JP2020503031A - 糖タンパク質−薬物コンジュゲートを調製する方法 - Google Patents

糖タンパク質−薬物コンジュゲートを調製する方法 Download PDF

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Abstract

糖タンパク質を修飾する方法を提供する。さらに本発明は、糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法、及びそれによって生じるコンジュゲートを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／４４０，０７５号の利益を主張するものである。
発明の分野
[0002]本発明は、糖タンパク質が１つ又は複数のトリ−マンノシルコアを含むように糖タンパク質を修飾する方法に関する。さらに本発明は、本発明の糖タンパク質と目的のペイロードを含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートに関する。
発明の背景
[0003]治療用タンパク質薬物は臨床分野で広く使用されており、高価値、高特異性及び低毒性というそれらの利点によって、世界中の大手製薬会社の幾つかは、臨床試験用にこのカテゴリーの薬物の開発に傾注している。これらの治療用タンパク質の大部分はモノクローナル抗体である。その臨床結果に満足している患者もある程度存在するが、臨床試験データは、これらの抗体の幾つかの治療効果は、特にがん治療において、依然として向上させる必要があることを示唆する。この欠点を解決するため、科学者達は、これらの臨床用抗体を幾つかの技術により修飾して、がん療法におけるそれらの有効性を向上させることに焦点を合わせ始めている。これらの技術の中では、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、それらの化学、製造及び品質管理（ＣＭＣ）フレンドリ性、ユーザフレンドリ性、及び少ない副作用のため一層注目されている。これまで、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）、ベスポンサ（Ｂｅｓｐｏｎｓａ）（登録商標）及びカドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）を含めた４個の治療用抗体−薬物コンジュゲートが市場で入手可能であり、多くの他の抗体−薬物コンジュゲートは開発中である（Ｋｕｂｉｚｅｋ Ｆ１、Ｅｇｇｅｎｒｅｉｃｈ Ｂ１、Ｓｐａｄｉｕｔ Ｏ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２０１７年、２４（８）：６８６〜６９５頁；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｅ．、Ｒｏｇｅｒ Ｓｃｈｉｂｌｉ Ｒ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１５年、４、１９７〜２２４頁；Ｓａｐｒａ、Ｐ．、Ｈｏｏｐｅｒ、Ａ．、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｃ．ａｎｄ Ｇｅｒｂｅｒ、Ｈ．−Ｐ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ２０１１年、２０、１１３１〜１１８０頁；Ｆｌｙｇａｒｅ、Ｊ．、Ｐｉｌｌｏｗ、Ｔ．ａｎｄ Ａｒｉｓｔｏｆｆ、Ｐ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．２０１３年、８１、１１３〜１２１頁；Ｐａｎｏｗｓｋｉ、Ｓ．；Ｂｈａｋｔａ、Ｓ．；Ｒａａｂ、Ｈ．；Ｐｏｌａｋｉｓ、Ｐ．ａｎｄＪｕｎｕｔｕｌａ、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．ＭＡｂｓ ２０１３年、６、３４〜４５頁）。
[0004]これらの臨床用ＡＤＣの中で、カドサイラ（登録商標）とマイロターグ（登録商標）は、リシン残基のアミン基にペイロード又はリンカーをランダムにコンジュゲートすることによって形成されるが、しかしながらアドセトリス（登録商標）、ブレンツキシマブベドチン（ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ、ＳＧＮ−３５）は、ネズミ抗ＣＤ３０抗体ＡＣ１０の可変重鎖及び軽鎖領域が融合したキメラ抗ＣＤ３０モノクローナル抗体である。平均４個の（２−８）ＭＭＡＥ分子がＳＧＮ−３０足場にコンジュゲートする。ＭＭＡＥのコンジュゲート地点は、鎖間ジスルフィド結合の軽度還元によって生じるシステイン残基のランダムな−ＳＨ基である。リンカーはチオール反応性マレイミドカプロイルスペーサー、ジペプチドバリン−シトルリンリンカー、及びＰＡＢＣスペーサーからなる（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＪＡ、Ｃｅｒｖｅｎｙ ＣＧ、Ｍｅｙｅｒ ＤＬ、Ｍｉｘａｎ ＢＪ、Ｋｌｕｓｓｍａｎ Ｋ、Ｃｈａｃｅ ＤＦ、Ｒｅｊｎｉａｋ ＳＸら、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ．Ｂｌｏｏｄ ２００３年、４、１４５８〜６５頁）。このような技術は抗体にペイロード又はリンカーを容易にコンジュゲートするが、抗体中の多数のリシン配列及びシステイン残基の最適還元反応の問題のため、コンジュゲートの薬物と抗体の比（ＤＡＲ）を制御することは、これら２つの技術には難しい。これらの現象は抗体製品の不均質性を常にもたらし、ＣＭＣの問題を誘発する。幾つかの文献は、このタイプの第一世代非部位特異的ＡＤＣには、ＰＫ及び免疫原性の欠点があることをさらに示す。
[0005]第一世代ＡＤＣのこれらの欠点を解決するため、スマート−タグ（ＳＭＡＲＴ−Ｔａｇ）、非天然アミノ酸、任意のチロシン、治療用ソルターゼ、チオ−ブリッジ（Ｔｈｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ）などを含む部位特異的ＡＤＣプラットホームが開発される。本発明者らの予想通り、これらの技術は、親抗体中の数箇所の特異的部位又はドメインを操作することにより均質なＡＤＣ製品を生成することができる。例えばチオ−ブリッジ技術は、抗体の部分的に還元状態のジスルフィド結合にリンカー及びペイロードを結合させる。スマート−タグは、細菌オキシダーゼの基質配列として抗体の隣接配列を突然変異させることによる技術である。ホルムアルデヒドを含む得られた産物は、リンカー及びペイロードの結合部位として使用される。予想通り、これらの第二世代ＡＤＣ技術は、独特なＤＡＲと高い均質性があるＡＤＣ製品を生成することができる。しかしながら、天然抗体の突然変異のため、これらのＡＤＣ製品はＰＫ及び免疫原性の問題を有し得る。現在、糖操作した抗体の開発が成功したため、Ｎ−グリコシル化を介した抗体とペイロードのコンジュゲーションが非常に注目されている。
[0006]全ての天然ＩｇＧ及び組換え抗体は、Ｎ−グリコシル化部位である重鎖ＣＨ２定常領域のそれぞれの中の位置２９７にアミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ２９７）を有する。哺乳動物細胞におけるグリコシル化及び翻訳後修飾によって、２つの２アンテナ形状グリカン部分がＩｇＧ上でのＮ−グリコシル化を介して形成され、２アンテナ形状グリカン部分のそれぞれは以下の式を有する少なくとも７つの糖部分によって基本的に構築される：

上式で第１のＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ１）、及び第２のＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ２）、及び任意選択でフコース糖（Ｆｕｃ）は抗体のＡｓｎ２９７にそれぞれ結合し、ＧｌｃＮＡｃ２は第１のマンノース（Ｍａｎ１）にさらに結合し、第２及び第３のマンノース（Ｍａｎ２及びＭａｎ３）はＭａｎ１のα−１，３及びα−１，６位置にそれぞれ結合し、２つのさらなるＧｌｃＮＡｃ糖（ＧｌｃＮＡｃ３及びＧｌｃＮＡｃ４）はＭａｎ２及びＭａｎ３のβ−１，２位置にそれぞれ結合する。このようなグリカン部分及びＧ０Ｆとして表されるフコースを有する抗体は、しかしながら、フコース部分が存在しないとき、この抗体はＧ０である（Ｔ．Ｓｈａｎｔｈａ ＲａｊｕＭＡｂｓ．２０１２年５月１日；４（３）：３８５〜３９１頁）。ＧｌｃＮＡｃ３又はＧｌｃＮＡｃ４の一方が他のガラサイトース糖（ｇａｌａｃｙｔｏｓｅ ｓｕｇａｒ）と結合するとき、抗体はＧ１Ｆ／Ｇ１抗体として表される。抗体のグリカン部分中の末端ＧｌｃＮＡｃ糖の両方が２つの他のガラサイトース糖にそれぞれ結合するとき、抗体はＧ２Ｆ／Ｇ２抗体として表される。哺乳動物細胞によって産生される抗体は、Ｇ０Ｆ（約４０％超）、Ｇ１Ｆ（約３０％〜４０％）及びＧ２Ｆ（１％未満）、及びシアル酸と結合した非常に少量のＧ１Ｆ／Ｇ１とＧ２Ｆ／Ｇ２を一般に含み得る。
[0007]Ｎ２９７グリカン中の各分岐部位の操作は構造を完全な状態に保ち、幾つかの機能多様性、例えば抗体のＡＤＣＣ、半減期及びＣＤＣをもたらすので、幾つかのＮ２９７糖操作ＡＤＣプラットホームが開発されており、幾つかの製品は臨床試験段階にある。ＷＯ２０１４／１６４５３４Ａ２、ＷＯ２０１４／０６５６６１Ａ１、ＷＯ２０１５／０３２８９９Ａ１、ＷＯ２０１５／０５７０６４Ａ１、ＷＯ２０１５／１５７４４６Ａ１、ＵＳ８７１６０３３Ｂ２、ＵＳ７４１６８５８Ｂ２、ＥＰ２７５３７５２Ｂ３、及び論評記事（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．；２０１５年１１月１８日；２６（１１）：２０７０〜５頁）は、抗体薬物コンジュゲーション用の多くの修飾グリカン部分を開示している。しかしながら、抗体−薬物コンジュゲーションにおける薬物と抗体の比（ＤＡＲ）は充分に制御することはできず、且つこれらの技術においてペイロードの多様化を実施できず、したがって、薬物と抗体の比を制御しＡＤＣのペイロード多様性を増大することが当技術分野において必要とされる。本発明はその必要性を満たし、他の利点を提供する。
[0008]本発明の一態様は、式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法を提供する：
[0009]本発明の別の態様は、式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法を提供する：
[00010]本発明の別の態様は、式（７）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲートを生成する方法を提供する：
[00011]本発明の別の態様は、本発明の方法によって入手可能な糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを提供する。
トリ−マンノシル抗体薬物コンジュゲートを生成する１ステップ方針と逐次的方針を示す図である。 実施例１の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、β１，４ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼの処理によってＧ０Ｆ／Ｇ０型ハーセプチンが生じたことを示す。 実施例２の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳにより、Ｇ０／Ｇ０Ｆ型ハーセプチンがトリ−マンノシルコア抗体に転換されたことを示す。 実施例３の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、ＭＧＡＴ−１により、ＧｌｃＮＡＣがトリ−マンノシルハーセプチンの各部位上の末端マンノースの１アームにコンジュゲートしたことを示す。 実施例４の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、ＭＧＡＴ−２及びＭＧＡＴ−１により、トリ−マンノシルハーセプチンがＧ０Ｆ／Ｇ０型ハーセプチンに転換されたことを示す。 実施例６の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、ＭＧＡＴ−１がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚをトリ−マンノシルハーセプチンの各部位上の末端マンノースの１アームにコンジュゲートさせたことを示す。 実施例７の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。図７Ｂは、実施例７のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す。結果は、ＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚをトリ−マンノシルハーセプチンにコンジュゲートさせて、末端Ｎ−アセチルグルコサミン中に４アジド基を有するＧ０Ｆ／Ｇ０型ハーセプチンが生じたことを示す。 実施例７のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、ＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚをトリ−マンノシルハーセプチンにコンジュゲートさせて、末端Ｎ−アセチルグルコサミン中に４アジド基を有するＧ０Ｆ／Ｇ０型ハーセプチンが生じたことを示す。 実施例８の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、トリ−マンノシルハーセプチンがＧｌｃＮＡｚのコンジュゲートに関してＭＧＡＴ−２の基質ではないことを証明する。 図９Ａは実施例９の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。図９Ｂは、実施例９のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す。これらの図の結果は、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１がクリックケミストリー反応によりトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚにコンジュゲートして、ＤＡＲ４を有するハーセプチンＡＤＣが生成したことを示す。 実施例１０の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。この図の結果は、ＭＧＡＴ−１及びＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１により、第１のペイロードがトリ−マンノシル−２ＧｌｃＮＡｚハーセプチン抗体の重鎖の各アームにコンジュゲートしたことを示す。 実施例１１の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。この図の結果は、ＭＧＡＴ−２により、第２のＧｌｃＮＡｚがα−６マンノース、トリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｚ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣの重鎖の各アームにコンジュゲートしたことを示す。これは、ＭＧＡＴ−２が非常に柔軟性のある基質酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚをトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｚ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）などの大型官能基抗体に転換して、デュアルペイロードＡＤＣ産物の中間体を生成することを示唆する。 実施例１２のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。この図の結果は、実施例１１の産物から生じた中間体トリ−マンノシルハーセプチン−２−ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）にＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥを加えることにより、抗体の各アーム上に１個のＭＭＡＥと１個のＤＭ１を有するＤＡＲ４ＡＤＣハーセプチン産物が生じたことを示す。 実施例１３のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、実施例１１の産物から生じた中間体トリ−マンノシルハーセプチン−２−ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）にＤＢＣＯ−ＭＭＡＦを加えることにより、抗体の各アーム上に１個のＭＭＡＦと１個のＤＭ１を有するＤＡＲ４ＡＤＣハーセプチン産物が生じたことを示す。 カドサイラと実施例１４中に記載したトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）の結合ＥＬＩＳＡを示す図である。結果は、カドサイラとトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）産物の間に有意なＫｄ差はなかったことを示す。 実施例１６のトリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体の換算質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。結果は、哺乳動物細胞株によりトリ−マンノシルトラスツズマブとトリマンノシル抗ＴＭＣＣ３が生成されたことを示す。 実施例１７の換算質量クロマトグラフィー分析及びインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。これらの図の結果は、トリ−マンノシルトラスツズマブ−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）が、トリ−マンノシルトラスツズマブ産生哺乳動物細胞から生じたことを示す。
発明の詳細な説明
[00029]他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明を実施又は試験する際に使用することはできるが、好ましい方法及び材料をここで記載する。本明細書で具体的に言及する全ての刊行物及び特許は、本発明に関して使用することができる刊行物中で報告された化学物質、細胞株、ベクター、動物、装置、統計分析及び方法の記載及び開示を含めたあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中に引用した全ての参照文献は、当技術分野における技術のレベルを示すものとして考えるべきである。
[00030]略語
ＡＤＣ 抗体−薬物コンジュゲート
ＤＡＲ 薬物と抗体の比
Ａｓｎ アスパラギン
ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＡｚ Ｎ−アジドアセチルグルコサミン
Ｆｕｃ フコース
Ｍａｎ マンノース
ＭＧＡＴ−１；ＧｎＴ−１ マンノシル（□（四角）−１，３−）−糖タンパク質□（四角）−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
ＭＧＡＴ−２；ＧｎＴ−２ マンノシル（□（四角）−１，６−）−
糖タンパク質□（四角）−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
ＵＤＰ ウリジン二リン酸
ＤＢＣＯ ジベンゾシクロオクチン基
ＤＭ１ メルタンシン
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＭＥＳ ４−モルホリンエタンスルホン酸
ＭＭＡＥ モノメチルアウリスタチンＥ
ＭＭＡＦ モノメチルアウリスタチンＦ
ＴＭＣＣ３ 膜貫通及びコイルドコイルドメインファミリー３
[00031]本明細書及び添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の事を明らかに示さない限り複数表示を含むことを記さなければならない。同様に、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は本明細書では同義で使用することができる。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｈａｖｉｎｇ」を同義で使用することができることも記さなければならない。
[00032]しばしば、「およそ」１つの特定値から及び／又は「およそ」別の特定値までとして、本明細書中で範囲を表す。このような範囲を表すとき、一実施形態は１つの特定値から及び／又は他の特定値までを含む。同様に、語句「およそ」の使用により値を近似値として表すとき、特定値が別の実施形態を形成することは理解される。範囲のそれぞれの終点は、他の終点に対して、それとは無関係にいずれも有意であることがさらに理解される。本明細書で使用する用語「およそ」は、±２０％、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、又は±０．２５％を指す。
[00033]製剤成分を言及するとき、使用する用語、例えば「作用物質」は指定分子体だけでなく、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、コンジュゲート、活性代謝産物、及び他のこのような誘導体、アナログ、及び関連化合物を非制限的に含めた、その薬学的に許容されるアナログも包含するものとする。
[00034]本明細書で使用する一般用語「糖」は、単糖、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクト−ス（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）、並びに単糖の誘導体、アミノ糖及び糖酸など、例えばグルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトースアミン（Ｇａｌｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＺ）、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）、Ｎ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）を示す。
[00035]本明細書で使用する用語「タンパク質」は、天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにそれらの起源又は調製形式に関わらず変異体及び修飾型を含み得る。天然アミノ酸配列を有するタンパク質は、自然界から得たものと同じアミノ酸配列を有するタンパク質である。このような天然配列タンパク質は自然界から単離することができ、又は標準的組換え及び／又は合成法を使用して調製することができる。天然配列タンパク質は、自然界に存在する切断型又は可溶型、自然界に存在する変異体型（例えば、選択的スプライシング型）、自然界に存在する対立遺伝子変異体、及び翻訳後修飾を含む型を具体的に包含する。天然配列タンパク質は、グリコシル化、又はリン酸化などの翻訳後修飾、又は数個のアミノ酸残基の他の修飾後のタンパク質を含む。
[00036]本明細書で使用する用語「糖タンパク質」は、そのタンパク質と共有結合した１つ又は複数の単糖又はオリゴ糖鎖を含むタンパク質を指す。グリカンは、タンパク質のヒドロキシル基（Ｏ−結合−グリコシル）、例えばセリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン又はヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、又はタンパク質上のアミド（Ｎ−糖タンパク質）、例えばアスパラギン又はアルギニン、又はタンパク質上の炭素（Ｃ−糖タンパク質）、例えばトリプトファンに結合し得る。糖タンパク質は２つ以上のグリカンを含む可能性があり、１つ又は複数の単糖と１つ又は複数のオリゴ糖グリカンの組合せを含む可能性があり、Ｎ−結合、Ｏ−結合及びＣ−結合グリカンの組合せを含む可能性がある。糖タンパク質の例には、細胞の表面抗原に特異的なリガンド、前立腺特異的膜抗原、カンジダアンタルクティカ（ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、不凍タンパク質及び抗体がある。
[00037]抗体は、特異的抗原を認識しそれに結合することができる、免疫系によって産生されるタンパク質である。本明細書中の用語抗体はその広い意味で使用し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ジマー、マルチマー、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、並びに二本鎖及び一本鎖抗体を具体的に含む。用語「抗体」は、本明細書ではヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びがん抗原に特異的に結合する抗体を含むことも意味する。用語「抗体」は、完全抗体、ただし抗体の断片、例えば切断抗体由来の抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖも含むことを意味する。さらに、この用語は抗体の遺伝子操作型誘導体を含む。抗体、抗体の断片、及び遺伝子操作型抗体は、当技術分野で知られている方法によって得ることができる。適切な市販の抗体には、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ−１１３１、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブがあるが、これらだけには限られない。
[00038]原核生物及び真核生物発現系を含めた任意の数の発現系を使用して、抗体を産生することができる。幾つかの実施形態では、発現系は、（ハイブリドーマ、又はＣＨＯ細胞発現系などの哺乳動物細胞発現系である。多くのこのような系は、民間の供給業者から広範囲で入手可能である。抗体がＶＨ領域とＶＬ領域の両方を含む実施形態では、ＶＨ領域とＶＬ領域を、シングルベクター、例えばジシストロニック発現ユニットを使用して、又は異なるプロモータの制御下において発現させることが可能である。他の実施形態では、別個のベクターを使用してＶＨ領域とＶＬ領域を発現させることが可能である。本明細書で記載するＶＨ領域又はＶＬ領域は、Ｎ末端にメチオニンを任意選択で含むことができる。
[00039]目的の抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、それらを使用して組換えモノクローナル抗体を産生することができる。モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子ライブラリも、ハイブリドーマ又は形質細胞から作製することができる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組合せによって、異なる抗原特異性を有する大群の抗体が生じる。
[00040]一本鎖抗体又は組換え抗体を産生するための技法（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を適合させて、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生することが可能である。さらに、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物などの他の生物を使用してヒト化又はヒト抗体を発現させることが可能である（例えば米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２〜１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５〜５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８２６（１９９６年）；及びＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３頁（１９９５年）を参照）。
[00041]本明細書で使用する「ＧｌｃＮＡｃ１」、「ＧｌｃＮＡｃ２」、「ＧｌｃＮＡｃ３」、及び「ＧｌｃＮＡｃ４」は、アンテナ状グリカン部分の異なる位置におけるＧｌｃＮＡｃ糖をそれぞれ表す。
[00042]本明細書で使用する

は３つのマンノースを含むトリ−マンノシル構造を表し、上式で第１のマンノース（Ｍａｎ１）はＧｌｃＮＡｃ糖に結合し、第２及び第３のマンノース（Ｍａｎ２及びＭａｎ３）はα−１，３及びα−１，６グリコシド結合を介してＭａｎ１にそれぞれ結合する。
[00043]本明細書で使用する「−（Ｆｕｃ）０−１」は、フコース糖が任意選択で存在し、存在する場合、１つのフコース糖のみが存在することを表す。
[00044]本明細書で使用する「−（ＣＨ２）０−８−」は、−ＣＨ２−が存在するか又は存在しない可能性があり、存在する場合、それは独立して１、２、３、４、５、６、７又は８個の−ＣＨ２−基であり得ることを表す。
[00045]本発明の一態様は、式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法であって、

（ｉ）式（２）

を有するグリカンを含む糖タンパク質とβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを反応させて、式（３）

のトリ−マンノシルコアを含む修飾糖タンパク質を生成するステップ、
（ｉｉ）式（３）のトリ−マンノシルコアを含む修飾糖タンパク質と、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒを、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びマンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、Ｍａｎ２及びＭａｎ３それぞれのβ−１，２位置に２つのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖をそれぞれ結合させ、それによって式（４）

のグリカン部分が形成されるステップ、及び
（ｉｉｉ）２つのコンジュゲータ−リンカー−ペイロードのペイロードが同じであるか又は異なる２つのコンジュゲータ−リンカー−ペイロードを式（４）のグリカン部分と反応させて、式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成するステップを含む方法を提供する。
[00046]幾つかの実施形態では、２つのペイロードは異なり、ペイロードはランダムな形式で、糖タンパク質中の４つのＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ構造のいずれかに結合することができる。
[00047]本発明の別の態様は、
式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法であって、

（ｉ）前に定義した式（３）のトリ−マンノシルコアを含む修飾糖タンパク質と、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒを、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、Ｍａｎ２のβ−１，２位置にＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖を結合させ、それによって式（６）

のグリカン部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、及び
（ｉｉ）式（６）のグリカン部分を含む糖タンパク質とコンジュゲータ−リンカー−ペイロードを反応させて、式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成するステップを含む方法を提供する。
[00048]幾つかの実施形態では、結合ペイロードの位置を正確に制御するため、式（７）

の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲートを、以下のステップ：
（ｉ）前に定義した式（３）のトリ−マンノシルコアを含む修飾糖タンパク質と、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒを、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、Ｍａｎ２のβ−１，２位置にＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖を結合させ、それによって前に定義した式（６）のグリカン部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、
（ｉｉ）式（６）のグリカン部分を含む糖タンパク質とコンジュゲータ−リンカー−ペイロードＡを反応させて、式（８）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡコンジュゲートを生成するステップ、

（ｉｉｉ）式（８）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡコンジュゲートと、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒを、マンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、Ｍａｎ３のβ−１，２位置にＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖を結合させ、それによって式（９）

を有しグリカン−ペイロードＡ部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、及び
（ｉｖ）式（９）を有しグリカン−ペイロードＡ部分を含む糖タンパク質とコンジュゲータ−リンカー−ペイロードＢを反応させて、式（７）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲートを生成するステップであって、
上式でペイロードＡとペイロードＢが同じであるか又は異なる方法によって生成することができる。
[00049]本明細書で使用する糖タンパク質は、例えば固相ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成用に、糖タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞中でのさらなるクローニング及び／又は発現用にベクター内に挿入する。このようなポリヌクレオチドは容易に単離することができ、従来手順を使用して塩基配列決定することができる。当業者によく知られる方法を使用して、糖タンパク質のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、及びＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）中に記載された技法を参照。
[00050]本明細書で使用するβ−Ｎ−エチルグルコサミニダーゼは、オリゴ糖からのβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基の加水分解を触媒するグルコシダーゼファミリーを表す。多くのβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼは、多タイプのβ−グリコシド結合を触媒する際に広範囲の加水分解能力を有することが分かっている。好ましい実施形態では、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、末端アセチルグルコサミン残基と糖タンパク質のＮ−グリカンの間に位置するβ１−２結合を触媒することができるエキソグリコシダーゼであり得る。エクソ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ変異体は、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）及びカナバリアエンシフォルミス（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）などの異なる供給源から得ることができる。
[00051]本発明によれば、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ−１；ＧｎＴ−Ｉ；ＥＣ：２．４．１．１０１）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからα１−３グリコシド結合を介して別の糖部分又はグリカンと結合した末端マンノースにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを移動させる。ＧｌｃＮＡｃとＭＧＡＴ１により移動したα３マンノースの結合はβ１−２グリコシド結合である。ＭＧＡＴ１は真核生物において共通して発現されることが分かっている。それは、ゴルジにおけるハイブリッド及び複雑なＮ−グリカン生合成に不可欠な酵素であるからである。
[00052]本発明によれば、マンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ−２；ＧｎＴ−ＩＩ；ＥＣ：２．４．１．１４３）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからα１，６グリコシド結合を介して別の糖部分又はグリカンと結合した末端マンノースにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを移動させる。ＧｌｃＮＡｃとＭＧＡＴＩＩにより移動したα６マンノースの結合はβ１−２グリコシド結合である。ＭＧＡＴ２は真核生物において共通して発現されることが分かっている。それは、ゴルジにおける複雑なＮ−グリカン生合成に不可欠な酵素であるからである。
[00053]幾つかの実施形態では、式（２）を有するグリカンを含む糖タンパク質とβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの間の反応を哺乳動物細胞培養において実施する。哺乳動物細胞培養では、式（２）を有するグリカンを含む糖タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞株を、糖タンパク質とβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現に適した条件において一培地中でインキュベートする。哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎細胞株（２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ科腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などのミエローマ細胞株がある。
[00054]本発明の幾つかの実施形態では、糖タンパク質は抗体又はその断片である。抗体又はその断片は、抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、切断抗体由来のＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖであり得る。好ましい実施形態では、抗体はハーセプチン、トラスツズマブ又は抗ＴＭＣＣ３抗体である。
[00055]本発明の一実施形態では、Ｒがアジドであり（これは正式名称なのか？）、コンジュゲータがアルキニルであるとき、コンジュゲータ−リンカー−ペイロードは、クリック反応により−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ基と反応して、−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−リンカー−ペイロードを形成する（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ．４０（１１）：２００４〜２０２１頁、及びＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６０（６）：３８４〜３９５頁）。別の実施形態では、Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、コンジュゲータがアミノであるとき、コンジュゲータ−リンカー−ペイロードは、還元的アミノ化により−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ基と反応して、−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−リンカー−ペイロードを形成する（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２０１０年、７５、５４７０〜５４７７頁；ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１１年、４９０〜４９６頁）。さらなる実施形態では、Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、コンジュゲータがβ−アリールエチルアミノであるとき、コンジュゲータ−リンカー−ペイロードは、ピクテ−スペングラー反応により−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ基と反応して、−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−リンカー−ペイロードを形成する（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０１３年、２４（６）、８４６〜８５１頁）。
[00056]幾つかの実施形態では、糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを対象における疾患の治療に使用するとき、ペイロードは治療剤であってよい。治療剤は、細胞増殖抑制薬又は細胞毒性薬、又は対応する放射性同位元素を含むアイソトープ−キレート剤であってよい。細胞増殖抑制薬又は細胞毒性薬の例には、非制限的に、代謝拮抗薬（例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシウレア、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、フルダラビンリン酸、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、カペシチビン、アザチオプリン、シトシンメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、又はペメトレキセド）、アルキル化剤（例えばメルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、ジブロモマンニトール、テトラニトレート、プロカルバジン、アルトレタミン、マイトゾロマミド、又はテモゾロミド）、アルキル化剤様作用物質（例えばシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、又はトリプラチン）、ＤＮＡ小溝アルキル化剤（例えばＣＣ−１０６５などのデュオカルマイシン、及びその任意のアナログ若しくは誘導体、ピロロベンゾジアザペン、又はその任意のアナログ若しくは誘導体）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、又はバルルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン、ベロマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン（例えばマイトマイシンＣ）、カリケアマイシン、抗有糸分裂薬（例えば、メイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４など）、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）含む）、ドラスタチン、クリプトフィシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、又は新規のタキサン）、ツブリシン、及びコルヒチン）含む）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、又はミトキサントロン）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えばボリノスタット、ロミデプシン、チダミド、パノビノスタット、又はベリノスタット）、プロテアソーム阻害剤（例えばペプチジルホウ酸）、並びにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２又は２１３、Ｐ３２などの放射性同位元素及びＬｕ１７７を含めたＬｕの放射性同位体がある。アイソトープ−キレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＴＨＰ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラキス（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、及びメルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）を非制限的に含む。
[00057]幾つかの実施形態では、糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを検出に使用するとき、ペイロードは標識であってよい。これらの標識には、直接検出される標識又は成分（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識など）、及び例えば酵素反応若しくは分子間相互作用によって間接的に検出される酵素又はリガンドなどの成分があるが、これらだけには限られない。例示的標識には、放射性同位元素Ｐ３２、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｈ３、及びＩ１３１、レアアースキレート剤又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、酵素と結合し過酸化水素を利用してＨＲＰなどの色素前駆体を酸化する、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式化合物オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定的フリーラジカルなどがあるが、これらだけには限られない。別の実施形態では、標識はポジトロンエミッタである。ポジトロンエミッタには、Ｇａ６８、Ｆ１８、Ｃｕ６４、Ｙ８６、Ｂｒ７６、Ｚｒ８９、及びＩ１２４があるが、これらだけには限られない。
[00058]幾つかの実施形態では、リンカーは糖タンパク質上に存在する電子求引基と反応することができる官能基を有する。このような電子求引基の例には、アルデヒド及びケトンカルボニル基があるが、これらだけには限られない。幾つかの実施形態では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は糖タンパク質上の電子求引基と反応することができ、糖タンパク質ユニットと共有結合を形成することができる。このような反応性官能基の非制限的な例には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドがあるが、これらだけには限られない。
[00059]幾つかの実施形態では、コンジュゲータは糖タンパク質上に存在する電子求引基と反応することができる官能基を有する。このような電子求引基の例には、アジド、アルデヒド及びケトン基があるが、これらだけには限られない。幾つかの実施形態では、コンジュゲータの反応性官能基のヘテロ原子は糖タンパク質上の電子求引基と反応することができ、糖タンパク質ユニットと共有結合を形成することができる。このような反応性官能基の非制限的な例には、アルキン、ジベンゾシクロシチン、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドがあるが、これらだけには限られない。
[00060]幾つかの実施形態では、リンカーはコンジュゲータ及びペイロードに結合することができる官能基を有する。このようなリンカーの例には、非切断性リンカー及び切断性リンカーがあるが、これらだけには限られない。幾つかの実施形態では、非切断性リンカーには、直鎖状又は分岐状の、２〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、又はアリールアミン基があるが、これらだけには限られない。幾つかの実施形態では、切断性リンカーには、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、及びエステラーゼ不安定性リンカーがあるが、これらだけには限られない。
[00061]以下の実施例は本発明の特定の実施形態を例証するために表し、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本発明の範囲は、図１中に示したような、トリ−マンノシルコア抗体由来の１種又は２種のペイロードを有する均質ＡＤＣを生成するための１ステップ又は逐次的プロセスを含む。
実施例１．β１，４−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼの使用によるハーセプチン抗体の調製
[00062]ハーセプチン抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ）からＮ−グリカンのガラクトースとシアル酸部分を除去するため、１０ｍｇのハーセプチン抗体を、２４時間３７℃で、２０μｌのβ１，４−ガラクトシダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７４５Ｌ、８単位／μｌ）及び５μｌのα２−３，６，８ノイラミニダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７２０Ｌ、５０単位／μｌ）、１×Ｇｌｙｃｏバッファー１（ＮＥＢ、全体積１ｍｌ）中を用いて処理した。１０μｌのβ１，４−ガラクトシダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７４５Ｌ、８単位／μｌ）を反応物にさらに加え、反応は３７℃でさらに２４時間実施させＧ０Ｆ／Ｇ０抗体試料を得た。この抗体試料は、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１２７９−０２）を使用することによって精製した。精製後、抗体試料は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図２中に示した結果は、試料中の多量の抗体が（５０，６００Ｄａの分子量である重鎖を有する）Ｇ０Ｆであり、ごく少量が（フコース糖を含まず、５０，４５１Ｄａの分子量である重鎖を有する）Ｇ０であることを明らかにする。
実施例２．トリ−マンノシルコア抗体へのハーセプチンの転換
[00063]実施例１からの１０ｍｇのＧ０Ｆ／Ｇ０ハーセプチン抗体を、２４時間３７℃で、２０μｌのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ（ＮＥＢ、Ｐ０７４４Ｌ、４単位／μｌ）、１×Ｇｌｙｃｏバッファー１（ＮＥＢ、全体積１ｍｌ）中を用いて処理した。１０μｌのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ（ＮＥＢ、Ｐ０７４４Ｌ、４単位／μｌ）を反応物に加え、反応は３７℃でさらに２４時間進行させ消化抗体試料を得た。この消化抗体試料は、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１２７９−０２）を使用することによって精製した。精製後、抗体試料は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図３中に示した結果は、５０，１９４Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体を得たこと、及びＧ０Ｆ及びＧ０ハーセプチン抗体のほぼ全てがトリ−マンノシルコア抗体に転換されたことを明らかにする。それは、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳが、高効率でＧ０Ｆ及びＧ０抗体をトリ−マンノシルコアを有する抗体に転換することができることを示唆する。
実施例３．マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ−１；ＧｎＴ−１）による、トリ−マンノシルコアハーセプチン抗体の各重鎖の１アームにおけるα−３マンノースとＧｌｃＮＡｃのコンジュゲーション
[00064]実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（４０μｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２．５ｍＭの最終濃度）（Ｓｉｇｍａ、Ｕ４３７５）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ（４−モルホリンエタンスルホン酸）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５））８０μｌ中を、ＭＧＡＴ−１（０．１５μｇ；Ｒ ａｎｄ Ｄ、８３３４−ＧＴ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図４中に示した結果として、５０，１９５Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体と比較して、その重鎖がもう１つのＧｌｃＮＡｃ（２０３Ｄａの分子量）を含有し５０，３９８Ｄａの分子量を有する抗体産物を得た。それは、ＭＧＡＴ−１が１つのＮ−アセチルグルコサミンのみをその基質タンパク質に転換することをサポートする。
実施例４．ＭＧＡＴ−１及びマンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ−２；ＧｎＴ−２）による、Ｇ０Ｆ／Ｇ０ハーセプチンへのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体の転換
[00065]実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（４０μｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２．５ｍＭの最終濃度）（Ｓｉｇｍａ、Ｕ４３７５）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５））８０μｌ中を、ＭＧＡＴ−１（０．１５μｇ）及びＭＧＡＴ−２（０．１μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、反応産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図５中に示した結果として、５０，１９４Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体と比較して、その重鎖がさらに２つのＧｌｃＮＡｃ（２０３Ｄａの分子量×２）を含有し５０，６００Ｄａの分子量を有する、少量のＧ０を含むＧ０Ｆ抗体産物を得た。これらの結果は、ＭＧＡＴ−１、ＭＧＡＴ−２及びＮ−アセチルグルコサミンを組合わせることによって、トリ−マンノシルコア抗体をＧ０／Ｇ０Ｆ抗体に転換することができることを示す。
実施例５．トリ−マンノシルコアハーセプチン抗体はＭＧＡＴ−２の基質ではない
[00066]ＭＧＡＴ−２は、トリ−マンノシルコアがα（１，３）マンノースと結合したＧｌｃＮＡｃ糖を既に有するときのみ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ由来のＧｌｃＮＡｃ糖をトリ−マンノシルコアのα（１，６）マンノースに転換する。言い換えると、ＧｌｃＮＡｃ糖がトリ−マンノシルコアのα（１，３）マンノースと結合していない場合、ＭＧＡＴ−２はＧｌｃＮＡｃ糖をα（１，３）マンノース又はα（１，６）マンノースのいずれかに転換することはできない。前述の観察結果を確認するため、実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（４０μｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２．５ｍＭ）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）８０μｌ中を、ＭＧＡＴ−２（０．１μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。質量スペクトルにおいてトリ−マンノシルコア抗体の分子量に有意な差はない（データ示さず）。この結果は、トリ−マンノシルコアがＭＧＡＴ−２の基質ではないこと、及びＧ０Ｆ／Ｇ０型抗体を生成するのにＭＧＡＴ−２がＭＧＡＴ−１の転換産物を必要とすることを示唆する。
実施例６．ＭＧＡＴ−１によるトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体の各重鎖の１アームの末端α−３マンノースとＧｌｃＮＡｚのコンジュゲーション
実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（４０μｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ（１ｍＭ）（Ｒ ａｎｄ Ｄ、ＥＳ１０４−１００）、１×バッファー（２０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）８０μｌ中を、ＭＧＡＴ−１（０．２５μｇ；Ｒ ａｎｄ Ｄ、８３３４−ＧＴ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図６中に示した結果として、５０，１９５Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体と比較して、その重鎖がもう１つのＧｌｃＮＡｚ（２４４Ｄａの分子量）を含有し５０，４３８Ｄａの分子量を有する抗体産物を得た。この結果は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚがＭＧＡＴ−１の基質の１つであること、及びＭＧＡＴ−１を介して、ＧｌｃＮＡｚはトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体の各重鎖のアーム中のα−３マンノースに結合し、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ抗体を形成することができることを示唆する。
実施例７．ＭＧＡＴ−１及びＵＤＰ−ＭＧＡＴ２によりトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚを生成するためのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体とＧｌｃＮＡｚのコンジュゲーション
[00067]実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（２ｍｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ（１ｍＭ）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）８００μｌ中を、ウサギＭＧＡＴ−１（２５μｇ）及びラットＭＧＡＴ−２（１０μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、反応産物は換算質量クロマトグラフィー分析、及びインタクト質量クロマトグラフィー分析にそれぞれ施した。図７Ａ中に示した換算質量クロマトグラフィー分析の結果として、５０，１９４Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体と比較して、その重鎖が２つのＧｌｃＮＡｚ分子（２４４Ｄａ×２＝４８８Ｄａの分子量）を含有し各重鎖が５０，６８０Ｄａの分子量を有する、トリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚ抗体産物を得た。この結果は、ＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２を介して、ＧｌｃＮＡｚがトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体の各重鎖のα−３マンノースとα−６マンノースにコンジュゲートすることを示唆する。この結果は、インタクト質量クロマトグラフィー分析によってさらに確認される。図７Ｂ中に示した結果として、１４７，２３７Ｄａの分子量を有する完全トリ−マンノシルコアハーセプチン抗体と比較して、４つのＧｌｃＮＡｚ分子（２４４Ｄａ×４＝９７６Ｄａの分子量）を含有し１４８，２１３Ｄａの分子量を有するＧ０Ｆトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚ抗体産物を得た。本発明者らの結果は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚがＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２の基質の１つであることをさらにサポートし、本発明者らは、本発明者らの１ステッププロセスの仮説において中間体テトラ−アジド抗体を首尾よく合成することができる。
実施例８．トリ−マンノシルコアハーセプチン抗体はＧｌｃＮＡｚとコンジュゲートするＭＧＡＴ−２の基質ではない
[00068]実施例２からのトリ−マンノシルコアハーセプチン抗体（４０μｇ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ（１ｍＭ）（Ｒ ａｎｄ Ｄ ＥＳ１０４−１００）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）８０μｌ中を、ラットＭＧＡＴ−２（０．２５μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図８は、質量スペクトルにおいてトリ−マンノシルコア抗体の分子量に有意な差はないことを示し、実施例５の結果としてトリ−マンノシルコア抗体がＭＧＡＴ−２の基質ではないことを示唆する。
実施例９．ＤＡＲ４を有するハーセプチンＡＤＣを生成するための、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１とトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚ抗体のコンジュゲーション
[00069]実施例７中で、４つのＧｌｃＮＡｚそれぞれが４つの末端マンノースに結合したトリ−マンノシル抗体を生成した。本発明の１ステッププロセスの仮説を実施するため、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１を使用し毒性ペイロードとトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚをカップリングさせ、ＤＡＲ４を有するＡＤＣを生成した。５μＬのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、実施例７から得た５ｍｇ／ｍＬのトリ−マンノシル−４ＧｌｃＮＡｚハーセプチン抗体を含有する５０μＬのバッファー（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５）にゆっくり加え、２５℃で一晩クリックケミストリー反応を実施した。反応後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルタデバイスにより抗体産物を精製して、トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを得た。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図９Ａ中の結果は、４ＧｌｃＮＡｚを含むその親トリ−マンノシル抗体との比較によって、反応産物、トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）の重鎖は５３，５０９Ｄａの分子量を有することを明らかにし、それは２つのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１分子（１，４１３Ｄａ×２＝２，８２６Ｄａの分子量）が抗体のそれぞれの重鎖にコンジュゲートしたことを意味する。この結果はインタクト質量クロマトグラフィー分析によってさらに確認される。図９Ｂ中の結果は、約１４８，２２４Ｄａの分子量を有するトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚ抗体と比較して、４つのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１分子（１，４１３Ｄａ×４＝５，６５２Ｄａの分子量）を含有し、１５３，８７６Ｄａの分子量を有する、トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣ産物を得たことを明らかにする。実施例７及び９からの結果は、ＭＧＡＴ−１、ＭＧＡＴ−２及びＧｌｃＮＡｚ反応及びＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１クリックケミストリー反応を直接組合わせることにより、トリ−マンノシル抗体からＡＤＣ−４ＤＭ１産物が生成されることを示す。したがって、本発明者らは、本発明中のＡＤＣ生成に関する本発明者らの１ステッププロセスの仮説を首尾よく合理化する。
実施例１０．ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１による、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚの重鎖の各アームにおける末端ＧｌｃＮＡｚと第１のペイロードのコンジュゲーション。
実施例４〜９は、本発明中のＡＤＣ生成に関する１ステッププロセスの実行をサポートして、４の均質ＤＡＲを有する部位特異的ＡＤＣを生成する。これらの成功結果によって、図１中に示した逐次的方法を証明するための試験を実施した。第１の中間体産物を合成するため、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１を使用し反応抗体の重鎖の各末端ＧｌｃＮＡｚにペイロードをカップリングさせた。１４μＬのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、実施例６から得た２ｍｇ／ｍＬのトリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ抗体を含有する３５０μＬのバッファー（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５）にゆっくり加えた。反応混合物はアルゴン下において２５℃で一晩攪拌し、クリックケミストリー反応を実施した。反応後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルタデバイスにより抗体産物を濾過して、トリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）中間体を得た。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図１０中に示した結果として、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｃ抗体と比較して、５１，８５２Ｄａの分子量を有するトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）中間体の重鎖の１アームは、１４１４Ｄａの分子量を有する１つの他のＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１分子を含有する。
実施例１１．ＭＧＡＴ−２によるトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｚ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣの重鎖の各アームにおける末端α−６マンノースと第２のＧｌｃＮＡｚのコンジュゲーション。
[00070]実施例１０から得たトリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ（１ｍＭ）（Ｒ ａｎｄ Ｄ ＥＳ１０４−１００）、１×バッファー（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）５００μｌ中を、ラットＭＧＡＴ−２（１５μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。反応後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルタデバイスにより抗体産物を濾過して、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）を得た。産物は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図１１中に示した結果として、親トリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）と比較して、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）の各重鎖は、５２，０９７Ｄａの分子量を有する１つの他のＧｌｃＮＡｚ分子を含有する（ＭＷ＝２４４）。この結果は、ＭＧＡＴ−２が非常に柔軟性のある基質酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚをトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｚ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）などの大型官能基抗体に転換して、デュアルペイロードＡＤＣ産物の中間体を生成することを示す。
実施例１２．抗体の各アーム上に１つのＭＭＡＥと１つのＤＭ１を有するＤＡＲ４ＡＤＣハーセプチン産物の構築
[00071]実施例１１中で、トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）中間体を生成した。図１中に示した本発明の逐次的プロセスを実施するため、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥを使用し毒性ペイロードとトリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）をカップリングさせ、ＤＡＲ４を有するＡＤＣ及び２種のペイロードを生成した。
[00072]３．８μＬのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、実施例１１から得た２．５ｍｇ／ｍＬのトリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを含有する７６μＬの１×バッファー（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５）にゆっくり加えた。反応混合物はアルゴン下において２５℃で一晩攪拌し、クリックケミストリー反応を実施した。反応後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルタデバイスにより抗体産物を濾過して、トリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ）ＡＤＣを得た。精製後、次いで産物はインタクト質量クロマトグラフィー分析に施した。図１２中に示した結果として、１５１，０５０Ｄａの分子量を有する親トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）と比較して、得られたトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ）ＡＤＣは２つの他のＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ分子（分子量＝１６４８×２＝３，２９６）を含有し、１５４，３４５Ｄａの分子量を有する。この結果は、本発明の方法が、トリ−マンノシルハーセプチンと２つの異なるペイロード（例えば、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１及びＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ）のコンジュゲーションを正確に制御することができることを示唆する。
実施例１３．抗体の各アーム上に１つのＭＭＡＦと１つのＤＭ１を有するＤＡＲ４ＡＤＣハーセプチン産物の構築
[00073]３．８μＬのＤＢＣＯ−ＭＭＡＦ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、実施例１１から得た２．５ｍｇ／ｍＬのトリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを含有する７６μＬの１×バッファー（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５）にゆっくり加えた。反応混合物はアルゴン下において２５℃で一晩攪拌し、クリックケミストリー反応を実施した。反応後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルタデバイスにより抗体産物を濾過して、トリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−ＭＭＡＦ）ＡＤＣを得た。産物はインタクト質量クロマトグラフィー分析に施した。図１３中に示した結果として、親トリ−マンノシルハーセプチン−２ＧｌｃＮＡｚ−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣ（分子量＝１５１，０５０Ｄａ）と比較して、得られたトリ−マンノシルハーセプチン−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）−２（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−ＭＭＡＦ）ＡＤＣは、２，０３８Ｄａの分子量である２つの他のＤＢＣＯ−ＭＭＡＦ分子を含有し、１５３，０８２Ｄａの分子量を有する。この結果は、本発明の方法が、トリ−マンノシルハーセプチンと様々な種のペイロード（例えば、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）１２−ＭＭＡＥ及びＤＢＣＯ−ＭＭＡＦ）のコンジュゲーションを正確に制御することができることを示唆する。
[00074]要約すると、ＭＧＡＴ−１、ＭＧＡＴ−２及びＧｌｃＮＡｚ酵素反応及びＤＢＣＯ−ペイロードケミストリー反応を組合わせることにより、本発明者らは本発明の本発明者らの仮説を合理化する。本発明者らは、本発明者らの１ステッププロセスにより、ＤＡＲ４又はＤＡＲ２を有する均質な部位特異的ＡＤＣ産物を生成することができる。他方で、本発明をさらに適用して、逐次的プロセスにより２種のペイロードを有する均質な部位特異的ＡＤＣ産物を合成する。
実施例１４．トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）の結合アフィニティー分析
[00075]トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを前に記載した方法によって構築した。Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ分子に対するカドサイラは（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）から購入した。ＥＲＢＢ２−ＥＣＤ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＢＭＳ３６２）（１００ｎｇ／ウエル）をＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウエルに加え、プレートは一晩４℃で別の場所に置いた。プレートは１×ＰＢＳ−Ｔ（０．１％）で洗浄し非コーティング試薬を除去した。３％スキムミルクをプレートのウエルに加え、プレートは室温で２時間別の場所に置いた。プレートは１×ＰＢＳ−Ｔ（０．１％）で３回洗浄し、乾燥させ、次いでさらなる使用のため−２０℃で保存した。個々の抗体の１×１０−６ｇ／ｍＬ〜１×１０−１２ｇ／ｍＬの連続希釈液をプレートに加え、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを１時間のインキュベーションで加え、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えた。ＯＤ４０５を読み取り活性を計算した。各試験は３回繰り返し、データは平均±ＳＤとして表した。ＯＤを読み取り値と抗体の濃度を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用し多重スキャッタープロットを作製した。図１４中に示した結果は、トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣの曲線は、陽性対照カドサイラ及びトリ−マンノシルハーセプチン−４ＧｌｃＮＡｚの曲線とほぼ同じであったことを明らかにする。陰性対照アンチメソテリン（ａｎｔｉ−ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｅｎ）はＨｅｒ２／Ｎｅｕ分子に対する結合アフィニティーを示さない。この結果は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ分子に対するトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣの結合アフィニティーは、施す修飾によって影響を受けないことを示唆する。
実施例１５．トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣの細胞毒性効果
[00076]Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ高度発現細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ中程度発現細胞株ＨＣＣ−１９５４及びＨｅｒ２／Ｎｅｕ低度発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を１０６細胞／ｍｌに希釈した。１００μＬの希釈細胞培養物を９６ウエルプレートのウエルに加えた後、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。８０μｌの完全培地を各ウエルに加え、２０μｌのトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを、次いで異なるウエルに異なる用量で加えた。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウエルに加えた。室温で１０分間さらにインキュベートした後、ウエルの発光（光）をルミノメータによって測定した。Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ高度発現細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、及びＨｅｒ２／Ｎｅｕ中程度発現細胞株ＨＣＣ−１９５４に対するトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣのＩＣ５０値は、それぞれ４．７ｎＭ及び１４ｎＭであった。これらのＩＣ５０値は、試験した全ての抗体には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ低度発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する抗増殖効果がなかったことも示す。この結果は、カドサイラ、トリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣは、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ高度発現細胞だけでなくＨｅｒ２／Ｎｅｕ中程度発現細胞に対しても細胞毒性があり、トリ−マンノシルＡＤＣプラットホームによる抗体の修飾はその生物活性に影響を与えないことを示唆する。
実施例１６．Ｆ２９３細胞によるトリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体及びトリ−マンノシルコア抗ＴＭＣ３３抗体の産生
[00077]β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＣＡＥ８．３−ｅｘｏ−Ｇａｌを構築し、２つのＦ２９３細胞株にコトランスフェクトして、トリ−マンノシルトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２抗体）及びトリ−マンノシル抗ＴＭＣ３３（膜貫通及びコイルドコイルドメインファミリー３）抗体をそれぞれ発現させた。インキュベーション後、２つの細胞培養物の上清を回収し、そこに含有されていた抗体は、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１２７９−０２）を使用することによってそれぞれ精製した。精製後、精製した抗体試料は換算質量クロマトグラフィー分析に施した。図１５Ａ中に示した結果は、トラスツズマブ遺伝子のみをトランスフェクトしたＦ２９３細胞から単離した抗体と比較して、トラスツズマブ遺伝子とさらにβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳをトランスフェクトした同じ細胞から得たトラスツズマブ抗体の重鎖は５０，１９５Ｄａの分子量でピークを示し、それは得られたトラスツズマブ抗体がトリ−マンノシルコア抗体であったことを示すことを明らかにする。同様の結果が、抗ＴＭＣＣ３抗体遺伝子をトランスフェクトした同じ細胞において見られる（図１５Ｂ）。この結果は、トリ−マンノシル抗体は市販の細胞株から大量生産することが可能であり、工業的ＣＭＣ増幅に施用されることを示唆する。
実施例１７．ＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２によりトリ−マンノシルハーセプチン−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣを生成するための細胞発現トリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚのコンジュゲーション
[00078]実施例７中に記載した方法に従い、（哺乳動物細胞によって産生され）実施例１６から得た２ｍｇのトリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｚ（１ｍＭ）、１×バッファーＳＰ（２５ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）８００μｌ中を、ウサギＭＧＡＴ−１（２５μｇ）及びラットＭＧＡＴ−２（１０μｇ）の存在下において１６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、反応産物は換算質量クロマトグラフィー分析、及びインタクト質量クロマトグラフィー分析に施した。図１６Ａ中に示した換算質量クロマトグラフィー分析の結果として、５０，１９４Ｄａの分子量である重鎖を有するトリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体と比較して、その重鎖が約２４４Ｄａ×２＝４８８の分子量である２つの他のＧｌｃＮＡｚ分子を含有し各重鎖が約５０，６８０Ｄａの分子量を有する、トリ−マンノシルトラスツズマブ−４ＧｌｃＮＡｚ抗体産物を得た。この結果は、ＭＧＡＴ−１及びＭＧＡＴ−２を介して、ＧｌｃＮＡｚが哺乳動物細胞によって産生されたトリ−マンノシルコアトラスツズマブ抗体の各重鎖のα−３マンノースとα−６マンノースにコンジュゲートし得ることを示唆する。
[00079]実施例９中に記載した方法に従い、ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１を、前に得たトリ−マンノシルトラスツズマブ−４ＧｌｃＮＡｚ抗体を含有するトリスバッファー（ｐＨ７．０）にゆっくり加え、２５℃で１６時間クリックケミストリー反応を実施した。反応及び精製後、産物は換算質量クロマトグラフィー分析、及びインタクト質量クロマトグラフィー分析に施した。図１６Ｂ中の換算質量クロマトグラフィー分析の結果は、産物の重鎖が５３，５０９Ｄａの分子量を有することを明らかにし、それは２つのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１分子（１，４１３Ｄａ×２＝２，８２６Ｄａの分子量）がトリ−マンノシルトラスツズマブ−４ＧｌｃＮＡｚ抗体の重鎖にコンジュゲートしたことを示唆する。この結果は、図１６Ｃ中のインタクト質量クロマトグラフィー分析の結果によってさらに確認される。この結果は、４つのＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１分子（１，４１３Ｄａ×４＝５，６５２Ｄａの分子量）を含有し約１５３，８６８Ｄａの分子量を有する、トリ−マンノシル−４（ＧｌｃＮＡｃ−トリアゾール−ＤＢＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＭ１）ＡＤＣ産物を得たことを明らかにする。
[00080]当業者は、本発明が主題を実行し、前述の目的及び利点、並びにそれらの本質を得るように充分構成されていることを容易に理解する。本発明の代表的な好ましい実施形態として本明細書に記載した方法及び組成物は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではない。本発明の変形及び他の使用は当業者には思い浮かび、それらは本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲によって定義される。

Claims (32)

  1. 式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを調製する方法であって、

    （ｉ）式（２）を有するグリカンを含む糖タンパク質とβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを反応させて、

    式（３）のトリ−マンノシルコアを含む修飾糖タンパク質を生成するステップ、

    （ｉｉ）式（３）の前記トリ−マンノシルコアを含む前記修飾糖タンパク質を、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒと、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びマンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、２つのＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖をそれぞれＭａｎ２及びＭａｎ３それぞれのβ−１，２位置に結合させ、それによって式（４）のグリカン部分が形成されるステップ、及び

    （ｉｉｉ）２つのコンジュゲータ−リンカー−ペイロードの前記ペイロードが同じであるか又は異なる２つのコンジュゲータ−リンカー−ペイロードを式（４）の前記グリカン部分と反応させて、式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成するステップを含む方法。
  2. ステップ（ｉ）中の式（２）を有するグリカンを含む前記糖タンパク質及び前記β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが哺乳動物細胞株によって生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記哺乳動物細胞株がＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎細胞株（２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ科腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞株である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記糖タンパク質が、抗体又はその断片、例えば切断抗体由来の抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖである、請求項１に記載の方法。
  5. Ｒがアジドであり、前記コンジュゲータがアルキニルであり、ステップ（ｉｉｉ）中で実施する前記反応がクリック反応である、請求項１に記載の方法。
  6. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがアミノであり、ステップ（ｉｉｉ）中で実施する前記反応が還元的アミノ化である、請求項１に記載の方法。
  7. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがβ−アリールエチルアミノであり、ステップ（ｉｉｉ）中で実施する前記反応がピクテ−スペングラー反応である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記リンカーが、直鎖状又は分岐状の、２〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、又はアリールアミン基、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、及びエステラーゼ不安定性リンカーから選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ペイロードが治療剤及び標識から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記治療剤が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アルキル化剤様作用物質、ＤＮＡ小溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリケアマイシン、抗有糸分裂薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射性同位元素から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記標識が、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、又はポジトロンエミッタである、請求項９に記載の方法。
  12. 請求項１で定義した式（１）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲート。
  13. 式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成する方法であって、

    （ｉ）請求項１で定義した式（３）の前記トリ−マンノシルコアを含む前記修飾糖タンパク質を、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒと、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖をＭａｎ２のβ−１，２位置に結合させ、それによって式（６）のグリカン部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、及び

    （ｉｉ）コンジュゲータ−リンカー−ペイロードを、式（６）のグリカン部分を含む前記糖タンパク質と反応させて、式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲートを生成するステップを含む方法。
  14. 前記糖タンパク質が、抗体又はその断片、例えば切断抗体由来の抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖである、請求項１３に記載の方法。
  15. Ｒがアジドであり、前記コンジュゲータがアルキニルであり、ステップ（ｉｉ）中で実施する前記反応がクリック反応である、請求項１３に記載の方法。
  16. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがアミノであり、ステップ（ｉｉ）中で実施する前記反応が還元的アミノ化である、請求項１３に記載の方法。
  17. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがβ−アリールエチルアミノであり、ステップ（ｉｉ）中で実施する前記反応がピクテ−スペングラー反応である、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記リンカーが直鎖状又は分岐状の、２〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、又はアリールアミン基、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、及びエステラーゼ不安定性リンカーから選択される、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記ペイロードが治療剤又は標識である、請求項１３に記載の方法。
  20. 前記治療剤が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アルキル化剤様作用物質、ＤＮＡ小溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリケアマイシン、抗有糸分裂薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射性同位元素から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標識が、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、又はポジトロンエミッタである、請求項１９に記載の方法。
  22. 請求項１３で定義した式（５）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードコンジュゲート。
  23. 式（７）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲートを生成する方法であって、

    （ｉ）請求項１で定義した式（３）の前記トリ−マンノシルコアを含む前記修飾糖タンパク質を、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒと、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖をＭａｎ２のβ−１，２位置に結合させ、それによって式（６）のグリカン部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、

    （ｉｉ）コンジュゲータ−リンカー−ペイロードＡを、式（６）のグリカン部分を含む前記糖タンパク質と反応させて、式（８）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡコンジュゲートを生成するステップ、

    （ｉｉｉ）式（８）の構造を含む前記糖タンパク質−ペイロードＡコンジュゲートを、Ｒがアジド、ケトン基又はアルデヒドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒと、マンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で反応させ、ＧｌｃＮＡｃ−（ＣＨ２）０−８−Ｒ糖をＭａｎ３のβ−１，２位置に結合させ、それによって式（９）を有しグリカン−ペイロードＡ部分を含む糖タンパク質が形成されるステップ、及び

    （ｉｖ）コンジュゲータ−リンカー−ペイロードＢを、式（９）を有し前記グリカン−ペイロードＡ部分を含む前記糖タンパク質と反応させて、式（７）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲートを生成するステップを含み、
    前記ペイロードＡと前記ペイロードＢとが同じであるか又は異なる方法。
  24. 前記糖タンパク質が、抗体又はその断片、例えば切断抗体由来の抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖである、請求項２３に記載の方法。
  25. Ｒがアジドであり、前記コンジュゲータがアルキニルであり、ステップ（ｉｉ）／（ｉｖ）中で実施する前記反応がクリック反応である、請求項２３に記載の方法。
  26. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがアミノであり、ステップ（ｉｉ）／（ｉｖ）中で実施する前記反応が還元的アミノ化である、請求項２３に記載の方法。
  27. Ｒがケトン基又はアルデヒドであり、前記コンジュゲータがβ−アリールエチルアミノであり、ステップ（ｉｉ）／（ｉｖ）中で実施する前記反応がピクテ−スペングラー反応である、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記リンカーが、直鎖状又は分岐状の、２〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、又はアリールアミン基、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、及びエステラーゼ不安定性リンカーから選択される、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記ペイロードＡ及び前記ペイロードＢが治療剤及び標識から独立して選択される、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記治療剤が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アルキル化剤様作用物質、ＤＮＡ小溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリケアマイシン、抗有糸分裂薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射性同位元素から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記標識が、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、又はポジトロンエミッタである、請求項２９に記載の方法。
  32. 請求項２３で定義した式（７）の構造を含む糖タンパク質−ペイロードＡ／Ｂコンジュゲート。
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