KR20190074880A

KR20190074880A - Method for production of Malpighia emarginata fruit extract without mass destruction of effective compound and cosmetic composition with the extract

Info

Publication number: KR20190074880A
Application number: KR1020170176568A
Authority: KR
Inventors: 권성필; 김희선; 조이슬; 이상석; 장동철
Original assignee: 청담씨디씨제이앤팜 유한책임회사
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2019-06-28
Also published as: KR102022068B1

Abstract

The present invention relates to a method for producing a Malpighia emarginata fruit extract with less destruction of useful components and a cosmetic composition containing the extract produced thereby. In the present invention, it has been confirmed that when a novel nitrogen injection extraction process is employed, it is possible to produce a Malpighia emarginata fruit extract having excellent antioxidant ability because the breakdown of useful components, especially vitamin C, in the extract of the Malpighia emarginata fruit is low. Therefore, the Malpighia emarginata fruit extract according to the nitrogen injection extraction process of the present invention shows excellent skin aging prevention effect, wrinkle formation prevention effect, whitening effect, and anti-inflammation (skin irritation soothing) effect.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing an extract of acerola fruit having a reduced destruction of a useful ingredient and a cosmetic composition containing the extract,

본 발명은 유용성분의 파괴가 적은 아세로라 열매 추출물의 제조방법 및 이렇게 제조한 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing an acerola fruit extract with less breakage of a useful ingredient and a cosmetic composition containing the extract thus prepared.

인체의 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 물, 전해질 등의 생체 성분의 손실을 방지하며, 동시에 외부로부터 유해물질의 침입을 막는 역할을 한다. The skin of the human body functions as a protective film for protecting the living body from the external environment and prevents the loss of biological components such as water and electrolytes in the human body and at the same time prevents the entry of harmful substances from the outside.

그러나, 일반적으로 나이가 들면서 이러한 기능들이 점차 약화되고, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처에 따른 프리라디칼의 활성화 등으로부터 피ㅎ부의 노화가 진행된다. 특히, 피부 장벽의 기능을 수행하는 지질층의 지질 조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격히 저하되는데, 피부 수분 함량이 감소하게 되면, 피부가 건조해지고, 주름이 형성되며, 기미, 주근깨, 색소 침착 및 다양한 피부 병변이 유발된다.However, in general, these functions are gradually weakened with age, and the aging of the subject is progressed from ultraviolet rays, stress, disease state, environmental factors, activation of free radicals due to scars, and the like. Particularly, as the lipid composition and the content of the lipid layer functioning as a skin barrier are changed, the function thereof is rapidly lowered. When the skin moisture content is decreased, the skin becomes dry, wrinkles are formed and stains, freckles, Various skin lesions are induced.

이런 상태가 심화할 경우, 생체 내에 존재하는 항산화 방어망이 파괴되고, 세포 및 조직을 손상되어 성인병 및 노화가 촉진된다. 특히, 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우, DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.When such conditions are intensified, the antioxidant defense network existing in the living body is destroyed, and cells and tissues are damaged, thereby promoting adult diseases and aging. Particularly, the oxidation of protein causes the severing of excessive inflammation reaction and skin elasticity by cutting collagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, and fibronectin which are connective tissues of skin. When this becomes worse, mutation, cancer And the immune function of the immune system.

따라서, 피부를 외부의 여러 요인으로부터 방어해 줄 수 있는 화장품의 사용이 요구되고, 이런 요구에 따라 많은 종류의 기능성 화장품이 출시되어 사용되고 있다. 기능성 화장품은 크게 합성 화합물을 사용한 화장품과, 천연물 유래의 추출물을 사용한 화장품으로 대비된다. 합성 화합물을 사용한 화장품은 그 효능이 비교적 명확히 발휘되는 장점이 있지만, 부작용이 큰 문제가 있고, 합성 화합물의 사용에 따른 소비자의 거부감이 큰 문제로 대두되어 있다. 이에 반해, 천연물 유래의 추출물을 사용한 화합물은 부작용이 적고, 소비자의 거부감이 적은 장점이 있으나, 효능의 발휘가 미미하고, 특정 효능을 발휘하기 위해서는 원료를 많이 사용해야 하는 문제가 있다. 따라서, 천연물 유래의 추출물을 화장품 원료로 사용하고자 하는 경우, 효능을 극대화할 수 있는 기술의 개발이 요구된다 할 것이다. Therefore, it is required to use cosmetics that can protect the skin from various external factors, and many kinds of functional cosmetics have been introduced and used according to such demands. Functional cosmetics are largely prepared with cosmetics using synthetic compounds and cosmetics using extracts derived from natural products. Although cosmetics using synthetic compounds have an advantage that their efficacy is comparatively clearly demonstrated, they have a serious problem of side effects, and consumers' rejection due to the use of synthetic compounds is a big problem. On the other hand, a compound using an extract derived from a natural product has a small side effect and a low rejection by a consumer. However, the effect is insignificant and a lot of raw materials must be used in order to exhibit a specific effect. Therefore, in the case of using an extract derived from a natural product as a cosmetic raw material, development of a technique capable of maximizing the efficacy will be required.

한편, 아세로라(Malpighia glabra)는 작은 관목으로, 건조하고 낙엽성숲에서 5 m정도 자라며, 직경이 1~2 cm정도 되는 밝은 빨강의 열매를 풍부히 생산한다. 열매는 유로피안 체리와 흡사하게 생겼고, 이러한 이유로 아세로라는 Antilles, Barbados, Puerto Rican cherry, West Indian cherry 등의 이름으로 불리운다. On the other hand, acerola ( Malpighia glabra ) is a small shrub, which grows about 5 m in dry and deciduous forests and produces bright red fruit with a diameter of 1 to 2 cm. For this reason, acerola is called Antilles, Barbados, Puerto Rican cherry, and West Indian cherry.

아세로라는 북동브라질의 모래토양에서 야생으로 자라고 있는 것을 볼 수 있는데, 원산지는 남아메리카와 중부미국, 자메이카에 이르고 있다. 28 ℉이상의 기온에서 생존하고, 오랜 기간의 가뭄에도 잘 견디며, 85~90 ℉의 따뜻하거나 뜨거운 기후를 선호한다. Acerola grows wild in the sandy soil of Northeast Brazil, with its origins in South America, Central America and Jamaica. It survives at temperatures above 28 ° F, survives long periods of drought, and prefers a warm or hot climate of 85-90 ° F.

아세로라 열매는 즙이 많고 부드러우며, 시큼한 맛과 향을 가졌는데, 이 맛을 즐기는 사람들이 많다. 음료용으로 신선하고 맛있게 먹는데, 남아메리카에서는 아이스크림과 음료수 칵테일의 맛과 향을 내는 첨가제로 쓰이고 있다. Acerola fruit is juicy and soft, has a sour taste and aroma, and there are many people who enjoy this taste. It is fresh and delicious for beverage use, and it is used as an additive to flavor and aroma of ice cream and beverage cocktails in South America.

한국등록특허 제10-1563310호 (등록일자:2015.10.20)에는, 아세로라 체리 열매의 분말 및 그의 제조 방법에 대하여 기재되어 있다.Korean Registered Patent No. 10-1563310 (Registered on May 20, 2015) describes a powder of acerola cherry fruit and a method for producing the same. 한국공개특허 제10-2017-0121033호 (공개일자:2017.11.01)에는, 젤 또는 크림 타입의 조성물을 위한 기재에, 메리골드, 아사이베리, 황기, 배롱나무, 차가버섯, 식물 유래 미네랄, 또는 아세로라 중 적어도 하나 이상이 함유된 입술용 화장료 조성물에 대하여 기재되어 있다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2017-0121033 (published on Apr. 11, 2017) discloses a method for preparing a gel or a cream-type composition, Acerola is contained in at least one cosmetic composition for lips.

본 발명은 화장품 원료로 사용하기 위한 아세로라 열매 추출물의 최적 추출조건을 개발하여 제공하고자 하고, 이렇게 추출된 추출물의 여러 피부 기능성을 확인하여 화장품에 사용될 수 있는 기능성 물질로 제공하고자 한다. The present invention aims to develop and provide optimal extraction conditions of the acerola fruit extract for use as a cosmetic raw material, and to provide various functionalities of the extract to the functional material which can be used in cosmetics.

본 발명은 아세로라 열매의 동결건조 분말에 추출 용매로 정제수를 첨가하여 23~28℃의 온도로 108~132분 동안 질소 퍼징을 하면서 추출하는 것을 특징으로 하는 아세로라 추출물의 제조방법을 제공한다. The present invention provides a method for producing acerola extract, which comprises adding purified water as an extraction solvent to a lyophilized powder of acerola fruit, and extracting the mixture with nitrogen purging at a temperature of 23 to 28 ° C for 108 to 132 minutes.

본 발명의 아세로라 추출물 제조방법에 있어서, 상기 아세로라 추출물은, 바람직하게 고형분 함량이 55~57 중량%이고, 비타민 C를 22~24 중량% 함유하는 것이 좋다. In the method for producing an acerola extract of the present invention, the above-mentioned acerola extract preferably contains 55 to 57% by weight of solid content and 22 to 24% by weight of vitamin C.

본 발명은 아세로라 열매의 동결건조 분말에 추출 용매로 정제수를 첨가하여 23~28℃의 온도로 108~132분 동안 질소 퍼징을 하면서 추출한 것으로, 고형분 함량이 55~57 중량%이고, 비타민 C를 22~24 중량%인 아세로라 추출물을 제공한다. The present invention relates to a method for preparing a freeze-dried powder of acerola fruit, which comprises extracting purified water from a freeze-dried powder of the acerola fruit with nitrogen purging at a temperature of 23 to 28 ° C for a period of 108 to 132 minutes, wherein the solid content is 55 to 57% To 24% by weight of acerola extract.

본 발명은 상기 본 발명의 아세로라 추출물을 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention provides a cosmetic composition for preventing skin aging containing the above-mentioned acerola extract of the present invention.

본 발명은 상기 본 발명의 아세로라 추출물을 함유하는 피부 주름 방지용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention provides a cosmetic composition for preventing skin wrinkles containing the above-mentioned acerola extract of the present invention.

본 발명은 상기 본 발명의 아세로라 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention provides a skin whitening cosmetic composition containing the above-described acerola extract of the present invention.

본 발명은 상기 본 발명의 아세로라 추출물을 함유하는 피부 자극완화용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention provides a cosmetic composition for relieving skin irritation containing the above-described acerola extract of the present invention.

본 발명에서 새롭게 착안한 질소 주입 추출 공정에 의할 경우, 아세로라 열매 추출물 내 유용성분, 특히 비타민 C의 파괴가 낮아 우수한 항산화력을 보유한 아세로라 열매 추출물을 제조할 수 있음이 확인되었다. 이로 말미암아 본 발명의 질소 주입 추출 공정에 따른 아세로라 열매 추출물은, 우수한 피부 노화 방지 효과, 주름 생성 방지 효과, 미백 효과, 항염(피부자극 완화) 효과를 발휘한다.In the present invention, it has been confirmed that when the nitrogen injection extraction process is employed, it is possible to produce an acerola fruit extract having a good antioxidant ability because the breakdown of useful components, particularly vitamin C, in the extract of the acerola fruit is low. Therefore, the fruit extract of the acerola according to the nitrogen injection extraction process of the present invention exerts excellent skin aging prevention effect, wrinkle formation prevention effect, whitening effect, and anti-inflammation (skin irritation mitigation) effect.

도 1은 아세로라 열매 동결건조 분말의 추출시, 온도, 시간에 따른 고형분 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 아세로라 열매 동결건조 분말의 추출시, 에탄올 농도별 추출 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 아세로라 열매 동결건조 분말의 일반추출 및 질소퍼징추출에서 온도 및 시간에 따른 고형분 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 아세로라 열매 동결건조 분말의 일반추출 및 질소퍼징추출에서 온도, 시간에 따른 항산화활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 아세로라 열매 동결건조 분말의 질소퍼징추출시, 온도, 시간에 따른 비타민 C 수율에 대한 반응표면분석 결과이다.
도 6은 아세로라 열매 동결건조 분말의 추출시, 질소 주입 여부 및 추출 시간에 따른 비타민 C의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 아세로라 열매 추출물 (Sample)의 DPPH 실험 결과이다.
도 8은 아세로라 열매 추출물의 환원력을 측정한 결과이다.
도 9는 아세로라 열매 추출물의 아질산염 소거능 측정 결과이다.
도 10은 아세로라 열매 추출물의 MMP-1발현 저해를 측정한 결과이다.
도 11은 아세로라 열매 추출물의 콜라겐 생성 여부를 측정한 결과이다.
도 12는 아세로라 열매 추출물 (Sample)의 티로시나제 억제능을 측정한 결과이다.
도 13은 아세로라 열매 추출물의 멜라닌 억제능을 측정한 결과이다.
도 14의 아세로라 열매 추출물의 NO 생성을 측정한 결과이다.
도 15의 A는 AP-1 유전자를 real-time PCR로 측정한 결과이고, 도 15의 B는 HMOX-1 유전자를 real-time PCR로 측정한 결과이며, 도 15의 C는 TrxR 유전자를 real-time PCR로 측정한 결과이고, 도 15의 D는 GAPDH 유전자를 real-time PCR로 측정한 결과이며, 도 15의 E는 Involucrin 유전자를 real-time PCR로 측정한 결과이다.
도 16은 아세로라 추출물의 히알루로니다아제 저해활성을 나타낸 결과이다.
도 17은 아세로라 질소퍼징추출물(아세로라 추출물 A) 및 일반추출물(아세로라 추출물 B)의 in vitro tyrosinase 억제능을 측정한 결과이다.
도 18은 아세로라 질소퍼징추출물(아세로라 추출물 A) 및 일반추출물(아세로라 추출물 B)의 멜라닌 억제능을 측정한 결과이다. FIG. 1 is a graph showing the change in the yield of solid content according to temperature and time during extraction of freeze-dried powder of acerola fruit.
FIG. 2 is a graph showing changes in the extraction yield according to the ethanol concentration upon extraction of the lyophilized acellular fruit powder.
FIG. 3 is a graph showing changes in solid yield according to temperature and time in general extraction and nitrogen purge extraction of acerola fruit freeze-dried powder.
FIG. 4 is a graph showing changes in antioxidant activity with temperature and time in general extraction and nitrogen purge extraction of freeze-dried powder of acerola fruit.
FIG. 5 is a result of the response surface analysis of the vitamin C yield according to temperature and time during nitrogen purge extraction of the lyophilized acerola fruit powder.
FIG. 6 is a graph showing the content of vitamin C in the extraction of freeze-dried powder of acerola fruit, with or without nitrogen injection and extraction time. FIG.
7 shows DPPH test results of the acerola fruit extract (Sample).
Fig. 8 shows the result of measuring the reducing power of the acerola fruit extract. Fig.
Fig. 9 shows the nitrite scavenging activity of the acerola fruit extract.
Fig. 10 shows the results of measurement of inhibition of MMP-1 expression by the acerola fruit extract.
Fig. 11 shows the results of measurement of collagen production of the acerola fruit extract.
Fig. 12 shows the result of measuring the inhibitory effect of tyrosinase on the extract of Acerola fruit (Sample).
13 shows the results of measuring the melanin inhibitory activity of the acerola fruit extract.
14 shows the results of measurement of NO production of the acerola fruit extract.
FIG. 15A shows the result of real-time PCR of the AP-1 gene, FIG. 15B shows the result of real-time PCR of the HMOX-1 gene, time PCR. In FIG. 15, D is the result of real-time PCR measurement of the GAPDH gene, and E of FIG. 15 is the result of real-time PCR of Involucrin gene.
Fig. 16 shows the hyaluronidase inhibitory activity of the acerola extract.
Fig. 17 shows the results of measurement of in vitro tyrosinase inhibitory activity of the Aspergillus niger purifying extract (acerola extract A) and the general extract (acerola extract B).
FIG. 18 shows the results of measuring the melanin inhibitory activity of the aspirin nitrogen purifying extract (acerola extract A) and the general extract (acerola extract B).

본 발명에서는 아세로라 추출물의 최적 추출조건을 확립하고자 하였는데, 우선 추출용매를 결정하고자 하였다. 본 발명에서는 다양한 용매를 사용하여 추출물을 수득한 후, 고형분 추출 수율을 비교하여 보았는데, 정제수를 사용하는 경우 가장 높은 추출 수율을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에서는 추출용매로 정제수를 선택하였다. In the present invention, it was attempted to establish an optimum extraction condition of the acerola extract. First, the extraction solvent was determined. In the present invention, the extract yield was obtained by using various solvents, and then the yield of the solid fraction was compared. When the purified water was used, the highest extraction yield was confirmed. From this, purified water was selected as an extraction solvent in the present invention.

한편, 아세로라 유래의 고기능성 활성성분 중 비타민 C는 고온 추출법 및 각종 산화적 스트레스에 매우 취약하기 때문에 이의 파괴를 최소화하여, 최대한 함유될 수 있도록 하는 추출방법의 개발이 요구된다. 본 발명에서 질소 주입(퍼징) 추출 공정을 도입하여 보았는데, 그 결과, 그렇지 않은 경우에 비해 비타민 C의 파괴가 적음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에서는 질소 주입 추출 공정을 도입하였다. On the other hand, vitamin C among the highly functional active ingredients derived from acerola is very vulnerable to high temperature extraction and various oxidative stresses. Therefore, it is required to develop an extraction method that minimizes the destruction thereof and maximally contains it. In the present invention, the nitrogen injection (purging) extraction process was introduced. As a result, it was confirmed that the destruction of vitamin C was less than that in the case of not. From this, the present invention introduces a nitrogen injection extraction process.

한편, 본 발명에서는 최적 추출온도 및 추출시간을 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 통해 확립하고자 하였다. RSM은 최소의 실험횟수로부터 최대의 정보를 얻을 수 있는 실험계획법과 실험계획법에 의해 얻어진 실험 자료를 분석하여 복잡한 시스템의 성능을 이해하고 반응변수에 영향을 주는 유의한 요인효과들을 찾고 최적화하는데 사용된다. Meanwhile, in the present invention, the optimum extraction temperature and extraction time were tried to be established through response surface methodology (RSM). RSM is used to understand the performance of complex systems and to find and optimize significant factorial effects that affect response variables by analyzing experimental data obtained from experimental design method and experimental design method to obtain maximum information from minimum number of experiments .

여러 개의 인자 중 하나씩 각각 변화시켜 실험을 진행하는 전통적인 실험법인 1회 1인자(one factor at a time) 실험법에 의해서는 최적의 실험 조건을 찾기 어렵다. 또한, 복합 공정에서 중요한 인자 간에 상호작용을 고려하지 못하고, 실험영역 전체를 균형 있게 판단하지 못하기 때문에 국지 최적점을 찾게 되는 문제점이 있다.It is difficult to find the optimal experimental conditions by the one factor at a time experiment, which is a conventional experimental method in which the experiment is performed by changing one of several factors. In addition, since the interactions between important factors in the complex process can not be considered and the entire experimental region can not be judged in a balanced manner, there is a problem that the local optimal point is found.

RSM은 전형적인 최적화 방법으로 일반적으로 여러 변수를 사용하여 최적 조건을 찾는 시스템인데, 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 효과를 측정하여 변수들의 최적 값을 확인할 수 있다.RSM is a typical optimization method. In general, it is a system to find optimal condition by using several variables. It can check the optimum value of variables by measuring the effect of interaction between one variable and other variables.

RSM 설정에 의해 온도 및 추출시간을 다양하게 하여 아세로라 추출물을 제조한 결과, 25℃ 온도에서 120분(2시간) 동안 추출하는 것이 최적의 비타민 C 추출 조건으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에서 25℃ 온도, 120분(2시간)의 추출시간이 본 발명에서 의도하는 최적의 추출조건으로 판단되었다. 이상의 25℃에서 2시간 동안 질소퍼징추출한 아세로라 추출물은, 고형분 함량이 약 56 중량%이고, 비타민 C가 약 23 중량%인 것으로 확인되었다. As a result of preparing the acerola extract by varying the temperature and the extraction time according to the RSM setting, it was confirmed that the extraction was carried out at 25 ° C for 120 minutes (2 hours) as the optimal vitamin C extraction condition. Therefore, in the present invention, the extraction time at 25 DEG C and 120 minutes (2 hours) was judged as the optimum extraction condition intended in the present invention. Or more at 25 캜 for 2 hours, the solid content is about 56% by weight, the vitamin C is about 23% by weight.

한편, 통상적으로 상기 최적 조건의 ±10% 정도는 호적 조건으로 인정할 수 있으므로, 본 발명 아세로라 추출물의 호적 추출조건으로 23~28℃의 온도 및 108~132분 동안의 질소퍼징추출 조건을 확립할 수 있었다. On the other hand, generally, about ± 10% of the optimum condition can be regarded as a family condition. Therefore, it is possible to establish the temperature of 23 to 28 ° C and the nitrogen purging extraction condition for 108 to 132 minutes as the family extraction condition of the present invention there was.

한편, 본 발명은 아세로라 열매의 동결건조 분말에 추출 용매로 정제수를 첨가하여 23~28℃의 온도로 108~132분 동안 질소 퍼징을 하면서 추출한 것으로, 고형분 함량이 55~57 중량%이고, 비타민 C 함량이 22~24 중량%인 아세로라 추출물을 제공한다. 본 발명의 아세로라 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 노화 방지 효능, 피부 주름 방지 효능, 피부 미백 효능, 피부 염증 완화 (피부 자극완화) 효능을 발휘한다. Meanwhile, the present invention relates to a method for preparing a lyophilized powder of acerola fruit, which comprises adding purified water as an extraction solvent to extract lyophilized powder of acerola fruit and extracting it with nitrogen purging at a temperature of 23 to 28 ° C for 108 to 132 minutes, To provide an extract of acerola having a content of 22 to 24% by weight. The cosmetic composition containing the acerola extract of the present invention exerts skin aging-preventing effect, skin wrinkle-preventing effect, skin whitening effect, and skin irritation alleviation (skin irritation alleviation).

본 발명의 화장료 조성물은, 일예로 용액, 현탄액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can be used as a cosmetic composition, for example, as a solution, a current liquid, an emulsion, a paste, a lotion, a gel, a water-soluble liquid, a cream, an essence, a surfactant-containing cleansing oil, W / O) type; skin; Lotion; Eye cream; Soothing gel; Ointment; A formulation for a mask pack; A body-wasting formulation; Peeling gel; Underwater type and wet type makeup base; foundation; Skin cover; Lipstick, lip gloss, face powder, two-way cake, eye syrup, cheek color, and eyebrow pencil; Formulation for scalp; Or the like.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일례로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.Meanwhile, the cosmetic composition of the present invention may contain commonly used components, and may include, for example, conventional auxiliary agents and carriers such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and perfumes.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation is a paste, a cream or a gel in the cosmetic composition of the present invention, an animal oil, a vegetable oil, a wax, a paraffin, a starch, a tragacanth, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, Talc or zinc oxide may be used.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일례로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. In the cosmetic composition of the present invention, when the formulation is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, Benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan can be used.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.In the cosmetic composition of the present invention, when the formulation is a suspension, water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester , Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tragacanth, and the like may be used.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.On the other hand, in the cosmetic composition of the present invention, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component when the formulation is a powder or a spray, Propellants such as chlorofluorohydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.On the other hand, in the case of the cosmetic composition of the present invention, when the formulation is a surfactant-containing cleansing agent, aliphatic alcohol sulfates, aliphatic alcohol ether sulfates, sulfosuccinic acid monoesters, isethionates, imidazolinium derivatives, sarcosinates, Fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유된 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.In the cosmetic composition of the present invention, if it is a cleansing formulation containing a surfactant or a cleansing formulation without a surfactant or a soap, it may be applied to the skin and then wiped off, washed or rinsed with water. The surfactant-containing cleansing formulation is a cleansing foam, a cleansing water, a cleansing towel, and a cleansing pack. The surfactant-free cleansing formulation may be a cleansing cream, Cleansing lotion, cleansing water, and cleansing gel, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.In addition, the cosmetic composition of the present invention can be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention. In addition, the cosmetic composition according to the present invention can be used according to a conventional method of use, and may be used in a different number of times depending on the skin condition or taste of the user.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 원료적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples and experimental examples, and includes modifications of equivalent raw materials.

[실시예 1: 아세로라 열매의 최적 추출을 위한 용매 선정][Example 1: Selection of solvent for optimum extraction of acerola fruit]

추출시간, 추출온도 및 추출용매는 천연물추출물 개발에서 가장 중요한 요소이다. 최대한 경제적인 공정을 통하여 유효성분을 최대한 함유할 수 있는 최적의 추출조건을 찾는 것은 산업화에 중요한 요소이다. Extraction time, extraction temperature and extraction solvent are the most important factors in the development of natural extracts. It is an important factor in industrialization to find the optimum extraction conditions that can contain the active ingredients as much as possible through the most economical process.

먼저, 온도 및 시간에 따른 고형분 수율 변화를 확인해 보았는데, 도 1에서 보듯이, 온도 및 시간이 경과할수록 수율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 1, it was confirmed that the yield was increased with increasing temperature and time.

한편, 최적 추출용매를 선정하고자, 분획과정 (헥산->EA(ethyl acetate)->ACN(acetonitrile)->부탄올->에탄올->정제수)을 통해 수득한 분획물 내 폴리페놀 함량을 확인해 보았다. On the other hand, in order to select the optimum extraction solvent, the content of polyphenols in the fraction obtained through fractionation (hexane-> EA (ethyl acetate) -> ACN (acetonitrile) -> butanol-> ethanol-> purified water) was examined.

아세로라 열매의 분획물 내 폴리페놀 함량 (Folin Denis 방법으로 측정함. 표준곡선은 y=0.0309x+0.0742, R²=0.9988)Polyphenol content in fractions of acerola fruit (measured by the Folin Denis method, y = 0.0309x + 0.0742, R ² = 0.9988) 원물투입량(g)Input of raw material (g) 250250 흡광도(765nm)Absorbance (765 nm) 함량 (mg GAE/g)Content (mg GAE / g) 헥산Hexane 0.0670.067 2.182.18 E.AE.A 0.0510.051 14.1814.18 ACNACN 0.1140.114 13.6613.66 부탄올Butanol 0.1870.187 112.66112.66 에탄올ethanol 0.3410.341 459.5459.5 정제수Purified water 2.5972.597 826.2826.2

분획시험 결과, 표 1에서 보듯이, 정제수에서 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타났고, 에탄올에서 두 번째로 높게 나타났다. 이 결과로부터 추출물공정개발 시 사용되는 용매는 정제수 또는 에탄올을 사용하기로 하였다. As a result of the fractionation test, as shown in Table 1, the polyphenol content was the highest in the purified water and the second highest in the ethanol. From these results, it was decided to use purified water or ethanol as a solvent for the development of the extract process.

[실시예 2: 에탄올 농도별 추출 수율 분석][Example 2: Analysis of extraction yield by ethanol concentration]

상기 실시예 1 실험에서 아세로라 추출물의 수득을 위한 최적 용매로 정제수가 적합한 것으로 나왔으나, 본 실험에서는 에탄올의 농도를 달리하여 고형분 추출 수율을 분석해 보고자 하였다. In the experiment of Example 1, purified water was found to be the most suitable solvent for obtaining the acerola extract. However, in this experiment, it was tried to analyze the yield of the solid fraction by varying the concentration of ethanol.

실험 결과는 도 2와 같이 나타났다. 도 2에서 보는 바와 같이 에탄올 함량이 높아질수록 추출 수율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 에탄올을 추출용매로 사용하는 경우, 30% 에탄올을 사용하는 것이 추출 수율 측면에서 가장 바람직한 것으로 판단되었다. The experimental results are shown in Fig. As shown in FIG. 2, the higher the ethanol content, the lower the extraction yield. When ethanol was used as the extraction solvent, it was judged that the use of 30% ethanol was the most preferable in terms of extraction yield.

에탄올 함량이 낮다는 것은 반대로 물의 함량이 높다는 것을 의미하는데, 본 실험에서, 에탄올 함량이 낮은 (즉, 물의 함량이 높은) 에탄올 수용액을 추출용매로 사용했을 때, 수율이 높게 나온 것은, 상기 실시예 1에서 추출용매로 물을 사용하였을 때, 추출 수율이 가장 높게 나온 것과 일맥 상통한 결과라 할 수 있다. The low ethanol content means that the water content is high. In this experiment, when the ethanol aqueous solution having a low ethanol content (that is, a high water content) was used as the extraction solvent, the yield was high. 1, the extraction yield was the highest when water was used as the extraction solvent.

[실시예 3: 질소 퍼징 추출공정의 개발][Example 3: Development of a nitrogen purge extraction process]

아세로라 열매의 유용성분은 대부분 수용성의 물질로 구성되어 있으며, 추출공정 시 가해지는 가혹한 물리화학적 스트레스에 민감하다. 이에 본 발명에서는 최적의 추출물 공정을 개발하기 위하여 최대한 유순하면서도 유효성과 경제성을 확보한 추출물 공정을 개발하고자 하였다. 이를 위하여, 추출공정 시 질소 퍼징 공법을 도입하였으며, 비타민 C 등 유용성분의 산화를 최대한 억제하고자 하였다. The useful components of the acerola fruit are mostly composed of water-soluble substances and are sensitive to severe physicochemical stresses during the extraction process. Therefore, in order to develop an optimum extracting process, the present invention has developed an extracting process which is as gentle as possible, and has obtained efficacy and economy. For this purpose, the nitrogen purging method was introduced during the extraction process and the oxidation of the useful components such as vitamin C was suppressed as much as possible.

질소 퍼징 공법의 도입에 따른 실험 결과는 하기 표 2에서 보는 바와 같았다.The experimental results of the introduction of the nitrogen purge method are shown in Table 2 below.

질소 퍼징 시 추출시간 별 DPPH의 변화 측정결과Measurement results of DPPH change by extraction time at nitrogen purge 질소 주입Nitrogen injection 질소 미주입Nitrogen impregnation 추출시간Extraction time 농도(ppm)Concentration (ppm) 흡광도Absorbance 라디칼소거능Radical scavenging ability 추출시간Extraction time 농도(ppm)Concentration (ppm) 흡광도Absorbance 라디칼소거능Radical scavenging ability 2시간2 hours 1010 0.4470.447 5.99%5.99% 2시간2 hours 1010 0.4240.424 5.24%5.24% 2525 0.3350.335 26.08%26.08% 2525 0.1710.171 21.33%21.33% 5050 0.1360.136 70.09%70.09% 5050 0.1850.185 63.25%63.25% 100100 0.0780.078 82.88%82.88% 100100 0.1490.149 74.94%74.94% 200200 0.0800.080 82.29%82.29% 200200 0.1490.149 78.32%78.32% 4시간4 hours 1010 0.4550.455 5.32%5.32% 4시간4 hours 1010 0.3410.341 4.88%4.88% 2525 0.4220.422 21.55%21.55% 2525 0.2790.279 17.43%17.43% 5050 0.3070.307 66.43%66.43% 5050 0.3070.307 61.51%61.51% 100100 0.1290.129 77.44%77.44% 100100 0.1290.129 72.33%72.33% 200200 0.0890.089 80.21%80.21% 200200 0.0890.089 76.58%76.58% 6시간6 hours 1010 0.2080.208 5.11%5.11% 6시간6 hours 1010 0.4290.429 4.53%4.53% 2525 0.3840.384 18.93%18.93% 2525 0.4280.428 16.80%16.80% 5050 0.2600.260 64.90%64.90% 5050 0.2050.205 61.40%61.40% 100100 0.0860.086 76.30%76.30% 100100 0.1030.103 71.30%71.30% 200200 0.0680.068 79.43%79.43% 200200 0.0620.062 75.50%75.50% 8시간8 hours 1010 0.5590.559 5.09%5.09% 8시간8 hours 1010 0.5030.503 4.43%4.43% 2525 0.4960.496 18.10%18.10% 2525 0.3910.391 16.30%16.30% 5050 0.4070.407 64.10%64.10% 5050 0.2090.209 60.60%60.60% 100100 0.1940.194 75.44%75.44% 100100 0.0660.066 71.20%71.20% 200200 0.0670.067 79.00%79.00% 200200 0.0670.067 74.50%74.50% 10시간10 hours 1010 0.5680.568 4.98%4.98% 10시간10 hours 1010 0.4940.494 4.33%4.33% 2525 0.5380.538 17.93%17.93% 2525 0.3800.380 15.88%15.88% 5050 0.4310.431 62.90%62.90% 5050 0.2180.218 60.20%60.20% 100100 0.1800.180 75.20%75.20% 100100 0.0740.074 70.70%70.70% 200200 0.0660.066 79.32%79.32% 200200 0.0790.079 73.90%73.90%

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 동일한 농도에서 질소 퍼징을 통해 추출한 추출물의 라디칼 소거능이 그렇지 않은 경우에 비해 더 높게 나타났다. 이를 통해 질소 퍼징을 할 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 항산화와 관련된 물질의 파괴가 적음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 질소 퍼징 공법을 도입하기로 하였다.As shown in Table 2 above, the radical scavenging ability of the extract extracted through nitrogen purging at the same concentration was higher than that of the untreated extract. It was found that the nitrogen purging resulted in less destruction of the antioxidant - related substances compared to the case without nitrogen purge. Therefore, in the present invention, the nitrogen purge method is adopted.

[실시예 4: 일반추출 및 질소퍼징추출에 의한 고형분 추출 수율의 비교][Example 4: Comparison of solid extraction yield by general extraction and nitrogen purge extraction]

본 실시예에서는 일반추출과 질소퍼징추출에 대해 고형분 추출 수율을 상호 비교해 보고자 하였다. 실험 결과는 도 3과 같이 나타났다. 도 3에서 보는 바와 같이, 질소퍼징추출의 고형분 추출 수율이 일반추출의 고형분 추출 수율 보다 더 높게 나타났다. In this Example, we tried to compare the yield of solid fraction extraction with normal extraction and nitrogen purge extraction. The experimental results are shown in Fig. As shown in FIG. 3, the solid extraction yield of the nitrogen purging extraction was higher than the solid extraction yield of the general extraction.

한편, 일반추출과 질소퍼징추출에 대해 항산화활성을 분석해 보았다. 실험결과는 도 4와 같이 나타났다. 도 4에서 보는 바와 같이, 질소퍼징추출이 더 높은 항산화 활성을 발휘하는 것으로 확인되었다. On the other hand, the antioxidant activity was analyzed for the general extraction and the nitrogen purge extraction. The experimental results are shown in Fig. As shown in FIG. 4, it was confirmed that the nitrogen purging extraction exhibited a higher antioxidative activity.

이상의 결과로부터, 질소퍼징추출이 일반추출에 비해 고형분 추출 수율 및 항산화 활성이 더 높은 추출물을 수득할 수 있는 방법임을 알 수 있었다. From the above results, it was found that the nitrogen purifying extraction is a method for obtaining an extract having higher solid extraction yield and antioxidant activity than general extraction.

[실시예 5: 반응표면분석법(RSM)을 통한 아세로라 열매로부터 비타민 C 최적 추출조건의 확립][Example 5: Establishment of Optimum Condition of Vitamin C Extraction from Acerola Fruit by Response Surface Analysis (RSM)] [

(1) 개요 (1) Overview

본 실시예에서는 질소퍼징추출물에 대해, 비타민 C 최적 추출 조건을 RSM으로 탐색하였다. In this example, for the nitrogen purifying extract, the vitamin C optimum Extraction conditions were searched by RSM.

(2) 비타민 C 추출의 최적 조건 확립 (2) Establishment of Optimum Conditions for Vitamin C Extraction

분산 분석Analysis of variance Factor¹⁾ Factor ¹⁾ DFDF Sum of SquaresSum of Squares F-valueF-value X1X1 1One 44.87244.872 157.79***²⁾ 157.79 *** ²⁾ X2X2 1One 4.524.52 0.170.17

1) X1: Process time (hr), X2: Temperature(℃)1) X1: Process time (hr), X2: Temperature (占 폚)

2)*Significant at p<0.05, **Significant at p<0.01,***Significant at p<0.0012) * Significant at p <0.05, ** Significant at p <0.01, *** Significant at p <0.001

2차 다항식의 회귀 계수의 측정Measurement of regression coefficients of second order polynomials ParameterParameter DFDF CoefficientCoefficient T-valueT-value P-valueP-value InterceptIntercept 1One 31.142231.1422 8.0768.076 0.0000.000 X₁ X ₁ 1One -1.8522-1.8522 -3.894-3.894 0.0060.006 X₂ X ₂ 1One -0.2018-0.2018 -1.199-1.199 0.2700.270 X₁X₁ X ₁ X ₁ 1One 0.07510.0751 5.6385.638 0.0010.001 X₂X₂ X ₂ X ₂ 1One 0.00230.0023 1.0641.064 0.3230.323 X₁X₂ X ₁ X ₂ 1One -0.0012-0.0012 -0.098-0.098 0.9250.925 R²=0.991R ² = 0.991

분석 결과, 상기 표 3~4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 비타민 C 추출 최적 조건은 2h, 25℃로 나타났고, 이론상 최적 수율은 24.0492%로 나타났다. As a result of the analysis, as shown in Tables 3 to 4 and FIG. 5, optimum conditions for vitamin C extraction were 2h and 25 ° C, and the theoretical yield was 24.0492%.

한편, 25℃의 온도에서 시간을 달리하면서 추출한 아세로라 추출물 내 비타민 C의 함량은 도 6에 나타났다. 도 6에서 보는 바와 같이 2시간 추출시 다른 시간에서 추출하는 것보다 비타민 C 함량이 가장 높게 나타났다. 25℃에서 2시간 추출시 질소를 주입하여 추출한 경우 추출물 내 비타민 C가 약 23 중량% 함유된 아세로라 추출물을 수득할 수 있었다. On the other hand, the content of vitamin C in the acerola extract extracted at different temperatures and at different temperatures at 25 캜 is shown in Fig. As shown in FIG. 6, the vitamin C content was the highest in the case of extracting 2 hours from the other times. When the extract was injected with nitrogen at 25 ° C for 2 hours, the extract of Aserora containing about 23% by weight of vitamin C in the extract could be obtained.

한편, 하기에서는 상기에서 확립한 질소주입추출 방법을 통해 수득한 아세로라 추출물을 가지고 여러 피부 기능성을 테스트해 보았다. 이때, 추출은 25℃에서 2시간 동안 수행한 것이다. Meanwhile, in the following, various skin functions were tested with the above-obtained acetone extract obtained through the nitrogen injection extraction method. At this time, extraction was carried out at 25 DEG C for 2 hours.

[실험예 1: 아세로라 열매 추출물이 세포 독성에 미치는 영향 측정][Experimental Example 1: Measurement of effect of acerola fruit extract on cytotoxicity]

본 발명에서 추출한 아세로라 열매 추출물에 세포독성이 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 세포 독성은 MTT 어세이를 이용하여 측정하였다. 배양된 세포를 DMEM 배지에 잘 혼합한 후 1x10⁵ cells/mL로 조정한 다음, 24-well 배양판에 준비된 세포를 1 mL씩 첨가한 후 3~4일 배양시켰다. 세포가 어느 정도 성장 했을 때, 우태아 혈청과 항생제를 첨가하지 않은 배지에 각 시료(0, 25, 50, 100, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)를 처리하고, 24시간 더 배양을 시켜 배양이 끝난 세포의 생존율을 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 각 well에 MTT 용액 5 mg/mL를 성장배지의 10분의 1 만큼 가해주고 다시 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 포르마잔(formazan)이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. 이후, 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후, DMSO를 이용하여 용해시킨 시료에 대해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 다음과 같이 계산하였다.The present inventors conducted an experiment to determine whether or not the acerola fruit extract extracted in the present invention is cytotoxic. Cytotoxicity was measured using an MTT assay. The cultured cells were mixed well in DMEM medium, adjusted to 1 × 10 ⁵ cells / mL, and the cells prepared in 24-well culture plates were added in 1 mL increments and cultured for 3-4 days. When cells were grown to a certain extent, each sample (0, 25, 50, 100, 300, 400, 500, 1000 μg / mL) was treated with medium containing no fetal bovine serum and antibiotics and cultured for another 24 hours The survival rate of cultured cells was measured by MTT reduction method. That is, 5 mg / mL of MTT solution was added to each well at a ratio of 1/10 of the growth medium, and further cultured at 37 ° C. for 4 hours to reduce the MTT. Formazan produced by the reduction of MTT Carefully removed. Thereafter, to completely remove the remaining medium, the sample was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the absorbance of the sample dissolved in DMSO was measured at 570 nm. The absorbance was measured by DMSO and the cell viability was calculated as follows.

실험결과는 하기 표 5와 같이 나타났다. 하기 표 5에서 보듯이, 대조군과 비교 시, 본 발명의 아세로라 추출물은 세포에 대한 독성이 없는 것으로 나타났다.The experimental results are shown in Table 5 below. As shown in Table 5 below, when compared with the control group, the acerola extract of the present invention was found not to be toxic to cells.

아세로라 열매 추출물의 세포 독성 실험Cytotoxicity test of acerola fruit extract Concentration
(w/v%)
SampleConcentration
(w / v%)
Sample 0.0050.005 0.010.01 ControlControl 100 ± 4.5100 ± 4.5 Acerola Fruits extractAcerola Fruits extract 99.8 ± 1.799.8 + 1.7 99.1 ± 0.999.1 ± 0.9

[실험예 2: 아세로라 열매 추출물의 DPPH 소거능 확인][Experimental Example 2: Identification of DPPH scavenging ability of acerola fruit extract]

본 실험예에서는 본 발명 아세로라 열매 추출물의 항산화력을 측정하고자 DPPH 소거능을 확인하였다.In this Experimental Example, DPPH scavenging ability was confirmed in order to measure the antioxidative power of the present invention extract of acerola fruit.

아세로라 추출물을 에탄올 또는 메탄올에 적정한 농도로 희석한 용액 2 ml와 0.2 mM DPPH(1,1-dipenyl-2-picrylhydrazyl) 2 ml씩을 균일하게 혼합하였다. 혼합용액을 실온에서 30분간 방치한 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 후, 하기 수학식 2에 따라 DPPH 라디칼 소거능을 계산하였다. 2 ml of the solution in which the acerola extract was diluted to a proper concentration in ethanol or methanol and 2 ml of 0.2 mM DPPH (1,1-dipenyl-2-picrylhydrazyl) were mixed uniformly. After the mixed solution was left at room temperature for 30 minutes, the absorbance was measured at 517 nm. After the absorbance was measured, the DPPH radical scavenging activity was calculated according to the following formula (2).

실험결과 도 7에서 보듯이, 아세로라 열매 추출물의 DPPH 소거능은 1, 0.5, 0.1mg/mL의 농도에서 각각 95.34, 95.34 및 45.21%로 확인되었다. 또한, 아스코르브산(Ascorbic Acid)와 아세로라 열매 최종추출물의 DPPH 비교시험 결과 최종추출물의 5배수의 농도에서 아스코르브산(Ascorbic Acid)와 비슷한 효과를 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 7, the DPPH scavenging ability of the acerola fruit extract was 95.34, 95.34 and 45.21% at the concentrations of 1, 0.5 and 0.1 mg / mL, respectively. In addition, DPPH test of Ascorbic Acid and Acerola fruit extract showed similar effects to Ascorbic Acid at 5 times the final extract concentration.

이상의 결과로부터, 본 발명 아세로라 열매 추출물에 우수한 자유 라디칼 (free radical) 제거능이 있음을 확인할 수 있었고, 항산화력이 있음을 확인할 수 있었다. From the above results, it was confirmed that the present invention had excellent free radical scavenging ability on the acerola fruit extract, and it was confirmed that there was antioxidant ability.

[실험예 3: 아세로라 열매 추출물의 총 페놀 (total polyphenol) 함량과 플라보노이드 함량 확인][Experimental Example 3: Determination of total polyphenol content and flavonoid content in acerola fruit extract]

본 실험에서 총 페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 아세로라 열매 추출물 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% Na²CO³용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음, 실온에서 1시간 정치한 후, 'spectrophotometer(UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)'를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid(Sigma Co., USA)를 0~100 ug/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다.In this experiment, total phenol contents were determined by adding 1 mL of Folin-Ciocalteau reagent and 10% Na ² CO ³ solution to each 1 mL of acerola fruit extract in the order of Folin-Denis method. After 1 hour at room temperature, the spectrophotometer (UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan) was used to measure the absorbance at 700 nm. Caffeic acid (Sigma Co., USA) was prepared at a concentration of 0 ~ 100 ug / mL and the total phenol content of the sample extract was calculated from the standard calibration curve obtained by the same method as the sample.

한편, 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법에 따라 추출물 0.5 mL에 10% 알루미늄나이트레이트(aluminum nitrate) 0.1 mL 및 1 M 포타슘아세테이트(potassium acetate) 0.1 mL, 에탄올(ethanol) 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합하고, 실온에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 'Quercetin(Sigma Co., USA)'를 표준물질로 하여 0~100 ㎍/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.On the other hand, 0.1 mL of 10% aluminum nitrate, 0.1 mL of 1 M potassium acetate, and 4.3 mL of ethanol were added to 0.5 mL of the extract in accordance with the method of Moreno et al. , Allowed to stand at room temperature for 40 minutes, and then absorbance was measured at 415 nm. The total flavonoid content of the extract was calculated from the standard calibration curve obtained from 0 to 100 μg / mL using 'Quercetin (Sigma Co., USA)' as a reference material.

하기 표 6에서 보듯이, 아세로라 열매 추출물의 총 페놀 함량은 90.37 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 3.76 mg/g으로 나타났다. 20여 종 약용식물류의 총 페놀과 플라보노이드 함량과 항산화 활성의 상관관계에서 폴리페놀의 함량이 플라보노이드보다 많을수록 항산화 활성이 높다고 보고한 결과와 유사한 결과로 나타났다. As shown in Table 6 below, the total phenol content of the acerola fruit extract was 90.37 mg / g and the total flavonoid content was 3.76 mg / g. The correlation between antioxidant activity and total phenol contents of 20 medicinal plants showed similar antioxidant activity to polyphenol contents more than flavonoids.

아세로라 열매 추출물의 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량Total Phenol Content and Total Flavonoid Content of Acerola Fruit Extract itemsitems ResultsResults 총 페놀 함량(mg GAE/g)Total phenol content (mg GAE / g) 90.37±0.4690.37 + - 0.46 총 플라보노이드 함량(mg RE/g)Total flavonoid content (mg RE / g) 3.76±1.373.76 ± 1.37

[실험예 4: 아세로라 열매 추출물의 환원력 측정][Experimental Example 4: Measurement of reducing power of acerola fruit extract]

아세로라 열매 추출물의 환원력은 Oyaizu의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 mL에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1% 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide)를 각 1 mL씩 차례로 가하여 교반한 후, 50℃의 수욕상에서 20분간 반응시켰다. 여기에 15% TCA(trichloroacetic acid) 용액을 1 mL 가하고, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상징액을 얻었다. 이렇게 얻은 상징액 1 mL에 증류수 및 염화 제2철(ferric chloride)을 각 1 mL를 가하여 혼합한 후, 700 mm에서 흡광도를 측정하였다. The reducing power of the acerola fruit extract It was measured according to Oyaizu's method. To 1 mL of the sample was added 200 mM phosphate buffer (pH 6.6) and 1% potassium ferricyanide in the order of 1 mL, and the mixture was stirred and reacted in a water bath at 50 ° C for 20 minutes. To this, 1 mL of 15% TCA (trichloroacetic acid) solution was added and centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant. To 1 mL of the resulting supernatant was added 1 mL of distilled water and ferric chloride, and the absorbance was measured at 700 mm.

실험 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 0.1, 10, 100 mg/mL의 농도에서 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명의 아세로라 열매 추출물은 환원력을 보유하고 있는 것으로 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 8, the results of the experiment showed a concentration-dependent increase at the concentrations of 0.1, 10 and 100 mg / mL. Therefore, it was confirmed that the acerola fruit extract of the present invention had a reducing power.

[실험예 5: 아세로라 열매 추출물의 아질산염 소거능 확인][Experimental Example 5: Determination of nitrite scavenging ability of acerola fruit extract]

아질산염 소거작용은 Gray와 Dugan의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 1 mM NaNO₂ 용액 1 mL에 일정 농도의 시료 1 mL를 가하고, 0.1 N HCl (pH 1.2)를 사용하여 pH를 1.2로 조정한 반응용액을 가해 총량을 10 mL로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 각 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 초산용액 5 mL, 그리스(Griess) 시약 0.4 mL를 가하여 잘 혼합시킨 다음, 실온에서 15분간 방치시킨 후 'UV-spectrophotometer'를 사용하여 520 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염량을 계산하였다. 공시험은 그리스(Griess) 시약 대신 증류수를 0.4 mL 가하여 동일하게 하였다. Nitrite scavenging activity was measured by the method of Gray and Dugan. That is, 1 mL of a 1 mM NaNO ₂ solution was added to 1 mL of a certain concentration, and the pH of the reaction solution was adjusted to 1.2 with 0.1 N HCl (pH 1.2) to make a total volume of 10 mL. This solution was reacted at 37 ° C for 1 hour, and then 1 mL of each reaction solution was taken. 5 mL of 2% acetic acid solution and 0.4 mL of Griess's reagent were added, mixed well, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, The absorbance at 520 nm was measured using a -spectrophotometer to calculate the amount of residual nitrite. Blank tests were performed by adding 0.4 mL of distilled water instead of the Griess reagent.

아질산염 소거작용은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율로써 하기 수학식 3과 같이 나타내었으며, 이 값이 큰 것일수록 아질산염 소거작용이 크다는 것을 의미한다.The nitrite scavenging activity is represented by the following equation (3) as the percentage of nitrite when the sample is added and when it is not added, which means that the larger the value, the greater the nitrite scavenging action.

실험결과는 도 9에서 보는 바와 같았고, 농도의존적으로 아질산염 소거능이 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명 아세로라 열매 추출물에 아질산염 소거능이 존재하는 것으로 확인할 수 있었다.The results of the experiment were as shown in FIG. 9, and it was confirmed that nitrite scavenging ability was increased in a concentration-dependent manner. Therefore, it was confirmed that nitrite scavenging ability was present in the fruit extract of Acerola according to the present invention.

[실험예 6: 아세로라 열매 추출물의 MMP-1 발현 저해 측정][Experimental Example 6: Measurement of inhibition of MMP-1 expression of acerola fruit extract]

본 실험에서는 아세로라 열매 추출물의 MMP-1 발현 저해 여부를 측정하고자 하였다.In this experiment, the inhibition of MMP-1 expression of the acerola fruit extract was examined.

CCD-986sk를 1.5×10⁵cells/㎖의 농도로 35 ㎜ dish에 약 80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다. UV 조사 전에 원래의 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거한 다음 UV등(Coralife, 35W, UV)에 필터를 이용하여 UVA(6. 3J/㎠)를 24시간 조사하였다. UVA 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 아세로라 열매 추출물을 0~1 ㎎/㎖의 농도별로 투여하여 24시간 동안 배양하였다. CCD-986sk was cultured in a 35 mm dish at a concentration of 1.5 × 10 ⁵ cells / ml until an 80% confluency was reached. Before the UV irradiation, the original medium was removed, and the serum component was removed by washing with PBS. UVA (6.3 J / cm 2) was irradiated for 24 hours using UV light filter (Coralife, 35W, UV). After UVA irradiation, acerola fruit extract was added to DMEM medium without FBS at 0 ~ 1 ㎎ / ㎖ concentration for 24 hours.

UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은 Dunsmore 등이 사용한 방법을 이용하여 실시하였다. UVA를 조사 후, 시료를 처리하여 24시간 배양한 배지를 96 well plate에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. TBS(phosphate bufferdsaline+0.05%Tween20)로 3회 세척하고 3% PBS로 37℃에서 1시간 동안 blocking 한 후, 1차 항체 (monoclonal anti-MMP-1 antibody)를 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 사용하여 1:3000으로 희석하여 처리하고 37℃에서 90분간 반응시켰다. PBS로 세척한 다음 2차 항체 (alkaline phosphatase conjugated Goat anti-mouse IgG)를 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 1:3,000으로 희석하여 처리하고, 37℃에서 90분간 반응시킨 후 PBS로 세척한 다음 알카라인포스파타제(alkaline phosphatase) 기질용액(1 ㎎/㎖,p-mitrophenylphosphate in diethanolamine buffer)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 3 N NaOH로 반응을 완전히 중지시킨 후, 'microplate reader'를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.The amount of MMP-1 expression induced by UVA irradiation was measured by Dunsmore et al. After irradiating with UVA, samples were treated and cultured for 24 hours. The medium was dispensed into a 96-well plate and reacted overnight at 4 ° C. The cells were washed three times with TBS (phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20) and blocked with 3% PBS at 37 ° C for 1 hour. Then, monoclonal anti-MMP-1 antibody was used as a blocking buffer Diluted 1: 3000, and reacted at 37 캜 for 90 minutes. After washing with PBS, the secondary antibody (alkaline phosphatase conjugated Goat anti-mouse IgG) was diluted 1: 3,000 in blocking buffer, treated at 37 ° C for 90 minutes, washed with PBS and then incubated with alkaline phosphatase (alkaline phosphatase) substrate solution (1 mg / ml, p-mitrophenylphosphate in diethanolamine buffer) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After the reaction was completely stopped with 3 N NaOH, absorbance was measured at 405 nm using a 'microplate reader'.

실험 결과, 도 10에서 보듯이, 농도 의존적으로 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명은 MMP-1의 발현을 억제하는 효능이 있는 것으로 확인할 수 있었고, 궁극적으로 피부 주름 개선 효능이 있는 것으로 확인할 수 있었다. As a result of the experiment, it was confirmed that the expression of MMP-1 was inhibited in a concentration-dependent manner, as shown in FIG. From this, it can be confirmed that the present invention has an effect of inhibiting the expression of MMP-1, and ultimately it has been confirmed that the present invention has an effect of improving skin wrinkles.

[실험예 7: 아세로라 열매 추출물의 콜라겐 생성효과 실험][Experimental Example 7: Experimental Effect of Collagen Production of Acerola Fruit Extract]

본 실험에서는 아세로라 열매 추출물의 콜라겐 생성효과를 실험하고자 하였다. In this experiment, the effect of acerola fruit extract on collagen production was examined.

섬유아세포를 48 well plate에 1×10⁴ cells/well의 밀도로 분주하고, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후, 아세로라 열매 추출물이 포함된 혈청이 없는 배지에서 24시간 추가 배양하였다. 배지 중에 유리된 프로콜라겐(procollagen)의 양은 'procollagen type I C-peptide EIA kit(MK101, Takara, Japan)'을 사용하여 측정하였다.Fibroblasts were seeded in 48-well plates at a density of 1 × 10 ⁴ cells / well, cultured in DMEM medium containing 10% FBS for 24 hours, and cultured for 24 hours in serum-free medium containing acerola fruit extract Respectively. The amount of procollagen liberated in the medium was measured using a procollagen type I C-peptide EIA kit (MK101, Takara, Japan).

실험결과, 도 11에서 보듯이, 본 발명 아세로라 열매 추출물의 처리에 의해 프로콜라겐의 함량이 증가하지는 않았다. As a result of the experiment, as shown in Fig. 11, the content of procollagen did not increase by the treatment of the present invention with the acerola fruit extract.

[실험예 8: 아세로라 열매 추출물의 티로시나아제 억제 효능 실험][Experimental Example 8: Effect of tyrosinase inhibitory effect of acerola fruit extract]

피부 내 미백효과를 측정하는 실험으로서 티로시나아제(tyrosinase) 억제효능을 도파크롬(dopachrome) 방법을 이용하여 측정하였다. 150 ㎕의 머쉬룸티로시나아제(mushroom tyrosinase)-150 unit, 225 ㎕의 2.5 mM L-tyrosine, 225 ㎕의 0.4 M 헤페스 버퍼(hepes buffer)(pH 6.8), 그리고 300 ㎕의 에탄올(ethanol) 용액 혹은 시료(1 ㎎/㎖)용액을 섞은 후, 배양 전과 15분간 배양을 한 후, 475 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하였다.As an experiment to measure whitening effect in the skin, tyrosinase inhibitory effect was measured using a dopachrome method. 150 μl of mushroom tyrosinase-150 units, 225 μl of 2.5 mM L-tyrosine, 225 μl of 0.4 M hepes buffer (pH 6.8), and 300 μl of ethanol, The solution or sample (1 mg / ml) solution was mixed and incubated for 15 minutes before and after incubation. Absorbance was measured at 475 nm.

아세로라 열매 추출물을 대상으로 티로시나아제 저해활성을 측정한 결과, 도 12에서 보듯이, 아세로라 열매 추출물 0.1, 1.0, 10 mg/mL에서 각각 20.1, 31.5 및 79.5%의 저해율을 나타냈다. 따라서, 본 발명 아세로라 열매 추출물에 우수한 티로시나아제 억제능이 있음을 확인할 수 있었고, 피부미백효능이 있는 것으로 확인할 수 있었다.As shown in Fig. 12, the inhibitory activity of tyrosinase inhibitory activity against the extracts of acerola fruit was 20.1, 31.5 and 79.5% at 0.1, 1.0 and 10 mg / mL, respectively, of the acerola fruit extract. Therefore, it was confirmed that the present invention has excellent tyrosinase inhibitory effect on the fruit extract of Acerola, and it can be confirmed that it has skin whitening effect.

[실험예 9: 아세로라 열매 추출물의 멜라닌 생성 억제 효능 실험][Experimental Example 9: Efficacy of melanin production inhibitory effect of acerola fruit extract]

쥐 유래 멜라노사이트(melanocyte)인 B-16 F1 세포는 멜라닌(melanin)을 생성한다. 멜라닌(Melanin)은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)내의 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 생합성되며, 이는 가시광선 영역대의 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교할 수 있다. Mouse-derived melanocytes, B-16 F1 cells, produce melanin. Melanin is biosynthesized in the melanosome, the organelle in the melanocyte present in the epidermal basal layer, which can be quantified by measuring the absorbance of the visible light region.

따라서, 본 발명에서는 B-16 F1 세포 접종 후 3일간 시료를 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 well당 1 ㎖의 1 N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 멜라닌(melanin) 성분을 녹여 나오게 하였다. 가시광선영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선영역인 400 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.Therefore, in the present invention, the sample is treated for 3 days after the inoculation of B-16 F1 cells, the medium is removed, the cells are washed with PBS, 1 ml of 1 N NaOH is added to each well, melanin. Absorbance was measured at 400 ㎚, which is the blue visible light region with the shortest wavelength of visible light.

실험 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 본 발명 아세로라 열매 추출물이 농도 의존적으로 멜라닌(melanin) 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명 아세로라 열매 추출물에 피부 미백 효능이 있음을 다시 한 번 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the fruit of the present invention inhibited the production of melanin in a concentration-dependent manner. From this, it was once again confirmed that the present invention has a skin whitening effect on the fruit extract of acerola.

[실험예 10: 아세로라 열매 추출물의 항염활성 측정][Experimental Example 10: Measurement of anti-inflammatory activity of acerola fruit extract]

(1) 세포배양 (1) Cell culture

마우스 유래 대식세포주 J774.1은 RPMI1640 배지를 Raw264.7은 DMEM 배지를 사용하였다. 세포를 10% FBS와 RPMI 1640 배지 또는 DMEM 배지에 배양하여 24 well plate에 4.5×10⁴cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가한 것과 첨가하지 않은 두 가지 군을 나누어 모두 37℃, 5% CO² 배양기에 48시간 동안 배양한 후, LPS(lipipilysaccharide)를 200 ng/well의 농도로 처리하여 일정시간 동안 세포를 배양하였다. Human Keratinocyte cell line인 HaCaT 세포를 (ATCC, USA) 10% FBS와 DMEM 배지에 배양하여 24 well plate에 4.5×10⁴cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가한 것과 첨가하지 않은 두 가지 군을 나누어 모두 37℃, 5% CO² 배양기에 48시간 동안 배양하였다.The mouse-derived macrophage cell line J774.1 was used for RPMI1640 medium and Raw264.7 for DMEM medium. Cells were cultured in 10% FBS, RPMI 1640 medium or DMEM medium and placed in a 24-well plate at a concentration of 4.5 × 10 4 cells / well. The cells were divided into two groups: ² incubator for 48 hours, LPS (lipipilysaccharide) was treated at a concentration of 200 ng / well, and cells were cultured for a certain period of time. Human Keratinocyte cell line HaCaT cells were cultured in 10% FBS and DMEM medium (ATCC, USA) and placed in a 24 well plate at a concentration of 4.5 × 10 4 cells / well. All were incubated at 37 ° C in a 5% CO ² incubator for 48 hours.

(2) 아세로라 열매 추출물의 NO 생성 측정 (2) Measurement of NO production of acerola fruit extract

상기에서 배양한 세포배양 상등액 100 ㎕을 채취하고, 여기에 동량의 그리스 시약을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후, 'microplate reader'를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 나이트라이트(Nitrite)의 표준물질로는 소듐나이트라이트(sodium nitrite)를 사용하였으며, 농도는 32 μM에서부터 0.25 μM까지 RPMI 1640 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.100 [mu] l of the cell culture supernatant cultured as described above was sampled, mixed with the same amount of a grease reagent, allowed to react for 15 minutes, and the absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader. Sodium nitrite was used as a standard material for Nitrite, and the concentration was calculated by comparing with the standard curve obtained by doubling the concentration from 32 μM to 0.25 μM in RPMI 1640 medium.

아세로라 추출물에 대한 염증 완화 효과를 확인하고자 Nitric oxide (NO) 생성량을 확인하였으며, 도 14에 나타내었다. 어떠한 샘플도 처리하지 않은 배지만 넣은 무처리 군에서 0.2 μM생성량을 보였고, LPS 처리 시에는 35.0 μM의 생성량으로 내독소인 LPS에 의해 NO의 생성이 다량 유발 된 것을 확인할 수 있었다. LPS 처리 후 아세로라 추출물을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명 아세로라 추출물이 항염증 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 피부자극은 염증 반응을 유발하는데, 본 발명 아세로라 추출물의 상기와 같은 항염 효과 확인으로부터, 피부자극 완화의 효능이 있는 것으로 추론할 수 있었다. The amount of nitric oxide (NO) produced was confirmed in order to confirm the inflammation mitigation effect on the acerola extract, and it is shown in Fig. In the untreated group treated with no sample, 0.2 μM was produced. In the LPS treatment, the amount of NO produced by the endotoxin LPS was increased to 35.0 μM. When the acerola extract was treated after the LPS treatment, it was confirmed that the NO production was decreased in a concentration-dependent manner. As a result, it was confirmed that the acerola extract of the present invention has an anti-inflammatory effect. Generally, skin irritation induces an inflammatory reaction. From the confirmation of the anti-inflammatory effect of the present invention as described above, it could be deduced that the effect of the skin irritation alleviation is effective.

(3) 아세로라 열매 추출물의 사이토카인(Cytokine) 생성 측정 (3) Cytokine production of acerola fruit extract

상기에서 배양한 마우스 대식세포주인 Raw264.7세포를 아세로라 열매 추출물을 이용하여 전처리한 후, 염증 유발물질인 1 μg/ml LPS를 처리하고, 일정시간이 지난 후 배지에 분비된 IL-6와 TNF-α의 양을 'Elisa detection kit (Life Technologies, USA)'를 사용하여 측정하였다. 사용된 ELISA kit들은 제조사가 추천하는 방법에 따라 실험을 진행하였으며, 모든 실험은 2반복으로 진행하고 농도는 'ELISA microplate reader'를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. The mouse macrophage cell line Raw264.7 cells cultured as described above was pretreated with acerola fruit extract, treated with 1 μg / ml LPS, which is an inflammation inducer, and IL-6 and TNF -α was measured using an Elisa detection kit (Life Technologies, USA). The ELISA kits were run according to the manufacturer's recommendations. All experiments were carried out in duplicate and the concentrations were measured at 450 nm using an 'ELISA microplate reader'.

TNF-α의 생성량 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 배지만 처리한 대조군(control)은 401.6 pg/ml의 생성량을, LPS 처리군은 1154.2 pg/ml의 생성량을 보였고, LPS 처리에 더해 본 발명의 샘플을 처리한 군 (1.0 mg/ml)에서는 TNF-α의 생성량이 986.3 pg/ml로 낮아짐을 확인할 수 있었다. The amount of TNF-α produced is shown in Table 7 below. In the control (control) treated group, the amount of production was 401.6 pg / ml, the LPS-treated group showed 1154.2 pg / ml, and in the group treated with the sample of the present invention (1.0 mg / ml) α production was reduced to 986.3 pg / ml.

IL-6의 생성량 결과는 표 8에 나타내었다. IL-6생성량을 확인하였을 때, 일반 배지만 처리한 대조군은 45.3 pg/ml의 생성량을 나타내었고, LPS 만 처리한 군은 1103.5 pg/ml의 생성량을 나타내었으며, LPS 처리에 더해 본 발명의 샘플을 처리한 군 (1.0 mg/ml)에서는 135.6 pg/ml로 낮아짐을 확인할 수 있었다.The amount of IL-6 produced is shown in Table 8. The amount of IL-6 produced was 45.3 pg / ml in control group, 1103.5 pg / ml in LPS-treated group, and the amount of IL- (1.0 mg / ml) was lowered to 135.6 pg / ml.

아세로라 열매 추출물의 TNF-α 감소 여부 Whether TNF-α is reduced in acerola fruit extract SampleSample 0.1 mg/ml0.1 mg / ml 1.0 mg/ml1.0 mg / ml 100 mg/ml100 mg / ml TNF-α
(pg/ml)
TNF-a
(pg / ml)
ControlControl 401.6±15.4401.6 ± 15.4 LPSLPS 1154.2±29.41154.2 ± 29.4 SAMPLESAMPLE 1013.1±17.21013.1 ± 17.2 986.3±21.5986.3 ± 21.5 453.2±14.8453.2 ± 14.8

아세로라 열매 추출물의 IL-6의 감소 여부 Reduction of IL-6 in acerola fruit extract SampleSample 0.1 mg/ml0.1 mg / ml 1.0 mg/ml1.0 mg / ml 100 mg/ml100 mg / ml IL-6
(pg/ml)
IL-6
(pg / ml)
ControlControl 45.3±11.245.3 ± 11.2 LPSLPS 1103.5±10.71103.5 + - 10.7 SAMPLESAMPLE 580.2±9.2580.2 ± 9.2 135.6±17.2135.6 ± 17.2 51.2±9.551.2 ± 9.5

[실험예 11: Real time PCR에 의한 유전자 발현 측정][Experimental Example 11: Measurement of gene expression by real time PCR]

마우스 대식세포주인 Raw264.7세포를 아세로라 열매 추출물을 이용하여 전처리한 후, 염증 유발물질인 1 ㎍/ml LPS를 처리하고 일정시간이 지난 후 세포에서 RNA를 분리하였다. RNA 분리는 'RNA isolation kit (Life Technologies, USA)'를 사용하여 제조사가 추천하는 방법에 따라 수행하였다. The mouse macrophage cell line, Raw264.7 cells, was pretreated with acerola fruit extract, treated with 1 ㎍ / ml LPS, which is an inflammation inducer, and RNA was isolated from cells after a certain time. RNA isolation was performed using the RNA isolation kit (Life Technologies, USA) as recommended by the manufacturer.

분리된 RNA 2 μg를 사용하여 'C-DNA Synthesis kit (Life Technologies, USA)'를 사용하여 제조사가 추천하는 방법에 따라 c-DNA를 준비하고 'QuantiTest SYBR green PCR kit(Qiagen, Kore)'를 사용하여 real-time PCR을 진행하였다. 선택된 유전자에 특이적인 프라이머를 선택하여 실험에 사용하였으며 그 프라이머의 염기서열은 하기 표 9와 같았다.Using c-DNA synthesis kit (Life Technologies, USA) using 2 μg of the separated RNA, c-DNA was prepared according to the manufacturer's recommendation, and QuantiTest SYBR green PCR kit (Qiagen, Korea) Real-time PCR was performed. A primer specific to the selected gene was selected and used in the experiment. The nucleotide sequences of the primers were as shown in Table 9 below.

프라이머의 염기서열The base sequence of the primer 유전자 종류Gene type sense primer센스 원어 anti-sense primeranti-sense primer Cox2Cox2 5'-CAAAAGCTGGGAAGCCTTCT-3'5'-CAAAAGCTGGGAAGCCTTCT-3 ' 5'-CCATCCTTGAAAAGGCGCAG-3'5'-CCATCCTTGAAAAGGCGCAG-3 ' iNOSiNOS 5'-GTTCTCAAGGCACAGGTCTC-3'5'-GTTCTCAAGGCACAGGTCTC-3 ' 5'-GCAGGTCACTTATGTCACTTATC-3'5'-GCAGGTCACTTATGTCACTTATC-3 ' c-Fos for AP-1c-Fos for AP-1 5'-AGAATCCGAAGGGAAAGGAA-3'5'-AGAATCCGAAGGGAAAGGAA-3 ' 5'-CTTCTCCTTCAGCAG GTTGG-35'-CTTCTCCTTCAGCAG GTTGG-3 hHMOX1hHMOX1 5'-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3'5'-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3 ' 5-'AAAGCCCTACAGCAA CTGTCG-3'5-'AAAGCCCTACAGCAA CTGTCG-3 ' hTrxR1hTrxR1 5 -ATGGGCAATTTATTGGTCCTCAC-3'5 -ATGGGCAATTTATTGGTCCTCAC-3 ' 5'-CCCAAGTAACGTGGTCTTTCAC-3'5'-CCCAAGTAACGTGGTCTTTCAC-3 ' GAPDHGAPDH 5 -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'5 -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 ' 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 ' InvolucrinInvolucrin 5'-CAAAGAACCTGGAGCAGGAG-3'5'-CAAAGAACCTGGAGCAGGAG-3 ' 5'-CAGGGCTGGTTGAATGTCTT-3'5'-CAGGGCTGGTTGAATGTCTT-3 '

모든 real-time PCR은 'ABI 7300 system (Applie Biosystems, USA)'을 이용하며 PCR amplification 조건은 95℃에서 15분간, 초기 변성(initial denaturation) 과정을 거친뒤, 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초의 과정을 40 cycle 반복하고, 마지막 연장(final extension) 과정으로 72℃에서 5분간 유지하였다.PCR amplification was performed at 95 ° C for 15 min and then at initial denaturation at 95 ° C for 15 sec and at 55 ° C for 15 min. 15 sec and 72 ° C for 30 sec were repeated 40 cycles and maintained at 72 ° C for 5 min in the final extension process.

실험결과, 도 15에서 보듯이, 농도 의존적으로 각각의 유전자의 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다. As a result of the experiment, as shown in FIG. 15, It was confirmed that the expression level of each gene was increased in a concentration-dependent manner.

[실험예 12: 아세로라 열매 추출물의 히알루로니다아제 활성 저해 효능 실험][Experimental Example 12: Experimental study on hyaluronidase inhibitory activity of acerola fruit extract]

피부 미백 효과와 함께 향장 활성의 중요한 요소 중 하나인 피부보호 효과를 알아보기 위하여 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제활성을 확인하였다. 히알루로니다아제(Hyaluronidase)는 피부 보습 및 탄력 유지에 기여하는 히알루론산(hyaluronic acid)의 분해효소로 피부면역에 관련된 것으로 알려져 있다. 따라서, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제 활성을 측정하여 아세로라 추출물의 히알루로니다아제(hyaluronidase) 저해활성을 비교하고자 하였다. The hyaluronidase inhibitory activity was confirmed in order to examine the effect of skin whitening and skin protection, which is one of the important factors of the flouractivation. Hyaluronidase is a hyaluronic acid degrading enzyme that contributes to skin moisturization and elasticity maintenance and is known to be involved in skin immunity. Therefore, the hyaluronidase inhibitory activity was measured to compare the hyaluronidase inhibitory activity of the acerola extract.

히알루로니다아제(hyaluronidase)활성 저해효능은 0.1 M 아세테이트버퍼(acetate buffer)(pH 3.5)에 녹인 히알루로니다아제(hyaluronidase) (77900 unit/ml) 50 ㎕에 시료를 최종 농도 0.2, 0.6, 1.0 mg/ml가 되도록 하여 20 ㎕씩 가하고, 효소의 활성화를 위해 12.5 mM의 CaCl₂200 ㎕를 혼합한 후 37℃ 수욕상에서 20분간 배양시켰다. 대조군은 DMSO용액을 넣고 수욕상에서 20분간 배양하였다. 활성화된 히알루로니다아제(hyaluronidase)용액에 0.1 M 아세테이트 버퍼(acetate buffer)(pH 3.5)에 녹인 히알루론산(hyaluronic acid)(12 mg/5 ml) 250 ㎕를 첨가하여 다시 수욕상에서 40분간 배양한 후, 0.4 N NaOH용액 100 ㎕와 0.4 M 포타슘테트라보레이트(potassium tetraborate) 100 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3분간 배양시킨 후 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 'dimethyl aminobenzaldegye 용액(p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350 ml, 10 N HCl 50 ml 혼합액)' 3.28 ml를 반응 혼합물에 첨가한 후, 37℃ 수욕상에서 20분간 배양하고 585 nm에서 흡광도를 측정한다. 저해율은 다음과 같이 계산하였다.The hyaluronidase activity inhibitory effect was evaluated by adding 50 μl of hyaluronidase (77900 unit / ml) dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 3.5) to a final concentration of 0.2, 0.6, 1.0 mg / ml, and 200 μl of 12.5 mM CaCl 2 was added to activate the enzyme, followed by incubation for 20 minutes in a water bath at 37 ° C. For the control, DMSO solution was added and incubated on a water bath for 20 minutes. 250 μl of hyaluronic acid (12 mg / 5 ml) dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 3.5) was added to the activated hyaluronidase solution, and the resultant was again cultured in a water bath for 40 minutes Then, 100 μl of 0.4 N NaOH solution and 100 μl of 0.4 M potassium tetraborate were added to the reaction mixture, which was incubated for 3 minutes in a boiling water bath, followed by cooling. 3.28 ml of 'dimethyl aminobenzaldehyde solution (4 g of p-dimethyl amino-benzaldehyde, 350 ml of 100% acetic acid and 50 ml of 10 N HCl)' was added to the reaction mixture, and the mixture was incubated for 20 minutes at 37 ° C in a water bath And the absorbance at 585 nm is measured. The inhibition rates were calculated as follows.

측정 결과, 도 16에서 보듯이, 추출물의 히알루로니다아제(hyaluronidase) 저해활성이 100 ㎎/㎖의 농도에서 42.3%으로 가장 높았으며, 농도 의존적으로 히알루로니다아제(Hyaluronidase) 활성 억제율은 증가 양상을 나타내었다.As shown in FIG. 16, the hyaluronidase inhibitory activity of the extract was the highest at 42.3% at a concentration of 100 mg / ml, and the inhibitory rate of hyaluronidase activity was increased in a concentration-dependent manner Respectively.

한편, 하기에서는 상기에서 확립한 질소주입추출 방법을 통해 수득한 아세로라 추출물과 일반추출 방법을 통해 수득한 아세로라 추출물의 기능성을 상호 비교해 보고자 하였다. 이때, 상기 두 방법의 추출은 모두 25℃에서 2시간 동안 추출한 것이다. 하기에서 '아세로라 추출물 A'는 질소퍼징추출 방법을 통해 수득한 아세로라 추출물이며, '아세로라 추출물 B'는 일반추출 방법을 통해 수득한 아세로라 추출물이다. In the following, the functions of the acerola extract obtained through the nitrogen injection extraction method established above and the acerola extract obtained through the general extraction method are compared with each other. At this time, the extraction of the above two methods was carried out at 25 ° C for 2 hours. In the following, 'Atheroma extract A' is the Atheria extract obtained through the nitrogen purge extraction method, and 'Atheroma extract B' is the Atheroma extract obtained through the general extraction method.

[실험예 13: 일반추출물과 질소퍼징추출물의 기능성 상호 비교][Experimental Example 13: Functional intercomparison of general extract and nitrogen purifying extract]

1. 미백 효능 비교 1. Whitening efficacy comparison

1) One) in vitro in vitro tyrosinase 활성 저해시험tyrosinase activity inhibition test

아세로라 추출물 A, 및 B를 멸균증류수에 각각 용해하여 준비하여 세포독성이 나타나지 않은 최대농도로부터 희석하여 준비하였다. 0.1 M 인산염완충액, 시료, 머쉬룸 티로시나제를 순차적으로 넣고 반응시켰다. 그 후, 1.5 mM 타이로신을 넣고 37℃에서 15분간 반응시켜 'ELISA reader'를 이용하여 490nm에서 흡광도 측정하였다. Acerola extracts A and B were each dissolved in sterilized distilled water and prepared, and diluted from the maximum concentration at which no cytotoxicity was observed. 0.1 M phosphate buffer, sample, and mushroom tyrosinase were sequentially added and reacted. Thereafter, 1.5 mM tyrosine was added thereto, followed by reaction at 37 ° C for 15 minutes. Absorbance was measured at 490 nm using an 'ELISA reader'.

아세로라 추출물의 티로시나제 활성 억제 시험결과는 도 17과 같았다. 도 17에서 보는 바와 같이 0.1% 처리 샘플의 경우, 본 발명의 질소퍼징추출물(도 17에서 아세로라 추출물 A)이 일반추출물(도 17에서 아세로라 추출물 B)에 비해 티로시나제 활성 억제 효과가 더 높은 것으로 나타났다. 한편, 아세로라 추출물 A의 경우, 티로시나제 활성을 억제하는 IC50 농도가 0.0835 %로 나타났으며, 아세로라 추출물 B의 경우, IC50 농도는 0.0967 %를 나타나, 질소퍼징추출물(아세로라 추출물 A)가 더 민감한 티로시나제 활성 억제 효과가 있는 것으로 확인할수 있었다. The results of inhibition of tyrosinase activity of the acerola extract were as shown in Fig. As shown in FIG. 17, the nitrogen purifying extract of the present invention (A.Asia A extract A in FIG. 17) showed a higher inhibitory effect on tyrosinase activity than the general extract (A.Asia B. extract B in FIG. 17). On the other hand, in the case of the acerola extract A, the IC50 concentration inhibiting the tyrosinase activity was 0.0835%, the IC50 concentration was 0.0967% in the case of the acerola extract B, and the nitrogen purifying extract (acerola extract A) exhibited the more sensitive tyrosinase activity Inhibitory effect.

2) 멜라닌 생성저해시험 2) Melanin formation inhibition test

마우스 유래 흑생종세포인 B-16 F1를 6 well plate에 1 x 10⁵ cells/well의 농도로 분주하고 24 시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후, PBS로 2회 세척한 다음 완전배지에 아세로라 추출물 A, 및 B를 농도별로 각각 처리하고 72시간 배양하였다. 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 2회 세척 후, M-per cell lysis buffer를 사용하여 세포용해하고, 세포용해물 회수하여 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 'Pierce BCA proteion assay kit'를 사용하여 단백질을 측정하였다. 70℃ 오븐에서 cell pellet 건조하여 건조된 cell pellet은 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 첨가하여 60℃ 항온수조에서 멜라닌을 추출하였다. 멜라닌 standard 이용하여 측정된 멜라닌 양은 측정된 단백질 양으로 보정하여 결과를 산출하였다.Mouse-derived melanoma cells, B-16 F1, were seeded at a density of 1 × 10 ⁵ cells / well in a 6-well plate and cultured for 24 hours. After the culture medium was removed, the cells were washed twice with PBS, and then each of the acerola extracts A and B was treated with the complete medium for 72 hours. Cells attached to the bottom were washed twice with PBS, lysed with M-per cell lysis buffer, and the cell lysate was recovered and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was collected and the proteins were measured using the Pierce BCA Protein Assay Kit. The cell pellet was dried in an oven at 70 ℃, and 1N NaOH containing 10% DMSO was added to the cell pellet. Melanin was extracted from the cell water at 60 ° C. The amount of melanin measured using the melanin standard was corrected to the amount of the measured protein and the result was calculated.

아세로라 추출물의 멜라닌 생성 억제 시험결과는 도 18과 같았다. 질소퍼징추출물 (도 18에서 아세로라 추출물 A)의 경우, 적용 농도 0.01 %, 0.05 %, 0.1 % 모두에서 통계적으로 유의한 멜라닌 생성 감소가 확인되었으며 (p<0.05), 0.05 % (0.5 mg/mL) 및 0.1 % (1 mg/mL) 농도에서는 대조군 대비 30% 이상 멜라닌 생성 감소가 확인되었다. The result of inhibition of melanin formation of the acerola extract was as shown in Fig. (P <0.05), 0.05% (0.5 mg / mL) of the nitrogen purge extract (A. acerola extract A in FIG. 18) And 0.1% (1 mg / mL) showed a decrease of melanin production by 30% or more of the control group.

Claims

A method for producing acerola extract, which comprises adding purified water as an extraction solvent to lyophilized powder of acerola fruit and purifying the mixture at a temperature of 23 to 28 ° C for 108 to 132 minutes under nitrogen purge.

The method according to claim 1,
The above-
Wherein the solid content is 55 to 57% by weight and the vitamin C is 22 to 24% by weight.

Which is extracted with nitrogen purging at a temperature of 23 to 28 占 폚 for a period of 108 to 132 minutes by adding purified water to the lyophilized powder of acerola fruit. The solid content is 55 to 57% by weight, the vitamin C is 22 to 24% by weight % Acerola extract.

A cosmetic composition for preventing skin aging containing the acerola extract of claim 3.

A cosmetic composition for preventing skin wrinkles containing the acerola extract of claim 3.

A cosmetic composition for skin whitening comprising the acerola extract of claim 3.

A cosmetic composition for relieving skin irritation containing the acerola extract of claim 3.