KR20190090387A - 세포막 결합된 신호전달 인자의 용도 - Google Patents

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KR20190090387A
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가브리엘 니스토르
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에이비타 바이오메디컬, 인크.
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Abstract

시클로덱스트린과 지질 변성된 줄기 세포 단백질의 복합체를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 상기 복합체를 포함하는 국소용 조성물이 또한 개시된다. 상기 조성물을 치료 목적으로 사용하는 방법, 그리고 상기 조성물을 제조하는 방법이 또한 개시된다.

Description

세포막 결합된 신호전달 인자의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에, 2016년 11월 16일에 제출된 미국 가특허 출원 제62/422,900호를 우선권으로 주장하며, 상기 가특허 출원의 전제 내용은 본원에 참조로 인용된다.
윙리스(Wingless)(Wnt) 및 헤지호그(Hedgehog)(Hh) 일족의 단백질을 포함하는, 막 결합된 신호전달 인자는 다양한 장애에 사용될 수 있는 잠재력을 갖고 있으나, 이들 단백질을 수득하는 현재의 방법은 안정되고 효과적인 분자를 생산하지 못하고 있다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 변성된 단백질과 시클로덱스트린의 복합체를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 변성된 단백질과 시클로덱스트린의 복합체를 포함하는 국소용 조성물이 또한 개시된다.
일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, ν-시클로덱스트린, 또는 메틸-β-시클로덱스트린 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 수소화, 히드로포르밀화, 메틸화, 산화, 환원, 또는 탄소-탄소 커플링 반응에 의해 변성된 화학적 변성 시클로덱스트린이다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 메틸-β-시클로덱스트린이다.
일부 실시양태에서, 지질 변성된 단백질은 세포막 지질과 관련된 하나 이상의 윙리스(Wnt) 또는 헤지호그(Hh) 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Hh 단백질은 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog)(Shh) 단백질, 데저트 헤지호그(Desert Hedgehog)(Dhh) 단백질, 또는 인디안 헤지호그(Indian Hedgehog)(Ihh) 단백질 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, Wnt 단백질은 Wnt3a, Wnt7b 또는 Wnt10b 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 지질 변성된 단백질은 윙리스(Wnt) 또는 헤지호그(Hh) 일족에 속하는 단백질 이외의 다른 단백질로 구성된다.
일부 실시양태에서, 지질 변성된 단백질은 줄기 세포의 집단으로부터 회수된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 단위생식(parthenogenic) 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 또는 유도 만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 포유류 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 Wnt 또는 Hh 단백질을 과발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 불멸성이도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 텔로머라아제 역전사 효소(hTERT)를 발현하도록 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 1 이상의 코스모트롭(kosmotrope)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 코스모트롭은 프로필렌 글리콜, 프롤린, 트레할로스, 엑토인, 또는 트리메틸아민 N-옥시드이다.
일부 실시양태에서, 국소용 조성물은 수성 제제 중에 있다. 일부 실시양태에서, 국소용 조성물은 1 이상의 코스모트롭, 및 항미생물제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 코스모트롭은 트레할로스이다. 일부 실시양태에서, 항미생물제는 은 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 은 입자는 은 나노 입자 또는 은 마이크로 입자이다. 일부 실시양태에서, 국소용 조성물의 pH는 약 4.5 ∼ 약 8.0이다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 조직 재생(tissue regeneration)의 촉진을 필요로 하는 조직에서 조직 재생을 촉진하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 조직 회생(tissue rejuvenation)의 촉진을 필요로 하는 조직에서 조직 회생을 촉진하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 감각 신경 기능의 회복을 필요로 하는 조직에서 감각 신경 기능을 회복시키는 방법이 또한 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 조직은 피부이다. 일부 실시양태에서, 조직은 반흔 조직이다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물에 모낭을 노출시키는 것을 포함하는, 모발 성장을 촉진하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물을 모낭에 노출시키는 것을 포함하는, 모발의 외관을 개선하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 모발 성장은 노인성 탈모, 전두 탈모증, 휴지기 및 성장기 탈모, 또는 원형 탈모증을 갖는 대상체에서 촉진된다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 두피에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 속눈썹에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 눈썹에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 안면에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 흉부에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 팔에 있다. 일부 실시양태에서, 모낭은 대상체의 다리에 있다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물에 피부를 노출시키는 것을 포함하는, 피부의 외관을 개선하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 개선된 외관은 피부결, 주름, 변색 및 검버섯 중 하나 이상이다.
본원에 개시된 조성물 또는 국소용 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양 배지에서 Wnt 및 Hh 단백질을 생성할 수 있는 줄기 세포를 배양하는 단계; 시클로덱스트린을 포함하는 회수(harvest) 용액에서 상기 세포를 인큐베이션하여, 지질 변성된 단백질의 시클로덱스트린 복합체를 수득하는 단계; 및 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하여, 국소용 제제를 형성하는 단계를 포함하는 제조 방법이 또한 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 회수 용액은 1 이상의 코스모트롭을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 회수 용액은 안정화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 코스모트롭이다. 일부 실시양태에서, 코스모트롭은 트레할로스이다. 일부 실시양태에서, 회수 용액 중 코스모트롭의 농도는 약 5% ∼ 약 30%이다. 일부 실시양태에서, 코스모트롭의 농도는 20%이다.
일부 실시양태에서, 회수 용액은 시클로덱스트린의 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 메틸-β-시클로덱스트린이다. 일부 실시양태에서, 회수 용액 중 시클로덱스트린의 농도는 약 1 mM ∼ 약 20 mM이다. 일부 실시양태에서, 회수 용액 중 시클로덱스트린의 농도는 약 10 mM이다.
일부 실시양태에서, 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체 용액은 4℃ 이하에서 보관된다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체 용액은 동결 건조된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 방부제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 항미생물제를 포함한다.
도 1은 시클로덱스트린의 화학적 및 물리적 구조를 도시한다.
도 2는 탈수 동안에 지질 막을 안정화하는 트레할로스 효과의 개략도를 도시한다.
도 3은 형태 형성 및 조직 성장에서의 국소 및 국부 인자 간의 상호작용을 도시한다.
도 4a-b는 시클로덱스트린을 사용하는, 막 결합된 지질 변성된 단백질 포획의 개략적인 기전을 도시한다. 도 4a는 용액 중의 시클로덱스트린이, 세포막에 부착된 지질 변성된 단백질을 포획할 수 있음을 도시한다. 도 4b는 시클로덱스트린 포획 복합체가, 단백질 분자를 둘러싸는 물의 변위 및 동결 건조식 보관 방법의 허용에 의해 코스모트롭 효과를 갖는 트레할로스의 첨가로 더 강화될 수 있음을 도시한다.
도 5a는 매끄럽고 치밀하고 다층형인 노출 전의 세포 배양물을 도시한다. 도 5b는 시클로덱스트린과 함께 인큐베이션한 후의 배양물을 도시하며, 여기서 대부분의 세포가 접착력을 상실하면서 배양물이 분해된다.
도 6A-D는 치료군 1(도 6A), 치료군 2(도 6B), 치료군 3(도 6C) 및 치료군 4(도 6D)의 마우스가, 신규 성장기 패치 "성장기파(anagen waves)"의 존재에 의해 성장기로의 이른 전이를 나타냄을 도시한다.
도 7a는 활성 농도 그룹에 관계 없이, 치료된 동물이 모발 성장 반응을 나타냄을 도시한다. 도 7b는 치료된 동물이 증가된 수의 새로운 성장기 모발 패치를 나타냄을 도시한다. 도 7c는 치료에 대한 반응이 치료군에서의 피부의 어두움의 증가에 의해 확인되었음을 도시한다.
도 8A-C는 치료된 마우스에서의 모낭의 휴지기 상태를 도시한다. 연구 1일째 (D1)에 샘플을 채취하여 마우스가 제1 휴지기 단계에 있음을 확인하였다. 대조군(그룹 1, 도 8A)의 마우스는 연구 종료시(D20)에, 모낭의 휴지기(T) 상태를 유지 하였다 (도 8B 및 C).
도 9A-C는 치료된 마우스에서의 모낭의 휴지기 상태를 도시한다. 치료군(그룹 2, 3 및 4; 각각 도 9A, 9B 및 9C)의 마우스는 신규 성장기 패치를 함유하지 않는 영역에서 휴지기 및 초기 성장기(EA) 모낭의 혼합을 나타내었다.
도 10A-C는 치료된 마우스에서의 모발 성장을 나타낸다. 모든 치료군(그룹 2, 3 및 4, 각각 도 10A, 10B 및 10C)의 마우스는 전형적인 성장기 모낭 형태를 갖는 새로운 성장기의 패치를 나타내었다.
도 11A-B는 2마리의 미치료 마우스에서의 모발 성장을 도시한다. 대조군 동물에서, 휴지기 단계는 Wnt 활성화가 지속적으로 거의 없거나 전혀 없었으며, 이는 극소수의 LRG5 양성 세포에 의해 입증되었다.
도 12A-C는 치료된 마우스에서의 모낭을 도시한다. 도 12A는 치료군 2를 도시하며, 새로운 모낭의 현미경 사진이다. 증식하는 LGR5 양성 벌지 세포(B)는 아래로 이동하고, 새로운 모구 기질(MX)을 채운다. 도 12B는 치료군 3을 도시하고, 신규 성장기 모낭의 현미경 사진이다. 증식하는 LGR5 양성 세포는 아래로 이동하고, 및 휴지기(T)에 있는 모낭 옆에 초기 성장기 모구(EA) 채운다. 도 12C는 치료군 4를 도시하며, 새로운 성장기 모낭의 현미경 사진이다. 새로운 모낭(EA)은 오래된 휴지기 모낭(T) 아래에 있다. LGR5 양성 세포는 벌지 영역(B)에서 증식하고 새로운 모구 기질(MX)을 아래쪽으로 채운다.
도 13a-b는 치료된 동물에서의 모발 성장을 도시한다. 치료된 동물은 Sox9 양성으로 모발 줄기 세포 동원을 보여준다. 도 13a는 초기 성장기 단계를 도시하고, 도 13b는 성장기 단계를 도시한다.
도 14A-G는 배양 2일 후(도 14A-C) 및 5일 후(도 14D-G) 다양한 농도에서 다른 성장 인자의 부재 하에 모낭의 시험관내 성장에 대한 메틸-β-시클로덱스트린(MBCD)의 효과를 나타낸다.
도 15a는 길이 성장 증가를 나타내는, 0.25 mM MBCD 복합체에서 성장한 모낭을 도시한다. 도 15b는 통계적으로 유의한 두께 성장 증가를 나타내는, 0.25 mM 및 0.5 mM MBCD 복합체에서 성장한 모낭을 도시한다(0.25 mM 그룹에 대해 p<0.01 및 0.5 mM 그룹에 대해 p<0.05).
도 16a-d는 배아 줄기 세포 막 성분 및 트레할로스가 로딩된 MBCD를 함유하는 조성물의 인간 피부에 대한 시험을 도시한다. 도 16a 및 도 16c는 미치료 영역을 도시한다. 도 16b 및 16d는 가시적인 회복된 연모, 보다 긴 연모, 및 감소된 검버섯을 갖는, 치료된 대측 영역을 도시한다.
윙리스(Wnt) 및 헤지호그(Hh) 단백질이 단리되고 특징화되었으나, 이들 인자의 적용은 매우 제한적이다. 이들 단백질의 공급원은 일반적으로, 온건한 세제에 의해 세포 표면으로부터 회수되는 하나의 특정 단백질을 과발현하도록 조작된 세포이다.
줄기 세포 및 시클로덱스트린으로부터의 지질 변성된 단백질의 복합체가 본원에 개시된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "지질 변성된"은 지질이 공유 결합된 단백질을 지칭한다. Wnt 및 Hh와 관련하여, 단백질은 지방산 팔미테이트로 변성되지만, 콜레스테롤을 비롯한 다른 지질로의 변성도, 본원에 개시된 조성물 및 방법의 범위 내에 속한다.
만능성 단계로부터 배아 층 단계로의 전이 상태를 나타내는 줄기 세포는 상당량의 Wnt 및 Hh 단백질을 발현한다. 그러나, 배양 상등액은 다수의 가용성 성장 인자를 함유하고 있지만, Wnt 및 Hh 단백질은 세포 배양 상등액에서 확인할 수 없다. Wnt 및 Hh의 생리학적 발현은 지질에 의한 변성을 유도하여, 그들이 세포외액으로의 분비보다는 발현 세포의 표면 막과 관련되게 한다. 줄기 세포를 시클로덱스트린 용액에 노출시킴으로써, 콜레스테롤 함유 세포 막에 결합된 지질 변성된 Wnt 및 Hh 단백질을 성공적으로 추출하여, 시클로덱스트린에 결합된 지질 변성된 단백질의 가용성 복합체를 형성할 수 있다. 트레할로스를 가용성 지질 변성된 단백질/시클로덱스트린 복합체에 첨가하면, 복합체가 안정화되어 동결 건조된 복합체를 장기 보존할 수 있게 된다.
Wnt 및 Hh 단백질은 세포 증식, 모발 성장 및 조직 재생에 있어 시험관내 및 생체내에서 효과적이다. 특성화된 정상 줄기 세포 배양물로부터 수득된 이종 Wnt(예컨대, Wnt3a, Wnt7b, Wnt10b 등) 및 Hh 혼합물의 사용은, 특정 단백질을 발현하도록 조작된 변성된 세포로부터 수득된 단일 인자보다 유리한데, 다양한 인자의 조합이 적절한 줄기 세포 기능과 치료 효능에 요구되기 때문이다.
따라서, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포로부터 막 결합된 지질 변성된 단백질을 포획하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 지질 변성된 단백질 구조의 예는, Wnt 및 Hh 일족의 단백질(리간드)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 세포는 이러한 단백질의 발현을 최대화하기 위해 조작된 다음, 소수성 분자를 포획하는 능력으로 알려진 시클로덱스트린에 노출된다. 시클로덱스트린 복합체는 트레할로스로 추가 코팅되어 건조 및 단백질 변성으로부터 보호한다.
본 개시내용에 앞서, 이들 지질 변성된 단백질은 유기 용매 또는 세제로 세포로부터 추출되었다. 이러한 방법은 추출된 단백질에 제한된 안정성 및 기능성을 부여하는 단점이 있다. 유기 용매는 단백질 성분을 변성시키고 단백질 활성에 필수적인 지질 변성을 배제시킬 수 있다. 세제 추출은 리포좀에 추가로 포함될 수 있는 지질단백질 미셀을 생성한다. 세제 추출 방법이 용매 추출보다 우수하지만, 미셀과 리포좀은 보존 기간이 제한된 불안정된 구조물이다.
본원에 기술된 방법은 지질 변성된 단백질의 포획을 보장하고 동결 건조(냉동 건조)에 의한 장기간 보존이 가능하게 한다. 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체는 트레할로스, 단백질 및 지질을 둘러싼 물을 변위하고 구조 보존을 보장하는 코스모트롭 제제를 사용하여 더 보존한다.
줄기 세포 배양물로부터 단리된 지질 변성된 단백질/시클로덱스트린 복합체는 조직 복구, 반흔 복구 및 재생, 피부 회생, 모발 성장 및 화장품에 유용하다.
시클로덱스트린
3가지 천연 시클로덱스트린, -α, -β 및 -γ가 있다. 시클로덱스트린은 다수의 다른 화학 물질과 함께 안정된 수용액을 형성한다. 일반적인 시클로덱스트린은 6-8 글루코피라노시드 단위를 포함하며, 토로이드의 큰 개구부와 작은 개구부가 각각 용매 2차 및 1차 히드록실기에 노출되는 토로이드로서 위상적으로 표현될 수 있다. 이러한 배열 때문에 토로이드의 내부는 소수성이 아니지만, 수성 환경보다 훨씬 친수성이 적어서 다른 소수성 분자를 수용할 수 있다. 대조적으로, 외부는 시클로덱스트린(또는 그의 복합체)에 수용성을 부여하기에 충분히 친수성이다(도 1).
봉입 복합체의 형성은 게스트 수용체의 물리적 및 화학적 특성을, 대개 수용성 측면에서 크게 변화시키므로, 소수성 분자를 갖는 시클로덱스트린의 봉입 복합체는 신체 조직을 관통할 수 있고, 생물학적으로 활성인 소수성 화합물을 특정 조건 하에서 방출할 수 있으며, 상기 특정 조건은 pH 변화, 열, 클루코오스 모노머들 사이의 α-1,4 결합을 절단할 수 있는 효소, 또는 다른 소수성 분자(예컨대, 콜레스테롤)에 의한 변위를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
분자내 글루코오스 고리의 수에 따라, 시클로덱스트린은 α(알파)-시클로덱스트린(6원의 당 고리 분자), β(베타)-시클로덱스트린(7원의 당 고리 분자), 또는 γ(감마)-시클로덱스트린(8원의 당 고리 분자)로 분류된다. 시클로덱스트린은 내부가 소수성이고 외부가 친수성이기 때문에, 소수성 화합물과 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 이들은 상기 화합물의 용해도 및 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 이는 소수성 화합물이 전달되는 약학 분야 및 식이 보충제 분야에서 큰 관심 대상이다. α-, β-, γ-시클로덱스트린은 모두 FDA가 일반적으로 안전하다고 인정한다.
천연 시클로덱스트린의 화학적 변성은 용해도를 증가시키고, 특정 소수성 분자를 수용하고, 다른 분자로의 부착에 사용될 수 있는 말단을 제공하고, 특정 기능성, 예컨대 특정 세포 성분에 대한 부착, 및 거대 분자 구조의 자기 조립을 제공하도록 조작될 수 있다. 통상적인 변성은 무작위 메틸화 및 히드록시프로필화를 포함한다.
β-시클로덱스트린 및 메틸-β-시클로덱스트린(MBCD)은 모두, 배양된 세포로부터 콜레스테롤을 제거한다. 메틸화된 형태(MBCD)는 배양된 세포에서 콜레스테롤을 제거하는 것에 있어서 β-시클로덱스트린보다 훨씬 효율적이다. 수용성 MBCD는 콜레스테롤과 함께 수용성 복합체를 형성하여, 수용액에서의 그의 용해도를 향상시킨다. MBCD는 콜레스테롤 무함유 제품의 제조에 사용되며, 부피가 크고 소수성인 콜레스테롤 분자는 시클로덱스트린 고리 내에 쉽게 자리 잡고있으며, 이후 제거된다. MBCD는 또한 막으로부터 콜레스테롤을 제거함으로써 지질 뗏목을 파괴하는 연구에도 사용되고 있다.
코스모트롭
코스모트롭은 물 분자를 유리하게 상호 작용시키며, 이는 (사실상) 거대 분자, 예컨대 단백질에서의 분자내 상호 작용을 또한 안정화한다. 예시적인 코스모트롭은 프로필렌 글리콜, 프롤린, 트레할로스, 엑토인 및 트리메틸아민 N-옥시드를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 트레할로스(마이코스, 트레말로오스)는 2개의 글루코오스 분자로 구성된 이당류이다.
버섯 및 박테리아에서의 트레할로스의 주요한 생물학적 목적은 수분 조절인데, 그것이 이 시간 동안의 세포 탈수 보호 동안에 겔상을 형성하고, 적절한 환경이 재도입될 때 신속한 재수화를 허용하기 때문이다. 그것은 인간에 있어서 수화 작용뿐만 아니라 일반적인 항산화 특성을 제공하나, 그의 주요한 역할은 단백질 접힘 및 펼침과 같은 세포내 기능을 조절하는 세포 보호자로서의 역할이다.
Figure pct00001
<트레할로스의 화학 구조>
트레할로스는 코스모트롭 또는 수분 구조 제조체로서 분류되며, 즉 트레할로스/물 사이의 상호 작용은 물/물 상호 작용보다 훨씬 강하며 그의 생물학적 보호 작용에 관여될 수 있다.
트레할로스는 치료용 단백질의 보관 수명을 개선시키기 위한 안정화제로서 작용하여, 단백질 응집을 억제할 수 있다. 모델 단백질로의 작업은, 트레할로스가 분자간 디설파이드 결합의 형성을 방해함으로써 수분에 의해 유도된 소 혈청 알부민 응집을 파괴할 수 있음을 보여주었다. 트레할로스는 지질막 안정화 및 탈수 방지에 효과적이다. 지질 이중층은, 그렇지 않으면 탈수 동안에 액정을 겔 전이시켜 이중층 구조를 영구적으로 손상시킨다. 트레할로스는 물을 변위하여 지질 사이의 공간을 차지하고, 재수화시에 조직된 액정 구조를 유지한다(도 2).
헤지호그 ( Hh ) 및 윙리스 ( Wnt ) 일족
포유류는 3가지 헤지호그 동족체, 데저트(Dhh), 인디안(Ihh) 및 소닉(Shh) 헤지호그를 가지고 있는데, 그 중 소닉이 가장 잘 연구되어 있다. 신호전달 경로는 녹아웃 마우스에서 연구되었으며, 뇌, 골격, 근육, 위장관, 폐 및 심장에 대한 세포 특이성이 입증되었다. 최근 연구들은 성체 조직의 유지 및 재생과 관련된 성체 줄기 세포의 조절에서의 헤지호그 신호전달의 역할을 시사한다. 그 경로는 또한 일부 암의 발생과 연관되어 있다. 암과 싸우기 위해 헤지호그 신호전달을 특이적으로 표적화하는 약물이 활발하게 발달되고 있다.
친유성 기의 부착은 다양한 구조 및 기능의 거의 1,000개의 단백질에서 일어나는 광범위한 변성이다(표 1). 지방산, 이소프레노이드, 스테롤, 인지질 및 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 포함하나 이에 한정되지 않는 단백질에, 적어도 5가지 상이한 유형의 지질이 공유 결합될 수 있다. 단백질은 하나 초과의 유형의 지질, 예컨대 미르스트산염 + 팔미트산염, 팔미트산염 + 콜레스테롤, 또는 파르네실 + 팔미트산염을 함유할 수 있다. 지질 변성의 가장 일반적인 결과는 막에 대한 친화성 증가이다.
Figure pct00002
Hh 단백질은 C-말단 프로테아제 도메인 및 N-말단 신호전달 유닛을 포함하는 전구체 분자로서 제조되고, 그의 합성 동안에 다수의 비정상적인 변성을 겪는다. Hh의 N 말단은, 신호 서열이 제거된 후 단백질의 매우 N 말단 단부에 노출되는 보존된 시스테인 잔기에서, 지방산 팔미트산염에 의해 변성된다. 팔미토일 기는 아미드를 통해 시스테인의 NH2 기에 부착된다.
Wnt 분자는 팔미토일화되고, 따라서 그의 주요 아미노산 서열로부터 예측되는 것보다 훨씬 더 소수성이다. 변성된 것으로 보이는 Wnt 단백질의 아미노산은 돌연변이 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 모든 Wnt에 존재하며 Wnt 기능에 필수적인 잔기인 제1 보존된 시스테인(C77)이다.
소수성을 부여하는 지질 변성 때문에, Hh 및 Wnt는 전신적으로 분산될 수 없으며, 이 단백질은 막에 결합되고, 직접 접촉하는 세포 사이에서만 세포로부터 세포로 전달될 수 있다. 대조적으로, 가용성 인자(예컨대 FGF, EGF 등)는 전신으로 분산되며, 국부 또는 원거리 세포에 영향을 미칠 수 있다.
Engrailed(En) 전사 인자를 발현하는 기원 세포(줄기 세포)는 Hh를 분비한다. En-발현 세포에 인접한 세포만이 Hh와 수용체 단백질 Patched(Ptc)의 상호 작용 후애 헤지호그에 반응할 수 있다.
Hh-활성화된 Ptc를 갖는 세포는 Wnt 단백질을 합성한다. Wnt 지질 변성된 단백질은 세포간 신호로서 작용하고, 그의 세포 표면 수용체 Frizzled를 활성화시킴으로써 인접한 세포 열을 패턴화한다. 따라서, 인접한 세포에 미치는 Wnt 및 Hh의 영향은 뚜렷한 해부학적 특징을 설명하는 일시적인 코드를 확립하는 반면에, 가용성 인자는 세포 증식 및 조직 성장을 위한 일시적인 코드를 확립한다(도 3).
모낭은 신경 외배엽-중배엽 상호 작용이 형성된 미니 장기로 간주된다. 모낭 신생은 상피 플라코드의 주위 진피로의 함입에 의해 태아에서 발생한다. 출생후 모낭은 성장기(성장), 퇴행기(퇴행) 및 휴지기(휴지)의 3단계로 갱신 주기를 거친다. 제1 완전한 출생후 모발 주기(제1 성장기, 제1 퇴행기, 제1 휴지기)는 생후 첫 번째 3.5주 후에 완료되고, 제2 모발 주기(제2 성장기, 제2 퇴행기, 제2 휴지기)가 후속된다.
피부에서, 상피가 발달하는 것으로부터 모낭이 형성되는 것은 기저의 진피에서 섬유아세포로부터의 신호를 필요로 한다. 모낭 형태 형성은 후기 배아 및 초기 신생아기에 일어난다. 성인 피부는 일반적으로 새로운 모낭을 발생시키지 않다.
모낭 신생은 Wnt/β-카테닌의 형질 전환 또는 반흔 유발 상피 활성화에 반응하여 성인 마우스 피부에서 유도될 수 있다. DKK1(Dickkopf 관련 단백질 1)에 의한 Wnt 신호전달의 억제는 모낭 발달에서 Wnt 신호전달의 기능적 중요성을 입증한다. 여러 Wnt 분자가 모낭에서 발현되며 이 기능을 수행할 수 있다. Wnt3a 및 Wnt7a는 모낭 기질 세포에서 발현되고, 성장기 상으로 모유두 세포를 유지한다. 이 세포들은 frizzled7, disheveled2, GSK3β, β-카테닌 및 Lef1을 포함하는 Wnt 신호전달 캐스케이드의 요소를 발현하기 때문에 Wnt에 반응할 가능성이 높다. 따라서, Wnt 경로는 모낭 형태 형성 동안의 주요한 조절자로 간주된다. Wnt 신호전달은 EDA/EDAR/NF-κB(활성화된 B 세포의 엑토디스플라신 A / 엑토디스플라신 A 수용체 / 핵 인자 카파-경쇄-인핸서) 신호전달을 통해 진행된다. NF-κB는 Wnt 경로를 조절하고 Shh의 발현을 상향 조절함으로써 신호 매개체로서 작용한다. 진피 Shh 및 혈소판 유도 성장 인자(PDGF) 신호전달은 피부 노긴 발현을 상향 조절하며, 노긴은 골 형태형성 단백질(BMP) 매개의 β-카테닌 억제에 대항하는데 조력하는 BMP 신호전달의 강력한 억제제이다. 상피 및 진피 계통 사이의 신호전달 상호작용은 상피성 Shh 신호 증폭에 조력한다.
모발 발달에 대한 Shh의 관련성은, 배아 발생 동안의 Shh 발현 패턴 및 배 발생 발달에 걸친 Shh 발현의 조작에 의해 시사되었다. 정상적인 모낭 발달 동안, Shh는 상피 플라코드의 모낭에서 발현되며, 그의 수용체 Ptc는 초기 배아 시기의 기저 간충직 응축에서 검출된다.
생체내 실험은, Shh가 가능하게는 다른 국재 인자와 협력하여 휴지기로부터 성장기로의 전이를 자극한다는 것을 시사하였다. Shh의 일시적인 발현은 질환 상태에서 모발 성장 주기를 재활성할 수 있었다.
포유류에서, 조직 재생을 위한 상당한 능력에도 불구하고, 큰 반흔은 조직 형태 및 기능의 완전한 회복 대신에 반흔 조직의 형성을 초래한다. 이 제한된 재생 능력은 부분적으로 섬유 조직의 신속한 삽입 및 이후의 조직 재생을 방지하는 어떠한 것에 기인하나, 유해한 미생물을 예방하는 데 방어적 이점이 될 수 있다. 부상을 입으면 뼈, 간 및 유아 손가락 끝만 재생될 수 있다. 노화는 조직 회복의 또 다른 결정 요인인데, 동물은 나이가 들수록 점차 재생 능력을 잃기 때문이다.
일반적으로 반흔으로서 치유되는 회복된 피부는 손상되지 않은 피부보다 약하고 손상되지 않은 피부와 비교하여 무질서한 세포외 기질(ECM)을 함유한다. 피부 반흔은 정상적으로 모낭을 재생하지 못한다. 결과적으로, 출생후의 포유류의 피부 회복은 재생된 조직이 손상되지 않은 조직과 거의 구별할 수 없는 초기 임신 태아 반흔의 재생 과정과 동일하지 않다.
비록 Wnt 신호전달이 피부 치료의 증식 단계 동안에 상승된 β-카테닌 수준을 유지하는데 결정적이지는 않긴 하지만, Wnt 단백질은 반흔 회복 동안에 피부 β-카테닌을 자극하는데 참여할 수 있다. 피부 발달에서의 그의 기능과 유사하게, Wnt 및/또는 β-카테닌 신호전달은 상피 구조의 구축 및 피부 구획의 재구성에 포함된 피부 반흔 회복의 각종 양태에서 중요한 역할을 한다.
β-카테닌의 상대적 수준 및 활성은 β-카테닌 수준 및 활성이 높은 피부 상피 표현형에 기여하여, 확대된 과세포 진피 구획을 유도함으로써, 비대성 반흔 형성에 기여한다. β-카테닌 수준은 Wnt에 독립적이며, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 수준에 의해 영향을 받을 가능성이 있다.
Wnt 신호전달은 피부 반흔 치유의 속도 및 정도에 직접 영향을 주는 성인 상피의 세포 증식을 조절한다. Wnt는 또한 적어도 2가지 유형의 피부 줄기 세포, 즉 모낭의 벌지 영역에 있는 것들 및 모세 혈관 상피의 기저층에 있는 것들에 대해 지위 신호전달의 역할을 하며, 이러한 줄기 세포는 피부 반흔 치료에 기여한다. 치유가 되지 않는 반흔에 리포좀 Wnt3a를 국소 적용하면 내인성 Wnt 신호전달이 보완되고 피부 반흔 치유가 향상된다.
헤지호그 신호전달은 마우스에서 정상 및 가속된 반흔 치유에 직접 기여하는 것으로 나타났다. Hh 신호전달이 억제될 경우, 반흔 치유(반흔 봉합, 상피화, 과립 형성, 혈관 형성 및 증식)의 모든 측면이 심각하게 저하된다.
피부에서, 접촉 돔은 1차 모낭과 함께 발생하고 감각 메르켈 세포를 함유한다. 진피 Wnt 신호전달과 후속의 상피 Eda/Edar(엑토디스플라신/엑토디스플라신 수용체) 신호전달은 초기 모낭에서 Shh 발현을 유도하여 메르켈 세포 형태 형성을 촉진한다. 발달 과정에서 모낭과 관련되어 있지만, 원기 분포도는 메르켈 세포가 주로 모낭 계통 외부에서 유래되었음을 증명했다. 이러한 발견은, 터치 돔 발달이 Wnt 의존성 간충직 신호가 1차 모낭으로부터 모낭외 메르켈 세포 전구체로 진행되는 외배엽 Shh 신호전달 내에서 상호 신호전달을 확립할 것을 요구한다. 모르포겐으로 작용하는 국소적으로 생성된 Shh는 발달 및 출생후 접촉 돔 줄기 세포 유지 동안의 계통 내역에 필수적이다.
양서류에서, Hh 신호전달, 및 Wnt 신호전달에 대한 그의 계층적 상관 관계는 사지 재생을 조절한다. Wnt 신호전달은 위장 상피 세포와 조혈 모세포(HSC) 모두에서 자가 재생을 촉진하는 것으로 나타났다. 다수의 조직의 줄기 세포가 Wnt에 반응한다(표 2).
Figure pct00003
또한 지질은, 세포막에 결합된 지질 변성된 단백질과 함께, 스핑고 지질계 지질(예컨대 세라마이드, 스핑고신, 스핑고신-1-포스페이트, 글루코실세라마이드, 세라마이드-1-포스페이트, 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트(PIP2) 지질 작용제; 포스파티딜이노시톨계 지질(예컨대 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트(PIP2)); G-단백질 커플링된 수용체의 활성화제(예컨대 리소포스파티드산(LPA), 스핑고신-1-포스페이트(S1P), 혈소판 활성 인자 (PAF), 엔도칸나비노이드, 프로스타글란딘, FAHFA, 레티놀 유도체); 및 핵 수용체의 활성화제(예컨대, 스테로이드 호르몬, 레티노산, 프로스타글란딘)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포 신호전달에 관계된다.
조성물
따라서, 지질 변성된 헤지호그(Hh) 및/또는 윙리스(Wnt) 단백질 및 1 이상의 시클로덱스트린을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 지질 변성된 Hh 및/또는 Wnt 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 인간 줄기 세포로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 만능성, 다능성, 단일 계통 분할 전구체 또는 불멸화된 세포주이다.
특정 실시양태에서, Wnt 및 Hh 단백질에 대한 공급원 세포는 인간 배아, 단위생식 또는 유도 만능 줄기 세포이다. 다른 관심의 세포는 태아 또는 성체 줄기 세포로 확인되었거나 태아 에넥스에서 공급되는 임의의 시험관내 증식 세포를 포함한다. 다른 세포는 세포 주기 탈조절, 예컨대 텔로머라아제 발현에 의해 불멸성을 부여하는 유전자 조작으로 변성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 텔로머라아제 역전사 효소(hTERT)의 유전자 조작된 발현에 의해 불멸화된다. 공급원 세포는 당업자에게 공지되어 있는 확립된 방법 및 세포 배양 배지를 사용하여 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, Hh 또는 Wnt 단백질은, 먼저 배양 배지를 버리고, 등장 성 완충액(예컨대 식염수, 행크스, 평형 염 용액 등)으로 배양물을 헹구고, 이어서 세포를 회수 용액과, 서서히, 연속적으로, 또는 간헐적으로 교반하면서 약 1시간 ~ 약 5시간 동안 조합함으로써 회수된다. 일부 세포는 기질에 대한 부착성을 잃을 수 있다. 수용성 지질 변성된 단백질/시클로덱스트린 복합체를 함유하는 회수된 용액을 추가로 부스러기를 여과하여(예컨대 0.1∼0.5 μm 필터) 제거하고 4℃에서 보관한다.
줄기 세포로부터 지질 변성된 Wnt 및 Hh 단백질을 얻는 데 적합한 회수 용액은 약 1-20 mM의 시클로덱스트린을 함유하는 등장성 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린의 농도는 약 1-5 mM, 약 5-10 mM, 약 10-15 mM, 약 15-20 mM, 약 2-10 mM, 약 5-20 mM, 약 8-20 mM, 약 12-20 mM, 약 8-12 mM, 약 5 mM, 약 7 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 13 mM, 또는 약 15 mM이다. 회수 용액의 부피는 디쉬 또는 플라스크 중 약 0.1-1.0 mL/cm2이다. 일부 실시양태에서, 회수 용액의 부피는 디쉬 또는 플라스크 중 약 0.25 mL/cm2이다.
회수 용액은 약 1시간 ∼ 약 5시간 동안 서서히, 연속적으로, 또는 간헐적으로 교반하면서 공급원 세포와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 회수 용액은 세포와 함께 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간 또는 약 5시간 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 천연 시클로덱스트린은 수소화, 히드로포르밀화, 산화, 환원, 및 탄소-탄소 커플링 반응에 의해 변성된다. 널리 공지된 이러한 변성은 2-히드록시프로필 β-시클로덱스트린 및 메틸-β-시클로덱스트린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린은 메틸-β-시클로덱스트린(MBCD)이다.
특정 실시양태에서, 회수 용액은 코스모트롭을 추가로 포함한다. 회수 용액 제조를 위한 한가지 예시적 방법은, 단백질 분자를 둘러싼 물을 변위하는 코스모트롭 제제의 첨가를 포함한다. 예시적 코스모트롭 제제는 약 5% ∼ 약 30%의 최종 농도로 시클로덱스트린 복합체 용액에 첨가되는 트레할로스이다. 다른 실시양태에서, 코스모트롭 농도는 약 5% ∼ 약 10%, 약 10% ∼ 약 15%, 약 15% ∼ 약 20%, 약 15% ∼ 약 25%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 또는 약 30%, 또는 이들 값에 의해 한정되는 임의의 농도이다. 한 실시양태에서, 트레할로스 농도는 회수 직후에 첨가된 20% w/v이다.
일부 실시양태에서, 회수 용액은 수중 10 mM 시클로덱스트린 및 20% 트레할로스를 포함한다.
시클로덱스트린 복합체는 저온 방법(예를 들어, 냉동 건조)을 사용하는 동결 건조에 의해 더 보존될 수 있다.
개시된 조성물 중 Wnt 및 Hh 단백질의 검출은, 상업적으로 입수 가능한 정량적 ELISA 검출 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 개시되어 있는 지질 변성된 단백질/시클로덱스트린 복합체의 한 실시양태가 도 4a 및 4b에 도시된다.
시클로덱스트린 Wnt/Hh 복합체의 사용은 하기 원리를 준수하여 생체내 적용을 위해 제제화될 수 있다: (1) 제조 및 보관 온도는 40℃ 미만으로 유지되어야 함; (2) 최종 생성물은 시클로덱스트린 페이로드(즉, 지질 변성된 단백질)를 변위할 수 있는 소수성 분자를 포함하지 않아야 함, 및 (3) 최종 생성물은 은(Ag) 나노 입자 또는 마이크로 입자, 페녹시에탄올, 카프릴릴 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 또는 국소 적용에 사용되는 기타 제제와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 항미생물 안정제 또는 방부제를 포함할 수 있음.
한 예시적 실시양태에서, Wnt/Hh-시클로덱스트린 복합체를 포함하는 조성물은 수용액이며, 선택적으로 은 입자를 추가로 포함한다. 조성물은 아미노산, 펩타이드, 단백질, 수용성 비타민 및 미량 원소 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 조성물의 예시적인 성분은 수용성 성장 인자 및 스테로이드 호르몬과 이의 유사체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 예시적인 수용성 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 상피 성장 인자(EGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 간세포 성장 인자(HGF) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
은 입자(나노 입자 또는 마이크로 입자)는 0.01-1.0% w/v의 농도로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 은 입자는 0.1-0.55 w/v의 농도로 포함된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따라 제조된 국소용 조성물 또는 제제는 액체, 페이스트, 크림, 로션, 분말, 연고 또는 겔의 조성물 형태를 취할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물 형태는 페이스트이며, 이는 국소 적용을 위한 하나 이상의 물질을 함유하는 반고체 제형을 의미한다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물 형태는 크림이다. 본원에서 사용될 때 용어 "크림"은 수중유 또는 유중수 형태의 점성 액체 또는 반고체 에멀션을 말한다. 본원에서 사용될 때 "에멀션"은 분산된 상과 분산 매질 모두가 비혼화성 액체인 콜로이드 시스템을 말하며, 여기서 분산된 액체는 분산 매질 액체의 자체 전반에 걸쳐 작은 작은 구체로 분산된다. 안정된 염기성 에멀션은 2 이상의 액체 및 유화제를 함유한다. 에멀션의 통상적인 유형은 오일이 분산된 액체이고 수용액, 예컨대 물이 분산 매질인 수중유, 그리고 반대로 수용액이 분산된 상인 유중수이다. 비수성 에멀션을 제조하는 것도 가능하다. 수중유 유형의 크림은 핸드 크림 및 파운데이션 크림을 포함한다. 유중수 크림은 콜드 크림 및 피부연화 크림을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물 형태는 적절한 비히클 중에 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 액체 또는 반 액체 조제물을 의미하는 로션이다. 로션은 수성 매질, 에멀션 또는 용액 중의 고형물 현탁액일 수 있다.
"용액"은 일반적으로 2 이상의 물질의 균질 혼합물로 간주된다. 이것은 필수적이지는 않지만 흔히 액체이다. 용액에서, 용질의 분자(또는 용해된 물질)는 용매의 그것들 사이에 균일하게 분산되어 있다. 본 개시내용의 조성물에 유용할 수 있는 용매는 물뿐만 아니라 유기 용매, 예컨대 알코올을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물 형태는 연고이다. 연고는 흔히 피부에 외부 적용을 목적으로 하는 반고체 제제이다. 일반적으로, 연고 베이스는 탄화수소 베이스(유성), 흡착 베이스(무수물); 에멀션 베이스(물 및 오일 타입); 및 수용성 베이스를 포함한다. 이들의 무수 성질 때문에, 연고는 일반적으로 방부제를 필요로 하지 않는다. 이들은 크림보다 더 보습성이고 더 차단성이며, 피부 위에 보호막을 형성한다. 차단 효과는 침투를 연장시키고 증진시키는 경향이 있다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 조성물 형태는 겔이다. 본원에서 사용될 때 용어 "겔"은 수성 또는 알코올성 베이스 중 고분자량 폴리머로부터 제조 된 점성의 젤리형 반고체 또는 고체를 가리킨다.
추가의 조성물 형태는 제제 분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 본원에 참조로 인용된 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Gennaro, A.R. et al., eds) Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
유화제, 방부제, 습윤제, 증점제, 향료, 염료, 약초 추출물 및 비타민을 포함하는 다수의 추가 성분이, 기능적, 심미적 및 마케팅 목적으로, 본원에 개시된 조성물에 첨가될 수 있으며, 단, 선택된 추가 성분(들)은 화학적으로 및 물리적으로 양립 가능해야 한다. 용어 "양립 가능"은 조성물의 성분이 통상적인 사용 조건 하에서 조성물의 효능을 실질적으로 감소시킬 수 있는 상호 작용이 없도록 하는 방식으로 서로 조합될 수 있음을 의미하는 것으로 사용된다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물은 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-80, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용될 때 용어 "담체"는 하나 이상의 활성 제제를 대상체에게 전달하기위한 약학적으로 허용 가능한 비활성 제제 또는 비히클을 지칭하며, 흔히 "부형제"로 지칭된다. 담체는 치료 대상체에게 투여하기에 적합하도록 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 담체는 또한 본원에 개시된 지질 변성된 단백질/시클로덱스트린 복합체의 안정성 및 생체 이용률을 유지해야 한다. 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 주어진 조성물의 활성 제제 및 다른 성분과 조합될 때 원하는 벌크, 일관성 등을 제공하기 위해, 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 기재된 조성물은 수성 담체를 포함한다. 담체의 수준 및 종은 다른 성분과의 양립 가능성 및 제품의 다른 바람직한 특성에 따라 선택된다. 수성 담체는, 예를 들어 약 30 ∼ 약 98 중량%, 약 50 ∼ 약 95 중량%, 또는 약 70 ∼ 약 95 중량%의 수준으로 조성물에 함유된다.
예시적인 담체는 물 및 저급 알킬 알코올 수용액을 포함한다. 예시적인 저급 알킬 알코올은 1∼6 개의 탄소 원자를 갖는 1가 알코올, 예컨대 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 수성 담체는 실질적으로 물이다.
기술된 조성물의 pH는, 예를 들어 약 4 ∼ 약 8이다. 피부 유익 제제가 조성물에 포함되는 경우, pH는 최적의 효능을 제공하는 것으로 조정될 수 있다. 바람직한 pH를 달성하기 위해서 완충제 및 다른 pH 조절제가 포함될 수 있다. 본원에서 예시적인 pH 조절제는 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 트리에탄올아민 및 카보네이트를 포함한다.
기술된 조성물의 점도(흐름에 대한 저항성)는 넓은 범위에 걸쳐 변화할 수 있으며, 점성화제에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에 따르면, 기술된 조성물은 약 500 mPas ∼ 약 1,000,000 Pas의 점도를 갖는 조성물을 제공하는 점성화제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 점성화제는 약 1,000 mPas ∼ 약 100,000 mPas의 점도를 갖는 조성물을 제공한다.
카르복실산/카르복실산 코폴리머는 마이크로 에멀션을 제공하기 위해 사용되는 점성화제의 비제한적인 예이다. 이러한 코폴리머는 사용시 끈적거리거나 기름지지 않으면서 적당한 점도로 조성물을 유지할 수 있으며, 수불용성 성분이 포함될 때 조성물에 수불용성 성분을 분산 및 안정화시킬 수 있다. 예시적인 시판의 카르복실산/카르복실레이트 코폴리머는 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체, 예컨대 PEMULENTM TR-I, PEMULENTM TR-2, CARBOPOL® 1342, CARBOPOL® 1382, 및 CARBOPOL® ETD 2020을 포함하며, 이들은 전부 B. F. Goodrich Company로부터 입수 가능하다.
중화제, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 모노에탄올아민, 디에탄올 아민, 트리에탄올아민, 디이소프로판올아민, 아미노메틸프로판올, 트로메타민, 테트라히드록시프로필 에틸렌디아민, 및 이들의 혼합물이 카르복실산/카르복실레이트 코폴리머를 중화하기 위해 포함될 수 있다.
예시적인 셀룰로오스 유도체 폴리머는, 제한 없이 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시에틸 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 나트륨 셀룰로오스 설페이트, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 셀룰로오스 유도체 폴리머는 히드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 및 이들의 혼합물이다. 본원에서 매우 유용한 시판의 화합물은 상표명 'Natrosol Hydroxyethylcellulose'를 갖는 히드록시에틸셀룰로오스 및 상표명 'Aqualon Cellulose Gum'을 갖는 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하며, 이들은 둘 다 Aqualon으로부터 입수 가능하다.
다른 예시적인 점성화제는 풀룰란, 만난, 스크룰루글루칸, 폴리비닐피롤리 돈, 폴리비닐 알코올, 구아 검, 히드록시프로필 구아 검, 크산탄 검, 아카시아 검, 아라비아 검, 트라가칸트, 갈락탄, 카로브 검, 카라야 검, 로커스트 콩 검, 카라기닌, 펙틴, 아밀로펙틴, 아가, 마르멜로 종자(Cydonia oblonga Mill), 전분(쌀, 옥수수, 감자, 밀), 및 조류 콜로이드(조류 추출물)을 포함한다. 예시적인 미생물 폴리머는, 제한 없이 덱스트란, 숙시노글루칸, 전분계 폴리머, 예컨대 카르복시메틸 전분 및 메틸히드록시프로필 전분을 포함한다. 예시적인 알긴산계 폴리머는, 제한 없이 알긴산나트륨, 및 알긴산 프로필렌 글리콜 에스테르를 포함한다. 예시적인 아크릴레이트 폴리머는, 제한 없이 나트륨 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드 및 폴리에틸렌이민을 포함한다. 예시적인 무기 수용성 물질은, 제한 없이 벤토나이트, 알루미늄 마그네슘 실리케이트, 라포나이트, 헥토나이트 및 무수 규산을 포함한다.
약 1000 초과의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 글리콜은 또한 예시적인 점성화제이다. 예시적인 화합물은 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌, 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드, 폴리옥시프로필렌, 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 폴리프로피렌 글리콜 및 혼합된 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 코폴리머를 포함한다. 예시적인 폴리에틸렌 글리콜 폴리머는, 제한 없이, Union Carbide로부터 PEG-2,000으로서 입수 가능한, POLYOX WSR® N-10으로도 공지된 PEG-2M; POLYOX WSR® N-35로도 공지된 PEG-5M; 및 POLYOX WSR® N-80(둘 다 Union Carbide로부터, PEG-5,000 및 Polyethylene Glycol 300,000으로서 입수 가능함); POLYOX WSR® N-750으로도 공지된 PEG-7M(Union Carbide로부터 입수 가능함); POLYOX WSR® N-3333으로도 공지된 PEG-9M(Union Carbide로부터 입수 가능함); 및 POLYOX WSR® N-3000으로도 공지된 PEG-14M(Union Carbide로부터 입수 가능함)을 포함한다.
예시적인 시판되는 추가의 수용성 폴리머는, 제한 없이 크산탄검(KELTROL™, Kelco로부터 입수 가능함), 카르보머(CARBOPOL™ 934, CARBOPOL™ 940, CARBOPOL™ 950, CARBOPOL™ 980 및 CARBOPOL™ 981(모두 B. F. Goodrich Company로부터 입수 가능함)), 아크릴레이트/스테아레스-20 메타크릴레이트 코폴리머(ACRYSOL™ 22(Rohm and Hass로부터 입수 가능함)), 폴리아크릴아미드(SEPIGEL™ 305(Seppic으로부터 입수 가능함)), 글리세릴 폴리메타크릴레이트(LUBRAGEL™ NP), 및 글리세릴 폴리메타크릴레이트의 혼합물, 프로필렌 글리콜 및 PVM/MA 코폴리머(LUBRAGEL™ OIL(ISP로부터 입수 가능함)), 스클레로글루칸(Michel Mercier Products Inc.(NJ, 미국)로부터 입수 가능한 CLEAROGEL™ SCII), 에틸렌 옥시드 및/또는 프로필렌 옥시드 베이스의 폴리머(CARBOWAX™ PEG, POLYOX™ WASR 및 UCON™ FLUIDS(모두 Amerchol에서 공급함))를 포함한다.
다른 예시적인 제제는 상업적으로 입수 가능한 양성 폴리머, 예컨대 Polyquaternium 22(MERQUAT™ 280, MERQUAT™ 295), Polyquaternium 39(MERQUAT™ PLUS 3330, MERQUAT™ PLUS 3331) 및 Polyquaternium 47(MERQUAT™ 2001, MERQUAT™ 200 IN)을 포함하며, 이들은 모두 Calgon Corporation에서 입수 가능하다.
본원에서 사용될 때 용어 "습윤제"는, 그의 흡습성으로 인해 수분 보유를 촉진시키는 물질을 가리킨다. 이들은 피부에 흡수되어 작용하고, 대기로부터 물을 끌어들인다. 끌어들여진 물은 각질층을 위한 급수장의 역할을 한다.
예시적인 수용성 습윤제는, 제한 없이 다가 알코올, 예컨대 부틸렌 글리콜(1,3-부탄디올), 펜틸렌 글리콜(1,2-펜탄디올), 글리세린, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 에톡실화 글루코오스, 1,2-헥산 디올, 1,2-펜탄 디올, 헥산트리올, 디프로필렌 글리콜, 에리트리톨, 트레할로스, 디글리세린, 자일리톨, 말티톨, 말토오스, 글루코오스, 프룩토오스; 및 다른 수용성 화합물, 예컨대 우레아, 나트륨 콘드로이틴 설페이트, 나트륨 히알루로네이트, 나트륨 아데노신 포스페이트, 나트륨 락테이트, 피롤리돈 카보네이트, 글루코사민, 시클로덱스트린, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 추가의 예는 수용성 알콕실화 비이온성 폴리머, 예컨대 약 1000 이하의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜(예컨대 PEG-200, PEG-400, PEG-600, PEG-1000), 및 이들의 혼합물을 포함한다.
상업적으로 입수 가능한 습윤제는, 제한 없이 부틸렌 글리콜(Celanese로부터 입수 가능한 1,3-부틸렌 글리콜), 펜틸렌 글리콜(Dragoco로부터 입수 가능한 HYDROLITE™-5), 글리세린(The Procter & Gamble Company로부터 입수 가능한 STAR™ 및 SUPEROL™), Croda Universal Ltd.로부터 입수 가능한 CRODEROL™ GA7000, Unichema로부터 입수 가능한 PRECERIN™ 시리즈, 및 NOF로부터 입수 가능한 화학명과 동일한 상표명; 프로필렌 글리콜(Inolex로부터 입수 가능한 LEXOL™ PG-865/855), BASF로부터 입수 가능한 1,2-PROPYLENE GLYCOL USP; 소르비톨(Lipo로부터 입수 가능한 LIPONIC™ 시리즈), ICI로부터 입수 가능한 SORBO™, ALEX™, A-625™ 및 A-641™, 및 UPI로부터 입수 가능한 UNISWEET™ 70, UNISWEET™ CONC; BASF로부터 입수 가능한 동일한 상표명을 갖는 디프로필렌 글리콜; 디글리세린(Solvay GmbH로부터 입수 가능한 DIGLYCEROL™); Kyowa and Eizai로부터 입수 가능한 동일한 상표명의 자일리톨, 말티톨(Hayashibara로부터 입수 가능한 MALBIT™), Freeman and Bioiberica로부터 입수 가능한 동일한 상표명을 갖는 나트륨 콘드로이틴 설페이트, Atomergic Chemetals로부터 입수 가능한 상표명 ATOMERGIC SODIUM CHONDROITIN SULFATE를 갖는 나트륨 콘드로이틴 설페이트; Chisso Corp.로부터 입수 가능한 소디움 히알루로네이트, Active Organics로부터 입수 가능한 상품명 ACTIMOIST™을 갖는 소디움 히알루로네이트, Intergen으로부터 입수 가능한 AVIAN SODIUM HYALURONATE 시리즈, Ichimaru Pharcos로부터 입수 가능한 HYALURONIC ACID Na; Asahikasei, Kyowa 및 Daiichi Seiyaku로부터 입수 가능한 동일한 상표명을 갖는 나트륨 아데노신 포스페이트; Merck, Wako 및 Showa Kako로부터 입수 가능한 동일한 상품명을 갖는 나트륨 락테이트, 시클로덱스트린(American Maize로부터 입수 가능한 CAVITRON™, Rhone-Poulenc로부터 입수 가능한 RHODOCAP™ 시리즈, 및 Tomen으로부터 입수 가능한 DEXPEARL™); 폴리에틸렌 글리콜(Union Carbide로부터 입수 가능한 CARBOWAX™ 시리즈), 및 글리세릴 폴리메타크릴레이트, 프로필렌 글리콜 및 PVM/MA 코폴리머의 혼합물(Guardian Lab으로부터 입수 가능한 LUBRAJEL™ Oil)을 포함한다.
본원에서 용어 "보존제"는 물을 함유하는 생성물에서 바람직하지 않은 미생물의 성장을 방지하거나 억제하는 물질을 지칭하기 위해 사용된다. 약제, 예컨대 국소용 제제에서의 사용이 승인된 방부제는, 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 연방 법전 편찬 21권에 게시된 현행의 연방 규정에서 확인할 수 있다. 예시적인 방부제는, 제한 없이 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 비오페인, BHT(부틸화 히드록실-톨루엔), 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸파라벤, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 소르베이트, 시트르산, 시나몬 카시아, 클로로크레졸, 디아졸리디닐 우레아, 디라우일 티오디프로피오네이트, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산 테트라나트륨 염), 에리토르빈산, 자몽씨 추출물, 히드록시벤조에이트, 메틸파라벤, 네오페인, 페노닙, 페녹시에탄올, 칼륨 바이설파이트, 칼륨 메타바이설파이트, 칼륨 소르베이트, 프로필파라벤, 로즈마리 오일 추출물, 아스코르브산 나트륨, 벤조산나트륨, 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 소르베이트, 이산화황, 슈프라레인, 티오디프로피온산, 은 입자, 및/또는 토코페롤을 포함한다. 추가로, 저온(예를 들어, 4℃ 미만, 또는 동결)에서 보관함으로써 보존을 수행할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 격일로, 매주, 또는 목적하는 결과를 달성하기 위해 필요한 임의의 기간 동안 국소적으로 적용된다. 일반적으로, 조성물은 원하는 치료 영역에 국소적으로 적용되고, 피부 내로 흡수되도록 허용된다.
치료 용도
시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체를 함유하는 조성물에 대한 치료 용도는, 모발 성장 또는 재성장 목적, 자가 수용체에 이식될 수 있는 모낭의 생성을 위한 모낭 줄기 세포의 시험관내 증식, 반흔 치유, 촉각 회복, 피부 외관 개선 및 조직 회생을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
시클로덱스트린 복합체에 의해 표적화된 조직은 페이로드 단백질(예컨대, Frizzled, Patched 등)에 대한 수용체 및 교환 소수성 분자, 예를 들어 세포막으로부터의 콜레스테롤 또는 지질 분비물, 예컨대 피지를 함유해야한다.
본원에 개시된 조성물 및 제제는 국소 투여될 수 있다. 시클로덱스트린 복합체 함유 조성물은 회수 용액의 약 0.1% ∼ 약 100%를 함유하는 용량으로 국소 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5% ∼ 약 25%(v/w, v/v 또는 w/v), 약 10% ∼ 약 25%, 약 15% ∼ 약 25%, 약 20% ∼ 약 25%, 약 5% ∼ 약 20%, 약 5% ∼ 약 15%, 약 5% ∼ 약 10%, 약 5%, 약 7.5%, 약 10%, 약 12.5%, 약 15%, 약 17.5%, 약 20%, 약 22.5% 또는 약 25%, 또는 이들 값에 의해 한정되는 임의의 범위의 용량으로 국소 투여된다.
본원에 개시된 조성물의 투여량 및 바람직한 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량의 결정은 일반 의사의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효 용량 결정에 대한 신뢰할만한 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 스케일링은 문헌[Mardenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 규정된 원리를 따라 수행될 수 있다. 본원에 사용될 때 용어 "치료 유효량"은, 예를 들어 모발 성장과 같은 특정 치료를 수행하는 데 필요한 양을 지칭한다. "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 말하며, 여기서 목적은 표적 병태 또는 장애를 예방하거나 느리게 하는(감소시키는) 것이다. 치료가 필요한 자로는 이미 장애가 있는 자, 그리고 장애를 갖기 쉬운 자, 또는 장애를 예방해야 하는 자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애가 존재한다.
모발 성장 또는 재성장의 용도로, 본원에 개시된 조성물은 연장된 성장기를 유지하기 위해 건강한 두피에 적용되거나, 휴지기로부터 성장기로 전환시키기 위해서 또는 데노보 모발 성장을 유도하기 위해서 다양한 형태의 탈모증에 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 모발 성장 또는 모발 재성장을 유도하기 위해서 두피의 일부에 국소 적용된다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 모발 성장 또는 모발 재성장이 필요한 신체의 다른 영역, 예를 들어 눈썹, 속눈썹, 안면, 흉부, 팔, 다리 또는 생식기 영역을 포함하는 이들로 한정되지 않는 영역에 적용된다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 반흔 치유, 예컨대 무력성 반흔의 치유 촉진 또는 흉터 없는 반흔 치유에 국소 적용된다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 반흔 치유를 돕도록 반흔에 국소 적용된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 흉터의 외관을 최소화하기 위해, 존재하는 흉터에 국소 적용된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 촉각을 개선하기 위해, 감소된 촉각 영역에 국소 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 생기 있는 외관의 향상, 주름 감소, 피부 탄력 개선, 피부 노화 및 환경 스트레스의 가시적 영향의 억제, 과색소 침착 또는 저색소 침착의 감소, 검버섯의 외관 개선, 피부결 개선, 및/또는 피부 색소 침착의 균질성 개선을 위해 피부에 국소 적용된다.
실시예
실시예 1. 부분적으로 분화된 배아 줄기 세포 배양물로부터 유래된 세포로부터의 Hh/Wnt의 포획 및 검출.
배아 줄기 세포는 MATRIGEL®의 박층 상에 구성된 부착성 기재 상에 bFGF(10 ng/mL) 및 액티틴 A(5 ng/mL)가 보충된 무혈청 배지를 사용하여, 현재 공개된 방법에 따라 증식시켰다. 융합 후, 배양물의 절반에 성장기 bFGF 및 Activin A를 포함하지 않는 동일한 배지를 공급하였다. 세포 배양 상등액 샘플을 폴리스트타틴 농도에 대해 분석하였다.
미분화 또는 부분 분화된 각각의 배양액을 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 또는 메틸-β-시클로덱스트린(MBCD)의 10 mM 용액에 60분 ∼ 180분 동안 노출시켰다. 노출 전의 세포 배양물은 매끄럽고 조밀하며 다층형이었다(도 5a). 시클로덱스트린과 함께 인큐베이션한 후, 대부분의 세포가 접착성을 잃으면서 배양물이 파괴되었다(도 5b).
이어서, 세포와 함께 인큐베이션된 MBCD 용액을 Shh, Wnt3a 및 Wnt7a의 농도에 대해 분석하였다. 그 결과를 표 3에 제시한다.
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α- 또는 β-시클로덱스트린의 첨가는, 감소되었지만 비례하는 효과를 나타내었다.
실시예 2. 동물 모델에서의 모발 성장에 대한 비교 연구
부분 분화된 배아 줄기 세포의 배양물을 10 mM 메틸-β-시클로덱스트린 및 주사용수 중 20% 트레할로스를 함유하는 회수 용액에, 1 mL/106 세포 부피로 실온에서 3시간 동안 노출시켜, 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체를 수득하였고, 이후 이것을 "활성 성분"으로 지칭하였다.
모발 성장(또는 재성장)을 목표로 하여, 제제화된 활성 성분(방부제로서 페녹시에탄올 및 카프릴릴 글리콜 0.75% 함유)을 시험하였다. 모발 성장에 대한 마우스 모델을 사용하여, 프로토타입 제제를 시험하였다. 확인된 제1 휴지기 단계에 있는 6주령의 수컷 및 암컷 마우스를, 3가지 상이한 농도의 치료군 및 음성 대조군으로 무작위 추출하였다.
-1일째에, 모든 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 등 전체(어깨에서 둔부까지)를 가위로 제모하였다. 시험품을 0일째부터 시작하여 연속적으로 14일 동안 국소 적용하였는데, 시험품을 각 마우스의 등 피부에 온건히 문질렀다. 각각 치료 유형마다 새로운 장갑을 착용하였다. 동물들은 케이지 동료가 시험품을 핥지 않도록, 치료 기간 동안에 단독 케이지에 수용하였다.
체중 및 임상적 관찰을 매주 측정하였다. 거시적 디지털 사진을 2일, 7일, 10일, 14일 및 21일째에 촬영하였다. 21일째에 모든 마우스의 피부 샘플을 수집하고, 조직학 분석을 위해 포르말린에 고정시켰다.
모든 치료군은 활성 성분의 농도에 관계 없이 새로운 성장기 패치에 의해 반응하였다. 그 반응은, 제모된 영역에서의 피부 어두움 증가 및 새로운 성장기 패치의 수 증가에 의해 확인되었다(도 6, 7a-c).
헤마톡실린 및 에오신 염색은, 대조군에 있어서 1일째에서의 휴지기 시작 및 연구 종료시의 지속성을 입증한다(도 8). 치료군은, 가시적인 않은 모발 성장(도 9) 및 새로운 모발 패치에서의 일반적인 성장기 모낭(도 10)을 아직 보이지 않는 영역에서, 휴지기로부터 성장기로의 전환을 보여준다.
휴지기 단계에서, 모낭 줄기 세포는 늙은 모낭의 벌지 영역에 후면 국재화된다. Wnt가 없는 경우, LGR5 발현은 최소이거나 부재한다. CK14는 모낭의 외모근초에 걸쳐 발견되는 피부 기저 세포 마커이다(도 11). 성장기로 전환되는 동안에, Wnt 신호전달은 β-카테닌을 안정화하고 추정상 모낭 줄기 세포 마커인 Lgr5를 유도한다. Lgr5+ 세포는 진피 유두로 이동하면, 실제 모낭 줄기를 북돋는다(도 12).
SOX9는 모낭 줄기 세포의 운명 및 가소성을 조절하는 개척 인자로서, 외모근초(ORS) 분화 및 벌지에서의 모발 줄기 세포 구획의 형성에 필수적이다. Sox9 발현은 소닉 헤지호그(Shh) 신호전달에 의존한다. 치료된 동물은 Sox9 양성으로 모발 줄기 세포 동원을 나타낸다(도 13).
실시예 3. 생체외 인간 모낭 배양물
모구 영역의 존재가 분명한, 뽑아낸 인간 모발을, 세포 성장 배지에서 수집 한 직후에 침지시켰다. 모발 샘플의 일부를, 실시예 2에 기술한 배아 줄기 세포 배양물로부터의 지질 변성된 단백질/MBCD 복합체(로딩된 MBCD)(활성 성분으로 언급됨)에, 또는 대조군으로서의 로딩되지 않은 MBCD에, 시클로덱스트린 성분의 0.25 mM의 동일한 농도로 노출시켰다. 다른 성장 인자(예컨대, EGF, KGF 등)를 모낭 배양에 사용하지 않았다. 배양 2일 후(도 14A-C), MBCD 함유 및 대조군 모낭 배양물 모두에서 세포의 부착 및 작은 돌출 성장이 관찰되었고, 이때 MBCD 로딩된 인자를 함유하는 모낭 배양물에서 더 많은 돌출 성장이 관찰되었다. 노출 5일 후(도 14D-G), 대조 모낭은 노화를 겪었고 기재로부터 분리된 반면에, MBCD에 노출된 모낭 배양물은 직경 증가 및 부착 세포의 돌출 성장이 지속되었다.
대머리가 아닌 사람으로부터의 인간 모낭을, 두피 샘플로부터 절개 채취하였다. 그룹당 총 15개의 모낭을, 5% 태아 소 혈청 배양 배지를 갖는 표준 DMEM:F12에 옮기고, 0.1 mM, 0.25 mM 또는 0.5 mM의 시클로덱스트린 성분 농도에 있는 활성 성분 또는 대조군에 노출시켰다. 모발 길이와 모낭 두께를 0일째 및 7일째에 측정하였다.
7일 이내에, 모낭 대부분이 길이가 성장하여, 길이가 0%에서 63%로 증가하였다. 0.25 mM의 활성 성분으로 치료된 모낭은 42% +/- 13% 성장하였고, 다른 치료군의 모낭은 33% ∼ 34% 성장하였다. 동일한 시험 조건이, 모낭 두께 성장에서 통계적으로 유의함(p<0.01)에 도달하였다(도 15a-B).
실시예 4. 세포막 결합된 지질 변성된 신호전달 인자를 함유하는 제제의 임상 시험
시클로덱스트린 /지질 변성된 단백질 복합체로 이루어진 활성 성분은, 부분 분화된 인간 배아 줄기 세포의 배양물을 10 mM 메틸-β-시클로덱스트린 및 주사용수 중 20% 트레할로스를 중에 함유하는 회수 용액에, 1 mL/106 세포로, 실온에서 3시간 노출시킴으로써 제조하였다. 이 조성물을, 한 손의 손목 관절의 등쪽 영역에 외부 적용한 반면에, 다른 손은 치료되지 않은 채로 두었다. 이 손의 섹션은 동일한 좌우 패턴 및 밀도를 갖는 말기 팔 연모로 덮여 있으나, 기계적 마모로 인한 휴지기의 징후가 분명하다. 적용은 약 1방울(30 μL)로 이루어졌으며, 이것을 피부에 퍼트려 점성이 될 때까지 건조한 다음, 점성이 사라질 때까지 문질러주었다. 이 부위를 5일간 매일 치료하고, 2주 후에 평가하였다. 말기 팔 연모의 성장은 치료된 영역에서 명백히 두드러졌다(도 16c-d). 또한, 나이와 관련된 주름 및 반점형 색소 침착이 명확히 감소되었으며, 피부결이 개선되었다. 촉각의 향상은, 2점 감별 능력을 증가시킴으로써 대상체에 의해 보고되었다. 이 관찰은 피부에 대한 회생 효과 를 시사한다(도 16a-b)
달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는, 모든 경우에서 "약"이라는 용어로 수식된 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용될 때 용어 "약" 및 "대략"은 10% ∼ 15%, 바람직하게는 5% ∼ 10% 이내를 의미한다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구 범위에 대한 균등내용의 원리 적용을 제한하려는 시도는 아니며, 각 수치 파라미터는 최소한 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 반드시 발생하는 특정 오류를 포함한다.
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "한", "하나", "그" 및 유사한 지시사는, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값 범위에 대한 기재는, 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 것의 단축된 방법으로서의 역할을 의도한 것이다. 본 명세서에서 달리 명시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본원에 기술된 모든 방법은, 본원에서 달리 명시되거나 아니면 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어구(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서 내의 어떠한 어구도 본 발명의 실시에 필수적인 비청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시양태의 그룹핑은, 제한으로 해석되어서는 안된다. 각 그룹의 일원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 일원이나 본원에서 찾아볼 수 있는 다른 요소와 조합하여 언급되거나 청구될 수 있다. 편의성 및/또는 특허성을 이유로, 한 그룹의 하나 이상의 일원이 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 그러한 포함 또는 삭제가 발생하면, 본 명세서는 변경된 그룹을 포함하는 것으로 간주되며, 따라서 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬 그룹의 서면 기재를 충족한다.
본 발명의 특정 실시양태는, 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최선의 모드를 포함하여 본원에 기재된다. 물론, 상기 기술한 실시양태에 대한 변형은 앞선 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 당업자가 그러한 변형을 적절하게 활용할 것으로 예상하고, 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기술된 것 이외의 방법으로 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률에 의해 허용되는 바로서, 본 명세서에 첨부된 청구범위에 기재된 주제의 모든 변형예 및 균등내용을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 명시되거나 문맥에상 명확히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형예에서의 전술한 요소들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 특정 실시양태는 '이루어진' 또는 '실질적으로 이루어진'의 어구를 사용하여 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 청구범위에서 사용될 때, 제출된 그대로이든, 또는 보정에 의해 추가되었든, 전도 용어 "이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전도 용어 "실질적으로 이루어진"은 청구범위를 특정 물질 또는 단계, 그리고 기본 특성과 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 한정한다. 이렇게 청구된 본 발명의 실시양태는 내재적으로 또는 명시적으로 기술되고 본원에서 가능해진다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허 및 공개 공보에 대한 다수의 참조가 이루어졌다. 상기 언급된 참고 문헌 및 공개 공보 각각은, 그의 전체가 본원에 개별적으로 참조 인용되어 있다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원리를 설명하는 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형예는 본 발명의 범위 내에 속한다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 설명된 바와 같이 정확하게 한정되지 않는다.

Claims (57)

  1. 지질 변성된 단백질과 시클로덱스트린의 복합체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 또는 메틸-β-시클로덱스트린 중 하나 이상인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시클로덱스트린은 수소화, 히드로포르밀화, 메틸화, 산화, 환원, 또는 탄소-탄소 커플링 반응에 의해 변성된 화학적 변성 시클로덱스트린인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로덱스트린은 메틸-β-시클로덱스트린인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 변성된 단백질은 세포막 지질과 관련된 하나 이상의 윙리스(Wingless)(Wnt) 또는 헤지호그(Hedgehog)(Hh) 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, Hh 단백질은 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog)(Shh) 단백질, 데저트 헤지호그(Desert Hedgehog)(Dhh) 단백질, 또는 인디안 헤지호그(Indian Hedgehog)(Ihh) 단백질 중 하나 이상인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, Wnt 단백질은 Wnt3a, Wnt7b 또는 Wnt10b 중 하나 이상인 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 변성된 단백질은 윙리스(Wnt) 또는 헤지호그(Hh) 일족에 속하는 단백질 이외의 다른 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 변성된 단백질은 줄기 세포의 집단으로부터 회수되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 단위생식(parthenogenic) 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 또는 유도 만능 줄기 세포인 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 줄기 세포는 포유류 줄기 세포인 조성물.
  12. 제9항 또는 제11항에 있어서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포인 조성물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포는 Wnt 또는 Hh 단백질을 과발현하도록 유전자 조작되는 것인 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포는 불멸성이도록 유전자 조작되는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 줄기 세포는 텔로머라아제 역전사 효소(hTERT)를 발현하도록 유전자 조작되는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 코스모트롭(kosmotrope)을 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 1 이상의 코스모트롭은 프로필렌 글리콜, 프롤린, 트레할로스, 엑토인, 또는 트리메틸아민 N-옥시드인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 1 이상의 코스모트롭은 트레할로스인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 지질 변성된 단백질과 시클로덱스트린의 복합체를 포함하는 국소용 조성물.
  20. 제19항 또는 제20항에 있어서, 수성 제제 중에 있는 국소용 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 1 이상의 코스모트롭, 및 항미생물제를 추가로 포함하는 국소용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 1 이상의 코스모트롭은 트레할로스인 국소용 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 항미생물제는 은 입자를 포함하는 것인 국소용 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 은 입자는 은 나노 입자 또는 은 마이크로 입자인 국소용 조성물.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 4.5 ∼ 약 8.0인 국소용 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 조직 재생(tissue regeneration)의 촉진을 필요로 하는 조직에서 조직 재생을 촉진하는 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 조직 회생(tissue rejuvenation)의 촉진을 필요로 하는 조직에서 조직 회생을 촉진하는 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물에 조직을 노출시키는 것을 포함하는, 조직에서 감각 신경 기능을 회복시키는 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조직은 피부인 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조직은 반흔 조직인 방법.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물에 모낭을 노출시키는 것을 포함하는, 모발 성장을 촉진하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 모발 성장은 노인성 탈모, 전두 탈모증, 휴지기 및 성장기 탈모, 또는 원형 탈모증을 갖는 대상체에서 촉진되는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 두피에 있는 것인 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 속눈썹에 있는 것인 방법.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 눈썹에 있는 것인 방법.
  36. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 안면에 있는 것인 방법.
  37. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 흉부에 있는 것인 방법.
  38. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 팔에 있는 것인 방법.
  39. 제31항 또는 제32항에 있어서, 모낭은 대상체의 다리에 있는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물에 피부를 노출시키는 것을 포함하는, 피부의 외관을 개선하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 개선된 외관은 피부결, 주름, 변색 및 검버섯 중 하나 이상인 방법.
  42. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물에 모낭을 노출시키는 것을 포함하는, 모발의 외관을 개선하는 방법.
  43. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    배양 배지에서 Wnt 및 Hh 단백질을 생성할 수 있는 줄기 세포를 배양하는 단계;
    시클로덱스트린을 포함하는 회수(harvest) 용액에서 상기 세포를 인큐베이션하여, 지질 변성된 단백질의 시클로덱스트린 복합체를 수득하는 단계; 및
    시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하여, 국소용 제제를 형성하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  44. 제43항에 있어서, 회수 용액은 1 이상의 코스모트롭을 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
  45. 제43항에 있어서, 회수 용액은 안정화제를 포함하는 것인 제조 방법.
  46. 제45항에 있어서, 안정화제는 코스모트롭인 제조 방법.
  47. 제44항 또는 제46항에 있어서, 코스모트롭은 트레할로스인 제조 방법.
  48. 제44항, 제46항 및 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 용액 중 코스모트롭의 농도가 약 5% ∼ 약 30%인 제조 방법.
  49. 제44항 및 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 코스모트롭의 농도가 20%인 제조 방법.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 용액은 시클로덱스트린의 수용액을 포함하는 것인 제조 방법.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로덱스트린은 메틸-β-시클로덱스트린인 제조 방법.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 용액 중 시클로덱스트린의 농도가 약 1 mM ∼ 약 20 mM인 제조 방법.
  53. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 용액 중 시클로덱스트린의 농도가 약 10 mM인 제조 방법.
  54. 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체 용액이 4℃ 이하에서 보관되는 것인 제조 방법.
  55. 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로덱스트린/지질 변성된 단백질 복합체 용액이 동결 건조되는 것인 제조 방법.
  56. 제43항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 방부제를 포함하는 것인 제조 방법.
  57. 제43항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 항미생물제를 포함하는 것인 제조 방법.
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