KR20190086029A - 당단백질-약물 컨주게이트를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

당단백질을 변형시키는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 당단백질-페이로드 컨주게이트를 생산하는 방법뿐만 아니라, 그에 의해서 생산된 컨주게이트를 제공한다.

Description

당단백질-약물 컨주게이트를 제조하는 방법
본 출원은 2016년 12월 29일 출원된 미국가특허 출원 제62/440,075호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에서 참조로 통합된다.
본 발명은 당단백질을 변형시켜 당단백질이 하나 이상의 트리-만노실 코어를 포함하게 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 당단백질 및 관심 페이로드(payload)를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트(glycoprotein-payload conjugate)에 관한 것이다.
치료학적 단백질 약물은 임상에서 광범위하게 사용되고, 이들의 높은 가치, 높은 특수성 및 낮은 독성의 이점으로 인해서 세계의 큰 제약회사들 중 일부가 임상 시험에 대한 이러한 부류의 약물의 개발에 그들 자신을 몰두하고 있다. 대부분의 이들 치료학적 단백질은 모노클로날 항체이다. 환자들 중 일부는 이들의 임상 결과에 만족하기도 하지만, 임상 시험 데이터는 이들 항체의 일부의 치료학적 효과가, 특히, 암 치료에서, 여전히 개선될 필요가 있음을 제시하고 있다. 이러한 단점을 해소시키기 위해서, 과학자들은 일부 기술에 의해서 암 요법에서 이들의 효능을 개선시키기 위해서 이들 임상 항체를 변형시키는 것에 촛점을 맞추기 시작하고 있다. 이들 기술 중에, 항체-약물 컨주게이트(ADC)는 이들의 화학, 제조 및 조절(chemistry, manufacturing and control: CMC) 친화, 사용자 친화, 및 낮은 부작용으로 인해서 더욱 주목을 끌고 있다. 지금까지, Mylotarg®, Adcetris® , Besponsa® 및 Kadcyla®를 포함하는, 시중에서 구입 가능한 4 가지의 치료학적-항체-약물 컨주게이트가 있으며; 다른 많은 것들은 개발 중에 있다(Kubizek F1, Eggenreich B1, Spadiut O1. Protein Pept Lett. 2017,24(8):686-695; Fischer E., Roger Schibli R. Antibodies 2015, 4, 197-224; Sapra, P., Hooper, A., O'Donnell, C. and Gerber, H.-P. Expert Opin. Investig. Drugs 2011, 20, 1131-1180; Flygare, J., Pillow, T. and Aristoff, P., Chem. Biol. Drug Des. 2013, 81, 113?121; Panowski, S.; Bhakta, S.; Raab, H.; Polakis, P. and Junutula, J.R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs 2013, 6, 34-45).
이들 임상 ADC에서, Kadcyla 및 Mylotarg는 라이신 잔기의 아민 기에 페이로드 또는 링커를 무작위로 컨주게이션시킴으로써 형성되지만, Adcetris®, 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)(cAC10-vcMMAE, SGN-35)은 쥐 항-CD30 항체 AC10의 가변성 중쇄 및 경쇄 영역의 융합에 의한 키메라 항-CD30 모노클로날 항체이다. 평균 4개(2-8개)의 MMAE 분자가 SGN-30 스캐폴드(SGN-30 scaffold)에 컨주게이션된다. MMAE의 컨주게이트된 지점은 사슬간 디설파이드 결합의 온화한 환원에 의해서 생성되는 시스테인 잔기의 무작위 -SH 기이다. 링커는 티올-반응성 말레이미도카프로일 스페이서(thiol-reactive maleimidocaproyl spacer), 디펩티드 발린-시트룰린 링커, 및 PABC 스페이서로 이루어진다(Francisco JA, Cerveny CG, Meyer DL, Mixan BJ, Klussman K, Chace DF, Rejniak SX et al. cAC10-vcMMAE. Blood 2003, 4, 1458-65). 비록, 그러한 기술이 용이하게 페이로드 또는 링커를 항체에 용이하게 컨주게이션시키지만, 다중 라이신 서열 및 항체 내의 환원 시스테인 잔기들의 임의의 반응의 문제로 인해서, 이들 두 기술이 컨주게이트의 약물-대-항체 비율(drug-to-antibody ratio (DAR))을 조절하기 어렵다. 이러한 현상은 항상 항체 생성물의 불균질성을 유발시키고, CMC 문제를 유도한다. 일부 문헌은 심지어 이러한 유형의 제 1 세대인 비 부위-특이적 ADC가 PK 및 면역원성의 단점을 가짐을 나타내고 있다.
제 1 세대 ADC의 이들 단점을 해소시키기 위해서, SMART-Tag, 비-천연 아미노산, 즉, 임의의 티로신, 치료 소르타제(therapeutic sortase), Thio-Bridge 등을 포함한 부위-특이적 ADC 플랫폼이 개발되었다. 본 발명자들이 예상한 바와 같이, 이들 기술은 모체 항체 내의 일부 특이적 부위 또는 도메인을 조작함으로써 균질의 ADC 생성물을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, Thio-Bridge 기술은 링커와 페이로드를 항체의 부분적으로 환원된 디설파이드 결합에 연결시킨다. SMART-Tag는 박테리아 옥시다제의 기질 서열로서 항체의 인접 서열을 돌연변이시키는 기술이다. 포름알데하이드를 갖는 생성되는 생성물은 링커 및 페이로드의 연결 부위로서 사용된다. 예상된 바와 같이, 이들 제 2 세대 ADC 기술은 독특한 DAR 및 높은 균일성을 갖는 ADC 생성물을 생성시킬 수 있다. 그러나, 천연 항체의 돌연변이로 인해서, ADC 생성물은 PK 및 면역원성 문제를 가질 수 있다. 현재, N-글리코실화를 통한 항체에의 페이로드의 컨주게이션(conjugation)은 항체의 당조작(glycolengineering)의 성공적인 개발로 인해서 많은 주목을 끌었다.
모든 천연 IgGs 및 재조합 항체는 N-글리코실화 부위인 중쇄 CH2 불변영역의 각각 내의 위치 297(Asn297)에서 아미노산 아스파라긴을 갖는다. 포유동물 세포에서의 글리코실화 및 후 변형에 의해서, 두 개의 디-안테나-모양 모이어티(moiety)가 IgG 상의 N-글리코실화를 통해서 형성되며 디-안테나 모양 글리칸 모이어티의 각각은 근본적으로는 하기 화학식을 갖는 적어도 7개의 당 모이어티에 의해서 구성된다:
Figure pct00001
(10) ,
상기 식에서,
제 1 GlcNAc (GlcNAc1)는 각각 항체의 Asn297 및 제 2 GlcNAc(GlcNAc2), 및 임의의 푸코오스 당(Fuc)에 결합되고; GlcNAc2는 추가로 제 1 만노오스(Man1)에 결합되고; 제 2 및 제 3 만노오스(Man2 및 Man3)는 각각 Man1의 α-1,3 및 α-1,6 위치에 결합되고; 두 개의 추가의 GlcNAc 당(GlcNAc3 및 GlcNAc4)가 각각 Man2 및 Man3의 β-1,2 위치에 결합된다. 푸코오스를 갖는 그러한 글리칸 모이어티를 갖는 항체는 GOF로서 표현되지만, 푸코오스 모이어티(moiety)가 부재하는 때에는, 항체는 GO이다. (T. Shantha Raju MAbs. 2012 May 1; 4(3): 385-391). GlcNAc3 또는 GlcNAc4 중 어느 하나가 추가의 갈락토오스 당에 결합되는 때에, 항체는 G1F/G1 항체로서 표현된다. 항체의 글리칸 모이어티 내의 말단 GlcNAc 당 둘 모두가 각각 두 개의 추가의 갈락토오스 당에 결합되는 때에, 항체는 G2F/G2 항체로서 표현된다. 포유동물 세포에 의해서 생성된 항체는 일반적으로는 G0F(약 40% 초과), G1F(약 30% - 40%) 및 G2F(1% 미만), 및 시알산에 연결되는 매우 소량의 G1F/G1 및 G2F/G2를 포함할 수 있다.
N297 글리칸 내의 각각의 분기 부위를 조작하는 것이 구조를 온전하게 유지시키고 일부 작용 다양성, 예를 들어, 항체의 ADCC, 반감기 및 CDC를 생성시키기 때문에, 일부 N297 당조작 ADC 플랫폼(N297 glycoengineering ADC platform)이 개q발되었고, 생성물의 일부는 임상실험 단계에 있다. WO 2014/164534 A2, WO 2014/065661 A1, WO 2015/032899 A1, WO 2015/057064 A1, WO 2015/157446 A1, US 8716033 B2, US 7416858 B2, EP 2753752 B3 및 검토 논평(Bioconjug Chem.; 2015 Nov. 18; 26(11):2070-5)은 항체 약물 컨주게이션을 위한 많은 변형된 글리칸 모이어티를 개시하고 있다. 그러나, 항체-약물 컨주게이션에서의 약물 항체 비율(DAR)이 잘 조절될 수 없고, 페이로드 다양성이 이들 기술에서 수행될 수 없고, 그에 따라서, 약물 항체 비율을 조절하고 ADC의 페이로드 다양성을 증가시키기 위한 본 기술분야에서의 요구가 있다. 본 발명은 그러한 요구를 충족시키고 있으며, 다른 이익을 제공하고 있다.
본 발명의 일 양태는 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트(glycoprotein-payload conjugate)를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure pct00002
(1).
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure pct00003
(5).
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure pct00004
(7).
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 방법에 의해서 얻을 수 있는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 제공한다.
도 1은 트리-만노실 항체 약물 컨주게이트를 제조하기 위한 원-스텝(one-step) 및 순차적 전략을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 G0F/G0 유형 헤르셉틴(G0F/G0 type Herceptin)이 β1,4 갈락토시다제 및 뉴라미니다제의 처리에 의해서 생성되었음을 나타낸다.
도 3은 실시예 2의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 G0F/G0 유형 헤르셉틴이 N-아세틸글루코사미니다제 S에 의해서 트리-만노실 코어 항체로 전환었음을 나타낸다.
도 4는 실시예 3의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 GlcNAC이 MGAT-1에 의해서 트리-만노실 헤르셉틴의 각각의 부위 상의 말단 만노오스의 한 아암(arm)에 컨주게이션되었음을 나타낸다.
도 5은 실시예 4의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 트리-만노실 헤르셉틴이 MGAT-2 및 MGAT-1에 의해서 유형 G0/G0F 헤르셉틴으로 전환되었음을 나타낸다.
도 6은 실시예 6의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 MGAT-1가 트리-만노실 헤르셉틴의 각각의 부위 상의 말단 만노오스의 한 아암에 UDP-GlcNAz 컨주게이트되었음을 나타낸다.
도 7a은 실시예 7의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내고; 도 7b는 실시예 7의 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 MGAT-1 및 MGAT-2가 트리-만노실 헤르셉틴에 UDP-GlcNAz 컨주게이션되어 말단 N-아세틸글루코사민에서 4개의 아지드 기를 갖는 G0F/G0 유형 헤르셉틴을 생성시켰음을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 실시예 7의 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 MGAT-1 및 MGAT-2가 트리-만노실 헤르셉틴에 UDP-GlcNAz 컨주게이션되어 말단 N-아세틸글루코사민에서 4개의 아지드 기를 갖는 G0F/G0 유형 헤르셉틴을 생성시켰음을 나타낸다.
도 8은 실시예 8의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 트리-만노실 헤르셉틴이 GlcNAz를 컨주게이트하기 위한 MGAT-2의 기질이 아님을 입증하고 있다.
도 9a은 실시예 9의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내고; 도 9b는 실시예 9의 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 DBCO-(PEG)4-DM1가 클릭 화학 반응(click chemistry reaction)에 의해서 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz에 컨주게이션되어 DAR4를 갖는 헤르셉틴 ADC를 생성시켰음을 나타내고 있다.
도 10은 실시예 10의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 도면의 결과는 제 1 페이로드가 MGAT-1 및 DBCO-(PEG)4-DM1에 의해서 트리-만노실-2GlcNAz 헤르셉틴 항체의 중쇄의 각각의 아암에 컨주게이션되었음을 나타낸다.
도 11은 실시예 11의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 도면의 결과는 제 2 GlcNAz가 MGAT-2에 의해서 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC의 중쇄의 각각의 아암에 대한 α-6 만노오스에 컨주게이션되었음을 나타낸다. 이는 MGAT-2가 매우 기질 유연성 효소이고, UDP-GlcNAz를 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)와 같은 큰 작용기 항체로 전환시켜 이중 페이로드 ADC 생성물을 위한 중간체를 생성시킨다.
도 12는 실시예 12의 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 도면의 결과는 항체의 각각의 아암 상의 하나의 MMAE 및 하나의 DM1을 갖는 DAR4 ADC 헤르셉틴 생성물이 DBCO-(PEG)12-MMAE를 실시예 11의 생성물로부터 생성된 중간체 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)에 첨가함으로써 생성되었음을 나타낸다.
도 13은 실시예 13의 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 항체의 각각의 아암 상의 하나의 MMAE 및 하나의 DM1을 갖는 DAR4 ADC 헤르셉틴 생성물이 DBCO-MMAF를 실시예 11의 생성물로부터 생성된 중간체 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)에 첨가함으로써 생성되었음을 나타낸다.
도 14는 실시예 14에 기재된 바와 같은 Kadcyla와 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)의 결합 ELISA를 나타내고 있다. 결과는 Kadcyla와 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) 생성물 사이의 유의미한 Kd 차이가 없음을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 실시예 16의 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체의 감소된 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 결과는 트리-만노실 트라스투주맙 및 트리만노실 항 TMCC3이 포유동물 세포주에 의해서 생성되었음을 나타낸다.
도 16a, 도 16b 및 도 16c는 실시예 17의 감소된 질량 크로마토그래피 분석 및 온전한 질량 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸다. 도면의 결과는 트리-만노실 트라스투주맙-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)가 트리-만노실 트라스투주맙을 생성시키는 포유동물 세포로부터 생성되었음을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에서 기재된다. 본 발명과 결부되어 사용될 수 있는 공보에서 보고된 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 장치, 통계학적 분석 및 방법론을 기재함을 포함한, 본원에서 특별히 언급된 모든 공보 및 특허는 모든 목적을 위해서 참조로 통합된다. 본 명세서에서 열거되는 모든 참조는 본 분야에서의 기술 수준을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
약어
ADC 항체-약물 컨주게이트
DAR 약물-대-항체 비율
Asn 아스파라긴
GlcNAc N-아세틸글루코사민
GlcNAz N-아지도아세틸글루코사민
Fuc 푸코오스(fucose)
Man 만노오스
MGAT-1; GnT-1 만노실 (□-1,3-)-당단백질 □-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제
MGAT-2; GnT-2 만노실 (□-1,6-)-당단백질 □-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제
UDP 우리딘 디포스페이트(uridine diphosphate)
DBCO 디벤조사이클로옥틴 기
DM1 메르탄신(mertansine)
PEG 폴리에틸렌 글리코
MES 4-모르폴린에탄설폰산
MMAE 모노메틸 아우리스타틴 E
MMAF 모노메틸 아우리스타틴 F
TMCC3 막관통(transmembrane) 및 코일드-코일 도메인 패밀리 3(coiled-coil domain family 3)
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 표현은, 문맥에서 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 복수의 참조를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 또한, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "포함하는", "지니는" 및 "갖는"은 상호 교환적으로 사용될 수 있음을 주지해야 한다.
흔히, 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정의 값으로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정의 값까지로서 표현된다. 그러한 범위가 표현되는 때에, 구체예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정의 값까지의 범위를 포함한다. 유사하게, 값이 용어 "약"의 사용에 의해서 근사치로 표현되는 때에, 특정의 값은 또 다른 구체예를 형성함이 이해될 것이다. 추가로, 범위의 각각의 한계치는 다른 한계치와 관련하여 그리고 그와는 독립적으로 둘 모두 중요하다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 ± 0.25%를 의미한다.
제형 성분을 언급할 때에, 사용된 용어, 예를 들어, "작용제"는 특정된 분자 자체뿐만 아니라, 이로 한정되는 것은 아니지만, 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 컨주게이트, 활성 대사물, 및 다른 그러한 유도체, 유사체 및 관련 화합물을 포함한 이의 약제학적으로 허용되는 유사체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 일반적인 용어 "당(sugar)"은 모노사카라이드, 예를 들어, 글루코오스(Glc), 갈락토오스(Gal), 만노오스(Man) 및 푸코오스(Fuc) 뿐만 아니라, 모노사카라이드의 유도체, 예컨대, 아미노당 및 당 산(sugar acid), 예를 들어, 글루코사민(GlcN), 갈락토사민(Galn), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), N-아지도아세틸글루코사민(GlcNAZ), N-아세틸갈락토사민(GlaNAc), N-아세틸뉴라민산(NeuNAc), N-아세틸뮤라민산(MurNAc), 글루쿠론산(GlcA), 및 이두론산(IdoA)를 나타낸다.
본원에서 상용된 용어 "단백질"은 본래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 기원 또는 제조 방식과 무관하게 변이체 및 변형된 형태를 포함할 수 있다. 본래의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 자연으로부터 얻은 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 그러한 본래의 서열 단백질은 자연으로부터 분리되거나 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본래의 서열 단백질은 특히 천연의 트렁케이티드(truncated) 또는 가용성 형태, 천연의 변이체 형태(예, 대안적으로 스플라이스드 형태(spliced form)), 천연 대립 변이체(allelic variant) 및 번역 후 변형(post-translational modification)을 포함한 형태를 포함한다. 본래의 서열 단백질은 번역 후 변형, 예컨대, 글리코실화 또는 포스포릴화, 또는 일부 아미노산 잔기의 다른 변형 후의 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "당단백질"은 단백질에 공유 결합된 하나 이상의 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드 사슬을 포함하는 단백질을 나타낸다. 글리칸은 단백질(O-연결된-글리코실)의 하이드록실 기에, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 티로신, 하이드록시라이신(hydroxylysine) 또는 하이드로프롤린의 하이드록시 기에, 또는 단백질(N-당단백질), 예를 들어, 아스파라긴 또는 아르기닌 상의 아미드에, 또는 단백질(C-당단백질), 예를 들어, 트립토판 상의 탄소에 결합될 수 있다. 당단백질은 하나 초과의 글리칸을 포함할 수 있고, 하나 이상의 모노사카라이드와 하나 이상의 올리고사카라이드 글리칸의 조합을 포함할 수 있고, N-연결된, O-연결된 및 C-연결된 글리칸의 조합을 포함할 수 있다. 당단백질의 예는 세포의 표면 항원에 특이적인 리간드, 전립선-특이적 막 항원, 칸디다 안타크티카 리파아제(candida antarctica lipase), gp41, gp120, 에리트로포이에틴(EPO), 항동결 단백질 및 항체를 포함한다.
항체는 특이적 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 면역계에 의해서 생성되는 단백질이다. 본원에서의 용어 항체는 이의 최광의로 사용되고, 특히 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 디머(dimer), 멀티머(multimer), 다중특이성 항체(multispecific antibody)(예, 이중특이적 항체), 항체 단편 및 이중 및 단일 사슬 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 본원에서 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 및 암 항원을 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "항체"는 전 항체(whole antibody)뿐만 아니라 항체의 단편, 예를 들어, 항체 Fab 단편, F(ab')2, 분해된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody) 또는 scFv을 포함하는 것을 의미한다. 더욱이, 상기 용어는 항체의 유전 조작된 유도체를 포함한다. 항체, 항체의 단편 및 유전 조작된 항체는 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 적합한 시중 판매중인 항체는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 아브식시맙(abciximab), 리툭시맙(rituximab), 바실릭시맙(basiliximab), 팔리비주맙(palivizumab), 인플릭시맙(infliximab), 트라스투주맙, 알렘투주맙(alemtuzumab), 아달리무맙(adalimumab), 투시투모맙-1131(tositumomab-1131), 세툭시맙(cetuximab), 이브리툭시맙 티욱세탄(ibrituximab tiuxetan), 오말리주맙(omalizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 파니투무맙(panitumumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 골리무맙(golimumab), 카나키누맙(canakinumab), 카투막소맙(catumaxomab), 우스테키누맙(ustekinumab), 토실리주맙(tocilizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 데노수맙(denosumab), 벨리무맙(belimumab), 이필리무맙(ipilimumab) 및 부렌툭시맙(brentuximab)을 포함한다.
항체는 원핵 및 진핵 발현 시스템을 포함한 어떠한 수의 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 시스템은 포유동물 세포 발현, 예컨대, 하이브리도마(hybridoma) 또는 CHO 세포 발현 시스템이다. 많은 그러한 시스템은 상업적 공급업자로부터 광범위하게 구입 가능하다. 항체가 VH 및 VL 영역 둘 모두를 포함하는 구체예에서, VH 및 VL 영역은 단일 벡터를 사용하여, 예를 들어, 디시스트론 발현 단위에서, 또는 상이한 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다. 다른 구체예에서, VH 및 VL 영역은 별도의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 본원에서 기재된 VH 및 VL 영역은 임의로 N-말단에서 메티오닌을 포함할 수 있다.
관심 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있고, 예를 들어, 모노클로날 항체를 엔코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝되어 재조합 모노클로날 항체를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자 라이브러리가 또한 하이브리도마 또는 혈장 세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합은 상이한 항원 특이성을 갖는 항체의 큰 풀(pool)을 생성시킨다.
단일 사슬 항체 또는 재조합 항체의 생산을 위한 기술(미국특허 제4,946,778호, 미국특허 제4,816,567호)은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하기 위해서 조절될 수 있다. 또한, 형질전환 마우스 또는 다른 유기체, 예컨대, 다른 포유동물이 인간화된 또는 인간 항체를 발현시키기 위해서 사용될 수 있다(참조예, 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); and Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995))
본원에서 사용된 "GlcNAc1," "GlcNAc2," "GlcNAc3," 및 "GlcNAc4"는 각각 안테나-모양 글리칸 모이어티의 상이한 위치에서 GlcNAc 당을 나타낸다.
본원에서 사용된 "
Figure pct00005
"는 세 개의 만노오스를 포함하는 트리-만노실 구조를 나타내며, 여기에서, 제 1 만노오스(Man1)가 GlcNAc 당에 연결되고; 제 2 및 제 3 만노오스((Man2 및 Man3)가 각각 α-1,3 및 α-1,6 글리코시드 연결을 통해서 Man1에 연결된다.
본원에서 사용된 "-(Fuc)0-1"는 푸코오스 당이 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 단지 하나의 푸코오스 당이 존재함을 나타낸다.
본원에서 사용된 "-(CH2)0-8-"는 -CH2-가 존재하거나 존재하지 않고, 존재하는 경우에는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 -CH2- 기가 존재할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 제조하는 방법으로서,
(i) 하기 화학식(2)을 갖는 글리칸을 포함하는 당단백질을 β-N-아세틸글루코사미니다제와 반응시켜 하기 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 생성시키키는 단계;
(ii) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 및 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 두 개의 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2 및 Man3의 각각의 β-1,2 위치에 각각 결합되게 하여, 화학식(4)의 글리칸 모이어티가 형성되게 하는 단계; 및
(iii) 페이로드가 동일하거나 상이한 두 개의 컨주게이터-링커-페이로드를 화학식(4)의 글리칸 모이어티와 반응시켜 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다:
Figure pct00006
(1)
Figure pct00007
(2)
Figure pct00008
(3)
Figure pct00009
(4).
일부 구체예에서, 두 개의 페이로드는 상이하고, 그러한 페이로드는 무작위 방식으로 당단백질 내의 네 개의 Man-GlcNAc 구조 중 어느 하나에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 제조하는 방법으로서,
(i) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 상기 정의된 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계; 및
(ii) 컨주게이터-링커-페이로드를 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
Figure pct00010
(5)
Figure pct00011
(6).
일부 구체예에서, 결합된 페이로드의 위치를 정확하게 조절하기 위해서, 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트는
(i) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 상기 정의된 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 상기 정의된 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계;
(ii) 컨주게이터-링커-페이로드 A를 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(8)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A 컨주게이트를 생성시키는 단계;
(iii) 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 화학식(8)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A 컨주게이트를 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man3의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 화학식(9)를 갖는 글리칸-페이로드 A 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계; 및
(iv) 컨주게이터-링커-페이로드 B를 화학식(9)를 갖는 글리칸-페이로드 A 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트를 생성시키는 단계에 의해서 생성될 수 있고,
여기에서, 페이로드 A 및 페이로드 B가 동일하거나 상이하다:
Figure pct00012
(7)
Figure pct00013
(8)
Figure pct00014
(9)
본원에서 사용된 당단백질은, 예를 들어, 고체-상태 펩티드 합성(예, Merrifield 고체 상 합성) 또는 재조합 생산에 의해서 얻어질 수 있다. 재조합 생산을 경우에, 당단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드가 단리되고 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 벡터내로 삽입된다. 그러한 폴리누클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 통상의 기술자에게는 잘 공지된 방법이 당단백질의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성시키기 위해서 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 다음 문헌에 기재된 기술[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]을 참조할 수 있다.
본원에서 사용된 β-N-에틸글루코사미니다제는 올리고사카라이드로부터 β-N-아세틸글루코사민 잔기의 가수분해를 촉매작용하는 글리코시다제 패밀리(glycosidase family)를 나타낸다. 많은 β-N-아세틸-글루코사미니다제가 다중 유형의 β-글리코시드 연결을 촉매작용하는데 있어서 광범위한 가수분해 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 구체예에서, β-N-아세틸글루코사미니다제는 당단백질의 말단 아세틸글루코사민 잔기와 N-글리칸 사이에 위치된 베타 1-2 연결을 가수분해할 수 있는 엑소글리코시다제일 수 있다. 엑소-β-N-아세틸글루코사미니다제 변이체는 상이한 공급원, 예컨대, 스트렙토코쿠스 에스피피.(Streptococcus spp.) 및 작두콩(Canavalia ensiformis)으로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(MGAT1; GnT-I; EC:2.4.1.101)는 N-아세틸-D-글루코사민을 UDP-GlcNAc로부터 알파 1-3 글리코시드 연결을 통해서 또 다른 당 모이어티 또는 글리칸에 연결되는 말단 만노오스에 전달한다. MGAT1에 의해서 전달된 GlcNAc와 알파 3 만노오스의 연결은 β1-2 글리코시드 결합이다. MGAT1은 진핵생물에서 보편적으로 발현되는데, 그 이유는 그것이 골지(Golgi)에서의 하이브리드 및 복합체 N-글리칸 생합성에 대한 필수 효소이기 때문임이 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(MGAT2;GnT-II ; EC 2.4.1.143)는 N-아세틸-D-글루코사민을 UDP-GlcNAc로부터 알파 1-6 글리코시드 연결을 통해서 또 다른 당 모이어티 또는 글리칸에 연결되는 말단 만노오스에 전달한다. MGATII에 의해서 전달된 GlcNAc와 알파 6 만노오스의 연결은 베타 1-2 글리코시드 결합이다. MGAT2는 진핵생물에서 보편적으로 발현되는데, 그 이유는 그것이 골지에서의 복합체 N-글리칸 생합성을 위한 필수 효소이기 때문임이 밝혀졌다.
일부 구체예에서, 화학식(2)를 갖는 글리칸을 포함하는 당단백질과 β-N-아세틸글루코사미니다제 사이의 반응은 포유동물 세포 배양에서 수행된다. 포유동물 세포 배양에서, 화학식(2)을 갖는 클리칸을 포함하는 당단백질을 엔코딩하는 제 1 폴리누클레오티드와 β-N-아세틸글루코사미니다제를 엔코딩하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함하는 포유동물 세포주가 당단백질과 β-N-아세틸글루코사미니다제의 발현에 적합한 조건하에 배지에서 인큐베이션된다. 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해서 변환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7); 인간 배아 신장 주(293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell: BHK), 마우스 세르톨리 세포(mouse sertoli cell)(TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(human cervical carcinoma cell: HELA), 개의 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(buffalo rat liver cell: BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(mammary tumor cell)(MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 차이니스 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 당단백질은 항체 또는 이의 단편이다. 항체 또는 이의 단편은 항체 Fab 단편, F(ab')2, 분해된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody) 또는 scFv일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 헤르셉틴, 트라스투주맙 또는 항-TMCC3 항체이다.
본 발명의 구체예에서, R이 아지도(일반적인 명칭?)이고, 컨주게이터가 알키닐인 경우에, 컨주게이터-링커-페이로드는 -GlcNAc-(CH2)0-8-R 기와 반응하여 클릭 반응을 통해서 -GlcNAc-(CH2)0-8-링커-페이로드를 형성시킨다(Angewandte Chemie International Edition. 40 (11): 2004-2021; and Australian Journal of Chemistry. 60 (6): 384-395). 또 다른 구체예에서, R이 케톤 기 또는 알데하이드이고 컨주게이터가 아미노인 경우에, 컨주게이터-링커-페이로드는 -GlcNAc-(CH2)0-8-R 기와 반응하여 환원성 아민화를 통해서 -GlcNAc-(CH2)0-8-링커-페이로드를 형성시킨다(J. Org. Chem., 2010, 75, 5470-5477; and Synthesis, 2011, 490-496). 추가의 구체예에서, R이 케톤 기 또는 알데하이드이고 컨주게이터가 β-아릴 에틸아미노인 경우에, 컨주게이터-링커-페이로드는 -GlcNAc-(CH2)0-8-R 기와 반응하여 Pictet-Spengler 반응을 통해서 -GlcNAc-(CH2)0-8-링커-페이로드를 형성시킨다(Bioconjugate Chem., 2013, 24 (6), pp 846-851).
일부 구체예에서, 당단백질-페이로드 컨주게이트가 대상체에서의 질환의 치료에 사용되는 경우에, 페이로드는 치료제일 수 있다. 치료제는 세포증식 억제제(cytostatic agent) 또는 세포 독성제(cytotoxic agent) 또는 상응하는 방사성동위원소를 함유한 동위원소-킬레이트화제(isotope-chelating agent)일 수 있다. 세포증식 억제제 또는 세포 독성제는, 제한 없이, 항대사물질(antimetabolite)(예, 플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU), 플록슈리딘(floxuridine)(5-FUdR), 메토트렉세이트(methotrexate), 류코보린(leucovorin), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 티오구아닌(thioguanine)(6-TG), 메르캅토퓨린(mercaptopurine)(6-MP), 시타라빈(cytarabine), 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈 포스페이트(fludarabine phosphate), 클라드리빈(cladribine)(2-CDA), 아스파라기나아제(asparaginase), 겜시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitibine), 아자티오프린(azathioprine), 시토신 메토트렉세이트(cytosine methotrexate), 트리메토프림(trimethoprim), 피리메타민(pyrimethamine), 또는 페메트렉시드(pemetrexed)); 알킬화제(예, 씨메팔란(cmelphalan), 클로람부실(chlorambucil), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 아이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 다카르바진(dacarbazine), 미토마이신 C(mitomycin C), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 우라무스틴(uramustine), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 테트라니트레이트(tetranitrate), 프로카르바진(procarbazine), 알트레타민(altretamine), 미토졸로미드(mitozolomide), 또는 테모졸로미드(temozolomide)); 알킬화-유사 작용제(alkylating-like agent)(예, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 또는 트리플라틴(triplatin)); DNA 마이너 그루브 알킬화제(DNA minor groove alkylating agent)(예, 듀오카마이신(duocarmycin), 예컨대, CC-1065, 및 이의 어떠한 유사체 또는 유도체; 피롤로벤조디아제펜, 또는 이의 어떠한 유사체 또는 유도체); 안트라사이클린(예, 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아이다루비신(idarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)); 항생제(예, 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 안트라마이신(anthramycin), 스트렙토조토신(streptozotocin), 그라미시딘 D(gramicidin D), 미토마이신(mitomycin)(예, 미토마이신 C(mitomycin C)); 칼리키아미신(calicheamicin); 항유사분열제(antimitotic agent)(예를 들어, 매이탄시노이드(maytansinoid)(예컨대, DM1, DM3, 및 DM4)를 포함함), 아우리스타틴(auristatin)(예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)을 포함함), 도라스타틴(dolastatin), 크립토파이신(cryptophycin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(예, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine)), 탁산(taxane)(예, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 또는 노블 탁산(novel taxane)), 투불리신(tubulysin), 및 콜히친(colchicine)); 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor)(예, 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 캄프토테신(camptothecin), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 또는 미톡산트론(mitoxantrone)); HDAC 억제제(예, 보리노스타트(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 키드아미드(chidamide), 파노비노스타트(panobinostat), 또는 벨리노스타트(belinostat)); 프로테아좀 억제제(예, 펩티딜 보론산) 뿐만 아니라; 방사성동위원소, 예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32 및 Lu177를 포함한 Lu의 방사성활성 동위원소를 포함한다. 동위원소-킬레이트화제의 예는, 제한 없이, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민--N,N,N',N",N"-펜타아세테이트(DTPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세테이트(DOTA), 1,4,7,10-테트라키스(2-하이드록시프로필)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(THP), 트리에틸렌테트라아민-N,N,N',N",N"',N"'-헥사아세테이트(TTHA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라키스(메틸렌포스포네이트)(DOTP), 및 메르캅토아세틸트리글리신(MAG3)을 포함한다.
일부 구체예에서, 당단백질-페이로드 컨주게이트가 검출을 위해서 사용되는 경우에, 페이로드는 라벨일 수 있다. 라벨은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 직접적으로 검출되는 라벨 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자-조밀, 화학발광 및 방사성활성 라벨)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해서 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함한다. 예시적인 라벨은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 방사성동위원소, P32, C14, I125, H3, 및 I131, 형광단, 예컨대, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone), 루세리페라제(luceriferase), 예를 들어, 반딧불이 루시페라제(firefly luciferase) 및 박테리아 루시페라제(bacterial luciferase), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제(glucoamylase), 리소자임(lysozyme), 사카라이드 옥시다제(saccharide oxidase), 예를 들어, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대, 과산화수소를 사용하여 염료 전구체, 예컨대, HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제를 산화시키는 효소와 결합된 우리카제(uricase) 및 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase), 비오틴/아비딘, 스핀 라벨(spin label), 박테리오파아지 라벨, 및 안정한 자유 라디칼 등을 포함하다. 또 다른 구체예에서, 라벨은 양전자 이미터(positron emitter)이다. 양전자 이미터는, 이로 제한되는 것은 아니지만, Ga68, F18, Cu64, Y86, Br76, Zr89, 및 I124를 포함한다.
일부 구체예에서, 링커는 당단백질 상에 존재하는 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용성을 갖는다. 그러한 친전자성 기의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 알데하이드 및 케톤 카르보닐 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커의 반응성 작용성의 헤테로원자가 당단백질 상의 친전자성 기와 반응하고 당단백질 단위에 대한 공유결합을 형성할 수 있다. 그러한 반응성 작용성의 비-제한 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함한다.
일부 구체예에서, 컨주게이터는 당단백질 상에 존재하는 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용성을 갖는다. 그러한 친전자성 기의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 아지드, 알데하이드 및 케톤 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 컨주게이터의 반응성 작용성의 헤테로원자는 당단백질 상의 친전자성 기와 반응하고 당단백질 단위에 대한 공유결합을 형성할 수 있다. 그러한 반응성 작용성의 비-제한 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 알킨, 디벤조사이클로옥틴, 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함한다.
일부 구체예에서, 링커는 컨주게이터와 페이로드를 연결시킬 수 있는 작용성을 갖는다. 그러한 링커의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 비-분해성 링커 및 분해성 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-분해성 링커는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아실, 알킬아민, 또는 아릴아민 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 분해 가능한 링커는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 디설파이드 함유 링커, 산 불안정 링커, 광불안정 링커, 펩티다제 불안정 링커, 및 에스트라제 불안정 링커를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정의 구체예를 예시하기 위한 것이지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 범위는 도 1에 도시된 바와 같은 트리-만노실 코어 항체로부터 하나의 페이로드 종 또는 이중 페이로드 종을 갖는 균질의 ADC를 생성시키기 위한 원 스텝(one step) 또는 순차적 공정을 포함한다.
실시예 1. β1,4-갈락토시다제 및 뉴라미니다제를 사용함에 의한 헤르셉틴 항체의 제조
헤르셉틴 항체(Roche Inc)로부터 N-글리칸의 갈락토오스 및 시알산 모이어티를 제거하기 위해서, 10 mg의 헤르셉틴 항체를 37℃에서 24시간 동안 1X 글리코버퍼 1(GlycoBuffer 1)(NEB, 전체 부피 1 ml) 중의 20 ㎕의 β1,4-갈락토시다제(NEB, P0745L, 8 단위/㎕) 및 5 ㎕의 α2-3,6,8 뉴라미니다제(NEB, P0720L, 50 단위/㎕)로 처리하였다. 10 ㎕의 β1,4-갈락토시다제(NEB, P0745L, 8 단위/㎕)를 반응물에 추가로 첨가하고, 반응을 37℃에서 추가로 24시간 동안 수행시켜 G0F/G0 항체 샘플을 얻었다. 항체 샘플을 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare, 17-1279-02)를 사용하여 정제하였다. 정제 후에, 항체 샘플을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 2에 도시된 결과는 샘플 중의 주된 양의 항체가 GOF(50,600 Da의 분자량을 갖는 중쇄를 가짐)이고, 단지 소량이 GO(푸코오스 당 없이; 50,451 Da의 분자량을 갖는 중쇄를 가짐)임을 나타내고 있다.
실시예 2. 트리-만노실 코어 항체로의 헤르셉틴의 전환
10 mg의 실시예 1로부터의 G0F/G0 헤르셉틴 항체를 37℃에서 24시간 동안 1X 글리코버퍼 1(NEB, 전체 부피 1 ml) 중의 20 ㎕의 β-N-아세틸글루코사미니다제 S(NEB, P0744L, 4 단위/㎕)로 처리하였다. 10 ㎕의 β-N-아세틸글루코사미니다제 S(NEB, P0744L, 4 단위/㎕)를 반응물에 첨가하고, 반응을 37℃에서 추가로 24시간 동안 수행시켜 소화된 항체 샘플을 얻었다. 소화된 항체 샘플을 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare, 17-1279-02)를 사용하여 정제하였다. 정제 후에, 항체 샘플을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 3에 나타낸 결과는 50,194 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체가 얻어졌으며, 거의 모든 G0F 및 G0 헤르셉틴 항체가 트리-만노실 코어 항체로 전환되었음을 나타낸다. 이는 β-N-아세틸글루코사미니다제 S가 G0F 및 G0 항체를 높은 효율로 트리-만노실 코어를 갖는 것으로 전환시킬 수 있음을 암시한다.
Figure pct00015
실시예 3. 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(MGAT-1; GnT-1)에 의한 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체의 각각의 중쇄의 한 아암에서의 α-3 만노오스에의 GlcNAc의 컨주게이션(Conjugation)
80 ㎕의 1X 완충액 SP (25 mM MES(4-모르폴린에탄설폰산), 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(40 μg) 및 UDP-GlcNAc(2.5 mM의 최종 농도)(Sigma, U4375)를 MGAT-1(0.15 μg; R&D, 8334-GT)의 존재 하에 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 4에 나타낸 결과로서, 50,195 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에 비해서, 중쇄가 GlcNAc를 하나 더 함유(203 Da의 분자량)하고 50,398 Da의 분자량을 갖는 항체 생성물을 얻었다. 그것은 MGAT-1가 단지 하나의 N-아세틸글루코사민을 이의 기질 단백질에 전달함을 지지한다.
Figure pct00016
실시예 4. MGAT-1 및 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(MGAT-2; GnT-2)에 의한 G0F/G0 헤르셉틴으로의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체의 전환
80 ㎕의 1X 완충액 SP(25 mM MES, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(40 μg) 및 UDP-GlcNAc(2.5 mM의 최종 농도)(Sigma, U4375)를 MGAT-1(0.15 μg) 및 MGAT-2(0.1 μg)의 존재 하에 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 반응 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 5에 나타낸 결과로서, 50,194 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에 비해서, 중쇄가 GlcNAc를 두개 더 함유(203 Da x 2의 분자량)하고 50,600 Da의 분자량을 갖는, G0F 항체 생성물을 소량의 GO와 함께 얻었다. 이들 결과는 MGAT-1, MGAT-2 및 N-아세틸글루코사민를 조합함으로써, 트리-만노실 코어 항체가 G0/G0F 항체로 변환될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00017
실시예 5. 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체는 MGAT-2의 기질이 아님
트리-만노실 코어가 α(1,3) 만노오스에 연결된 GlcNAc 당을 이미 가지는 경우에만, MGAT-2는 GlcNAc 당을 UDP-GlcNAc로부터 트리-만노실 코어의 α(1,6) 만노오스로 전달한다. 달리 설명하면, GlcNAc 당이 트리-만노실 코어의 α(1,3) 만노오스에 연결되지 않으면, MGAT-2는 GlcNAc 당을 α(1,3) 만노오스 또는 α(1,6) 만노오스 중 어느 하나에 전달할 수 없다. 상기 관찰을 확인하기 위해서, 80 ㎕ 1X 완충액 SP(25 mM MES , 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(40 μg) 및 UDP-GlcNAc(2.5 mM)를 MGAT-2(0.1 μg)의 존재하에 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 질량 스펙트럼에서 트리-만노실 코어 항체의 분자량에 대한 유의미한 변화가 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 트리-만노실 코어가 MGAT-2의 기질이 아니며, MGAT-2가 G0F/G0 유형 항체를 생성시키기 위해서 MGAT-1의 전환 생성물을 필요로 한다는 것을 암시한다.
Figure pct00018
실시예 6. MGAT-1에 의한 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체의 각각의 중쇄의 한 아암의 말단 α-3 만노오스에의 GlcNAz의 컨주게이션
80 ㎕ 1X 완충액( 20 mM Tris, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(40 μg) 및 UDP-GlcNAz(1 mM)(R&D, ES104-100)를 MGAT-1(0.25 μg; R&D, 8334-GT)의 존재 하에 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 6에 나타낸 결과로서, 50,195 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에 비해서, 중쇄가 GlcNAz를 하나 더 함유(244 Da의 분자량)하고 50,438 Da의 분자량을 갖는 항체 생성물을 얻었다. 이러한 결과는 UDP-GlcNAz가 MGAT-1의 기질들 중 하나이고, MGAT-1를 통해서 GlcNAz가 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체의 각각의 중쇄의 아암 내의 α-3 만노오스에 연결되어 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz 항체를 생성시킬 수 있음을 암시한다.
Figure pct00019
실시예 7. MGAT-1 및 MGAT-2에 의한 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz를 생성시키기 위한 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에의 UDP-GlcNAz의 컨주게이션
800 ㎕ 1X 완충액 SP(25 mM MES, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(2 mg) 및 UDP-GlcNAz(1 mM)를 토끼 MGAT-1(25 μg) 및 래트 MGAT-2(10 μg)의 존재 하에 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 반응 생성물을 각각 감소된 질량 크로마토그래피 분석 및 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 7a에 나타낸 감소된 질량 크로마토그래피 결과로서, 50,194 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에 비해서, 중쇄가 GlcNAz 분자를 두 개 함유(244 Da x 2= 488의 분자량)하고 각각의 중쇄가 50,680 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실 헤르셉틴 -4GlcNAz 항체 생성물을 얻었다. 이러한 결과는, MGAT-1과 MGAT-2를 통해서, GlcNAz가 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체의 각각의 중쇄의 α-3 만노오스 및 α-6 만노오스에 컨주게이션됨을 암시한다. 이러한 결과는 온전한 질량 크로마토그래피에 의해서 추가로 확인된다. 도 7b에 나타낸 결과로서, 147,237 Da의 분자량을 갖는 전체 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체에 비해서, 4 개의 GlcNAz 분자(244 Da x 4 = 976 Da의 분자량)을 함유하고 148,213 Da의 분자량을 갖는 G0F 트리-만노오스 헤르셉틴-4GlcNAz 항체 생성물을 얻었다. 본 발명자들의 결과는 UDP-GlcNAz가 MGAT-1 및 MGAT-2의 기질들 중 하나이고, 본 발명자들이 본 발명자들의 원-스텝 공정 가설로 중간 테트라-아지도 항체를 성공적으로 합성할 수 있음은 추가로 암시하다.
Figure pct00020
실시예 8. 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체는 GlcNAz를 컨주게이트시키기 위한 MGAT-2이 기질이 아님
80 ㎕ 1X 완충액 SP(25 mM MES, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 2로부터의 트리-만노실 코어 헤르셉틴 항체(40 μg) 및 UDP-GlcNAz(1 mM)(R&D ES104-100)를 래트 MGAT-2(0.25 μg)의 존재 하에 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 8은 질량 스펙트럼에서 트리-만노실 코어 항체의 분자량에 대한 유의미한 변화가 없음을 나타내고 있으며, 실시예 5의 결과로서 트리-만노실 항체가 MGAT-2의 기질이 아님을 암시하고 있다.
Figure pct00021
실시예 9. DAR4를 갖는 헤르셉틴 ADC를 생성시키기 위한 DBCO-(PEG) 4 -DM1을 갖는 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz 항체의 컨주게이션
실시예 7에서, 4개의 말단 만노오스에 결합된 4개의 GlcNAz의 각각을 갖는 트리-만노실 항체를 생성시켰다. 본 발명의 원-스텝 공정 가설을 완성하기 위해서, DBCO-(PEG)4-DM1을 사용하여 독성 페이로드를 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz에 커플링시켜 DAR4를 갖는 ADC를 생성시켰다. 5 μL의 DBCO-(PEG)4-DM1(DMSO 중의 10 mM)을 실시예 7로부터 얻은 5 mg/mL 트리-만노실-4GlcNAz 헤르셉틴 항체를 함유하는 50 μL 완충액(25 mM MES; pH 6.5)에 서서히 첨가하여 클릭 화학 반응을 25℃에서 밤새 수행하였다. 반응 후에, 항체 생성물을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 통해서 정제하여 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)ADC를 얻었다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 9a에서의 결과는, 4 GlcNAz를 갖는 이의 모체 트리-만노실 항체에 비해서, 반응 생성물의 중쇄, 즉, 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)가 53,509 Da의 분자량을 지니며, 이는 두 개의 DBCO-(PEG)4-DM1 분자(1,413 Da x 2 = 2,826의 분자량)가 항체의 각각의 중쇄에 컨주게이션되었음을 의미함을 나타내고 있다. 이러한 결과는 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 의해서 추가로 확인된다. 도 9b에서의 결과는, 약 148,224 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz 항체에 비해서, 4 개의 DBCO-(PEG)4-DM1 분자(1,413 Da x 4 = 5,652 Da의 분자량)를 함유하고 153,876 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC 생성물이 얻어졌음을 나타낸다. 실시예 7 및 9로부터의 결과는 ADC-4DM1 생성물이 MGAT-1, MGAT-2 및 GlcNAz 반응과 DBCO-(PEG)4-DM1 클릭 화학 반응을 직접 조합함으로써 트리-만노실 항체로부터 생성됨을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 본 발명에서의 ADC 생성을 위한 원-스텝 공정의 본 발명자들의 가설을 성공적으로 합리화시키고 있다.
Figure pct00022
실시예 10. DBCO-(PEG) 4 -DM1에 의한 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz의 중쇄의 각각의 아암에서의 말단 GlcNAz에의 제 1 페이로드의 컨주세이션
실시예 4 내지 9는 4개의 균일한 DAR을 갖는 부위-특이적 ADC를 생성시키기 위한 본 발명에서의 ADC 생성을 위한 원-스텝 공정의 실현 가능성을 지지한다. 이들 성공적인 결과로, 도 1에 도시된 순차적 공정을 입증하기 위한 연구를 수행하였다. 제 1 중간 생성물을 합성하기 위해서, DBCO-(PEG)4-DM1을 사용하여 페이로드를 커플링시켜 반응물 항체의 중쇄의 각각의 말단 GlcNAz를 결합시켰다. 14 μL의 DBCO-(PEG)4-DM1(DMSO 중의 10 mM)을 실시예 6으로부터 얻은 2 mg/mL 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz 항체를 함유하는 350 μL 완충액(25 mM MES; pH 6.5)에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하에 25℃에서 밤새 교반시켜 클릭 화학 반응을 수행하였다. 반응 후에, 항체 생성물을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 통해서 여과하여 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) 중간체를 얻었다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 10에 나타낸 결과로서, 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz 항체에 비해서, 51,852 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) 중간체의 중쇄의 한 아암은 1414Da의 분자량을 갖는 하나의 추가 DBCO-(PEG)4-DM1 분자를 함유한다.
Figure pct00023
실시예 11. MGAT-2에 의한 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG) 4 -DM1) ADC의 중쇄의 각각의 아암에서의 말단 α-6 만노오스에의 제 2 GlcNAz의 컨주게이션
500 ㎕ 1X 완충액(25 mM MES, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 10으로부터 얻은 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) 및 UDP-GlcNAz(1 mM)(R&D ES104-100)을 래트 MGAT-2(15 μg)의 존재 하에 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 후에, 항체 생성물을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 통해서 여과하여 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)을 얻었다. 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 11에서 나타낸 결과로서, 모체 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)에 비해서, 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)의 중쇄의 각각은 52,097 Da의 분자량의 하나의 추가의 GlcNAz 분자(MW=244)를 함유한다. 이러한 결과는 MGAT-2가 매우 기질 유연성 효소이며, UDP-GlcNAz를 큰 작용성 항체, 예컨대, 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)로 전환시켜 이중 페이로드 ADC 생성물을 위한 중간체를 생성시킴을 나타낸다.
Figure pct00024
실시예 12. 항체의 각각의 아암 상의 하나의 MMAE 및 하나의 DM1을 갖는 DAR4 ADC 헤르셉틴 생성물의 구성
실시예 11에서, 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) 중간체를 생성시켰다. 도 1에 도시된 본 발명의 순차적 공정을 완성하기 위해서, DBCO-(PEG)12-MMAE를 사용하여 독성 페이로드를 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz 2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)에 커플링시키고 DAR4 및 이중 페이로드 종을 갖는 ADC를 생성시켰다.
3.8 μL의 DBCO-(PEG)12-MMAE(DMSO 중의 10 mM)를 실시예 11로부터 얻은 2.5 mg/mL 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC를 함유하는 76 μL 1X 완충액(25 mM MES, pH 6.5)에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하에 25℃에서 밤새 교반시켜 클릭 화학 반응을 수행하였다. 반응 후에, 항체 생성물을 Amicon Ultra-15 원심분리 장치를 통해서 여과하여 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)12-MMAE) ADC를 얻었다. 정제 후에, 생성물을 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 12에 나타낸 결과로서, 151,050 kD의 분자량을 갖는 모체 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)에 비해서, 얻은 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)12-MMAE) ADC는 두 개의 추가의 DBCO-(PEG)12-MMAE 분자(MW=1648 x 2 = 3,296)를 함유하고 154,345 Da의 분자량을 갖는다. 이러한 결과는 본 발명의 방법이 트리-만노실 헤르셉틴에의 두 개의 상이한 페이로드(예, DBCO-PEG4-DM1 및 DBCO-(PEG)12-MMAE)의 컨주게이션을 정밀하게 조절할 수 있음을 암시한다.
Figure pct00025
실시예 13. 항체의 각각의 아암 상에 하나의 MMAF와 하나의 DM1을 갖는 DAR4 ADC 헤르셉틴 생성물의 구성
3.8 μL의 DBCO-MMAF(DMSO 중의 10 mM)를 실시예 11로부터 얻은 2.5 mg/mL 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC를 함유하는 76 μL 1X 완충액(25 mM MES, pH 6.5)에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하에 25℃에서 밤새 교반하여 클릭 화학 반응을 수행하였다. 반응 후에, 항체 생성물을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 통해서 여과하여 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-MMAF) ADC를 얻었다. 생성물을 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 13에 나타낸 결과로서, 모체 트리-만노실 헤르셉틴-2GlcNAz-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC (MW = 151,050)에 비해서, 얻은 트리-만노실 헤르셉틴-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1)-2(GlcNAc-트리아졸-DBCO-MMAF) ADC는 2,038 Da의 분자량을 갖는 두 개의 추가의 DBCO-MMAF 분자를 함유하고 153,082 Da의 분자량을 갖는다. 이러한 결과는, 본 발명의 방법이 트리-만노실 헤르셉틴에의 다양한 페이로드의 종(예, DBCO-(PEG)4-DM1, DBCO-(PEG)12-MMAE 및 DBCO-MMAF)의 컨주게이션을 정밀하게 조절할 수 있음을 암시한다.
요약하면, MGAT-1, MGAT-2, 및 GlcNAz 효소 반응 및 DBCO-페이로드 화학 반응을 조합함으로써, 본 발명의 발명자들은 본 발명의 가설을 합리화시키고 있다. 본 발명의 발명자들은 본 발명의 발명자들의 원-스텝 공정에 의해서 DAR4 또는 DAR2를 갖는 균일한 부위-특이적 ADC 생성물을 생성시킬 수 있다. 반면에, 본 발명은 또한 순차적 공정에 의해서 이중 페이로드 종을 갖는 균일한 부위-특이적 ADC 생성물을 합성하기 위해서 적용된다.
Figure pct00026
실시예 14. 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG) 4 -DM1)의 결합 친화성 합성
트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC를 상기 기재된 공정에 의해서 구성시켰다. Her2/Neu 분자에 대항하는 Kadcyla를 (Roche Inc)로부터 구매하였다. ERBB2-ECD(ebioscience BMS362)(100ng/웰)을 NUNC Maxisorp 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4℃에서 밤새 정치시켰다. 플레이트를 1X PBS-T(0.1%)로 세척하여 비코팅된 시약을 제거하였다. 3% 탈지 우유를 플레이트의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 플레이트를 1X PBS-T(0.1%)로 3회 세척하고, 건조시킨 다음에, 추가의 사용을 위해서 -20℃에서 저장하였다. 1 x 10-6 g/mL로부터 1 x 10-12 g/mL까지의 각각의 항체의 일련의 희석액을 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 컨주게이션된 염소 항-인간 IgG를 1 시간 인큐베이션동안 첨가한 다음에, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하였다. OD405를 판독하여 활성을 계산하였다. 모든 연구를 3회 반복하였고, 데이터를 평균 ± SD로서 나타내었다. OD 판독 및 항체의 농도를 사용하여 Prism 소프트웨어를 사용한 다중 산란 플롯(multiple scatter plot)을 작성하였다. 도 14에 나타낸 결과는 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC의 곡선이 양성 대조군 Kadcyla 및 트리-만노실 헤르셉틴-4GlcNAz의 것들과 거의 동일하였음을 나타낸다. 음성 대조군 항-메소텔린(negative control anti-mesothelien)은 Her2/Neu 분자에 대한 결합 친화성을 나타내지 않는다. 이러한 결과는 Her2/Neu 분자에 대한 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC의 결합 친화성이 형성된 변형에 영향을 받지 않음을 암시한다.
실시예 15. 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG) 4 -DM1) ADC의 세포 독성 효과
Her2/Neu 고-발현 세포주 SK-BR-3, Her2/Neu 중간-발현 세포주 HCC-1954 및 Her2/Neu 저-발현 세포주 MDA-MB-231를 106 세포/ml로 희석시켰다. 96-웰 플레이트의 웰에 100 μL의 희석된 세포 배양물을 첨가한 후에, 세포를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 80 ㎕의 완전 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 이어서, 상이한 투입량으로 20 ㎕의 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC를 상이한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 100 ㎕의 CellTiter-Glo® Reagent을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 추가의 인큐베이션 후에, 웰의 발광(광)을 광도계에 의해서 측정하였다. Her2/Neu 고-발현 세포주 SK-BR-3, 및 Her2/Neu 중간-발현 세포주 HCC-1954에 대한 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC의 IC50 값은 각각 4.7 nM 및 14 nM이었다. IC50 값은 또한 시험된 모든 항체가 Her2/Neu 저-발현 세포주 MDA-MB-231에 대한 항-증식 효과가 없었음을 나타낸다. 이러한 결과는, Kadcyla로서, 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC가 Her2/Neu 고 발현 세포에 대한 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 중간-발현 세포를 중간 발현하는 Her2/Neu 및 트리-만노실 ADC 플랫폼에 의한 항체의 변형이 이의 생물학적 활성에 영향을 주지 않음을 암시한다.
실시예 16. F293 세포에 의한 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체 및 트리-만노실 코어 항-TMC33 항체의 생성
β-N-아세틸글루코사미니다제 S를 엔코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pTCAE8.3-exo-Gal을 구성시키고, 두 개의 F293 세포주 내로 공동-형질감염(co-transfection)시켜 각각 트리-만노실 트라스투주맙(항-Her2 항체) 및 트리-만노실 항-TMCC3(막관통 및 이중 코일 도메인 패밀리 3(transmembrane and coiled-coil domain family 3)) 항체를 발현시켰다. 인큐베이션 후에, 두 개의 세포 배양물의 상등액을 수거하고, 그에 함유된 항체를 각각 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare, 17-1279-02)를 사용하여 정제하였다. 정제 후에, 정제된 항체 샘플을 감소된 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 15a에 나타낸 결과는, 단지 트라스투주맙 유전자로 형질감염된 F293 세포로부터 단리된 항체와 비교할 때, β-N-아세틸글루코사미니다제 S 및 트라스투주맙 유전자로 또한 형질감염된 동일한 세포로부터 얻은 트라스투주맙 항체의 중쇄가 50,195 Da의 분자량을 갖는 피크를 나타내고, 이는 생성되는 트라스투주맙 항체가 트리만노실 코어 항체이었음을 나타낸다는 것을 밝히고 있다. 유사한 결과가 항-TMCC3 항체 유전자로 형질감염된 동일한 세포에서 나타났다(도 15b). 결과는, 트리-만노실 항체가 상업적 세포주로부터 대량생산 가능하고 산업적 CMC 증폭에 적용될 수 있음을 암시한다.
Figure pct00027
실시예 17. MGAT-1 및 MGAT-2에 의한 트리-만노실 헤르셉틴-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG) 4 -DM1) ADC를 생성시키기 위한 세포-발현된 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체에의 UDP-GlcNAz의 컨주게이션
실시예 7에 기재된 공정에 따라서, 800 ㎕ 1X 완충액 SP(25 mM MES, 10 mM MnCl2, pH 6.5) 중의 실시예 16으로부터 얻은 2mg의 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체(포유동물 세포에 의해서 생성됨) 및 UDP-GlcNAz(1 mM)를 토끼 MGAT-1(25 μg) 및 래트 MGAT-2(10 μg)의 존재 하에 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 반응 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석 및 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 16a에 나타낸 감소된 질량 크로마토그래피 결과로서, 50,194 Da의 분자량의 중쇄를 갖는 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체에 비해서, 중쇄가 약 244 Da x 2 = 488의 분자량으로 GlcNAz 분자를 두 개 더 함유하고, 각각의 중쇄가 약 50,680 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실 트라스투주맙-4GlcNAz 항체 생성물을 얻었다. 이러한 결과는, MGAT-1 및 MGAT-2를 통해서, GlcNAz가 포유동물 세포에 의해서 생성된 트리-만노실 코어 트라스투주맙 항체의 각각의 중쇄의 α-3 만노오스 및 α-6 만노오스에 컨주게이션될 수 있음을 암시한다.
실시예 9에 기재된 공정에 따르면, DBCO-(PEG)4-DM1을 상기 얻은 트리-만노실 트라스투주맙-4GlcNAz 항체를 함유하는 트리스 완충액(pH 7.0)에 서서히 첨가하여 25℃에서 16 시간 동안 클릭 화학 반응을 수행하였다. 반응 및 정제 후에, 생성물을 감소된 질량 크로마토그래피 분석 및 온전한 질량 크로마토그래피 분석에 가하였다. 도 16b에서의 감소된 질량 크로마토그래피 분석 결과는 생성물의 중쇄가 53,509 Da의 분자량을 가지며, 이는 두 개의 DBCO-(PEG)4-DM1 분자(1,413 Da x 2 = 2,826의 분자량)가 트리-만노실 트라스투주맙-4GlcNAz 항체의 중쇄에 컨주게이션되었음을 나타내고 있음을 밝히고 있다. 이러한 결과는 도 16c에서의 온전한 질량 크로마토그래피 분석 결과로부터 추가로 확인된다. 이러한 결과는, 4개의 DBCO-(PEG)4-DM1 분자(1,413 Da x 4 = 5,652 Da의 분자량)을 함유하며 약 153,868 Da의 분자량을 갖는 트리-만노실-4(GlcNAc-트리아졸-DBCO-(PEG)4-DM1) ADC 생성물이 얻어졌음을 밝히고 있다.
통상의 기술자는 본 발명이 목적들을 수행하고 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라 그 안에 내재된 것들을 수행하기 위해서 잘 조절됨을 용이하게 인지할 것이다. 현재 대표적인 바람직한 구체예로서 본원에 기재된 방법 및 조성은 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 사상 내에 포함되는 그 안에서의 변화 및 다른 사용이 통상의 기술자에게는 자명할 것이며, 청구범위에 의해서 정의된다.

Claims (32)

  1. 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트(glycoprotein-payload conjugate)를 제조하는 방법으로서,
    (i) 화학식(2)를 갖는 글리칸을 포함하는 당단백질을 β-N-아세틸글루코사미니다제와 반응시켜 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 생성시키는 단계;
    (ii) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 및 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 두 개의 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2 및 Man3의 각각의 β-1,2 위치에 각각 결합되게 하여, 화학식(4)의 글리칸 모이어티가 형성되게 하는 단계; 및
    (iii) 페이로드가 동일하거나 상이한 두 개의 컨주게이터-링커-페이로드(conjugator-linker-payload)를 화학식(4)의 글리칸 모이어티와 반응시켜 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 생성시키는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00028

    (1)
    Figure pct00029

    (2)
    Figure pct00030

    (3)
    Figure pct00031

    (4).
  2. 청구항 1에 있어서,
    단계(i)에서 화학식(2)을 갖는 글리칸을 포함하는 당단백질과 β-N-아세틸글루코사미니다제가 포유동물 세포주에 의해서 생성되는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    포유동물 세포주가 SV40에 의해서 변환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7); 인간 배아 신장 주(293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell: BHK), 마우스 세르톨리 세포(mouse sertoli cell)(TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(human cervical carcinoma cell: HELA), 개의 신장 세포(canine kidney cell)(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(buffalo rat liver cell: BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(mammary tumor cell)(MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 차이니스 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 및 골수종 세포주인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    당단백질이 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 항체 Fab 단편, F(ab')2, 분해된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody) 또는 scFv인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    R이 아지도이고, 컨주게이터가 알키닐이고, 단계(iii)에서 수행되는 반응이 클릭 반응(click reaction)인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 아미노이고, 단계(iii)에서 수행되는 반응이 환원성 아민화인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 β-아릴에틸아미노이고, 단계(iii)에서 수행되는 반응이 Pictet-Spengler 반응인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    링커가 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아실, 알킬아민, 또는 아릴아민 기, 디설파이드 함유 링커, 산 불안정 링커, 광불안정 링커, 펩티다제 불안정 링커, 및 에스트라제 불안정 링커로부터 선택되는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    페이로드가 치료제 및 라벨(label)로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    치료제가 항대사물질(antimetabolite), 알킬화제, 알킬화-유사 작용제, DNA 마이너 그루브 알킬화제(DNA minor groove alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 항생제(antibiotic), 칼리키아미신(calicheamicin), 항유사분열제(antimitotic agent), 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor), 및 방사성동위워소(radioisotope)로부터 선택되는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 라벨이 형광 라벨, 발색 라벨(chromophoric label), 전자-조밀 라벨(electron-dense label), 화학발광 라벨(chemiluminescent label), 방사성활성 라벨(radioactive label), 효소적 라벨(enzymatic label), 또는 양전자 이미터(positron emitter)인 방법.
  12. 청구항 1에 정의된 화학식(1)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트.
  13. 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 제조하는 방법으로서,
    (i) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 청구항 1에 정의된 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계;
    (ii) 컨주게이터-링커-페이로드를 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트를 생성시키는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00032

    (5)
    Figure pct00033

    (6).
  14. 청구항 13에 있어서,
    당단백질이 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 항체 Fab 단편, F(ab')2, 분해된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody) 또는 scFv인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    R이 아지도이고, 컨주게이터가 알키닐이고, 단계(ii)에서 수행되는 반응이 클릭 반응(click reaction)인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 아미노이고, 단계(ii)에서 수행되는 반응이 환원성 아민화인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 β-아릴에틸아미노이고, 단계(ii)에서 수행되는 반응이 Pictet-Spengler 반응인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서,
    링커가 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아실, 알킬아민, 또는 아릴아민 기, 디설파이드 함유 링커, 산 불안정 링커, 광불안정 링커, 펩티다제 불안정 링커, 및 에스트라제 불안정 링커로부터 선택되는 방법.
  19. 청구항 13에 있어서,
    페이로드가 치료제 또는 라벨(label)인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    치료제가 항대사물질(antimetabolite), 알킬화제, 알킬화-유사 작용제, DNA 마이너 그루브 알킬화제(DNA minor groove alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 항생제(antibiotic), 칼리키아미신(calicheamicin), 항유사분열제(antimitotic agent), 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor), 및 방사성동위워소(radioisotope)로부터 선택되는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 라벨이 형광 라벨, 발색 라벨(chromophoric label), 전자-조밀 라벨(electron-dense label), 화학발광 라벨(chemiluminescent label), 방사성활성 라벨(radioactive label), 효소적 라벨(enzymatic label), 또는 양전자 이미터(positron emitter)인 방법.
  22. 청구항 13에 정의된 화학식(5)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 컨주게이트.
  23. 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트를 제조하는 방법으로서,
    (i) 만노실 (α-1,3-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 청구항 1에서 정의된 화학식(3)의 트리-만노실 코어를 포함하는 변형된 당단백질을 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man2의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계;
    (ii) 컨주게이터-링커-페이로드 A를 화학식(6)의 글리칸 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(8)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A 컨주게이트를 생성시키는 단계;
    (iii) 만노실 (α-1,6-)-당단백질 β-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제의 존재 하에 화학식(8)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A 컨주게이트를 R이 아지도, 케톤 기 또는 알데하이드인 UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R과 반응시켜 GlcNAc-(CH2)0-8-R 당이 Man3의 β-1,2 위치에 결합되게 하여, 화학식(9)를 갖는 글리칸-페이로드 A 모이어티를 포함하는 당단백질이 형성되게 하는 단계; 및
    (iv) 컨주게이터-링커-페이로드 B를 화학식(9)를 갖는 글리칸-페이로드 A 모이어티를 포함하는 당단백질과 반응시켜 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트를 생성시키는 단계를 포함하고,
    여기에서, 페이로드 A 및 페이로드 B가 동일하거나 상이한 방법:
    Figure pct00034

    (6)
    Figure pct00035

    (7)
    Figure pct00036

    (8)
    Figure pct00037

    (9).
  24. 청구항 23에 있어서,
    당단백질이 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 항체 Fab 단편, F(ab')2, 분해된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody) 또는 scFv인 방법.
  25. 청구항 23에 있어서,
    R이 아지도이고, 컨주게이터가 알키닐이고, 단계(ii)/(iv)에서 수행되는 반응이 클릭 반응(click reaction)인 방법.
  26. 청구항 23에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 아미노이고, 단계(ii)/(iv)에서 수행되는 반응이 환원성 아민화인 방법.
  27. 청구항 23에 있어서,
    R이 케톤 기 또는 알데하이드이고, 컨주게이터가 β-아릴에틸아미노이고, 단계(ii)/(iv)에서 수행되는 반응이 Pictet-Spengler 반응인 방법.
  28. 청구항 23에 있어서,
    링커가 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아실, 알킬아민, 또는 아릴아민 기, 디설파이드 함유 링커, 산 불안정 링커, 광불안정 링커, 펩티다제 불안정 링커, 및 에스트라제 불안정 링커로부터 선택되는 방법.
  29. 청구항 23에 있어서,
    페이로드 A 및 페이로드 B가 치료제 및 라벨(label)로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서,
    치료제가 항대사물질(antimetabolite), 알킬화제, 알킬화-유사 작용제, DNA 마이너 그루브 알킬화제(DNA minor groove alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 항생제(antibiotic), 칼리키아미신(calicheamicin), 항유사분열제(antimitotic agent), 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor), 및 방사성동위워소(radioisotope)로부터 선택되는 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 라벨이 형광 라벨, 발색 라벨(chromophoric label), 전자-조밀 라벨(electron-dense label), 화학발광 라벨(chemiluminescent label), 방사성활성 라벨(radioactive label), 효소적 라벨(enzymatic label), 또는 양전자 이미터(positron emitter)인 방법.
  32. 청구항 23에 정의된 화학식(7)의 구조를 포함하는 당단백질-페이로드 A/B 컨주게이트.
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