KR20190080901A

KR20190080901A - 엑손 20 삽입 변이형 egfr 선택적 저해제

Info

Publication number: KR20190080901A
Application number: KR1020197015270A
Authority: KR
Inventors: 가즈타카 미야데라; 요시미 아오야기; 신이치 하사코
Original assignee: 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2019-07-08
Also published as: PH12019500957A1; EP3533449A4; JOP20190073A1; EP3533449A1; IL266239B1; DK3533449T3; AU2017350440B2; EP3533449B1; RU2019116780A3; TW201821079A; CA3041015A1; TWI774699B; PL3533449T3; US11857513B2; CN110191711A; US20190262345A1; BR112019008374A2; RU2019116780A; MX2019004969A; HUE063712T2

Abstract

명세서에 기재된 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 항종양제.

Description

엑손 20 삽입 변이형 EGFR 선택적 저해제

본 발명은 엑손 20 삽입 변이형 상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, 이하, 「EGFR」이라고도 칭한다)를 갖는 암에 대한 항종양제에 관한 것이다.

EGFR은 수용체 티로신 키나아제이며, 정상 조직에 있어서는 리간드인 상피 성장 인자(Epidermal Growth Factor, 이하 「EGF」라고도 칭한다)와 결합함으로써 생리 기능을 발휘하여, 상피 조직에 있어서 증식 및 아포토시스 저해에 기여하고 있다(비특허문헌 1). 또한, EGFR 유전자의 체세포 변이는 암의 원인 유전자로서 알려져 있으며, 예를 들어 EGFR의 엑손 19 영역의 746 내지 750번 아미노산이 결실된 것(이하, 「엑손 19 결실 변이」라고도 칭한다) 및 엑손 21 영역의 858번 아미노산이 류신으로부터 아르기닌으로 변이한 것(이하, 「L858R 변이」라고도 칭한다)은 EGF 비의존적인 키나아제 활성을 항상적으로 유도하여, 암세포의 증식 및 생존에 기여한다(비특허문헌 2). 이들 변이는, 동아시아에 있어서는, 예를 들어 비소세포 폐암의 30 내지 50%에서 확인되며, 또한 구미에 있어서도 비소세포 폐암의 약 10%에서 확인된다고 보고되어 있으며, 암의 원인인자 중 하나로서 생각되고 있다(비특허문헌 3).

그 때문에, EGFR 저해제의 항종양제로서의 연구 개발은 종래부터 활발하게 행해지고 있으며, EGFR 변이 양성 폐암의 치료에 도입되고 있다. 예를 들어 게피티닙, 에를로티닙 및 아파티닙은, 치료 용량에 있어서, 야생형 EGFR의 저해에 기인한다고 널리 생각되고 있는 피부의 이상 및 소화관 장애가 부작용으로서 발현하는 반면에, 엑손 19 결실 변이형 및 L858R 변이형 EGFR 양성 폐암에 대하여 높은 항종양 효과를 나타낸다. 이들 치료 효과는, EGFR 저해제가 야생형 EGFR에 비해 변이형 EGFR을 선택적으로 저해하는 것에 기인한다고 생각되고 있다(비특허문헌 4).

그러나 근년, 암 중에는 엑손 20 영역에 1개 이상의 아미노산이 삽입된 변이(이하, 「엑손 20 삽입 변이」라고도 칭한다)를 갖는 EGFR을 갖는 것이 존재하고, 이들 암은 종래의 EGFR 저해제에 저감수성인 것이 명확해져 왔다. 예를 들어 아파티닙의 EGFR 변이 양성 폐암에 대한 임상의 항종양 효과는, 엑손 19 결실 변이 및 L858R 변이에 비해 엑손 20 삽입 변이에서는 현저하게 낮은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5). 그 때문에 이들 환자에게는 화학 요법이 범용되고 있지만, 치료법의 선택지가 한정되는 점 및 충분한 치료 효과를 얻지 못하는 점에서, 더욱 치료 효과가 높은 항종양제가 필요해지고 있다.

특허문헌 1에는, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 특징지어진 질환의 치료에 사용할 수 있는 화합물이 기재되어 있다. 그러나 당해 문헌 1에 기재된 화합물은, 본 발명에 관한 화합물과 구조가 크게 다른 데다가, 야생형 EGFR과의 비교에 의한 선택성 및 생체내(in vivo) 모델에 있어서의 유효성은 개시되어 있지 않다.

또한, 특허문헌 2에는, 퀴놀린 치환 화합물이 기재되어 있지만, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 저해 활성은 기재되어 있지 않다.

WO2015/175632A1 WO2015/025936A1

Nat. Rev. Cancer, vol. 6, pp803-812(2006) Nature Medicine, vol. 19, pp1389-1400(2013) Nat. Rev. Cancer, vol. 7, pp169-181(2007) Lancet Oncol. vol. 13, e23-31(2012) Lancet Oncol. vol. 16, pp830-838(2015)

본 발명의 과제는, 종래의 EGFR 저해제로 치료 효과가 충분하지 않은, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택성이 높은 저해제이며, 또한 야생형 EGFR을 저해하는 것에 의한 부작용이 저감된 항종양제를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR이 암의 치료 표적으로서 타당한 것과 아울러, 종래 치료에 도입되고 있는 EGFR 저해제가, 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR간의 선택성이 부족한 것을 발견했다. 또한, 특정한 화합물이, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택성 및 종양 증식 억제 효과를 나타내고, 대표적인 EGFR 변이 양성암 치료약인 아파티닙보다 우수한 것인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은, 이하의 양태를 포함한다.

항 1. (S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드(이하, 「화합물 A」라고도 칭한다);

(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드(이하, 「화합물 B」라고도 칭한다);

(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드(이하, 「화합물 C」라고도 칭한다); 및

(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드(이하, 「화합물 D」라고도 칭한다)로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 항종양제.

항 2. 화합물이, (S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드인, 항 1에 기재된 항종양제.

항 3. 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자는, 폐암, 유방암, 두경부암, 뇌종양, 자궁암, 조혈기종양, 또는 피부암의 환자인, 항 1 또는 2에 기재된 항종양제.

항 4. 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자는, 폐암 환자인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 5. 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1개 이상의 아미노산이 삽입된 변이인, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 6. 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1 내지 7개의 아미노산이 삽입된 변이인, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 7. 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1 내지 4개의 아미노산이 삽입된 변이인, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 8. 엑손 20 삽입 변이가, A763_Y764insFQEA, V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insNPG, D770_N771insG, D770>GY, N771_P772insN, P772_R773insPR, H773_V774insNPH, H773_V774insPH, H773_V774insAH, H773_V774insH, V774_C774insHV, 또는 A761_E762insEAFQ인, 항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 9. 엑손 20 삽입 변이가, V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insG, H773_V774insNPH, H773_V774insPH인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 항종양제.

항 10. 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자에게 유효량의

(S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드;

(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드;

(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드; 및

(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드

로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 항종양제를 투여하는 공정을 포함하는, 악성 종양 환자의 치료 방법.

항 11. 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한,

로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염.

항 12. 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 항종양제를 제조하기 위한,

로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염의 용도.

본 발명에 관한 항종양제는, 야생형 EGFR을 저해하지 않고, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 높은 선택성을 나타낸다. 따라서, 야생형 EGFR을 저해하는 것에 의한 부작용을 저감하면서, 종래의 EGFR 저해제로 치료 효과가 충분하지 않은, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자에 대한 우수한 치료 효과를 발휘하는 항종양제를 제공하는 것으로서 유용하다.

종래의 EGFR 저해제는, 야생형 EGFR에 비하여 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택성이 낮기 때문에, 항종양 효과를 발휘하는 투여량과 야생형 EGFR 저해에 기인하는 부작용(피부의 이상, 소화관 장애 등)이 발생하는 투여량과의 괴리가 작아, 충분한 치료 효과를 발휘하는 것이 곤란했다. 한편, 본 발명에 관한 항종양제는, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택성이 높기 때문에, 야생형 EGFR에 기인하는 부작용을 발생시키지 않고 투여량을 증가시키는 것이 가능하여, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자에 대하여 우수한 치료 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 야생형 및 변이형 EGFR 발현 세포주에 대한 화합물 A, B, C, D, 그리고 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙 및 아파티닙의 세포 증식 억제에 관한 시험 결과로부터 산출한, 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR과의 IC50비를 나타낸다.
도 2는 야생형 및 변이형 EGFR 발현 인간 세포주에 대한 화합물 A, 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙 및 아파티닙의 세포 증식 억제에 관한 시험 결과로부터 산출한, 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR과의 GI50비를 나타낸다.
도 3은 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsASV 세포) 피하 이식 모델 마우스에 있어서의 상대적 종양 체적(이하, 「RTV」라고도 한다.)을 나타낸다.
도 4는 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsASV 세포) 피하 이식 모델 마우스의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 5는 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 마우스에 있어서의 상대적 종양 체적을 나타낸다.
도 6은 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 마우스의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 7은 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(H1975-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 마우스에 있어서의 상대적 종양 체적을 나타낸다.
도 8은 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(H1975-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 마우스의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 9는 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsNPH) 피하 이식 모델 마우스에 있어서의 종양 체적을 나타낸다.
도 10은 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(NIH3T3-EGFRinsNPH) 피하 이식 모델 마우스의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 11은 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(H1975-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 래트 있어서의 종양 체적을 나타낸다.
도 12는 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 변이형 EGFR 발현 세포주(H1975-EGFRinsSVD 세포) 피하 이식 모델 래트의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 13은 화합물 A의 항종양 효과를 측정하기 위한 V769_D770insASV 변이형 EGFR 양성 폐암 환자 유래 종양 피하 이식 모델 마우스에 있어서의 종양 체적을 나타낸다.
도 14는 본 발명 화합물 A의 독성을 측정하기 위한 V769_D770insASV 변이형 EGFR 양성 폐암 환자 유래 종양 피하 이식 모델 마우스의 종양의 군분류 후에 있어서의 체중 변화율을 나타낸다.
도 15는 야생형 EGFR(Wild-type EGFR)의 아미노산 서열을 나타낸다(서열번호 1).

명세서의 상기 또는 하기 기재에 있어서, 본 발명 범위에 포함되는 여러가지 정의의 적합예를, 하기에서 상세히 설명한다.

본 명세서에 있어서 「EGFR」이란, 인간 상피 성장 인자 수용체 단백질을 나타내고, ErbB-1 또는 HER1이라고도 부르고 있다.

본 명세서에 있어서 「야생형 EGFR」이란, 체세포 변이를 갖고 있지 않은 EGFR을 나타내고, 구체적으로는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다(GenBank 액세션 번호: NP_005219.2).

본 명세서에 있어서 「엑손 20 삽입 변이」란, EGFR의 엑손 20 영역(서열번호 1에 있어서의 761 내지 823번의 아미노산 서열)에 1개 이상(바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개)의 아미노산이 삽입된 변이를 나타내고, 바람직하게는, 엑손 20 영역의 763번 알라닌으로부터 764번 티로신 사이에 아미노산 서열 FQEA(N 말단측에서부터 차례로 페닐알라닌, 글루타민, 글루탐산, 알라닌)가 삽입된 변이(A763_Y764insFQEA), 엑손 20 영역의 769번 발린으로부터 770번 아스파르트산 사이에 아미노산 서열 ASV(N 말단측에서부터 차례로 알라닌, 세린, 발린)가 삽입된 변이(V769_D770insASV), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 서열 SVD(N 말단측에서부터 차례로 세린, 발린, 아스파르트산)가 삽입된 변이(D770_N771insSVD), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 서열 NPG(N 말단측에서부터 차례로 아스파라긴, 프롤린, 글리신)가 삽입된 변이(D770_N771insNPG), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 G(글리신)가 삽입된 변이(D770_N771insG), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산이 결실하고 대신에 아미노산 서열 GY(N 말단측에서부터 순서대로 글리신, 티로신)가 삽입된 변이(D770>GY), 엑손 20 영역의 771번 아스파라긴으로부터 772번 프롤린 사이에 아미노산 N(아스파라긴)이 삽입된 변이(N771_P772insN), 엑손 20 영역의 772번 프롤린으로부터 773번 히스티딘 사이에 아미노산 서열 PR(N 말단측에서부터 순서대로 프롤린, 아르기닌)이 삽입된 변이(P772_R773insPR), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 서열 NPH(N 말단측에서부터 차례로 아스파라긴, 프롤린, 히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insNPH), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 서열 PH(N 말단측에서부터 차례로 프롤린, 히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insPH), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 서열 AH(N 말단측에서부터 차례로 알라닌, 히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insAH), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 H(히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insH), 엑손 20 영역의 774번 발린으로부터 775번 시스테인 사이에 아미노산 서열 HV(N 말단측에서부터 차례로 히스티딘, 발린)가 삽입된 변이(V774_C775insHV), 엑손 20 영역의 761번 알라닌으로부터 762번 글루탐산 사이에 아미노산 서열 EAFQ(N 말단측에서부터 차례로 글루탐산, 알라닌, 페닐알라닌, 글루타민)가 삽입된 변이(A761_E762insEAFQ) 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 엑손 20 영역의 769번 발린으로부터 770번 아스파르트산 사이에 아미노산 서열 ASV(N 말단측에서부터 차례로 알라닌, 세린, 발린)가 삽입된 변이(V769_D770insASV), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 서열 SVD(N 말단측에서부터 차례로 세린, 발린, 아스파르트산)가 삽입된 변이(D770_N771insSVD), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 G(글리신)가 삽입된 변이(D770_N771insG), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 서열 NPH(N 말단측에서부터 차례로 아스파라긴, 프롤린, 히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insNPH), 엑손 20 영역의 773번 히스티딘으로부터 774번 발린 사이에 아미노산 서열 PH(N 말단측에서부터 차례로 프롤린, 히스티딘)가 삽입된 변이(H773_V774insPH)를 들 수 있다. 특히 바람직하게는 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 서열 SVD(N 말단측에서부터 차례로 세린, 발린, 아스파르트산)가 삽입된 변이(D770_N771insSVD), 엑손 20 영역의 770번 아스파르트산으로부터 771번 아스파라긴 사이에 아미노산 G(글리신)가 삽입된 변이(D770_N771insG)를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 「엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자」란, EGFR의 엑손 20 영역의 적어도 1군데에 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 나타내고, 당해 EGFR은 상이한 2군데 이상에 엑손 20 삽입 변이를 가져도 되지만, 바람직하게는 1군데에 엑손 20 삽입 변이를 갖는 것이다. 또한, 당해 EGFR은 엑손 20 삽입 변이 이외의 변이(예를 들어, 엑손 19 결실 변이, L858R 변이, L790M 변이 등)를 가질 수도 있다.

본 발명에 있어서, 악성 종양 환자가 발현하고 있는 EGFR이 엑손 20 삽입 변이를 갖는 것의 검출 방법은, 당해 변이를 검출할 수 있으면 특별히 제한되지 않고, 공지된 검출 방법을 사용할 수 있다. 엑손 20 삽입 변이의 검출에 있어서는, EGFR 유전자의 게놈 서열, EGFR 유전자의 전사 산물, 또는 EGFR 단백질의 어느 것이든 검출 대상으로 할 수 있다.

엑손 20 삽입 변이의 검출에 제공하는 시료로서는, 악성 종양 환자 유래의 생체 시료, 특히 악성 종양 환자에게서 채취한 것으로 악성 종양 세포를 포함하는 시료이면 특별히 한정되지 않는다. 생체 시료로서는, 예를 들어 체액(혈액, 오줌 등), 조직, 그의 추출물 및 채취한 조직의 배양물 등을 예시할 수 있다. 또한, 생체 시료의 채취 방법은, 생체 시료의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다.

생체 시료는, 검출 방법에 따라, 적절한 처리를 함으로써 제조된다. 또한, 검출에 사용되는 시약(예를 들어, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 시약)은, 검출 방법에 따라, 관용되는 방법에 의해 조정할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 항종양제를 악성 종양 환자에게 투여하기 전에, 악성 종양 환자가 발현하고 있는 EGFR이 엑손 20 삽입 변이를 갖는 것을 검출하는 공정을 행할 수 있다.

이어서, 화합물 A 내지 D(화합물 A, B, C 및 D)(본 명세서에 있어서, 「본 발명 화합물」, 「본 발명에 관한 화합물」이라고 총칭하는 경우가 있다) 및 그의 제조법에 대해서 설명한다.

화합물 A((S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드)는, 하기 화학식으로 표시된다.

화합물 B((S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드)는, 하기 화학식으로 표시된다.

화합물 C((S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드)는, 하기 화학식으로 표시된다.

화합물 D((R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드)는, 하기 화학식으로 표시된다.

상기 화합물 A 내지 D는, 예를 들어 WO2015/025936A1에 기재된 제조법 또는 실시예에 나타내는 방법 등에 의해 제조할 수 있다. 단, 화합물 A 내지 D의 제조법은 이들 반응예에 한정되는 것은 아니다.

상기 화합물 A 내지 D가, 광학 이성체, 입체 이성체, 회전 이성체, 호변 이성체 등의 이성체를 갖는 경우에는, 특별히 명기하지 않는 한, 어느 것의 이성체도 혼합물도 본 발명 화합물에 포함된다. 예를 들어, 화합물 A 내지 D에 광학 이성체가 존재하는 경우에는, 특별히 명기하지 않는 한, 라세미체 및 라세미체로부터 분할된 광학 이성체도 본 발명 화합물에 포함된다.

상기 화합물 A 내지 D의 염이란, 약학적으로 허용되는 염을 의미하고, 염기 부가염 또는 산 부가염을 들 수 있다.

해당 염기 부가염으로서는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 예를 들어 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염; 예를 들어 암모늄염; 예를 들어 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, 에탄올아민염, 디에탄올아민염, 트리에탄올아민염, 프로카인염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.

해당 산 부가염으로서는, 예를 들어 염산염, 황산염, 질산염, 인산염, 과염소산염 등의 무기산염; 예를 들어 아세트산염, 포름산염, 말레산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 시트르산염, 아스코르브산염, 트리플루오로아세트산염 등의 유기산염; 예를 들어 메탄술폰산염, 이세티온산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 술폰산염 등을 들 수 있다.

상기 화합물 A 내지 D 또는 그의 염에는, 그의 프로드러그도 포함된다. 프로드러그는, 생체 내에 있어서의 생리 조건 하에서 효소, 위산 등에 의한 반응에 의해 화합물 A 내지 D 또는 그의 염으로 변환하는 화합물, 즉 효소적으로 산화, 환원, 가수분해 등을 일으켜서 본 발명 화합물 또는 그의 염으로 변화하는 화합물, 위산 등에 의해 가수분해 등을 일으켜서 화합물 A 내지 D 또는 그의 염으로 변화하는 화합물을 말한다. 또한, 히로카와 쇼텐 1990년간 「의약품의 개발」 제7권 분자 설계 163페이지 내지 198페이지에 기재되어 있는 생리적 조건으로 화합물 A 내지 D 또는 그의 염으로 변화하는 것으로 할 수도 있다.

[질환의 기재]

본 발명의 대상이 되는 종양은 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들어 두경부암, 소화기암(식도암, 위암, 십이지장암, 간암, 담도암(담낭·담관암 등), 췌장암, 결장직장암(결장암, 직장암 등) 등), 폐암(비소세포폐암, 소세포폐암, 중피종 등), 유방암, 생식기암(난소암, 자궁암(자궁경부암, 자궁체암 등) 등), 비뇨기암(신장암, 방광암, 전립선암, 정소종양 등), 조혈기종양(백혈병, 악성 림프종, 다발성 골수종 등), 골·연부종양, 피부암, 뇌종양 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 폐암, 유방암, 두경부암, 뇌종양, 자궁암, 조혈기종양, 또는 피부암이다.

상기 화합물 A 내지 D 또는 그의 염을 의약으로서 사용하는 것에 있어서는, 필요에 따라 약학적 담체를 배합하고, 예방 또는 치료 목적에 따라 각종 투여 형태를 채용 가능하다. 해당 형태로서는, 예를 들어, 경구제, 주사제, 좌제, 연고제, 첩부제 등의 어느 것이든 무방하며, 바람직하게는 경구제가 채용된다. 이들 투여 형태는, 각각 당업자가 공지 관용의 제제 방법에 의해 제조할 수 있다.

약학적 담체로서는, 제제 소재로서 관용의 각종 유기 혹은 무기 담체 물질이 사용되고, 고형 제제에 있어서의 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 액상제재에 있어서의 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제 등으로서 배합된다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제, 안정화제 등의 제제 첨가물을 사용할 수도 있다.

경구용 고형 제제를 제조하는 경우에는, 화합물 A 내지 D에 부형제, 필요에 따라서 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미·교취제 등을 더 첨가한 후, 통상의 방법에 의해 정제, 피복 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등을 제조할 수 있다.

부형제로서는, 유당, 백당, D-만니톨, 포도당, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 미결정 셀룰로오스, 무수 규산 등을 들 수 있다. 결합제로서는, 물, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 단시럽, 포도당액, α-전분액, 젤라틴액, D-만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀락, 인산칼슘, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다. 붕괴제로서는, 건조 전분, 알긴산나트륨, 한천 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 라우릴 황산나트륨, 스테아르산모노글리세리드, 유당 등을 들 수 있다. 활택제로서는, 정제 탈크, 스테아르산염나트륨, 스테아르산마그네슘, 붕사, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 착색제로서는, 산화티타늄, 산화철 등을 들 수 있다. 교미·교취제로서는 백당, 등피, 시트르산, 타르타르산 등을 들 수 있다.

경구용 액체 제제를 제조하는 경우에는, 화합물 A 내지 D에 교미제, 완충제, 안정화제, 교취제 등을 가해서 통상의 방법에 의해 내복 액제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 제조할 수 있다.

교미·교취제로서는, 상기에 예로 든 것을 사용할 수 있다. 완충제로서는, 시트르산나트륨 등을 들 수 있다. 안정제로서는, 트라가칸트, 아라비아 고무, 젤라틴 등을 들 수 있다. 필요에 따라, 장용성 코팅 또는 효과의 지속을 목적으로 하여, 경구 제제에 공지된 방법에 의해, 코팅을 실시할 수도 있다. 이러한 코팅제에는 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌글리콜, Tween80(상표) 등을 들 수 있다.

주사제를 제조하는 경우에는, 화합물 A 내지 D에 pH 조절제, 완충제, 안정화제, 등장화제, 국소 마취제 등을 첨가하여, 통상의 방법에 의해 피하, 근육내 및 정맥내용 주사제를 제조할 수 있다.

pH 조절제 및 완충제로서는, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다. 안정화제로서는, 피로아황산나트륨, EDTA, 티오글리콜산, 티오 락트산 등을 들 수 있다. 국소 마취제로서는, 염산프로카인, 염산리도카인 등을 들 수 있다. 등장화제로서는, 염화나트륨, 포도당, D-만니톨, 글리세린 등을 들 수 있다.

좌제를 제조하는 경우에는, 화합물 A 내지 D에 당업자에게 있어서 공지된 제제용 담체, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 라놀린, 카카오 버터, 지방산 트리글리세리드 등을, 필요에 따라 Tween80(상표)과 같은 계면 활성제 등을 더 첨가한 후, 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.

연고제를 제조하는 경우에는, 화합물 A 내지 D에 통상 사용되는 기제, 안정제, 습윤제, 보존제 등이 필요에 따라서 배합되어, 통상의 방법에 의해 혼합, 제제화할 수 있다.

기제로서는, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 표백 밀랍, 옥틸도데실알코올, 파라핀 등을 들 수 있다.

보존제로서는, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 파라옥시벤조산프로필 등을 들 수 있다.

첩부제를 제조하는 경우에는, 통상의 지지체에 상기 연고, 크림, 겔, 페이스트 등을 통상의 방법에 의해 도포함으로써 제조할 수 있다.

지지체로서는, 면, 스테이플 파이버, 화학 섬유를 포함하는 직포 혹은 부직포, 연질 염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리우레탄 등의 필름 혹은 발포체 시트를 들 수 있다.

상기의 각 투여 단위 형태 중에 배합되어야 할 상기 화합물 A 내지 D의 양은, 이것을 적용할 환자의 증상에 따라, 혹은 그의 제형 등에 따라 일정하지 않지만, 일반적으로 투여 단위 형태당, 경구제로는 0.05 내지 1000㎎, 주사제로는 0.01 내지 500㎎, 좌제로는 1 내지 1000㎎으로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 투여 형태를 갖는 약제의 1일당 투여량은, 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라 다르며 일률적으로 결정할 수는 없지만, 유효 성분의 화합물 A 내지 D로서 통상 성인(체중 50㎏) 1일당 0.05 내지 5000㎎, 바람직하게는 0.1 내지 1000㎎으로 할 수 있고, 이것을 1일 1회 또는 2 내지 3회 정도로 나누어서 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자에게 유효량의 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 항종양제를 투여하는 공정을 포함하는, 악성 종양 환자의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한, 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 제공한다.

본 발명은 또한, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한, 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 항종양제를 제조하기 위한, 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 하기 공정 (1) 내지 (2)를 포함하는, 악성 종양 환자에 있어서의 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 유효 성분으로 하는 항종양제를 사용한 화학 요법의 치료 효과를 예측하는 방법:

(1) 당해 환자에게서 채취한 생체 시료에 포함되는 EGFR 유전자의 변이 유무를 검출하는 공정 및

(2) 상기 공정 (1)에 있어서의 검출의 결과, EGFR 유전자가 엑손 20 삽입 변이를 갖고 있는 경우, 당해 환자에 대한 당해 화학 요법이 충분한 치료 효과를 나타낼 가능성이 높다고 예측하는 공정.

본 발명은 또한, 하기 공정 (1) 내지 (3)을 포함하는, 악성 종양 환자의 치료 방법:

(2) 상기 공정 (1)에 있어서의 검출의 결과, EGFR 유전자가 엑손 20 삽입 변이를 갖고 있는 경우, 당해 환자에 대한 화합물 A 내지 D로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 항종양제를 사용한 화학 요법이 충분한 치료 효과를 나타낼 가능성이 높다고 예측하는 공정 및

(3) 상기 공정 (2)에서 당해 화학 요법이 충분한 치료 효과를 나타낼 가능성이 높다고 예측된 환자에게, 당해 항종양제를 투여하는 공정.

EGFR 유전자의 염기 서열은 공지이다. cDNA의 염기 서열의 GenBank 액세션 번호는, NM_005228.4이다.

또한, 「치료 효과」는, 종양 축소 효과, 재발 억제 효과, 연명 효과 등에 의해 평가할 수 있고, 재발 억제 효과는 무재발 생존 기간 연장 및/또는 재발률의 개선의 정도, 연명 효과는 전체 생존 기간 및/또는 무증악 생존 기간의 중앙값의 연장의 정도 등에 따라 나타낼 수 있다. 화합물 A 또는 그의 염을 유효 성분으로서 함유하는 항종양제를 사용한 화학 요법이 「충분한 치료 효과를 나타낸다」란, 화합물 A 또는 그의 염을 유효 성분으로서 함유하는 항종양제를 투여하는 것에 의해, 비투여의 경우와 비교하여, 생존 기간을 현저하게 연장시키거나, 재발을 현저하게 억제시키거나 하는 정도의 우수한 치료 효과를 말한다.

실시예

이하에 시험예를 나타내고, 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예(시험예)에 제한되는 것은 아니다.

시험예 1

시험관내(In vitro) 약효 시험

야생형 및 변이형 EGFR 발현 세포주에 대한 세포 증식 억제 효과의 평가 (1)

화합물의 야생형 EGFR 및 변이형 EGFR에 대한 저해 활성은, 인간 EGFR 유전자를 도입한 마우스 B임파구 전구 세포주인 Ba/F3 세포를 사용하여 행하였다. Ba/F3 세포는 10% 소태아혈청(FBS), 100U/mL 페니실린/100㎍/mL 스트렙토마이신(서모 피셔 사이언티픽) 및 1ng/mL 마우스 인터류킨-3(mIL-3)(CST)을 포함하는 RPMI-1640배지(서모 피셔 사이언티픽)에서 유지하고, 인간 EGFR 유전자(야생형(WT), V769_D770insASV(insASV), D770_N771insSVD(insSVD), D770_N771insG(insG), H773_V774insNPH(insNPH), H773_V774insPH(insPH))를 코딩한 PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro 벡터 혹은 PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro 벡터를 슈퍼 피기백 트랜스포사제(Super PiggyBac Transposase) 발현 벡터와 함께 Amaxa(상표) 세포주 뉴클레오펙터(Cell Line Nucleofector)(상표) 키트(Kit) V에 의한 전기 천공법에 의해 도입한 후 퓨로마이신(SIGMA)으로 선택했다. 야생형 EGFR을 발현한 Ba/F3 세포(이하, 「Ba/F3-EGFR_WT」라고도 칭한다)는 50ng/mL EGF(R&D 시스템즈) 존재 하에서 mIL-3 비의존적인 증식을 나타내고, 또한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 Ba/F3 세포(이하, 「Ba/F3-EGFRinsASV」, 「Ba/F3-EGFRinsSVD」, 「Ba/F3-EGFRinsG」, 「Ba/F3-EGFRinsNPH」, 「Ba/F3-EGFRinsPH」라고도 칭한다)은 EGF 비존재 하에서 mIL-3 비의존적인 증식을 나타냈다.

세포 증식 억제 효과의 평가 시에 있어서, Ba/F3-EGFR_WT 세포를 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 50ng/mL EGF를 포함하는 RPMI-1640배지에서 현탁하고, 세포 현탁액을 96웰 평저 마이크로플레이트의 각 웰에 1웰당 세포수가 30,000개가 되도록 파종했다. 한편, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 Ba/F3 세포는 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 현탁하고, 세포 현탁액을 96웰 평저 마이크로플레이트의 각 웰에 1웰당 세포수가 15,000개가 되도록 파종했다. 다음에 특허문헌 2에 기재된 제조 방법에 따라서 얻어진 (S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드(화합물 A), (S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드(화합물 B), (S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드(화합물 C), (R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드(화합물 D) 및 WO2013/125709A1에 기재된 제조 방법에 따라서 얻어진 (S)-N-(4-아미노-5-(퀴놀린-3-일)-6,7,8,9-테트라히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드(WO2013/125709A1의 실시예 1의 화합물)(이하, 「비교 화합물」이라고도 칭한다)를 DMSO에 용해하고, DMSO 혹은 각 세포의 현탁에 사용한 배지를 사용해서 희석하고, 이것을 세포의 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하여, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 3일 배양했다. 배양 후의 세포수의 계측은 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(상표) 발광 셀 생존율 검정(Luminescent Cell Viability Assay)(프로메가)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 프로토콜에 기초하여 행하였다. 이하의 식으로부터 증식율을 산출하고, 50% 저해하는 피검 화합물의 농도(IC₅₀(μM))를 구하였다.

증식율(%)=T/C×100

T: 피검 화합물을 첨가한 웰의 발광 강도

C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 웰의 발광 강도.

또한, 이하의 식으로부터 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR의 IC₅₀의 비를 산출했다. 결과를 도 1에 도시한다.

IC₅₀비=IC₅₀(WT)/IC₅₀(ex20ins)

IC₅₀(WT): 야생형 EGFR에 대한 IC₅₀

IC₅₀(ex20ins): 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 IC₅₀.

도 1에서 명백해진 바와 같이, 화합물 A 내지 D는 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 세포주에 대하여 세포 증식 억제 효과를 나타내고, 변이 선택성은 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙 및 아파티닙에 비해서 높았다.

시험예 2

야생형 및 변이형 EGFR 발현 인간 세포주에 대한 세포 증식 억제 효과 (2)

화합물의 야생형 EGFR 및 변이형 EGFR에 대한 저해 활성을 평가하기 위해서, 유전자 개변에 의해 D770_N771insSVD 변이형 EGFR을 발현시킨 인간 폐선암 세포주인 NCI-H1975 세포(이하, 「H1975-EGFRinsSVD」라고도 칭한다), 야생형 EGFR을 발현하고 있는 인간류 상피암 세포주인 A431 세포를 사용했다. H1975-EGFRinsSVD 세포는, NCI-H1975 세포에 D770_N771insSVD(insSVD)을 코딩한 PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro 벡터를 슈퍼 피기백 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 Amaxa(상표) 세포주 뉴클레오펙터(상표) 키트 R에 의한 전기 천공법에 의해 도입한 후 퓨로마이신(SIGMA)에서 선택한 후, XTN(상표) TALENs 부위-특이적 뉴클레아제(Site-Specific Nucleases)(Transposagen)를 Amaxa(상표) 세포주 뉴클레오펙터(상표) 키트 R에 의한 전기 천공법에 의해 도입하고, 내재성 EGFR(T790M/L858R)이 녹아웃된 세포를 시퀀싱에 의해 선택했다.

세포 증식 억제 효과의 평가 시에 있어서, 각각의 세포를 ATCC에 의해 권장되어 있는 배지 중에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 96웰 평저 플레이트의 각 웰에 1웰당 세포수가 3,000개가 되도록 파종하고, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 1일 배양했다. 화합물 A, 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙 및 아파티닙을 DMSO에 용해하고, DMSO를 사용해서 피검 화합물을 최종 농도의 200배의 농도가 되도록 희석했다. 피검 화합물의 DMSO 용액을 각 세포의 현탁에 사용한 배지로 희석하고, 이것을 세포의 배양 플레이트의 각 웰에 DMSO의 최종 농도가 0.5%가 되도록 첨가하고, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 3일 배양했다. 배양 개시 시(day0) 및 배양 후(day3)의 세포수의 계측은 셀타이터-글로(상표) 발광 셀 생존율 검정(프로메가)을 사용하여, 제조사에서 권장하는 프로토콜에 기초하여 행하였다. 이하의 식으로부터 증식율을 산출하여, 50% 저해하는 피검 화합물의 농도(GI₅₀(μM))를 구하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

1) Tday3≥Cday0인 경우

증식율(%)=(Tday3-Cday0)/(Cday3-Cday0)×100

T: 피검 화합물을 첨가한 웰의 발광 강도

C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 웰의 발광 강도

day0: 피검 화합물을 첨가한 날

day3: 평가일.

2) Tday3<Cday0인 경우

증식율(%)=(Tday3-Cday0)/(Cday0)×100

T: 피검 화합물을 첨가한 웰의 발광 강도

C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 웰의 발광 강도

day0: 피검 화합물을 첨가한 날

day3: 평가일.

또한, 이하의 식으로부터 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR의 GI₅₀값의 비를 산출했다. 결과를 도 2에 도시한다.

GI₅₀비=GI₅₀(A431)/GI₅₀(H1975 EGFRinsSVD)

GI₅₀(A431): 야생형 EGFR에 대한 GI₅₀

GI₅₀(H1975 EGFRinsSVD): 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 GI₅₀.

표 1 및 도 2로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 세포주에 대하여 세포 증식 억제 효과를 나타내고, 변이 선택성은 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 오시머티닙에 비해서 높았다.

시험예 3

야생형 및 변이형 EGFR 발현 세포주에 대한 인산화 EGFR 저해 활성의 평가 (1)

야생형 EGFR을 과잉 발현하고 있는 인간류 상피암 세포주인 A431 세포, 유전자 개변에 의해 D770_N771insSVD 변이형 EGFR을 발현하고 있는 인간 폐선암 세포주인 H1975-EGFRinsSVD 세포를 각각 배지 중에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 각각 60㎜ 디쉬에 파종하고, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 1일 배양했다. 화합물 A를 DMSO에 용해하고, DMSO를 사용해서 피검 화합물을 최종 농도의 1000배의 농도가 되도록 희석했다. 피검 화합물의 DMSO 용액을 각 세포의 현탁에 사용한 배지에서 희석하고, 이것을 세포의 배양 디쉬에 DMSO의 최종 농도가 0.1%가 되도록 첨가하고, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 6시간 배양했다. 배양 후, 세포를 회수하고, 펠릿의 상태에서 사용 시까지 -80℃에서 보관했다. 펠릿에 프로테아제 인히비터 칵테일(서모 피셔 사이언티픽)을 첨가한 RIPA 버퍼(서모 피셔 사이언티픽)를 첨가하여 세포 내의 단백질을 추출 후, BCA 단백질 검정 키트(서모 피셔 사이언티픽)를 사용해서 단백질 농도를 측정하고, 각 샘플을 인산화 EGFR 발현 측정에 적합한 단백질 농도로 각각 조정했다. 인산화 EGFR 발현 측정은 Simple Western(상표) 분석 시스템(프로테인심플)을 사용하여, 제조사 권장의 프로토콜에 기초하여 행하였다. 1차 항체는 포스포(Phospho)-EGF 수용체(Receptor)(Tyr1068) #3777(CST)을 50분의 1로 희석하여, 측정에 사용했다.

세포마다 단백질 농도(x축)와 인산화 EGFR 발현량(y축)의 검량선을 작성하고, 그 검량선을 기초로 각 샘플의 인산화 EGFR 발현량을 단백질 농도로 환산했다. 이하의 식으로부터 인산화 EGFR 비율을 산출하고, 인산화 EGFR을 50% 저해할 수 있는 피검 화합물의 농도(IC₅₀(μM))를 구하였다.

인산화 EGFR 비율(%)=T/C×100

T: 피검 화합물을 첨가한 샘플의 단백질 농도 상당량

C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 샘플의 단백질 농도 상당량.

또한, 이하의 식으로부터 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR과의 선택성을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

IC₅₀비=IC₅₀(A431)/IC₅₀(H1975 EGFRinsSVD)

IC₅₀(A431): 야생형 EGFR에 대한 IC₅₀

IC₅₀(H1975 EGFRinsSVD): 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 IC₅₀.

표 2로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는, 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택적 저해 활성을 나타냈다.

시험예 4

야생형 및 변이형 EGFR 발현 세포주에 대한 인산화 EGFR 저해 활성의 평가 (2)

화합물의 야생형 EGFR 및 변이형 EGFR의 자기 인산화 저해 활성은, 인간 EGFR 유전자를 도입한 마우스 섬유아세포주인 NIH-3T3 세포를 사용하여 행하였다. NIH-3T3 세포는 10% 소신생아 혈청(NBCS), 1,500㎎/L 탄산수소나트륨, 100U/mL 페니실린/100㎍/mL 스트렙토마이신(서모 피셔 사이언티픽)을 포함하는 D-MEM(고 글루코오스) 배지(와코 준야쿠)에서 유지하고, 인간 EGFR 유전자(WT, insASV, insSVD, insG, insNPH, insPH)를 코딩한 PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro 벡터를 슈퍼 피기백 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 Amaxa(상표) 세포주 뉴클레오펙터(상표) 키트 R에 의한 전기 천공법에 의해 도입한 후 퓨로마이신(SIGMA)으로 선택했다. 야생형 EGFR을 발현한 NIH-3T3 세포(이하, 「NIH3T3-EGFR_WT」라고도 칭한다)는 1% NBCS 조건 하 또한 50ng/mL EGF(R&D 시스템즈) 존재 하에서 증식을 나타내고, 또한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 NIH-3T3 세포(이하, 「NIH3T3-EGFRinsASV」, 「NIH3T3-EGFRinsSVD」, 「NIH3T3-EGFRinsG」, 「NIH3T3-EGFRinsNPH」, 「NIH3T3-EGFRinsPH」라고도 칭한다)는 1% NBCS 조건 하 또한 EGF 비존재 하에서 증식을 나타냈다.

EGFR 자기 인산화 저해 활성 평가 시에 있어서, 인간 EGFR을 도입한 NIH3T3 세포를 각각 배지 중에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 각각 60㎜ 디쉬 또는 6웰 평저 플레이트에 파종하고, 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 1일 배양했다. 화합물 A를 DMSO에 용해하고, DMSO를 사용해서 피검 화합물을 최종 농도의 400배의 농도가 되도록 희석했다. 피검 화합물의 DMSO 용액을 각 세포의 현탁에 사용한 배지에서 희석하고, 이것을 세포의 배양 디쉬에 DMSO의 최종 농도가 0.25%가 되도록 첨가했다. 또한 NIH3T3-EGFR_WT 세포의 배양 디쉬에는 EGF를 최종 농도 50ng/mL가 되도록 첨가했다. 모든 배양 디쉬를 5% 탄산 가스 함유의 배양기 중 37℃에서 6시간 배양했다. 배양 후, 세포를 회수하고, 펠릿의 상태에서 사용 시까지 -80℃에서 보관했다. 펠릿에 프로테아제 인히비터 칵테일(서모 피셔 사이언티픽)을 첨가한 RIPA 버퍼(서모 피셔 사이언티픽)를 첨가하여 세포 내의 단백질을 추출 후, BCA 단백질 검정 키트(서모 피셔 사이언티픽)를 사용해서 단백질 농도를 측정하고, 각 샘플을 인산화 EGFR 발현 측정에 적합한 단백질 농도로 각각 조정했다. 인산화 EGFR 발현 측정은 Simple Western(상표) 분석 시스템(프로테인심플)을 사용하여, 제조사 권장의 프로토콜에 기초하여 행하였다. 1차 항체는 포스포-EGF 수용체(Tyr1068) #3777(CST)을 50분의 1로 희석하고, 측정에 사용했다.

세포마다 단백질 농도(x축) 및 인산화 EGFR 발현량(y축)의 검량선을 작성하고, 그 검량선을 기초로 각 샘플의 인산화 EGFR 발현량을 단백질 농도로 환산했다. 이하의 식으로부터 인산화 EGFR 저해율을 산출하고, 인산화 EGFR을 50% 저해할 수 있는 피검 화합물의 농도(IC₅₀(μM))를 구하였다.

인산화 EGFR 저해율(%)=T/C×100

T: 피검 화합물을 첨가한 샘플의 단백질 농도 상당량

또한, 이하의 식으로부터 야생형 EGFR과 엑손 20 삽입 변이형 EGFR과의 선택성을 산출했다. 결과를 표 3에 나타낸다.

IC₅₀비=IC₅₀(WT)/IC₅₀(엑손 20 삽입 변이형 EGFR)

표 3으로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는, 다양한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR에 대한 선택적 저해 활성을 나타냈다.

상기 시험예 1 내지 4의 결과로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A 내지 D는 엑손 20 삽입 변이형 EGFR을 발현한 세포주에 대하여 EGFR 저해 효과를 수반한 세포 증식 억제 효과를 나타내고, 그 효과 및 변이 선택성은 비교 화합물, 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 오시머티닙에 비해서 높았다.

시험예 5

생체내 약효 시험

변이형 EGFR 발현 세포주 피하 이식 모델을 사용한 항종양 효과의 평가

인간 변이형 EGFR을 도입한 NIH3T3-EGFRinsASV 세포, NIH3T3-EGFRinsSVD 세포 혹은 H1975-EGFRinsSVD 세포를 누드 마우스의 피하에 이식하고, 종양이 생착한 누드 마우스의 종양 체적이 100 내지 200㎣ 정도가 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 5 내지 6마리를 할당하여, 화합물 A 및 아파티닙을 14일간, 1일 1회 연일 경구 투여했다.

투여 용량은, 아파티닙에서는 본 시험의 투여 기간인 14일간에서의 최대 내약용량(투여 기간 중 체중 감소가 20% 미만이 되는 최대 투여 용량)의 20㎎/㎏/day를, 화합물 A에서는 200㎎/㎏/day(최대 내약용량)를 사용했다. 또한, 최대 내약용량은, 미국 국립암 연구소(NCI)에 의한 「Guidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Rats」에 따라서 인도적 관점에서 설정했다.

각 피검 화합물 투여에 있어서의 종양의 경시적 증식 추이를 비교하기 위해서, 종양의 증식 비율로서 군분류 시의 종양 체적을 1로 한 상대 종양 체적(Relative tumor weight, 이하, 「RTV」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 또한 독성의 지표로서 경시적으로 체중을 측정해서 군분류일에 대한 평균 체중 변화율(Body weight change, 이하, 「BWC(%)」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 각 개체의 RTV 및 BWC의 평균값의 추이를 도 3 내지 8에 나타낸다.

RTV=(종양 체적 계측일의 종양 체적)/(군분류 시의 종양 체적)

BWC(%)=(체중 측정일의 체중)/(군분류 시의 체중).

최종 평가일의 화합물 A 투여군의 평균 RTV값이, 아파티닙의 투여군의 평균 RTV값보다 작고, 또한 통계적 유의차(Student-t 검정, p<0.05)를 나타낸 경우에, 화합물 A는, 아파티닙보다 유의하게 유효하다고 판정하고, 도면 중에 *표시로 나타낸다. 또한, 최종 평가일의 T/C(%)를 이하의 식에 따라서 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

도 3 내지 8 및 표 4에 나타내는 결과로 명백해진 바와 같이, 화합물 A는 누드 마우스의 피하에 이식한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR 발현 세포주에 대하여 현저한 항종양 효과를 나타냈다. 또한 그 효과는 아파티닙에 비해서 높으며, 그 때 마우스에서의 위중한 체중 감소, 변 이상, 피부 이상의 증상은 확인되지 않았다.

시험예 6

생체내 약효 시험

인간 변이형 EGFR을 도입한 NIH3T3-EGFRinsNPH 세포를 누드 마우스의 피하에 이식했다. 종양이 생착한 누드 마우스의 종양 체적이 100 내지 200㎣ 정도가 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 6마리를 할당하여, 화합물 A 및 아파티닙을 10일간 1일 1회 연일 경구 투여했다.

투여 용량은, 아파티닙에서는 최대 내약용량(투여 기간 중 체중 감소가 20% 미만이 되는 최대 투여 용량)의 20㎎/㎏/day를, 화합물 A에서는 100 및 200㎎/㎏/day를 사용했다. 또한, 최대 내약용량은, 미국 국립 암 연구소(NCI)에 의한 「Guidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Rats」에 따라서 인도적 관점에서 설정했다.

각 피검 화합물 투여에 있어서의 종양의 경시적 증식 추이의 비교를 위해, 각 개체의 종양 체적(이하, 「TV」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 또한 독성의 지표로서 경시적으로 체중을 측정해서 군분류일에 대한 체중 변화율(Body weight change, 이하, 「BWC(%)」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 각 개체의 TV 및 BWC의 평균값의 추이를 도 9 내지 10에 나타낸다.

TV(㎣)=(긴 직경×짧은 직경²)/2

BWC(%)=(체중 측정일의 체중)/(군분류 시의 체중).

항종양 효과에 대해서, 화합물 A 투여군의 최종 투여 다음날의 평균 TV값이, 컨트롤군의 평균 TV값보다 작고, 또한 통계적 유의차(Dunnett 검정, p<0.05)를 나타낸 경우에, 화합물 A는 유효하다고 판정하고, 도면 중에 *표시로 나타낸다. 또한, 최종 평가일의 T/C(%)를 이하의 식에 따라서 산출했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

T/C(%)=(피검 화합물 투여군의 종양 체적)/(컨트롤군의 종양 체적).

도 9 내지 10 및 표 5로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명 화합물 A는 누드 마우스 피하에 이식한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR 발현 세포주에 대하여 종양 증식 억제 또는 종양 퇴축을 수반하는 현저한 항종양 효과를 나타내고, 그 때 평가 동물에서의 위중한 체중 감소는 확인되지 않았다.

시험예 7

변이형 EGFR 발현 세포주 래트 피하 이식 모델을 사용한 항종양 효과의 평가

인간 변이형 EGFR을 도입한 H1975-EGFRinsSVD 세포를 누드 래트의 피하에 이식했다. 종양이 생착한 누드 래트의 종양 체적이 200 내지 500㎣ 정도가 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 6마리를 할당하여, 화합물 A를 14일간 1일 1회 연일 경구 투여했다.

투여 용량은 본 시험의 투여 기간인 14일간에서의 최대 내약용량(투여 기간 중 체중 감소가 20% 미만이 되는 최대 투여 용량) 미만인 20 및 40㎎/㎏/day를 사용했다. 또한, 최대 내약용량은, 미국 국립 암 연구소(NCI)에 의한 「Guidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Rats」에 따라서 인도적 관점에서 설정했다.

각 피검 화합물 투여에 있어서의 종양의 경시적 증식 추이의 비교를 위해, 각 개체의 종양 체적(이하, 「TV」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 또한 독성의 지표로서 경시적으로 체중을 측정해서 군분류일에 대한 체중 변화율(Body weight change, 이하, 「BWC(%)」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 각 개체의 TV 및 BWC의 평균값의 추이를 도 11 내지 12에 나타낸다.

TV(㎣)=(긴 직경×짧은 직경²)/2

BWC(%)=(체중 측정일의 체중)/(군분류 시의 체중).

항종양 효과에 대해서, 화합물 A 투여군의 최종 평가일의 평균 TV값이, 컨트롤군의 평균 TV값보다 작고, 또한 통계적 유의차(Dunnett 검정, p<0.05)를 나타낸 경우에, 화합물 A는 유효하다고 판정하고, 도면 중에 *표시로 나타낸다. 또한, 최종 평가일의 T/C(%)를 이하의 식에 따라서 산출했다. 결과를 표 6에 나타낸다.

도 11 내지 12 및 표 6으로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는 누드 래트 피하에 이식한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR 발현 세포주에 대하여 종양 증식 억제 또는 종양 퇴축을 수반하는 현저한 항종양 효과를 나타내고, 그 때 평가 동물에서의 위중한 체중 감소는 확인되지 않았다.

시험예 8

변이형 EGFR 양성 폐암 환자 유래 종양의 마우스 피하 이식 모델을 사용한 항종양 효과의 평가

V769_D770insASV 변이형 EGFR 양성 인간 폐암 환자 유래 종양인 LXF 2478을 누드 마우스의 피하에 이식했다. 종양이 생착한 누드 마우스의 종양 체적이 100 내지 200㎣ 정도가 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 8마리를 할당하여, 화합물 A 및 아파티닙을 28일간 1일 1회 연일 경구 투여한 후, 2주일의 관찰 기간을 설정했다.

각 피검 화합물 투여에 있어서의 종양의 경시적 증식 추이의 비교를 위해, 종양의 증식 비율로서 군분류 시의 종양 체적을 1로 한 상대 종양 체적(Relative tumor weight, 이하, 「RTV」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 또한 독성의 지표로서 경시적으로 체중을 측정해서 군분류일에 대한 체중 변화율(Body weight change, 이하, 「BWC(%)」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다. 각 개체의 RTV 및 BWC의 평균값의 추이를 도 13 내지 14에 나타낸다.

RTV=(종양 체적 계측일의 종양 체적)/(군분류 시의 종양 체적)

BWC(%)=(체중 측정일의 체중)/(군분류 시의 체중).

투여 마지막 날 다음날(Day28)의 화합물 A 투여군의 평균 RTV값이, 컨트롤군의 평균 RTV값보다 작고, 또한 통계적 유의차(Dunnett 검정, p<0.05)를 나타낸 경우에, 화합물 A는 유효하다고 판정하고, 도면 중에 *표시로 나타낸다. 또한, 최종 투여일 다음날(Day28)의 T/C(%)를 이하의 식에 따라서 산출했다. 결과를 표 7에 나타낸다.

T/C(%)=(피검 화합물 투여군의 RTV)/(컨트롤군의 RTV).

도 13 내지 14 및 표 7로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는 누드 마우스의 피하에 이식한 엑손 20 삽입 변이형 EGFR 양성 폐암 환자 유래 종양에 대하여 종양 퇴축을 수반하는 현저한 항종양 효과를 나타내고, 관찰 기간 중에도 그 효과는 지속되었다. 그 때 평가 동물에서의 위중한 체중 감소는 확인되지 않았다.

시험예 9

변이형 EGFR 발현 세포주 폐 이식 모델을 사용한 연명 효과의 평가

인간 변이형 EGFR 도입 세포주인 H1975-EGFRinsSVD에 루시페라제(Luciferase)를 도입한 H1975-EGFRinsSVD-Luc주를 수립했다. H1975-EGFRinsSVD-Luc 세포는, NCI-H1975-EGFRinsSVD 세포에 루시페라제를 코딩한 pJTI(상표) FAST DEST 벡터를 pJTI(상표) PhiC31 인테그라제(Integrase) 발현 벡터와 함께 Amaxa(상표) 세포주 뉴클레오펙터(상표) 키트 R에 의한 전기 천공법에 의해 도입한 후, 하이그로마이신 B(나카라이테스크 가부시키가이샤)로 선택했다.

연명 효과의 평가 시에 있어서, 배양한 H1975-EGFRinsSVD-Luc 세포의 현탁액에 매트리겔(Matrigel)을 등량 첨가해서 세포 부유액을 제조한 후, 누드 마우스의 우폐에 이식했다. 이식 후 6일의 시점에서 생존하고 있는 모든 마우스에 루시페린(Luciferin)을 미정맥내 투여하고, 각 군의 발광 강도의 평균값이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 9마리를 할당하여, 화합물 A 및 아파티닙을 1일 1회 연일 경구 투여했다. 투여 용량은, 아파티닙에서는 최대 내약용량(투여 기간 중 체중 감소가 20% 미만이 되는 최대 투여 용량)의 20㎎/㎏/day를, 화합물 A에서는 100 및 200㎎/㎏/day를 사용했다. 또한, 최대 내약용량은, 미국 국립 암 연구소(NCI)에 의한 「Guidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Rats」에 따라서 인도적 관점에서 설정했다.

연명 효과의 평가로서, 이식 후 생존 기간을 관찰하고, 개개의 마우스에 대해서 생존일수를 구하였다. 구한 생존일수로부터 각 군의 생존일수 중앙값(Median survival time, 이하 「MST」라고도 칭한다)을 산출하고, 컨트롤군과 피검 화합물 투여군의 MST를 사용해서 이하의 계산식에 의해 생존 기간 연장 효과(Increase in life span, 이하 「I.L.S.(%)」라고도 칭한다)를 산출했다. 또한 독성의 지표로서 경시적으로 체중을 측정해서 군분류일에 대한 체중 변화율(Body weight change, 이하, 「BWC(%)」라고도 칭한다)을 이하의 식에 따라서 산출했다.

I.L.S.(%)=(T/C-1)×100

T: 피검 화합물 투여군의 MST

C: 컨트롤군의 MST.

BWC(%)=(체중 측정일의 체중)/(군분류 시의 체중).

연명 효과의 판정으로서, 피검 화합물 투여군의 MST가, 컨트롤군의 MST보다 크고, 또한 통계적 유의차(Wilcoxon 검정, p<0.05)를 나타낸 경우에, 화합물 A는 유효하다고 판정하고, 결과를 표 8에 나타낸다.

표 8로부터 명백해진 바와 같이, 화합물 A는 엑손 20 삽입 변이형 EGFR 발현 세포주를 누드 마우스의 폐 동일 개소에 이식한 모델에 있어서 현저한 연명 작용을 나타냈다. 한편, 아파티닙에는 본 모델에 있어서의 연명 작용은 확인되지 않았다. 또한, 화합물 A의 투여에 의한 동물의 위중한 체중 감소는 확인되지 않았다.

시험예 10

이식 종양 및 마우스 피부 조직에 있어서의 인산화 EGFR 저해 활성의 평가

인간 변이형 EGFR을 도입한 NIH3T3-EGFRinsSVD 세포를 누드 마우스의 피하에 이식하여, 종양이 생착한 누드 마우스의 종양 체적이 250 내지 500㎣ 정도가 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 균일해지도록 무작위 층별화에 의해 1군 3마리를 할당하고, 화합물 A 및 아파티닙을 단회 경구 투여했다. 투여 후, 화합물 A 및 아파티닙 각각의 최고 혈중 농도 도달 시간 부근인 1시간 및 3시간의 시점에서 종양 및 피부 조직을 채취했다. 채취한 조직은 액체 질소를 사용해서 순간 동결하고, 사용 시까지 -80℃에서 보관했다. 종양 및 피부 조직은 프로테아제 인히비터 칵테일(서모 피셔 사이언티픽)을 첨가한 RIPA 버퍼(서모 피셔 사이언티픽)를 첨가한 상태에서 균질화해서 세포 내의 단백질을 추출한 후, BCA 단백질 검정 키트(서모 피셔 사이언티픽)를 사용해서 단백질 농도를 측정하고, 각 샘플을 인산화 EGFR 발현 측정에 적합한 단백질 농도로 각각 조정했다. 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리해서 PVDF 멤브레인에 전사했다. 블로킹한 후, 1차 항체인 포스포-EGF 수용체(Tyr1068) #2234(CST)를 0.1% TBS-T 버퍼에서 1000분의 1로 희석하고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 2차 항체인 HRP 표지 항래빗 항체 #NA9340V(GE 헬스케어)를 0.1% TBS-T 버퍼에서 제조한 5% 스킴 밀크 용액에 2500분의 1로 희석하고, 실온에서 40분 반응시켰다. ECL-Prime(GE 헬스케어)에서 반응시킨 후, LAS-3000(GE 헬스케어)에서 검출했다.

상기 시험의 결과로부터, 화합물 A는 피부의 야생형 EGFR에 비해 종양의 변이형 EGFR을 선택적으로 저해하는 것이 명확해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Exon 20 Insertion EGFR Mutant-selective Inhibitor <130> P17-145WO <150> JP 2016-213072 <151> 2016-10-31 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims

(S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드;
(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드;
(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드; 및
(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 항종양제.
제1항에 있어서, 화합물이, (S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드인 항종양제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자는, 폐암, 유방암, 두경부암, 뇌종양, 자궁암, 조혈기종양, 또는 피부암의 환자인 항종양제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자는, 폐암 환자인 항종양제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1개 이상의 아미노산이 삽입된 변이인 항종양제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1 내지 7개의 아미노산이 삽입된 변이인 항종양제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이가, 엑손 20 영역에 1 내지 4개의 아미노산이 삽입된 변이인 항종양제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 20 삽입 변이가, V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insG, H773_V774insNPH, H773_V774insPH인 항종양제.
엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자에게 유효량의
(S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드;
(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드;
(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드; 및
(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드
로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염을 투여하는 공정을 포함하는 악성 종양 환자의 치료 방법.
엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한,
(S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드;
(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드;
(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드; 및
(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드
로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염.
(S)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)아크릴아미드;
(S)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)아크릴아미드;
(S,E)-N-(4-아미노-6-메틸렌-5-(퀴놀린-3-일)-7,8-디히드로-6H-피리미도[5,4-b]피롤리진-7-일)-3-클로로아크릴아미드; 및
(R)-N-(4-아미노-6-메틸-5-(퀴놀린-3-일)-8,9-디히드로피리미도[5,4-b]인돌리진-8-일)-N-메틸아크릴아미드
로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 염의, 엑손 20 삽입 변이를 갖는 EGFR을 발현하고 있는 악성 종양 환자를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 용도.