KR100861465B1 - A gastric carcinoma gene znf312b, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same - Google Patents

A gastric carcinoma gene znf312b, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same Download PDF

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KR100861465B1 KR1020070083814A KR20070083814A KR100861465B1 KR 100861465 B1 KR100861465 B1 KR 100861465B1 KR 1020070083814 A KR1020070083814 A KR 1020070083814A KR 20070083814 A KR20070083814 A KR 20070083814A KR 100861465 B1 KR100861465 B1 KR 100861465B1
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정소영
김정민
김철희
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Abstract

A novel gene showing no homology to conventionally reported carcinogenic/metastatic genes is provided to be used for diagnosing gastric cancer as a marker for diagnosing and treating gastric cancer, preparing a transgenic cell line and an animal, gene therapy using an anti-sense or an siRNA(small interfering RNA), and developing an anticancer agent specific to the gastric cancer. A gastric cancer marker diagnostic kit comprises an antibody specifically coupled to an ZNF312b protein. Further, the cancer diagnostic kit is a kit for ELISA(enzyme linked immunosorbent assay). A method for detecting a gastric cancer marker comprises a step of contacting the antibody specifically coupled to the ZNF312b protein with a biological sample selected from the group consisting of gastric tissue, gastric cell, urine, blood, serum and plasma. A vector for transformation comprises an ZNF312b carcinogenic gene of SEQ ID : NO. 1 or a fragment thereof. An animal cell line is transformed by the vector and is SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b. A method for screening an inhibitor of gastric cancer comprises the steps of: (a) coupling a test compound to the ZNF312b protein; and (b) identifying whether the test compound promotes or inhibits the action of the ZNF312b protein. A target gene ZNF312b for treating cancer or inhibiting metastasis comprises a sequence of SEQ ID : NO. 1. A target ZNF312b protein for treating cancer or inhibiting metastasis comprises an amino acid sequence of SEQ ID : NO. 2.

Description

위암 유발 유전자 ＺＮＦ312ｂ와 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 위암 진단 키트{A gastric carcinoma gene ZNF312b, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same}Gastric carcinoma gene ZNF312b, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same}

본 발명은 위암 진단 마커에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 ZNF312b 위암 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단 키트 및 이를 이용하여 위암 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gastric cancer diagnostic marker, and more particularly, to a gastric cancer diagnostic kit comprising an agent for measuring the presence of ZNF312b gastric cancer marker and a method for detecting gastric cancer marker using the same.

인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000개의 유전자를 가지고 있으며, 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상, 즉 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기 조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다(Liang, P. and A.B. Pardee, Science, 257: 967-971 (1992)).Higher animals, including humans, have about 30,000 genes, only about 15% of which are expressed in each individual. Thus, which gene is selected and expressed determines all aspects of life: development, differentiation, homeostasis, response to stimuli, regulation of cell division cycles, aging and apoptosis (programmed cell death). (Liang, P. and AB Pardee, Science , 257: 967-971 (1992)).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 되며 이러한 유전자 변화는 세포 신호체계의 이상을 초래하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라 할 수 있다.Pathological phenomena, such as tumor development, are caused by genetic mutations that eventually lead to changes in gene expression, which can lead to abnormal cell signaling. Thus, comparison of gene expression between different cells is a fundamental and effective approach to understanding many biological phenomena.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 발암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양 억제유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간 종양을 일으킨다고 보고되고 있다(Bishop, J. M., Cell, 64:235-248 (1991), 및 Hunter, T., Cell, 64:249-270(1991)). 또한, 암의 10~30%는 발암 유전자가 증폭됨으로써 발암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다. 발암 유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.Taken together, studies on tumor development suggest that several genetic changes, such as loss of chromosomal heterozygosity, activation of carcinogenic genes, and inactivation of other tumor suppressor genes, including the p53 gene, may be present in tumor tissues. It has been reported to accumulate and cause human tumors (Bishop, JM, Cell , 64 : 235-248 (1991), and Hunter, T., Cell , 64 : 249-270 (1991)). In addition, it is reported that 10-30% of cancers are caused by the oncogenic gene being activated by amplifying the oncogenic gene. Activation of oncogenic genes plays an important role in the etiology of many cancers, and it is required to identify them.

위암은 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다(Parkin 등, Int . J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut 등, Semin . Oncol. 23: 281-291, 1996). 위암과 관련한 유전자는 별로 보고되고 있지 않으나, 최근 분자적 생물학적 분석으로 p53 (Yokozaki 등, Int . Rev . Cytol . 204: 49-95, 2001), β-카테닌 (박 등, Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999), E-카데린 (Berx 등, Hum . Mutat. 12: 226-237, 1998), 삼엽형 인자 1(trefoil factor 1) (박 등, Gastroenterology 119: 691-698, 2000), c-met (이 등, Oncogene 19: 4947-4953, 2000)과 같은 유전자들이 위암에서 많은 유전적 변이가 있다고 보고되고 있다. 그리고 CA11 (Yoshikawa 등, Jpn . J. Cancer Res . 91: 459-463, 2000; Shiozaki 등, Int . J. Oncol . 19: 701-707, 2001)과 위장 점막에서 합성되는 삼엽형 인자(trefoil factor)인 TFF1과 TFF2(Shiozaki 등, Int . J. Oncol . 19: 701- 707, 2001; Kirikoshi와 KatohKirikoshi, Int . J. Oncol . 21: 655-659, 2002)과 같은 유전자들이 위암에서 저발현 된다는 보고도 있다. 또한, Hasegawa 등은 장 타입의 위암에서 발현되는 23,040개 유전자로 이뤄진 cDNA 마이크로어레이를 이용해 RPL10, HSPCB, LOC56287, IGHM, PGC, REGIA, RNASE1, TFF1, TFF2 유전자의 발현이 위암 전이와 관련한다는 사실을 보고한 바 있다 (Hasegawa 등, Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002). 그러나 이러한 유전자만으로 위암을 진단/ 치료하기에는 아직 불충분하며 현재까지 임상에 사용되는 위암 타겟 유전자는 존재하지 않는 실정이다.Gastric cancer is one of the most common cancers in Asia, including Korea and Japan, with the highest mortality rate (Parkin et al . , Int . J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut et al . , Semin . Oncol . 23: 281-). 291, 1996). Genes associated with gastric cancer include, but not being reported by recent molecular biological analysis in p53 (including Yokozaki, Int Rev Cytol 204:. .. 49-95, 2001), β- catenin (Park et al., Cancer Res . 59: 4257-4260, 1999), E-cadherin (Berx et al ., Hum . Mutat . 12: 226-237, 1998), trefoil factor 1 (Pak et al., Gastroenterology 119: 691-698, Genes such as c-met ( Oncogene 19: 4947-4953, 2000) have been reported to have many genetic variations in gastric cancer. And CA11 (Yoshikawa et al . , Jpn . J. Cancer Res . 91: 459-463, 2000; Shiozaki et al . , Int . J. Oncol . 19: 701-707, 2001) and TFF1 and TFF2 (Shiozaki et al . , Int . J. Oncol . 19: 701- 707, 2001; Kirikoshi and Katoh Kirikoshi, Int . J ), which are trefoil factors synthesized in the gastrointestinal mucosa . . Oncol 21:. genes, such as 655-659, 2002) have also reported that low expression in gastric cancer. Hasegawa et al. Also found that expression of RPL10, HSPCB, LOC56287, IGHM, PGC, REGIA, RNASE1, TFF1, and TFF2 genes is associated with gastric cancer metastasis using cDNA microarrays consisting of 23,040 genes expressed in intestinal type gastric cancer. It has been reported (Hasegawa et al., Cancer Res . 62 : 7012-7017, 2002). However, only these genes are still insufficient to diagnose / treat gastric cancer, and there are no gastric cancer target genes used in clinical practice.

ZNF312b 유전자는 Fez(forebrain embryonic zinc finger)로도 불리며, 개구리(Xenopus)의 전뇌(forebrain)와 후각 신경(olfactory sensory neuron; OSN)에서 처음 동정된 것으로 아연(Zinc) 이온을 갖는 단백질을 코드한다(Matsuo-Takasaki et al., Mech . Dev . 93: 201-204(2000)). 이 유전자는 후각신경의 적절한 종료, 후각연수(olfactory bulb)의 형성과 중간 뉴런 프로제니터(interneuron progenitor)의 로스트랄 스트림 전이(rostral stream migration) 등을 위해 필요한 유전자로 후각신경 축색 돌기 (axonal projection)의 세포 자율적 조절(cell-autonomously control)과 후각연수의 막 형성의 조절을 위한 필수 요소로 알려져 있다(Tsutomu Hirata et al., Development 133: 1433-1443 (2006)). 또한 ZNF312b의 발현은 배아 발생단계에서 나타나며, 그 후 성체가 된 이후 위에서 그 발현이 미약하게 일어나며 다른 조직에서는 발현이 되지 않는 것으로 보고되고 있다. 지금까지 ZNF312b 유전자의 기능으로 알려진 것들 중 위암 또는 암발생 등과 관련해서는 어떠한 보고도 없는 실정이다.The ZNF312b gene, also called Fez (forebrain embryonic zinc finger), was first identified in the forebrain and olfactory sensory neuron (OSN) of frogs (Xenopus) and codes for proteins with zinc ions (Matsuo). -Takasaki et al., Mech . Dev . 93 : 201-204 (2000)). These genes are necessary for proper termination of the olfactory nerves, formation of olfactory bulbs and rostral stream migration of interneuron progenitors. Is known as an essential element for cell-autonomously control and regulation of membrane formation in olfactory training (Tsutomu Hirata et al., Development 133 : 1433-1443 (2006)). In addition, the expression of ZNF312b appears in the embryonic development phase, after which it is reported that the expression occurs slightly in the stomach after adulthood, and is not expressed in other tissues. So far, there are no reports on gastric cancer or cancer occurrence among those known to function of the ZNF312b gene.

이에 본 발명자들은 ZNF312b 유전자가 위암 조직에서 그 발현이 증가되어 있는 것에 착안하여 현재까지 알려진 기능 외에 상기 유전자가 암 발생과정에 관여할 것으로 사료되어, 암 발생과 관련한 상기 유전자의 기능을 연구한 결과, ZNF312b 유전자는 위암에서 특이적으로 발현이 증가하며, 발암 관련 기능을 가지며 세포증식 신호 전달체계의 한 요소로 작용한다는 것을 밝혀내었다. 따라서 상기 유전자는 발암과 관련한 유전자로 기능하며 위암의 진단 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.Accordingly, the inventors of the present invention have focused on the increased expression of ZNF312b genes in gastric cancer tissues. In addition to the functions known to date, the present inventors believe that the genes may be involved in the cancer development process. The ZNF312b gene has been shown to increase expression specifically in gastric cancer, have a carcinogenic function and act as an element of cell proliferation signaling system. Therefore, the gene functions as a gene related to carcinogenesis and can be effectively used for diagnosis and treatment of gastric cancer.

지금까지의 기술로는 유전자만으로 위암을 진단/ 치료하기에는 아직 불충분하며 현재까지 임상에 사용되는 위암 타겟 유전자는 존재하지 않는 실정이다. 따라서, 본 발명의 목적은 신규 위암 마커인 ZNF312b의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단 키트를 제공하는 것이다.Until now, only the gene alone is insufficient to diagnose / treat gastric cancer, and there are no gastric cancer target genes used in clinical practice. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a gastric cancer diagnostic kit comprising an agent for measuring the presence of a novel gastric cancer marker ZNF312b.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 유래되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 유전자 및 siRNA를 사용하여 위암을 치료 또는 예방하는 제제를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an agent for treating or preventing gastric cancer using antisense genes and siRNAs having base sequences complementary to mRNAs derived from the oncogenic genes or fragments thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발암 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법 및 저분자 물질을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for screening a liver cancer inhibitor and a low molecular weight substance, which are characterized by confirming whether the action of the protein encoded by the carcinogen is promoted or inhibited.

이에, 본 발명자는 실시간(real time) RT-PCR 방법에 의해 위암 환자 시료에서 ZNF312b 유전자가 고발현됨을 확인하고, 상기 유전자의 과발현 또는 siRNA를 이용한 억제에 의해 위암세포주의 세포증식과 종양 형성능이 활성/억제됨을 증명함으로써 ZNF312b 유전자가 위암의 발암유전자임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors confirmed that ZNF312b gene was highly expressed in gastric cancer patient samples by real time RT-PCR method, and cell proliferation and tumor formation ability of gastric cancer cell lines were activated by overexpression of the gene or inhibition using siRNA. By confirming that the ZNF312b gene is a carcinogen of gastric cancer, the present invention was completed.

본 발명은 기존에 보고된 발암 유전자들과는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로 위암의 진단 및 치료의 마커로서 위암의 진단, 형질 전환 세포주와 동물의 제조, 안티-센스(anti-sense), siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 위암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention is a novel gene that does not show any homology with previously reported oncogenic genes. As a marker for the diagnosis and treatment of gastric cancer, the present invention is for the diagnosis of gastric cancer, preparation of transformed cell lines and animals, anti-sense and siRNA ( small interfering RNA) can be effectively used for gene therapy, gastric cancer-specific anticancer drugs, and the like.

본 발명은 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 위암 마커 진단 키트를 제공한다.The present invention provides a gastric cancer marker diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds ZNF312b protein.

또한, 본 발명은 정상 대조군과 비교하여 ZNF312b 단백질 양의 증가로 위암을 진단하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.In addition, the present invention provides a gastric cancer marker diagnostic kit, characterized in that the diagnosis of gastric cancer with an increase in the amount of ZNF312b protein compared to the normal control. The kit includes a kit for an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

또한, 본 발명은 ZNF312b mRNA를 정량적으로 검출하는 위암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등을 선택할 수 있다. 상기 mRNA 정량 검출 위암 마커 진단 키트는 ZNF312b mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 6 또는 7 중 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 mRNA 정량 검출 위암 마커 진단 키트는 ZNF312b mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.ZNF312b mRNA에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드를 포함하여 구성된다.The present invention also provides a gastric cancer marker diagnostic kit for quantitatively detecting ZNF312b mRNA. The mRNA quantitative detection method may be selected from RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RNase protection assay), Northern blotting, DNA chip and the like. The mRNA quantitative detection gastric cancer marker diagnostic kit is characterized in that it comprises one or more nucleotides of SEQ ID NO: 6 or 7 specifically binding to ZNF312b mRNA. In addition, the mRNA quantitative detection gastric cancer marker diagnostic kit gastric cancer marker diagnostic kit comprising cDNA preparation primer, reverse transcriptase, Taq polymerase, PCR primer, dNTP corresponding to ZNF312b mRNA. And nucleotides that bind.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드가 서열번호 3 내지 7 중 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the nucleotide is at least one of SEQ ID NOs: 3 to 7.

본 발명은 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 위 조직, 위 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 위암 마커 검출 방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting gastric cancer markers, comprising contacting an antibody specifically binding to ZNF312b protein with a biological sample selected from gastric tissue, gastric cells, urine, blood, serum and plasma.

또한, 본 발명의 위암 마커 검출 방법은In addition, the gastric cancer marker detection method of the present invention

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;a) providing a biological sample for analysis;

b) 상기 시료와 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;b) contacting said sample with an antibody that specifically binds ZNF312b protein;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및c) quantitatively detecting the antigen-antibody complex; And

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.and d) comparing the detection result of step c) with a normal control group.

본 발명은 서열번호 1의 ZNF312b 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터를 제공한다.The present invention provides a vector for transformation comprising the ZNF312b carcinogen or a fragment thereof of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b 등의 동물 세포주를 제공한다.In addition, the present invention provides animal cell lines such as SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b transformed by the vector.

본 발명은 서열번호 1의 ZNF312b 위암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.The present invention provides an anti-sense gene having a sequence complementary to all or a part of the sequence of mRNA transcribed from ZNF312b gastric carcinogenic gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1, which binds to the mRNA and inhibits the expression of the carcinogenic gene or fragment. To provide.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 ZNF312b 위암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 ZNF312b 위암 발암 유전자의 발현을 저해 하는 siRNA 서열을 제공한다. 상기 서열은 서열번호 3 내지 5번 중 하나인 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention has a sequence complementary to all or part of the sequence of mRNA transcribed from ZNF312b gastric carcinogen gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1, and is recognized by Dicer protein expression of the ZNF312b gastric cancer carcinogen It provides an siRNA sequence that inhibits. The sequence is characterized in that one of SEQ ID NO: 3 to 5.

또한, 본 발명은 ZNF312b 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 ZNF312b 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening a gastric cancer inhibitor, comprising binding a test compound to a ZNF312b protein and confirming that the test compound promotes or inhibits the action of the ZNF312b protein.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 타겟 유전자 ZNF312b를 제공한다.The present invention also provides a target gene ZNF312b for the treatment of gastric cancer, characterized by having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 타겟 ZNF312b 단백질을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a target ZNF312b protein for the treatment of gastric cancer, characterized by having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명은 ZNF312b 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 마커 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a gastric cancer marker diagnostic kit comprising an agent for measuring mRNA or protein level of ZNF312b gene.

또한, 본 발명은 ZNF312b 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 위암 마커 검출 방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a method for detecting gastric cancer markers, comprising contacting a biological sample with an agent measuring the mRNA or protein level of the ZNF312b gene.

본 발명에서 "마커"는 위암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, ZNF312b 유전자에 대한 핵산 마커 및 ZNF312b 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 위암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.In the present invention, "marker" is a substance capable of distinguishing gastric cancer cells from normal cells, and may be a nucleic acid marker for the ZNF312b gene and a polypeptide marker for the ZNF312b protein. It is characterized by an increase in expression.

본 발명에서 "진단"은 위암 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한 다."Diagnosis" in the present invention means identifying the presence or characteristics of gastric cancer conditions.

본 발명의 인간 신규 발암 유전자는 ZNF312b로서, 서열번호 1로 나타낸 바와 같이 2026bp 길이의 전체 염기서열을 가지며(GeneBank Accession number: AY726588), 전사 조절인자로 작용하여 세포증식에 관련된 유전자를 활성화하는 것으로 보고되어 있다. 서열번호 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 109 부위에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타나 있으며 475개의 아미노산으로 이루어져 있다("ZNF312b 단백질"). 그러나 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 발암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 발암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.Human novel carcinogenic gene of the present invention is ZNF312b, and has a total sequence of 2026 bp as shown in SEQ ID NO: 1 (GeneBank Accession number: AY726588), and acts as a transcriptional regulator to activate genes related to cell proliferation. It is. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the open reading frame corresponding to the nucleotide number 109 site is the entire protein coding region, and the amino acid sequence derived therefrom is shown in SEQ ID NO: 2 and consists of 475 amino acids (" ZNF312b protein "). However, due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codon in the organism to express the carcinogenic gene, the gene of the present invention is a coding region within a range that does not change the amino acid of the carcinogenic protein expressed from the coding region. Various modifications may be made and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of genes in portions other than the coding region, and such modified genes are also included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention encompasses polynucleotides having fragments of the gene and bases having substantially the same base sequence as the carcinogenic gene of SEQ ID NO: 1. By substantially identical polynucleotides are meant those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 95%.

본 발명의 위암 발암 유전자 ZNF312b로부터 발현되는 단백질은 475개의 아미노산으로 이루어져 있고, 서열번호 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 52kd이다. 본 발명의 단백질은 기존의 ZNF312와 더불어 Fez family로 발생과정 중 전뇌에 발 현되는 단백질로 알려져 있으며, 상기 발암유전자 ZNF312b와 ZNF312는 50% 이하의 상동성을 갖는다.The protein expressed from the gastric cancer carcinogenic gene ZNF312b of the present invention is composed of 475 amino acids, has a sequence such as SEQ ID NO: 2, and is about 52 kd in size. The protein of the present invention is known as a protein expressed in the whole brain during the developmental process in the Fez family, along with the existing ZNF312, the carcinogenic genes ZNF312b and ZNF312 has a homology of 50% or less.

생물학적 시료 중의 ZNF312b 위암 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.The expression level of the ZNF312b gastric cancer marker gene in a biological sample can be determined by confirming the amount of mRNA or its protein. The process of separating mRNA and protein from the biological sample can be performed using a known process. It can be measured in various ways.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 ZNF312b 위암 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "biological sample" includes tissues, cells, and the like that can detect a difference in mRNA or protein levels of ZNF312b gastric cancer marker gene, and preferably includes, but is not limited to, urine, blood, plasma, serum, and the like.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 ZNF312b 위암 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 ZNF312b 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "mRNA level measurement" refers to a process for confirming the presence and expression level of mRNA of ZNF312b marker genes in a biological sample in order to detect ZNF312b gastric cancer marker gene. Analytical methods for this purpose include, but are not limited to, RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, and the like.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 위암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, ZNF312b 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 위암 의심 환자의 실제 위암 환자 여부를 진단할 수 있다.Through the above detection methods, it is possible to compare the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in the suspected gastric cancer patient, and to determine whether the expression level of the ZNF312b marker gene is increased in the mRNA to determine whether the actual gastric cancer patient is suspected of gastric cancer. Diagnosis can be made.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 ZNF312b 위암 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서 열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 내지 50bp의 길이, 좀더 바람직하게는 약 10 내지 30bp의 길이이다. 또한, 대조군 유전자의 핵산서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머레이저 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.Kits for measuring mRNA levels by RT-PCR include each primer pair specific for the ZNF312b gastric cancer marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific for the nucleic acid sequence of each marker gene, and is about 7 to 50 bp in length, more preferably about 10 to 30 bp in length. In addition, a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene may be included. Other RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerizers and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitor DEPC water, sterile water, and the like. It may include. "Primer" refers to a short nucleic acid sequence that is capable of forming base pairs with complementary templates with nucleic acid sequences having short free 3 'hydroxyl groups and that serves as a starting point for template strand copying. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization in the appropriate buffer and temperature. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis. Primers can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 ZNF312b 위암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.In the present invention, "protein level measurement" is a process of confirming the presence and expression of the protein expressed in ZNF312b gastric cancer marker gene in a biological sample, preferably using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Check the amount of.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 ZNF312b 위암 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다."Antibody" means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to ZNF312b gastric cancer marker protein, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.Assays for measuring protein levels using antibodies include Western blot, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, Tissue immunostaining, immunoprecipitation, complement fixation assay, FACS, protein chips, and the like, are not limited to the described methods.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 위암 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, ZNF312b 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 위암 의심환자의 실제 위암 여부를 진단할 수 있다.Through the above analysis method, the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected gastric cancer patients can be compared, and the actual expression level of the suspected gastric cancer patient is judged by determining whether the expression level of ZNF312b protein is increased significantly. Diagnosis of gastric cancer is possible.

"항원-항체 복합체"란 ZNF312b 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레 스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 3H,14C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다."Antigen-antibody complex" means a combination of a ZNF312b protein with an antibody specific for it, and the amount of antigen-antibody complex formation can be quantitatively determined through the signal size of the detection label. The detection label can be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited to the materials described above. When enzymes are used as detection labels, the available enzymes include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetyl Cholinesterase, glucose oxidase, hexokinase and the like, and are not limited to the ranges described above. Fluorescent materials include fluorescein, phycocyanin, fluorescamine, and the like, and are not limited to the materials described above. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Luminescent materials include luciferin and the like, but are not limited thereto. The microparticles include colloidal gold and the like, but are not limited thereto. Redox molecules include, but are not limited to, quinone, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, and the like. Radioisotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, and the like.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. ZNF312b 위암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 위암 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA. In ELISA, a direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and the antibody attached to the solid support, and reacted with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and antigen attached to the solid support Various ELISA methods include an indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes this antibody. More preferably, the antibody is attached to a solid support and reacted with a sample, followed by enzymatic color development by attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches a labeled secondary antibody and enzymatically develops. ZNF312b gastric cancer marker protein and antibody to determine the degree of complex formation can determine whether the onset of gastric cancer.

또 다른 방법으로 ZNF312b 위암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 위암 발병 여부를 확인할 수 있다.Alternatively, one or more antibodies against the ZNF312b gastric cancer marker may be arranged in a predetermined position on a substrate, and may use a protein chip immobilized at a high density. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, and the protein is read to determine the presence or expression of the protein to determine whether the cancer is developed. You can check it.

또 다른 방법으로 ZNF312b에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 위암 발병 여부를 확인할 수 있다.Another method is Western blotting using an antibody against ZNF312b. The whole protein is isolated from the sample, which is electrophoresed to separate the protein according to size and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed using a labeled antibody to determine whether gastric cancer develops.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 위암 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질의 수준은 ZNF312b 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.Such detection methods include comparing the expression level of the marker gene in the gastric cancer-causing cells with the expression level of the marker gene in the normal control group. The level of mRNA or protein can be expressed as an absolute or relative difference between the ZNF312b marker proteins.

본 발명은 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 위암 마커 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a gastric cancer marker diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds ZNF312b protein.

또한, 본 발명은 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 위암 마커 검출 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for detecting gastric cancer markers comprising contacting a biological sample with an antibody that specifically binds a ZNF312b protein.

본 발명에서 ZNF312b 단백질이 위암 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 ZNF312b 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브 리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.Since the ZNF312b protein has been identified as a gastric cancer marker in the present invention, the production of antibodies using the same can be easily prepared using techniques well known in the art. As is well known in the art, polyclonal antibodies are injected from an animal with ZNF312b protein antigen and collected from the animal to obtain serum comprising the antibody. Animals can be prepared using any animal host such as goat, rabbit, pig. Monoclonal antibodies are known in the art to which the invention belongs, such as the hybrida method (see Kohler & Milstein (1976) European J. Immunology 6 : 511-519) or phage antibody libraries (Clackson et al., Nature , 352 : 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol . , 222 : 58, 1-597, 1991).

하이브리도마 방법은 ZNF312b 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 ZNF312b 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.The hybridoma method utilizes cells of an immunologically suitable host animal, such as a mouse injected with ZNF312b protein antigen, and the other uses a cancer or myeloma cell line. These two kinds of cells are fused by methods well known in the art, such as polyethylene glycol, and then antibody-producing cells are propagated by standard tissue culture methods. After obtaining a uniform cell population by subcloning by the limited dilution technique, hybridomas capable of producing antibodies specific for the ZNF312b protein are mass cultured in vitro or in vivo according to standard techniques.

파지 항체 라이브러리 방법은 ZNF312b 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 ZNF312b 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.The phage antibody library method obtains an antibody gene for the ZNF312b protein and expresses it in the form of a fusion protein on the surface of the phage to prepare an antibody library in vitro, and isolates the monoclonal antibody binding to the ZNF312b protein from the library. , How to make.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.Antibodies prepared by the above method can be separated by electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2 및 Fv 등이 있다.Antibodies included in the kits of the present invention include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. The functional fragment of an antibody molecule means a fragment which retains at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , F (ab) 2 and Fv.

ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.The diagnostic kit of the present invention comprising an antibody that specifically binds to the ZNF312b protein is preferably a diagnostic kit for ELISA, and may include an antibody specific for a control protein, and may also detect an antigen-antibody complex. Reagents such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes conjugated with the antibody and its substrate or other substance capable of binding to the antibody, and the like.

본 발명의 ZNF312b 발암 유전자 및 단백질은 사람의 위암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, ZNF312b 유전자가 삽입된 동물 발현용 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.The ZNF312b carcinogenic genes and proteins of the present invention can be isolated from various tissues, including human gastric cancer, or synthesized according to known DNA or peptide synthesis methods. In addition, the gene thus prepared can be inserted into an animal expression vector known in the art to which the present invention pertains, and the animal expression vector into which the ZNF312b gene is inserted can be introduced into an appropriate animal cell line.

본 발명의 유전자는 정량적 RT-PCR 등의 분석 방법에서 위암조직에서만 발현이 확인되므로 위암을 유발하는 발암 유전자로 판단된다. 또한 위암 세포주인 SNU638 및 SNU668에 이 유전자를 형질도입(transfection)시키면 원래의 위암 세포주와는 다른 성장 속도와 세포 내 신호 전달을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 발암 유전자는 위암의 발생에 관여하는 것으로 판단되며, 위암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 위암 특이적 항암제 탐색, 안티센스 및 siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.Since the gene of the present invention is identified only in gastric cancer tissues in analytical methods such as quantitative RT-PCR, it is determined to be a carcinogenic gene that causes gastric cancer. In addition, transfection of these genes into gastric cancer cell lines SNU638 and SNU668 shows different growth rates and intracellular signal transduction than the original gastric cancer cell lines. Therefore, the carcinogenic gene of the present invention is determined to be involved in the development of gastric cancer, and can be effectively used for the diagnosis of gastric cancer, the production of transgenic animals, the detection of gastric cancer specific anticancer agents, antisense and siRNA gene therapy.

본 발명에서는 상기 ZNF312b 발암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing gastric cancer comprising all or part of the ZNF312b carcinogen.

형질전환 동물은 본 발명의 발암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 마우스 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 상기 유전자 저해물질 및 항암물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.Transgenic animals can be produced by introducing a carcinogenic gene of the present invention into a mammal, for example, a rodent animal such as a mouse, and the gene is preferably introduced at the fertilized egg stage at least 8 cell stages ago. The transgenic animals thus prepared may be usefully used for the search for carcinogenic substances or the gene inhibitors and anticancer substances.

본 발명은 또한 단백질 수준 및 유전자 수준의 위암 치료에 있어서 타겟 유전자로서 서열번호 1의 ZNF312b 유전자 및 타겟 단백질로서 서열번호 2의 ZNF312b 단백질을 제공한다.The present invention also provides a ZNF312b gene of SEQ ID NO: 1 as a target gene and a ZNF312b protein of SEQ ID NO: 2 as a target protein in the treatment of protein levels and gene levels of gastric cancer.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 ZNF312b 유전자에 대한 안티-센스 유전자와 siRNA(small interfering RNA)를 제공한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호 1의 발암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA와 결합하여 리보솜에 의한 해독과정을 저해할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 발암 유전자의 발현으로 인한 암을 치료할 수 있다. 또한 상기 ZNF312b 유전자의 siRNA는 21~30 뉴클레오티드의 RNA 조각으로 세포 내에 도입되면 다이써(Dicer)에 의해 인지되고 이는 세포 내에 존재하는 상기 유전자의 mRNA를 분해하게 되어 유전자의 발현을 저해하게 된다. 따라서, 본 발명 은 ZNF312b 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 위암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 ZNF312b 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The present invention also provides anti-sense genes and siRNAs (small interfering RNAs) for the ZNF312b gene which are effective for gene therapy. In the present invention, the "anti-sense gene" is a polynucleotide having a sequence complementary to some or all of the mRNA that is transcribed from the carcinogenic gene or a part thereof of SEQ ID NO: 1, by binding to the mRNA by ribosomes By introducing a DNA sequence having a sequence capable of inhibiting the translation process into the patient's body can be treated cancer caused by the expression of the carcinogenic gene. In addition, the siRNA of the ZNF312b gene is recognized by Dicer when introduced into the cell as an RNA fragment of 21-30 nucleotides, which degrades the mRNA of the gene present in the cell, thereby inhibiting the expression of the gene. Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of gastric cancer comprising at least one of an antisense gene and siRNA of ZNF312b gene and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier ie saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, in addition to at least one active ingredient of the antisense gene and siRNA of the ZNF312b gene Ethanol, liposomes and one or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants and buffers may be added as necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, and may act specifically on target organs. Target organ specific antibodies or other ligands may be used in combination with the carriers so as to be used. Furthermore, it may be preferably formulated according to each component by a suitable method in the art or by a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA).

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.5 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.The method of administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be parenterally or orally administered, such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or topical application, depending on the desired method. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient. The daily dosage is about 0.1 to 100 mg / kg for the compound and preferably 0.5 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.

본 발명의 조성물을 이용한 siRNA와 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자를 포함하는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들면, 문헌(J.S. Kim et al., J. Controlled Release, 53, 175-182(1998))의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥 투여한다.In siRNA and antisense gene therapy using the compositions of the invention, it is administered to a patient in a conventional manner comprising the antisense gene of the invention to inhibit the expression of carcinogenic genes. For example, antisense oligodeoxynucleotides (ODN) can be applied to poly-L-lysine derivatives and electrostatic attraction according to the method of JS Kim et al., J. Controlled Release , 53 , 175-182 (1998). By mixing, and the mixture is administered intravenously to the patient.

본 발명의 항암 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 안티센스 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.The anticancer composition of the present invention contains the antisense gene of the present invention as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or optionally other additives. The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but is preferably formulated as an injection.

또한, 본 발명의 ZNF312b 발암 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.In addition, it is possible to establish a continuously proliferating cell line having a reporter system using the promoter of the ZNF312b carcinogen of the present invention, and such cell lines can be usefully used for the anticancer drug search through the search for the small molecule material.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1: 종양 세포 배양 및 총  1: Tumor Cell Culture and Total RNARNA 의 분리Separation of

1-1. 종양 세포 배양1-1. Tumor cell culture

위암 세포에서 ZNF312b의 특이적 발현을 확인하고 상기 유전자의 기능을 확 인하기 위하여 위암 조직에서 확립된 SNU-638과 SNU-668 세포주를 배양하였다. 이 두 세포주는 1982년 한국 위암 환자로부터 확립된 것으로 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 본 실험을 위해 사용하였다.In order to confirm the specific expression of ZNF312b in gastric cancer cells and to confirm the function of the gene, SNU-638 and SNU-668 cell lines established in gastric cancer tissues were cultured. These two cell lines were established in 1982 by Korean gastric cancer patients. They were distributed by the Bank of Korea Cell Line and used for this experiment.

상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100㎎/㎖ 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/㎖ 엠피실린이 포함된 RPMI-1640(Hyclone, USA) 배지에서 배양되었다.The cell lines were cultured in RPMI-1640 (Hyclone, USA) medium containing 10% fetal bovine serum, 100 mg / ml streptomycin, and 100 IU / ml empicillin.

1-2. 총 1-2. gun RNARNA 분리 detach

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy Total RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 위암 환자로부터 얻은 조직에서 총 RNA를 추출하였다. DNA 오염원을 제거하기 위하여 DNase (Promega, USA)를 사용하였으며, 페놀-클로로포름 법에 의하여 총 RNA만을 정제하였다.Total RNA was extracted from tissue obtained from gastric cancer patients using a commercially available system, RNeasy Total RNA Kit (Qiagen Inc., Germany). DNase (Promega, USA) was used to remove DNA contaminants, and only total RNA was purified by phenol-chloroform method.

실시예Example 2:  2: 역전사Reverse transcription 효소 중합연쇄반응( Enzyme polymerase chain reaction reversereverse transcriptasetranscriptase -- PCRPCR ))

ZNF312b가 위암 특이적 발현 유전자임을 보이기 위하여 기존의 리앙과 파디에 의해 보고된 방법인 역전사 효소 중합연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 먼저, 실시예 1-2에서 얻은 총 RNA 1㎎에 올리고dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다. 이어서 생성된 cDNA를 1/20으로 희석한 후 희석된 cDNA 2㎕를 주형으로 하여 ZNF312b의 프라이머를 가지고 PCR을 수행하였다{정방향: 5'-CGAAGTGTGTGGAAAGGT-3'(서열번호 6), 역방향: 5'- AATACACGCGGGCTACAAAC-3'(서열번호 7)}. PCR 반응의 조건은 94℃ 45초, 58℃ 45초, 그리고 72℃ 45초를 반응시키며 이를 35회 반복한 후 최종 연장 시간으로 7분을 반응시켰다. 증폭된 산물은 1.2% 아가로즈 젤에 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 자외선을 조사하여 이미지 분석 장치로 확인하였다. 그 결과를 영상분석장치로 분석하여 정량화하였다. 대조군으로 B2M을 사용하여 시료 간의 차이를 보정하였다.In order to show that ZNF312b is a gastric cancer-specific expression gene, experiments were performed using reverse transcriptase polymerase chain reaction, a method reported by Liang and Paddy. First, reverse transcription reaction was performed using oligodT as a primer to 1 mg of total RNA obtained in Example 1-2. Subsequently, the resulting cDNA was diluted to 1/20, followed by PCR with a primer of ZNF312b using 2 µl of the diluted cDNA as a template (forward: 5'-CGAAGTGTGTGGAAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 6), reverse: 5'). AATACACGCGGGCTACAAAC-3 '(SEQ ID NO: 7)}. PCR reaction conditions were 94 ℃ 45 seconds, 58 ℃ 45 seconds, and 72 ℃ 45 seconds was reacted for 35 times and the final extension time for 7 minutes to react. The amplified product was electrophoresed in 1.2% agarose gel and stained with EtBr to irradiate ultraviolet rays and confirmed by an image analyzer. The results were quantified by analyzing with an image analyzer. B2M was used as a control to correct for differences between samples.

도 1a는 위암 환자들의 조직으로부터 ZNF312b의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 이는 도 1b를 정량화하여 나타낸 것이다. 도 1a에서 알 수 있듯이, ZNF312b는 위암 조직에서 과량으로 고발현됨이 확인되었다.Figure 1a shows the results of confirming the expression level of ZNF312b from the tissues of patients with gastric cancer, which shows a quantified Figure 1b. As can be seen in Figure 1a, it was confirmed that ZNF312b is excessively expressed in gastric cancer tissue.

실시예Example 3: 각종 발현벡터 제조 3: Preparation of various expression vectors

3-1. 3-1. ZNF312bZNF312b 발현 벡터의 제조 Preparation of Expression Vectors

인간 ZNF312b 유전자는 상기 위암 세포주에서 분리한 총 RNA를 PCR로 증폭한 후 pCGN 벡터에 클로닝하였다. 먼저 총 RNA를을 주형으로 하여 KpnI과 BamHI 제한 효소 인지부위를 포함한 ZNF312b 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 PCR 산물을 정제한 후 KpnI과 BamHI 제한효소로 자른 다음 pCGN 벡터에 삽입하여 pCGN-ZNF312b 발현벡터를 제조하였다.Human ZNF312b gene was cloned into pCGN vector after PCR amplification of total RNA isolated from the gastric cancer cell line. First, PCR was performed using ZNF312b primers including KpnI and BamHI restriction enzyme recognition sites using total RNA as a template. The resulting purified PCR product was cut with Kpn I and BamH I restriction enzymes and then inserted into the pCGN vector was prepared pCGN-ZNF312b expression vector.

3-2. 3-2. ZNF312bZNF312b shsh (( smallsmall hairpinhairpin ) ) RNARNA 발현 벡터의 제조 Preparation of Expression Vectors

ZNF312b의 발현을 억제하여 상기 유전자의 기능을 살펴보기 위하여 ZNF312b shRNA를 발현하는 벡터를 제조하였다. ZNF312b shRNA를 제조하기 위하여 pSilencer4.1-CMVneo (Ambion, USA) 벡터에 ZNF312b shRNA 서열을 포함한 si- ZNF312b-1 올리고머(서열번호 3)를 삽입하여 pSilent-ZNF312b 벡터를 제조하였다.In order to examine the function of the gene by inhibiting the expression of ZNF312b, a vector expressing ZNF312b shRNA was prepared. In order to prepare ZNF312b shRNA, pSilent-ZNF312b vector was prepared by inserting si-ZNF312b-1 oligomer (SEQ ID NO: 3) including ZNF312b shRNA sequence into pSilencer4.1-CMVneo (Ambion, USA) vector.

si-ZNF312b-1 (서열번호 3) : 5'-GCA CUC UCU GCA UCU CAA C -3'si-ZNF312b-1 (SEQ ID NO: 3): 5'-GCA CUC UCU GCA UCU CAA C -3 '

실시예Example 4: 각종 발현벡터 형질전환 위암 세포주의 확립 4: Establishment of various expression vector transformed gastric cancer cell lines

4-1. 4-1. ZNF312bZNF312b 과발현 위암 세포주의 확립 Establishment of Overexpressed Gastric Cancer Cell Lines

상기 유전자의 기능을 규명하기 위하여 실시예 3-1에서 제조된 벡터 pCGN-ZNF312b를 위암 세포주인 SNU-638과 SNU-668에 트랜스펙션시켜 ZNF312b 과발현 세포주인 SNU638-ZNF312b와 SNU668-ZNF312b를 각각 확립하였다.In order to elucidate the function of the gene, the vector pCGN-ZNF312b prepared in Example 3-1 was transfected into gastric cancer cell lines SNU-638 and SNU-668 to establish ZNUF312b overexpressing cell lines SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b, respectively. It was.

먼저, 과발현 세포주를 확립하기 위하여 두 위암 세포주 SNU-638과 SNU-668 세포에 Fugene-6(Roche, 독일)를 사용하여 각각 pCGN-ZNF312b를 트랜스펙션하였다. 상기 유전자가 발현되는 세포주만을 선택하기 위하여 선별 마커인 G418을 600㎍/㎖이 되게 배양액에 넣어 주었다. 또한 단일 클론을 가진 세포주를 얻기 위하여 콜로니 선별을 하였다. 이를 위해 G418 배지를 3일 간격으로 교환하였다. 형성된 콜로니를 선택하여 세포수를 늘려 동결보관하고 일부는 상기 유전자의 발현 확인을 위해 RNA 추출 또는 단백질 추출을 위해 사용되었다. 도 3c, 도 3d와 같이, 형질 전환된 위암 세포주인 SNU638-ZNF312b와 SNU668-ZNF312b를 확립하였다. 상기 유전자의 과발현이 확인된 세포주는 다량으로 배양하여 동결보관용과 기능 규명용으로 사용하였다.First, in order to establish an overexpressed cell line, two gastric cancer cell lines SNU-638 and SNU-668 cells were transfected with pCGN-ZNF312b using Fugene-6 (Roche, Germany), respectively. In order to select only the cell line in which the gene is expressed, G418, a selection marker, was added to the culture medium at 600 µg / ml. In addition, colonies were screened to obtain cell lines with monoclones. For this, G418 medium was exchanged every three days. Selected colonies were selected to increase cell number for cryopreservation and some were used for RNA extraction or protein extraction to confirm expression of the gene. As shown in Figure 3c, 3d, the transformed gastric cancer cell lines SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b were established. Cell lines in which the overexpression of the gene was confirmed were cultured in large quantities and used for cryopreservation and function identification.

4-2. 4-2. ZNF312bZNF312b 억제 위암 세포주의 확립 Establishment of Inhibiting Gastric Cancer Cell Lines

상기 유전자의 기능을 규명하기 위하여 실시예 3-2에서 제조된 벡터 pSilent-ZNF312b를 위암 세포주인 SNU-668에 트랜스펙션시켜 ZNF312b 억제 세포주인 SNU668-shZNF312b를 확립하였다.In order to elucidate the function of the gene, the vector pSilent-ZNF312b prepared in Example 3-2 was transfected into SNU-668, a gastric cancer cell line, to establish SNU668-shZNF312b, a ZNF312b inhibitory cell line.

먼저, 억제 세포주를 확립하기 위하여 위암 세포주 SNU-668 세포에 Fugene-6 (Roche, 독일)를 사용하여 각각 pSilent-ZNF312b를 트랜스펙션하였다. 상기 유전자가 발현되는 세포주만을 선택하기 위하여 선별 마커인 G418을 600㎍/㎖이 되게 배양액에 넣어 주었다. 또한 단일 클론을 가진 세포주를 얻기 위하여 콜로니 선별을 하였다. 이를 위해 G418 배지를 3일 간격으로 교환하였다. 형성된 콜로니를 선택하여 세포수를 늘려 동결보관하고 일부는 상기 유전자의 발현 확인을 위해 RNA 추출 또는 단백질 추출용으로 사용되었다. 도 2b와 같이, 형질 전환된 위암 세포주인 SNU668-shZNF312b를 확립하였다. 상기 유전자의 억제가 확인된 세포주는 다량으로 배양하여 동결보관용과 기능 규명용으로 사용되었다.First, to establish an inhibitory cell line, gastric cancer cell line SNU-668 cells were transfected with pSilent-ZNF312b using Fugene-6 (Roche, Germany), respectively. In order to select only the cell line in which the gene is expressed, G418, a selection marker, was added to the culture medium at 600 µg / ml. In addition, colonies were screened to obtain cell lines with monoclones. For this, G418 medium was exchanged every three days. Selected colonies were selected to increase cell number for cryopreservation and some were used for RNA extraction or protein extraction to confirm expression of the gene. As shown in Figure 2b, the transformed gastric cancer cell line SNU668-shZNF312b was established. The cell line confirmed the inhibition of the gene was cultured in a large amount was used for cryopreservation and function identification.

실시예Example 5: 세포증식 실험 5: Cell Proliferation Experiment

5-1. 5-1. ZNF312bZNF312b 유전자의 발현 억제에 의한 세포증식  Cell proliferation by suppressing gene expression

ZNF312b 유전자의 발현 억제에 의한 위암 세포주의 세포 증식능을 조사하기 위하여, ZNF312b의 염기서열 (서열번호 1) 중에서 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 세 종류의 siRNA(서열번호 3~5)를 제작하였으며 이것에 의해 ZNF312b 유전자의 발현 저해능을 도 2a에 나타내었다. 도 2a와 같이 si-ZNF312b-1의 저해능이 가장 높은 것으로 조사되어 이를 ZNF312b 유전자의 일시적인 발현 저해 실험에 사용하였 다. 또한, 지속적인 상기 유전자의 발현 억제를 유도하기 위하여 실시예 3-2에서 제조한 SNU668-shZNF312b 세포주에서 총 RNA를 추출하여 발현 저해정도를 확인한 결과, ZNF312b 유전자가 억제됨이 확인되었고(도 2b), 이를 ZNF312b 유전자의 지속적인 억제 실험에 사용하였다.In order to investigate the cell proliferation ability of gastric cancer cell lines by suppressing the expression of ZNF312b gene, three kinds of siRNAs (SEQ ID NOs: 3 to 5) consisting of 19 nucleotides were prepared from the base sequence (SEQ ID NO: 1) of ZNF312b. Expression inhibition of the gene is shown in Figure 2a. As shown in FIG. 2A, si-ZNF312b-1 was found to have the highest inhibitory ability, and was used for transient inhibition of ZNF312b gene expression. In addition, as a result of confirming the expression inhibition by extracting the total RNA from the SNU668-shZNF312b cell line prepared in Example 3-2 in order to induce continuous expression of the gene, it was confirmed that the ZNF312b gene is inhibited (Fig. 2b), It was used in the continuous suppression experiment of ZNF312b gene.

세포증식 실험은 CCK-8 (Dojindo, Japan) 시약을 이용하여 수행하였으며, 이는 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)을 이용하는 방법으로 세포 내에 존재하는 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 친수성의 포마잔(formazan)으로 전환되는 것을 측정하여 세포증식 여부를 판단하는 것이다. 도 3a에는 일시적으로 상기 ZNF312b 유전자의 발현을 저해하였을 때 세포증식이 감소함을 보여주고 있으며, 도 3b는 지속적으로 상기 유전자를 저해하는 세포주를 이용하여 세포증식 실험을 수행한 것으로 세포증식이 대조군에 비해 감소함을 알 수 있다.Cell proliferation experiments were carried out using CCK-8 (Dojindo, Japan) reagent, which is a hydrophilic formazan by dehydrogenase present in the cells by means of tetrazolium salt. The conversion is measured to determine cell proliferation. 3A shows that cell proliferation decreases when the expression of the ZNF312b gene is temporarily inhibited. FIG. 3B shows that cell proliferation experiments were carried out using cell lines that continuously inhibit the gene. It can be seen that the decrease.

si-ZNF312b-1 (서열번호 3) : 5'-GCA CUC UCU GCA UCU CAA C -3'si-ZNF312b-1 (SEQ ID NO: 3): 5'-GCA CUC UCU GCA UCU CAA C -3 '

si-ZNF312b-2 (서열번호 4) : 5'-GUG UGU GGA AAG GUC UUU A -3'si-ZNF312b-2 (SEQ ID NO: 4): 5'-GUG UGU GGA AAG GUC UUU A -3 '

si-ZNF312b-3 (서열번호 5) : 5'-GCA GUU CAA GUG CAA UAU C -3'si-ZNF312b-3 (SEQ ID NO: 5): 5'-GCA GUU CAA GUG CAA UAU C -3 '

5-2. 5-2. ZNF312bZNF312b 유전자의 과발현에 의한 세포증식 Cell proliferation due to overexpression of genes

실시예 4에서 확립된 세포주인 SNU638-ZNF312b와 SNU668-ZNF312b를 이용하여 상기 유전자의 과발현을 통한 위암세포주의 세포 증식능을 조사하였다. 세포 증식실험은 실시예 5-1과 같은 CCK-8 시약을 사용하여 수행하였으며, 세포(5 X 103 개) 를 96 웰 플레이트에 넣고 24시간 동안 배양한 후, 24시간 간격으로 세포증식 실험을 수행하였다. 도 3c는 SNU638-ZNF312b를, 도 3d는 SSNU668-ZNF312b를 사용하여 세포 증식 실험을 수행한 결과를 나타낸 것으로 상기 유전자의 과발현이 세포 증식을 증가시켰다.SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b, the cell lines established in Example 4, were used to investigate the cell proliferation capacity of gastric cancer cell lines through overexpression of the gene. Cell proliferation experiments were carried out using the same CCK-8 reagents as in Example 5-1. Cells (5 X 10 3 cells) were placed in 96 well plates and incubated for 24 hours, followed by cell proliferation experiments at 24 hour intervals. Was performed. 3c shows the results of cell proliferation experiments using SNU638-ZNF312b and FIG. 3d using SSNU668-ZNF312b. Overexpression of the gene increased cell proliferation.

과발현 세포주를 이용한 세포증식 실험 결과 역시 실시예 5-1과 마찬가지로 세포증식에 영향을 주고 있음을 확인할 수 있었다.As a result of the cell proliferation experiment using the overexpressed cell line, it could be confirmed that the cell proliferation was affected as in Example 5-1.

실시예Example 6: 세포주기 실험 6: cell cycle experiment

세포 증식의 또 다른 측정법인 세포주기를 이용한 방법을 사용하여 상기 유전자의 세포증식 관련성을 규명 조사하였다.Another method of cell proliferation, the cell cycle method, was used to investigate the cell proliferation of the gene.

세포주기 실험은 PI 염색법을 이용하여 수행하였다. PI는 핵을 염색하는 방법으로써, 각 세포들을 24시간 동안 배양한 후 70% 에탄올로 4℃에서 12시간 이상 고정시킨 후 PI로 염색하여 FACS 분석기를 이용하여 측정하였다. 측정 결과는 도 4a 와 b로 나타냈으며, 도 4a는 일시적으로 상기 유전자의 발현을 저해한 경우로 대조군에 비해 상기 유전자의 발현이 저해되었을 때 G1기가 증가되고 G2+M 시기가 감소하여 세포증식이 감소하였으며, 도 4b는 상기 유전자를 과발현한 경우로 저해한 경우와 반대로 G1기가 감소하고 G2+M 시기가 증가함에 따라 세포증식율이 증가됨이 확인되었다.Cell cycle experiments were performed using PI staining. PI is a method of staining the nucleus. Each cell was incubated for 24 hours, and then fixed with at least 4 hours at 4 ° C. with 70% ethanol, and then stained with PI and measured using a FACS analyzer. The measurement results are shown in Figures 4a and b, Figure 4a is a case of temporarily inhibiting the expression of the gene compared to the control group when the expression of the gene is inhibited compared to the increase in the G1 phase and G2 + M period decreases cell growth 4b shows that the cell proliferation rate increased as the G1 phase decreased and the G2 + M phase increased as opposed to the case of overexpressing the gene.

세포 주기를 이용한 세포 증식 실험 또한 실시예 5와 마찬가지로 상기 유전자의 억제/과발현에 의해 세포증식의 억제/활성이 확인되어 본 유전자가 세포증식 과 관련 있음이 확인되었다.Cell proliferation experiment using the cell cycle In addition, the inhibition / activity of cell proliferation was confirmed by the inhibition / overexpression of the gene as in Example 5, confirming that this gene is related to cell proliferation.

실시예Example 7:  7: 콜로니Colony 형성 실험 Formation experiment

상기 ZNF312b 유전자의 발암 유전자로써의 기능을 확인하기 위하여 콜로니 형성 실험을 수행하였다. 콜로니 형성실험(clonogenic assay)은 세포성장 특성 및 약제에 대한 세포의 반응성을 조사하는 목적으로 사용된다. 콜로니 형성 실험은 부드러운 한천(soft-agar)을 사용하여 세포의 콜로니 형성 효율을 측정했다.Colony formation experiments were performed to confirm the function of the ZNF312b gene as a carcinogenic gene. Colony assays are used to examine cell growth characteristics and cell responsiveness to drugs. Colony formation experiments measured the efficiency of colony formation in cells using soft agar.

45℃의 2배 농도의 RPMI1640 배지와 1.2% 아가로스 용액을 동량씩 섞어 0.6%의 1X 배지를 만들어 6웰 플레이트에 넣고 굳힌다. 한 시간 동안 굳힌 후, 5000개의 세포를 0.5㎖ 배지에 희석하여 동량의 0.6% 아가로스와 섞어 0.6%의 아가로스 평판 위에 넣어 준다. 상온에서 한 시간 동안 굳힌 후, 1X 배지를 넣고, 37℃ 배양기에서 배양하면서 콜로니의 형성을 관찰했다. 형성된 콜로니는 100배율 현미경하에서 관찰하여 계수하여 도식화하였다. 도 5a는 ZNF312b 위암 억제세포주인 SNU668-shZNF312b를 사용하여 상기 유전자를 저해한 후 콜로니 형성을 관찰한 것이며, 도 5b는 상기 유전자를 과발현 위암세포주인 SNU638-ZNF312b와 SNU668-ZNF312b를 이용하여 콜로니 형성실험을 수행한 것이다. 그 결과 상기 유전자를 저해하였을 때는 콜로니 형성이 저해되었으며, 상기 유전자를 과발현시켰을 때는 콜로니 형성이 증가하였다. 이로써 상기 유전자는 위암 종양 형성능을 보유하고 있음이 확인되었다.Mix twice the same amount of RPMI1640 medium and 1.2% agarose solution at 45 ° C. to make 0.6% 1X medium and place in a 6-well plate. After solidification for one hour, 5000 cells are diluted in 0.5 ml medium and mixed with an equal amount of 0.6% agarose and placed on a 0.6% agarose plate. After solidifying for 1 hour at room temperature, 1X medium was added, and the formation of colonies was observed while culturing in a 37 ° C incubator. Colonies formed were observed and counted and plotted under a 100x microscope. 5A shows the colony formation after inhibiting the gene using SNU668-shZNF312b, a ZNF312b gastric cancer suppressor cell line, and FIG. 5B shows colony formation experiments using the SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b overexpressed genes. Will be done. As a result, colony formation was inhibited when the gene was inhibited, and colony formation was increased when the gene was overexpressed. As a result, the gene has been confirmed to possess gastric cancer tumor-forming ability.

실시예Example 8: 종양 형성 실험 8: Tumor Formation Experiment

ZNF312b 유전자의 발암 유전자로서의 기능을 확인하기 위하여 누드 마우스를 이용한 종양 형성 실험을 수행하였다. 누드마우스 종양 형성(tumorigenicity) 실험은 T 림프구의 분할이 거의 일어나지 않는 누드마우스를 이용하여 마우스 표피에 종양 세포주를 이식하여 종양의 형성 여부를 관찰하는 실험이다. 실시예 4-1에서 확립된 SNU668-ZNF312b 세포주와 대조군인 SNU668-Neo 세포주를 누드 마우스에 각각 이식하여 종양 형성을 관찰하였다. 본 실시예의 실험군은 각 3 마리의 누드마우스에 각 세포주를 5 x 105의 세포를 접종하였다. 접종 4주 후 각각의 종양 크기를 측정하여 수치화하여 비교하였다. 종양 크기는(mm3) 넓이 x 높이 / 2 의 공식을 사용하여 수치화하였다. 도 6은 종양 형성 실험의 결과를 나타낸 것으로 상기 유전자의 과발현 세포주인 SNU668-ZNF312b를 이식한 누드마우스의 종양 크기가 현저히 커져 있음을 확인할 수 있다.Tumor formation experiments were performed using nude mice to confirm the function of ZNF312b gene as a carcinogenic gene. Nude mouse tumorigenicity (tumorigenicity) experiment is a test to observe the tumor formation by implanting the tumor cell line in the mouse epidermis using a nude mouse that hardly split T lymphocytes. Tumor formation was observed by implanting the SNU668-ZNF312b cell line established in Example 4-1 and the control SNU668-Neo cell line into nude mice, respectively. The experimental group of this example was inoculated with 5 x 10 5 cells of each cell line to each of three nude mice. Four weeks after inoculation each tumor size was measured and quantified and compared. Tumor size (mm 3 ) was quantified using the formula width x height / 2. Figure 6 shows the results of the tumor formation experiments, it can be seen that the tumor size of nude mice transplanted with SNU668-ZNF312b, the overexpressing cell line of the gene, is significantly larger.

본 발명의 ZNF312b 유전자는 기존의 보고된 발암 유전자들과는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규유전자로 위암의 진단 및 치료의 마커로서 위암의 진단, 형질 전환 세포주와 동물의 제조, 안티-센스(anti-sense), siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 위암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.The ZNF312b gene of the present invention is a novel gene that shows no homology with existing reported oncogenic genes. As a marker for diagnosis and treatment of gastric cancer, the diagnosis of gastric cancer, preparation of transformed cell lines and animals, and anti-sense , gene therapy using siRNA (small interfering RNA), and can be effectively used for the development of gastric cancer-specific anticancer agent.

도 1은 인간 위암 환자로부터 얻은 총 RNA를 이용하여 ZNF312b 유전자에 대한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과(도 1a와 1b)를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of real-time RT-PCR for the ZNF312b gene using the total RNA obtained from human gastric cancer patients (Fig. 1a and 1b).

도 2는 ZNF312b의 siRNA(도 2a)와, 이 중 si-ZNF312b-1 서열을 이용하여 제작된 벡터인 shZNF312b를 도입하여 확립된 위암 세포주인 SNU668-shZNF312b (도 2b) 및 과발현 벡터 ZNF312b를 이용하여 확립된 위암 세포주인 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b (도 2c)에서의 상기 유전자의 발현을 나타내고 있다. 이는 ZNF312b의 발암 유전자로써의 기능을 규명하기 위하여 사용되었다.Figure 2 using the siRNA of ZNF312b (Fig. 2a), and the stomach cancer cell line SNU668-shZNF312b (Fig. 2b) and overexpression vector ZNF312b established by introducing shZNF312b, a vector produced using the si-ZNF312b-1 sequence Expression of these genes in established gastric cancer cell lines SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b (FIG. 2C) is shown. It was used to characterize ZNF312b as a carcinogenic gene.

도 3은 상기 유전자의 세포증식 실험 결과를 나타낸 것으로 상기 유전자의 세포증식 기능 관련성을 나타낸다. 도 3a는 ZNF312b의 si-ZNF312b-1 올리고머를 위암 세포주인 SNU668에 도입한 후의 세포증식 결과를 나타낸 것이며, 3b는 ZNF312b의 억제 세포주인 SNU668-shZNF312b의 세포증식 결과를 나타낸 것이며, 3c와 d는 ZNF312b의 과발현 세포주인 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b의 세포증식 실험 결과를 나타낸 것이다. 실험결과는 유의성 검사를 통해 결과의 신뢰성을 확인하였으며, 이는 P value 0.05 이하는 95%의 신뢰도를 갖는 것으로 “ * ”로, 0.01 이하는 99%의 신뢰도를 갖는 것으로 “**”로, 0.001 이하는 99.9%의 신뢰도를 갖는 것으로 “***”로 그림에 나타내었다. 이는 신뢰성이 요구되는 실험에 공통적으로 적용되어 도면에 나타내었다.Figure 3 shows the results of the cell proliferation experiment of the gene showing the relationship between the cell proliferation function of the gene. Figure 3a shows the cell proliferation results after the introduction of si-ZNF312b-1 oligomer of ZNF312b into SNU668, gastric cancer cell line, 3b shows the cell proliferation results of SNU668-shZNF312b, an inhibitory cell line of ZNF312b, 3c and d is ZNF312b The results of cell proliferation experiments of SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b overexpressed cell lines. The test result was verified by the significance test. The P value of 0.05 or less has 95% of confidence, and the 0.01 or less of 99% of confidence has “**” and less than 0.001. Has 99.9% reliability and is shown as “***”. This is commonly applied to experiments requiring reliability, and is shown in the drawings.

도 4는 상기 유전자의 세포주기 실험 결과를 나타낸 것으로 PI 염색법을 이용하여 DNA를 염색한 후 세포분석기를 이용하여 측정하였다. 도 4a는 ZNF312b의 si-ZNF312b-1을 위암 세포주인 SNU668에 도입한 후의 세포주기 결과를 나타낸 것이다. 그림은 세포분석기를 통해 분석된 세포주기를 나타내고 있으며, 분석된 세포주기는 세포증식율(G2+M+S기의 세포수/ 전체 세포수 X 100)로 계산하여 아래 그래프로 나타내었다. 4b는 ZNF312b의 과발현 세포주인 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b의 세포주기 실험 결과를 나타낸 것이다.Figure 4 shows the cell cycle test results of the gene was measured using a cytometer after staining the DNA using PI staining method. Figure 4a shows the cell cycle results after the introduction of si-ZNF312b-1 of ZNF312b into SNU668, a gastric cancer cell line. The figure shows the cell cycle analyzed by the cell analyzer, and the analyzed cell cycle is shown in the graph below by calculating the cell growth rate (cell count of G2 + M + S phase / total cell count × 100). 4b shows the results of cell cycle experiments of SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b overexpressing ZNF312b cell lines.

도 5는 상기 유전자의 종양 형성능을 알아보기 위하여 실시한 실험으로 콜로니 형성실험 결과를 나타낸 것으로 soft-agar를 이용하여 콜로니 형성 효율을 측정한 실험이다. 도 5a는 ZNF312b의 억제 세포주인 SNU668-shZNF312b의 콜로니 형성 결과를 나타낸 것이며, 5b는 ZNF312b의 과발현 세포주인 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b의 콜로니 형성 실험 결과를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the results of colony formation experiments by experiments conducted to determine the tumor formation ability of the gene is an experiment measuring the colony formation efficiency using soft-agar. 5A shows the colony formation results of SNU668-shZNF312b, an inhibitory cell line of ZNF312b, and 5b shows the colony formation experiments of SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b, which are overexpressing cell lines of ZNF312b.

도 6은 ZNF312b의 과발현 세포주인 SNU668-ZNF312b를 누드마우스에 이식하여 종양 형성능 실험을 수행한 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the results of tumor formation ability test by transplanting the SNU668-ZNF312b overexpressed cell line of ZNF312b in nude mice.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A GASTRIC CARCINOMA GENE ZNF312b, A PROTEIN TRANSLATED FROM THE GENE AND A DIAGNOSTIC KIT USING THE SAME <130> KRIBB0708-NSK2 <150> KR 2007-78585 <151> 2007-08-06 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2026 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cagtagctgc cacaacgcga ctaccaaaat gttagcgact gctccagctc ggggcaacat 60 gatgagcacg tccaaaccct tggctttctc cattgaacga atcatggcgc gcaccccaga 120 gcccaaggcc ctgccagtcc cccacttcct gcagggagcc ttacccaagg gggaacccaa 180 gcactctctg catctcaact cgtcgatccc ctgcatgatc cccttcgtgc ctgtggccta 240 cgacacgagc cccaaggcag gagtgacggg ctccgagccg cggaaggcca gtctggaggc 300 cccggcggcg cccgcggcgg tgccctcggc tcccgcattc agctgcagcg acctgctcaa 360 ctgcgcactg agtctcaagg gcgacctggc ccgcgacgcg ctgccgctgc agcagtacaa 420 gctggtaagg ccgcgtgtgg tcaaccactc ttcattccac gccatgggcg ccttgtgcta 480 cctgaaccga ggtgacggcc catgccaccc ggcagccggc gtgaacatcc acccggtggc 540 ctcctacttc ctcagttccc ctttgcaccc gcagccaaaa 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Tyr Phe Leu Ser Ser Pro Leu His Pro Gln Pro Lys Thr Tyr                 165 170 175 Leu Ala Glu Arg Asn Lys Leu Val Val Pro Ala Val Glu Lys Tyr Pro             180 185 190 Ser Gly Val Ala Phe Lys Asp Leu Ser Gln Ala Gln Leu Gln His Tyr         195 200 205 Met Lys Glu Ser Ala Gln Leu Leu Ser Glu Lys Ile Ala Phe Lys Thr     210 215 220 Ser Asp Phe Ser Arg Gly Ser Pro Asn Ala Lys Pro Lys Val Phe Thr 225 230 235 240 Cys Glu Val Cys Gly Lys Val Phe Asn Ala His Tyr Asn Leu Thr Arg                 245 250 255 His Met Pro Val His Thr Gly Ala Arg Pro Phe Val Cys Lys Val Cys             260 265 270 Gly Lys Gly Phe Arg Gln Ala Ser Thr Leu Cys Arg His Lys Ile Ile         275 280 285 His Thr Gln Glu Lys Pro His Lys Cys Asn Gln Cys Gly Lys Ala Phe     290 295 300 Asn Arg Ser Ser Thr Leu Asn Thr His Thr Arg Ile His Ala Gly Tyr 305 310 315 320 Lys Pro Phe Val Cys Glu Phe Cys Gly Lys Gly Phe His Gln Lys Gly                 325 330 335 Asn Tyr Lys Asn His Lys Leu Thr His Ser Gly Glu Lys Gln Phe Lys             340 345 350 Cys Asn Ile Cys Asn Lys Ala Phe His Gln Val Tyr Asn Leu Thr Phe         355 360 365 His Met His Thr His Asn Asp Lys Lys Pro Phe Thr Cys Pro Thr Cys     370 375 380 Gly Lys Gly Phe Cys Arg Asn Phe Asp Leu Lys Lys His Val Arg Lys 385 390 395 400 Leu His Asp Ser Ser Leu Gly Leu Ala Arg Thr Pro Ala Gly Glu Pro                 405 410 415 Gly Thr Glu Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gln Gln Pro Pro Met Thr Leu             420 425 430 Pro Pro Leu Gln Pro Pro Leu Pro Thr Pro Gly Pro Leu Gln Pro Gly         435 440 445 Leu His Gln Gly His Gln     450 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcacucucug caucucaac 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 guguguggaa aggucuuua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcaguucaag ugcaauauc 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 6 cgaagtgtgt ggaaaggt 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 7 aatacacgcg ggctacaaac 20  

Claims (18)

ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 위암 마커 진단 키트.Gastric cancer marker diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds ZNF312b protein. 제1항에 있어서, The method of claim 1, 정상 대조군과 비교하여 ZNF312b 단백질 양의 증가로 위암을 진단하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.Gastric cancer marker diagnostic kit, characterized in that the diagnosis of gastric cancer by increasing the amount of ZNF312b protein compared to the normal control. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.The kit is a gastric cancer marker diagnostic kit, characterized in that the kit for ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay). ZNF312b mRNA를 정량적으로 검출하는 위암 마커 진단 키트.Gastric cancer marker diagnostic kit for quantitative detection of ZNF312b mRNA. 제4항에 있어서,The method of claim 4, wherein mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.The mRNA quantitative detection method is a gastric cancer marker diagnostic kit, characterized in that selected from RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RNase protection assay), Northern blotting and DNA chip. 제4항에 있어서,The method of claim 4, wherein ZNF312b mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 6 또는 7 중 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.Gastric cancer marker diagnostic kit, characterized in that it comprises one or more nucleotides of SEQ ID NO: 6 or 7 specifically binding to ZNF312b mRNA. 제4항에 있어서,The method of claim 4, wherein ZNF312b mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 진단 키트.Gastric cancer marker diagnostic kit comprising a cDNA preparation primer, a reverse transcriptase, Taq polymerase, PCR primer, dNTP corresponding to ZNF312b mRNA. ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 위 조직, 위 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 위암 마커 검출 방법.A method of detecting gastric cancer markers comprising contacting an antibody specifically binding to ZNF312b protein with a biological sample selected from gastric tissue, gastric cells, urine, blood, serum and plasma. 제8항에 있어서,The method of claim 8, a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;a) providing a biological sample for analysis; b) 상기 시료와 ZNF312b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;b) contacting said sample with an antibody that specifically binds ZNF312b protein; c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및c) quantitatively detecting the antigen-antibody complex; And d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 마커 검출 방법.d) comparing the detection result of the step c) with a normal control; gastric cancer marker detection method comprising a. 서열번호 1의 ZNF312b 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터.A transformation vector comprising a ZNF312b carcinogenic gene of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof. 제10항의 벡터에 의해 형질전환된 동물 세포주.Animal cell line transformed with the vector of claim 10. 제11항에 있어서, 상기 형질전환된 동물 세포주는 SNU638-ZNF312b 및 SNU668-ZNF312b인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.12. The animal cell line of claim 11, wherein said transformed animal cell lines are SNU638-ZNF312b and SNU668-ZNF312b. 서열번호 1의 ZNF312b 위암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.An anti-sense gene having a sequence complementary to all or a portion of the sequence of mRNA transcribed from ZNF312b gastric carcinogenic gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1, which binds to the mRNA and inhibits expression of the carcinogenic gene or fragment. 서열번호 1의 ZNF312b 위암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 ZNF312b 위암 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA(Small intefering RNA) 서열.SiRNA having a sequence complementary to all or part of the sequence of mRNA transcribed from the ZNF312b gastric carcinogen gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 1 and recognized by Dicer protein to inhibit the expression of the ZNF312b gastric carcinogen gene ( Small intefering RNA) sequence. 제14항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 3 내지 5번 중 하나인 것을 특징으로 하는 siRNA 서열.The siRNA sequence of claim 14, wherein the sequence is one of SEQ ID NOs: 3 to 5. 15. ZNF312b 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 ZNF312b 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 억제제의 스크리닝 방법.A method of screening a gastric cancer inhibitor, comprising binding a test compound to a ZNF312b protein and confirming that the test compound promotes or inhibits the action of the ZNF312b protein. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 타겟 유전자 ZNF312b.ZNF312b, a target gene for gastric cancer treatment, having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 타겟 ZNF312b 단백질.Stomach cancer target ZNF312b protein, characterized in that it has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
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