KR20190090939A - Biomarker composition comprising human cytochrome P450 4A for diagnosis or predicting prognosis of hepatocellular carcinoma - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인간 시토크롬 P450 4A를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma comprising human cytochrome P450 4A as an active ingredient.
간암(liver cancer)은 간에서 발생하는 모든 악성종양을 총칭하는 것으로, 전 세계적으로 암 사망 순위 4위이며, 우리나라의 경우 40, 50대 남자의 주요 사망원인이다. 이러한 간암은 크게 전이성 간암과 간 내에서 발생하는 일차성 간암으로 나뉜다. 일차성 간암 중에서는 간세포에서 유래하는 간세포암종이 가장 많으며, 이를 주로 간암이라고 한다(김지훈, 2013).Liver cancer is a generic term for all malignant tumors occurring in the liver. It is the fourth largest cancer death worldwide and is the leading cause of death among men in their 40s and 50s. These liver cancers are largely divided into metastatic liver cancer and primary liver cancer occurring in the liver. Among primary liver cancers, hepatocellular carcinoma derived from hepatocytes is the most common and is mainly called liver cancer (Kim Ji-hoon, 2013).
간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 우리나라 암 발생 순위 3위인 주요 암이며, 5년 관찰 생존율 9.6%로 예후가 매우 불량한 암이다(Bae, S.H., 2008). 간세포암종의 원인 인자로는 간염 바이러스, 아플라톡신 B1, 음주, 당뇨 등의 다양한 인자들이 알려져 있으며, 간암의 발생 과정 또한 유전체 및 후성 유전체 변이 등의 다단계 과정을 거쳐 일어나는 것으로 알려져 있다(우현구, 2011). Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third largest cancer in Korea and has a very poor prognosis with a 5-year survival rate of 9.6% (Bae, S.H., 2008). Hepatocellular carcinoma is known to cause various factors such as hepatitis virus, aflatoxin B1, drinking and diabetes, and the development of liver cancer is known to occur through multi-step processes such as genome and epigenetic mutation (Woo, 2011). .
간세포암종은 40대부터 발생이 급격히 증가하고 60대 정도에 최고치를 이룬다. 간세포암종은 증상이 별로 없고, 이 시기는 사회 활동을 적극적으로 해나가는 시기로 피로감, 식욕부진, 전신 쇄약감 등이 어느 정도 수반될 수밖에 없기 때문에 초기에 나타날 수 있는 증상들이 간과되어 조기 발견을 어렵게 하는 요인이 된다(김지훈, 2013). Hepatocellular carcinoma develops rapidly in the 40s and peaks in the 60s. Hepatocellular carcinoma has few symptoms, and this is a period of active social activities, which is accompanied by fatigue, loss of appetite, and general weakness. (Kim Ji-hoon, 2013).
간세포암종의 최근 진단기술과 치료 방법의 발달에도 불구하고 많은 환자에서 병기(stage)가 진행되어 발견되는 경우가 많아 효과적인 치료가 어렵다. 따라서, 이러한 간암을 조기에 진단하여 근치적인 시술을 행하는 것이 환자의 생존율을 높일 수 있는 가장 효과적인 방법이다. Despite recent developments in hepatocellular carcinoma and the development of methods of treatment, many patients are found to have advanced stages. Therefore, early diagnosis and curative treatment of liver cancer are the most effective methods for increasing the survival rate of patients.
시토크롬 P450(cytochrome P450, CYP)은 보결분자단(prosthetic group)으로 헴(heme)을 가지는 효소군으로 대부분의 약물이나 환경물질들 등의 다양한 외인성 물질 또는 스테로이드나 지질 등의 내인성 물질에 대해 산화적 대사 작용을 수행하는 생명체에 필수적인 촉매 효소로 알려져 있다. 이러한 시토크롬 P450들은 고세균(archaebacteria)에서 인간까지 대부분의 생물체에 존재하며, 현재까지 약 2,500개 이상의 시토크롬 P450 유전자들이 발견되었다(Guengerich, F.P., 2004).Cytochrome P450 (CYP) is a prosthetic group that is a group of enzymes with heme. It is oxidative to various exogenous substances such as most drugs or environmental substances or endogenous substances such as steroids or lipids. It is known as a catalytic enzyme essential for life-giving metabolism. These cytochrome P450s are present in most organisms, from archaebacteria to humans, and to date more than 2,500 cytochrome P450 genes have been found (Guengerich, F.P., 2004).
인간의 유전자에는 57개의 시토크롬 P450 유전자들이 알려져 있으나, 이 중 약 1/4에 해당하는 부분이 그 기능, 발현형태, 조절기작 등이 거의 알려지지 않았다. 반면에, 시토크롬 P450 1A2(CYP1A2), 2A6(CYP2A6)는 발암기전에 가장 중심적인 역할을 수행하는 것으로 확인되었다(Guengerich, F.P., 2003). CYP1A2는 탄 고기 등의 음식에서 나오는 다양한 헤테로 사이클릭 아민(heterocyclic amine) 화합물들의 발암성을 활성화시키고, CYP2A6는 니트로사민(nitrosamine) 화합물들의 발암성을 활성화시키며, CYP2A6가 머리나 목 부위에 발현됨에 따라 이들 부위의 발생하는 암과 높은 상관성을 나타내는 것을 보여주었다(Ding, X., et al., 2003). 또한, 일본인들에서의 흡연과 관련된 CYP2A6와 폐암과의 연관성에 관한 여러 연구들이 수행되었다(Kamataki, T., et al., 2002). There are 57 cytochrome P450 genes known in human genes, but about one-fourth of them have little known function, expression, or regulatory mechanism. In contrast, cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) and 2A6 (CYP2A6) were found to play the most central role in carcinogenesis (Guengerich, F.P., 2003). CYP1A2 activates carcinogenicity of various heterocyclic amine compounds from foods such as charcoal meat, CYP2A6 activates carcinogenicity of nitrosamine compounds, and as CYP2A6 is expressed in the head or neck It has been shown to be highly correlated with developing cancer at these sites (Ding, X., et al., 2003). In addition, several studies have been conducted on the association between lung cancer and CYP2A6 associated with smoking in Japanese (Kamataki, T., et al., 2002).
생리학적으로 인간 시토크롬 P450 4 패밀리(CYP4)는 포화된 분지형 사슬 및 불포화 지방산의 오메가-수산화(ω-hydroxylation)와 관련이 있다. 이러한 CYP4 패밀리는 CYP4A11, CYP4F2 및 CYP4F3가 가장 많이 연구되었고, 이들이 인간 간 조직에서 발현이 많이 되고 있다는 것이 알려져 있다(Johnson, A.L., et al., 2015). 또한, 인간 CYP4A 서브패밀리(subfamily)는 매우 상동적인 유전자 서열을 갖는 CYP4A11과 CYP4A22로 이루어져 있으며, CYP4A22는 몇몇의 조직에서 낮은 수준으로 발현되며, 아직까지 그 활성이 밝혀지지 않았다(Katheryne, Z.E., et al., 2013).Physiologically, the
이에, 본 발명자들은 간세포암종 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 연구하는 과정에서, 간세포암종 환자의 간 조직 중, 비종양성 부분에 비해 종양 부분에서 인간 시토크롬 P450 4A(CYP4A) 유전자 및 단백질 발현이 현저히 감소되는 것을 확인하였고, 인간 CYP4A 발현이 낮을수록 환자 생존율이 낮고, 간세포암종의 재발 가능성이 증가하며, 암의 병기도 진행되어 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다. Accordingly, the present inventors, in the course of studying a biomarker for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma, the expression of human cytochrome P450 4A (CYP4A) gene and protein in the tumor part of the liver tissue of hepatocellular carcinoma patients is remarkably high. It was confirmed that the decrease, the lower the expression of human CYP4A, the lower the patient survival rate, the possibility of recurrence of hepatocellular carcinoma, and confirmed the progress of the cancer was able to complete the present invention.
종래 선행기술로서 미국공개특허 제2004-0248142호 및 제2014-0100127호에는 간세포암종의 바이오마커로서 시토크롬 P450이 기재되어 있어 본 발명의 구성과 유사하나, 본 발명의 인간 시토크롬 P450 4A와는 그 구성이 다르다. In the prior art, US Patent Publication Nos. 2004-0248142 and 2014-0100127 disclose cytochrome P450 as a biomarker of hepatocellular carcinoma, which is similar to the configuration of the present invention, but the configuration thereof is different from that of human cytochrome P450 4A of the present invention. different.
비특허문헌인 Meyer, K., et al. 2003.에는 유전독성 발암물질(genotoxic carcinogen)에 의해 유도된 간세포암종에서 시토크롬 P450 4A10의 유전자 발현이 감소된다고 기재되어 있어, 본 발명의 구성과 유사하나, CYP4A10은 마우스의 시토크롬 P450으로 본 발명의 인간 시토크롬 P450 4A와는 그 구성이 다르다. Non-Patent Documents Meyer, K., et al. 2003. It is described that the gene expression of cytochrome P450 4A10 is reduced in hepatocellular carcinoma induced by genotoxic carcinogen, which is similar to the composition of the present invention, but CYP4A10 is cytochrome P450 of mouse and human of the present invention. The configuration is different from cytochrome P450 4A.
본 발명의 목적은 인간 시토크롬 P450 4A를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다. An object of the present invention to provide a biomarker composition for diagnosing or prognostic hepatocellular carcinoma comprising human cytochrome P450 4A as an active ingredient.
본 발명은 인간 시토크롬 P450 4A(cytochrome P450 4A, CYP4A)를 유효성분으로 포함하는 간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC) 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma (HCC) comprising human cytochrome P450 4A (CYP4A) as an active ingredient.
상기 인간 CYP4A는 CYP4A11 및 CYP4A22일 수 있다. The human CYP4A may be CYP4A11 and CYP4A22.
상기 인간 CYP4A는 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종 또는 간세포암종 병기 진행에 따라 발현이 감소되는 것일 수 있다. The human CYP4A may be reduced in expression according to progression of hepatocellular carcinoma or hepatocellular carcinoma compared to normal liver tissue.
또한, 본 발명은 상기 인간 CYP4A에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a kit for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma comprising an antibody specifically binding to the human CYP4A.
상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb)일 수 있다. The antibody may be a monoclonal antibody (mAb) or a polyclonal antibody (pAb).
본 발명은 또한, 상기 인간 CYP4A 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a kit for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma comprising a primer pair or a probe specifically binding to the human CYP4A gene.
또한, 본 발명은 간세포암종 환자의 간 조직 또는 간세포에서 발현되는 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준을 측정하는 1단계; 상기 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및, 상기 환자의 간 조직 또는 간세포에서의 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. In addition, the present invention comprises the steps of measuring the human CYP4A protein or gene expression level expressed in liver tissue or hepatocytes of hepatocellular carcinoma patients; Comparing the human CYP4A protein or gene expression level with a normal control sample; And, if the human CYP4A protein or gene expression level in the liver tissue or hepatocytes of the patient is lower than the
상기 인간 CYP4A 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정할 수 있다. The human CYP4A protein expression level can be measured via an antigen-antibody response.
상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 확인할 수 있다. The antigen-antibody reactions include Western blot, immunohistochemical staining, radioimmunoassay, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunodiffusion, immunoprecipitation assay ), Complement fixation assay (complement fixation assay) and protein chips (protein chip) can be confirmed by one or more methods selected from the group consisting of.
상기 인간 CYP4A 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. The method for measuring human CYP4A gene expression level is reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real time RT-PCR (realtime RT-PCR) , RNase protection assay (RNase protection assay), northern blot (northern blot) and DNA chip (DNA chip) may be one or more selected from the group consisting of.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 인간 시토크롬 P450 4A(cytochrome P450 4A, CYP4A)를 유효성분으로 포함하는 간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC) 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma (HCC) comprising human cytochrome P450 4A (CYP4A) as an active ingredient.
상기 "간세포암종"은 간세포에서 유래하는 일차성 간암을 의미한다. "Hepatocellular carcinoma" means primary liver cancer derived from hepatocytes.
상기 "예후"는 간세포암종의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 간세포암종-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. The "prognosis" refers to the progress and cure of a disease, such as the possibility of relapse or recurrence of hepatocellular carcinoma, metastatic proliferation, and the possibility of hepatocellular carcinoma-causing death or progression, including drug resistance.
상기 "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 재발이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 재발이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.The term "prediction" means that the patient responds favorably or unfavorably to treatments such as chemotherapy or radiation therapy so that the patient is treated, for example, by surgical removal of certain therapeutic agents, and / or primary tumors, and / or cancer Survival and / or likelihood after treatment with chemotherapy for a certain period of time without recurrence. The prediction method of the present invention can be used clinically by selecting and applying the most appropriate treatment regimen for any particular patient. Prediction methods of the present invention determine whether a patient responds favorably to a treatment such as a prescribed treatment regimen, including, for example, administration of a predetermined treatment or combination, surgical intervention, chemotherapy, or the like, or after a treatment regimen. Long term survival or systemic or local recurrence is predictable. It can also be planned to minimize unnecessary adjuvant chemotherapy or to use adjuvant chemotherapy for patients who are expected to have systemic or local recurrence.
상기 "바이오마커(biomarker)"란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고, 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미하는 것으로, DNA, RNA와 같은 유전자, 단백질, 지방질, 대사물질 등과 그 패턴의 변화 등이 이용되고 있다. The "biomarker" refers to a marker that can distinguish a normal or pathological condition or predict a therapeutic response, and can be objectively measured. Genes, proteins, lipids, metabolites such as DNA and RNA And the like and variations of the pattern are used.
상기 바이오마커 조성물은 인간 CYP4A 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 조성물 또는 인간 CYP4A 유전자 서열 전부 또는 일부를 포함하는 조성물일 수 있다. The biomarker composition may be a composition comprising a human CYP4A protein or an immunogenic fragment thereof or a composition comprising all or part of a human CYP4A gene sequence.
상기 인간 CYP4A는 CYP4 패밀리 중 하나로, CYP4A11 및 CYP4A22일 수 있다. 바람직하게는 CYP4A11이다. The human CYP4A is one of the CYP4 families, which may be CYP4A11 and CYP4A22. Preferably CYP4A11.
상기 인간 CYP4A는 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 감소된다. 또한, 간세포암종의 병기(stage) 진행에 따라 간세포암종에서의 인간 CYP4A의 발현이 점차 감소된다. The human CYP4A is reduced in hepatocellular carcinoma compared to normal liver tissue. In addition, as stages of hepatocellular carcinoma progress, expression of human CYP4A in hepatocellular carcinoma gradually decreases.
상기 "병기"는 암의 진행도를 분류하는 개념으로, 통상적으로 1기에서 4기까지 4단계로 분류하는데, 암의 진행정도가 심해질수록 숫자가 올라간다. The "stage" is a concept of classifying cancer progression, and is usually classified into four stages from
상기 인간 CYP4A 발현 감소는 단백질 및 유전자의 발현 감소일 수 있고, 인간 CYP4A 유전자 발현 감소는 mRNA 발현 감소일 수 있다. The decrease in human CYP4A expression may be a decrease in expression of proteins and genes, and the decrease in human CYP4A gene expression may be a decrease in mRNA expression.
또한, 본 발명은 인간 CYP4A에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간 CYP4A 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a kit for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma comprising a antibody or a primer pair or a probe specifically binding to a human CYP4A gene.
상기 인간 CYP4A에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 간세포암종에서 발현되는 인간 CYP4A 단백질을 검출하기 위한 것으로, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC, Cy3, Cy5 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아님), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다. Hepatocellular carcinoma diagnostic or prognostic kit comprising the antibody specifically binding to human CYP4A is for detecting human CYP4A protein expressed in hepatocellular carcinoma, the substrate, suitable buffer, color development for immunological detection of the antibody Secondary antibodies labeled with enzymes or fluorescent materials, chromogenic substrates, and the like. As the substrate, a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, etc. may be used, and peroxidase (peroxidase) may be used. ), Alkaline phosphatase and the like can be used. In addition, FITC, RITC, Cy3, Cy5, etc. may be used as the fluorescent substance, and ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD as a chromogenic substrate (o-phenylenedia), TMB (tetramethyl benzidine) and the like can be used.
상기 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 인간 CYP4A 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb), 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb) 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 다클론 항체는 인간 CYP4A 단백질 또는 이의 면역원성 단편(항원)을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지, 양 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler, G. et al., 1976), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson, T. et al., 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 인간 CYP4A 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 인간 CYP4A 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 인간 CYP4A 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 결합하는 단클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.The term "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. Preferably, the antibody refers to an antibody that specifically binds to a human CYP4A protein or an immunogenic fragment thereof, and includes all monoclonal antibodies (mAb), polyclonal antibodies (pAb), and recombinant antibodies. can do. Producing such antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art. The polyclonal antibody can be obtained from serum collected after injecting a human CYP4A protein or an immunogenic fragment thereof (antigen) into an animal. The animal may be any animal host such as goat, rabbit, pig or sheep. The monoclonal antibody, as is well known in the art to which the present invention pertains, uses hybridoma method (Kohler, G. et al., 1976), or phage antibody library (Clackson, T. et al., 1991) technology. It can manufacture. In order to perform the hybridoma method, cells of an immunologically suitable host animal such as a mouse and cancer or myeloma cell line may be used. Thereafter, by using a method such as polyethylene glycol, that is, a method well known in the art to which the present invention belongs, after fusing these two kinds of cells, the antibody producing cells can be propagated by a standard tissue culture method. have. Subsequently, after obtaining a uniform cell population by subcloning by the limited dilution technique, hybridomas capable of producing antibodies specific for the human CYP4A protein of the present invention are in vitro or in accordance with standard techniques. It can be mass culture in vivo. The phage antibody library method obtains an antibody gene that specifically recognizes a human CYP4A protein or immunogenic fragment thereof of the present invention, and expresses it in the form of a fusion protein on the surface of the phage to express the antibody library in vitro. And a monoclonal antibody which binds to the human CYP4A protein of the present invention or an immunogenic fragment thereof from the library can be isolated and produced. Antibodies prepared by the above methods can be separated by electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.The antibody may comprise functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , F (ab) 2 , and Fv.
상기 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 항체 대신에 인간 CYP4A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide) 등을 포함할 수 있다. Hepatocellular carcinoma diagnostic or prognostic kit comprising the antibody may include an aptamer, a peptide, or the like that can specifically bind to human CYP4A protein instead of the antibody.
상기 "압타머"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종으로, 압타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.The "aptamer" refers to a polynucleotide composed of a special kind of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure and having a characteristic of binding to a target molecule with high affinity and specificity. In one kind, aptamers can be used in place of antibodies because they are specifically composed of polynucleotides that can bind specifically to antigenic substances like antibodies, but are more stable than proteins, simple in structure, and easy to synthesize. .
상기 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.The "peptide" has a high binding strength to the target material, and does not occur denaturation even during thermal / chemical treatment. In addition, the small size of the molecule can be used as a fusion protein by attaching to other proteins. Specifically, since it can be used by attaching to a polymer protein chain, it can be used as a diagnostic kit and drug delivery material.
상기 인간 CYP4A 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 간세포암종에서 발현되는 인간 CYP4A 유전자를 검출하기 위한 것으로, 상기 유전자는 인간 CYP4A mRNA일 수 있다. Hepatocellular carcinoma diagnosis or prognostic kit comprising a primer pair or probe specifically binding to the human CYP4A gene is for detecting a human CYP4A gene expressed in hepatocellular carcinoma, the gene is human CYP4A mRNA.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.The "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group, which forms a base pair with a complementary template and serves as a starting point for template strand copying. Say. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. PCR conditions, sense and antisense primer lengths may be appropriately selected according to techniques known in the art.
상기 프라이머는 인간 CYP4A 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로, 상기 인간 CYP4A 유전자 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지는 것으로, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 쌍을 이룬다.The primer is a primer capable of amplifying all or part of a human CYP4A gene sequence. The primer has a base sequence complementary to all or a part of the human CYP4A gene sequence, and a sense primer and an antisense primer are paired.
상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.The "probe" refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA, which are short to several bases to hundreds of bases that can specifically bind to mRNA, and are labeled to identify the presence or absence of expression of a specific mRNA. Can be. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of appropriate probes and hybridization conditions may be appropriately selected according to techniques known in the art.
상기 프로브는 인간 CYP4A 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부에 결합하는 것으로, 인간 CYP4A 유전자 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. The probe binds to all or a portion of the human CYP4A gene sequence, and may have a base sequence complementary to all or a portion of the human CYP4A gene sequence.
상기 인간 CYP4A 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는, 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), DNA/RNA 중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. Hepatocellular carcinoma diagnosis or prognosis kit comprising a primer pair or probe specifically binding to the human CYP4A gene, in addition to the primer pair, a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxyribonucleotide (dNTPs), enzymes such as DNA / RNA polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, sterile water and the like.
본 발명은 또한, 간세포암종 환자의 간 조직 또는 간세포에서 발현되는 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준을 측정하는 1단계; 상기 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및, 상기 환자의 간 조직 또는 간세포에서의 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. The present invention also comprises the steps of measuring the human CYP4A protein or gene expression level expressed in liver tissue or hepatocytes of hepatocellular carcinoma patients; Comparing the human CYP4A protein or gene expression level with a normal control sample; And, if the human CYP4A protein or gene expression level in the liver tissue or hepatocytes of the patient is lower than the
상기 인간 CYP4A 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정할 수 있다.The human CYP4A protein expression level can be measured via an antigen-antibody response.
상기 항원-항체 반응은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다. The antigen-antibody response can be carried out according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the past. The immunoassay format is Western blot, immunohistochemical staining, radioimmunoassay, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunodiffusion, immunoprecipitation assay At least one selected from the group consisting of a complement fixation assay and a protein chip, but not limited thereto.
상기 인간 CYP4A 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCT), 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The method for measuring human CYP4A gene expression level is reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCT, real time RT-PCR (realtime RT-PCR) , RNase protection assay (RNase protection assay), northern blot (northern blot) and DNA chip (DNA chip) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명은 인간 시토크롬 P450 4A(CYP4A)를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 간세포암종 환자의 종양 부분의 간 조직에서 인간 CYP4A의 유전자 및 단백질 발현이 비종양 부분의 간조직에 비해 현저히 감소되는 것을 확인하였고, 간세포암종의 병기 진행에 따라 인간 CYP4A의 발현이 감소하고, 인간 CYP4A의 발현이 낮을수록 간세포암종의 재발 가능성이 높아지며, 환자 생존율이 낮은 것을 확인하였다. The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis or prognosis of hepatocellular carcinoma comprising human cytochrome P450 4A (CYP4A) as an active ingredient, wherein the gene and protein expression of human CYP4A is non-tumor in liver tissue of the tumor part of hepatocellular carcinoma patient. It was confirmed that the hepatocellular carcinoma was significantly reduced compared with the partial hepatocellular carcinoma. As the stage of the hepatocellular carcinoma progressed, the expression of human CYP4A decreased, and the lower the expression of human CYP4A, the higher the possibility of recurrence of hepatocellular carcinoma, and the lower the patient survival rate. .
이에 따라, 본 발명의 인간 CYP4A는 간세포암종의 바이오마커로 이용가능하며, 이러한 인간 CYP4A 발현율 분석을 통해 간세포암종의 진단 및 예후 예측이 가능하고, 간세포암종의 예방 또는 치료제 개발에 있어서도 활용 가치가 높을 것으로 기대된다. Accordingly, the human CYP4A of the present invention can be used as a biomarker of hepatocellular carcinoma, and the diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma can be predicted through the analysis of the human CYP4A expression rate, and the value of the CYP4A can be high in the development of a preventive or therapeutic agent for hepatocellular carcinoma. It is expected to be.
도 1은 면역조직화학염색 한 간세포암종 환자의 간 조직에서의 인간 CYP4A 단백질 발현을 분석한 결과로, (A)는 염색된 조직으로 간세포암종 환자의 간 조직의 종양 부분(HCC)과 비종양 부분(Non-tumor)에서의 인간 CYP4A 발현 정도를, (B)는 염색된 정도를 분석하여 종양 부분과 비종양 부분에서의 인간 CYP4A의 단백질 발현 정도를 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 간세포암종 환자의 간 조직에서의 인간 CYP4A 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과로, (A)는 종양 부분(T)과 비종양 부분(N)에서의 인간 CYP4A 발현을 확인한 웨스턴 블롯 밴드 결과를, (B)는 웨스턴 블롯 결과에서 얻은 밴드를 분석하여 종양 부분(HCC)과 비종양 부분(Non-tumor)에서의 인간 CYP4A 단백질 발현 정도를 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 인간 CYP4A 단백질 발현 정도에 따른 간세포암종 환자의 생존 곡선을 보여주고 있는 것으로, (A)는 인간 CYP4A 단백질 발현과 무병생존 누적율(Cumulative Disease-free Survival)과의, (B)는 인간 CYP4A 단백질 발현과 전체생존 누적율(Cumulative Overall Survival)과의 상관관계를 보여주고 있다.
도 4는 간세포암종 환자의 종양부분(HCC)의 간 조직과 비종양 부분(Non-Tumor)의 간 조직에서의 인간 CYP4A mRNA 발현 정도를 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 간세포암종의 진행에 따른 인간 CYP4A mRNA 발현 정도를 분석한 결과로, (A)는 조직학적 등급에 따른, (B)는 병리학적 병기에 따른 인간 CYP4A mRNA 발현 정도를 분석한 결과를 보여주고 있다. 1 is a result of analysis of human CYP4A protein expression in liver tissue of immunohistochemically stained hepatocellular carcinoma patients, (A) is a stained tissue tumor portion (HCC) and non-tumor portion of liver tissue of hepatocellular carcinoma patients The degree of human CYP4A expression in (non-tumor) and (B) shows the result of comparing the protein expression levels of human CYP4A in tumor and non-tumor areas by analyzing the degree of staining.
Figure 2 is a Western blot confirming the expression level of human CYP4A protein in liver tissue of hepatocellular carcinoma patients, (A) Western blot band confirming the human CYP4A expression in the tumor (T) and non-tumor (N) As a result, (B) shows the result of comparing the expression level of human CYP4A protein in the tumor part (HCC) and the non-tumor part by analyzing the band obtained from the western blot result.
Figure 3 shows the survival curves of hepatocellular carcinoma patients according to the expression level of human CYP4A protein, (A) human CYP4A protein expression and cumulative disease-free Survival, (B) human Correlation between CYP4A protein expression and Cumulative Overall Survival is shown.
FIG. 4 shows the results of confirming the expression level of human CYP4A mRNA in liver tissues of HCC and non-tumor liver tissues of HCC patients by real-time RT-PCR.
5 is a result of analyzing the degree of human CYP4A mRNA expression according to the progression of hepatocellular carcinoma, (A) according to the histological grade, (B) shows the result of analyzing the degree of human CYP4A mRNA expression according to the pathological stage Giving.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in other forms. Rather, the information provided herein is to be thorough and complete, and to fully convey the spirit of the present invention to those skilled in the art.
<실시예 1. 간세포암종 환자의 임상정보 및 간 조직 확보> <Example 1. Clinical information and liver tissue secured in patients with hepatocellular carcinoma>
간세포암종의 진단 또는 예후 예측 관련 바이오마커를 찾기 위해 간세포암종 환자의 간 조직을 확보했다. The liver tissues of HCC patients were searched for biomarkers for diagnosis or prognosis of HCC.
간세포암종 환자의 간 조직은 1999년부터 2013년까지 충남대학교 병원에서 간세포암종 절제 수술한 120명의 조직을 이용하였다. 간 조직의 경우, 파라핀으로 고정 후, H&E 염색(hematoxylin and eosin stain)된 것으로, 조직 슬라이드에서 종양 부분과 비종양 부분을 선택하여 표시하였다. Liver tissues of hepatocellular carcinoma patients were used from 1999 to 2013 in 120 patients who underwent hepatocellular carcinoma resection at Chungnam National University Hospital. In the case of liver tissue, it was fixed with paraffin and then H & E stained (hematoxylin and eosin stain), and the tumor portion and the non-tumor portion were selected on the tissue slide.
간세포암종에 대한 병리학적 병기(pathological stage)는 TNM(tumor, node and metastasis) 병기로, 절제 수술 시기를 기반으로 AJCC(the American Joint Committee on Cancer)의 제8판 병기 결정 체계에 따라 결정하였다. 또한, 환자의 임상정보는 전자의무 기록인 KHK 및 HSE를 통해 확보하여 하기 표 1에 정리하였다. The pathological stage for hepatocellular carcinoma was a tumor, node and metastasis (TNM) stage, which was determined according to the 8th edition of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) based on the timing of resection surgery. In addition, the clinical information of the patient is secured through the electronic medical records KHK and HSE are summarized in Table 1 below.
(pathological stage,
TNM stage)Pathological staging
(pathological stage,
TNM stage)
(histological grade)Histological grade
(histological grade)
<< 실시예Example 2. 2. 간세포암종Hepatocellular Carcinoma 환자의 간 조직 염색을 통한 인간 시토크롬 P450 4A(CYP4A) 단백질 발현 정도 확인> Determination of Human Cytochrome P450 4A (CYP4A) Protein Expression by Patient's Liver Staining>
실시예 2-1. 조직 염색을 통한 인간 CYP4A 발현 정도 확인Example 2-1. Confirmation of Human CYP4A Expression by Tissue Staining
상기 실시예 1에서 확보한 간세포암종 환자의 간 조직 슬라이드에 인간 CYP4A를 인식하는 항체를 처리하여 면역조직화학염색(immunohistochemical stain)을 수행하고, 디지털 스캔한 조직 파일과 ScanScope 프로그램(Aperio ScanScope CS system, Vista, USA)을 이용하여 염색된 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 인간 CYP4A를 인식하는 항체(Clone# EPR8276, Abcam 사, UK)는 CYP4A11 및 CYP4A22를 동시에 검출할 수 있는 항체를 이용하였고, 간세포암종 환자의 간 조직을 종양 부분과 비종양 부분으로 나누어 인간 CYP4A의 발현 정도를 비교하였다. Immunohistochemical staining was performed by treating human CYP4A-recognized antibodies on liver tissue slides of hepatocellular carcinoma patients obtained in Example 1, and performing digital scan of tissue files and ScanScope program (Aperio ScanScope CS system, Vista, USA) was analyzed for the degree of staining, the results are shown in FIG. At this time, the antibody that recognizes human CYP4A (Clone # EPR8276, Abcam, UK) used an antibody that can detect CYP4A11 and CYP4A22 at the same time, and divided the liver tissue of hepatocellular carcinoma patients into tumor and non-tumor parts and human CYP4A The expression level of was compared.
도 1(A)의 간세포암종 환자의 간 조직을 인간 CYP4A 항체를 이용해 염색한 결과에서 보여주듯이, 동일한 간 조직임에도 불구하고 종양 부분(HCC)과 비교하여 비종양 부분(Non-Tumor)에서 인간 CYP4A의 발현량이 많아 갈색으로 진하게 염색된 것을 확인하였다. 종양 부분과 비종양 부분에 각각 표시된 별표 부분을 확대한 경우((A)의 아래 그림)에도 종양 부분에는 갈색을 띠는 부분이 거의 없는 반면에, 비종양 부분에는 대부분이 갈색을 띠고 있는 것을 확인하였다. As shown in the results of staining the liver tissue of the hepatocellular carcinoma patient of Figure 1 (A) using human CYP4A antibody, human CYP4A in the non-tumor region (Non-Tumor) compared to the tumor region (HCC) despite the same liver tissue It was confirmed that a lot of expression of the deeply stained brown. Even when the asterisk portion marked on the tumor part and the non-tumor part was enlarged (figure below in (A)), the tumor part was almost brown, whereas the non-tumor part was mostly brown. It was.
또한, 도 1(B)의 간세포암종 환자의 비종양 부분과 종양 부분에서의 인간 CYP4A 발현 정도를 수치화하여 비교한 결과에서도 비종양 부분과 대비하여 종양 부분에서 인간 CYP4A의 발현이 현저히 감소되는 것을 확인하였다. In addition, the results of quantifying the expression level of human CYP4A in the non-tumor portion and the tumor portion of the hepatocellular carcinoma patient of FIG. 1 (B) showed that the expression of human CYP4A was significantly reduced in the tumor portion as compared to the non-tumor portion. It was.
실시예 2-2. 웨스턴 블롯(western blot)을 통한 발현 정도 확인 Example 2-2. Western blots confirm expression
간세포암종 환자의 간 조직에서의 인간 CYP4A 단백질 발현을 좀 더 정확하게 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 환자 조직 중 15명의 조직을 선택하였다. To more accurately confirm human CYP4A protein expression in liver tissue of hepatocellular carcinoma patients, 15 tissues from the patient tissues of Example 1 were selected.
선택한 15명의 조직에서 종양 부분(HCC)의 조직과 종양 부분으로부터 최소 5㎝ 정도 떨어져 있는 비종양 부분(Non-Tumor)의 조직을 채취하고, 균질기를 이용하여 균질화 한 후, 단백질을 분리하고, 이를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 인간 CYP4A를 검출하기 위해 상기 실시예 2-1에서 사용한 항체와 로딩 대조군으로 β-액틴을 검출하기 위한 β-액틴 항체(sc-1616, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하였다. From 15 tissues selected, tissues of the tumor part (HCC) and non-tumor part (Non-Tumor) at least 5 cm away from the tumor part were collected, homogenized using a homogenizer, and proteins were separated. Western blot was performed using the results, and the results are shown in FIG. 2. In this case, β-actin antibody (sc-1616, Santa Cruz Biotechnology, USA) for detecting β-actin was used as the antibody used in Example 2-1 and the loading control to detect human CYP4A.
도 2에서 보여주듯이, 15명의 간세포암종 환자의 간 조직에서의 인간 CYP4A의 발현을 비교한 결과, 종양 부분(HCC, T)의 인간 CYP4A 밴드가 비종양 부분(Non-Tumor, N)의 인간 CYP4A 밴드에 비해 흐리거나 얇게 나타나는 것을 확인하였고(A), 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 경우(B)에도 종양 부분에서의 인간 CYP4A의 발현량이 비종양 부분에 비해 감소된 것을 확인하였다. As shown in FIG. 2, the expression of human CYP4A in the liver tissues of 15 hepatocellular carcinoma patients showed that the human CYP4A bands of the tumor parts (HCC, T) were non-tumor parts (Non-Tumor, N) of human CYP4A. Compared with the band, it was confirmed that it appeared to be thin or thin (A), and when it was numerically represented as a graph (B), it was confirmed that the expression level of human CYP4A in the tumor part was reduced compared to the non-tumor part.
따라서, 상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 결과를 통해, 간세포암종 환자의 종양 부분에서 인간 CYP4A의 발현이 감소되는 것을 알 수 있었고, 이는 인간 CYP4A가 간세포암종 진단을 위한 바이오마커로서 이용가능하다는 것을 보여주는 것이라 사료된다. Therefore, the results of Examples 2-1 and 2-2 showed that the expression of human CYP4A is reduced in the tumor part of hepatocellular carcinoma patients, which is a biomarker for diagnosing hepatocellular carcinoma. It is believed to show that it is available.
실시예 2-3. 간세포암종 환자의 병리학적 특성과 인간 CYP4A 발현량과의 관련성 확인 Example 2-3. Correlation of Pathologic Characteristics and Human CYP4A Expression in Hepatocellular Carcinoma Patients.
간세포암종 환자의 간 조직에서의 인간 CYP4A의 발현 정도와 환자의 임상병리학적 특성과의 관련성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 간세포암종 환자의 임상정보와 상기 실시예 2-1의 간세포암종 환자의 간 조직으로부터 분석한 인간 CYP4A 발현량을 하기 표 2에 정리하였다. 또한, 간세포암종 환자의 치료 후 추적 검사를 통해, 인간 CYP4A 발현에 따른 간세포암종 환자의 생존율을 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. In order to confirm the relationship between the expression level of human CYP4A in liver tissue of hepatocellular carcinoma patients and the clinical pathologic characteristics of the patient, the clinical information of the hepatocellular carcinoma patient of Example 1 and the hepatocellular carcinoma patient of Example 2-1 The amount of human CYP4A expression analyzed from liver tissues is summarized in Table 2 below. In addition, through the post-treatment test of hepatocellular carcinoma patients, the survival rate of hepatocellular carcinoma patients according to human CYP4A expression was analyzed and the results are shown in FIG. 3.
(pathological stage,
TNM stage)Pathological staging
(pathological stage,
TNM stage)
(histological grade)Histological grade
(histological grade)
상기 표 2에서 보여주듯이, 간세포암종 환자의 임상병리학적 특성과 인간 CYP4A 발현량과의 관련성을 살펴보면, 환자의 나이, 성별, HBV 또는 HCV 감염 여부 및 간경화 여부의 경우에는 인간 CYP4A 발현량과 상관성이 없는 것으로 나타나는 반면에, 암종의 진행과 관련되어 있는 병리학적 병기 및 조직학적 등급과의 관계를 살펴보면, 병기 또는 조직학적 등급이 낮은 경우에는 인간 CYP4A의 발현량이 높은 환자의 비율이 발현량이 낮은 환자의 비율에 비해 높은 반면에, 병기 또는 조직학적 등급이 높아질수록 인간 CYP4A의 발현량이 높은 환자 비율보다 발현량이 낮은 환자의 비율이 현저히 증가된 것을 확인하였다.As shown in Table 2, the relationship between the clinicopathologic characteristics of human hepatocellular carcinoma patients and human CYP4A expression levels was not correlated with human CYP4A expression levels in patients with age, sex, HBV or HCV infection, and liver cirrhosis. On the other hand, the relationship between the pathological stage and histological grades related to the progression of the carcinoma shows that in patients with low stage or histological grade, the proportion of patients with high expression level of human CYP4A is higher than that of patients with low expression level. On the other hand, as the stage or histological grade was higher, the proportion of patients with low expression level was higher than that of patients with high expression level of human CYP4A.
또한, 도 3의 인간 CYP4A 발현에 따른 간세포암종 환자의 생존율 분석 결과에서 보여주듯이, 간세포암종 치료 후 무병생존 누적율(Cumulative Disease-free Survival)(A) 및 전체생존 누적율(Cumulative Overall Survival)(B) 모두에서 인간 CYP4A의 발현이 낮은 환자에 비해, 인간 CYP4A 발현이 높은 환자의 생존율이 높은 것을 확인하였다. In addition, as shown in the results of survival analysis of hepatocellular carcinoma patients according to the expression of human CYP4A in FIG. 3, cumulative disease-free survival (A) and cumulative overall survival (A) after hepatocellular carcinoma treatment ( B) In all, it was confirmed that the survival rate of patients with high expression of human CYP4A was higher than that of patients with low expression of human CYP4A.
반면에, 본 명세서에는 나타내지 않았지만, 인간 간 조직에서 발현되고 있는 CYP4 패밀리 중 하나인 CYP4F2의 발현량에 따른 간세포암종 환자의 생존율을 분석한 경우에는 CYP4F2의 발현량에 따른 환자의 생존율에 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. On the other hand, although not shown in the present specification, when analyzing the survival rate of hepatocellular carcinoma patients according to the expression level of CYP4F2, one of the CYP4 family expressed in human liver tissue, there is a big difference in the survival rate of patients according to the expression level of CYP4F2 It was confirmed that there was no.
이를 통해, 인간 CYP4A가 간세포암종의 병기가 진행됨에 따라 발현이 감소되며, 환자의 생존율에도 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있으며, 인간 CYP4A를 간세포암종의 병기 진행 및 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다. Through this, the expression of human CYP4A decreases as the stage of hepatocellular carcinoma progresses, and it can be seen that it significantly affects the survival rate of patients, and human CYP4A can be used as a biomarker for predicting the progression and prognosis of hepatocellular carcinoma. I could see that.
<실시예 3. 간세포암종 환자에서의 인간 CYP4A mRNA 발현 분석> Example 3 Analysis of Human CYP4A mRNA Expression in Hepatocellular Carcinoma Patients
실시예 3-1. 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCR)을 이용한 인간 CYP4A mRNA 발현 정도 확인Example 3-1. Expression of Human CYP4A mRNA by Real-Time RT-PCR
상기 실시예 1에서 확보한 간세포암종 환자의 간 조직으로부터 RNA를 분리, 정제하여, 인간 CYP4A의 mRNA 발현을 분석하였다. RNA was isolated and purified from liver tissue of the hepatocellular carcinoma patient obtained in Example 1, and mRNA expression of human CYP4A was analyzed.
TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용해 회사에서 제공한 매뉴얼을 이용해 20명의 간세포암종 환자의 간 조직으로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 이때, 간 조직을 종양 부분과 비종양 부분으로 나누어 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA와 GenDEPOT 사의 cDNA 합성 키트(amfiRivert cDNA synthesis master mix)를 이용해 cDNA(complementary DNA)를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 하기 표 3의 프라이머와 SYBR Green Real-time PCR master Mix(Toyobo, Japan)를 이용하여 실시간 역전사 중합효소반응을 수행하여 인간 CYP4A mRNA 발현량을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, β-액틴(β-actin)을 정량 대조군으로 이용하여 mRNA 발현량 분석에 이용하였다. Total RNA was isolated from the liver tissue of 20 hepatocellular carcinoma patients using a company-supplied manual using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, USA). At this time, liver tissue was divided into tumor parts and non-tumor parts to separate total RNA. Complementary DNA (cDNA) was synthesized using the isolated total RNA and the cDNA synthesis kit (amfiRivert cDNA synthesis master mix) of GenDEPOT. Using synthetic cDNA as a template, real-time reverse transcriptase polymerase reaction was performed using the primers of Table 3 and SYBR Green Real-time PCR master Mix (Toyobo, Japan) to confirm the expression level of human CYP4A mRNA. 4 is shown. At this time, β-actin (β-actin) was used as a quantitative control for mRNA expression analysis.
도 4에서 보여주듯이, 간세포암종 환자의 비종양 부분(Non-Tumor)과 종양 부분(HCC)에서의 인간 CYP4A mRNA 발현량을 비교한 결과, 비종양 부분에 비해 종양 부분에서 인간 CYP4A mRNA 발현량이 현저히 감소되어 있는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 4, a comparison of the amount of human CYP4A mRNA expression in the non-tumor portion and the tumor portion (HCC) of hepatocellular carcinoma patients showed that the amount of human CYP4A mRNA expression in the tumor portion was significantly higher than that in the non-tumor portion. It was confirmed that it was reduced.
실시예 3-2. 간세포암종 코호트 정보를 이용한 인간 CYP4A mRNA 발현 분석Example 3-2. Analysis of Human CYP4A mRNA Expression Using Hepatocellular Carcinoma Cohort Information
인간 CYP4A mRNA 발현과 간세포암종과의 관련성을 확인하기 위해 FIREHOSE(https://gdac.broadinstitute.org)의 간세포암종 코호트(cohort)인 LIHC(Liver hepatocellular carcinoma)로부터 하기 표 4의 367명의 간세포암종 환자 정보를 확보하고, TCGA Research Network로부터 환자의 TCGA RNA-seq 데이터를 확보하였다. 확보한 TCGA RNA-seq 데이터는 GenePattern사의 Rank Normalized module을 이용하여 표준화(normalization)시킨 후, 간세포암종 환자의 임상정보와 인간 CYP4A mRNA 발현량과의 상관관계를 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.To determine the relationship between human CYP4A mRNA expression and hepatocellular carcinoma, 367 patients with hepatocellular carcinoma of Table 4 from Liver hepatocellular carcinoma (LIHC), a cohort of FIREHOSE (https://gdac.broadinstitute.org) Information was obtained and patient's TCGA RNA-seq data was obtained from the TCGA Research Network. The obtained TCGA RNA-seq data was normalized using the Rank Normalized module of GenePattern, and then analyzed the correlation between the clinical information of hepatocellular carcinoma patients and the expression level of human CYP4A mRNA, and the results are shown in FIG. 5. .
(Ishak Fibrosis score)Isaac Fibrosis Score
Ishak Fibrosis score
(no fiborsis)No 0-fibrosis
(no fiborsis)
(portal fibrosis)1,2-contextual fibrosis
(portal fibrosis)
(fibrous septa)3, 4-fiber diaphragm
(fibrous septa)
(nodula formation and incomplete cirrhosis)5-nodule formation and incomplete cirrhosis
(nodula formation and incomplete cirrhosis)
(established cirrhosis)6-Cirrhosis
(established cirrhosis)
(pathological stage,
TNM stage)Pathological staging
(pathological stage,
TNM stage)
(histological grade)Histological grade
(histological grade)
도 5에서 보여주듯이, 인간 CYP4A의 mRNA 발현량이 간세포암종 환자의 조직학적 등급(A) 및 병리학적 병기(TNM stage)(B)가 진행됨에 따라 감소하고 있는 것을 확인하였다. As shown in Figure 5, it was confirmed that the mRNA expression level of human CYP4A decreases as the histological grade (A) and the pathological stage (TNM stage) (B) of hepatocellular carcinoma patients progress.
상기 실시예 3-1 및 실시예 3-2의 결과를 통해, 인간 CYP4A의 mRNA 발현량이 간세포암종의 병기 및 조직학적 등급이 진행됨에 따라 감소되는 것을 확인함으로써, 인간 CYP4A를 간세포암종의 병기 진행 및 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다. Through the results of Example 3-1 and Example 3-2, it was confirmed that the mRNA expression level of human CYP4A is reduced as the stage and histologic grade of hepatocellular carcinoma progresses. It was found that it can be used as a biomarker for prognostic prediction.
Claims (10)
상기 인간 CYP4A는 CYP4A11 및 CYP4A22인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.The method of claim 1,
The human CYP4A is CYP4A11 and CYP4A22 biomarker composition for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma.
상기 인간 CYP4A는 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.The method according to claim 1 or 2,
The human CYP4A is a biomarker composition for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma, characterized in that the expression is reduced in hepatocellular carcinoma compared to normal liver tissue.
상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb)인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트.The method of claim 4, wherein
Said antibody is a monoclonal antibody (monoclonal antibody, mAb) or polyclonal antibody (polyclonal antibody, pAb), characterized in that hepatocellular carcinoma diagnosis or prognosis kit.
상기 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및
상기 환자의 간 조직 또는 간세포에서의 인간 CYP4A 단백질 또는 유전자 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;
를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.Measuring a human CYP4A protein or gene expression level expressed in liver tissue or hepatocytes of a hepatocellular carcinoma patient;
Comparing the human CYP4A protein or gene expression level with a normal control sample; And
Step 3 judging that the human CYP4A protein or gene expression level in the liver tissue or hepatocytes of the patient is lower than the normal control sample, hepatocellular carcinoma;
Method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis of hepatocellular carcinoma comprising a.
상기 인간 CYP4A 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 7, wherein
The human CYP4A protein expression level is measured by an antigen-antibody response to provide information necessary for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma.
상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8,
The antigen-antibody reaction may include Western blot, immunohistochemical staining, radioimmunoassay, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunodiffusion, immunoprecipitation assay ), Complement fixation assay (complement fixation assay) and protein chip (protein chip) is a method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis of hepatocellular carcinoma, characterized in that at least one method selected from the group consisting of.
상기 인간 CYP4A 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCT), 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
The method of claim 7, wherein
The method for measuring human CYP4A gene expression level is reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCT, real time RT-PCR (realtime RT-PCR) And RNase protection assay (RNase protection assay), Northern blot (northern blot) and DNA chip (DNA chip) is one or more selected from the group consisting of a method for providing information necessary for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma.
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