KR100948808B1 - Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간암 환자의 조직, 세포 또는 체액에서 LCN2의 과발현 현상을 이용하여 간단한 분석을 통해 간암 진단의 정확성을 높인 간암 마커 및 이를 이용한 간암 진단 키트에 관한 발명이다.The present invention relates to a liver cancer marker that improves the accuracy of liver cancer diagnosis through a simple analysis using the overexpression of LCN2 in tissues, cells or body fluids of liver cancer patients, and a liver cancer diagnostic kit using the same.

간암, LCN 2, 리포칼린, 체액, 진단 키트 Liver Cancer, LCN 2, Lipocalin, Fluids, Diagnostic Kit

Description

간암 마커로서의 ＬＣＮ2 유전자, 단백질 및 간암 진단 키트{Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using thereof}Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using approximately}

본 발명은 간암 환자의 혈청에서 LCN(Lipocalin) 2(이하 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구범위에서 "리포칼린 2"와 혼용함)의 과발현 현상을 이용하여 정량 분석을 통해 간암 진단의 정확성을 높인 간암 마커 및 간암 진단 키트에 관한 발명이다.The present invention improves the accuracy of the diagnosis of liver cancer through quantitative analysis using the overexpression of LCN (Lipocalin) 2 (combined with "lipocalin 2" in the following description, drawings and claims) in the serum of liver cancer patients. The invention relates to a liver cancer marker and a liver cancer diagnostic kit.

간염, 간경변, 간암 등을 포함한 간질환은 한국, 일본, 대만, 중국 및 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있으며 간암으로 인한 사망률은 장기별 기준으로 보면 세계적으로 네 번째(50만5천명)이며(세계보건기구 1997년도), 국내에 있어서는 세 번째(11.5%)를 차지하고 있다(한국 암발생 통계 2002). 간암진단의 경우 조직검사를 실시하거나 혈중 알파 태아 단백질(alpha-fetoprotein, 이하 "AFP")과 같은 간암표지 단백질검사를 실시하여 간암 여부를 진단하여 왔다.Liver diseases, including hepatitis, cirrhosis, and liver cancer, are the most common single disease in Korea, Japan, Taiwan, China, and most Southeast Asian countries. 505,000 people) (World Health Organization, 1997), and third in Korea (11.5%) (Korea Cancer Development Statistics 2002). In the case of liver cancer diagnosis, liver cancer has been diagnosed by performing a biopsy or by testing a liver cancer marker protein such as blood alpha-fetoprotein (hereinafter referred to as "AFP").

현재 간암관련 진단, 예후판정, 치료평가 바이오마커로 가장 잘 알려진 마커 는 AFP, PIVKA(Protein Induced by Vitamin K Absence)-II등이 있으나 특이도, 민감도에서 만족스럽지 못하다. 간세포암 진단에 있어서 혈중 알파 태아 단백질(alpha-fetoprotein, AFP)의 유용성은 잘 알려져 있다. 진행된 간세포암의 진단뿐만 아니라 간경변증 환자에서 자연경과 중 매년 3-10%에서 간세포암이 발병하기 때문에 조기발견을 위한 정기적인 AFP 측정이 필요하다. 그러나 AFP는 간세포암뿐만 아니라 알콜성 간염, 만성 간염이나 간경변증과 같은 양성질환에서도 고농도로 상승하기 때문에 위양성이 많고 실제 양성율이 50-60%에 지나지 않는다(민감도는 20ng/㎖ 및 400ng/㎖에서 각각 29.9% 및 65.8%). PIVKA-II는 DCP(des-r-carboxyprothrombin) 즉 응고작용이 없는 비정상 프로트롬빈으로 혈청 AFP와는 독립적으로 간세포암의 진단에서 각각 48.2% 및 95.9%의 민감도와 특이도가 보고되고 있다. 이러한 생물학적 지표들은 현재 임상적으로 이용되고 있으나 모든 간암의 생물학적 특성을 반영하지 못하고 제한적 유용성이 높다. 그러므로 현재의 간암 마커인 AFP나 PIVKAII보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단할 수 있는 검사 시약의 개발이 필요하다.Currently, the most well-known markers for liver cancer-related diagnosis, prognosis, and treatment evaluation are AFP and Protein Induced by Vitamin K Absence (PIVKA) -II, but they are not satisfactory in specificity and sensitivity. The usefulness of alpha-fetoprotein (AFP) in blood is well known in the diagnosis of HCC. In addition to the diagnosis of advanced hepatocellular carcinoma, hepatocellular carcinoma develops in patients with liver cirrhosis in 3-10% annually every year, so regular AFP measurements are necessary for early detection. However, AFP is highly false positive because of its elevated concentration in benign diseases such as alcoholic hepatitis, chronic hepatitis, or cirrhosis, as well as hepatocellular carcinoma, and the actual positive rate is only 50-60% (sensitivity is 20ng / ml and 400ng / ml respectively) 29.9% and 65.8%). PIVKA-II is DCP (des-r-carboxyprothrombin) or abnormal cothrombin with no coagulation activity. Independently of serum AFP, 48.2% and 95.9% sensitivity and specificity have been reported in the diagnosis of hepatocellular carcinoma, respectively. Although these biological indicators are currently used clinically, they do not reflect the biological characteristics of all liver cancers and have limited utility. Therefore, it is necessary to find a marker that can diagnose liver cancer more specifically and effectively than the current liver cancer markers AFP or PIVKAII and to develop test reagents for early diagnosis of liver cancer.

현재 혈액, 조직, 배설물로부터 종양을 진단할 수 있는 마커가 일부 개발되어 있으나 많은 종류의 종양 마커는 암이 없어도 증가하거나 검출되는 경우가 있다. 종양 마커 발굴은 암을 사전에 예방하거나 혹은 조기발견, 치료중인 경우는 그 예후를 관찰하기 위한 목적으로 활용되고 있다. 최근에 제노믹스(Genomics), 프로테오믹스(Proteomics) 연구에 의해 몇 가지 종류의 간암 마커 후보 단백질과 유전 자가 보고되고 있다. 김남순 등에 의해 간암조직에서 정상조직과 비교하여 발현율 차이를 보이는 14종의 유전자를 발굴, 이들 유전자 발현 차이를 이용, 간암 진단으로 활용에 대한 논문과 특허가 발표된바 있다(대한민국 공개번호 10-2005-0076876, 2005: International J. of oncology, 29 :315-327, 2006). 이 특허와 논문에서는 14종 유전자에 대한 경쟁적 RT-PCR을 실시하며 간암 진단의 유용성을 밝혔으며 항체를 이용한다면 단백질 측정도 가능할 것이라는 가능성을 제시하였다. 현재 대부분의 종양 마커 발굴은 조직의 유전자 발현 차를 중심으로 탐색하고 있으나 바이오 마커의 성질상 조직에서 유전자 발현이 높다고 해서 조직, 뇨, 또는 혈청으로 단백질이 분비되는 것은 아니다. 따라서 진단의 편의성을 위하여 혈액이나 뇨에서 분비되는 종양 마커 발굴이 중요하며 그에 대한 분석법 및 진단법이 중요하다.Currently, some markers for diagnosing tumors from blood, tissue, and excreta have been developed, but many types of tumor markers may be increased or detected even without cancer. Excavation of tumor markers is used to prevent cancer in advance, or to observe the prognosis in early detection and treatment. Recently, several types of liver cancer marker candidate proteins and genes have been reported by studies of Genomics and Proteomics. Kim Nam-soon et al. Published 14 papers and patents on the discovery of 14 genes with different expression rates in liver cancer tissues compared to normal tissues, and the use of these gene expression differences for liver cancer diagnosis (Korean Publication No. 10-2005). -0076876, 2005: International J. of oncology , 29: 315-327, 2006). The patent and paper demonstrated the usefulness of diagnosing liver cancer by performing competitive RT-PCR on 14 genes, and suggesting that the use of antibodies would allow for protein measurements. Currently, the discovery of most tumor markers is mainly focused on the difference in gene expression in tissues, but the high gene expression in tissues does not mean that proteins are secreted into tissues, urine, or serum due to the properties of biomarkers. Therefore, it is important to discover tumor markers secreted from blood or urine for the convenience of diagnosis, and analysis and diagnosis methods are important.

리포칼린 2(LCN2)는 호중구 젤라티나제-결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; "NGAL")으로도 불리며 24-kDa 단백질로서 인간 호중구(human neutrophils)의 특정 그래뉼에 저장되어 있다. 그 기능으로는 지방산이나 철을 수송하고 사이토카인-의존성 호중구(cytokine-dependent neutrophils) 및 다른 류코사이트(leukocytes)에서 세포사멸(apoptosis)을 유도하고 bacterial catecholate-type ferric siderophores에 결합함으로서 세균 성장을 억제하고 inflammatory responses의 조절기능을 지니고 있다. 최근 암과 관련된 보고가 발표되고 있으며(Bratt T. Biochim Biophys Acta 2000). 특히 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에서 발견한 보고가 있다(Nielsen BS et al. Gut 1996, Furutani M et al, Cancer Lett 1998). 정상 난소에서는 발현되지 않으나(Cowland JB eta al. Genomics 1997), 난소암에서는 과량 발현한다는 보고가 있다(Bartsch S, EBS Lett 1995). 이들은 주로 암세포주를 이용하여 실험하였으며 RNA 수준에서 발현차를 보고 면역조직화학 등에 의해 단백질 발현을 조사하였다. 간암과 관련되어 보고되어 있는 논문은 없다.Lipocalin 2 (LCN2), also called neutrophil gelatinase-associated lipocalin ("NGAL"), is a 24-kDa protein stored in specific granules of human neutrophils. Its functions include transporting fatty acids or iron, inducing apoptosis in cytokine-dependent neutrophils and other leukocytes, and inhibiting bacterial growth by binding to bacterial catecholate-type ferric siderophores. It has a function of controlling inflammatory responses. Recently, reports related to cancer have been published (Bratt T. Biochim). Biophys Acta 2000). In particular , there are reports of breast cancer , lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer (Nielsen BS et al. Gut 1996, Furutani M et al, Cancer Lett 1998). It is not expressed in normal ovaries (Cowland JB et al. Genomics 1997), but has been reported to be overexpressed in ovarian cancer (Bartsch S, EBS). Lett 1995). They mainly experimented with cancer cell lines and examined the expression of proteins by immunohistochemistry and the expression difference at the RNA level. There are no papers reported on liver cancer.

기존 연구에 의하면 조직에서의 LCN2에 대한 mRNA 발현은 cDNA microarray, RT-PCR, Northern Blot, dot-blot hybridization같은 방법에 의해 측정하였고 단백질은 항체를 이용한 면역조직화학 방법에 의해 측정되어 왔다.In previous studies, mRNA expression of LCN2 in tissues was measured by methods such as cDNA microarray, RT-PCR, Northern Blot, and dot-blot hybridization. Proteins have been measured by immunohistochemistry using antibodies.

측정테스트 킷에 관련된 연구로는 “치근막 질환의 진단과 이의 진행위험을 예견하는 방법과 이에 사용되는 테스트 킷트”(KR 1998-7003659, 1998,12,05), 췌장암 진단용 킷트(KR 2006-0096833, 2006.9.30)가 보고된 바 있으나 본 발명자의 특허가 LCN2를 이용한 간암진단 과 치료에 관한 특허인 반면 이들 특허는 LCN2를 측정하여 치근막 질환, 췌장암을 진단하는 킷트이다.Studies related to measurement test kits include: “Diagnosis of the Periodontal Fascia Disease, and Methods for Predicting the Risk of its Progression and Test Kits Used for It” (KR 1998-7003659, 1998,12,05), pancreatic cancer diagnostic kit (KR 2006-0096833, 2006.9.30) has been reported, while the inventor's patent is for liver cancer diagnosis and treatment using LCN2, these patents are kits for diagnosing periodontal membrane disease and pancreatic cancer by measuring LCN2.

LCN2가 치료와 진단에 사용된 용도로 제시된 특허는 “인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법”(KR2006-0095114, 2006,08,31)이 있으며 이 특허에는 리포칼린 2 단백질을 이용하여 대장암전이 억제 방법, 대장암 전이 가능성 예측키트 및 대장암 전이 위험군의 선별 방법이 개시되어 있다.Patents proposed for the use of LCN2 in the treatment and diagnosis are “pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising human lipocalin 2 as an active ingredient, methods for inhibiting cancer metastasis using the same” (KR2006-0095114, 2006,08,31) This patent discloses a method for inhibiting colorectal cancer metastasis, a kit for predicting the potential for colorectal cancer metastasis, and a method for screening the risk group for colorectal cancer metastasis using lipocalin 2 protein.

진단방법에 사용된 특허로 “Assay for carcinoma proliferative status by measuring NGAL expression level”(US 5627034(1997,5,6)), “Methods and compositions for diagnosing and treating rheumatoid arthritis, US2001-023451(2001,12,17)” 등이 있으며 이들은 LCN2 유전자 발현을 정량 분석함으로써 암세포 증식분석 - 조직과 혈청을 이용한 유방암 진단하거나 마이크로어레이를 이용한 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 마커에 관한 것이다.Patents used in diagnostic methods include “Assay for carcinoma proliferative status by measuring NGAL expression level” (US 5627034 (1997, 5, 6)), “Methods and compositions for diagnosing and treating rheumatoid arthritis, US 2001-023451 (2001, 12, 17) ”and these are related to cancer cell proliferation assay—diagnosis of breast cancer using tissues and serum or rheumatoid arthritis marker using microarray by quantitative analysis of LCN2 gene expression.

이와 같이 대부분의 특허와 논문이 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에 관련된 내용이며 간암에 관련되어 특성을 규명하고 이를 이용하여 간암 진단과 치료에 이용하는 선행연구는 없다. 그러므로 본 발명에서 밝힌 LCN2의 생물학적 의의와 간암과의 연관성은 LCN2를 이용하여 간암을 진단, 예후에 중요하게 이용할 수 있으며 LCN2가 관여된 암화의 기작을 밝히고 이를 이용하여 암을 치료하는데 중요한 역할을 하게 될 것으로 사료된다.As mentioned above, most of the patents and articles are related to breast cancer , lung cancer, colon cancer, and pancreatic cancer, and there are no previous studies that use them for the diagnosis and treatment of liver cancer. Therefore, the relationship between the biological significance of LCN2 and liver cancer revealed in the present invention can be important for the diagnosis and prognosis of liver cancer using LCN2, and to reveal the mechanism of cancerization involving LCN2 and to play an important role in treating cancer. It is believed to be.

따라서, 본 발명의 목적은 간암 유전자 LCN2 또는 그의 단편 및 항체를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a kit for diagnosing liver cancer comprising liver cancer gene LCN2 or fragments thereof and antibodies.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 LCN2 또는 그의 단편으로부터 유래되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 siRNA를 제공하고, 이를 사용하여 간암의 발병 또는 전이를 치료 또는 예방하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an siRNA having a nucleotide sequence complementary to mRNA derived from the gene LCN2 or a fragment thereof, and using the same to treat or prevent the onset or metastasis of liver cancer.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for screening a liver cancer inhibitor, the method characterized by identifying whether to promote or inhibit the action of the protein encoded by the gene.

본 발명에서는 LCN2의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보기 위하여 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직과 혈액에서 RNA, 단백질 발현정도를 밝혀 간암의 진단, 예후마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 이를 위하여 간암조직, 정상인의 간 조직, 간암환자의 정상 간조직을 대상으로 cDNA 마이크로어레이, RT-PCR, 조직면역화학염색을 실시하였으며 실험결과 LCN2는 간암조직에서 비암(non-tumor) 조직 또는 정상 간조직과 비교했을 때 보다 높은 RNA, 단백질 발현을 보였다. 특히 에드먼슨의 암 단계(Edmondson's tumor grade) III, 임파선으로부터 전이한 간암세포조직에서 높은 단백질 발현증가를 보였다. 또한 간암 세포주를 대상으로 웨스턴 블랏을 실시한 HLK2, HKK2, HLK6에서 LCN2 발현을 보였으며, 특히 HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.In the present invention, in order to clarify the biological function and clinical significance of LCN2, RNA and protein expression levels in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and blood were examined to evaluate the possibility of diagnosis and prognostic marker of liver cancer. To this end, cDNA microarrays, RT-PCR, and immunohistochemical staining were performed on liver cancer tissues, normal liver tissues, and normal liver tissues of liver cancer patients. Compared with liver tissue, it showed higher RNA and protein expression. In particular, Edmonson's tumor grade III, hepatic cancer cell metastases from lymph nodes showed high protein expression. In addition, the expression of LCN2 in HLK2, HKK2, and HLK6, which were subjected to western blot, was performed on liver cancer cell lines. In particular, HLK2 is a metastatic liver cancer cell line.

임상혈청시료를 이용하여 LCN2의 분포도를 조사해 본 결과 간암에서 높은 농도의 LCN2이 분비됨을 볼 수 있었다.Examination of the distribution of LCN2 using clinical serum samples revealed high levels of LCN2 in liver cancer.

이와 같은 실험결과들로 미루어 보아 LCN2는 간암 진행, 특히 전이성 간암에 있어 중요한 마커이며 간암 진단과 예후에 좋은 마커로서 사용 가능성이 높다. 본 발명은 간암조직과 혈청에서의 LCN2의 발현 및 특성을 연구하여 LCN2를 간암의 조기 진단, 예후, 치료의 모니터링에 사용함을 목적으로 한다. ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 법을 비롯한 정량분석법을 이용한다면 간암의 조기진단, 예후, 치료 모니터링에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 본 발명은 간암 치료 연구 및 암화 특성을 연구하는데도 사용될 수 있다.These results suggest that LCN2 is an important marker for liver cancer progression, especially metastatic liver cancer, and is likely to be a useful marker for liver cancer diagnosis and prognosis. The present invention aims to study the expression and characteristics of LCN2 in liver cancer tissues and serum and to use LCN2 for the early diagnosis, prognosis, and treatment of liver cancer. Quantitative assays, including ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), can be used to monitor early diagnosis, prognosis and treatment of liver cancer. The present invention can also be used to study liver cancer treatment and to study the cancerous properties.

본 발명은 기존의 간암의 진단 및 치료의 마커에 관한 것으로서 형질 전환 세포주와 동물의 제조, siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 간암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention relates to a marker for diagnosis and treatment of existing liver cancer, and can be effectively used for the production of transformed cell lines and animals, gene therapy using siRNA (small interfering RNA), and development of liver cancer specific anticancer agents.

본 발명은 인간 LCN2의 간암에서의 생물학적 특징과 임상의학적 의의를 제공한다. 또한 이를 이용하여 간암세포와 조직, 혈청에서 LCN2의 RNA, 단백질의 발현을 비교하는 것을 그 특징으로 한다. LCN2의 발현은 간암 발병 원인 규명, 진단 및 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대한다.The present invention provides the biological characteristics and clinical significance of human LCN2 in liver cancer. In addition, it is characterized by comparing the expression of RNA, protein of LCN2 in liver cancer cells and tissues, serum. The expression of LCN2 is expected to be useful in identifying, diagnosing, and treating the cause of liver cancer.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.

본 발명에서는 LCN2의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보기 위하여 간암조직에서 RNA, 단백질 발현정도를 밝혀 간암의 진단, 예후 마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 이를 위하여 전북대학교, 강남성모병원으로부터 간암환자로부터 원발성 간암 조직(primary HCC tissues)을 얻어 양성시료로 사용하였으며 정상 간 조직은 강남성모병원으로부터 간암환자가 아닌 환자로부터 얻었다. 조직시료로부터 RNA을 분리 cDNA 마이크로어레이, RT-PCR을 실시하여 RNA 발현분포를 보았다. 단백질 발현을 보기 위하여 웨스턴 블랏, 조직면역화학염색을 실시하였으며 혈청에서의 분포를 알아보기 위하여 단국대학교와 전북대학교에서 간암을 비롯한 간질환관련환자로부터 혈액을 채취, ELISA법을 이용하여 혈청 중 LCN2의 양을 분석하였다. ELISA법 확립을 위해 LCN2에 대한 재조합 단백질과 항체를 생산하였다. 통계 분석은 SPSS statistical software V13.0을 하였으며 p값이 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 간주하였다. cDNA 마이크로어레이, RT-PCR, 웨스턴 블랏, 면역화학 염색 실험결과 LCN2는 간암조직에서 비암 조직 또는 정상 간과 비교했을 때 좀더 높은 RNA 및 단백질 발현을 보였다. 특히 에드먼슨의 암 단계9Edmondson's tumor grade) III, IV 전이성 간암에서 높은 단백질 발현증가를 보였다. 혈청검사 결과 간암환자의 혈청에서 LCN2가 높은 발현을 보였으며, 간암 세포주에서도 높은 발현을 보였다.In the present invention, in order to clarify the biological function and clinical significance of LCN2, RNA and protein expression levels in liver cancer tissues were examined to evaluate the possibility of liver cancer diagnosis and prognostic markers. For this purpose, primary HCC tissues were obtained from liver cancer patients from Chonbuk National University, Gangnam St. Mary's Hospital, and used as benign samples. Normal liver tissues were obtained from Kangnam St. Mary's Hospital from non-liver patients. RNA was isolated from tissue samples RNA cDNA microarray, RT-PCR was performed to see the RNA expression distribution. Western blot and tissue immunochemical staining were performed for protein expression. Blood samples were collected from patients with liver disease, including liver cancer, from Dankook University and Chonbuk National University. The amount was analyzed. Recombinant proteins and antibodies to LCN2 were produced to establish the ELISA method. Statistical analysis was performed using SPSS statistical software V13.0, and it was considered significant if p value was less than 0.05. As a result of cDNA microarray, RT-PCR, Western blot, and immunochemical staining, LCN2 showed higher RNA and protein expression in liver cancer tissues compared to non-cancerous tissues or normal livers. In particular, Edmonson showed high protein expression levels in Edmonson's tumor grade III and IV metastatic liver cancer. Serum test showed high expression of LCN2 in serum of liver cancer patients and high expression in liver cancer cell lines.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다.The present invention provides a liver cancer marker diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to LCN2 protein.

또한, 본 발명은 정상 대조군과 비교하여 LCN2 단백질 양의 증가로 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.In addition, the present invention provides a liver cancer marker diagnostic kit, characterized in that the diagnosis of liver cancer with an increase in the amount of LCN2 protein compared to the normal control. The kit includes a kit for an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

또한, 본 발명은 LCN2 mRNA를 정량적으로 검출하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등을 선택할 수 있다. 상기 mRNA 정량 검출 간암 마커 진단 키트는 LCN2 mRNA에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 mRNA 정량 검출 간암 마커 진단 키트는 LCN2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 진단 키트인 것을 특징으로 한다.The present invention also provides a liver cancer marker diagnostic kit for quantitatively detecting LCN2 mRNA. The mRNA quantitative detection method may be selected from RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RNase protection assay), Northern blotting, DNA chip and the like. The mRNA quantitative detection liver cancer marker diagnostic kit is characterized in that it comprises a nucleotide that specifically binds to LCN2 mRNA. In addition, the mRNA quantitative detection liver cancer marker diagnostic kit is characterized in that hepatic cancer marker diagnostic kit comprising a cDNA preparation primer, reverse transcriptase, Taq polymerase, PCR primers, dNTP corresponding to LCN2 mRNA.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 조직, 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting liver cancer markers comprising contacting an antibody specifically binding to LCN2 protein with a biological sample selected from tissues, cells, urine, blood, serum and plasma.

또한, 본 발명의 간암 마커 검출 방법은In addition, the liver cancer marker detection method of the present invention

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;a) providing a biological sample for analysis;

b) 상기 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;b) contacting said sample with an antibody that specifically binds LCN2 protein;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및c) quantitatively detecting the antigen-antibody complex; And

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것 을 특징으로 한다.d) comparing the detection result of step c) with a normal control group.

본 발명은 서열번호 1의 LCN2 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터를 제공한다.The present invention provides a vector for transformation comprising the LCN2 carcinogenic gene of SEQ ID NO: 1 or fragments thereof.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 HLK2-LCN2, HKK2-LCN2, HLK6-LCN2 등의 동물 세포주를 제공한다.In addition, the present invention is HLK2-LCN2, HKK2-LCN2, HLK6-LCN2 transformed by the vector And animal cell lines.

본 발명은 서열번호 1의 LCN2 간암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.The present invention provides an anti-sense gene having a sequence complementary to all or a part of the sequence of mRNA transcribed from the LCN2 liver cancer gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1, which binds to the mRNA and inhibits the expression of the carcinogenic gene or fragment. to provide.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 LCN2 간암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 LCN2 간암 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 서열을 제공한다.In addition, the present invention has a sequence complementary to all or part of the sequence of mRNA transcribed from the LCN2 liver cancer gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1 and recognized by Dicer protein to express the expression of the LCN2 liver cancer carcinogen Provides siRNA sequences that inhibit.

또한, 본 발명은 LCN2 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 LCN2 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening a liver cancer inhibitor, comprising binding a test compound to an LCN2 protein and confirming that the test compound promotes or inhibits the action of the LCN2 protein.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 유전자 LCN2를 제공한다.In addition, the present invention provides a target gene LCN2 for treating liver cancer or inhibiting metastasis, having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 LCN2 단백질을 제공한다.The present invention also provides a target LCN2 protein for treating liver cancer or inhibiting metastasis, having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명은 LCN2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a cancer diagnostic kit comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of the LCN2 gene.

또한, 본 발명은 LCN2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 마커 검출 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a method for detecting cancer markers comprising contacting a biological sample with an agent that measures the mRNA or protein level of the LCN2 gene.

본 발명에서 "마커"는 간암 등의 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, LCN2 유전자에 대한 핵산 마커 및 LCN2 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 간암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.In the present invention, "marker" is a substance capable of diagnosing cancer cells, such as liver cancer, from normal cells, and may be a nucleic acid marker for the LCN2 gene and a polypeptide marker for the LCN2 protein. It is characterized by increased expression in liver cancer cells.

본 발명에서 "진단"은 간암 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다."Diagnosis" in the present invention means identifying the presence or characteristics of liver cancer conditions.

본 발명의 인간 간암 유전자인 LCN2은 서열번호 1로 나타낸 바와 같이 597bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 서열번호 1의 염기서열에서 뉴클레오티드 번호 1-594 부위에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)을 가지며 여기서 코딩되는 전체 단백질은 198개의 아미노산으로 이루어져 있으며 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다. 그러나 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 발암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수 식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 발암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.LCN2, a human liver cancer gene of the present invention, has a total sequence of 597 bp in length as shown in SEQ ID NO: 1, and has an open reading frame corresponding to nucleotide numbers 1-594 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Wherein the entire protein encoded here consists of 198 amino acids and the amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 2. However, due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codon in the organism to express the carcinogenic gene, the gene of the present invention is a coding region within a range that does not change the amino acid of the carcinogenic protein expressed from the coding region. Various modifications may be made and various modifications or formulas may be made within a range that does not affect the expression of genes in portions other than the coding region, and such modified genes are also included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention encompasses polynucleotides having fragments of the gene and bases having substantially the same base sequence as the carcinogenic gene of SEQ ID NO: 1. By substantially identical polynucleotides are meant those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 95%.

본 발명의 간암 유전자로부터 발현되는 단백질은 198개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호 2와 같은 서열을 가진다.The protein expressed from the liver cancer gene of the present invention consists of 198 amino acids and has the same sequence as SEQ ID NO: 2.

본 발명의 간암 유전자 및 단백질은 사람의 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, 이를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.Liver cancer genes and proteins of the present invention can be isolated from various tissues, including human liver cancer, or synthesized according to known DNA or peptide synthesis methods. In addition, the gene thus prepared may be inserted into an animal expression vector known in the art, and may be introduced into an appropriate animal cell line.

본 발명의 유전자는 실시간 PCR의 분석 방법에서 간암조직에서 비교적 발현이 높기 때문에 간암을 유발하는 발암/전이 유전자로 판단된다.Since the gene of the present invention is relatively high in liver cancer tissue in the method of real-time PCR analysis, it is determined to be a carcinogenesis / transition gene that causes liver cancer.

따라서, 본 발명의 간암 유전자는 간암의 발생에 관여하는 것으로 판단되며, 간암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 간암 특이적 항암제 탐색, siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있으며, 인간의 수명을 조절하는 유전자로 이용될 수 있다.Therefore, the liver cancer gene of the present invention is believed to be involved in the development of liver cancer, and can be effectively used for diagnosis of liver cancer, production of transgenic animals, search for liver cancer specific anticancer agents, siRNA gene therapy, and the like. It can be used as a gene.

상기 발암/전이 유전자를 이용한 암의 진단방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자가 코드한 단백질의 항체를 이용한 방법과 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 조직으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던 블롯팅(Northern blotting)등으로 이를 검출함으로써 대상자가 본 발명의 발암/전이 유전자를 발현하는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하거나 항체를 이용한 면역학적 분석법은 용이하게 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.The method for diagnosing cancer using the carcinogen / transfer gene may include, for example, a method using an antibody of a protein encoded by the primary cancer gene and separating all or part of the carcinogen / transfer gene from a tissue of a subject using a probe. After hybridization with a nucleic acid, the subject may be diagnosed by various methods known in the art, such as reverse transcription polymerase chain reaction, Northern blotting, and the like. Determining whether the gene is expressed. The probe may be labeled with a radioisotope or enzyme, or an immunological assay using an antibody may readily confirm expression of a gene. Therefore, the present invention provides a kit for diagnosing liver cancer, which includes all or part of the carcinogen / metastasis gene.

형질전환 동물은 본 발명의 발암/전이 유전자를 포유동물, 예를 들어, 마우스 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암/전이성 물질 또는 상기 유전자 저해물질 및 항암물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.Transgenic animals can be produced by introducing a carcinogenic / transgenic gene of the present invention into a rodent animal such as a mammal, eg, a mouse, which is preferably introduced at the fertilized egg stage prior to at least 8 cell stage. The transgenic animals thus prepared may be usefully used for the search for carcinogenic / metastatic substances or the gene inhibitors and anticancer substances.

본 발명의 발암/전이 유전자로부터 유도되는 단백질을 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 발암/전이 유전자로부터 발현된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 단일 모노클론항체(Monoclonal antibody) 또는 폴리클론항체(polyclonal antibody)로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA), 샌드위 치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 간암을 진단할 수 있다.Proteins derived from the carcinogenesis / transfer genes of the present invention can be usefully used for producing antibodies as diagnostic tools. The antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a monoclonal antibody according to a conventional method known in the art using a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 expressed from a carcinogen / transfer gene of the present invention or a fragment thereof. It can be prepared as a polyclonal antibody, using these antibodies known in the art Enzyme Linked Immunosorbent assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Sandwich assay (sandwich) Liver cancer can be diagnosed by confirming whether the protein is expressed in a bodily fluid sample of the subject by a method such as an assay), a Western blot on an polyacryl gel, or an immunoblot.

또한, 본 발명의 발암/전이 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.In addition, it is possible to establish a continuously proliferating cell line having a reporter system using a promoter of a carcinogen / transition gene of the present invention, and such cell line may be usefully used for the anticancer drug search through the search for a low molecular weight material.

생물학적 시료 중의 LCN2 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.The expression level of the LCN2 marker gene in the biological sample can be determined by checking the mRNA or its protein amount. The process of separating the mRNA and the protein from the biological sample can be carried out using a known process. It can be measured by the method.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 LCN2 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "biological sample" includes tissues, cells, and the like capable of detecting a difference in mRNA or protein levels of the LCN2 marker gene, and preferably includes, but is not limited to, urine, blood, plasma, serum, and the like.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 LCN2 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 LCN2 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "mRNA level measurement" refers to a process of confirming the presence and expression level of mRNA of LCN2 marker genes in a biological sample in order to detect LCN2 marker gene. Analytical methods for this purpose include, but are not limited to, RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, and the like.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 간암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, LCN2 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발 현량의 증가 여부를 판단하여 간암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.Through the above detection methods, the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in the suspected liver cancer patient can be compared, and the significant expression level of the LCN2 marker gene to the mRNA was increased to determine whether the actual cancer patient was suspected of liver cancer. Diagnosis can be made.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 LCN2 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 내지 50bp의 길이, 좀더 바람직하게는 약 10 내지 30bp의 길이이다. 또한, 대조군 유전자의 핵산서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머레이저 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.Kits for measuring mRNA levels by RT-PCR include each primer pair specific for the LCN2 marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and is about 7 to 50 bp in length, more preferably about 10 to 30 bp in length. In addition, a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene may be included. Other RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerizers and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitor DEPC water, sterile water, and the like. It may include. "Primer" refers to a short nucleic acid sequence that is capable of forming base pairs with complementary templates with nucleic acid sequences having short free 3 'hydroxyl groups and that serves as a starting point for template strand copying. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization in the appropriate buffer and temperature. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis. Primers can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 LCN2 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.In the present invention, "protein level measurement" is a process of confirming the presence and expression level of the protein expressed in the LCN2 marker gene in a biological sample, preferably using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Check the quantity.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 LCN2 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다."Antibody" means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention an antibody refers to an antibody that specifically binds to an LCN2 marker protein and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.Assays for measuring protein levels using antibodies include Western blot, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, Tissue immunostaining, immunoprecipitation, complement fixation assay, FACS, protein chips, and the like, are not limited to the described methods.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, LCN2 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 간암 의심환자의 실제 간암 여부를 진단할 수 있다.Through the above analysis method, the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected liver cancer patients can be compared. Can diagnose liver cancer.

"항원-항체 복합체"란 LCN2 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효 소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 3H,14C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.By "antigen-antibody complex" is meant a combination of an LCN2 protein and an antibody specific to it, and the amount of antigen-antibody complex formation can be quantitatively determined through the signal size of the detection label. The detection label can be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited to the materials described above. Enzymes that can be used when using the enzyme as a detection label include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, Acetylcholinesterase, glucose oxidase, hexokinase and the like, and are not limited to the ranges described above. Fluorescent materials include fluorescein, phycocyanin, fluorescarmine and the like, and are not limited to the above-described materials. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Luminescent materials include luciferin and the like, but are not limited thereto. The microparticles include colloidal gold and the like, but are not limited thereto. Redox molecules include, but are not limited to, quinone, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, and the like. Radioisotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, and the like.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. LCN2 마커 단백질과 항체의 복 합체 형성 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA. In ELISA, a direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and the antibody attached to the solid support, and reacted with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and antigen attached to the solid support Various ELISA methods include an indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes this antibody. More preferably, the antibody is attached to a solid support and reacted with a sample, followed by enzymatic color development by attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches a labeled secondary antibody and enzymatically develops. The degree of formation of the complex of the LCN2 marker protein and the antibody can be checked to determine whether the cancer has occurred.

또 다른 방법으로 LCN2 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있다.Alternatively, one or more antibodies against LCN2 markers may be arranged in a predetermined position on a substrate, and may be used with a high density immobilized protein chip. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is then read to confirm the presence or expression of the protein to determine whether the cancer develops. You can check it.

또 다른 방법으로 LCN2에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 암 발병 여부를 확인할 수 있다.Another method is western blotting using an antibody against LCN2. The whole protein is isolated from the sample, which is electrophoresed to separate the protein according to size and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed by using a labeled antibody to determine whether cancer has occurred.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 간암 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질의 수준은 LCN2 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.Such detection methods include comparing the expression levels of marker genes in liver cancer-causing cells with marker gene expression levels in normal controls. Levels of mRNA or protein can be represented by absolute or relative differences of LCN2 marker proteins.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a cancer diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to LCN2 protein.

또한, 본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for detecting liver cancer markers comprising contacting an antibody that specifically binds an LCN2 protein with a biological sample.

본 발명에서 LCN2 단백질이 간암 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있 다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 LCN2 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.Since the LCN2 protein has been identified as a liver cancer marker in the present invention, the production of antibodies using the same can be easily prepared using techniques well known in the art. As is well known in the art, polyclonal antibodies are injected from an animal with LCN2 protein antigen to be collected from the animal to obtain a serum comprising the antibody. Animals can be prepared using any animal host such as goat, rabbit, pig. Monoclonal antibodies are known in the art to which the present invention pertains, such as the hybridoma method (see Kohler & Milstein (1976) European J. Immunology 6 : 511-519) or phage antibody libraries (Clackson et al., Nature , 352 : 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol . , 222 : 58, 1-597, 1991).

하이브리도마 방법은 LCN2 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 LCN2 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.Hybridoma methods utilize cells of an immunologically suitable host animal, such as a mouse injected with LCN2 protein antigen, and the other uses cancer or myeloma cell lines. These two kinds of cells are fused by methods well known in the art, such as polyethylene glycol, and then antibody-producing cells are propagated by standard tissue culture methods. After obtaining a uniform cell population by subcloning by the limited dilution technique, hybridomas capable of producing antibodies specific for LCN2 protein are mass cultured in vitro or in vivo according to standard techniques.

파지 항체 라이브러리 방법은 LCN2 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 LCN2 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.The phage antibody library method obtains an antibody gene for the LCN2 protein and expresses it in the form of a fusion protein on the surface of the phage to prepare an antibody library in vitro, and isolate the monoclonal antibody that binds the LCN2 protein from the library. , How to make.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.Antibodies prepared by the above method can be separated by electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2 및 Fv 등이 있다.Antibodies included in the kits of the present invention include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. The functional fragment of an antibody molecule means a fragment which retains at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , F (ab) 2 and Fv.

LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.The diagnostic kit of the present invention comprising an antibody that specifically binds to LCN2 protein is preferably a diagnostic kit for ELISA, which may include an antibody specific for a control protein, and may also detect an antigen-antibody complex. Reagents such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes conjugated with the antibody and its substrate or other substance capable of binding to the antibody, and the like.

본 발명의 LCN2 발암/전이 유전자 및 단백질은 사람의 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, LCN2 유전자가 삽입된 동물 발현용 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.The LCN2 carcinogenesis / transition genes and proteins of the present invention can be isolated from various tissues, including human liver cancer, or synthesized according to known DNA or peptide synthesis methods. In addition, the gene thus prepared may be inserted into an animal expression vector known in the art to which the present invention pertains, and the animal expression vector into which the LCN2 gene is inserted may be introduced into an appropriate animal cell line.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 LCN2 유전자에 대한 안티-센스 유전 자와 siRNA(small interfering RNA)를 제공한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호 1의 발암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA와 결합하여 리보솜에 의한 해독과정을 저해할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 발암 유전자의 발현으로 인한 암을 치료할 수 있다. 또한 상기 LCN2 유전자의 siRNA는 21~30 뉴클레오티드의 RNA 조각으로 세포 내에 도입되면 다이써(Dicer)에 의해 인지되고 이는 세포 내에 존재하는 상기 유전자의 mRNA를 분해하게 되어 유전자의 발현을 저해하게 된다. 본 발명의 조성물을 이용한 siRNA 유전자 치료에서 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암/전이 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들어 문헌 (Filleur 등, Cancer Res ., 63(14): 3919-22, 2003)에 따라 특별한 생체 내 도입 방법 없이 적은 양의 정맥 주사 방법(low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현이 조절 가능하다는 것을 보여주고 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위한 시도로써, 문헌 (Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005)의 방법에 따라 siRNA의 정맥을 통한 주입에서 복합체를 만들어 사용하는 방법도 제시되고 있다. 이 방법은 정맥 주사의 효율이 기존의 다른 리포솜 복합체보다 약 7배 정도 높게 나타났으며, 부작용도 적은 것이 확인되었다(Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005).The present invention also provides anti-sense genes and small interfering RNA (siRNA) for LCN2 genes that are effective for gene therapy. In the present invention, the "anti-sense gene" is a polynucleotide having a sequence complementary to some or all of the mRNA that is transcribed from the carcinogenic gene or a part thereof of SEQ ID NO: 1, by binding to the mRNA by ribosomes By introducing a DNA sequence having a sequence capable of inhibiting the translation process into the patient's body can be treated cancer caused by the expression of the carcinogenic gene. In addition, the siRNA of the LCN2 gene is recognized by Dicer when introduced into the cell into an RNA fragment of 21-30 nucleotides, which degrades the mRNA of the gene present in the cell, thereby inhibiting the expression of the gene. In siRNA gene therapy with the compositions of the present invention, it is administered to a patient in a conventional manner to inhibit the expression of carcinogenic / metastatic genes. See, eg, Filleur et al., Cancer Res . , 63 (14): 3919-22, 2003) show that gene expression can be regulated with siRNA by low-volume intravenous injection without special in vivo introduction methods. In addition, as an attempt to increase siRNA uptake and stability in vivo, Chien et al., Cancer Gene Ther ., 12 (3): 321-8, 2005) has also been proposed to make and use the complex in the injection of siRNA through the vein. In this method, the efficiency of intravenous injection was about 7 times higher than that of other liposome complexes, and the side effects were confirmed (Chien et al., Cancer. Gene Ther ., 12 (3): 321-8, 2005).

따라서, 본 발명은 LCN2 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 간암의 예방, 치료용, 전이억제용 약제학 적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 LCN2 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating, and inhibiting metastasis of liver cancer, which comprises at least one of an antisense gene and an siRNA of the LCN2 gene and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier ie saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, Ethanol, liposomes and one or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants and buffers may be added as necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, and may act specifically on target organs. Target organ specific antibodies or other ligands may be used in combination with the carriers so as to be used. Furthermore, it may be preferably formulated according to each component by a suitable method in the art or by a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA).

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.5 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.The method of administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be parenterally or orally administered, such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or topical application, depending on the desired method. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient. The daily dosage is about 0.1 to 100 mg / kg for the compound and preferably 0.5 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.

본 발명의 조성물을 이용한 siRNA와 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자를 포함하는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들면, 문헌(J.S. Kim et al., J. Controlled Release, 53, 175-182(1998))의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥 투여한다.In siRNA and antisense gene therapy using the compositions of the invention, it is administered to a patient in a conventional manner comprising the antisense gene of the invention to inhibit the expression of carcinogenic genes. See, eg, JS Kim et al., J. Controlled Antisense oligodeoxynucleotides (ODN) are mixed with poly-L-lysine derivatives by electrostatic attraction according to the method of Release , 53 , 175-182 (1998)), and the mixture is administered intravenously to the patient.

본 발명의 항암 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 안티센스 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.The anticancer composition of the present invention contains the antisense gene of the present invention as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or optionally other additives. The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but is preferably formulated as an injection.

또한, 본 발명의 LCN2 발암 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.In addition, it is possible to establish a continuously proliferating cell line having a reporter system using the promoter of the LCN2 carcinogenic gene of the present invention, and such cell lines can be usefully used for the screening of anticancer drugs through the search for small molecule materials.

이하, 다음 실시예에 의거하여 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.

<< 실시예Example 1> 조직 시료 처리 1> tissue sample processing

cDNA 마이크로어레이 실험을 위하여, 강남성모병원과 전북대학교 병원으로부터 40명의 간암환자로부터 원발성 간암 조직(primary HCC tissues)을 얻었다. 정상 간 조직은 강남 성모병원으로부터 간암환자가 아닌 환자로부터 얻었다. 조직시료는 액체질소에서 동결시켰다. RNeasy midi kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 또한 조직은 10% 포르말린으로 고정, 파라핀 블록을 만들었다.For cDNA microarray experiments, primary HCC tissues were obtained from 40 liver cancer patients from Gangnam St. Mary's Hospital and Chonbuk National University Hospital. Normal liver tissue was obtained from Kangnam St. Mary's Hospital. Tissue samples were frozen in liquid nitrogen. Total RNA was isolated using RNeasy midi kit (Qiagen, Hilden, Germany). The tissue also made paraffin blocks, fixed with 10% formalin.

<< 실시예Example 2> 간암조직에서의  2> in liver cancer tissue LCN2LCN2 의 of mRNAmRNA 발현 조사 Expression survey

LCN2과 간암의 발전(progression)과의 연관성을 밝히기 위해 cDNA microarrayer를 이용하여 간암환자의 암조직과 인접 조직을 대상으로 LCN2의 유전자 발현을 조사, 비교하였다. LCN2가 간암조직에서 중요한 발현 차이를 보였다(도 1). 특별히 LCN2는 간암환자의 80%이상(35/40)이 정상 간 조직에 비해 RNA 발현 증가를 나타내었다(q-value = 0.0002846).In order to elucidate the association between LCN2 and the progression of liver cancer, the gene expression of LCN2 was examined in cancer tissues and adjacent tissues of liver cancer patients using cDNA microarrayer. LCN2 showed a significant difference in expression in liver cancer tissues (FIG. 1). Specifically, LCN2 showed increased RNA expression in more than 80% of liver cancer patients (35/40) compared to normal liver tissue (q-value = 0.0002846).

40쌍의 암(tumor)-비암(nontumor) HCC 시료 쌍을 선택하여 RT-PCR를 실시하여 RNA 수준을 조사하였다. RT-PCR은 다음과 같이 실시하였다.Forty-nine tumor-nontumor HCC sample pairs were selected to perform RT-PCR to examine RNA levels. RT-PCR was performed as follows.

즉, Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 LCN2에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 정방향 프라이머는 5'-CCG GAA TTC CAT GCC CCT AGG TCT CCT G-3', 역방향 프라이머는 5'-CGG GGT ACC TCA GCC GTC GAT ACA CTG G-3'와 같다. RT-PCR 분석에 대한 주형(template)으로써 total RNA 5㎍에 상응하는 1차쇄(first strand) cDNA 혼합물을 사용하였다. 유전자의 발현수준은 β-액틴 발현에 대해 표준화(normalization)하였다. DNA 칩 분석결과와 마찬가지로 간암조직에서의 LCN2 발현은 정상조직과 비교하여 발현이 크게 증가함을 볼 수 있었다(도 2). 위의 실험으로부터 대부분의 간암에서(28/40, 70%) LCN2의 mRNA 발현이 상향 조절됨을 확인할 수 있었다.In other words, oligonucleotide sequences corresponding to LCN2 were designed using Primer3 software ( http://frodo.wi.mit.edu/ ). The forward primer is 5'-CCG GAA TTC CAT GCC CCT AGG TCT CCT G-3 'and the reverse primer is 5'-CGG GGT ACC TCA GCC GTC GAT ACA CTG G-3'. As a template for RT-PCR analysis, a first strand cDNA mixture corresponding to 5 μg total RNA was used. Gene expression levels were normalized to β-actin expression. As in the DNA chip analysis, LCN2 expression in liver cancer tissues was significantly increased compared to normal tissues (FIG. 2). From the above experiments, it was confirmed that mRNA expression of LCN2 was upregulated in most liver cancers (28/40, 70%).

<< 실시예Example 3>  3> LCN2LCN2 재조합 단백질 및 항체 생산 Recombinant Protein and Antibody Production

1. One. LCN2LCN2 재조합 단백질 Recombinant protein

NdeI/BamHI으로 이중 절단(double digestion)하여 pET11a에 LCN2 유전자를 서브클로닝하였다. 발현세포로는 BL21(DE3)를 사용하였다. LB 배지(Luria-Bertani medium)(앰피실린 100㎍/㎖ 포함)에 BL21-pET-11a(+)LCN2의 싱글 콜로니를 시딩한 다음, 37℃ 쉐이킹 배양기(shaking incubator)에서 하룻밤 동안 배양하였다. IPTG를 처리하여 LCN2 단백질이 잘 발현되는 것을 확인한 후, 단백질의 용해도를 확인하였다. IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)에 의해 발현된 LCN2 단백질이 불용성 형태(insoluble form)을 형성하는 것을 확인하였다. LCN2 단백질을 대량생산한 후 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 수지 컬럼을 이용하여 LCN2 단백질을 분리하였다.The LCN2 gene was subcloned in pET11a by double digestion with NdeI / BamHI. BL21 (DE3) was used as the expression cell. Single colonies of BL21-pET-11a (+) LCN2 were seeded in Luria-Bertani medium (including 100 μg / ml ampicillin) and then incubated overnight in a 37 ° C. shaking incubator. After treatment with IPTG to confirm that the LCN2 protein is well expressed, the solubility of the protein was confirmed. It was confirmed that LCN2 protein expressed by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) forms an insoluble form. After mass production of LCN2 protein, LCN2 protein was isolated using a Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) resin column.

2. 항체생산2. Antibody Production

2-1. 토끼 2-1. rabbit 폴리클론Polyclonal 항체 Antibodies

정제된 항원과 CFA(Colonization Factor Antigen)를 섞어 토끼에 피하 면역주사하였다. 면역형광항체(Immunofluorescent antibody)와 항원을 사용하여 혈액을 검사하고 ELISA로 역가를 측정하였다. 이후 전채혈하여 혈청을 분리하고 Protein A column(upstate)을 이용하여 정제하였다.The purified antigen was mixed with Colonization Factor Antigen (CFA) and injected subcutaneously into rabbits. Blood was tested using immunofluorescent antibody and antigen and titer was measured by ELISA. Since serum was separated by whole blood and purified using Protein A column (upstate).

2-2. 마우스 2-2. mouse 모노클론Monoclonal 항체 Antibodies

정제된 항원과 CFA를 섞어 Balb/c 마우스에 혈관주사 및 피하주사로 면역하였다. 이후 면역형광항체와 항원으로 부스팅(boosting)하고, ELISA로 역가를 측정하였다. 이후 마우스 비장을 분리하여 SP2/0-Ag14 세포와 기존에 알려진 방법(Somat Cell Mol Genet,1979, Schneiderman S. et al.)대로 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합하였다. 이후, HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 선택을 이용하여 스크리닝하고, LCN2를 항원으로 사용하는 ELISA를 통하여 하이브리도마(hybridoma)를 선별하였다. 선별된 하이브리도마는 Balb/c 마우스의 복강에 주사하여 복수를 얻고, 모노클론 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 Protein A column(upstate)을 이용하였다.The purified antigen and CFA were mixed to immunize Balb / c mice with vasculature and subcutaneous injection. Then boosted with immunofluorescent antibody and antigen (boosting), the titer was measured by ELISA. Mouse spleens were then isolated and SP2 / 0-Ag14 cells and known methods ( Somat Cell Mol And fused with polyethylene glycol as Genet , 1979, Schneiderman S. et al. Subsequently, screening was performed using HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) selection, and hybridomas were selected through ELISA using LCN2 as an antigen. Selected hybridomas were injected into the abdominal cavity of Balb / c mice to obtain ascites and purified monoclonal antibodies. Purification of the antibody was performed using a Protein A column (upstate).

3. 특이성 검증3. Specificity Verification

293T 세포주에서 녹색형광단백질(Green fluorescence protein; "GFP"와 혼용함) 표지 또는 myc 표지발현벡터를 이용하여 융합 단백질 재조합 유전자를 일시적으로 발현시켜 웨스턴 블랏으로 그 특이성을 관찰하였다(도 3). LCN2는 녹색형광단백질이나 myc 융합 단백질에 일치하는 밴드를 보여 주었다. 면역형광염색에 의해서도 핵과 세포질에 위치하는 녹색형광단백질의 형광에 일치하게 LCN2 면역염색성을 관찰할 수 있었다(도 4).The fusion protein recombinant gene was transiently expressed using a green fluorescence protein (combined with "GFP") label or myc label expression vector in 293T cell line, and its specificity was observed by Western blot (FIG. 3). LCN2 showed a matching band to either the green fluorescent protein or the myc fusion protein. Immunofluorescence staining also showed LCN2 immunostaining consistent with the fluorescence of the green fluorescent protein located in the nucleus and cytoplasm (Fig. 4).

<< 실시예Example 4 > 간암 세포주에서의  4> in liver cancer cell lines LCN2LCN2 발현 Expression

간암 세포주에서 단백질 발현을 비교하기 위하여 폴리클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다(도 5). 이를 위하여 간암 세포주를 배양한 후 세포를 용출용액(1% Triton X-100, 150mM NaCl, 100mM KCl, 20mM HEPES(pH 7.9), 10mM EDTA, 1mM sodium orthovanadate, 10㎍/㎖ aprotinin, 10㎍/㎖ leupeptin, 1M PMSF)에 용출시킨 후 세포 용균액을 전기영동하고 나이트로셀룰로스 막(Bio-Rad, CA, USA)에 블랏팅하였다. 면역블랏팅 멤브레인을 5% non fat dry milk, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS(Phosphate buffered saline)용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후 LCN2에 대한 항체 (1:5,000)로 2시간 동안 반응시킨 후, 5,000배 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase; "HRP"과 혼용함)가 접합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 enhanced chemiluminescence assay kit (Pierce, IL, USA)으로 전개하여 분석하였다. 웨스턴 블랏을 실시한 HLK2, HKK2, HLK6에서 LCN2 발현을 보였으며, 특히 HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.Western blot analysis was performed using polyclonal antibodies to compare protein expression in liver cancer cell lines (FIG. 5). To this end, after culturing the liver cancer cell line, the cells were eluted (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 µg / ml aprotinin, 10 µg / ml). After eluting with leupeptin, 1M PMSF, cell lysates were electrophoresed and blotted onto nitrocellulose membranes (Bio-Rad, CA, USA). The immunoblotting membrane was placed in a Phosphate buffered saline (PBS) solution containing 5% non fat dry milk, 0.1% Tween 20, blocked for 2 hours at room temperature, and then reacted with an antibody to LCN2 (1: 5,000) for 2 hours. After the reaction, 5,000-fold-diluted horseradish peroxidase (Horseradish Peroxidase; mixed with "HRP") was reacted for 1 hour with a conjugated secondary antibody. Finally, the analysis was performed using an enhanced chemiluminescence assay kit (Pierce, IL, USA). Western blot showed the expression of LCN2 in HLK2, HKK2, HLK6, especially HLK2 is a metastatic liver cancer cell line.

<< 실시예Example 5> 면역조직화학 시험에 의한  5> By immunohistochemistry test 간조직에서의In liver tissue LCN2LCN2 발현 시험 Expression test

정상조직, 간암조직, 전이성 간암조직을 대상으로 면역조직화학 연구를 실시하여 LCN2 단백질 발현을 조사하였다(도 6). 파라핀을 제거하고 항원 복구(antigenic retrieval processes)를 거쳐, 슬라이드는 LCN2에 대한 항체 (1:200)로 표지(labeling)하였으며 표지된 LCN2는 아비딘-바이오틴 복합체(avidin-biotin complex; ABC)법에 의해 분석하였다. 이때 발색시약으로 DAB(3, 3'- Diaminobenzidine)을 사용하였다. 항체에 대한 음성 대조군으로 식염수를 사용하였으며 조직영역에서 세포의 10% 이상이 균일하게 염색되면 양성으로 간주하였다.Normal tissue, liver cancer tissue, and metastatic liver cancer tissues were performed by immunohistochemistry to investigate the expression of LCN2 protein (Fig. 6). After removal of paraffin and through antigenic retrieval processes, slides were labeled with an antibody to LCN2 (1: 200) and labeled LCN2 by the avidin-biotin complex (ABC) method. Analyzed. At this time, DAB (3, 3'-diaminobenzidine) was used as a coloring reagent. Saline was used as a negative control for the antibody and was considered positive if more than 10% of cells in the tissue region were uniformly stained.

분석을 실시한 결과 LCN2는 간암조직의 변연부에서 발현이 증가되었으며, 간실질과 임파구 침윤 변역부에서 발현이 증가하였다. 또한 전이성 간암조직에서 그 발현량이 현저하게 증가하였다. 또한 에드먼슨의 단계 II, III에서 그 발현량이 증가하였다.As a result of the analysis, LCN2 was increased in the margins of liver cancer tissues and in the parenchymal and lymphocyte infiltrating regions. In addition, the expression level of metastatic liver cancer tissues increased significantly. In addition, the expression level of Edmonson increased in stages II and III.

<< 실시예Example 6>  6> ELISAELISA 에 의한 환자 혈청 중 In patient serum by LCN2LCN2 단백질 농도 측정 Protein concentration measurement

모노클론 항체와 폴리클론 항체를 이용하여 ELISA 방법을 확립하였다. 토끼에서 얻은 폴리클론 항체를 1㎍/㎖로 코팅한 후 1% BSAT(1% bovine serum albumin and 0.1% Triton-X)로 블로킹하였다. LCN2 표준액 및 희석된 환자혈청을 가한 후 LCN2에 대한 단일클론 항체를 가하여 2시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 적당한 농도로 희석된 2차 항체 접합 서양고추냉이를 가하고 1시간 후 세척하고 TMB(tetramethylbenzidine)로 현상하였다. 표준액의 검정곡선에 따라 ELISA 방법에 의하여 환자 혈청 중 LCN2 단백질 농도를 측정하였다. 정상인(16), 간경변 환자(16), 간암 환자(16)의 혈청을 100배씩 희석한 후 LCN2의 농도를 측정한 결과 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 LCN2 농도를 보였다(도 7, 표 4). 이 결과는 혈청 내 LCN2 농도의 상승이 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.ELISA methods were established using monoclonal and polyclonal antibodies. Polyclonal antibodies obtained from rabbits were coated with 1 μg / ml and blocked with 1% BSAT (1% bovine serum albumin and 0.1% Triton-X). After addition of LCN2 standard solution and diluted patient serum, monoclonal antibody against LCN2 was added for reaction for 2 hours and then washed. A secondary antibody conjugated horseradish diluted to an appropriate concentration was added, washed after 1 hour, and developed with TMB (tetramethylbenzidine). According to the calibration curve of the standard solution, the concentration of LCN2 protein in patient serum was measured by ELISA method. After diluting the serum of normal subjects (16), cirrhosis patients (16), liver cancer patients (16) by 100-fold and measuring LCN2 concentrations, liver cancer showed a higher LCN2 concentration than normal (Fig. 7, Table 4). ). These results indicate that elevated levels of LCN2 in serum are associated with the development of liver cancer.

질환명Disease name 개체수Population 평균 (ng/㎖)Average (ng / ml) 표준편차 (ng/㎖)Standard deviation (ng / ml) 정상(Normal)Normal 1616 59.6 59.6 43.643.6 간경변(LC)Cirrhosis (LC) 1616 19.3 19.3 41.141.1 간암(HCC)Liver Cancer (HCC) 1616 130.8 130.8 226.2226.2

결론적으로 간암에서 LCN2 발현이 증가하며 간암에서 LCN2 수준은 진단, 예후 인자로서 가능성과 효용성이 크다.In conclusion, LCN2 expression is increased in liver cancer, and LCN2 level in liver cancer is highly useful and useful as a diagnostic and prognostic factor.

<< 실시예Example 7>  7> 샌드위치형Sandwich Type ELISAELISA 키트Kit

다음의 구성요소들을 사용하여 LCN2 농도 측정용 키트를 제조하였다:Kits for measuring LCN2 concentrations were prepared using the following components:

A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, LCN2에 대한 폴리클론 항체 100㎕를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.A. Solid antibody: Antibody-adsorbed microtiter plate prepared by adding 100 μl of polyclonal antibody against LCN2 to a microtiter plate and leaving it at 4 ° C. overnight, then adsorbing albumin to the space on the solid surface. It was.

B. 탐지용 항체: LCN2에 대한 모노클론 항체B. Detection Antibodies: Monoclonal Antibodies Against LCN2

C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체 용액(anti-mouse-IgG-퍼옥시다제)C. Enzyme-linked Antibodies: Secondary Antibody Solution (Anti-mouse-IgG-Peroxidase) with Horseradish Peroxidase

D. 혈청 희석용액D. Serum Dilutions

E. 기질액E. Substrate

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액F. Wash Solution: Phosphate Buffer with 0.05% Tween

G. 표준용액: LCN2 표준액G. Standard Solution: LCN2 Standard Solution

상기 키트를 이용하여 간암 환자 중 LCN2의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다. A의 고상형 항체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100㎕씩 가한 후 B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 6과 같은 샌드위치형 측정방법으로 LCN2 농도를 검사하였다.Serum dilution of LCN2 in liver cancer patients was examined using the kit as follows. After diluting each serum sample to the solid-state antibody of A, that is, the microtiter plate, using a serum dilution solution (D), and diluting 100 μl per well, the components of B, C, and E were used as in Example 6. LCN2 concentrations were examined by sandwich method.

도 1은 cDNA 마이크로어레이에 의한 간암조직(T)과 비간암 조직(NT)에서 LCN2 mRNA 발현 프로파일을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the LCN2 mRNA expression profile in liver cancer tissue (T) and non-hepatic cancer tissue (NT) by cDNA microarray.

도 2는 RT-PCR에 의한 간암조직(T)과 비간암 조직(NT)에서 LCN2 mRNA 발현을 비교분석한 것이다.Figure 2 is a comparative analysis of LCN2 mRNA expression in liver cancer tissue (T) and non-hepatic cancer tissue (NT) by RT-PCR.

도 3은 웨스턴 블랏 분석에 의한 LCN2 항체 특이성 검증: Myc 또는 녹색형광단백질(GFP) 표지 LCN2 발현 벡터의 도입에 의한 발현 293T 세포의 단백발현 분석 결과이다.Figure 3 Verification of LCN2 antibody specificity by Western blot analysis: Protein expression analysis results of expression 293T cells by the introduction of Myc or green fluorescent protein (GFP) labeled LCN2 expression vector.

도 4는 면역형광염색에 의한 LCN2 항체 특이성 검증: 녹색형광단백질 표지 LCN2 발현 벡터의 도입에 의한 Hep 3B 및 Chang 간세포에서 단백질 발현 분석결과이다.Fig. 4 shows LCN2 antibody specificity by immunofluorescence staining: Protein expression analysis in Hep 3B and Chang hepatocytes by introduction of green fluorescent protein-labeled LCN2 expression vector.

도 5는 웨스턴 블랏 분석에 의한 간암 세포주에서 LCN2 발현 분석결과이다. HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.Figure 5 shows the results of LCN2 expression in liver cancer cell lines by Western blot analysis. HLK2 is a liver cancer cell line showing metastatic.

도 6은 조직면역화학염색에 의한 간암조직에서의 LCN2 발현 분석 결과이다.Figure 6 shows the results of LCN2 expression in liver cancer tissues by tissue immunohistochemical staining.

A: 간암조직의 변연부의 LCN2 발현 증가A: Increased LCN2 expression in the margins of liver cancer tissue

B: 간암조직의 내부 간실질 및 임파구 침윤 변연부에서의 LCN2 발현 증가B: Increased LCN2 expression in the inner hepatic parenchyma and lymphocyte infiltrating margins of liver cancer tissues

C: 전이성 간암조직 내의 간암세포의 LCN2 발현 증가C: Increased LCN2 expression in liver cancer cells in metastatic liver cancer tissue

D: 정상 간 조직에서의 LCN2 발현D: LCN2 expression in normal liver tissue

E: 에드먼슨(Edmondson) 2등급 간세포암에서 LCN2 발현 증가E: Increased LCN2 Expression in Edmondson Grade 2 Hepatocellular Carcinoma

F: 에드먼슨(Edmondson) 3등급 간세포암에서 LCN2발현 증가F: Increased LCN2 Expression in Edmondson Grade 3 Hepatocellular Carcinoma

G: 임파선에서 전이성 간세포암조직의 LCN2 발현 증가G: Increased LCN2 expression in metastatic hepatocellular carcinoma tissues in lymph nodes

도 7은 ELISA 방법에 의한 임상시료 결과Figure 7 clinical sample results by the ELISA method

<110> Korea Reasearch Institute of Bioscience and Biotechnology Industrial coorporation foundation chonbuk national university <120> Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using thereof <130> KRIBB-EYSONG-LCN2 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(594) <400> 1 atg ccc cta ggt ctc ctg tgg ctg ggc cta gcc ctg ttg ggg gct ctg 48 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 cat gcc cag gcc cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct 96 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 ctg agc aag gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag 144 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 ggg aag tgg tat gtg gta ggc ctg gca ggg aat gca att ctc aga gaa 192 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 gac aaa gac ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 240 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt 288 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 gac tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc 336 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc gtc 384 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc ttc aag 432 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag atc acc ctc tac ggg aga 480 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 acc aag gag ctg act tcg gaa cta aag gag aac ttc atc cgc ttc tcc 528 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc ttc cct gtc cca atc 576 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 gac cag tgt atc gac ggc tga 597 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggaattcc atgcccctag gtctcctg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggggtacct cagccgtcga tacactgg 28 <110> Korea Reasearch Institute of Bioscience and Biotechnology          Industrial coorporation foundation chonbuk national university <120> Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular          carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using          about <130> KRIBB-EYSONG-LCN2 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS (222) (1) .. (594) <400> 1 atg ccc cta ggt ctc ctg tgg ctg ggc cta gcc ctg ttg ggg gct ctg 48 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu   1 5 10 15 cat gcc cag gcc cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct 96 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro              20 25 30 ctg agc aag gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag 144 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln          35 40 45 ggg aag tgg tat gtg gta ggc ctg gca ggg aat gca att ctc aga gaa 192 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu      50 55 60 gac aaa gac ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 240 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu  65 70 75 80 gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt 288 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys                  85 90 95 gac tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc 336 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe             100 105 110 acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc gtc 384 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val         115 120 125 cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc ttc aag 432 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys     130 135 140 aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag atc acc ctc tac ggg aga 480 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 acc aag gag ctg act tcg gaa cta aag gag aac ttc atc cgc ttc tcc 528 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser                 165 170 175 aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc ttc cct gtc cca atc 576 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile             180 185 190 gac cag tgt atc gac ggc tga 597 Asp Gln Cys Ile Asp Gly         195 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu   1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro              20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln          35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu      50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu  65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys                  85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe             100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val         115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys     130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser                 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile             180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly         195 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggaattcc atgcccctag gtctcctg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggggtacct cagccgtcga tacactgg 28  

Claims (18)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법.A method of detecting liver cancer markers comprising contacting an antibody that specifically binds an LCN2 protein with a biological sample selected from blood, serum and plasma. 제9항에 있어서,The method of claim 9, a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;a) providing a biological sample for analysis; b) 상기 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;b) contacting said sample with an antibody that specifically binds LCN2 protein; c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및c) quantitatively detecting the antigen-antibody complex; And d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 검출 방법.d) comparing the detection result of the step c) with a normal control; liver cancer marker detection method comprising a. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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