KR102199000B1 - A novel biomarker for diagnosing liver cancer - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 간암 진단을 위한 신규 바이오마커 조성물, 이를 이용한 간암의 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel biomarker composition for diagnosing liver cancer, and a method for diagnosing liver cancer using the same.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 간암, 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다. Cancer has a high mortality rate worldwide, and is the most common cause of death after cardiovascular disease in Western society. In particular, lung cancer is increasing due to an increase in the smoking population and air pollution along with the aging of the population, and the intake of high-fat diets has become common due to the westernization of dietary life, and liver cancer and colon cancer due to a rapid increase in environmental pollutants and an increase in alcohol consumption. , Breast cancer, prostate cancer, etc. are on a continuous increase. In this situation, the creation of anticancer substances that can contribute to the promotion of human health, improvement of healthy quality of life, and improvement of human health by enabling early prevention and treatment of cancer is urgently required.
그 중에서도 간암은 한국인 남성에서 4위, 그리고 여성에서 6위를 차지하는 암으로써 국내 전체 암 사망자 중 약 22% 이상 (2015년 기준)을 차지하는 대표적인 고위험 한국인 호발암이다. 또한, 환자 1명당 치료비용이 약 6,622만원으로 한국인 호발암 중 가장 많은 치료비용이 필요하며 사회·경제적 의료 부담을 증가시키는 주요 질환에 해당한다. 간암은 바이엘사의 넥사바(Nexavar)가 현재 유일한 치료제인데 연평균 10% 이상의 고성장을 통해 연간 1조 2천억원의 시장을 형성하고 있다. Among them, liver cancer is a cancer that ranks fourth among Korean men and sixth among women. It is a representative high-risk Korean predominant cancer, accounting for more than 22% of all cancer deaths in Korea (as of 2015). In addition, the treatment cost per patient is about 66.2 million won, which is the most common cancer among Koreans, and is a major disease that increases the socio-economic medical burden. Bayer's Nexavar is currently the only treatment for liver cancer, and it is forming a market of 1.2 trillion won per year through high growth of over 10% per year.
간암의 진단은 뚜렷한 고위험군에 대한 감시 검사로 주로 진행되었으나 국내에서 간암으로 진단받은 환자 중 검진에 의해 발견되는 경우가 50%에 미치지 못한다. 현재까지 간암 진단을 위해 AFP와 PIVKA II 단백질을 이용한 바이오마커 개발이 진행되었으나 간암 환자별 치료 효과 및 예후를 예측할 수 있는 고성능 바이오마커 및 진단시스템 개발은 부진한 상태이다. 또한, 최근 TCGA (The Cancer Genome Atlas)와 같은 대규모 암유전체 프로젝트에서 암에 대한 대규모 유전체/전사체/후성유전체 분석을 수행하여 다수의 유전체/전사체/후성유전체 변이를 보고하고 새로운 분자아형들을 제시하고 있으나, 간암 환자 예후와 연관성 있는 바이오마커는 아직까지 체계적으로 개발되어 있지 않은 상태이다. The diagnosis of liver cancer was mainly carried out as a surveillance test for a clear high-risk group, but less than 50% of patients diagnosed with liver cancer in Korea were detected by examination. To date, biomarkers using AFP and PIVKA II proteins have been developed for diagnosis of liver cancer, but development of high-performance biomarkers and diagnostic systems that can predict the treatment effect and prognosis for each liver cancer patient is in a state of sluggishness. In addition, in recent large-scale cancer genome projects such as TCGA (The Cancer Genome Atlas), large-scale genome/transcriptome/epigenetic analysis on cancer was performed to report multiple genome/transcriptome/epigenetic mutations and propose new molecular subtypes. However, biomarkers that are related to the prognosis of liver cancer patients have not been systematically developed.
한편, 인간 게놈의 약 90%에서 RNA polymerase에 의한 전사가 일어나며 대부분의 RNA는 단백질을 암호화하지 않는 noncoding RNA이다. 이러한 noncoding RNA는 길이 및 기능에 따라 분류되며, transfer RNA, ribosomal RNA, miRNA, siRNA, 그리고 long noncoding RNA (lncRNA)의 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 새로운 noncoding RNA의 한 종류로서, 활성화된 enhancer에서 만들어지는 enhancer RNA (eRNA)의 존재가 밝혀졌다. eRNA는 길이와 만들어지는 방식에 따라 1D(unidirectional) eRNA와 2D(bidirectional) eRNA로 구분이 된다. 최근 활발히 연구되고 있는 lncRNA와 달리 5' capping은 일어나지만 splicing이나 polyadenylation은 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. On the other hand, transcription by RNA polymerase occurs in about 90% of the human genome, and most RNAs are noncoding RNAs that do not encode proteins. These noncoding RNAs are classified according to their length and function, and studies on the functions of transfer RNA, ribosomal RNA, miRNA, siRNA, and long noncoding RNA (lncRNA) are actively being conducted. Recently, as a type of new noncoding RNA, the existence of enhancer RNA (eRNA) produced by activated enhancer has been revealed. eRNAs are classified into 1D (unidirectional) eRNA and 2D (bidirectional) eRNA depending on the length and the way they are made. Unlike lncRNA, which has been actively studied recently, it is known that 5'capping occurs but no splicing or polyadenylation occurs.
따라서, 간암 세포주, 환자 유래의 조직 및 오가노이드를 기반으로 한국인 간암 특이적 enhancer 및 eRNA들을 발굴하여 암 발병기전을 이해하고 간암 진단 및 치료를 위한 신규 타겟을 제시할 필요성이 있다. 더욱이, 신규 enhancer 및 eRNA의 조절기전을 규명하여 간암 특이적 예측 시스템을 개발하기 위한 노력이 필요하다. Therefore, there is a need to understand the pathogenesis of cancer by discovering Korean liver cancer-specific enhancers and eRNAs based on liver cancer cell lines, patient-derived tissues, and organoids, and to present new targets for diagnosis and treatment of liver cancer. Moreover, efforts are needed to develop a liver cancer-specific prediction system by identifying the regulatory mechanisms of novel enhancers and eRNAs.
한편, 간은 체내의 혈액을 대부분 여과하고 다양한 독성을 나타낼 수 있는 약물의 작용을 완화시키는 역할을 하는데, 이러한 간에 암이 발생하게 되면 독성 문제로 인하여 사용가능한 항암제의 종류가 매우 제한되게 된다. 이에 따라, 일반적으로 넥사바(소라페닙)를 치료제로써 사용하고 있는데, 치료 효과가 다른 항암제에 비해 충분히 만족스럽지 못하여 새로운 약물에 대한 요구가 상당히 많은 실정이다. 특히, 간암의 경우, 3기 또는 4기에 이르게 되면 원격성 전이가 많이 일어나게 되어 폐나 기타 장기들로 암의 전이가 많이 일어나게 되며, 이러한 전이에 대해서, 위 언급한 간 자체의 문제로 인하여 약물의 사용이 매우 한정되기 때문에, 전이에 대한 치료를 해결하지 못하여 다수의 환자가 사망하게 되는 결과를 나타낸다. On the other hand, the liver plays a role of filtering most of the blood in the body and alleviating the action of drugs that can exhibit various toxicity. When cancer occurs in the liver, the types of anticancer drugs that can be used are very limited due to toxicity problems. Accordingly, in general, Nexavar (Sorafenib) is used as a therapeutic agent, but the therapeutic effect is not sufficiently satisfactory compared to other anticancer drugs, so there is a considerable number of demands for new drugs. In particular, in the case of liver cancer, when it reaches stage 3 or stage 4, distant metastasis occurs a lot, and cancer metastasis to the lungs or other organs a lot occurs. For this metastasis, the use of drugs due to the above-mentioned problems in the liver itself. Because this is very limited, treatment for metastasis is not resolved, resulting in the death of a large number of patients.
이에, 본 발명자들은 간암 세포주들을 이용하여 통합 전사체 분석을 실시하고, 간암 세포주에서 활성화된 enhancer를 발굴하기 위해 histone H3, H3K4me1과 H3K27ac에 대한 ChIP-sequencing을 실시하였으며, Enhancer 부위 확인을 위해 ATAC-seq을 수행하여 히스톤 ChIP-seq에서 확보한 enhancer peaks로 통합 분석을 수행하였다. Accordingly, the present inventors performed an integrated transcriptome analysis using liver cancer cell lines, and performed ChIP-sequencing for histone H3, H3K4me1 and H3K27ac to discover an enhancer activated in liver cancer cell lines, and ATAC- An integrated analysis was performed with enhancer peaks obtained from histone ChIP-seq by performing seq.
이에 따라, 간암 세포주로부터 활성화된 enhancer를 발굴하고, TRAF3IP2-AS1을 The Cancer Genome Atlas(TCGA)의 데이터를 통해 분석한 결과, 정상인 대비 간암 환자에서 증가되어 있는 것으로 나타났다. Accordingly, as a result of discovering the enhancer activated from the liver cancer cell line, and analyzing TRAF3IP2-AS1 through the data of The Cancer Genome Atlas (TCGA), it was found that the increase in liver cancer patients compared to the normal person.
이러한 실험 결과를 바탕으로 검토하여 볼 때, TRAF3IP2-AS1이 간암에 대한 특이적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. When reviewed based on these experimental results, it was confirmed that TRAF3IP2-AS1 can be used as a specific biomarker for liver cancer, and the present invention was completed.
특히, 본 발명에 따른 바이오마커들은 ChIP-seq 분석, TCGA에서 모두 동일 결과를 나타내는 것을 확인하였다는 점에서 마커로써 우수한 효과가 인정된다. In particular, it was confirmed that the biomarkers according to the present invention showed the same results in ChIP-seq analysis and TCGA, and thus excellent effects as markers are recognized.
또한, 본 발명에 따른 바이오마커는 TRAF3IP2-AS1 자체 뿐만 아니라 발현 상관관계 기반 타겟 유전자에서도 동일한 발현 패턴을 확인하고 관련 그룹을 더 포함할 수 있는 점에서 보다 더 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다. In addition, the biomarker according to the present invention can provide more accurate diagnostic information in that it can confirm the same expression pattern not only in TRAF3IP2-AS1 itself but also in the expression correlation-based target gene and further include related groups.
상기 발현 상관관계 기반 타겟 유전자에 대해 보다 구체적으로 설명하면, eRNA는 유전자 발현조절, 특히 타겟 유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, eRNA의 발현 정도와 타겟 유전자의 발현 정도는 매우 높은 상관관계를 나타낼 가능성이 있다. 따라서 각 eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하고 이를 발현 상관관계 기반 타겟 유전자의 대상으로 검토할 수 있다. 여기서 검출된 동일 발현 패턴을 보이는 유전자들을 발현 상관관계 기반 타겟 유전자로 선정하였다. 즉, eRNA가 regulator의 역할을 할 수 있기 때문에, eRNA의 발현량과 유의한 연관성이 있는 mRNA를 correlation test를 통해 선별하여 이를 eRNA의 타겟 유전자로 정의하였다.In more detail, the expression correlation-based target gene is known to play an important role in regulating gene expression, particularly in activating the expression of the target gene, so the expression level of eRNA and the expression level of the target gene are very high. Possibility to show correlation. Therefore, genes showing the same expression change pattern as each eRNA (increase or decrease in expression) can be selected and reviewed as target genes based on expression correlation. Genes showing the same expression pattern detected here were selected as target genes based on expression correlation. In other words, since eRNA can act as a regulator, mRNA having a significant correlation with the expression level of eRNA was selected through a correlation test and defined as a target gene for eRNA.
더욱이 TRAF3IP2-AS1은 타암종에서 유사 발현 변화를 나타내지 않고, 간암에 특이적으로만 정상대조군과 차이를 나타내는 발현 변화를 보이는 점에서 간암에 대해 특이적인 바이오마커로 이용될 가능성이 매우 높다. Moreover, TRAF3IP2-AS1 is highly likely to be used as a specific biomarker for liver cancer in that it does not show a similar expression change in other carcinomas, but only shows a change in expression that is different from the normal control group specifically for liver cancer.
본 발명의 하나의 목적은 TRAF3IP2-AS1 바이오마커를 포함하는 간암의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosis of liver cancer comprising the TRAF3IP2-AS1 biomarker.
본 발명의 다른 하나의 목적은 TRAF3IP2-AS1 eRNA(바이오마커)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of liver cancer, comprising an agent measuring the expression level of TRAF3IP2-AS1 eRNA (biomarker).
TRAF3IP2-AS1의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 키트를 제공하는 것이다. It is to provide a kit for diagnosis of liver cancer, including an agent for measuring the expression level of eRNA of TRAF3IP2-AS1.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 TRAF3IP2-AS1의 eRNA 발현 수준을 측정하는 단계; Another object of the present invention is (a) measuring the eRNA expression level of TRAF3IP2-AS1 from the isolated biological sample;
(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준과 비교하는 단계; 및(b) comparing the measured expression level with the expression level of TRAF3IP2-AS1 in a contrast normal control sample; And
(c) 상기 생물학적 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. (c) If the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the biological sample is higher than the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the contrasting normal control, it is to provide a method of providing information for diagnosis of liver cancer, comprising the step of determining as liver cancer. .
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TRAF3IP2-AS1의 바이오마커를 포함하는 간암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for diagnosis of liver cancer comprising a biomarker of TRAF3IP2-AS1.
상기 하나 이상의 eRNA는 독립적 또는 조합으로 간암의 진단용 바이오마커로 사용될 수 있다. The one or more eRNAs may be used independently or in combination as a diagnostic biomarker for liver cancer.
간암은 간세포가 지속적인 다양한 자극에 의해 자신의 고유 기능을 상실하고 암세포로 변신하여 끊임없는 자기증식을 이루면서 주변 또는 먼 곳으로 퍼져 나가는 특징을 갖게 되는 종양을 말하며, 원발성 종양과 간에서 발생하여 다른 장기로 이전된 전이암이 있다. 원발성 간암은 간세포의 이상으로 발생하는 간세포암과 담관세포의 이상으로 발생하는 담관암, 맥관육종을 포함하며, 90% 이상이 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)이다.Liver cancer refers to a tumor in which hepatocytes lose their own function by continuous various stimulation and transform into cancer cells to achieve endless self-proliferation and spread to surrounding or distant places. Metastatic cancer has been transferred to. Primary liver cancer includes hepatocellular carcinoma caused by an abnormality in hepatocytes, cholangiocarcinoma caused by an abnormality in bile duct cells, and angiosarcoma, and more than 90% is hepatocellular carcinoma (HCC).
본원에 따른 간암은 조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양이며, 간세포암이다. 간세포암은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 간경변 또는 간경화를 포함하는 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 고위험군 환자에서 빈발한다. 간세포암은 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다.Liver cancer according to the present application is a primary malignant tumor that occurs in the tissue itself, and is hepatocellular carcinoma. Hepatocellular carcinoma is frequent in high-risk patients with risk factors such as alcohol abuse, viral hepatitis, and metabolic liver disease, including cirrhosis or cirrhosis. Hepatocellular carcinoma does not have fibrous stroma, resulting in bleeding and cell necrosis, vascular infiltration into the portal vein system, and in severe cases can lead to liver rupture and intraperitoneal blood effusion.
암의 진단 및 병기는 일반적으로 수술이나 생검으로 획득한 조직을 조직검사를 통해 암 세포의 종류와 분화도, 전이 정도 등에 따라 암종의 진행 병기를 결정한다. 즉 일반적인 고형암은 치료 및 예후가 TNM 병기에 의해 결정된다.In general, the diagnosis and stage of cancer is determined by the type of cancer cells, the degree of differentiation, and the degree of metastasis through a tissue obtained by surgery or biopsy through a biopsy. In other words, the treatment and prognosis of general solid cancer are determined by the TNM stage.
그러나, 간암의 경우, TNM 병기만으로 치료방법을 선택하거나 예후를 예측하기 어려울 수 있다. 이는 대부분의 간암환자에서 만성 간질환이 병발되어 암과는 별개의 진행된 간질환만으로도 치료방법 선택에 제한이 있기 때문이다. However, in the case of liver cancer, it may be difficult to select a treatment method or predict the prognosis only with the TNM stage. This is because chronic liver disease occurs in most patients with liver cancer, and there is a limitation in selecting a treatment method even with advanced liver disease separate from cancer.
따라서, 본 발명에 따른 마커를 사용하는 경우 간암의 발병을 모니터링하고 조기 진단할 수 있다. 본 발명에서 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암의 발병 여부, 간암의 예후, 간암으로 진행 가능성 등을 확인하는 것이다. 예를 들어, 병명을 판정하는 일을 말하고, 간암의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.Therefore, when the marker according to the present invention is used, the onset of liver cancer can be monitored and diagnosed early. In the present invention, diagnosis means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the onset of liver cancer, the prognosis of liver cancer, and the likelihood of progression to liver cancer. For example, it refers to determining the disease name, and may include the disease name of liver cancer, the disease state, the stage, the etiology, the presence or absence of complications, prognosis, and recurrence.
본 발명에서 바이오마커는 간암을 정상 간세포 등과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 간암에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: eRNA, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 간암 진단용 바이오마커는 정상 간의 세포에 비해 간암에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내는 TRAF3IP2-AS1의 eRNA이다. In the present invention, a biomarker is a substance that can be diagnosed by distinguishing liver cancer from normal hepatocytes, etc., and a polypeptide or nucleic acid showing an increase or decrease in liver cancer (e.g., eRNA, mRNA, etc.), lipid, glycolipid, glycoprotein, or sugar (monosaccharide , Disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like. For the purposes of the present invention, a biomarker for diagnosis of liver cancer is an eRNA of TRAF3IP2-AS1 that exhibits a specific high level of expression in liver cancer compared to normal liver cells.
본 발명에서 enhancer RNA (eRNA)는 noncoding RNA의 한 종류로서 활성화된 enhancer에서 만들어지는 것으로 알려져 있다. In the present invention, enhancer RNA (eRNA) is known to be made from activated enhancer as a type of noncoding RNA.
본 발명에서 TRAF3IP2-AS1(TRAF3IP2 antisense RNA 1 ) (ENSG00000231889) 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 GeneID: 643749로 등록되어 있다. In the present invention, TRAF3IP2-AS1 (TRAF3IP2 antisense RNA 1) (ENSG00000231889) information is registered as GeneID: 643749 in NCBI (National Center for Biotechnology Information).
본 발명의 일실시양태에 따르면, TRAF3IP2-AS1을 The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 데이터 간암 샘플을 통해 분석한 결과, 정상인 대비 간암 환자에서 증가되어 있는 것으로 나타났다. According to one embodiment of the present invention, as a result of analyzing TRAF3IP2-AS1 through the data liver cancer sample of The Cancer Genome Atlas (TCGA), it was found that the increase in liver cancer patients compared to the normal person.
이러한 실험 결과를 바탕으로 검토하여 볼 때, TRAF3IP2-AS1이 간암에 대한 특이적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. When reviewed based on these experimental results, it was confirmed that TRAF3IP2-AS1 can be used as a specific biomarker for liver cancer, and the present invention was completed.
본 발명에 있어서, 상기 바이오마커 조성물은 단독으로 이용될 수 있고, 기타의 간암에 대한 마커들과 함께 조합되어 이용될 수 있다. In the present invention, the biomarker composition may be used alone, or may be used in combination with other liver cancer markers.
예를 들어, TRAF3IP2-AS1 eRNA와 관련된 mRNA로 CRAMP1(cramped chromatin regulator homolog 1, GeneID: 57585), CTSA(cathepsin A, GeneID: 5476), DCAF15(DDB1 and CUL4 associated factor 15, GeneID: 90379), DHX37(DEAH-box helicase 37, GeneID: 57647), ERVK3-1(endogenous retrovirus group K3 member 1, GeneID: 105372481), PRPF31(pre-mRNA processing factor 31, GeneID: 26121), REXO4(REX4 homolog, 3'-5' exonuclease, GeneID: 57109), SNRPA(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A, GeneID: 6626), STX16 (syntaxin16, GeneID: 8675) 및 ZNF234(zinc finger protein 234, GeneID: 10780)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 마커로 더 포함할 수 있다. 즉, TRAF3IP2-AS1 eRNA와 관련하여 TCGA LIHC Tumor 상 상관관계가 높은 mRNA로 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16, ZNF234은 TRAF3IP2-AS1 eRNA와 유사하게 정상 시료와 대비하여 간암 시료에서 높게 발현된다. For example, TRAF3IP2-AS1 eRNA-related mRNA is CRAMP1 (cramped
상기 관련된 mRNA(발현 상관관계 기반 타겟 유전자들)는 TRAF3IP2-AS1 eRNA와 간암 및 정상 조직에서 동일 유사 발현 패턴을 보이기 때문에, 보다 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다. 즉, 상기 언급된 mRNA들은 정상 간 조직과 대비할 때 간암에서 높게 발현된다. Since the related mRNAs (target genes based on expression correlation) show the same similar expression pattern in TRAF3IP2-AS1 eRNA and liver cancer and normal tissues, more accurate diagnostic information can be provided. That is, the aforementioned mRNAs are highly expressed in liver cancer when compared to normal liver tissue.
본 발명은 또한, TRAF3IP2-AS1의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosis of liver cancer, comprising an agent for measuring the expression level of eRNA of TRAF3IP2-AS1.
TRAF3IP2-AS1의 바이오마커의 발현 수준은 eRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. The expression level of the biomarker of TRAF3IP2-AS1 can be determined by checking the expression level of eRNA.
본 발명에서 "eRNA 및/또는 mRNA 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 eRNA 및/또는 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, eRNA 및/또는 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "measurement of eRNA and/or mRNA expression level" refers to a process of checking the presence and expression level of the eRNA and/or mRNA in a biological sample to diagnose liver cancer, and is known by measuring the amount of eRNA and/or mRNA. I can. Analysis methods for this are RT-PCR, Competitive RT-PCR (Competitive RT-PCR), Real-time RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting (Northern blotting) and DNA chips, but are not limited thereto.
eRNA 및/또는 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, TRAF3IP2-AS1의 유전자의 핵산 서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. The agent for measuring the level of eRNA and/or mRNA is preferably a primer pair or a probe, and since the nucleic acid sequence of the gene of TRAF3IP2-AS1 is revealed, those skilled in the art are primers that specifically amplify a specific region of these genes based on the sequence. Or you can design a probe.
본 발명에서 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 합성을 개시할 수 있다. In the present invention, the primer is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and functions as a starting point for template strand copying. It means a short nucleic acid sequence. Primers can initiate synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at an appropriate buffer and temperature.
본 발명에서는 예를 들어 TRAF3IP2-AS1의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, for example, by performing PCR amplification using the sense and antisense primers of the gene of TRAF3IP2-AS1, it is possible to diagnose liver cancer through the production of a desired product. The PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
본 발명에서 프로브는 eRNA 및/또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 eRNA 및/또는 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들어 본 발명에서는 TRAF3IP2-AS1의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, a probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short number of bases to a few hundred bases that can achieve specific binding to eRNA and/or mRNA, and is labeled You can check the presence or absence. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. For example, in the present invention, hybridization is performed using a probe that is complementary to the polynucleotide of TRAF3IP2-AS1, and liver cancer can be diagnosed through hybridization. Selection of suitable probes and conditions for hybridization can be modified based on those known in the art.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, “encapsulation”, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (eg, methyl phosphonate, phosphotriester, Phosphoroamidate, carbamate, etc.) or to a charged linker (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
상기 TRAF3IP2-AS1의 수준을 측정하는 제제 및 방법에 대한 예시는 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16, ZNF234에도 동일하게 적용될 수 있다. Examples of formulations and methods for measuring the level of TRAF3IP2-AS1 may be equally applied to CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16, and ZNF234.
본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단용 조성물은 단독, 또는 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 eRNA, 및/또는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 제한없이 포함할 수 있다. In the present invention, the composition for diagnosis of liver cancer may include, without limitation, an agent for measuring the expression level of eRNA, and/or mRNA or a protein thereof for a single or a combination of two or more biomarkers.
예를 들어, 본 발명에 따른 간암의 진단용 조성물은 TRAF3IP2-AS1 eRNA와 관련된 mRNA로 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. For example, the composition for diagnosis of liver cancer according to the present invention is an mRNA related to TRAF3IP2-AS1 eRNA. Any one selected from the group consisting of CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234 It may further include an agent for measuring the expression level of the above mRNA or protein thereof.
상기 관련된 mRNA는 TRAF3IP2-AS1 eRNA와 간암 및 정상 조직에서 동일 유사 발현 패턴을 보이기 때문에, 보다 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다. Since the related mRNA shows the same similar expression pattern as TRAF3IP2-AS1 eRNA in liver cancer and normal tissues, more accurate diagnostic information can be provided.
또한, 필요에 따라, 마커의 양을 확인할 수 있는 공지된 방법이면 제한없이 이용할 수 있기 때문에, 다중 마커들, 즉 eRNA의 다량 분석을 위해 ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq, CLIP-seq, RIP-seq 및 luciferase assay로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, if necessary, since any known method that can check the amount of the marker can be used without limitation, ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq for the analysis of a large amount of multiple markers, that is, eRNA. , FAIRE-seq, CLIP-seq, RIP-seq, and any one or more selected from the group consisting of luciferase assay may be used, but is not limited thereto.
또한, 상기 mRNA를 고려할 때의 발현 수준의 측정은 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하는 것일 수 있다. 즉, CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234에 대해서는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로써 이의 발현 변화의 측정을 하는 것이 또한 가능하다. In addition, the measurement of the expression level in consideration of the mRNA may be performed using an agent for measuring the protein expression level thereof. That is, for CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16, and ZNF234, it is also possible to measure the change in its expression as an agent measuring its protein expression level.
"단백질의 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 구체적으로는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다."Measurement of protein level" is a process of confirming the presence and expression of a protein expressed from a marker gene in a biological sample to diagnose cancer. Specifically, an antibody that specifically binds to the protein of the gene is Can be used to determine the amount of protein.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.In the present invention, "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes all of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Since the marker protein has been identified as described above, generating an antibody using it can be easily prepared using techniques well known in the art.
다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.The polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art in which the above-described marker protein antigen is injected into an animal and blood is collected from the animal to obtain a serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow and dog.
단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.Monoclonal antibodies are a hybridoma method well known in the art (see Kohler and Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519), or a phage antibody library (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) technology. The antibody prepared by the above method can be separated and purified using a method such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.In addition, the antibody of the present invention includes a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that has at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.As an analysis method for determining the amount of the target protein bound to it using the antibody, Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, OY Ouchterlony immune diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), protein There is a chip (protein chip) and the like, but is not limited thereto.
본 발명은 또한 TRAF3IP2-AS1의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosis of liver cancer, comprising an agent for measuring the expression level of eRNA of TRAF3IP2-AS1.
본 발명의 키트는 간암 진단을 위한 바이오마커인 TRAF3IP2-AS1의 바이오마커, 즉 eRNA의 발현 수준을 확인함으로써 검출할 수 있다. 본 발명의 진단용 키트에는 간암 바이오마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.The kit of the present invention can be detected by confirming the expression level of the biomarker of TRAF3IP2-AS1, that is, eRNA, which is a biomarker for diagnosis of liver cancer. The diagnostic kit of the present invention may include a primer and a probe for measuring the expression level of a liver cancer biomarker, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for an analysis method.
구체적으로, TRAF3IP2-AS1의 eRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 바이오마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭용 시약은 중합효소, dNTP, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다. 상기 키트는 핵산 분리용 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 분리용 시약은 세포 용해 용액을 포함할 수 있다. 세포 용해 용액은 염, 계면활성제, 금속 이온, 당, 환원제(예, DTT), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.Specifically, a kit for measuring the expression level of eRNA of TRAF3IP2-AS1 may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR. In addition to each primer pair specific for the biomarker gene, the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer (varies in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), Taq- Enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like may be included. In addition, a primer pair specific to a gene used as a quantitative control may be included. Also preferably, the kit of the present invention may be a diagnostic kit containing essential elements necessary to perform a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescently labeled probe. In addition, the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof. For example, the reagent for amplifying a nucleic acid may be a polymerase, dNTP, a buffer, a nucleic acid, a coenzyme, a fluorescent substance, or a combination thereof. The polymerase is, for example, Taq polymerase. The kit may further include a reagent for separating nucleic acids. The reagent for separating the nucleic acid may include a cell lysis solution. The cell lysis solution may contain a salt, a surfactant, a metal ion, a sugar, a reducing agent (eg, DTT), or a combination thereof.
본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단용 키트는 앞서 살핀 조성물에서와 같이 단독, 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 즉, eRNA; 및 상기 관련 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직한 예는 앞서 살핀 바와 같다.In the present invention, the kit for diagnosing liver cancer comprises: eRNA for a combination of two or more biomarkers alone, as in the above salpin composition; And an agent for measuring the expression level of the related mRNA or protein thereof, without limitation, and a preferred example is as described above.
mRNA의 발현 수준 측정에 관한 사항은 앞서는 eRNA의 발현 수준 측정에 관한 사항을 적절히 적용할 수 있다. As for the measurement of the expression level of mRNA, the previous information on the measurement of the expression level of eRNA can be appropriately applied.
이에 따라, TRAF3IP2-AS1 eRNA와 관련된 mRNA로 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하여 키트를 구성할 수 있다. Accordingly, the expression level of any one or more mRNAs selected from the group consisting of CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234 as an mRNA related to TRAF3IP2-AS1 eRNA or a protein thereof is measured. The kit may be configured by further including an agent.
eRNA 및 mRNA를 기반으로 측정되고 제공되는 키트는 위 살핀바와 같다. The kits measured and provided based on eRNA and mRNA are the same as the salpin bars above.
한편, mRNA 마커의 단백질을 기초로 고려할 때, 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하는 키트가 더 포함되어 제공될 수 있다. 예를 들어, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.Meanwhile, when considering the protein of the mRNA marker as a basis, a kit using an agent for measuring the protein expression level thereof may be further included and provided. For example, it may contain the necessary elements required to perform an ELISA. ELISA kits contain antibodies specific to the marker protein. Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. In addition, the ELISA kit may contain an antibody specific for a control protein. Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or antibodies capable of binding. Other materials may be included.
본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준을 측정하는 단계; The present invention comprises the steps of: (a) measuring the expression level of TRAF3IP2-AS1 from the isolated biological sample;
(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준과 비교하는 단계; 및(b) comparing the measured expression level with the expression level of TRAF3IP2-AS1 in a contrast normal control sample; And
(c) 상기 생물학적 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (c) If the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the biological sample is higher than the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the contrasting normal control, it provides a method of providing information for diagnosis of liver cancer, comprising determining as liver cancer.
상기 (a) 및 (b) 단계의 발현 수준을 eRNA 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 eRNA 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.The expression levels of steps (a) and (b) can be detected at the eRNA level, and eRNA isolation from a biological sample can be performed using a known process.
본 발명에서 "시료"란 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료를 포함하며, 바람직하게 간 조직 시료이다. In the present invention, the "sample" includes samples such as cells, tissues, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, sputum or urine, and is preferably a liver tissue sample.
상기 발현 수준 측정을 통하여, 정상 대조군에서의 eRNA 발현 수준을 간암 의심환자에서의 eRNA 발현 수준과 비교함으로써 간암 의심 환자의 간암 여부 발병 및 진행을 진단할 수 있다. Through the expression level measurement, it is possible to diagnose the onset and progression of liver cancer in patients with suspected liver cancer by comparing the level of eRNA expression in the normal control group with the level of expression in the patients suspected of liver cancer.
즉, 간암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 더 많이 발현되면 간암으로 추정되며, 이에 따라 간암으로 예측할 수 있는 것이다.That is, after measuring the expression level of the biomarker of the present invention from cells presumed to be liver cancer, measuring the expression level of the marker of the present invention from normal cells and comparing both, the expression level of the marker of the present invention is If it is expressed more than that, it is presumed to be liver cancer, and accordingly, it can be predicted as liver cancer.
eRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 eRNA 발현량과 간암 의심환자에서의 eRNA 발현량을 비교할 수 있고, 간암 바이오마커 유전자에서 eRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 간암 의심 환자의 발병 여부를 진단할 수 있다.Analysis methods for measuring eRNA levels include reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting, and DNA chip, but are not limited thereto. Through the above detection methods, it is possible to compare the eRNA expression level in the normal control and the eRNA expression level in the suspected liver cancer patient, and determine whether a significant increase in the expression level of eRNA in the liver cancer biomarker gene is determined to determine whether a patient with suspected liver cancer is Can be diagnosed.
eRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 간암 바이오마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.The eRNA expression level is preferably measured using a reverse transcriptase polymerase reaction method or a DNA chip using a primer specific for a gene used as a liver cancer biomarker.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 간암 바이오마커로 사용되는 유전자의 eRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 간암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.The reverse transcriptase polymerase reaction described above can be performed by electrophoresis after the reaction to check the band pattern and the thickness of the band, so that the expression and degree of eRNA of the gene used as a liver cancer biomarker can be checked. Can be diagnosed.
DNA 칩은 상기 간암 바이오마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 eRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 간암의 발병 여부를 판독할 수 있다.The DNA chip uses a DNA chip in which a nucleic acid corresponding to the liver cancer biomarker gene or its fragment is attached at high density to a glass-like substrate, separating the eRNA from a sample, and a cDNA probe labeled with a fluorescent substance at its end or inside Is prepared, hybridized to a DNA chip, and then the onset of liver cancer can be read.
본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 앞서 살핀 조성물에서와 같이 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 발현 수준 측정을 제한없이 포함할 수 있으며 바람직한 예는 앞서 살핀 바와 같다.In the present invention, the method of providing information for diagnosis of liver cancer may include, without limitation, measurement of the expression level of a combination of two or more biomarkers as in the salpin composition above, and a preferred example is as described above.
상기 언급한 (a) 단계의 eRNA의 측정에 더하여, 추가로 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 하는 단계를 포함할 수 있다. 이에 따라, (b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. In addition to the measurement of the eRNA of step (a) mentioned above, any one or more mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234 further It may include the step of measuring the expression level of. Accordingly, (b) any one or more mRNAs selected from the group consisting of CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234 of the normal control sample compared to the measured expression level or Comparing the level of expression of the protein thereof; And (c) a normal control in which the expression level of any one or more mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234 of the biological sample is compared. If it is higher than the expression level of TRAF3IP2-AS1 of, it may include determining as liver cancer.
상기 측정 및 판정 방법은 위 살핀 내용을 적절히 변형하여 적용할 수 있다. The above measurement and determination method can be applied by appropriately modifying the above salpin content.
본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준을 측정하는 단계; The present invention comprises the steps of: (a) measuring the expression level of TRAF3IP2-AS1 from the isolated biological sample;
(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준과 비교하는 단계; 및(b) comparing the measured expression level with the expression level of TRAF3IP2-AS1 in a contrast normal control sample; And
(c) 상기 생물학적 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계; 및(c) determining as liver cancer when the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the biological sample is higher than the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the contrast normal control; And
(d) 상기 간암으로 판정된 환자에게 약학적으로 유효한 양의 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 치료 방법을 제공한다. (d) It provides a method of treating liver cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of an anticancer agent to the patient determined as liver cancer.
상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to inhibit or alleviate the increase in vascular permeability at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical use, and the effective dose level is the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, drug Sensitivity to, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by a person skilled in the art.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 항암제를 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.The administration refers to introducing an anticancer agent to a subject by any suitable method, and the route of administration may be administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue.
또한, 위 언급한 바와 같이, 각 단계에서 추가로 상기 관련 mRNA 의 발현 수준에 대한 확인 및 판단을 더 포함할 수 있다. In addition, as mentioned above, in each step may further include confirmation and determination of the expression level of the related mRNA.
본 발명에 따른 TRAF3IP2-AS1의 바이오마커와 이와 관련된 유전자들은 간암의 진단에 우수한 효과를 보여, 간암 환자의 분류, 이에 따른 치료제 선택, 및 치료 계획 수립에 유용하게 이용될 수 있다. The biomarker of TRAF3IP2-AS1 and related genes according to the present invention show excellent effects in the diagnosis of liver cancer, and can be usefully used for classification of liver cancer patients, selection of therapeutic agents according to this, and establishment of treatment plans.
도 1은 간암 특이적 enhancer 및 eRNA 발굴을 위한 전체 프로세스에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는 eRNA를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는, TRAF3IP2-AS1과 발현 상관관계 분석을 통해 확인된 하위 타겟유전자의 발현량 차이, 유의성을 확인한 박스플랏 결과를 나타낸다.
도 4는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는, TRAF3IP2-AS1과 발현 상관관계 분석을 통해 확인된 하위 타겟유전자의 발현량 차이, 유의성, 발현 패턴을 나타내는 도이다. 1 shows a schematic diagram of the entire process for discovering a liver cancer-specific enhancer and eRNA.
2 shows the results of analyzing eRNA that is highly expressed in liver cancer compared to the normal control group based on TCGA (The Cancer Genome Atlas) data.
3 is a box plot result confirming the difference in expression levels and significance of the lower target genes identified through expression correlation analysis with TRAF3IP2-AS1, which is highly expressed in liver cancer compared to the normal control group based on TCGA (The Cancer Genome Atlas) data. Show.
Figure 4 is a diagram showing the difference in expression levels, significance, and expression patterns of the lower target genes identified through expression correlation analysis with TRAF3IP2-AS1, which is highly expressed in liver cancer compared to the normal control based on TCGA (The Cancer Genome Atlas) data to be.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 또는 제제예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples and formulation examples are presented to aid in understanding the present invention. However, the following examples and formulation examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples or formulation examples.
<실험예 1> ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation-sequencing) 분석<Experimental Example 1> ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation-sequencing) analysis
간암 특이적 enhancer 및 eRNA 발굴을 위해 총 8개의 간암(HCC) 세포주 (FT 3-7, Huh 7, Huh 7-5, PCLC PRF 5, SNU 182, SNU 387, SNU 449, HepG2)를 이용하였다A total of eight liver cancer (HCC) cell lines (FT 3-7, Huh 7, Huh 7-5, PCLC PRF 5, SNU 182, SNU 387, SNU 449, HepG2) were used to discover liver cancer-specific enhancers and eRNAs.
HCC 세포주들을 1 % 파라포름알데히드로 고정하고 글리신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 펠릿을 용해 완충액 (5mM PIPES pH 8.0, 85nM KCl, 0.5 % NP40, 1X 프로테아제 억제제 (Roche))에 용해시키고 sonication 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, 0.1 % Na-Deoxycholate, 1 % Triton X-100)으로 대부분의 조각 크기가 200 ~ 300bp 범위에 있을때까지 milliTUBE 또는 microTUBE에서 60 분 동안 초음파처리(diagenode)하였다. 각각의 면역 침강에 대해 항체를 첨가하고 실온에서 2 시간 회전시켜 비드 (DynabeadsTM Protein A, Invitrogen)에 결합시켰다. 사용된 항체는 H3 (면역 침 전당 2μg, Abcam ab1791), H3K27ac (면역 침 전당 2μg, Abcam ab4729) 및 H3K4me1 (면역 침 전당 2μg, Abcam ab8895)이었다. 대조군 라이브러리의 경우, 1 μg의 비특이적 IgG 마우스 항체를 사용한 면역 침전이 사용되었다. block된 항체-접합된 비드를 자석에 놓고 상층액을 제거하고 초음파 처리된 용해물을 비드에 첨가한 다음 회전기, 4 °C에서 3 ~ 4 시간 동안 배양하였다. 비드를 세척한 다음 태그를 반응시켰다 (Nextra® DNA Library Prep Kit, illumina). 비드를 세척하고 2.5μl의 Proteinase K (Roche) 및 1.5ul의 10 % SDS를 포함하는 1X TE 완충액 (10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA)으로 65 °C에서 밤새도록 용출하여 포름알데히드 cross-linking을 revert하였다. 마지막으로, DNA를 AMPure XP 비드로 정제하고 각 라이브러리를 증폭하였다 (Nextra® DNA Library Prep Kit, Nextra® Index Kit, illumina). 증폭된 라이브러리는 AMPure XP 비드를 사용하여 정제한 다음 AMPure XP 비드를 사용하여 크기를 선택하여 200-400bp의 조각 길이를 가진 라이브러리를 복구하였다. RNA 라이브러리 시퀀싱은 Illumina HiSeq2000 플랫폼에서 수행되었다. HCC cell lines were fixed with 1% paraformaldehyde and glycine was added to stop the reaction. The pellet was dissolved in lysis buffer (5mM PIPES pH 8.0, 85nM KCl, 0.5% NP40, 1X protease inhibitor (Roche)) and sonication buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, 0.1% Na-Deoxycholate, 1% Triton X-100) was sonicated (diagenode) in milliTUBE or microTUBE for 60 minutes until most pieces were in the range of 200 ~ 300bp. For each immunoprecipitation, antibodies were added and rotated at room temperature for 2 hours to bind to beads (DynabeadsTM Protein A, Invitrogen). Antibodies used were H3 (2 μg per immune saliva, Abcam ab1791), H3K27ac (2 μg per immune saliva, Abcam ab4729) and H3K4me1 (2 μg per immune saliva, Abcam ab8895). For the control library, immunoprecipitation with 1 μg of non-specific IgG mouse antibody was used. Blocked antibody-conjugated beads were placed on a magnet, the supernatant was removed, the sonicated lysate was added to the beads, and incubated for 3-4 hours at 4 °C on a rotating machine. After washing the beads, the tags were reacted (Nextra® DNA Library Prep Kit, illumina). Wash the beads and cross-link formaldehyde by eluting them overnight at 65 °C with 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA) containing 2.5 μl Proteinase K (Roche) and 1.5 μl 10% SDS. Was reverted. Finally, DNA was purified with AMPure XP beads and each library was amplified (Nextra® DNA Library Prep Kit, Nextra® Index Kit, illumina). The amplified library was purified using AMPure XP beads, and then the size was selected using AMPure XP beads to recover a library having a fragment length of 200-400 bp. RNA library sequencing was performed on the Illumina HiSeq2000 platform.
<실험예 2> ChIP-seq 및 Total RNA-seq 분석<Experimental Example 2> ChIP-seq and Total RNA-seq analysis
활성화된 enhancer 발굴을 위해 H3K4 monomethylation (H3K4me1)과 H3K27 acetylation에 대한 ChIP-seq을 수행하였다. 또한 활성화된 enhancer로부터 발현되는 eRNA의 발굴을 위해 상기 8개의 간암세포주로부터 총 RNA 추출하여 total RNA-seq을 수행하였다.ChIP-seq for H3K4 monomethylation (H3K4me1) and H3K27 acetylation was performed to discover the activated enhancer. In addition, total RNA-seq was performed by extracting total RNA from the eight liver cancer cell lines in order to discover eRNA expressed from the activated enhancer.
구체적으로, Chip seq를 위하여, ‘FastQC’로 리드 퀄리티 체크 진행 후, ‘Trimmomatic’으로 리드 필터링을 진행하였다. ‘Bowtie2’로 alignment를 진행한 뒤 non-uniquely aligned reads 및 potential PCR duplicates를 제거한 BAM파일을 생성하였다. 이후 ‘MACS14’를 사용해 peack calling을 진행하고, ‘HOMER’로 peak annotation을 진행하였다.Specifically, for the Chip seq, the lead quality was checked with'FastQC' and then lead filtering was performed with'Trimmomatic'. After performing alignment with'Bowtie2', a BAM file was created from which non-uniquely aligned reads and potential PCR duplicates were removed. After that, peack calling was performed using'MACS14', and peak annotation was performed with'HOMER'.
또한, RNA seq를 위하여, ‘FastQC’로 리드 퀄리티 체크 진행 후, ‘Trimmomatic’으로 리드 필터링을 진행하였다. ‘Tophat’을 사용하여 total RNA-seq 리드를 Reference genom에 alignment하였다. Reference genome은 Ensembl의 GRCh38을 사용하였다. 이후 ‘Cufflinks’를 수행하고, 유전자의 발현량을 FPKM으로 구하였다.In addition, for RNA seq, read quality check was performed with'FastQC' and read filtering was performed with'Trimmomatic'. The total RNA-seq read was aligned to the Reference genom using'Tophat'. For the reference genome, Ensembl's GRCh38 was used. After that,'Cufflinks' was performed, and the expression level of the gene was calculated by FPKM.
<< 실험예Experimental example 3> 간암 특이적 3> liver cancer specific enhancerenhancer 및 And eRNAeRNA 발굴 excavation
간암세포주에서 특이적으로 활성화된 enhancer 및 이로부터 발현되는 eRNA 발굴을 위해, 활성화된 enhancer에서 높게 나타나는 것으로 알려진 H3K27 acetylation peaks을 전체 genome 상에서 선별하였다. 활성화된 enhancer만을 발굴하기 위해 유전자의 promoter나 내부에서 나타나는 H3K27 acetylation peaks은 제외하였다. 다음으로 enhancer에 대한 마커로 알려진 H3K4 monometylation (H3K4me1)의 peaks을 전체 genome에서 선별하였고, 최종적으로 H3K27 acetylation과 H3K4 monomethylation이 동시에 높게 존재하는 활성화된 enhancer 부위를 선별하였다. In order to discover the enhancer specifically activated in liver cancer cell lines and the eRNA expressed therefrom, H3K27 acetylation peaks known to be high in the activated enhancer were selected on the entire genome. In order to discover only the activated enhancer, H3K27 acetylation peaks appearing in the gene promoter or inside were excluded. Next, peaks of H3K4 monometylation (H3K4me1), known as a marker for enhancer, were selected from the entire genome, and finally, an activated enhancer site in which H3K27 acetylation and H3K4 monomethylation were simultaneously high was selected.
또한 활성화된 enhancer에서 발현되는 eRNA를 발굴하기 위해 total RNA-seq 데이터와 통합 분석을 진행하였다. In addition, total RNA-seq data and integrated analysis were performed to discover eRNA expressed in the activated enhancer.
이와 관련된 일련의 분석 모식도를 도 1에 나타내었다. A schematic diagram of a series of related analyzes is shown in FIG. 1.
<< 실험예Experimental example 4> 4> eRNA의eRNA 하위 down 타겟유전자Target gene 선별 Selection
발현 상관관계 기반 Based on expression correlation 타겟유전자Target gene 선별 (Correlation-based identification of target genes) Selection (Correlation-based identification of target genes)
eRNA는 유전자 발현조절, 특히 타겟유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 eRNA의 발현정도와 타겟유전자의 발현 정도는 매우 높은 상관관계를 나타낼 가능성이 있다. 따라서 각 eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하여 이를 타겟유전자 후보군으로 선정하였다. eRNA is known to play an important role in regulating gene expression, particularly in activating the expression of a target gene. Therefore, it is possible to show a very high correlation between the expression level of the eRNA and the expression level of the target gene. Therefore, genes showing the same expression change pattern as each eRNA (increase or decrease in expression) were selected and selected as target gene candidates.
<실험예 5> TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 이용한 검증<Experimental Example 5> Verification using TCGA (The Cancer Genome Atlas) data
정산인 간암 시료 50례와 간암환자 시료 50례에서 생산된 RNA-seq 데이터를 활용하여 선별된 eRNA의 발현 패턴을 분석하였다. The expression patterns of the selected eRNA were analyzed using RNA-seq data produced from 50 samples of liver cancer and 50 samples of liver cancer patients.
또한, 기타의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 로 유방암, 두경부암, 신세포암, 폐선암, 폐편평상피세포암 및 위암에 대해서 선별된 eRNA 중 TRAF3IP2-AS1에 대한 발현 변화를 분석하였다.In addition, the expression changes of TRAF3IP2-AS1 among eRNAs selected for breast cancer, head and neck cancer, renal cell carcinoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma and gastric cancer were analyzed by other TCGA (The Cancer Genome Atlas).
<실험결과><Experiment result>
1. 간암세포주에서 발현되는 eRNA 발굴 및 4개의 간암세포주를 이용한 분석1. Identification of eRNA expressed in liver cancer cell lines and analysis using 4 liver cancer cell lines
전체 8개의 간암세포주를 이용하여 활성화된 enhancer와 이로부터 발현되는 eRNA를 분석하여, 총 6개의 eRNA를 발굴하였다. A total of 6 eRNAs were discovered by analyzing the activated enhancer and the eRNA expressed therefrom using a total of 8 liver cancer cell lines.
그리고 나서, 8개의 간암세포주 중 유전자 발현 패턴이 유사한 4개의 간암세포주 (F-3-7, Huh-7-5, SNU182, PLC-PRF-5)를 이용하여 총 45개의 eRNA을 선별하였고, 이 중 6개의 eRNA는 8개의 간암 세포주 모두에서 발현되는 것을 확인하였다.Then, a total of 45 eRNAs were selected using 4 liver cancer cell lines (F-3-7, Huh-7-5, SNU182, PLC-PRF-5) having similar gene expression patterns among 8 liver cancer cell lines. It was confirmed that 6 of the eRNAs were expressed in all 8 liver cancer cell lines.
그 구체적 분석 결과를 아래 표 1에 나타내었다. The specific analysis results are shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, THUMPD3-AS1, TRAF3IP2-AS1, LINC00511, SAP30L-AS1, LINC01572, AL136311.1의 6종 eRNA가 8개의 간암세포주에서 모두 발현되는 것이 확인되었다.As can be seen in Table 1, it was confirmed that all six eRNAs of THUMPD3-AS1, TRAF3IP2-AS1, LINC00511, SAP30L-AS1, LINC01572, and AL136311.1 were expressed in all eight hepatic cancer cell lines.
2. TCGA 데이터를 이용한 검증2. Verification using TCGA data
(1) 간암에서의 검증 (1) Verification in liver cancer
TCGA 데이터를 이용하여 발굴된 45개의 eRNA의 발현패턴을 확인하였다. 총 11개의 eRNA는 정상(Normal) 간조직 (50례) 대비 간암조직(Tumor) (50례)에서 발현이 증가하였다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 그 중 특히 TRAF3IP2-AS1의 경우 우수한 진단 효과(즉, 간암과 정상 대조군 사이에 매우 유의적 의미를 가지는 발현 차이를 나타냄)를 나타내었다. The expression patterns of 45 eRNAs discovered using TCGA data were confirmed. A total of 11 eRNAs were expressed in liver cancer tissues (50 cases) compared to normal liver tissues (50 cases). As can be seen in FIG. 2, among them, TRAF3IP2-AS1 exhibited excellent diagnostic effect (ie, an expression difference having a very significant meaning between liver cancer and a normal control group) was exhibited.
(2) 기타 암종에서의 검증(2) Verification in other cancer types
TCGA(The Cancer Genome Atlas) 로 유방암, 두경부암, 신세포암, 폐선암, 폐편평상피세포암 및 위암에 대해서 선별된 eRNA 중 TRAF3IP2-AS1에 대한 발현 변화를 분석한 결과, 위 암종들에 대해서는 TRAF3IP2-AS1이 발현 변화가 크게 없거나 오히려 일부 감소하는 등의 결과가 나왔다. As a result of analyzing the expression change of TRAF3IP2-AS1 among eRNAs selected for breast cancer, head and neck cancer, renal cell carcinoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma and gastric cancer with TCGA (The Cancer Genome Atlas), gastric carcinomas The result was that the expression of TRAF3IP2-AS1 was not significantly or rather decreased partially.
(3) 정리 (3) summary
상기 TCGA 데이터를 이용한 검증에서는 간암에서 TRAF3IP2-AS1이 우수한 진단 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, 암종의 특이성을 고려하여서 간암 특이적으로 우수한 진단 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. In the verification using the TCGA data, it was confirmed that TRAF3IP2-AS1 exhibits excellent diagnostic effect in liver cancer. In other words, it was confirmed that it can exhibit excellent diagnostic effect specifically for liver cancer in consideration of the specificity of the carcinoma.
3. eRNA의 하위 타겟유전자 확인 3. Identification of eRNA sub-target genes
발현 상관관계 분석을 통한 하위 타겟유전자 선별 Selection of sub-target genes through expression correlation analysis
eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하여 이를 타겟유전자 후보군으로 선정하여 검토한 결과 총 14개의 관련 유전자 중 10 종에 대해서 동일 발현 패턴(즉, 정상대조군 대비 간암에서 증가, 71.43%)을 나타내는 것을 확인하였다. Genes showing the same expression change pattern as eRNA (increased or decreased expression) were selected and reviewed as target gene candidates. Increase, 71.43%).
해당 결과를 표 2 및 도 3과 도 4에 나타내었다. Q < 0.01 이면서 normal.mean < tumor.mean 인 유전자들을 선별하였다. box plot에 표기된 유의값은 Q value(adjusted P)이다. The results are shown in Table 2 and FIGS. 3 and 4. Genes with Q <0.01 and normal.mean <tumor.mean were selected. The significance value indicated in the box plot is the Q value (adjusted P).
normal.meannormal.mean
tumor.meantumor.mean
P val : P < 0.05, Cor: |Cor| > 0.9, R.squared: >= 0.7P val: P <0.05, Cor: |Cor| > 0.9, R.squared: >= 0.7
kendall-tau correlation test를 진행하여 Cor값(=tau값)이 계산되었고, 이 테스트에 대한 P val이다. R.squared 값은 두 값으로 회귀선을 그었을 때, x값이 y값을 얼마나 잘 설명하고 있느냐에 대한 score 값이다. The kendall-tau correlation test was performed to calculate the Cor value (=tau value), which is the P val for this test. The R.squared value is a score value for how well the x value describes the y value when a regression line is drawn with two values.
도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 발현 상관관계 분석에서 동일 발현 패턴을 나타내는 10종의 유전자는 CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 및 ZNF234로 확인되었다. As can be seen in FIGS. 3 and 4, 10 genes showing the same expression pattern in the expression correlation analysis were identified as CRAMP1, CTSA, DCAF15, DHX37, ERVK3-1, PRPF31, REXO4, SNRPA, STX16 and ZNF234. Became.
상기 결과를 통해서, TRAF3IP2-AS1 뿐만 아니라 이의 발현 상관관계 분석을 통한 하위 타겟유전자가 간암의 진단 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다. Through the above results, it was confirmed that not only TRAF3IP2-AS1 but also a lower target gene through an expression correlation analysis thereof can be used as a diagnostic marker for liver cancer.
Claims (9)
(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 생물학적 시료의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 TRAF3IP2-AS1의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. (a) measuring the expression level of TRAF3IP2-AS1 from the isolated biological sample;
(b) comparing the measured expression level with the expression level of TRAF3IP2-AS1 in a contrast normal control sample; And
(c) If the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the biological sample is higher than the expression level of TRAF3IP2-AS1 in the contrast normal control, the method of providing information for diagnosis of liver cancer, comprising the step of determining as liver cancer.
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| KR1020200124542A KR102199000B1 (en) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | A novel biomarker for diagnosing liver cancer |
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| KR (1) | KR102199000B1 (en) |
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2020
- 2020-09-25 KR KR1020200124542A patent/KR102199000B1/en active IP Right Grant
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