KR20190069328A

KR20190069328A - 결핵진단용 조성물 및 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법

Info

Publication number: KR20190069328A
Application number: KR1020180158404A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 전선아; 박찬영; 김은주
Original assignee: 주식회사 딕스젠
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2019-06-19
Also published as: CN111465856A; KR102098030B1

Abstract

본 발명은 결핵진단용 조성물 및 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법에 관한 것이다.
상기 결핵 진단방법은 (a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 (b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체의 광학적 특성 변화에 기반한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 광학적 특성의 변화에 기반한 결핵 진단방법은 금속나노입자 및 형광나노물질의 형광세기 변화를 이용하므로 낮은 검출한계를 갖는 결핵을 신속하고, 정확하게 측정할 수 있다.

Description

결핵진단용 조성물 및 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법 {Composition for Tuberculosis Diagnosis and Diagnostic Method for Tuberculosis based on Optical Properties}

본 발명은 결핵진단용 조성물 및 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법에 관한 것이다.

일반적으로 결핵은 우리나라 법정전염병 중 발병률 1위로, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 감염으로 유발되는 질병이다. 그래서, 결핵에 감염된 것으로 의심되는 환자로부터 단기간 내에 신뢰할 수 있는 정보를 얻을 수 있는 조기 진단 및 치료가 무엇보다 중요하다.

결핵을 진단하기 위한 통상적인 방법으로는 튜베르쿨린 피부반응검사(Tuberculin skin test, TST)법이 있으나, 특이성이 낮아 결핵진단에 있어 낮은 신뢰도를 가진다. 그러나 민감도가 높고 저렴하다는 장점으로 여전히 널리 사용되고 있다. 배양법 또한 많이 사용되고 있는데, 이는 다양한 결핵 진단방법 중 신뢰도가 가장 높은 검사법으로, 결핵균을 배양시켜 결핵 유무를 판단하는 방법으로, 결핵 확진여부를 판단할 수 있는 최적 표준법으로 많이 사용되고 있다. 그러나 균을 분리하여 배양하기 때문에 실험자의 감염 위험성을 배제할 수 없으며, 균을 배양하는 데에 걸리는 시간이 최소 4~6주 소요되어 조기진단 할 수 없다는 단점이 있다.

최근에는 액체 배지를 이용한 BACTEC 시스템 또는 MGIT(Mycobacteria Growth Indicator Tube)법이 시행되고 있다. 이러한 방법은 액체 배지를 이용함으로써 배양기간을 단축시켜, 약 2주 정도면 결핵균의 증식을 확인할 수 있지만 비정형 결핵균과 감별하기 위한 추가 확진 시험이 필요한 단점이 있다. 또한 방사선 동위원소 사용에 따른 폐기물 처리문제, 결핵균의 감염우려, 고가의 장비 필요 등의 문제점이 있다.

결핵 진단법 중 분자진단법은 결핵균 DNA를 추출한 다음 결핵균 존재여부를 확인하는 방법으로서, 객담도말검사나 배양검사의 보조적인 진단방법으로 이용되고 있다. 한국 등록특허 제1794212호는 결핵균 검출 및 결핵 진단에 사용되는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 및 키트를 개시하였고, 한국등록특허 제1765677호는 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법을 개시하였으나, 분자생물학적 방법은 현장에서 즉시 진단할 수 없다는 문제점이 있다.

항원-항체 결합을 기반으로 하는 면역센서를 이용해서도 결핵을 진단할 수 있다. 항원에 대한 항체의 특이결합에 때문에 항체는 특히 바이오마커를 검출하기위해 면역센서의 표면 등에 고정되어 이용된다. 한국등록특허 제1700891호는 CFP-10 및 ESAT-6 융합 단백질을 포함하는 결핵 진단용 항원조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2017-0011200호는 결핵의 혈청학적 진단을 위한 결핵균 특이 항원의 조합을 포함하는 결핵균 특이 항원의 융합 단백질 조성물을 개시하였다.

한편, 양자점은 광안정성이 우수하고 실시간으로 연속적인 모니터링이 가능하기 때문에 바이오센서 분야에서도 매력적인 물질이다. 그러나 소수성에서 친수성 형태로 전환되거나 다른 물질과 포접 시 광발광성 양자 수율이 상당히 감소되므로 바이오센서 분야에의 적용이 제한되어 왔다. 최근에는 양자점이 양자점과 수용체 분자 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET)를 위한 전자 공여체로 사용되는 일부 표적 분석물에 대한 센서를 개발하는데 연구가 집중되고 있다.

또한, 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticles: UCNPs)는 화학적으로 안정하고 소광이 없으며, 생화학적으로 많이 사용되고 있는 양자점과는 달리, 최대 발광 파장이 크기-의존이 아니며, 호스트 결정과 희토류 (Rare earth) 도핑물질을 변화시켜 쉽게 다중 색 발광을 할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 UCNPs는 유동 세포계측법(flow cytometry), 광역학 요법(photodynamic therapy), 진단 등에 활용되고 있으며 면역분석법과 유전자 분석 같은 생물학적 분석에서 발광 표지로 사용되고 화학적 감지/세포의 영상화에도 활용되고 있다.

하지만, 아직까지 형광나노물질-항체 복합체의 광학적 특성변화에 기반하여 결핵을 진단하는 기술은 개발되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체의 광학적 특성 변화에 따라 결핵을 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 결핵의 발병 유무를 간단하고 정확하게 판단할 수 있는 결핵 진단용 조성물 및 진단방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 (b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 (b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체의 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금속나노입자-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계; (b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[금속나노입자-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계; (b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 자성나노물질-항체 복합체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; (b) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]에 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]를 자기 분리법으로 분리한 다음, 분리된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값을 측정하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 CFP10, Ag85B 및 LAM으로 구성된 군에서 선택되는 결핵균 항원과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 금속나노입자는 자성나노입자, 은나노입자 및 금나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 형광나노물질은 상향전환나노입자, 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 및 산화그래핀 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 광학적 특성의 변화에 기반한 결핵 진단방법은 금속나노입자 및 형광나노물질의 형광세기 변화를 이용하므로 낮은 검출한계를 갖는 결핵을 신속하고, 정확하게 측정할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 [상향전환나노입자-항체 복합체]-[결핵 항원]-[양자점-항체 복합체]의 설명도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 [상향전환나노입자-항체 복합체]-[결핵 항원]-[산화그래핀 양자점-항체 복합체]의 설명도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 [상향전환나노입자-항체 복합체]-[결핵 항원]-[금나노입자-항체 복합체]의 설명도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 [상향전환나노입자-항체 복합체]-[결핵 항원]-[자성나노입자-항체 복합체]의 설명도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵균 특이 항원 CFP10과 이에 대한 항체 G2와 G3 항체를 발현하여 SDS-PAGE와 Western blot 분석으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 금나노입자의 TEM 사진 (A), 평균 입도 (B) 및 전하 (C)를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금나노입자 및 금나노입자-G2 항체 복합체의 흡광스펙트럼 (A)과 FT-IR (B) 측정 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 일련의 상향전환나노입자 및 결핵항체 G3 고정화된 입자 복합체를 분석한 SEM (A) 과 FT-IR (B) 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP) 및 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3)의 상향전환 형광을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 상향전환나노입자-G3 항체 복합체 및 금나노입자-G2 항체 복합체의 CFP10 항원의 검출한계를 분석한 결과이다.

본 발명에서는 결핵균 분비항원에 대한 항체가 결합되어 있는 형광나노물질과 금속나노입자를 이용할 경우, 광학적 특성 변화를 기반으로 하여 결핵을 신속하고 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 자성나노입자와 금나노입자를 이용한 금속나노입자-항체 복합체와 상향전환나노입자를 이용한 형광나노물질-항체 복합체를 각각 제조한 다음, 결핵 항원을 함유하는 생물학적 시료와 반응시킨 후의 광학적 특성 변화를 기반으로 결핵여부를 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 (a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 (b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체를 포함하는 결핵 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 항체는 결핵균 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 특별한 제한없이 이용할 수 있으나 CFP10, Ag85B, LAM 등을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 금속나노입자는 자성나노입자, 은나노입자, 금나노입자 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 직경은 약 5 nm 내지 약 200 nm인 것이 바람직하다.

상기 형광나노물질은 상향전환나노입자(Upconversion Nanoparticle, UCNP), 양자점(Quantum Dot), 양자나노막대(Quantum Nanorod), 양자나노선(Quantum Nanowire), 산화그래핀 양자점(Graphene Oxide Quantum Dot) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 다른 관점에서 (a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는 (b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체의 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법에 관한 것이다.

상기 결핵 진단방법에 있어서, 결핵 진단은 결핵균 특이 항원의 양에 따라 달라지는 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체 또는 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금속나노입자-항체복합체간 간의 결합량에 따라 비례 또는 반비례적으로 발생하는 광학적 특성변화를 기준으로 결정할 수 있다.

즉, (1) 자성나노입자와 상향전환나노입자를 이용할 경우, 항원의 농도에 따라 증가하는 형광세기를 통하여 결핵여부를 확인할 수 있고, (2) 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 또는 산화그래핀 양자점과 상향전환나노입자를 이용할 경우, 상향전환나노입자의 형광을 방출하는 파장과 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 또는 산화그래핀 양자점의 형광을 흡수하는 파장의 공명으로 인해 상향전환 나노입자의 형광을 흡수하여 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 또는 산화그래핀 양자점의 증가하는 형광세기를 통하여 결핵여부를 확인할 수 있으며, (3) 금나노입자 또는 은나노입자와 상향전환나노입자를 이용할 경우, 상향전환나노입자의 형광을 금나노입자 또는 은나노입자가 흡수하여 형광세기가 증가하거나 감소하는 광학적 신호를 통하여 결핵여부를 확인할 수 있다.

예를 들어, 금나노입자는 입자의 크기 및 형태에 따라 흡수파장이 다르지만 일반적으로 550 nm의 흡수 파장을 갖고, 상향전환나노입자는 980 nm에서 여기(excitation)되고, 550 nm 및 660 nm에서 형광을 나타낸다. 따라서, 1차 항체가 결합된 상향전환나노입자-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금나노입자-항체복합체에 결핵 항원을 포함하는 생물학적 시료를 반응시키면, 결핵 항원을 매개로 하여 상향전환나노입자와 금나노입자의 거리가 가까워지게 되고, 그 결과 550 nm의 형광세기가 감소하게 된다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금속나노입자-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계; (b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[금속나노입자-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법에 관한 것이다.

또 다른 예로서, 양자점은 입자의 크기 및 형태에 따라 흡수파장이 다르지만 일반적으로 550 nm의 흡수 파장을 갖고, 흡수파장에 따라 형광을 나타내는 파장이 달라지며, 정해진 흡수파장 외의 파장에서는 형광이 방출되지 않는 특성이 있으며, 상향전환나노입자는 980 nm에서 여기(excitation)되고, 550 nm 및 660 nm에서 형광을 나타낸다. 따라서, 1차 항체가 결합된 상향전환나노입자-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 양자점-항체복합체에 결핵 항원을 포함하는 생물학적 시료를 반응시키면, 결핵 항원을 매개로 하여 상향전환나노입자와 양자점의 거리가 가까워지게 되고, 양자점의 흡수파장이 아닌 상향전환나노입자의 흡수파장을 가하게 되면 형광세기가 증가하게 된다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계; (b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법에 관한 것이다.

또 다른 예로서, 자성나노입자는 자석에 의하여 끌리는 특성이 있으며, UV/Vis 범위에서 특별한 흡수파장이 없으며, 상향전환나노입자는 980 nm에서 여기(excitation)되고, 550 nm 및 660 nm에서 형광을 나타낸다. 따라서, 1차 항체가 결합된 상향전환나노입자-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 자성나노입자-항체복합체에 결핵 항원을 포함하는 생물학적 시료를 반응시키면, 결핵 항원을 매개로 하여 상향전환나노입자와 자성나노입자가 결합하게 되고, 자석을 이용하여 분리 후 세척하는 과정을 반복할 경우, 자성나노입자에 포집된 상향전환나노입자만 남게 된다. 따라서, 결핵 항원을 반응시키기 전 형광을 측정한 결과와 결핵 항원을 반응시킨 후 자석을 이용하여 분리 및 세척 후 형광을 측정함으로써 줄어드는 형광세기를 측정하는 음성 검출방법 또는 결핵 항원을 반응시킨 후 자석을 이용하여 분리 및 세척 후 상향전환나노입자의 형광을 측정하는 양성 검출방법으로 결핵을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 자성나노물질-항체 복합체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; (b) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]에 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체를 반응시키는 단계; 및 (c) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]를 자기 분리법으로 분리한 다음, 분리된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값을 측정하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 결핵균 특이 항원 CFP10과 이에 대한 재조합 항체 G2 및 G3의 제조

한국등록특허 제1631054호를 참조하여, 실시예에 사용할 결핵항원 CFP10과 이와 결합과 할 수 있는 2종의 Group 2 (G2)와 Group 3 (G3) 항체 유전자를 대장균에서 발현하고 분리정제하여 준비하였다.

이를 위하여, 컨트롤 벡터 pET22, CFP10 항원 발현 벡터 pET22-CFP10, G2 항체 발현 벡터 pET22-GBP-CFP10G2, G3 항체 발현 벡터 pET22-CFP10G3를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다. 각 균주를 100 ml LB (1%(w/v) tryptone, 1% NaCl, 0.5% Yeast extract)+ampicillin 배지에서 37℃에서 OD 0.4까지 배양하고, 0.1 mM IPTG를 넣어 단백질 발현시키고 6시간동안 배양한 후 균주들을 원심분리 (3,500 rpm, 4℃, 10분)하여 회수하였다.

배양한 균주는 lysis (50 mM sodium phosphate (pH 7.5), 5% (w/v), 50 mM NaCl) 버퍼에서 소니케이션으로 파쇄한 후, 원심분리 (15,000 g, 4℃, 10분)하여 단백질을 얻었고, SDS-PAGE와 Western blot analysis를 통해 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 재조합 CFP10 항원과 G2 (GBP-CFP10G2) 및 G3 (CFP10G3) 항체의 발현을 확인할 수 있었다.

상기에서 발현한 재조합 CFP10 항원과 항체는 6x-His tag을 가지고 있으므로, HisTrap FF컬럼과 FPLC(GE Healthcare)를 이용하여 정제하여 다음 실험에 사용하였다.

실시예 2. 결핵균 특이 항원 CFP10에 대한 "금속나노입자-항체 복합체" 및 "형광나노물질-항체 복합체"의 제조

2-1: 금속나노입자-항체 복합체 제조

2-1-1: 자성나노입자-항체 복합체 제조

2-1-1-1: 자성나노입자의 아민 작용기 치환

1 mL의 APTES 용액에 9 mL의 메탄올을 넣어 잘 섞어준 뒤, 10 mg의 자성나노입자를 넣고 초음파 분쇄기로 분산시킨 후, 17시간 동안 교반하며 표면에 아민 작용기가 생기도록 하였다. 이후 자석을 이용해 자성나노입자를 모은 후 상등액을 버리고, 1회 세척당 10 mL의 메탄올과 자석을 이용해 3회 세척하여 아민 그룹으로 치환된 자성나노입자를 제조한 후 4℃에 보관하였다.

2-1-1-2: 자성나노입자-G2 항체 복합체 제조

아민 그룹으로 치환된 자성나노입자를 8 mL의 glutaraldehyde 용액 (pH 7.4)에 분산시킨 후 1시간동안 교반하였다. 이후 자석을 이용해 자성나노입자를 모은 후 상등액을 버리고, 1회 세척당 10 mL의 10 mM의 PBS(pH 7.4)용액과 자석을 이용해 3회 세척한 뒤, 2 mL의 10 mM PBS(pH 7.4)용액에 분산시켰다. glutaraldehyde로 활성화된 자성나노입자 용액 1 mL당 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 실시예 1에서 준비한 결핵항원 CFP10과 결합할 수 있는 G2 항체를 첨가하여 상온에서 14시간 동안 가볍게 흔들면서 반응시켰다. 이후 자석을 이용해 자성나노입자를 모은 후 상등액을 버리고, 1회 세척당 10 mL의 10 mM의 PBS(pH 7.4)용액과 자석을 이용해 3회 세척한 뒤, PBS에 용해시킨 0.5% 카제인(casein)을 첨가하여 30분 동안 블록킹 반응시켜 자성나노입자-G2 항체 복합체를 제조하고, 4℃에서 보관하였다.

2-1-2: 금나노입자-항체 복합체 제조

2-1-2-1. 금나노입자의 제조

실시예에 사용한 금나노입자 (AuNP)는 HAuCl₄의 citrate reduction 법으로 합성하였다. 100 ml의 1 mM HAuCl₄ 용액을 reflux에서 격렬하게 교반하면서, 용액의 온도가 90℃에 도달하면 10 ml의 38.8mM trisodium citrate dihydrate를 빠르게 첨가하고 동일한 온도에서 15 분간 반응시켰다. 용액이 짙은 보라색에서 진한 빨간색으로 즉시 바뀌면서 분산된 금나노입자가 합성되면, 반응용액을 아이스에서 급속히 식히고, 사용전 까지 4℃에서 보관하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 합성된 금 나노입자의 형상을 TEM으로 관찰하였고 평균적으로 15 nm 정도의 지름을 갖는 금 나노입자들이 합성되었으며 음 전하를 띠고 있음을 확인하였다.

2-1-2-2: 금나노입자-G2 항체 복합체 제조

2-1-2-1에서 제조된 1 mL 금나노입자를 DI로 2회 세척하고, 0.5 mM K₂CO₃ 용액으로 pH 9.0으로 적정하였다. 금나노입자의 안정성을 증대시키기 위해서 25 μL의 10%(w/v) PEG8000을 첨가하였다. 그리고, 실시예 1에서 준비한 6 ml의 300 ug/ml G2 (GBP-CFP10G2) 항체를 첨가하고, 부드럽게 교반하면서 2 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 제조된 금나노입자-G2 항체 복합체는 원심 분리 (13,000 rpm, 4℃, 30 분)와 세척을 2회 반복한 후, TBST 버퍼 (0.5% Tween 20)에 현탁하여 사용 전까지 4℃에 보관하였다.

금나노입자(AuNPs)와 제조된 금나노입자-G2 항체 복합체(AuNPs@GBP-CFP10G2)의 흡광스펙트럼과 FT-IR을 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 도시한 바와 같이, 2-1-1-1에서 금나노입자(AuNP)와 제조된 금나노입자-G2 항체 복합체(AuNP@GBP-CFP10G2)는 550nm대의 동일한 흡수파장을 갖는다는 것을 알 수 있었고, FT-IR 스펙트럼을 통하여 G2 항체가 각각 제대로 결합되어 표면처리가 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

2-2: 형광나노물질-항체 복합체 제조

2-2-1: 상향전환나노입자 제조

0.2 M Ln (NO₃)₃xH₂O (Ln: Y³⁺, Yb³⁺, Er³⁺)을 0.2 M 시트르산 나트륨과 30 분 동안 격렬히 교반하면서 혼합하였다. 그리고, 3 ml 초순수(DI), 22.5 ml 에탄올 및 150 mg CTAB을 차례로 교반하면서 용액에 첨가 하였다. 1.0 M NaF를 적가하고 생성된 용액을 실온에서 2 시간 동안 강하게 교반하면서 결정 핵(crystal nuclei)을 형성시켰다. 다음으로, 1.5 mL 질산을 첨가하고, 혼합 용액을 23 mL Teflon-lined autoclave로 옮기고 180℃에서 8 시간 반응시켰다. 생성된 상향전환나노입자(UCNPs)는 20 분 동안 원심분리하여 수집하고 에탄올과 초순수(DI) (1:1, v/v)로 세척 한 후 dry 오븐에서 60℃로 건조시켰다.

카복실 그룹이 있는 50 mg Poly(acrylic acid) (PAA, MW = 1800)을 9 mL 초순수(DI)에 넣고, 0.2M NaOH를 사용하여 pH 8로 적정한 다음, 1 mL UCNP 분산액을 적가하고, 생성된 용액을 추가로 5 시간 동안 교반 하였다. 분산액을 10mL DEG에 용해시키고, 105℃에서 1 시간 동안 교반하여 물을 제거하였다. 마지막으로, 혼합물을 23 mL Teflon-lined autoclave로 옮기고 160℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 입자를 원심 분리에 의해 수집하고, 초순수(DI) 및 에탄올 (1:1, v/v %)로 세척하고, 건조 공기 오븐에서 60 ℃에서 건조시켜, 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP)를 제조하였다.

제조된 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP)의 형상을 TEM으로 확인하고, 평균 입자크기를 확인하고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다.

도 8A에 나타난 바와 같이, 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP)의 평균 지름은 약 57 nm인 것을 확인하였다.

2-2-2: 상향전환나노입자-항체 복합체 제조

200 mg EDC와 200 mg sulfo-NHS를 5 mL의 MES buffer에 녹인 후, 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP) 1 mL을 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 이후 원심분리기를 이용해 13,000 rpm, 5분의 조건으로 3회 MES buffer를 이용해 세척을 한 뒤, 5 mL의 HEPES buffer에 초음파분쇄기를 이용해 분산시켰다. 이어서 최종 상향전환나노입자 용액 1 mL당 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 실시예 1에서 제조된 결핵항원 CFP10과 결합할 수 있는 G3 항체를 첨가한 뒤 17시간 동안 상온에서 교반하며 반응시켜, 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3)를 제조하였다. 반응 이후 원심분리기를 이용해 13,000 rpm, 5분의 조건으로 10 mM PBS buffer (pH 7.4)를 이용해 3회 세척한 후 4˚C에서 보관하였다.

제조된 상향전환나노입자(UCNP), 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP) 및 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3)의 FT-IR을 측정하였고, 그 결과를 도 8B에 나타내었다.

도 8B에 나타난 바와 같이, 상향전환나노입자 (UCNP)에 카복실 그룹 및 G3 항체가 각각 제대로 결합하여 표면처리가 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

또한, 상향전환나노입자의 광학적 특성을 확인하기 위하여, 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP) 및 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3)를 980 nm에서 여기(excitation)시킨 후, 400~800 nm까지의 영역을 emission scanning하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 카복실 그룹으로 처리된 상향전환나노입자(PAA-UCNP) 및 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3) 모두 약 550 nm와 660 nm의 파장 영역에서 형광 파장을 관찰할 수 있었다. 따라서, 상향전환나노입자-G3 항체 복합체(UCNP@CFP10G3)는 상향전환나노입자의 광학적 특성을 그대로 보유하고 있으므로, 이 특성을 이용하여 결핵균 진단에 활용할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. "금속나노입자-항체 복합체" 및 "형광나노물질-항체 복합체"를 이용한 결핵균 검출

3-1: 자성나노입자-항체 복합체와 상향전환나노입자-항체 복합체를 이용한 TB 검출

2-2-2에서 제조된 상향전환나노입자-G3 항체 복합체 0.5 mL과 2-1-1-2에서 제조된 자성나노입자-G2 항체 복합체 0.3 mL을 1.5 mL 마이크로튜브에 넣은 뒤 잘 섞었다. 이후 결핵 항원(CFP-10)이 들어있는 용액 0.05 mL을 넣고 30분간 상온에서 가볍게 흔들며 반응시킨 후, 자석을 이용해 결핵 항원에 의해 결합된 상향전환나노입자-자성나노입자 및 결합되지 않은 자성나노입자를 모은 후 상등액을 버리고, 1회 세척당 3 mL의 10 mM의 PBS(pH 7.4)용액과 자석을 이용해 3회 세척한 뒤 980 nm의 광원을 조사하여 발생하는 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과, 상향전환나노입자-G3 항체 복합체와 자성나노입자-G2 항체 복합체를 사용했을 때, R²는 0.9914로 매우 높은 신뢰성을 가지고 있으며, 타깃 결핵 항원 CFP-10을 2.68 pg/mL의 검출한계로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

3-2: 금나노입자-항체 복합체와 상향전환나노입자-항체 복합체를 이용한 TB 검출

2-2-2에서 제조된 상향전환나노입자-G3 항체 복합체 0.5 mL과 2-1-2-2에서 제조된 금나노입자-G2 항체 복합체 0.3 mL을 1.5 mL 마이크로튜브에 넣은 뒤 잘 섞었다. 해당 상태에서 980 nm의 광원을 조사하여 발생하는 형광의 세기를 측정해 기록하였다. 이후 결핵 항원(CFP-10)이 들어있는 용액 0.05 mL을 넣고 30분간 상온에서 가볍게 흔들며 반응시킨 후, 980 nm의 광원을 재조사하여 결핵 항원의 농도에 따라 감소한 상향전환나노입자의 형광의 세기를 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10으로 부터, 상향전환나노입자-G3 항체 복합체와 금나노입자-G2 항체 복합체를 사용했을 때, R²는 0.9922로 매우 높은 신뢰성을 가지고 있으며, 타깃 결핵 항원 CFP-10을 1.80 pg/mL의 검출한계로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는
(b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체를 포함하는 결핵 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항체는 CFP10, Ag85B 및 LAM으로 구성된 군에서 선택되는 결핵균 항원과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 금속나노입자는 자성나노입자, 은나노입자 및 금나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 형광나노물질은 상향전환나노입자, 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 및 산화그래핀 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 조성물.
(a) 형광나노물질-항체 복합체와 형광나노물질-항체 복합체 또는
(b) 형광나노물질-항체 복합체와 금속나노입자-항체 복합체의 광학적 특성 변화에 기반한 결핵 진단방법.
제5항에 있어서, 상기 항체는 CFP10, Ag85B 및 LAM으로 구성된 군에서 선택되는 결핵균 항원과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단방법.
제5항에 있어서, 상기 금속나노입자는 자성나노입자, 은나노입자 및 금나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단방법.
제5항에 있어서, 상기 형광나노물질은 상향전환나노입자, 양자점, 양자나노막대, 양자나노선 및 산화그래핀 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단방법.
제5항에 있어서, 결핵 진단은 결핵균 특이 항원의 양에 따라 달라지는 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체 또는 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금속나노입자-항체복합체간 간의 결합량 및 이로 인한 광학적 특성변화를 기준으로 결정하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단방법.
(a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 금속나노입자-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계;
(b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및
(c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[금속나노입자-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법.
(a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체와 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체복합체가 포함된 결핵 진단용 조성물의 형광 값을 측정하는 단계;
(b) 형광 값이 측정된 결핵 진단용 조성물에 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및
(c) 형성된 [형광나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값 변화를 확인하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법.
(a) 마이코박테리아 유래 결핵 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 1차 항체가 결합된 자성나노물질-항체 복합체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계;
(b) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]에 2차 항체가 결합된 형광나노물질-항체 복합체를 반응시키는 단계; 및
(c) 형성된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]를 자기 분리법으로 분리한 다음, 분리된 [자성나노물질-항체 복합체]-[결핵 항원]-[형광나노물질-항체 복합체]의 형광 값을 측정하는 단계를 포함하는 결핵 진단방법.