并测量体重。
一旦肿瘤的体积达到60-130mm3(定义为第0天)，则开始治疗。在第0、1、5、6、10和11天，在异氟烷麻醉下，通过肿瘤内注射给小鼠施用待评估的细菌菌株(每次施用50μl PBS中7.5×107个细菌)。通过稀释铺板法验证肿瘤内施用于小鼠的接种物。作为对照，仅向小鼠注射不含内毒素的PBS。在最后一次细菌治疗之前24小时(第10天)，通过腹膜内注射给小鼠施用8mg/ml的得斯芬溶液(10ml/kg)。肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.5x长x宽2。肿瘤体积超过1500mm3被定义为人道终点。在治疗开始后第54天，使用异氟烷麻醉显示出完全肿瘤消退的小鼠，并将200μL的RPMI 1640中的1×106个EMT-6细胞皮下注射到与第一次肿瘤细胞注射相关的对侧(左)侧腹中。作为对照组，包括之前未用EMT-6细胞移植的空白小鼠。肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.5x长x宽2。肿瘤体积超过1500mm3被定义为人道终点。
静脉内治疗后EMT-6肿瘤同种异体移植小鼠模型中肿瘤发展的研究。所有动物实验均经主管部门批准，并根据当地指南和动物保护法进行。从Charles River(L'Arbresles)订购5-6周龄雌性BALB/c(BALB/cByJ)小鼠。在适应至少一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将200μL的RPMI 1640中1x106个EMT-6细胞皮下注射到小鼠的右侧腹中。定期检查小鼠的行为和外观，并测量体重。
一旦肿瘤的体积达到80-250mm3(定义为第0天)，则将小鼠随机分入治疗组。在随机化前24小时(D-1)，通过腹膜内注射向小鼠施用8mg/ml的得斯芬溶液(10ml/kg)。在第0天，在异氟烷麻醉下，通过静脉内注射给小鼠施用待评估的细菌菌株(每次施用100μl PBS中5x106个细菌)。通过稀释铺板法验证静脉内施用于小鼠的接种物。作为对照，仅向小鼠注射不含内毒素的PBS。肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.5x长x宽2。肿瘤体积超过1500mm3被定义为人道终点。
肿瘤细胞分离物感染后IFNβ分泌的测量。所有动物实验均获得批准(许可证1908；KantonalesBasel-Stadt)并根据当地指南(Tierschutz-Verordnung，Basel-Stadt)和瑞士动物保护法(Tierschutz-Gesetz)进行。从Janvier实验室订购6周龄的BALB/c小鼠。在适应一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将100ul EMT-6细胞(1x106细胞)皮下注射到小鼠的侧腹中。在整个实验中，对小鼠的行为和外观进行评分，并测量表面温度以及体重。肿瘤发展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.5x长x宽2。在测定当天，分离肿瘤，切成1-2mm的小片，消化1-1.5小时并通过70μm尼龙网以获得单细胞悬浮液。测定该粗细胞分离物的细胞计数，并在生长培养基(DMEM+L-谷氨酰胺+非必需氨基酸+10％FCS)中在平底24孔板(Corning)中每孔接种300'000个细胞。在37℃和5％CO2孵育1小时后，通过每孔加入100μl细菌滴度(不同的MOI，在生长培养基中稀释)而用待评估的细菌菌株感染细胞。在37℃和5％CO2孵育1小时后，通过加入含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的生长培养基杀死细菌。继续孵育3小时。将板离心以收集孔底部的所有细胞，并根据制造商的说明通过LumiKineTMXpress鼠IFN-βELISA(Invivogen)分析上清液的IFNβ浓度。
B)结果
基于YopE融合蛋白的3型分泌的蛋白递送系统
虽然小肠结肠炎耶尔森氏菌T3SS效应子YopE的N-末端(SEQ ID NO：1)就含有足以使异源蛋白转运的分泌信号22，但不包括其伴侣蛋白(SycE)的伴侣蛋白-结合位点(CBS)36。我们选择了YopE的N-末端138个氨基酸(SEQ ID NO：2)来与待递送的蛋白融合，因为这对于其他异源T3S底物的转运显示出了最佳结果24。由于YopE的这些N-末端138个氨基酸含有CBS，因此我们进一步决定共表达SycE。从纯化的小肠结肠炎耶尔森氏菌pYV40毒力质粒克隆的SycE-YopE1-138片段含有YopE和其伴侣SycE的内源启动子(图2)。因此，SycE和任意YopE1-138融合蛋白均通过使温度从生长室温快速变化至37℃而诱导。在37℃下的培养时间将影响细菌中存在的融合蛋白量。在YopE1-138的3’末端添加多克隆位点(MCS)(图2B)，然后添加Myc和6xHis标签和终止密码子。
仔细选择背景菌株。首先，为了限制内源效应子的转运，我们使用了缺失了所有已知效应子——Yop H、O、P、E、M和T的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌菌株(命名为ΔHOPEMT)37。另外，我们偶尔使用在不存在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸的情况下不能生长的营养缺陷型突变体38。该菌株缺失了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(Δasd)，并被瑞士安全机构(修正案A010088/2)归类为生物安全级别1级。另外，我们使粘附蛋白YadA和/或InvA缺失以提供更多的背景菌株选择。虽然使用yadA或yadA/invA菌株会降低诱导的背景信号39，但所递送的蛋白量也受到影响40。
在将融合蛋白转运到真核细胞后，去除YopE1-138附属物
虽然对于细菌递送而言YopE1-138片段具有很大的益处，但是它可能妨碍融合蛋白的功能和/或定位。因此，最好在蛋白递送后将其去除。为此，我们在YopE1-138和融合伙伴(转录调节子ET1-Myc(SEQ ID NO：9和11)44和人INK4C(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10))之间引入了两个TEV切割位点(ENLYFQS)41-43。为了保持所提出的方法的优点，我们进一步在另一小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中将TEV蛋白酶(S219V变体；45)与YopE1-138融合(SEQ ID NO：12)。同时用两种菌株感染HeLa细胞。为了仅分析转运的蛋白部分，在感染后2小时用毛地黄皂苷裂解感染的HeLa细胞，已知毛地黄皂苷不裂解细菌(46)。蛋白印迹分析显示只有当细胞用对应菌株感染时，才存在YopE1-138-2xTEV-切割-位点-ET1-Myc或YopE1-138-2xTEV-切割-位点-Flag-INK4C-Myc。在用纯化的TEV蛋白酶过夜消化该细胞裂解物后，可以观察到移位的条带。该条带对应于具有TEV切割位点的N-末端残基的ET1-Myc或Flag-INK4C，最可能仅有一个丝氨酸。在用递送TEV蛋白酶的菌株共感染细胞后，同样切割的ET1-Myc或Flag-INK4C片段变得可见，表明通过T3SS递送的TEV蛋白酶是功能性的，并且单细胞已经被两种细菌菌株感染。虽然切割不完全，但在感染后2小时大部分转运的蛋白已经被切割，甚至用纯化的TEV蛋白酶过夜消化也不会产生更好的切割速率。据报道，TEV蛋白酶依赖性切割可能需要依赖于融合蛋白的优化47,48。因此，转运后YopE1-138附属物的TEV蛋白酶依赖性去除首次提供了几乎天然的异源蛋白(氨基酸组成的变化仅在于一个N-末端氨基酸)的T3SS蛋白递送。
YopE片段的TEV蛋白酶依赖性切割的另一种方法在于将泛素掺入目标融合蛋白中。实际上，泛素在其C-末端被一组内源泛素特异性C-末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)处理。由于切割应该精确发生在泛素的C-末端(G76之后)，因此目标蛋白应该没有额外的氨基酸序列。在YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis融合蛋白上对该方法进行了检测。在被YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis表达细菌感染的对照细胞中，发现了对应于YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis的条带，指示融合蛋白的有效转运。当用YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis-表达细菌感染细胞1小时时，可见对应于Flag-INK4C-MycHis大小的另外的条带，表明融合蛋白的一部分被切割。该结果表明，将泛素引入融合蛋白能够切掉YopE1-138片段而不需要外源蛋白酶。
通过使对真核细胞具有毒力活性的细菌效应蛋白缺失/突变来减毒
对于小肠结肠炎耶尔森氏菌，通过使六种内源效应蛋白缺失来降低毒力，这六种内源效应蛋白被称为“耶尔森氏菌外蛋白”(Yop)，具体为YopH、O、P、E、M、T(MRS40pIML421[yopHΔ1–352、yopOΔ65–558、yopP23、yopE21、yopM23、yopT135])37。这些Yop在“耶尔森氏菌毒力质粒”(pYV)(一种约70kbp大小的质粒)上编码，在其上编码完整的3型分泌系统(T3SS)以及其他毒力参与者(图4)。YopH、O、P、E、M和T是六种效应蛋白，它们通过三型细菌分泌系统被递送至宿主细胞从而调节和抑制免疫系统。每种Yop在宿主细胞中都有特定的生化活性。YopT切割Rho GTP酶的C-末端半胱氨酸并因此去除将GTP酶锚定到膜上的异戊二烯基(isporenyl group)。这种由于错误定位导致的Rho失活避免被免疫细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)吞噬49。YopE以相同的途径作为Rho GTP酶的GTP酶激活蛋白(GTPaseactivating protein、GAP)起作用，使它们失活。这导致吞噬作用下降并抑制免疫细胞释放IL-1β49。此外，YopO作为胍核苷酸解离抑制剂(guanidine nucleotide dissociationinhibitor、GDI)起作用，使Rho GTP酶失活。YopO还具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，其以尚未确定的方式作用于肌动蛋白细胞骨架49。YopH是一种酪氨酸磷酸化酶，其作用于粘着斑蛋白，如粘着斑激酶(Fak)、桩蛋白等，从而强力地阻止巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用49。YopP在假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)或鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)中被命名为YopJ，其被发现可以使免疫细胞中的MAPK/NFkB途径失活，防止免疫细胞释放TNFa和IL-8(由细菌的存而刺激)。此外，发现YopP诱导免疫细胞的细胞凋亡，这可能与对MAPK途径的影响有关，活化状态下的MAPK途径保护细胞免于细胞凋亡49。YopM的作用还不完全清楚，但发现它与核糖体S6激酶1(ribosomal S6 kinase 1、RSK1)和蛋白激酶C样2(proteinkinase C-like 2、PRK2)相关。似乎YopM可以刺激RSK1的磷酸化，从而影响下游靶标，例如细胞周期进展49。通过使这些Yop中的一个或几个缺失，细菌对免疫系统的防御机制受到显著影响50。通过相应区域的PCR并通过体外分泌测定验证了相应yop的突变。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行的体外分泌分析证实没有全长YopH、O、M和YopE。
此外，构建了具有在asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)中缺失的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株。asd中的突变导致在不添加内消旋-二氨基庚二酸的情况下完全丧失生长能力。这允许基于相应质粒上asd的存在产生无抗生素质粒维持系统。可以以类似的方式使用其他营养缺陷型突变体。
增强型促细胞凋亡细菌的产生
为了优化促细胞凋亡蛋白的递送，根据表IV形成了用不同促细胞凋亡蛋白转化的菌株。
表IV：用不同促细胞凋亡蛋白转化的菌株
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将递送的蛋白缩短至信号传导所需的关键结构域(例如t-BID的BH3结构域(SEQID NO.19))可以提高细胞杀伤效率(图5)。不受理论束缚，这种效率的增加很可能与由于所递送蛋白的大小较小而引起的蛋白产生以及随后经由T3SS递送的量增加有关。在YopE部分和tBID的BH3结构域之间引入接头(SEQ ID NO.23)降低了效率，并且将BH3结构域延伸4个另外的氨基酸(SEQ ID NO.22)也降低了效率(图5)。
另外，产生了具有这种基本结构域的重复(例如t-BID的BH3结构域(SEQ IDNO.27))或这些基本结构域的组合(例如t-BID的BH3结构域和BAX的BH3结构域(SEQ IDNO.24和28))的合成运载物。令人惊讶的是，发现相同或不同BH3结构域的串联重复导致对癌细胞系(包括4T1和B16F10细胞，图5)的细胞凋亡诱导增强。与单一tBID BH3结构域相比，在递送tBID BH3结构域的串联重复之后，发现IC50(半数最大抑制浓度)降低，IC50是指杀死50％的真核细胞所需的每个真核细胞所对应的细菌数(MOI)(图5)。这一发现是令人惊讶的，因为通过融合t-BID的第二个BH3结构域增加了蛋白大小。由此，预期与YopE1-138-tBIDBH3(SEQ ID NO：19和25)相比，YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO：27)的表达和递送水平会降低，可能至多达到同等水平。为了达到细胞杀伤活性的增加，融合的tBID BH3结构域必须在被T3SS递送到真核细胞中后同时、并行起作用。在YopE1-138-(tBID BH3)2构建体中只有一个tBID BH3结构域起作用的情况下，可能至多预期与YopE1-138-tBID BH3相同的效率。
为了增加YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.27)的遗传稳定性以进行体内研究，我们通过在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下(使用变异体质粒pSI_408和pSI_419)同源重组克隆了YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.27)。这种变异体含有编码所需蛋白的DNA序列(其在对应于相应基因位点的两侧侧接有200-250bp的序列)，整合应该发生在其中。将这些质粒转化到大肠杆菌Sm10λpir中，质粒从其中被动员到相应的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中。携带整合载体的突变体在没有选择压力的情况下繁殖数代。然后使用蔗糖来选择已经失去载体的克隆。最后通过菌落PCR鉴定突变体。被T3SS转运的内源蛋白(称为“耶尔森氏菌外蛋白”，Yop)由小肠结肠炎耶尔森氏菌在这一70kb质粒上编码，该质粒被命名为耶尔森氏菌毒力质粒(pYV)，其还编码T3SS系统。
对于在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)(SEQ ID NO.19和25)或YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.27)的耶尔森氏菌菌株，评估了其诱导癌细胞凋亡的能力(包括4T1和B16F10细胞，图6)。当两个蛋白均在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码时，与单一tBID BH3结构域相比，在递送tBID BH3结构域的串联重复之后，发现IC50(半数最大抑制浓度)降低，IC50指杀死50％的真核细胞所需的每个真核细胞所对应的细菌数(MOI)(图6)。这与在这些蛋白的表达质粒携带的递送中的发现一致(图5)。同样，这一发现是令人惊讶的，因为通过融合t-BID的第二个BH3结构域增加了蛋白大小。由此，预期与YopE1-138-tBID BH3(SEQ ID NO：19和25)相比，YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO：27)的表达和递送水平会降低，可能至多达到同等水平。为了达到细胞杀伤活性的增加，融合的tBID BH3结构域必须在被T3SS递送到真核细胞中后同时、并行起作用。在YopE1-138-(tBID BH3)2构建体中只有一个tBID BH3结构域起作用的情况下，可能至多预期与YopE1-138-tBID BH3相同的效率。此外，对于在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.27)的耶尔森氏菌菌株，将其与表达质粒(基于pBad-MycHisA)衍生的YopE1-138-(tBID BH3)2的递送进行比较，以比较其诱导癌细胞凋亡的能力。与pBad-MycHisA(20-25个拷贝)相比于pYV(报道了1-6个拷贝)的更高拷贝数相一致，基于pBad-MycHisA的YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.27)的递送导致对4T1和B16F10细胞的IC50值略有下降(图6)。
黑素瘤鼠模型中的生物分布研究
为了验证作为肿瘤特异性载体的在关键毒力决定因子(如T3SS效应子)中具有突变的革兰氏阴性菌，使用已建立的B16F10黑素瘤模型(ATCC No.CRL-6475)进行了鼠同种异体移植肿瘤研究。当皮下注射肿瘤达到一定大小(约100-200mm3)时，用2×105cfu小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40或小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T静脉注射感染小鼠。为了允许细菌生长，在感染前24小时，用去铁胺对小鼠进行预处理。在感染的前48h，感染了野生型小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40菌株的小鼠的外观和行为评分增加(图47-48)，并且显示出显著的体重减轻(图49)，这促使我们在感染后第2天处死该组中的所有小鼠。相反，用减毒小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T菌株感染的小鼠在感染后第4天仍没有显示出显著的体重减轻，并且外观和行为评分正常(图47-49)。在感染了野生型菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40)的小鼠中，在评估的所有器官中以及在血液中均检测到了活细菌(图51)。虽然恶性实体肿瘤中存在野生型细菌，但在其他器官中也发现了同样高或更高的计数，在脾中最高(图51)。与之形成鲜明对比的是，在用小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T感染的小鼠中，在感染后第1天，活细菌主要见于恶性实体肿瘤中，脾、肝和肺中观察到的细菌计数较低。值得注意的是，在感染后第4天，恶性实体肿瘤中的细菌计数增加了若干数量级(达到超过108cfu/g肿瘤组织)，而在评估的所有其他器官中，细菌计数降至检测限以下(图50)。因此，与脾或肝相比，小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40ΔyopH,O,P,E,M,T在感染后第4天以约(最低)一百万倍的比例在恶性实体肿瘤部位积聚(在计算相对检测限的比例时)。
对于小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT、小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT+pYV-YopE1-138-鼠RIG1 CARDs或小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMTΔHairpinI-VirF+pYV-YopE1-138-鼠RIG1 CARDs，在向携带B16F10黑素瘤的小鼠的侧尾静脉静脉内施用后第5天或第8天，在每克实体瘤中检测到了相似高数量的细菌(图26)。这些结果验证：异源蛋白运载物和影响T3SS调节(VirF)的进一步突变不影响鼠模型中实体瘤的细菌定殖。
这些结果验证了通过使关键毒力决定因子突变来减毒，以产生特异性靶向恶性实体肿瘤的细菌载体的策略。
直至细菌施用后第14天体内肿瘤特异性生长的验证
在同系鼠同种异体移植模型(4T1乳腺癌模型)中重复进行基因修饰型小肠结肠炎耶尔森氏菌的肿瘤定殖实验，然后进行两周的细菌定殖。这次，用1×106个菌落形成单位(CFU)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T感染小鼠。虽然在感染后的早期数天获得了与B16F10模型相似的结果，但我们可以进一步显示，在感染后第8天并且直至第14天始终发现肿瘤定殖(图7)。此外，定殖保持高度特异性，在所评估的所有其他器官中仅检测到了低计数的细菌(图8)。这些发现表明，小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T能够建立肿瘤的持续定殖，从而防止被免疫系统清除。
小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT在延缓肿瘤发展中的功效
为了评估递送至肿瘤细胞的YopE1-138-(tBID BH3)2的体内影响，我们在通过皮下注射4T1乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中进行了研究。我们的目的是评估在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)2的耶尔森氏菌ΔHOPEMT菌株，其通过缺失位于VirF的上游的发夹I区而被进一步优化以增加递送的蛋白的量。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用PBS或1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔHairpinI-virF pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2静脉注射小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。将肿瘤体积相对于第0天的肿瘤体积进行标准化，以弥补肿瘤大小的任意初始不均匀性。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔHairpinI-virF pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2处理显示对肿瘤体积发展具有影响，在细菌施用后第8、9和10天具有统计学显著的肿瘤减少(图9)。重要的是，发现单独的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT对4T1鼠癌症模型中的肿瘤发展没有影响(图10)。这些发现强调了这种细菌及其T3SS可用于干扰肿瘤发展。
位于编码AraC型DNA结合蛋白的基因的上游的RNA热传感器区域内具有缺失的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT
大多数已知的耶尔森氏菌毒力基因不在真核宿主外表达，仅在进入宿主环境后被诱导。这些毒力基因的表达是由与进入宿主相关的温度突然升高诱导的。特别是，pYV编码的毒力因子(如T3SS及其效应蛋白(Yop的))以这种方式被调节。在室温(20-25℃)下，T3SS调节、T3SS自身形成和递送的效应子所需的基因不表达，并且仅在温度升高至37℃后，表达才被诱导。大多数pYV编码的毒力基因(yadA和T3SS相关基因)的表达由温度诱导，并且需要小肠结肠炎耶尔森氏菌中的AraC型DNA结合蛋白VirF(其他耶尔森氏菌种中的LcrF)。LcrF表达的温度调节被认为是通过在较高温度下mRNA中的RNA茎环的融解而发生的，其在未融化时会隔离核糖体结合位点，从而阻止翻译51。相反，在小肠结肠炎耶尔森氏菌中，VirF的转录主要表现为依赖于温度52。最近的研究示出了更为复杂的图片，其中包含一种称为YmoA的不耐热调节子51，而位于LcrF上游的RNA热传感器被发现主要负责LcrF的温度调节，因此，LcrF是温度依赖性毒力基因。
为了增加从pYV的天然YopE启动子下表达的异源运载物的分泌水平，我们意图删除小肠结肠炎耶尔森氏菌中位于VirF上游的这些RNA发夹结构之一。虽然在小肠结肠炎耶尔森氏菌中没有清楚地显示这种RNA茎环的重要性，并且温度诱导被归因于转录的变化，但我们可以确定位于小肠结肠炎耶尔森氏菌VirF上游的发夹I51。然后我们通过同源重组去除了发夹I的部分(如51中的-111至-57)，并在体外分泌测定中评估了pYV编码的YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO：27)或YopE1-138–鼠RIG-1 CARD2蛋白(SEQ ID NO：38)(各自在YopE的天然位点处)的分泌能力(图11)。令人惊讶的是，小肠结肠炎耶尔森氏菌中VirF上游的发夹区I的一部分的缺失增加了体外异源蛋白的分泌(图11A和B)，这与先前关于小肠结肠炎耶尔森氏菌的报道52相反，其中VirF的转录被认为是温度调节的主要驱动力。
为了能够人工诱导T3SS的表达和T3SS对蛋白的递送，我们在另一个菌株中用阿拉伯糖诱导型启动子(已知其来自pBad-MycHisA)替换pYV上的VirF的内源启动子。除了替换VirF的启动子外，我们还在上游(以相反的方向)引入了完整的araC基因。然后我们在体外分泌测定中，在阿拉伯糖存在或不存在的情况下，评估了YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ IDNO：27)(pYV编码的；在YopE的天然位点处)的分泌能力(图11A)。仅在添加阿拉伯糖后才发现异源蛋白由T3SS分泌，这与阿拉伯糖对VirF表达的调节一致。
具有增加的异源运载物稳定性(体外和体内)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT
在我们的小鼠实验中，小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T显示是一种靶向实体瘤的高度特异性菌株，而细胞毒性蛋白的T3SS依赖性递送在癌细胞的细胞培养中被发现是有效的。为了结合这两种性状，最好需要对实体肿瘤定殖细菌进行工程化，以便在体内数天或甚至数周内稳定编码细胞毒性运载物。由于监管要求，使用经典的抗生素抗性来维持细菌中的外源质粒是不受欢迎的。因此，我们在鼠同种异体移植研究中评估了无抗生素抗性的质粒维持系统。该系统基于必需基因(例如天冬氨酸-半醛脱氢酶，asd)的染色体缺失，并在异源质粒上编码相同基因以维持细菌生长。在之前53已经显示了用于质粒维持的asd缺失的互补，但已经报道了在重复性和数日内持久性方面的困难54。我们将该系统进行调整用于在小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T使用，其中我们另外删除了染色体编码的asd(得到小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd)，然后使其在中等拷贝数质粒pBad-MycHisA上恢复(pBad-MycHisA-asd)。从小肠结肠炎耶尔森氏菌8081克隆asd基因(连同其内源启动子和转录终止子)，并分别以正向和反向方向插入到pBad-MycHisA的PciI位点中。在体外培养瓶(BHI培养基)中将所得菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd+pBad-MycHisA-asd(正向或反向asd方向)的生长行为与野生型和亲本小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd菌株进行比较(图12)。在两种方向中，pBad-MycHisA-asd均拯救了在asd缺失时观察到的表型(图12)。相反，在B16F10黑素瘤小鼠模型以及4T1模型中，我们发现小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd+pBad-MycHisA-asd不能充分地定殖实体瘤(图13和14)，并且我们无法从分离的少数菌落中回收pBad-MycHisA-asd质粒。此外，证实从B16F10黑素瘤小鼠模型中分离的菌落能够在含氨苄青霉素的平板上生长，这证明存在编码氨苄青霉素抗性的pBad-MycHisA-asd质粒。在静脉注射后的第4天，只有一小部分分离的菌落表现出氨苄青霉素抗性(图13)。这可能反映了pBad-MycHisA-asd的丢失，但也可能与仅氨苄青霉素抗性基因的丢失有关，或者难以快速重新启动氨苄青霉素抗性基因的表达以避免被氨苄青霉素杀死。在任何情况下，在B16F10黑素瘤小鼠模型以及4T1模型中观察到的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd+pBad-MycHisA-asd的肿瘤定殖均显示实体肿瘤内的细菌计数迅速下降，这与小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T相反。因此，染色体asd的缺失和pBad-MycHisA上的互补导致体内细菌适应性急剧下降。这一观察结果与asd水平失衡时活力降低的报告54一致。
被T3SS转运的内源蛋白(称为“耶尔森氏菌外蛋白”，Yop)由小肠结肠炎耶尔森氏菌在一个70kb质粒上编码。该质粒被命名为耶尔森氏菌毒力质粒(pYV)，其还编码T3SS系统。我们已经评估了pYV质粒在4T1鼠同种异体移植模型中的稳定性。我们已经成功地从感染小鼠后第9天或第10天收集的菌株中分离了pYV(图15)。在体内实体瘤中生长8天后，我们进一步进行了测试，证实了分离的细菌菌株的T3SS的存在和功能。因此，我们将pYV视为编码用于体内递送的异源运载物的选择载体。然而，我们发现在小鼠的4T1实体瘤中生长9-10天后，携带pYV质粒的细菌菌落的百分比是各种各样的(图15)。除了pYV的内在不稳定性之外，菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T失去了增加毒力的Yop在体内的选择优势。
为了稳定pYV并因此稳定在pYV上编码的异源运载物，我们将“asd”系统进行改变用于在小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,T中在pYV上使用。我们删除了染色体编码的asd(得到小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd)，然后使其在pYV上恢复(称为pYV-asd)。
从小肠结肠炎耶尔森氏菌8081(小肠结肠炎耶尔森氏菌亚种小肠结肠炎8081)克隆asd基因(连同其内源启动子和转录终止子)，并通过同源重组插入到pYV(插入到SycO之前的天然插入区域中)。在体外培养瓶(BHI培养基)中将所得菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd+pYV-asd的生长行为与野生型和亲本小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd菌株进行比较(图12)。pYV-asd能够拯救在asd缺失时观察到的表型(图12)，但拯救不完全，并且可以观察到轻微的体外生长降低。相反，在体内同系4T1鼠癌模型中，我们发现小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd+pYV-asd有效地定殖实体瘤(图16)。引人注目的是，发现在注射后第9-10天从实体瘤中分离的所有菌落仍然含有pYV质粒(在含有亚砷酸盐的生长平板上进行选择；亚砷酸盐抗性与pYV上arsRBC基因的存在有关55)(图15)因此，在小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH,O,P,E,M,TΔasd菌株背景下，pYV-asd令人惊讶地显示是一种体内稳定载体，用于通过使细菌在几天和几周内定殖而编码待在实体瘤中表达的异源蛋白。
小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT在延缓肿瘤发展方面的功效和改变VirF活性以及增加稳定性的影响
在EMT6乳腺癌小鼠模型中进行与4T1细胞相似的实验(图9和10)，其中用EMT6乳腺癌细胞皮下注射野生型Balb/C小鼠使其被同种异体移植，并且一旦肿瘤的大小达到约80-250mm3，则通过单次静脉注射细菌对其进行治疗。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天，所有小鼠在第0天的前一天腹膜内注射得斯芬。与盐水溶液相比，用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT治疗不影响肿瘤发展。小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBIDBH3)2对肿瘤发展有轻微影响，所述发展通过使用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔHairpinI-VirF pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2被增强(图45)。这些发现强调，在体内给药后，这些细菌及其T3SS可用于干扰肿瘤发展，并且VirF活性的控制可用于调节细菌T3SS活性。此外，使用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTΔHairpinI-VirFΔasd pYV-asd-YopE1-138-(tBID BH3)2进一步增强了对肿瘤发展的影响(图45)，突出了在全身给药后增加的遗传稳定性的益处。
通过细菌T3SS递送RIG-1样受体途径触发蛋白以诱导I型IFN应答
细胞溶质核酸被作为RIG-1样受体(RLR)家族成员的受体检测，所述RIG-1样受体(RLR)家族成员检测细胞溶质中病原体衍生的RNA56。RIG-1和MDA5由两个N-末端CARD结构域和一个检测特定核苷酸的中心(DExD/H)解旋酶结构域组成56。与刺激性RNA的结合诱导RIG-1(和MDA5)的结构重排，其释放其CARD用于随后与未锚定的K63-连接的泛素链缔合以形成寡聚体56(在MDA5的情况下形成细丝)。RIG-1和MDA5的寡聚化CARD结构域与MAVS的CARD结构域相互作用。这种相互作用促进了MAVS的单个CARD结构域的聚合，其诱导下游信号传导，最终导致I型IFN基因的诱导56。
我们产生了表达人源或鼠源RIG-1的两个N-末端CARD结构域的细菌菌株，所述两个N-末端CARD结构域与用于被T3SS递送的N-末端细菌分泌信号(具体为YopE1-138)融合(SEQID NO：37和38)。通过标准体外分泌测定法评估融合蛋白YopE1-138-RIG-1 CARD2的递送，并且在报告细胞系上评估了递送的蛋白用于诱导I型IFN的功能性。用于I型IFN刺激的鼠B16F10黑素瘤报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138-RIG-1 CARD2蛋白。鼠和人的RIG-1的N-末端CARD结构域显示在报告细胞系中诱导剂量依赖性I型IFN应答(图17)，而细菌背景菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)不能诱导这种应答(图17)。人和鼠RIG-1 CARD结构域在鼠报告细胞系中诱导类似的I型IFN应答(图17)，这与高序列同一性(76％)和相似性(88.5％)一致。
因此，与细菌的N-末端分泌信号的融合导致细菌表达的人和鼠YopE1-138-RIG-1CARD2蛋白的成功递送，并且不阻碍RIG-1 CARD结构域在真核细胞内的折叠和功能。这意味着，YopE融合的RIG1 CARD结构域仍能够自我多聚化并诱导MAVS的多聚化，这是令人惊讶的。
在使用该B16F10I型IFN报告细胞系的进一步实验中，我们将小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT与在pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)YopE1-138-MycHis或YopE1-138-人Rig1CARD2上编码的的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT进行了比较。同样，人RIG-1 CARD结构域的递送诱导了剂量依赖性的I型IFN应答，而小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT或递送YopE1-138-MycHis的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT对I型IFN应答没有影响(图18)。在相同的测定中，我们将递送RIG-1 CARD结构域的细菌的I型IFN诱导潜力与阳性对照(鼠干扰素γ(IFNγ))进行了比较。非常令人惊讶的是，RIG-1 CARD结构域的细菌递送能够诱导报告细胞系的最大应答，类似于由I型IFN诱导的阳性对照(IFNγ)获得的应答(图18和19)。
在进一步的实验中，我们感染了4T1鼠乳腺癌细胞或野生B16F10黑素瘤细胞，并在4小时后将可能含有IFN的上清液转移到B16F10I型IFN报告细胞系上。这样，我们将小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT与在内源毒力质粒(pYV)YopE1-138-鼠RIG1 CARD2上编码的的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT进行了比较。在野生型B16F10(图20)或4T1细胞(图21)中，pYV编码的鼠RIG-1 CARD结构域的递送诱导了剂量依赖性的I型IFN应答，而小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT对I型IFN应答没有影响。
在进一步的实验中，对由不同长度的鼠RIG-1 CARD组成的几种形式评估了其诱导I型IFN应答的潜力。预测RIG-1的CARD结构域由第1-172位氨基酸(鼠序列，UniprotNr.Q6Q899)编码。我们在B16F10黑素瘤IFN报告细胞以及RAW巨噬细胞IFN报告细胞上评估了YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-229和YopE1-138-鼠RIG1CARD结构域1-218(图27-28)。发现YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246、YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-229和YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218具有同等的活性。
在后续实验中，我们评估了细菌递送的MDA5的效力。我们克隆了由不同长度的鼠MDA5CARD组成的几种形式，并评估了它们在B16F10 IFN报告细胞上诱导I型IFN应答的潜力。预测MDA5的CARD结构域由第1-190位氨基酸(鼠序列，Uniprot Nr.Q8R5F7)编码。我们在B16F10黑素瘤IFN报告细胞上评估了YopE1-138-鼠MDA5CARD结构域1-294和YopE1-138-鼠MDA5CARD结构域1-231。发现所有变体都是有活性的(图29)。令人惊讶的是，发现递送的MDA5CARD的活性远不如RIG-1 CARD，即使这些蛋白具有非常相似的生物学功能和蛋白结构(由两个N-末端CARD结构域和一个检测特定核苷酸的中心(DExD/H)解旋酶结构域组成56)。
通过细菌T3SS递送cGAS/STING途径触发蛋白以诱导I型IFN应答
在cGAS/STING途径中，通过与酶环状GMP-AMP合酶(cGAS)结合来检测细胞溶质双链DNA。在dsDNA结合后，cGAS被激活并产生环状CDN第二信使——环状GMP-AMP(cGAMP)。然后cGAMP直接与内质网受体蛋白STING(IFN基因的刺激子)结合。结合cGAMP后，STING被激活并诱导信号转导通路，导致I型IFN和其他共调节基因的转录57。人cGAS产生2’,3’cGAMP(含有2'-5'和3'-5'磷酸二酯键)，但已显示其他CDN能够在不同水平诱导鼠或人STING。这包括3’,3’cGAMP(例如由霍乱弧菌DncV或一些真核cGAS产生)、环状二-AMP(例如由不同革兰氏阳性物种的CdaA或DisA产生)或环状二-GMP(例如由铜绿假单胞菌WspR产生)57,58。虽然野生型人STING(和鼠STING)识别2’,3’cGAMP、3’,3’cGAMP、环状二-AMP和环状二-GMP，但几种天然人STING变体对这些激动剂的反应不同59。
为了在细菌递送蛋白后激活cGAS/STING途径，我们克隆了产生环状二-GMP的铜绿假单胞菌WspR，用于被表达并通过T3SS被小肠结肠炎耶尔森氏菌递送。为了增加WspR的活性，仅使用其GGDEF结构域(二鸟苷酸环化结构域)，并且上游茎结构域被替换为来自酵母的GCN4的亮氨酸-拉链(zipper)基序。已知WspR的二聚化是其活性所必需的，并且已显示GCN4的亮氨酸拉链形成平行的卷曲螺旋，因此被用作强二聚化单元。将GCN4基序融合到WspR的GGDEF结构域，其中包括GGDEF和螺旋茎之间的天然接头，以允许与野生型WspR相当的结构域间灵活性60。
在报告细胞系上评估了递送YopE1-138–GCN4亮氨酸拉链-WspR GGDEF结构域(缩写：YopE1-138–WspR)(SEQ ID NO：39)的I型IFN诱导作用。用于I型IFN刺激的鼠B16F10黑素瘤报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138-WspR蛋白。与GCN4亮氨酸拉链基序融合的铜绿假单胞菌WspR GGDEF结构域显示在报告细胞系中诱导剂量依赖性的I型IFN应答(图22)，而细菌背景菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)不能诱导这种应答(图22)。
因此，与细菌的N-末端分泌信号的融合导致细菌表达的YopE1-138-GCN4亮氨酸拉链(酵母)-WspR GGDEF(铜绿假单胞菌)蛋白的成功递送，并且不阻碍这种三方(tri-partite)蛋白在真核细胞内的折叠和功能。这意味着，YopE融合的GCN4亮氨酸拉链-WspR GGDEF仍然能够二聚化，从而得到有活性的GGDEF结构域，这是令人惊讶的。
对于进一步的实验，我们克隆了霍乱弧菌DncV(产生3’,3’cGAMP)57、蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白(产生环二-AMP)61和真核生物Anemonae(Nematostella vectensis)cGAS(产生3’,3’cGAMP)57(在没有外部刺激的情况下，其具有活性)，用于被细菌表达和转运。DisA型环化酶通常形成八聚体61，其可能与N-末端YopE融合和细菌递送不相容。基于与经典DisA蛋白的二硫酸环化酶(DAC)结构域的结构相似性鉴定了蜡样芽孢杆菌DisA样(PDB代码2fb5)61，但有趣的是其缺少多聚化所需的其他DisA蛋白已知的所有螺旋。因此，我们决定利用来自蜡样芽孢杆菌的可能单体活性DisA样蛋白(PDB代码2fb5；残基76-205)。
在报告细胞系上评估了递送融合蛋白YopE1-138–霍乱弧菌DncV(SEQ ID NO：41)、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白(SEQ ID NO：42)和YopE1-138-Anemonae cGAS(SEQ IDNO：43)的I型IFN诱导作用。用于I型IFN刺激的鼠B16F10黑素瘤报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138–霍乱弧菌DncV、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白和YopE1-138-Anemonae cGAS。YopE1-138–霍乱弧菌DncV、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白和YopE1-138-Anemonae cGAS均显示在报告细胞系中诱导了剂量依赖性的I型IFN应答(图23)，而细菌背景菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)或递送YopE1-138-MycHis的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT不能诱导这种应答(图23)。产生3’,3’cGAMP的Anemonae(Nematostella vectensis)cGAS显示出最高的活性，而发现霍乱弧菌DncV(产生3’,3’cGAMP)和蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白(产生环状二-AMP)类似地激活I型IFN应答。
因此，与细菌的N-末端分泌信号的融合导致细菌表达的YopE1-138–霍乱弧菌DncV、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白和YopE1-138-Anemonae cGAS蛋白的成功递送，并且不阻碍这些蛋白在真核细胞内的折叠和功能，这是无法预测的。
或者，克隆了鼠IRF3(RLR或cGAS/STING依赖性信号传导下游的中心转录因子62)用于被细菌表达和转运。在没有活化的情况下，IRF-3在细胞质中处于潜伏构象。仅在激活上游受体如RIG-1、MDA5或STING后，IRF-3才通过TBK1和IKKβ被磷酸化并因此被激活。IRF-3的磷酸化导致二聚化、转运至细胞核并与共激活子结合62。为了达到IRF3的组成型活性形式，我们用Asp替换了最重要的磷酸化位点之一(鼠IRF3中的Ser397)62。
在体外分泌测定中评估了融合蛋白YopE1-138–鼠IRF3 Ser397Asp(SEQ ID NO：40)的递送，其中人工诱导蛋白分泌到周围液体中。在基于TCA的蛋白沉淀之后，使用抗-YopE抗体的蛋白印迹分析来确定分泌的蛋白量(图24)。虽然编码YopE1-138-鼠tBID BH3的ΔHOPEMT菌株在分泌的部分中产生了强条带(在15-20kDa)，但发现也分泌了YopE1-138–鼠IRF3Ser397Asp(在50-75Da)，虽然程度较轻(图24)。总细菌细胞部分分析显示YopE1-138-鼠tBIDBH3和YopE1-138–鼠IRF3 Ser397Asp的表达水平相当，而YopE1-138–鼠IRF3 Ser397Asp显示降解条带的模式(图24)。
通过细菌T3SS递送cGAS/STING和RIG-1样受体途径触发蛋白以诱导免疫细胞中的I型IFN应答
在免疫报告细胞系上评估了递送融合蛋白YopE1-138–鼠RIG-1 CARD2、YopE1-138–霍乱弧菌DncV、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白和YopE1-138-Anemonae cGAS的I型IFN诱导作用。用于I型IFN刺激的鼠RAW264.7巨噬细胞报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138–鼠RIG-1 CARD2、YopE1-138–霍乱弧菌DncV、YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白和YopE1-138-Anemonae cGAS。YopE1-138–鼠RIG-1CARD2、YopE1-138–霍乱弧菌DncV和YopE1-138-Anemonae cGAS均显示在这种免疫报告细胞系中诱导了剂量依赖性I型IFN应答(图25)，而细菌背景菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)不能诱导这种应答(图25)。YopE1-138–鼠RIG-1 CARD2显示出最高活性，其次是产生3’,3’cGAMP的Anemonae(Nematostella vectensis)cGAS和霍乱弧菌DncV(产生3’,3’cGAMP)。蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白(产生环状di-AMP)被发现仅微弱地激活I型IFN应答
对于进一步的实验，我们克隆了人cGAS第161-522位氨基酸(Uniprot Nr.Q8N884和SEQ ID No.115；产生2’,3’cGAMP)57，用于被细菌的表达和转运。用于I型IFN刺激的鼠B16F10黑素瘤和鼠RAW巨噬细胞报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138–人cGAS161-522蛋白，并显示在报告细胞系中以剂量依赖性的方式诱导I型IFN应答，还用不同量(MOI)的细菌菌株感染报告细胞，其中所述细菌菌株表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138-Anemonae cGAS、YopE1-138-Anemonae cGAS60-422、YopE1-138-利斯特氏菌CdaA101-273、YopE1-138-霍乱弧菌DncV或YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白(图32-33)。用YopE1-138–人cGAS161-522观察到了最强的活化，其次是YopE1-138-Anemonae cGAS、YopE1-138-Anemonae cGAS60-422。有趣的是，较短的Anemonae cGAS60-422变体具有稍微更高的活性。YopE1-138-利斯特氏菌CdaA101-273、YopE1-138-霍乱弧菌DncV或YopE1-138-蜡样芽孢杆菌DisA样蛋白也呈现剂量依赖性的IFN活化，虽然比cGAS蛋白的程度小(图32-33)。
通过细菌T3SS递送MAVS以诱导I型IFN应答
细胞溶质核酸被作为RIG-1样受体(RLR)家族成员的受体检测，所述RIG-1样受体(RLR)家族成员检测细胞溶质中病原体衍生的RNA56。RIG-1和MDA5由两个N-末端CARD结构域和一个检测特定核苷酸的中心(DExD/H)解旋酶结构域组成56。与刺激性RNA的结合诱导RIG-1(和MDA5)的结构重排，其释放其CARD用于随后与未锚定的K63-连接的泛素链缔合以形成寡聚体56(对于MDA5形成细丝56)。RIG-1和MDA5的寡聚化CARD结构域与MAVS的CARD结构域相互作用。这种相互作用促进了MAVS的单个CARD结构域的聚合，其诱导下游信号传导，最终导致I型IFN基因的诱导56。
我们产生了表达人源MAVS的N-末端CARD结构域的细菌菌株(基于小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)，所述N-末端CARD结构域与用于被T3SS递送的N-末端细菌分泌信号(具体为YopE1-138)融合。通过标准体外分泌测定法评估了融合蛋白YopE1-138–MAVS CARD的递送，并且在报告细胞系上评估了递送的蛋白用于诱导I型IFN的功能性。用于I型IFN刺激的鼠B16F10黑素瘤或鼠RAW巨噬细胞报告细胞基于分泌的碱性磷酸酶的活性，所述碱性磷酸酶在I-ISG54启动子的控制下，所述I-ISG54启动子由通过多聚ISRE增强的IFN诱导型ISG54启动子组成。用不同量(MOI)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染报告细胞，其中所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT表达自pBadMycHisA衍生质粒(pBad_Si2)并转运YopE1-138–人MAVS CARD蛋白。MAVS的小鼠N-末端CARD结构域显示在报告细胞系中诱导了剂量依赖性的I型IFN应答(图30-31)，而细菌背景菌株(小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT)不能诱导这种应答(图30-31)。人cGAS和鼠RIG-1 CARD结构域以相似的方式在鼠报告细胞系中诱导了I型IFN应答(图30-31)，其中RIG-1显示出最高的活化潜力，其次是MAVS和cGAS。
因此，与细菌的N-末端分泌信号的融合导致细菌表达的人YopE1-138-MAVS CARD蛋白成功递送，并且不阻碍MAVS CARD结构域在真核细胞内的折叠和功能。这意味着，YopE-融合的MAVS CARD结构域仍能够自我多聚化并诱导MAVS的多聚化，这是令人惊讶的。更令人惊讶的是，仅MAVS CARD显示不能诱导IFN下游信号传导64，而我们发现YopE融合的MAVS CARD结构域强烈地激活I型IFN途径。
此外，MAVS的C-末端跨膜结构域已被证明在DNA转染后对于MAVS的功能是必需的，并且当从转染的DNA构建体表达时，单独的MAVS CARD结构域显示无活性66。甚至，与跨膜区域融合的MAVS CARD(当从转染的DNA表达或作为纯化的蛋白时，其具有激活I型IFN应答的能力64,66)显示依赖于内源MAVS，其开始聚集并因此激活内源MAVS64。我们可以通过使用MAVS KO细胞系显示(图52)，在线粒体上不存在内源MAVS的情况下，细菌递送的YopE融合的MAVS CARD是有活性的。YopE融合的MAVS CARD能够在没有跨膜结构域的情况下多聚化和激活下游伴侣，而且在没有内源MAVS的情况下也是如此，这是令人惊讶的。
对小分子STING激动剂进行基准测试以在体外诱导I型IFN应答
环状二核苷酸是众所周知的STING途径的激动剂，导致I型IFN信号传导的下游诱导。STING激动剂已在文献59中描述，并且已被发现主要作用于免疫细胞，在树突细胞上显示最高活性59。相反，发现RLR信号传导更普遍地表达63。因此我们在免疫细胞(RAW巨噬细胞IFN报告细胞)和非免疫细胞(B16F1黑素瘤IFN报告细胞)上对于干扰素诱导潜力比较了递送环状二核苷酸生成酶(YopE1-138-Anemonae cGAS和YopE1-138-人cGAS)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT细菌或递送YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218的细菌与小分子STING激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)(类似于Aduro Biotech的ADU-S100)。在免疫细胞上，观察到小分子STING激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)和所有三种所测试的递送蛋白(YopE1-138-Anemonae cGAS、YopE1-138-人cGAS或YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218)的细菌菌株具有相似的激活潜力，而不递送蛋白的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT细菌显示出非常弱的激活潜力(图34-37)。在非免疫细胞(癌细胞、黑素瘤)上，细菌递送的YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-218、细菌递送的YopE1-138-Anemonae cGAS和YopE1-138-人cGAS同样良好，几乎优于小分子STING激动剂，突出了RLR与STING相比更普遍的存在(图34-37)。
细菌递送的RIG1 CARD结构域或MAVS CARD的严格T3SS依赖性
为证实严格的T3SS依赖性转运，使形成进入真核细胞膜的转运孔的一种T3SS蛋白缺失(YopB)。在RAW巨噬细胞IFN报告细胞系上评估了表达YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246或YopE1-138–人MAVS CARD1-100的这种yopB缺失细菌(称为小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT-yopB)的潜力，并与表达yopB且表达YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246或YopE1-138–人MAVS CARD1-100的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT细菌进行比较(图38)。虽然表达YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246或YopE1-138–人MAVS CARD1-100的yopB-野生型细菌表现出I型IFN应答的剂量依赖性激活，但表达相同蛋白的yopB缺失菌株未能诱导这种超过由不表达待递送蛋白的背景细菌菌株诱导的背景水平的应答(图38)。这证实，YopE1-138-鼠RIG1CARD结构域1-246或YopE1-138–人MAVS CARD1-100都通过T3SS针被转运到靶真核细胞中。
在粗肿瘤分离物中诱导I型IFN应答
为了验证可以在肿瘤微环境中启动I型IFN应答，我们对用细菌菌株离体感染的粗肿瘤分离物进行了分析，然后进行关于干扰素β的ELISA。当肿瘤的体积达到时，处死通过皮下注射EMT6乳腺癌细胞而被同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将肿瘤捣碎、消化并作为单细胞悬浮液接种到24孔板中。来自两个不同肿瘤的这种细胞不被感染(图39中的虚线)或者被小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT或在pBadMycHisA衍生质粒上编码YopE1-138-鼠RIG1CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT感染。使用关于干扰素β的ELISA评估IFN刺激，并且显示虽然小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT不能诱导干扰素β分泌，但是编码YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT导致两种不同肿瘤的粗肿瘤分离物剂量依赖性地分泌干扰素β(图39)。这证实，细菌递送的RIG1 CARD结构域能够在由癌细胞、免疫细胞和肿瘤微环境中的所有其他细胞组成的混合细胞群中诱导干扰素产生。
递送RIG1 CARD或cGAS的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT在延缓肿瘤发展中的功效
为了评估递送至肿瘤细胞的YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246和YopE1-138-人cGAS的体内影响，我们在用EMT6乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中进行了研究。一旦肿瘤的大小达到约60-130mm3，则给小鼠肿瘤内(it)注射PBS(图40)或7.5*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT、小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138鼠RIG1CARD结构域1-246或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138人cGAS。将第一次注射细菌的那一天定义为第0天。在第0天、第1天、第5天、第6天、第10天和第11天，给小鼠肿瘤内注射。在随后的几天用测径器测量肿瘤体积。单独使用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT治疗显示出对肿瘤体积发展具有影响，其中4/14小鼠表现出完全的肿瘤消退(图41)。发现递送诱导I型IFN应答的蛋白(即RIG1 CARDS或cGAS)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT对肿瘤发展产生更显著的影响，其中分别有8/14(RIG1 CARD)或8/15(cGAS)小鼠显示出完全且持久的肿瘤消退(图42-43)。这些发现强调，这些细菌及其T3SS可用于非常显著地干扰肿瘤发展，并且递送I型IFN诱导蛋白非常适合于诱导原发性肿瘤的消退。
进一步观察肿瘤完全消退的小鼠直至初始肿瘤同种异体移植后的第65天，然后在第65天在对侧侧腹上用EMT6乳腺癌细胞再次激发以评估对这些癌细胞的免疫介导的记忆活性和全身活性。在这次再激发研究中，没有进行另外的治疗，并且只观察小鼠对侧侧腹上的肿瘤发展，并与空白小鼠(之前暴露于EMT6乳腺癌细胞的小鼠，但所有其他参数(如年龄)相同)进行比较。在空白小鼠中，通过皮下注射而同种异体移植的肿瘤细胞导致肿瘤生长，但所有先前在相对侧腹用EMT6肿瘤处理且完全消退的小鼠均免于肿瘤生长(图44)。值得注意的是，先前在对侧侧腹上被细菌治疗诱导完全消退的小鼠中的肿瘤开始生长数日，体积达到>100mm3(第二次移植后第10天左右达到峰值体积)，此后缩小(图44)。这个滞后期可能表明在充分工作前需要几天的获得性免疫系统应答。
在评估递送至肿瘤细胞的YopE1-138-鼠RIG1 CARD结构域1-246和YopE1-138-人cGAS的体内影响的进一步实验中，我们在用B16F10黑素瘤癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型C57BL/6小鼠中进行了研究。一旦肿瘤的大小达到约75mm3，则给小鼠肿瘤内注射PBS或7.5*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT、小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138鼠RIG1 CARD结构域1-246或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+YopE1-138人cGAS。将第一次注射细菌的那一天定义为第0天。在第0天、第1天、第2天、第3天、第6天和第9天，给小鼠肿瘤内注射。在随后的几天用测径器测量肿瘤体积。单独使用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT治疗显示出对肿瘤体积发展具有影响，其中1/15小鼠表现出完全的肿瘤消退(图46)。发现递送诱导I型IFN应答的蛋白(即RIG1 CARDS或cGAS)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT对肿瘤发展产生非常显著的影响，其中分别有5/15(RIG1 CARD)或8/15(cGAS)小鼠显示出完全且持久的肿瘤消退(图46)。这些发现强调这些细菌及其T3SS可用于非常显著地干扰肿瘤发展，并且递送I型IFN诱导蛋白非常适合于诱导原发性肿瘤的消退。值得注意的是，特别是在细菌递送YopE1-138-人cGAS的情况下，与PBS处理的对照相比，在第一次施用后不久观察到了肿瘤体积增加，这可能是由细胞内递送诱导I型IFN的cGAS蛋白所诱导的白细胞流入肿瘤内而诱导的。
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<212> PRT
<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）
<400> 1
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Gly Ser Gly Pro Leu Arg
130 135 140
Gly Ser Ile Thr Gln Cys Gln Gly Leu Met Gln Phe Cys Gly Gly Glu
145 150 155 160
Leu Gln Ala Glu Ala Ser Ala Ile Leu Asn Thr Pro Val Cys Gly Ile
165 170 175
Pro Phe Ser Gln Trp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Ser Ala Tyr Val
180 185 190
Ala Ser Gly Val Asp Leu Thr Gln Ala Ala Asn Glu Ile Lys Gly Leu
195 200 205
Gly Gln Gln Met Gln Gln Leu Leu Ser Leu Met
210 215
<210> 2
<211> 138
<212> PRT
<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）
<400> 2
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr
130 135
<210> 3
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-MycHis
<400> 3
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu
130 135 140
Lys Leu Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser
145 150 155 160
Ala Val Asp His His His His His His
165
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）
<400> 4
Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn
1 5 10 15
Lys Leu Pro His
20
<210> 5
<211> 210
<212> PRT
<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）
<400> 5
Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn
1 5 10 15
Lys Leu Pro His Val Ala Ala Gly Asp Tyr Glu Asn Lys Leu Ser Thr
20 25 30
Lys Ile Met Lys Gly Ile Leu Tyr Val Leu Thr Ala Gly Leu Ala Tyr
35 40 45
Gly Phe Thr Arg Val Ile Glu His Tyr Cys Asn Val Thr Pro Lys Val
50 55 60
Ala Glu Phe Cys Ala Asn Ala Gly Asn Ile His Asn His Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Arg Asp Gly Leu Phe Thr Ile Asp Val Glu Leu Ser Asp Gly
85 90 95
Arg Met Leu Thr Phe Glu Gln Leu Ser Leu Ile Ala Glu Gly Lys Pro
100 105 110
Ile Val Arg Ile Ser Asp Gly Glu His Thr Val Glu Val Glu Gly Thr
115 120 125
Phe Glu Glu Ile Cys Met Arg Leu Glu Glu Gly Phe Phe Glu Ala Pro
130 135 140
Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Asp Glu Lys Tyr Lys Thr Val Arg Glu
145 150 155 160
Arg Met Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Ala Leu Gly Ala Ile Pro
165 170 175
Cys Leu Glu Tyr Tyr Ile Ala Arg Ala Ser Asn Met Gln Glu Ala Lys
180 185 190
Ala Gln Trp Ala Ala Asp Ile Lys Ala Arg Tyr His Asn Tyr Leu Asp
195 200 205
Asn Tyr
210
<210> 6
<211> 81
<212> PRT
<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）
<400> 6
Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys
35 40 45
Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr
50 55 60
His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn
65 70 75 80
Lys
<210> 7
<211> 105
<212> PRT
<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）
<400> 7
Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys
35 40 45
Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr
50 55 60
His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn
65 70 75 80
Lys Val Val Lys Asp Phe Met Leu Gln Thr Leu Asn Asp Ile Asp Ile
85 90 95
Arg Gly Ser Ala Ser Lys Asp Pro Ala
100 105
<210> 8
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - Ink4C
<400> 8
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ala
130 135 140
Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp Leu
145 150 155 160
Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn Ala Gln
165 170 175
Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly Asn Pro
180 185 190
Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn Pro Asp Leu Lys
195 200 205
Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Ala Gly Phe
210 215 220
Leu Asp Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe Gln Ala Asp Val Asn Ile
225 230 235 240
Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Glu Gly
245 250 255
His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser Asn Val
260 265 270
Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala Arg Leu
275 280 285
Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Thr Asn Leu Gln
305 310
<210> 9
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - ET1
<400> 9
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Pro
130 135 140
Arg Pro Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala Thr Val
145 150 155 160
Val Leu Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala
165 170 175
Lys Glu Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe Thr Asn
180 185 190
Arg Asp Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu Gln Val
195 200 205
Arg His Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu
210 215 220
Trp Glu Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg Asn Asp
225 230 235 240
Phe Ser Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val Pro Glu
245 250 255
Leu Arg Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu Gly Ile
260 265 270
Arg Lys Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu Leu Leu
275 280 285
His Ser Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp Pro Asp
290 295 300
Gly Glu Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile Leu Cys
305 310 315 320
Leu Met Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala His Ala
325 330 335
Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile
340 345 350
Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly
355 360 365
Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg
370 375 380
Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
385 390 395 400
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
405 410 415
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
420 425 430
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
435 440 445
Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
450 455 460
Gly
465
<210> 10
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 2x TEV位点 - INK4C
<400> 10
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Ala Glu Pro
145 150 155 160
Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp Leu Glu Gln
165 170 175
Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn Ala Gln Asn Gly
180 185 190
Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly Asn Pro Glu Ile
195 200 205
Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg
210 215 220
Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Ala Gly Phe Leu Asp
225 230 235 240
Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe Gln Ala Asp Val Asn Ile Glu Asp
245 250 255
Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Glu Gly His Leu
260 265 270
Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser Asn Val Gly His
275 280 285
Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala Arg Leu Tyr Gly
290 295 300
Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly Ala Gly Gly Ala
305 310 315 320
Thr Asn Leu Gln
<210> 11
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 2x TEV位点 - ET1
<400> 11
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Pro Arg Pro
145 150 155 160
Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala Thr Val Val Leu
165 170 175
Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala Lys Glu
180 185 190
Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe Thr Asn Arg Asp
195 200 205
Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu Gln Val Arg His
210 215 220
Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Trp Glu
225 230 235 240
Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg Asn Asp Phe Ser
245 250 255
Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val Pro Glu Leu Arg
260 265 270
Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu Gly Ile Arg Lys
275 280 285
Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu Leu Leu His Ser
290 295 300
Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp Pro Asp Gly Glu
305 310 315 320
Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile Leu Cys Leu Met
325 330 335
Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala His Ala Ser Ala
340 345 350
Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly
355 360 365
Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala
370 375 380
Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser
385 390 395 400
Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp
405 410 415
Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
420 425 430
Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
435 440 445
His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
450 455 460
Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
465 470 475
<210> 12
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - TEV蛋白酶S219V
<400> 12
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Glu Ser Leu Phe
130 135 140
Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser Thr Ile Cys His Leu
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu Tyr Gly Ile Gly Phe
165 170 175
Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly
180 185 190
Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val Lys Asn Thr
195 200 205
Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg Asp Met Ile Ile Ile
210 215 220
Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln Lys Leu Lys Phe Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val Thr Thr Asn Phe Gln
245 250 255
Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr Ser Cys Thr Phe Pro
260 265 270
Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile Gln Thr Lys Asp Gly
275 280 285
Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp Gly Phe Ile Val Gly
290 295 300
Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn Asn Tyr Phe Thr Ser
305 310 315 320
Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn Gln Glu Ala Gln Gln
325 330 335
Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser Val Leu Trp Gly Gly
340 345 350
His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro Phe Gln Pro Val Lys
355 360 365
Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Arg Arg Arg Arg Arg
370 375 380
<210> 13
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 2x TEV位点 - Flag - INK4C
<400> 13
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asp Tyr Lys Asp
145 150 155 160
Asp Asp Asp Lys Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Ala Ala Arg Gly Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn
180 185 190
Val Asn Val Asn Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val
195 200 205
Met Lys Leu Gly Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly
210 215 220
Ala Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp
225 230 235 240
Ala Ala Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe
245 250 255
Gln Ala Asp Val Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His
260 265 270
Leu Ala Ala Lys Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys
275 280 285
His Thr Ala Ser Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala
290 295 300
Cys Asp Leu Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met
305 310 315 320
Gln Ala Asn Gly Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln
325 330
<210> 14
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-泛素
<400> 14
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Met Gln Ile Phe
130 135 140
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
145 150 155 160
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
165 170 175
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
180 185 190
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
195 200 205
Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Glu Ala Ser Lys Leu Gly Pro
210 215 220
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
225 230 235 240
His His His His His
245
<210> 15
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis
<400> 15
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Met Gln Ile Phe
130 135 140
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
145 150 155 160
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
165 170 175
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
180 185 190
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
195 200 205
Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
210 215 220
Asp Lys Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala
225 230 235 240
Arg Gly Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn
245 250 255
Val Asn Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys
260 265 270
Leu Gly Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn
275 280 285
Pro Asp Leu Lys Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala
290 295 300
Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe Gln Ala
305 310 315 320
Asp Val Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala
325 330 335
Ala Lys Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr
340 345 350
Ala Ser Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp
355 360 365
Leu Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala
370 375 380
Asn Gly Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln Lys Leu Gly Pro Glu Gln
385 390 395 400
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His
405 410 415
His His His
<210> 16
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - z-BIM
<400> 16
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Asp Thr Ser Arg Glu Gln Thr Leu Ala Asn Gly Pro Ala Ser Gln Gly
145 150 155 160
Ser Gly Glu Ser Thr Gly Gly Gly Val Val Leu Pro Ala Gly His Phe
165 170 175
Asp Phe Pro Gln Pro Gly Glu Gly Asp Pro Leu Arg Gly Gly Ile Ser
180 185 190
Met Ser Asn Asn Gln Ser Arg Ser Pro Met Asn Arg Thr Phe Ser Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Val Asp Ser Asp Ser Val Pro Gly Ser
210 215 220
Pro Leu Met Pro Asn Ile Ser Glu Ala Gln Asp Gly Gln Asn Asp Glu
225 230 235 240
Val Trp Leu Ser Glu His Ser His Gln His Leu Gln Met Ala Ala Pro
245 250 255
Val Ala Ala Leu Pro Pro Glu Met Val Val Ala Arg Glu Leu Arg Arg
260 265 270
Ile Gly Asp Glu Phe Asn Arg Leu Tyr Cys Glu Ala Gly Ala Gly Val
275 280 285
Asn Gln Leu Arg Ala Pro Asn Glu His Ala Ile Val Leu Trp Met Asn
290 295 300
Val Ile Ile Gly Arg Leu Val His Phe Phe Leu Arg Arg Arg
305 310 315
<210> 17
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 人Bid
<400> 17
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Asp
130 135 140
Cys Glu Val Asn Asn Gly Ser Ser Leu Arg Asp Glu Cys Ile Thr Asn
145 150 155 160
Leu Leu Val Phe Gly Phe Leu Gln Ser Cys Ser Asp Asn Ser Phe Arg
165 170 175
Arg Glu Leu Asp Ala Leu Gly His Glu Leu Pro Val Leu Ala Pro Gln
180 185 190
Trp Glu Gly Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Asp Gly Asn Arg Ser Ser His
195 200 205
Ser Arg Leu Gly Arg Ile Glu Ala Asp Ser Glu Ser Gln Glu Asp Ile
210 215 220
Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp
225 230 235 240
Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala Leu Gln Leu Arg
245 250 255
Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn Arg Asp Leu Ala Thr Ala
260 265 270
Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg Asp Met Glu Lys Glu Lys
275 280 285
Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His
290 295 300
Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile
305 310 315 320
Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met
325 330 335
Asp
<210> 18
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 人t-Bid
<400> 18
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gly Asn
130 135 140
Arg Ser Ser His Ser Arg Leu Gly Arg Ile Glu Ala Asp Ser Glu Ser
145 150 155 160
Gln Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly
165 170 175
Asp Ser Met Asp Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala
180 185 190
Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn Arg Asp
195 200 205
Leu Ala Thr Ala Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg Asp Met
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys
225 230 235 240
Val Ala Ser His Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr
245 250 255
Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala
260 265 270
Arg Asn Gly Met Asp
275
<210> 19
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠BID BH3部分
<400> 19
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu
130 135 140
Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu
145 150 155 160
Met Asp His
<210> 20
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠Bax BH3部分
<400> 20
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Lys Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
145 150 155
<210> 21
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠tBid
<400> 21
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ser Gln Ala
130 135 140
Ser Arg Ser Phe Asn Gln Gly Arg Ile Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln
145 150 155 160
Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp
165 170 175
Glu Met Asp His Asn Ile Gln Pro Thr Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala
180 185 190
Gln Phe Met Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu
195 200 205
Ala Lys Ala Leu Asp Glu Val Lys Thr Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu
210 215 220
Asn Asp Lys Ala Met Leu Ile Met Thr Met Leu Leu Ala Lys Lys Val
225 230 235 240
Ala Ser His Ala Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val
245 250 255
Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Phe Ser Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg
260 265 270
Asn Glu Met Asp
275
<210> 22
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 密码子优化的鼠tBid BH3延伸部分
<400> 22
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu
130 135 140
Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu
145 150 155 160
Met Asp His Asn Ile Gln Pro
165
<210> 23
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-10 Aa连接体 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠
tBid BH3部分
<400> 23
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu
130 135 140
Ala Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala
145 150 155 160
Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His
165
<210> 24
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠Bax BH3部分-
小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠tBid BH3部分
<400> 24
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp
130 135 140
Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp
145 150 155 160
Ser Gly Ala Phe Asp Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His
165 170 175
Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His
180 185
<210> 25
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠BID BH3部分
（准备插入其它结构域）
<400> 25
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp
130 135 140
Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly
145 150 155 160
Asp Glu Met Asp His
165
<210> 26
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠Bax BH3部分
（准备插入其它结构域）
<400> 26
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp
130 135 140
Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp
145 150 155 160
Ser
<210> 27
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - (小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠BID BH3
部分)2
<400> 27
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp
130 135 140
Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly
145 150 155 160
Asp Glu Met Asp His Gly Ala Phe Asp Ala Glu Glu Ile Ile His Asn
165 170 175
Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His
180 185 190
<210> 28
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - (小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠BID BH3
部分)(小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠Bax BH3部分)
<400> 28
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp
130 135 140
Ala Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly
145 150 155 160
Asp Glu Met Asp His Gly Ala Phe Asp Ala Lys Lys Leu Ser Glu Cys
165 170 175
Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
180 185
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 29
Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp
1 5 10 15
Glu Met Asp His
20
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 30
Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His
1 5 10
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp
1 5 10 15
Ser Met Asp Arg
20
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 33
Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 34
Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人RIG-1两个
CARD结构域(Aa. 1-245)
<400> 37
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys
145 150 155 160
Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg
165 170 175
Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro
180 185 190
Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu
195 200 205
Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr
210 215 220
Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu
225 230 235 240
Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe
245 250 255
Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys
260 265 270
Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys
275 280 285
Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser
290 295 300
Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu
305 310 315 320
Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp
325 330 335
Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln
340 345 350
Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu Asn Ser
355 360 365
Cys Pro Pro Ser Glu Val Ser Asp Thr Asn Leu Tyr Ser Pro Phe Lys
370 375 380
Pro Arg Asn
385
<210> 38
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠RIG-1两个
CARD结构域(Aa. 1-246)
<400> 38
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys
145 150 155 160
Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu
165 170 175
Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro
180 185 190
Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser
195 200 205
Glu Gly Trp Phe Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Tyr His Ala Gly Tyr
210 215 220
Cys Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys Ile Glu
225 230 235 240
Lys Leu Glu Glu His Arg Leu Leu Leu Arg Arg Leu Glu Pro Glu Phe
245 250 255
Lys Ala Thr Val Asp Pro Asn Asp Ile Leu Ser Glu Leu Ser Glu Cys
260 265 270
Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Arg Gln Ile Arg Asp Thr Lys
275 280 285
Gly Arg Met Ala Gly Ala Glu Lys Met Ala Glu Cys Leu Ile Arg Ser
290 295 300
Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Val Leu Gln Leu Ala Leu Glu Lys Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Asp Lys Gly Phe Lys Arg
325 330 335
Ala Glu Ser Lys Ala Asp Glu Asp Asp Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ile
340 345 350
Gln Ile Phe Ile Gln Glu Glu Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Gln Asn
355 360 365
Pro Gly Pro Pro Ser Glu Ala Ser Ser Asn Asn Leu His Ser Pro Leu
370 375 380
Lys Pro Arg Asn
385
<210> 39
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的酿酒酵母GCN4
(Aa. 249-278) - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的铜绿假单
胞菌WspR (Aa. 172-347)
<400> 39
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Arg Met
130 135 140
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
145 150 155 160
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Asn Ser Asp Gly
165 170 175
Leu Thr Gly Leu Ser Asn Arg Arg His Phe Asp Glu Tyr Leu Glu Met
180 185 190
Glu Trp Arg Arg Ser Leu Arg Glu Gln Ser Gln Leu Ser Leu Leu Met
195 200 205
Ile Asp Val Asp Tyr Phe Lys Ser Tyr Asn Asp Thr Phe Gly His Val
210 215 220
Ala Gly Asp Glu Ala Leu Arg Gln Val Ala Gly Ala Ile Arg Glu Gly
225 230 235 240
Cys Ser Arg Ser Ser Asp Leu Ala Ala Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Phe
245 250 255
Ala Met Val Leu Pro Gly Thr Ser Pro Gly Gly Ala Arg Leu Leu Ala
260 265 270
Glu Lys Val Arg Arg Thr Val Glu Ser Leu Gln Ile Ser His Asp Gln
275 280 285
Pro Arg Pro Gly Ser His Leu Thr Val Ser Ile Gly Val Ser Thr Leu
290 295 300
Val Pro Gly Gly Gly Gly Gln Thr Phe Arg Val Leu Ile Glu Met Ala
305 310 315 320
Asp Gln Ala Leu Tyr Gln Ala Lys Asn Asn Gly Arg Asn Gln Val Gly
325 330 335
Leu Met Glu Gln Pro Val Pro Pro Ala Pro Ala Gly
340 345
<210> 40
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠IRF3 S397D
<400> 40
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Glu
130 135 140
Thr Pro Lys Pro Arg Ile Leu Pro Trp Leu Val Ser Gln Leu Asp Leu
145 150 155 160
Gly Gln Leu Glu Gly Val Ala Trp Leu Asp Glu Ser Arg Thr Arg Phe
165 170 175
Arg Ile Pro Trp Lys His Gly Leu Arg Gln Asp Ala Gln Met Ala Asp
180 185 190
Phe Gly Ile Phe Gln Ala Trp Ala Glu Ala Ser Gly Ala Tyr Thr Pro
195 200 205
Gly Lys Asp Lys Pro Asp Val Ser Thr Trp Lys Arg Asn Phe Arg Ser
210 215 220
Ala Leu Asn Arg Lys Glu Val Leu Arg Leu Ala Ala Asp Asn Ser Lys
225 230 235 240
Asp Pro Tyr Asp Pro His Lys Val Tyr Glu Phe Val Thr Pro Gly Ala
245 250 255
Arg Asp Phe Val His Leu Gly Ala Ser Pro Asp Thr Asn Gly Lys Ser
260 265 270
Ser Leu Pro His Ser Gln Glu Asn Leu Pro Lys Leu Phe Asp Gly Leu
275 280 285
Ile Leu Gly Pro Leu Lys Asp Glu Gly Ser Ser Asp Leu Ala Ile Val
290 295 300
Ser Asp Pro Ser Gln Gln Leu Pro Ser Pro Asn Val Asn Asn Phe Leu
305 310 315 320
Asn Pro Ala Pro Gln Glu Asn Pro Leu Lys Gln Leu Leu Ala Glu Glu
325 330 335
Gln Trp Glu Phe Glu Val Thr Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Gln Val Phe
340 345 350
Gln Gln Thr Leu Phe Cys Pro Gly Gly Leu Arg Leu Val Gly Ser Thr
355 360 365
Ala Asp Met Thr Leu Pro Trp Gln Pro Val Thr Leu Pro Asp Pro Glu
370 375 380
Gly Phe Leu Thr Asp Lys Leu Val Lys Glu Tyr Val Gly Gln Val Leu
385 390 395 400
Lys Gly Leu Gly Asn Gly Leu Ala Leu Trp Gln Ala Gly Gln Cys Leu
405 410 415
Trp Ala Gln Arg Leu Gly His Ser His Ala Phe Trp Ala Leu Gly Glu
420 425 430
Glu Leu Leu Pro Asp Ser Gly Arg Gly Pro Asp Gly Glu Val His Lys
435 440 445
Asp Lys Asp Gly Ala Val Phe Asp Leu Arg Pro Phe Val Ala Asp Leu
450 455 460
Ile Ala Phe Met Glu Gly Ser Gly His Ser Pro Arg Tyr Thr Leu Trp
465 470 475 480
Phe Cys Met Gly Glu Met Trp Pro Gln Asp Gln Pro Trp Val Lys Arg
485 490 495
Leu Val Met Val Lys Val Val Pro Thr Cys Leu Lys Glu Leu Leu Glu
500 505 510
Met Ala Arg Glu Gly Gly Ala Ser Ser Leu Lys Thr Val Asp Leu His
515 520 525
Ile Asp Asn Ser Gln Pro Ile Ser Leu Thr Ser Asp Gln Tyr Lys Ala
530 535 540
Tyr Leu Gln Asp Leu Val Glu Asp Met Asp Phe Gln Ala Thr Gly Asn
545 550 555 560
Ile
<210> 41
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的霍乱弧菌DncV
(M3至L413)
<400> 41
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Trp Asn Phe His Gln Tyr Tyr Thr Asn Arg Asn Asp Gly Leu Met Gly
145 150 155 160
Lys Leu Val Leu Thr Asp Glu Glu Lys Asn Asn Leu Lys Ala Leu Arg
165 170 175
Lys Ile Ile Arg Leu Arg Thr Arg Asp Val Phe Glu Glu Ala Lys Gly
180 185 190
Ile Ala Lys Ala Val Lys Lys Ser Ala Leu Thr Phe Glu Ile Ile Gln
195 200 205
Glu Lys Val Ser Thr Thr Gln Ile Lys His Leu Ser Asp Ser Glu Gln
210 215 220
Arg Glu Val Ala Lys Leu Ile Tyr Glu Met Asp Asp Asp Ala Arg Asp
225 230 235 240
Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro Arg Phe Trp Thr Gln Gly Ser Phe Gln
245 250 255
Tyr Asp Thr Leu Asn Arg Pro Phe Gln Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile
260 265 270
Asp Asp Gly Thr Tyr Met Pro Met Pro Ile Phe Glu Ser Glu Pro Lys
275 280 285
Ile Gly His Ser Leu Leu Ile Leu Leu Val Asp Ala Ser Leu Lys Ser
290 295 300
Leu Val Ala Glu Asn His Gly Trp Lys Phe Glu Ala Lys Gln Thr Cys
305 310 315 320
Gly Arg Ile Lys Ile Glu Ala Glu Lys Thr His Ile Asp Val Pro Met
325 330 335
Tyr Ala Ile Pro Lys Asp Glu Phe Gln Lys Lys Gln Ile Ala Leu Glu
340 345 350
Ala Asn Arg Ser Phe Val Lys Gly Ala Ile Phe Glu Ser Tyr Val Ala
355 360 365
Asp Ser Ile Thr Asp Asp Ser Glu Thr Tyr Glu Leu Asp Ser Glu Asn
370 375 380
Val Asn Leu Ala Leu Arg Glu Gly Asp Arg Lys Trp Ile Asn Ser Asp
385 390 395 400
Pro Lys Ile Val Glu Asp Trp Phe Asn Asp Ser Cys Ile Arg Ile Gly
405 410 415
Lys His Leu Arg Lys Val Cys Arg Phe Met Lys Ala Trp Arg Asp Ala
420 425 430
Gln Trp Asp Val Gly Gly Pro Ser Ser Ile Ser Leu Met Ala Ala Thr
435 440 445
Val Asn Ile Leu Asp Ser Val Ala His Asp Ala Ser Asp Leu Gly Glu
450 455 460
Thr Met Lys Ile Ile Ala Lys His Leu Pro Ser Glu Phe Ala Arg Gly
465 470 475 480
Val Glu Ser Pro Asp Ser Thr Asp Glu Lys Pro Leu Phe Pro Pro Ser
485 490 495
Tyr Lys His Gly Pro Arg Glu Met Asp Ile Met Ser Lys Leu Glu Arg
500 505 510
Leu Pro Glu Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Asp Ser Lys Ser Glu
515 520 525
Ala Leu Lys Lys Ile Asn Met Ala Phe Gly Asn Arg Val Thr Asn Ser
530 535 540
Glu Leu Ile Val Leu Ala Lys Ala Leu
545 550
<210> 42
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的蜡样芽孢杆
菌_DisA样(PDB: 2FB5; Aa. 76-205)
<400> 42
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Ser Ser
130 135 140
Ser Phe Ile Thr Thr Ala Ile Gln His Leu Ser Ala Arg Lys His Gly
145 150 155 160
Ala Leu Ile Val Val Glu Arg Asn Glu Thr Leu Glu Ala Leu Ile Gln
165 170 175
Thr Gly Thr Thr Leu Asn Ala His Leu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Ser
180 185 190
Ile Phe Tyr Pro Gly Asn Pro Leu His Asp Gly Ala Val Leu Val Lys
195 200 205
Asn Asn His Ile Val Ser Ala Ala Asn Ile Leu Pro Leu Thr Lys Ser
210 215 220
Thr Glu Val Asp Pro Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Ile Gly
225 230 235 240
Leu Ser Glu Lys Ser Asp Ala Leu Ile Leu Val Val Ser Glu Glu Thr
245 250 255
Gly Arg Thr Ser Phe Ala Leu Asn Gly Ile Leu Tyr Thr Ile Ser Leu
260 265 270
<210> 43
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的Anemonae (N.
vectensis) cGAS (Ensembl: A7SFB5.1)
<400> 43
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ala
130 135 140
Thr Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu Leu Arg Glu Tyr His Leu Asp Asp
145 150 155 160
Val Leu Phe His Asn Ser Thr Pro Glu Leu Gly Ile Gln His Arg Ser
165 170 175
Arg Pro Lys Gln Lys Arg Ile Ile Arg Gly Lys Lys Gln Gln Lys Ser
180 185 190
Lys Lys Leu Lys Arg Asn Glu Gln Gln Gln Pro Phe Pro Lys Gly Asp
195 200 205
Leu Glu Thr Leu Arg Arg Phe Ser Val Thr Asp Val Lys Ile Ser Lys
210 215 220
Gln Ser Thr Lys Trp Ala Lys Lys Met Ala Asp Lys His Leu Glu Ile
225 230 235 240
Ile Arg Lys His Cys Lys Thr Asn Ser Ile Lys Leu Phe Asn His Phe
245 250 255
Glu Tyr Thr Gly Ser Phe Tyr Glu His Leu Lys Thr Ile Asp Ala Asp
260 265 270
Glu Leu Asp Ile Met Val Ala Leu Ser Ile Lys Met Asp Glu Leu Glu
275 280 285
Val Glu Gln Val Thr Pro Gly Tyr Ala Gly Leu Lys Leu Arg Asp Thr
290 295 300
Pro Ser Asn Arg Asn Lys Tyr Asn Asp Leu Thr Ile Ala Asp Asn Tyr
305 310 315 320
Gly Arg Tyr Leu Ser Pro Glu Lys Val Ser Arg Trp Phe Phe Ser Leu
325 330 335
Val Gln Lys Ala Val Asn Thr Tyr Lys Asp Glu Ile Pro Gln Thr Glu
340 345 350
Val Lys Leu Thr Asp Asn Gly Pro Ala Thr Thr Leu Val Ile Thr Tyr
355 360 365
Arg Glu Gly Asp Lys Pro Gln Glu Lys Asn Arg Arg Leu Ser Ile Asp
370 375 380
Leu Val Pro Ala Leu Leu Phe Lys Asp Lys Thr Lys Pro Ala Gly Asp
385 390 395 400
Asp Leu Arg Ala Trp His Tyr Val Ala Lys Thr Ile Pro Lys Gly Ala
405 410 415
Arg Leu Lys Glu Pro Leu Pro Phe Arg Ser Glu Leu Leu Trp Arg Gln
420 425 430
Ser Phe Ser Leu Lys Glu Lys His Leu Met Asp Lys Leu Asp Lys Asp
435 440 445
Asp Asn Gly Cys Arg Arg Glu Met Val Arg Ile Val Lys Thr Ile Val
450 455 460
Lys Lys Asp Pro Thr Leu Ala Gln Leu Ser Ser Tyr His Ile Lys Thr
465 470 475 480
Ala Phe Leu Gln Tyr Asn Phe Ser Asp Val Lys Leu Asp Trp Glu Gly
485 490 495
Lys Lys Leu Ala Glu Arg Phe Leu His Phe Leu Glu Phe Leu Arg Asp
500 505 510
Arg Val Lys Asp Lys Thr Leu Asn Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Leu Asn
515 520 525
Leu Leu Asp Asp Leu Asn Asp Ser Asn Ile Asp Asn Ile Ala Asn Arg
530 535 540
Leu Asp Lys Ile Ile Gln Asn Glu Thr Glu Arg Ala Lys Ile Phe Thr
545 550 555 560
Thr Gln Arg Gln
<210> 44
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MDA5两个
CARD结构域(最小: Aa 1-190)
<400> 44
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe
145 150 155 160
Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His
165 170 175
Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys
245 250 255
Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn
325 330
<210> 45
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MDA5两个
CARD结构域(延伸: Aa 1-315)
<400> 45
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe
145 150 155 160
Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His
165 170 175
Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys
245 250 255
Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp Ala Leu Phe
325 330 335
Gln Glu Leu Thr Gly Gly Gly Cys Pro Glu Asp Asn Thr Asp Leu Ala
340 345 350
Asn Ser Ser His Arg Asp Gly Pro Ala Ala Asn Glu Cys Leu Leu Pro
355 360 365
Ala Val Asp Glu Ser Ser Leu Glu Thr Glu Ala Trp Asn Val Asp Asp
370 375 380
Ile Leu Pro Glu Ala Ser Cys Thr Asp Ser Ser Val Thr Thr Glu Ser
385 390 395 400
Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Phe Asp Glu Ser Leu
405 410 415
Gly His Asn Ser Asn Met Gly Arg Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser Asp
420 425 430
Ser Asp Glu Ser Val Ile Gln Thr Lys Arg Val Ser Pro Glu Pro Glu
435 440 445
Leu Gln Leu Arg Pro Tyr Gln Met Glu
450 455
<210> 46
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人MDA5两个
CARD结构域(最小: Aa 1-190)
<400> 46
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Asn Gly Tyr Ser Thr Asp Glu Asn Phe Arg Tyr Leu Ile Ser Cys Phe
145 150 155 160
Arg Ala Arg Val Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp Tyr
165 170 175
Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln Arg Thr Val
180 185 190
Ala Thr Ser Gly Asn Met Gln Ala Val Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Lys Gly Val Trp His Leu Gly Trp Thr Arg Glu Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Arg Arg Thr Gly Ser Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Met Asn Pro Glu
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Phe Glu Asn Ala His Asp Glu Tyr
245 250 255
Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Val Arg Asp Val Leu Asp Lys Cys Met Glu Glu Glu Leu Leu Thr Ile
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ala Glu Asn Asn Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Ala Phe Leu Asn Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn
325 330
<210> 47
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人MDA5两个
CARD结构域(延伸: Aa 1-314)
<400> 47
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Asn Gly Tyr Ser Thr Asp Glu Asn Phe Arg Tyr Leu Ile Ser Cys Phe
145 150 155 160
Arg Ala Arg Val Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp Tyr
165 170 175
Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln Arg Thr Val
180 185 190
Ala Thr Ser Gly Asn Met Gln Ala Val Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Lys Gly Val Trp His Leu Gly Trp Thr Arg Glu Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Arg Arg Thr Gly Ser Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Met Asn Pro Glu
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Phe Glu Asn Ala His Asp Glu Tyr
245 250 255
Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Val Arg Asp Val Leu Asp Lys Cys Met Glu Glu Glu Leu Leu Thr Ile
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ala Glu Asn Asn Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Ala Phe Leu Asn Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asn Glu Leu Val
325 330 335
Gln Glu Leu Thr Gly Ser Asp Cys Ser Glu Ser Asn Ala Glu Ile Glu
340 345 350
Asn Leu Ser Gln Val Asp Gly Pro Gln Val Glu Glu Gln Leu Leu Ser
355 360 365
Thr Thr Val Gln Pro Asn Leu Glu Lys Glu Val Trp Gly Met Glu Asn
370 375 380
Asn Ser Ser Glu Ser Ser Phe Ala Asp Ser Ser Val Val Ser Glu Ser
385 390 395 400
Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Leu Asp Glu Ser Leu
405 410 415
Gly His Asn Ser Asn Met Gly Ser Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser Asp
420 425 430
Ser Asp Glu Glu Asn Val Ala Ala Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu Leu
435 440 445
Gln Leu Arg Pro Tyr Gln Met Glu
450 455
<210> 48
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人MAVS CARD
结构域(最小: Aa 1-77)
<400> 48
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Pro
130 135 140
Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Ser Asn
145 150 155 160
Phe Cys Asn Val Asp Val Val Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Cys Leu
165 170 175
Thr Ala Arg Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Thr Cys Thr Leu Ser Gly
180 185 190
Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg Arg Pro
195 200 205
Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Leu Arg
210 215
<210> 49
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MAVS CARD
结构域(最小: Aa 1-77)
<400> 49
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg
130 135 140
<210> 50
<211> 1675
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于产生整合到pYV质粒上的YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌
密码子优化的鼠RIG-1两个CARD结构域(Aa. 1-246)的增变体序列
<400> 50
gaatagacag cgaaagttgt tgaaataatt gagtgatagc ttgttcaaat gaatacattt 60
gatctcctaa tagttagata aaatatcaac ttaaccaaag cactctcggc agaccatcaa 120
ttttagccta taatttttag tttttatttt gtctaatata acaacaaaaa cagcagcggt 180
tttttatata accaccggct attttcccac taagataacc ttgttttaat agccaaggga 240
ataaatagtc atgaaaatat catcatttat ttctacatca ctgcccctgc cggcatcagt 300
gtcaggatct agcagcgtag gagaaatgtc tgggcgctca gtctcacagc aaaaaagtga 360
tcaatatgca aacaatctgg ccgggcgcac tgaaagccct cagggttcca gcttagccag 420
ccgtatcatt gagaggttat catcaatggc ccactctgtg attggattta tccaacgcat 480
gttctcggag gggagccata aaccggtggt gacaccagca ctcacgcctg cacaaatgcc 540
aagccctacg tctttcagtg atagtatcaa gcaacttgct gctgagacgc tgccaaaata 600
catgcagcag ttgagtagct tggatgcaga gacgctgcag aaaaatcatg accagttcgc 660
cacgctcgag tctagaatga ccgccgaaca acgccaaaat ctgcaagcct ttcgcgatta 720
tattaaaaaa attctggatc cgacctatat tctgagctat atgagcagct ggctggaaga 780
tgaagaagtg caatatattc aagccgaaaa aaataataaa ggtccgatgg aagccgccag 840
cctgtttctg caatatctgc tgaaactgca aagcgaaggt tggtttcaag cctttctgga 900
tgccctgtat catgccggtt attgtggtct gtgtgaagcc attgaaagct gggattttca 960
aaaaattgaa aaactggaag aacatcgcct gctgctgcgc cgcctggaac cggaatttaa 1020
agccaccgtg gatccgaatg atattctgag cgaactgagc gaatgtctga ttaatcaaga 1080
atgtgaagaa attcgccaaa ttcgcgatac caaaggtcgc atggccggtg ccgaaaaaat 1140
ggccgaatgt ctgattcgca gcgataaaga aaattggccg aaagtgctgc aactggccct 1200
ggaaaaagat aatagcaaat ttagcgaact gtggattgtg gataaaggtt ttaaacgcgc 1260
cgaaagcaaa gccgatgaag atgatggtgc cgaagccagc agcattcaaa tttttattca 1320
agaagaaccg gaatgtcaaa atctgagcca aaatccgggt ccgccgagcg aagccagcag 1380
caataatctg catagcccgc tgaaaccgcg caattaatat ggataaaaac aagggggtag 1440
tgtttccccc tttttctatc aatattgcga atatcttcgt ccctgatctt tcaggggcga 1500
atcgtttttt agcatgctca ttgttagaat ttctgactta tctctcttct gtattactac 1560
tcatactctg gaaaatcctg agcatttata tctatggatt gatgcagcac tcgagaaatc 1620
aaaatatcat tgctaagcgt tatatagtat ataccgtgct ttttatactg aaaac 1675
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_285
<400> 51
cataccatgg gagtgagcaa gggcgag 27
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_286
<400> 52
ggaagatctt tacttgtaca gctcgtccat 30
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_287
<400> 53
cggggtacct caactaaatg accgtggtg 29
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_288
<400> 54
gttaaagctt ttcgaatcta gactcgagcg tggcgaactg gtc 43
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_387
<400> 55
cgtatctaga atggactgtg aggtcaacaa 30
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_391
<400> 56
cgtatctaga ggcaaccgca gca 23
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_389
<400> 57
gttaaagctt tcagtccatc ccatttctg 29
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_436
<400> 58
cgtatctaga atgccccgcc cc 22
<210> 59
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_437
<400> 59
gttaaagctt ctacccaccg tactcgtcaa t 31
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_438
<400> 60
cgtatctaga atgtctgaca cgtccagaga g 31
<210> 61
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_439
<400> 61
gttaaagctt tcatcttctt cgcaggaaaa ag 32
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_463
<400> 62
cagtctcgag gaaagcttgt ttaaggggc 29
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_464
<400> 63
cagtttcgaa ttagcgacgg cgacg 25
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_476
<400> 64
gttaaagctt ttacttgtac agctcgtcca t 31
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_494
<400> 65
cgtatctaga atggccgagc cttg 24
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_495
<400> 66
gttaaagctt ttattgaaga tttgtggctc c 31
<210> 67
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_504
<400> 67
cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatgccccg 60
cccc 64
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_505
<400> 68
gttaaagctt cccaccgtac tcgtcaattc 30
<210> 69
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_508
<400> 69
cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatggccga 60
gccttg 66
<210> 70
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_509
<400> 70
gttaaagctt ttgaagattt gtggctccc 29
<210> 71
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_511
<400> 71
cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgtgagcaa 60
gggcgag 67
<210> 72
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_512
<400> 72
cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtccgccgaa 60
aaaaaaacgt aaagttgtga gcaagggcga g 91
<210> 73
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_513
<400> 73
gttaaagctt ttaaacttta cgtttttttt tcggcggctt gtacagctcg tccat 55
<210> 74
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_515
<400> 74
cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgattataa 60
agatgatgat gataaaatgg ccgagccttg 90
<210> 75
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_677
<400> 75
ttactattcg aagaaattat tcataatatt gcccgccatc tggcccaaat tggtgatgaa 60
atggatcatt aagcttggag ta 82
<210> 76
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_678
<400> 76
tactccaagc ttaatgatcc atttcatcac caatttgggc cagatggcgg gcaatattat 60
gaataatttc ttcgaatagt aa 82
<210> 77
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_682
<400> 77
ttactactcg agaaaaaact gagcgaatgt ctgcgccgca ttggtgatga actggatagc 60
taagcttgga gta 73
<210> 78
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_683
<400> 78
tactccaagc ttagctatcc agttcatcac caatgcggcg cagacattcg ctcagttttt 60
tctcgagtag taa 73
<210> 79
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_580
<400> 79
catgccatgg atttatggtc atagatatga cctc 34
<210> 80
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_612
<400> 80
cggggtacca tgaggtagct tatttcctga taaag 35
<210> 81
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_613
<400> 81
cggggtacca taattgtcca aatagttatg gtagc 35
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_614
<400> 82
catgccatgg cggcaaggct cctc 24
<210> 83
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_615
<400> 83
cggggtacct ttatttgtca acactgccc 29
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_616
<400> 84
cggggtacct gcggggtctt tactcg 26
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_585
<400> 85
cagtctcgag atgcagatct tcgtcaagac 30
<210> 86
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_586
<400> 86
gttaaagctt gctagcttcg aaaccaccac gtagacgtaa gac 43
<210> 87
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. : Si_588
<400> 87
cagtttcgaa gattataaag atgatgatga taaaatggcc gagccttg 48
<210> 88
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 733
<400> 88
ttactactcg agggtgccat cgatgccgaa gaaattattc ataatattgc ccg 53
<210> 89
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 735
<400> 89
tactccttcg aattaatgat ccatttcatc accaatttg 39
<210> 90
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 736
<400> 90
ttactactcg agggtgccat cgatgccaaa aaactgagcg aatgtctgcg 50
<210> 91
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 738
<400> 91
tactccttcg aattagctat ccagttcatc accaatg 37
<210> 92
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 734
<400> 92
tactccttcg aaggcaccat gatccatttc atcaccaatt tgg 43
<210> 93
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 725
<400> 93
ttactattcg aagaaattat tcataatatt gcc 33
<210> 94
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 726
<400> 94
tactccaagc ttacggttga atattatgat ccatttcatc accaatttgg 50
<210> 95
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 727
<400> 95
ttactattcg aagccggtgg tgccgaagaa attattcata atattgccc 49
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 728
<400> 96
tactccaagc ttaatgatcc atttcatca 29
<210> 97
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 737
<400> 97
tactccttcg aaggcaccgc tatccagttc atcaccaatg 40
<210> 98
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 2xTEV位点 - EGFP
<400> 98
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly
145 150 155 160
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
165 170 175
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
180 185 190
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
195 200 205
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
210 215 220
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
225 230 235 240
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
245 250 255
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
260 265 270
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
275 280 285
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
290 295 300
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
305 310 315 320
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
325 330 335
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
340 345 350
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
355 360 365
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
370 375 380
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
385 390
<210> 99
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 2xTEV位点 - NLS - EGFP
<400> 99
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly Gln Ser Pro Pro Lys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Lys Val Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
165 170 175
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val
180 185 190
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
195 200 205
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
210 215 220
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
225 230 235 240
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
245 250 255
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
260 265 270
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
275 280 285
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
290 295 300
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
305 310 315 320
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
325 330 335
Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
340 345 350
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser
355 360 365
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
370 375 380
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
385 390 395 400
Lys
<210> 100
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 2xTEV位点 - EGFP - NLS
<400> 100
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly
145 150 155 160
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
165 170 175
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
180 185 190
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
195 200 205
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
210 215 220
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
225 230 235 240
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
245 250 255
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
260 265 270
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
275 280 285
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
290 295 300
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
305 310 315 320
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
325 330 335
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
340 345 350
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
355 360 365
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
370 375 380
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Pro Pro Lys Lys Lys Arg
385 390 395 400
Lys Val
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 869
<400> 101
gatcgtcgac ttaagttcaa tggagcgttt aatatc 36
<210> 102
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 870
<400> 102
ctttgactgg cgagaaacgc tcttaacatg aggctgagct c 41
<210> 103
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 871
<400> 103
gagctcagcc tcatgttaag agcgtttctc gccagtcaaa g 41
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 872
<400> 104
gatagccccc gagcctgtgc actttgtcat taacctcagc 40
<210> 105
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 873
<400> 105
gctgaggtta atgacaaagt gcacaggctc gggggctatc 40
<210> 106
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 874
<400> 106
catgtctaga ccctcagcat aataacgact c 31
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 600
<400> 107
catgacatgt tggcgtttct cgcc 24
<210> 108
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 601
<400> 108
catgacatgt attaacctca gccctgacta taag 34
<210> 109
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Multiple cloning 位点 of pBad_Si_1 and pBad_Si_2
<400> 109
gttcgccacg ctcgagtcta gattcgaaaa gcttgggccc gaacaaaaac tcatctcaga 60
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt aaacggtctc 120
cagcttggct gttttggc 138
<210> 110
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠RIG1 CARD
结构域(Aa. 1-229)
<400> 110
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys
145 150 155 160
Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu
165 170 175
Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro
180 185 190
Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser
195 200 205
Glu Gly Trp Phe Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Tyr His Ala Gly Tyr
210 215 220
Cys Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys Ile Glu
225 230 235 240
Lys Leu Glu Glu His Arg Leu Leu Leu Arg Arg Leu Glu Pro Glu Phe
245 250 255
Lys Ala Thr Val Asp Pro Asn Asp Ile Leu Ser Glu Leu Ser Glu Cys
260 265 270
Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Arg Gln Ile Arg Asp Thr Lys
275 280 285
Gly Arg Met Ala Gly Ala Glu Lys Met Ala Glu Cys Leu Ile Arg Ser
290 295 300
Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Val Leu Gln Leu Ala Leu Glu Lys Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Asp Lys Gly Phe Lys Arg
325 330 335
Ala Glu Ser Lys Ala Asp Glu Asp Asp Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ile
340 345 350
Gln Ile Phe Ile Gln Glu Glu Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Gln Asn
355 360 365
Pro Gly Pro
370
<210> 111
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠RIG1 CARD
结构域(Aa. 1-218)
<400> 111
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Ala Glu Gln Arg Gln Asn Leu Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Ile Lys Lys
145 150 155 160
Ile Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Trp Leu Glu
165 170 175
Asp Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro
180 185 190
Met Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Tyr Leu Leu Lys Leu Gln Ser
195 200 205
Glu Gly Trp Phe Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Tyr His Ala Gly Tyr
210 215 220
Cys Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys Ile Glu
225 230 235 240
Lys Leu Glu Glu His Arg Leu Leu Leu Arg Arg Leu Glu Pro Glu Phe
245 250 255
Lys Ala Thr Val Asp Pro Asn Asp Ile Leu Ser Glu Leu Ser Glu Cys
260 265 270
Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Arg Gln Ile Arg Asp Thr Lys
275 280 285
Gly Arg Met Ala Gly Ala Glu Lys Met Ala Glu Cys Leu Ile Arg Ser
290 295 300
Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Val Leu Gln Leu Ala Leu Glu Lys Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Asp Lys Gly Phe Lys Arg
325 330 335
Ala Glu Ser Lys Ala Asp Glu Asp Asp Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ile
340 345 350
Gln Ile Phe Ile Gln Glu Glu Pro
355 360
<210> 112
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MDA5 (Aa.
1-294)
<400> 112
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe
145 150 155 160
Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His
165 170 175
Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys
245 250 255
Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp Ala Leu Phe
325 330 335
Gln Glu Leu Thr Gly Gly Gly Cys Pro Glu Asp Asn Thr Asp Leu Ala
340 345 350
Asn Ser Ser His Arg Asp Gly Pro Ala Ala Asn Glu Cys Leu Leu Pro
355 360 365
Ala Val Asp Glu Ser Ser Leu Glu Thr Glu Ala Trp Asn Val Asp Asp
370 375 380
Ile Leu Pro Glu Ala Ser Cys Thr Asp Ser Ser Val Thr Thr Glu Ser
385 390 395 400
Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Phe Asp Glu Ser Leu
405 410 415
Gly His Asn Ser Asn Met Gly Arg Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser Asp
420 425 430
Ser Asp Glu Ser
435
<210> 113
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MDA5 (Aa.
1-231)
<400> 113
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Ser
130 135 140
Ile Val Cys Ser Ala Glu Asp Ser Phe Arg Asn Leu Ile Leu Phe Phe
145 150 155 160
Arg Pro Arg Leu Lys Met Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val Leu Asp His
165 170 175
Leu Ile Phe Leu Ser Ala Glu Thr Lys Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Cys Gly Asn Thr Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Glu Gln Gly Gln Trp Pro Leu Gly Trp Thr Gln Met Phe Val Glu Ala
210 215 220
Leu Glu His Ser Gly Asn Pro Leu Ala Ala Arg Tyr Val Lys Pro Thr
225 230 235 240
Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Ala His Asp Glu Cys
245 250 255
Leu His Leu Leu Thr Leu Leu Gln Pro Thr Leu Val Asp Lys Leu Leu
260 265 270
Ile Asn Asp Val Leu Asp Thr Cys Phe Glu Lys Gly Leu Leu Thr Val
275 280 285
Glu Asp Arg Asn Arg Ile Ser Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Glu Ser
290 295 300
Gly Val Arg Glu Leu Leu Arg Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Trp Phe
305 310 315 320
Ser Thr Phe Leu Asp Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp Ala Leu Phe
325 330 335
Gln Glu Leu Thr Gly Gly Gly Cys Pro Glu Asp Asn Thr Asp Leu Ala
340 345 350
Asn Ser Ser His Arg Asp Gly Pro Ala Ala Asn Glu Cys Leu Leu Pro
355 360 365
Ala Val Asp Glu Ser
370
<210> 114
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的枯草芽孢杆菌
CdaS L44F组成型活性变体
<400> 114
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Lys
130 135 140
Ala Met Arg Tyr Glu Gln Ile Ser Glu Asn Ala Phe Lys Gly Lys Ile
145 150 155 160
Gln Val Tyr Leu Glu Gln Ile Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ile Leu Lys
165 170 175
Thr Leu His Glu Lys Asp Gln Cys Leu Phe Cys Glu Leu Asp Asp Leu
180 185 190
Gly His Val Phe Gln Asp Met Gln Gly Ile Ala Ser Ser Phe Tyr Leu
195 200 205
Gln Ser Tyr Ile Glu Glu Phe Thr Pro Ala Phe Ile Glu Leu Ala Lys
210 215 220
Ala Ile Lys Ala Leu Ser Glu His Lys His Gly Ala Leu Ile Val Ile
225 230 235 240
Glu Arg Ala Asp Pro Val Glu Arg Phe Ile Gln Lys Gly Thr Ser Leu
245 250 255
His Ala Glu Ile Ser Ser Ser Leu Ile Glu Ser Ile Phe Phe Pro Gly
260 265 270
Asn Pro Leu His Asp Gly Ala Leu Leu Val Arg Glu Asn Lys Leu Val
275 280 285
Ser Ala Ala Asn Val Leu Pro Leu Thr Thr Lys Glu Val Asp Ile His
290 295 300
Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu Gly Met Ser Gly Tyr Thr Asp
305 310 315 320
Ala Leu Val Leu Val Val Ser Glu Glu Thr Gly Lys Met Ser Phe Ala
325 330 335
Lys Asp Gly Val Leu Tyr Pro Leu Ile Ser Pro Arg Thr
340 345
<210> 115
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人cGAS (Aa.
161-522)
<400> 115
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gly Ala
130 135 140
Ser Lys Leu Arg Ala Val Leu Glu Lys Leu Lys Leu Ser Arg Asp Asp
145 150 155 160
Ile Ser Thr Ala Ala Gly Met Val Lys Gly Val Val Asp His Leu Leu
165 170 175
Leu Arg Leu Lys Cys Asp Ser Ala Phe Arg Gly Val Gly Leu Leu Asn
180 185 190
Thr Gly Ser Tyr Tyr Glu His Val Lys Ile Ser Ala Pro Asn Glu Phe
195 200 205
Asp Val Met Phe Lys Leu Glu Val Pro Arg Ile Gln Leu Glu Glu Tyr
210 215 220
Ser Asn Thr Arg Ala Tyr Tyr Phe Val Lys Phe Lys Arg Asn Pro Lys
225 230 235 240
Glu Asn Pro Leu Ser Gln Phe Leu Glu Gly Glu Ile Leu Ser Ala Ser
245 250 255
Lys Met Leu Ser Lys Phe Arg Lys Ile Ile Lys Glu Glu Ile Asn Asp
260 265 270
Ile Lys Asp Thr Asp Val Ile Met Lys Arg Lys Arg Gly Gly Ser Pro
275 280 285
Ala Val Thr Leu Leu Ile Ser Glu Lys Ile Ser Val Asp Ile Thr Leu
290 295 300
Ala Leu Glu Ser Lys Ser Ser Trp Pro Ala Ser Thr Gln Glu Gly Leu
305 310 315 320
Arg Ile Gln Asn Trp Leu Ser Ala Lys Val Arg Lys Gln Leu Arg Leu
325 330 335
Lys Pro Phe Tyr Leu Val Pro Lys His Ala Lys Glu Gly Asn Gly Phe
340 345 350
Gln Glu Glu Thr Trp Arg Leu Ser Phe Ser His Ile Glu Lys Glu Ile
355 360 365
Leu Asn Asn His Gly Lys Ser Lys Thr Cys Cys Glu Asn Lys Glu Glu
370 375 380
Lys Cys Cys Arg Lys Asp Cys Leu Lys Leu Met Lys Tyr Leu Leu Glu
385 390 395 400
Gln Leu Lys Glu Arg Phe Lys Asp Lys Lys His Leu Asp Lys Phe Ser
405 410 415
Ser Tyr His Val Lys Thr Ala Phe Phe His Val Cys Thr Gln Asn Pro
420 425 430
Gln Asp Ser Gln Trp Asp Arg Lys Asp Leu Gly Leu Cys Phe Asp Asn
435 440 445
Cys Val Thr Tyr Phe Leu Gln Cys Leu Arg Thr Glu Lys Leu Glu Asn
450 455 460
Tyr Phe Ile Pro Glu Phe Asn Leu Phe Ser Ser Asn Leu Ile Asp Lys
465 470 475 480
Arg Ser Lys Glu Phe Leu Thr Lys Gln Ile Glu Tyr Glu Arg Asn Asn
485 490 495
Glu Phe Pro Val Phe Asp Glu Phe
500
<210> 116
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人MAVS CARD
(Aa.1-100)
<400> 116
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Pro
130 135 140
Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Ser Asn
145 150 155 160
Phe Cys Asn Val Asp Val Val Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Cys Leu
165 170 175
Thr Ala Arg Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Thr Cys Thr Leu Ser Gly
180 185 190
Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg Arg Pro
195 200 205
Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Leu Arg Gly Cys Glu Leu Val
210 215 220
Asp Leu Ala Asp Glu Val Ala Ser Val Tyr Glu Ser Tyr Gln Pro Arg
225 230 235 240
Thr Ser
<210> 117
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的Anemonae (N.
vectensis) cGAS (Aa. 60-422) (Ensembl: A7SFB5.1)
<400> 117
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Gln Pro
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Asp Leu Glu Thr Leu Arg Arg Phe Ser Val Thr Asp
145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Lys Gln Ser Thr Lys Trp Ala Lys Lys Met Ala Asp
165 170 175
Lys His Leu Glu Ile Ile Arg Lys His Cys Lys Thr Asn Ser Ile Lys
180 185 190
Leu Phe Asn His Phe Glu Tyr Thr Gly Ser Phe Tyr Glu His Leu Lys
195 200 205
Thr Ile Asp Ala Asp Glu Leu Asp Ile Met Val Ala Leu Ser Ile Lys
210 215 220
Met Asp Glu Leu Glu Val Glu Gln Val Thr Pro Gly Tyr Ala Gly Leu
225 230 235 240
Lys Leu Arg Asp Thr Pro Ser Asn Arg Asn Lys Tyr Asn Asp Leu Thr
245 250 255
Ile Ala Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Leu Ser Pro Glu Lys Val Ser Arg
260 265 270
Trp Phe Phe Ser Leu Val Gln Lys Ala Val Asn Thr Tyr Lys Asp Glu
275 280 285
Ile Pro Gln Thr Glu Val Lys Leu Thr Asp Asn Gly Pro Ala Thr Thr
290 295 300
Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Gly Asp Lys Pro Gln Glu Lys Asn Arg
305 310 315 320
Arg Leu Ser Ile Asp Leu Val Pro Ala Leu Leu Phe Lys Asp Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Ala Gly Asp Asp Leu Arg Ala Trp His Tyr Val Ala Lys Thr
340 345 350
Ile Pro Lys Gly Ala Arg Leu Lys Glu Pro Leu Pro Phe Arg Ser Glu
355 360 365
Leu Leu Trp Arg Gln Ser Phe Ser Leu Lys Glu Lys His Leu Met Asp
370 375 380
Lys Leu Asp Lys Asp Asp Asn Gly Cys Arg Arg Glu Met Val Arg Ile
385 390 395 400
Val Lys Thr Ile Val Lys Lys Asp Pro Thr Leu Ala Gln Leu Ser Ser
405 410 415
Tyr His Ile Lys Thr Ala Phe Leu Gln Tyr Asn Phe Ser Asp Val Lys
420 425 430
Leu Asp Trp Glu Gly Lys Lys Leu Ala Glu Arg Phe Leu His Phe Leu
435 440 445
Glu Phe Leu Arg Asp Arg Val Lys Asp Lys Thr Leu Asn Asn Tyr Phe
450 455 460
Ile Thr Asp Leu Asn Leu Leu Asp Asp Leu Asn Asp Ser Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Ile Ala Asn Arg Leu Asp Lys Ile Ile Gln Asn Glu Thr Glu Arg
485 490 495
Ala Lys Ile Phe Thr Thr Gln Arg Gln
500 505
<210> 118
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的利斯特氏菌CdaA
(Aa.101-273)
<400> 118
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Tyr Gly
130 135 140
Ser Arg Ile Glu Arg Glu Gln His His Leu Ile Glu Ser Ile Glu Lys
145 150 155 160
Ser Thr Gln Tyr Met Ala Lys Arg Arg Ile Gly Ala Leu Ile Ser Val
165 170 175
Ala Arg Asp Thr Gly Met Asp Asp Tyr Ile Glu Thr Gly Ile Pro Leu
180 185 190
Asn Ala Lys Ile Ser Ser Gln Leu Leu Ile Asn Ile Phe Ile Pro Asn
195 200 205
Thr Pro Leu His Asp Gly Ala Val Ile Ile Lys Gly Asn Glu Ile Ala
210 215 220
Ser Ala Ala Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Asp Ser Pro Phe Leu Ser Lys
225 230 235 240
Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu Gly Ile Ser Glu Val Thr
245 250 255
Asp Ser Ile Thr Ile Val Val Ser Glu Glu Thr Gly Gly Ile Ser Leu
260 265 270
Thr Lys Gly Gly Glu Leu Phe Arg Asp Val Ser Glu Glu Glu Leu His
275 280 285
Lys Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val Thr Val Thr Ala Lys Lys Pro Ser
290 295 300
Ile Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly Lys Ser Glu
305 310 315
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1010
<400> 119
cacatgtcta gacaaccgtt tccgaaaggt gatctg 36
<210> 120
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1012
<400> 120
atcccaagct tattggcgtt gggtggtaaa aattttg 37
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1021
<400> 121
cacatgtcta gaatgaccgc cgaacaacgc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1022
<400> 122
catgaagctt acggacccgg attttggctc 30
<210> 123
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1023
<400> 123
catgaagctt acggttcttc ttgaataaaa atttgaatg 39
<210> 124
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1024
<400> 124
catgaagctt attgcagcac tttcggccaa ttt 33
<210> 125
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1025
<400> 125
cacatgtcta gaatgagcat tgtgtgtagc gc 32
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1026
<400> 126
catgaagctt agctttcatc cacggccgg 29
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物No. 1027
<400> 127
catgaagctt aattaccggt ttggcgcagc 30
<210> 128
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人RIG1 CARD
结构域(Aa. 1-228)
<400> 128
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys
145 150 155 160
Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg
165 170 175
Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro
180 185 190
Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu
195 200 205
Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr
210 215 220
Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu
225 230 235 240
Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe
245 250 255
Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys
260 265 270
Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys
275 280 285
Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser
290 295 300
Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu
305 310 315 320
Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp
325 330 335
Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln
340 345 350
Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu Asn Ser
355 360 365
Cys Pro
370
<210> 129
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的人RIG1 CARD
结构域(Aa. 1-217)
<400> 129
Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser Val
1 5 10 15
Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser Gln
20 25 30
Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser Ser
50 55 60
Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu Gly
65 70 75 80
Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met Pro
85 90 95
Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu Thr
100 105 110
Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr Leu
115 120 125
Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr Thr
130 135 140
Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr
145 150 155 160
Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp Phe Arg Glu
165 170 175
Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys Gly Pro Met
180 185 190
Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Glu Glu
195 200 205
Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala Gly Tyr Ser
210 215 220
Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys Ile Glu Lys
225 230 235 240
Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro Glu Phe Lys
245 250 255
Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser Glu Cys Leu
260 265 270
Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser Thr Lys Gly
275 280 285
Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu Arg Ser Asp
290 295 300
Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Glu Arg
305 310 315 320
Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val
325 330 335
Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp Ile Gln Ile
340 345 350
Phe Tyr Gln Glu Asp Pro
355
<210> 130
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138 - 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠MAVS CARD
结构域(Aa. 1-101)
<400> 130
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Arg Asp Asn His Ser Lys
145 150 155 160
Phe Cys Cys Val Asp Val Leu Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Ser Cys Leu
165 170 175
Thr Ala Ser Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Ser Tyr Arg Gln Ile Gly
180 185 190
Asn Arg Asp Thr Leu Trp Gly Leu Phe Asn Asn Leu Gln Arg Arg Pro
195 200 205
Gly Trp Val Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Gln Ile Cys Glu Leu Pro
210 215 220
Gly Leu Ala Asp Gln Val Thr Arg Val Tyr Gln Ser Tyr Leu Pro Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser
<210> 131
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YopE1-138- 小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠cGAS (Aa.
146-507)
<400> 131
Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu
35 40 45
Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser
50 55 60
Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu
100 105 110
Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr
115 120 125
Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Pro
130 135 140
Asp Lys Leu Lys Lys Val Leu Asp Lys Leu Arg Leu Lys Arg Lys Asp
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ala Ala Glu Thr Val Asn Lys Val Val Glu Arg Leu Leu
165 170 175
Arg Arg Met Gln Lys Arg Glu Ser Glu Phe Lys Gly Val Glu Gln Leu
180 185 190
Asn Thr Gly Ser Tyr Tyr Glu His Val Lys Ile Ser Ala Pro Asn Glu
195 200 205
Phe Asp Val Met Phe Lys Leu Glu Val Pro Arg Ile Glu Leu Gln Glu
210 215 220
Tyr Tyr Glu Thr Gly Ala Phe Tyr Leu Val Lys Phe Lys Arg Ile Pro
225 230 235 240
Arg Gly Asn Pro Leu Ser His Phe Leu Glu Gly Glu Val Leu Ser Ala
245 250 255
Thr Lys Met Leu Ser Lys Phe Arg Lys Ile Ile Lys Glu Glu Val Lys
260 265 270
Glu Ile Lys Asp Ile Asp Val Ser Val Glu Lys Glu Lys Pro Gly Ser
275 280 285
Pro Ala Val Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Glu Glu Ile Ser Val Asp
290 295 300
Ile Ile Leu Ala Leu Glu Ser Lys Gly Ser Trp Pro Ile Ser Thr Lys
305 310 315 320
Glu Gly Leu Pro Ile Gln Gly Trp Leu Gly Thr Lys Val Arg Thr Asn
325 330 335
Leu Arg Arg Glu Pro Phe Tyr Leu Val Pro Lys Asn Ala Lys Asp Gly
340 345 350
Asn Ser Phe Gln Gly Glu Thr Trp Arg Leu Ser Phe Ser His Thr Glu
355 360 365
Lys Tyr Ile Leu Asn Asn His Gly Ile Glu Lys Thr Cys Cys Glu Ser
370 375 380
Ser Gly Ala Lys Cys Cys Arg Lys Glu Cys Leu Lys Leu Met Lys Tyr
385 390 395 400
Leu Leu Glu Gln Leu Lys Lys Glu Phe Gln Glu Leu Asp Ala Phe Cys
405 410 415
Ser Tyr His Val Lys Thr Ala Ile Phe His Met Trp Thr Gln Asp Pro
420 425 430
Gln Asp Ser Gln Trp Asp Pro Arg Asn Leu Ser Ser Cys Phe Asp Lys
435 440 445
Leu Leu Ala Phe Phe Leu Glu Cys Leu Arg Thr Glu Lys Leu Asp His
450 455 460
Tyr Phe Ile Pro Lys Phe Asn Leu Phe Ser Gln Glu Leu Ile Asp Arg
465 470 475 480
Lys Ser Lys Glu Phe Leu Ser Lys Lys Ile Glu Tyr Glu Arg Asn Asn
485 490 495
Gly Phe Pro Ile Phe Asp Lys Leu
500

Claims (14)

1.一种重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是命名为耶尔森氏菌的ΔyopH,O,P,E,M,T的六突变耶尔森氏菌菌株，其包含核苷酸分子，所述核苷酸分子包含编码异源蛋白的核苷酸序列，所述编码异源蛋白的核苷酸序列与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3'末端框内融合，其中，所述编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中，所述异源蛋白是参与诱导或调节干扰素(IFN)应答的蛋白，
其中，所述参与诱导或调节IFN应答的蛋白是参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白，其中所述诱导或调节I型IFN应答的异源蛋白选自由以下组成的组：RIG-I样受体(RLR)家族、参与抗病毒信号传导和I型IFN诱导的其他含有CARD结构域的蛋白和导致STING刺激的环状二核苷酸产生酶例如环-二-AMP、环-二-GMP和环-二-GAMP环化酶，其选自由WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA、CdaS和cGAS组成的组。
2.根据权利要求1所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，参与所述诱导或调节IFN应答的蛋白是参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白，其中，所述参与诱导或调节I型IFN应答的蛋白选自由以下组成的组：RIG1、MDA5、MAVS/IPS-1、WspR、DncV、DisA和DisA样、CdaA和cGAS或其片段。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含编码生长所必需的内源蛋白的染色体基因的缺失，并且还包含内源毒力质粒，所述内源毒力质粒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与启动子可操作地连接的编码生长所必需的所述内源蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述减毒重组革兰氏阴性细菌菌株在至少一种细菌效应蛋白的产生方面有缺陷。
5.根据权利要求3或4所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述编码生长所必需的内源蛋白的基因选自编码氨基酸产生所必需的酶的基因、编码参与肽聚糖生物合成的酶的基因、编码参与LPS生物合成的酶的基因、编码参与核苷酸合成的酶的基因和编码翻译起始因子的基因。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述编码生长所必需的内源蛋白的基因是编码氨基酸产生所必需的酶的基因，其中，所述氨基酸产生所必需的酶是天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(asd)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中位于所述内源毒力质粒上的编码生长所必需的内源酶的基因包含其内源启动子及其内源转录终止子。
9.根据权利要求8所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述编码生长所必需的内源酶的基因、其内源启动子及其内源转录终止子位于内源毒力质粒上的orf155起点(SycO)的上游122bp处。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株还包含位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整。
11.根据权利要求10所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA热传感器区域内的调整包含缺失，所述缺失去除了位于编码内源AraC型DNA结合蛋白的基因上游的RNA发夹结构或其部分。
12.根据权利要求11所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述内源AraC型DNA结合蛋白是VirF。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中，所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其用于在治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括给受试者施用所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组减毒革兰氏阴性细菌菌株以足以治疗受试者的量施用。
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