KR20190085292A

KR20190085292A - Tha를 유효성분으로 포함하는 전립선암 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20190085292A
Application number: KR1020180003229A
Authority: KR
Inventors: 강건욱; 정성백
Original assignee: 한국유나이티드제약 주식회사
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2019-07-18
Also published as: JP6990776B2; KR102404681B1; JP2021509901A; US20210093583A1; WO2019139283A1; US11484511B2

Abstract

본 발명은 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 THA는 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)의 주성분이다. 본 발명의 조성물은 특히, PLK1 (Polo-like kinase 1)의 활성을 억제함으로써 전립선암의 증식을 효과적으로 억제하는바, 향후 전립선암에 대한 예방, 개선, 및 치료의 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

THA를 유효성분으로 포함하는 전립선암 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition comprising 2,4,6-trihydroxyacetophenone as a active ingredient for treating prostate cancer}

본 발명은 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

커큐마 코모사 (Curcuma Comosa)는 태국과 베트남 등의 동남아시아에서 건강기능성식품의 원료로 널리 사용되는 강황 속 식물로, 특히, 여성호르몬인 에스트로겐 유사 작용으로 폐경기 여성의 질 위축이나 혈관확장 등에 효과가 있음이 알려져 있다. 커큐마 코모사의 유효성분으로는 다이아릴헤파타노이드 (diarylhepatanoid) 계열이 알려져 있으며, 상기 화합물은 간세포 보호 (간 보호), 멜라닌 생성 억제 (미백), 또는 조골세포 분화 촉진 (골다공증 개선) 과정에 영향을 미친다는 사실이 밝혀져 있다. 또한, 커큐마 코모사의 추출물은 혈중 콜레스테롤 감소 효과가 있음이 알려져 있으며, 이는 커큐마 코모사의 또 다른 유효성분인 2,4,6-트라이하이드록시아세토페논 (2,4,6-trihydroxyacetophenone, THA, Phloracetophenone (플로로아세토페논))의 작용으로 알려져 있으나, 상기 화합물의 항암 활성에 관하여는 아직 알려진 바가 없다.

한편, 전립선암이란 전립선에 발생한 암을 의미하는데, 미국, 유럽에서는 전체 남성암 중 유병률 1위, 사망률 2위의 대표적인 남성 암 질환이다. 국내에서는 서구국가에 비해 발생률은 낮지만 악성도가 높다는 보고가 있고, 서구화된 식생활의 보편화, 노령인구 증가, 진단 기술의 발달 등으로 남성암 중 증가율 1위를 차지하는 등 전립선암이 빠르게 증가하고 있는 추세이다. 전립선암의 발병 원인은 아직까지 명확하기 밝혀진 바가 없으나, 연령, 인종, 가족력 및 유전적 소인 외에도 호르몬, 식이습관, 제초제와 같은 화학약품 등도 발병에 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있다.

전립선암의 치료는 병의 진행 단계에 따라 차이가 있는데, 조기 전립선암은 외과적인 수술과 방사선 치료로 암세포를 제거하는 근본적인 치료가 선행되며, 암세포가 전립선을 벗어나 주위로 전이된 경우 호르몬치료를 받게 된다. 남성호르몬은 전립선암의 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있어, 이를 억제함으로써 전립선암의 진행을 늦추거나 막을 수 있다. 다만, 이와 같은 호르몬 치료를 장기간 받게 되면 결국 호르몬 치료에 내성이 생겨 전이성 호르몬 불응성(거세저항성) 전립선암으로 진행되게 되는데, 환자의 생존 기간이 9~13개월에 불과할 정도로 예후가 좋지 않아 적극적인 치료가 필요하다. 이때부터는 항암화학요법으로 도세탁셀을 처방할 수 있지만 전립선암 환자는 대다수가 고령이기 때문에 화학적 항암요법이 가진 부작용을 견디기 어렵다는 문제점이 있다.

Plk family 중 하나인 Polo-like kinase 1 (Plk1)은 증식 중인 성체 조직과 분열 중인 세포에서만 발현되는 키나아제 단백질로서, Plk1의 발현량은 세포 증식의 지표가 되어 다양한 암의 악성화를 추적할 수 있다. 또한, 암 조직에서 Plk1의 높은 발현량은 증식뿐만 아니라, 전이와도 관련이 있다고 보고된 바 있는데, 다양한 암 조직에서 암의 악성화에 관여하는 대표적인 원인인 P53의 변이가 Plk1의 발현 양과 관련되어 있고, P53의 변이는 Plk1의 활성화를 일으키고 이를 통하여 암의 악성화가 일어난다고 알려져 있다.

Plk1은 serine/threonine 인산화 효소로서, 중심체 형성, 양극 방추사 형성, 염색체 골격, 및 분열구 형성을 조절하는 세포분열을 통한 암세포 증식의 핵심 신호에 해당하는데, 암세포 증식 과정에서 Plk1이 활성화되어, cdc25c를 작동시키며, 작동된 cdc25c는 cyclin B1을 탈인산화 시켜 암세포의 유사분열을 유도하게 된다. 이는 결국 암세포 증식을 일으키게 되는데, 이에, Plk1의 억제제인 볼라설팁 (Volasertib)이 최근 희귀 의약품 (orphan drug) 혈액암 치료제로 승인받는 등 현재 많은 합성 Plk1 억제제가 항암 약물로 임상시험에 진입하였다. 또한, 최근 Plk1은 다양한 종류의 혈액암과 고형암에서 치료표적으로 관심을 모을 뿐만 아니라 젬시타빈 (gemcitabine) 저항성 췌장암세포 및 이마티닙 (imatinib) 저항성 만성골수성백혈병 등의 항암제 저항성 암종에서 약물 타깃으로 적용 가능성이 제시된 바가 있다. 하지만, 아직까지 Plk1의 거세저항성 전립선암 치료 가능성 평가는 현재 전무한 실정이다.

한국등록특허 제10-0922519호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 Plk1 활성을 억제하는 약물 개발을 위하여 연구 노력한 결과, 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)의 주성분인 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)가 Plk1 활성 억제를 일으켜 전립선암의 진행을 억제한다는 것을 최초로 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로, 상기 THA는 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)로부터 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 전립선암은 Plk1 (Polo-like kinase 1) 과발현 전립선암 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 Plk1 (Polo-like kinase 1) 활성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 cdc25c 또는 cyclin B1의 활성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 카스파제-3/7 (caspase-3/7) 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 세포자가사멸 지수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

나아가, 본 발명은 전립선암 치료를 필요로 하는 개체에 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 전립선암의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 전립선암의 치료용도를 제공한다.

본 발명은 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 THA는 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)의 주성분이다. 본 발명의 조성물은 특히, PLK1 (Polo-like kinase 1)의 활성을 억제함으로써 전립선암의 증식을 효과적으로 억제하는바, 향후 전립선암에 대한 예방, 개선, 및 치료의 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 전립선암 세포주에서 Plk1 및 안드로겐 수용체의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 전립선암 세포주에서 Plk1 및 하위 단백질의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 전립선암 세포주에 THA, BI2536, 및 푸르푸로갈린 (PPG)을 처리한 다음, 세포 증식 억제 효과를 비교하여 나타낸 도이다.
도 4a 및 도 4b는 카스파제-3/7 (caspase-3/7) 활성을 통하여 세포자가사멸 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 cleaved caspase-3 (CC3) 발현량을 통하여 세포자가사멸 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 전립선암 세포주에 THA 및 BI2536을 처리한 다음, 세포주기 차단 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명자들은, 전립선암 치료법에 대하여 예의 연구한 결과, 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)의 주성분인 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)가 특히, PLK1 억제 활성을 통해 전립선암의 증식을 억제하는데 효과적이라는 사실을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 전립선암 세포주에서의 Plk1, 안드로겐 수용체 및 하위단백질의 발현 변화를 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone) 처리에 따른 전립선암 세포의 세포증식 억제 효과를 확인하였으며(실시예 3 참조), 또한, THA 처리에 따른 세포자가사멸 증가 효과를 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, THA 처리에 따른 전립선암 세포의 세포주기 차단 효과를 확인하였다(실시예 5 참조).

따라서 본 발명에 따른 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)를 이용하여 전립선암의 예방 또는 치료가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용할 수 있다.

이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 전립선암 또는 거세저항성 전립선암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 전립선암 또는 거세저항성 전립선암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점 또는 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체 (예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물 또는 조성물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염"은 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해 시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조 시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조 시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "암"은 정상인 조직세포가 어떤 원인으로 무제한 증식하여 그 생체의 생활현상이나 주위의 조직상태 등에 관계없이 급속한 발육을 계속하는 질환으로 구분되며, 본 발명에서의 암은 전립선암 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화합물은 PLK1 억제 활성을 통해 암 세포의 증식을 억제함으로써 암의 예방, 개선 또는 치료하는데 효과가 있다.

본 발명에서, 상기 THA는 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)로부터 추출될 수 있으며, 당 업계에 공지된 천연으로부터 추출물을 수득하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 바람직하게는 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출하는 방법을 통해 수득할 수 있다.

상기 커큐마 코모사에 물이나 유기용매를 첨가하여 추출하는 과정은 교반 또는 방치 등의 방법으로 수행될 수 있는데, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법 또는 초음파 추출법 등을 1회 또는 수회 반복하여 추출할 수 있으며, 이때 첨가할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 또는 메틸렌클로라이드 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 전립선암의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 쥐(rat), 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 시약 및 재료

cleaved caspase-3 (CC3), Cdc25c, Polo-like kinase 1 (Plk1) 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구매하였고, Cyclin B1 (G2/mitotic-specifiec cyclin-B1), androgen receptor (AR) 항체 및 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX. USA)에서 구입하였다. 또한, phospho-HH3 (histone H3, PHH3) 항체는 Biolegend (San Diego. CA, USA) 에서 구입하였다.

IncucyteTM caspase-3/7 green apoptosis assay reagent는 Essen Bioscience (Ann Arbor, MI, USA)에서 구매하였고, β-actin 항체 및 플루타마이드 (flutamide)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며, 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)는 ㈜한국유나이티드제약에서 제공받아 사용하였다.

1-2. 전립선암 세포주 배양

LnCaP 세포, 안드로겐 수용체 (Androgen Receptor, AR) 음성세포인 PC3 세포, 및 거세저항성을 보이는 C4-2 세포는 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) (Hyclone, Logan, UT, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)을 포함하는 RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여 배양하였다.

플루타마이드 저항성 LnCaP 세포(FLTRLNCaP 세포)는 9 % 소태아혈청 (Hyclone, Logan, UT, USA)과 1% Charcoal-dextran 소태아혈청 (Gemini, West Sacramento, CA, USA)를 포함하는 배지에서 LnCaP 세포를 배양한 다음, 플루타마이드 (flutamide)를 처리하여 구축한 것으로서, 상기 플루타마이드의 농도를 약 12개월간 1 μM 에서부터 시작해 점차적으로 높여, 결과적으로 30 μM에서 저항성을 획득한 플루타마이드 저항성 LnCaP 세포를 구축하였다.

1-3. 면역화학적 분석

겔 전기영동 장치 (Mighty Small SE250, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco)를 사용하여 SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)를 수행하였다. 세포의 용해분획을 시료 희석 완충용액 [63 mM Tris (pH 6.8), 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 0.0013 % 브로모페놀블루, 5 % β-메르캅토에탄올 (mercaptoethanol)]에 희석한 후 8~12 % 겔을 사용하여 전극 완충용액 (1 L 용액 중 Tris 15 g, 글리세린 72 g, SDS 5 g 함유) 내에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔을 전이용 전기영동 장치를 이용하여 전이완충용액 (25 mM Tris, 192 mM 글리세린, 20 % v/v 메탄올 (pH 8.3)) 내에서 190 mAmps로 70 분 동안 나이트로셀룰로오즈 막에 단백질을 전이시켰다. 1차 항체로 상기 나이트로셀룰로오즈 막에 반응시킨 후 여기에 2차 항체로 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG (horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)와 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 (anti-mouse) IgG를 6 시간 동안 반응시키고 ECL 검출 시스템 (ECL chemiluminecence system, Amersham, Gaithesberg, MA)을 사용하여 발색하였다.

1-4. 실시간 세포증식 분석

세포증식을 측정하기 위하여, 세포를 96-well dish (5x10³ 세포/well)에 깔았다. 약물을 처치한 뒤, 4 시간 간격으로 살아있는 세포수를 IncuCyte ZOOM　 Live Cell Anaylsis System (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다.

1-5. 실시간 세포사멸 분석

세포사멸을 측정하기 위하여, 세포를 96-well dish (5x10³ 세포/well)에 깔았다. The IncuCyte ZOOMTM 96-well Caspase-3/7 apoptosis assay reagent (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)를 3 시간 전처리하고 약물을 처치한 뒤, 4 시간 간격으로 형광 발현 정도를 IncuCyte ZOOMTM Live Cell Anaylsis System (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)을 이용하여 측정하였다.

1-6. 세포주기 분석

세포주기 분포를 측정하기 위하여, 세포를 100 mm dish (5x10⁵ 세포/well)에 깔았다. 세포를 4 ℃ PBS로 고정하였고, 70 % EtOH에 4 ℃ 냉장하여 24 시간 배양하였다. 70% EtOH를 제거한 뒤, 1% bovine serum albumine/0.5% Triton X-100/0.2 mg/ml EDTA 으로 조성된 용해 솔루션(lysing solution)에 PHH3 항체를 최종농도 1:50으로 처리한 다음, 37 ℃에서 15 분간 염색하였다. 그 후, 상기 Lysing solution을 제거하고, PI (Propidium Iodide)/Triton X-100/DNAse-free RNAse A를 이용하여 37 ℃에서 15 분간 다시 염색하였다. 그 다음, FACS CaliburTM (BD Biosciences, CA, USA) 기계를 이용하여 실험군 당 20,000 개의 세포를 분석하였다.

실시예 2. 전립선암 세포에서의 Plk1 발현 양상 확인

2-1. 전립선암 세포에서 Plk1 및 안드로겐 수용체의 발현 변화 확인

상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 LnCaP, C4-2, PC3, 및 FLTR-LnCaP 세포를 6 well plate에 깔았다. 36 시간이 지난 후, 실시예 1-3의 면역화학적 분석 방법으로 Plk1(Polo-like kinase 1) 및 안드로겐 수용체(Androgen Receptor, AR)의 발현 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Plk1의 발현량은 거세저항성을 보이는 C4-2 세포와 PC3 세포(AR 음성세포)에서 높게 나타났으며, AR의 발현량은 C4-2 세포에서 가장 높은 것을 확인하였다. 한편, FLTR-LNCaP 세포의 경우, AR 길항제를 장기 처치하여 플루타마이드 저항성을 일으킨 세포이나, Plk1의 발현은 높게 나타나지 않았다. 상기로부터, Plk1은 거세 저항성 전립선암세포 (C4-2) 및 AR 음성 전립선암세포 (PC3)에서 선택적으로 과다 발현됨을 알 수 있다.

2-2. 전립선암 세포에서 Plk1 및 하위단백질의 발현 변화 확인

상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 전립선암 세포 중 3종인 LNCaP, PC3, 및 C4-2 세포를 6 well plate에 깐 다음, 12 시간 후, 실시예 1-3의 면역화학적 분석 방법으로 Plk1(Polo-like kinase 1) 및 Plk1 하위 인자인 cdc25c와 cyclin B1의 발현 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, PC3와 C4-2 세포에서 Plk1뿐만이 아니라 cdc25c (M-phase inducer phosphatase 3) 및 cyclin B1 (G2/mitotic-specific cyclin-B1) 의 발현량이 모두 증가하였으나, 반면 LNCaP 세포에서는 발현량의 변화가 없음을 확인하였다. 상기로부터, Plk1 발현이 높은 세포에서 Plk1 하위 신호의 활성화가 관찰됨을 알 수 있다.

실시예 3. THA 처리에 따른 전립선암 세포의 세포증식 억제 효과 확인

THA를 전립선암 세포에 처리한 후, 이에 따른 세포증식 억제 효과를 비교 관찰하기 위하여, THA (분자량: 168.15) 0.168 g을 1 ml DMSO에 희석하여 1M을 조제하였다. 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 전립선암 세포주 (LnCaP, PC3, C4-2)에 THA (3, 10, 30 μM), Plk1 억제제인 BI2536 (1, 5, 10, 50, 100 nM) 및 푸르푸로갈린(purpurogaline, PPG) (3, 10, 30, 100 μM) 처리한 다음, 실시예 1-4에 따른 실시간 세포증식 분석 방법으로 세포 증식 억제 효과를 68 시간 동안 비교 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 전립선암 세포에서 THA, BI2536, 및 푸르푸로갈린 사이의 세포증식 억제 효과를 비교한 결과, PC3 및 C4-2 세포에서 THA가 BI2536와 동일하게 세포증식 억제 효과를 보였다.

상기로부터, THA는 BI2536과 마찬가지로 Plk1의 발현이 높았던 호르몬 저항성 전립선암세포(C4-2 및 PC3)에서 선택적으로 세포증식을 억제함을 알 수 있으며, 호르몬 반응성인 LNCaP 세포에서는 5-0% 이상의 세포 증식 억제가 관찰되지 않음을 알 수 있다. Plk1 polo-box domain 억제제로 알려진 푸르푸로갈린은 LNCaP 세포 및 PC3에서 제한적인 세포증식 억제 활성을 보였으며, C4-2 세포에서는 100 uM 농도에서만 비선택적으로 보이는 세포증식 억제효과가 관찰되었다.

실시예 4. THA 처리에 따른 전립선암 세포의 세포자가사멸 증가 효과 확인

카스파제-3/7 (caspase-3/7)은 미토콘드리아 매개성 또는 세포사멸수용체 매개성 세포자가사멸(apoptosis) 유도 시 선택적으로 활성화되는 효소로, THA를 전립선암 세포에 처리한 후, 이에 따른 세포사멸 증가 효과를 비교 관찰하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 전립선암 세포주인 PC3 및 C4-2 세포에 30 μM THA 및 5 nM BI2536을 각 처리한 다음, IncuCyte ZOOM^TM Live Cell Anaylsis System (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)를 이용해 4시간 간격으로 카스파제-3/7 선택적 형광기질을 정량하여, 세포자가사멸 정도를 48시간 동안 관찰하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, THA는 세포자가사멸 지수를 유의적으로 증가시킴을 확인하였다.

또한, 세포자가사멸 시의 활성형 카스파제-3인 cleaved caspase-3(CC3)의 발현 변화를 확인하여 세포자가사멸 정도를 관찰하였는데, 먼저 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 C4-2 및 PC3 세포를 6 well plate에 깐 다음, 12 시간이 지난 후, 30 μM THA 및 5 nM BI2536을 48 시간동안 처리하였다. 그 후, 상기 실시예 1-3의 면역화학적 분석 방법으로 cleaved caspase-3(CC3)의 발현 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, cleaved caspase-3의 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었는바, THA는 세포자가사멸 지수를 유의적으로 증가시킴을 확인하였다. 상기로부터, 호르몬 저항성 전립선암세포인 PC3 및 C4-2세포에서 THA 및 BI2536 처리시 모두 세포자가사멸을 효과적으로 유도함을 알 수 있다.

실시예 5. THA 처리에 따른 전립선암 세포의 세포주기 차단 효과 확인

Plk1은 대표적인 G2/M 세포주기조절 인산화효소로, THA 처치에 따른 전립선암 세포의 세포주기 차단 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양한 PC3 세포를 6 well plate에 깐 다음, 12 시간이 지난 후, 30 μM THA와 5 nM BI2536을 24 시간 동안 처리하였다. 그 후, 상기 실시예 6의 방법으로 각 sub-G1, S, G2/M기의 세포분포도 및 PHH3 양성세포 (M phase 마커)의 비율을 변화 관찰하였다.

그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, THA는 G2/M 주기에 선택적으로 세포주기 진행을 차단한다는 것을 확인할 수 있었는데, BI2536이나 THA 처치 시 G2/M 주기에 30% 이상의 세포가 관찰되었으며, PHH3 양성세포 정량 시에도 대조군 대비 유의적인 증가가 관찰되었다. 따라서 상기로부터, 호르몬 저항성 전립선암세포인 PC3세포에서 THA 및 BI2536 처리 시 G2/M기 진행억제를 유도함을 알 수 있다.

상기로부터, Plk1 발현이 높은 전립선암세포에 THA가 선택적으로 작용함을 알 수 있는바, 따라서 향후 Plk1 양성 전립선암 치료에 있어서 THA를 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 THA (2,4,6-trihydroxyacetophenone) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 THA는 커큐마 코모사 (Curcuma comosa)로부터 추출한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 전립선암은 Plk1 (Polo-like kinase 1) 과발현 전립선암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 Plk1 (Polo-like kinase 1) 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 cdc25c의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 cyclin B1의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 카스파제-3/7 (caspase-3/7) 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 세포자가사멸 지수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.