KR20190068411A - 팥 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
팥 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 손상된 근육 세포에 미치는 영향을 확인한 것으로, 상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드는 투여 시 손상된 근육에서 근육 위성세포의 활성화를 촉진시켰으므로 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물과 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 팥 추출물을 포함하는 근육 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 손상 근육 재생용 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물에 관한 것이다.
근육(Muscle)이란 중배엽의 줄기세포가 발달되어 생성된 조직으로써 근육세포(myoblast)들의 결합(fusion)으로 이루어진 근섬유(myofiber) 다발로 구성되어 있다. 근육은 체중의 40-50%를 차지하고 있어 뼈, 내장 기관을 지탱 및 보호하는 동시에 심장의 박동과 같은 근육 외의 다른 조직의 운동성을 갖도록 한다(J. Nutr. Sci. Vitaminol., 61: 188-194, 2015). 또한 기관의 보호 외에도 근육은 운동을 포함한 신체활동뿐만 아니라 영양소 대사(metabolism)에도 큰 영향을 주기 때문에 제 2형 당뇨, 비만, 심혈관 질환 등과 같은 대사성 질환의 발병과도 밀접하게 연관되어 있다. 이러한 중요성으로 인해 근육의 손상 및 상처에 따른 근육의 재생 및 회복은 정상적인 신체 기능의 유지를 위해 필수적 요소로 자리잡고 있다(Am. J. Cardiol., 110: 58B-68B, 2012; Br. J. Pharmacol., 170: 1153-1166, 2013).
근육에 상처나 손상이 있을 때, 근육 세포로의 전구체(precursor)인 근육 위성세포(muscle satellite cell)는 근육 재생에 있어서 중요한 역할을 한다. 정상일 경우, 근섬유의 가장자리에 위치한 근육 위성세포는 휴지(quiescent)상태로 유지되지만, 근육이 물리적 또는 화학적으로 외부로부터 손상을 입게 되면 이를 재생하기 위해 다양한 전사 인자(transcription factor)들을 분비하며 근육 재생(regeneration) 단계에 돌입하게 된다.
위성세포는 발현된 전사 인자들에 의해 자가 증식(self-renewal)을 하며 근육 재생에 쓰일 위성세포풀(stem cell pool)을 형성하게 되는데, 이 때, 근 재생에 필요한 위성세포 수를 일정하게 유지하기 위해 Paired Box 7 (Pax7)의 발현이 증가하게 된다. 발현이 증가된 Pax7은 coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1) 단백질에 의해 메틸화(methylation)되어 Pax7-CARM1 복합체(complex)를 형성함으로써 myogenic factor 5 (Myf5)의 발현을 촉진시킨다. Myf5 인자의 발현량 증가로 인해 휴지기 상태였던 근육 위성세포가 활성화되어 상처 및 손상된 근육 부위로 이동(migration)한다. 그 후 근섬유 다발을 형성하여 새로운 근육을 생성한다(Stem Cells Transl. Med., 5: 282-290, 2016).
대표적인 두류 중 하나인 팥(Vigna angularis)은 쌍떡잎식물 콩과(Fabaceae)의 동부속(Vigna spp.)에 속하는 한해살이풀로 콩 다음으로 중요한 두류작물이다. 팥은 비타민 B1이 풍부하기 때문에 쌀과 혼합하여 밥을 지으면 쌀밥에 부족하기 쉬운 비타민을 공급하여 준다. 따라서 각기병 예방, 개선, 치료 효과를 보일 뿐만 아니라 피로회복에도 효과가 있음이 알려져 있다. 팥에 함유된 사포닌은 섬유질과 함께 변통을 돕는 효과가 있고 독을 풀고 배변을 촉진하여 장을 깨끗이 해주며, 신장병 또는 숙취 개선에도 이용된다(Korean. J. Food. Sci. Technol., 42(6): 693-698, 2010). 또한, 팥은 항산화(J. Food Lipids, 11(4): 278-286, 2004), 항당뇨(Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(12): 24212426, 2004), 항균(Phytother. Res., 20(2): 162164, 2006), 미백(Int. J. Mol. Sci., 12(10): 7048-7058, 2011)등의 활성을 보유하고 있음이 보고 되어있으나, 근육 손상 예방, 치료 또는 개선 효능에 관하여는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 손상된 근육을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 다양한 천연재료를 이용한 연구를 수행한 결과, 팥을 추출한 추출물이 근육 위성세포(muscle satellite cell)의 활성화를 촉진시켜 근육 손상을 예방, 개선 또는 치료하고 재생을 촉진하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물일 수도 있고, 유효성분으로서 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드로 구성되는 조성물일 수도 있으며, 또는 유효성분으로서 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 필수적으로 구성되는 조성물일 수도 있다.
본 명세서에서 용어 ‘을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는(including)’또는 ‘특징으로 하는(characterized by)’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 ‘로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란, 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 내 “근”은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하는 것으로서, 단순 골격근(skeletal muuscle)에 국한되지 않고, 심근(cardiac muscle), 평활근(smooth muscle)을 포함한다.
본 명세서 내 “근육 재생”은 근육이 물리적으로 또는 화학적으로 손상을 입었을 때 빠르게 회복시키는 것을 의미하여, 손상된 근육이 정상인 기능을 할 수 있을 때까지의 과정과 기간을 포괄적으로 지칭한다.
본 명세서에서 '팥(Vigna angularis)'은 쌍떡잎식물 콩과(Fabaceae)의 동부속(Vigna spp.)에 속하는 팥(V.angularis W.F.Wight), 검은팥(V. angularis var. angularis) 또는 그 이외의 식물들의 씨앗을 건조한 것이며, 이들을 단독으로 사용하여도 좋고, 혼합하여 사용하여도 좋다.
본 명세서에서 ‘팥 추출물’은 팥을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 팥 추출물의 제조방법은 물, C1 내지 C6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 팥을 추출하여 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 팥 추출물은 팥을 식품가공에 적합한 정제수, 에탄올 및 아임계수 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있거나, 또는 팥을 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 팥 추출물은 팥을 100 내지 1000 MPa의 압력에서 40 내지 90 ℃의 온도로 1 내지 24 시간 동안 초고압 처리 및 추출하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 팥 추출물은 알카라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex) 및 단백질 가수분해효소-NP (Protease-NP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질가수분해효소를 처리하여 제조할 수 있으며, 2 내지 8의 pH 조건 및 30 내지 60℃의 온도 조건에서 효소를 활성화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 여과 및/또는 농축하여 액상으로 사용할 수 있고, 분무건조 또는 동결건조 등 통상의 건조 공정을 통하여 고형화하여 사용할 수 있다. 상기 건조 공정에서는 분무건조 또는 동결건조 전 덱스트린 등을 혼합하여 건조할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따른 조성물은 근육 위성세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다. 구체적으로, 근육이 손상될 경우, Pax7을 통해 근육 위성세포가 활성화되고 근육의 손상부위로 이동하여 손상부위의 회복을 유도한다. 상기 근육 위성세포 활성화 촉진여부를 확인하기 위하여, 팥의 근육 재생 활성을 평가한 결과, 팥에서 분리한 펩타이드가 Pax7의 mRNA를 증가시켰을 뿐만 아니라, 팥 추출물이 근육을 빠르게 회복시켰기 때문에 정상처럼 근육 위성세포의 핵이 근섬유의 가장자리에 위치하게 되었다. 따라서 팥 추출물이 손상된 근육에서 근육을 빠르게 회복시킴을 확인하였다. 이는, 본 발명에 따른 팥 추출물이 근육의 재생 또는 회복 강화에 이점이 있음을 의미한다.
본 명세서에서 ‘팥 유래 펩타이드’는 팥으로부터 분리한 팥 단백질에 단백질 가수분해효소를 처리하여 수득한 것을 의미한다.
본 명세서에서 상기 ‘가수분해효소’는 알카라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex) 및 단백질가수분해효소-NP (Protease-NP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소일 수 있으며, 바람직하게는 프로타멕스일 수 있다.
본 명세서에서 ‘팥 유래 펩타이드’는 구체적으로 하기 단계로 이루어진 방법으로 수득될 수 있다:
i) 건조된 팥을 분쇄하고 헥산을 용매로 하여 추출하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 추출한 헥산 추출물을 제거하고, 박에 물을 가하여 pH 7.0 내지 10.0 조건에서 방치하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 방치한 용액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
iv) 상기 단계 iii)에서 수득한 상층액을 다시 pH 2.0 내지 6.0 조건에서 방치하는 단계;
v) 상기 단계 iv)에서 방치한 용액을 다시 원심분리하여 침전한 침전체를 팥 유래 단백질로 수득하는 단계;
vi) 상기 단계 v)에서 수득한 팥 유래 단백질에 가수분해효소를 가하고 효소 반응한 후, 여과하여 침전물을 제거하는 단계; 및
vii) 상기 단계 vi)에서 침전물이 제거된 여과액을 동결건조하여 펩타이드를 수득하는 단계.
본 명세서에서 ‘근육 손상’은 운동-유발성 근육손상(exercise-induced muscle damage)일 수 있다. 근육 손상은 일반적으로 특정한 상해를 일으키는 활동 후 근육 구조의 물리적인 파괴에 의한 근기능의 손실로 정의될 수 있는데, 근육 손상을 일으키는 원인으로는 외상, 과도한 온도, 근독소에 의한 상해, 국소빈혈, 근육관련질병, 염증, 운동 등 다양하게 들 수 있다. 이 중 운동-유발성 근육 손상은 근육 내의 형태적 또는 구조적 변화를 일으키는 1차성 근육 손상(primary muscle damage) 과 염증성 반응, 칼슘 항상성의 손실 등을 일으키는 2차성 근육 손상(secondary muscle damage)으로 분류될 수 있다. 1차성 근육 손상은 근절(sarcomere)과 세포골격요소(cytoskeletal elements)의 구조적인 파괴 등이 나타나며 근육 손상 직후 근력의 발생을 약화시킨다. 2차성 근육 손상은 1차성 손상을 복구하는 과정에서 나타나는데 염증성 반응에 의해 지연성 근육통(delayed onset muscle soreness; DOMS)을 일으키고 혈장 내로 근단백질을 유출시킬 뿐만 아니라 지속적인 근력 감소 등을 나타내어 일시적인 근육 기능의 손실을 일으키게 된다.
또한, 상기 근육 손상은 근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion), 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 및 근육염(myositis)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피 투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 도포하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명의 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 근육 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효량으로 포함할 때 바람직한 근육 손상 예방 및 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, '유효량'이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 손상된 근육을 회복 및 재생시키기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물에 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 0.001 내지 99.99% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.
보다 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물 내 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드의 용량은 0.001 % 내지 50 %의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 상기 농도 범위 미만인 경우, 근육 손상 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 근육 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에 따른 근육 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 '치료'란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 시술을 의미하며, 임상적 병리의 예방을 위해서도 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다. 또한 용어 '예방'은 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품용 조성물을 제조하기 위한 팥 추출물에 대하여서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 팥 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 팥 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 손상 근육에 대하여 회복 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 팥 추출물은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 근육 손상 예방 또는 개선용 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물을 제조하기 위한 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드에 대하여서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 화장료 조성물은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 팥 추출물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 팥 추출물 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 팥 추출물의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001 중량% 미만에서는 목적하는 손상 근육 치료/개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드의 제조 방법 및 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드에 대하여서는 전술한 바와 같으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 약학적 조성물의 제형화, 투여 경로와 투여량 등의 투여 방법 등에 대하여서도 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물일 수도 있고, 유효성분으로서 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드로 구성되는 조성물일 수도 있으며, 또는 유효성분으로서 팥 추출물이 필수적으로 구성되는 조성물일 수도 있다.
또한, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드의 제조 방법 및 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드에 대하여서는 전술한 바와 같으며, 상기 식품용 조성물의 예시 및 함유량에 대하여서도 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드의 제조 방법 및 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드에 대하여서는 전술한 바와 같으며, 상기 화장료 조성물의 예시 및 함유량에 대하여서도 전술한 바와 같다.
따라서, 본 발명은 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드가 손상된 근육 세포에 미치는 영향을 확인한 것으로, 상기 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드는 투여시 손상된 근육에서 근육 위성세포의 활성화를 촉진시켜 근육의 회복을 촉진시키는 효과를 보였으므로 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물과 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 마우스의 뒷다리에서 분리한 근육 위성세포에서 팥 펩타이드가 Pax7 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 2는 팥 50% 에탄올 추출물(300 mg/kg 또는 600 mg/kg의 농도) 처리에 따른 근육 손상을 야기한 장딴지 근육 조직의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 프로타멕스가 처리된 팥 추출물(300 mg/kg 또는 600 mg/kg의 농도) 처리에 따른 근육 손상을 야기한 장딴지 근육 조직의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 팥 50% 에탄올 추출물(300 mg/kg 또는 600 mg/kg의 농도) 처리에 따른 근육 손상을 야기한 장딴지 근육 조직의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 프로타멕스가 처리된 팥 추출물(300 mg/kg 또는 600 mg/kg의 농도) 처리에 따른 근육 손상을 야기한 장딴지 근육 조직의 변화를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 팥 추출물의 제조
<1-1> 메탄올 추출물
건조된 팥을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 팥 100 g을 100% 메탄올 1 L에 넣고 3시간 상온에서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만(Whatman) 2번 여과지로 감압여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 팥 메탄올 추출물을 얻었다.
<1-2> 에탄올 추출물
용매로 100% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올, 30% 에탄올, 10% 에탄올을 사용하였으며, 80℃에서 추출하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 수행하여 팥 에탄올 추출물을 얻었다.
<1-3> 에틸아세테이트 추출물
용매로 100% 에틸아세테이트를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 수행하여 팥 에틸아세테이트 추출물을 얻었다.
<1-4> 헥산 추출물
용매로 100% 헥산을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 수행하여 팥 헥산 추출물을 얻었다.
<1-5> 열수 추출물
용매로 물을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 수행하여 팥 열수 추출물을 얻었다.
<1-6> 초고압 추출물
건조된 팥을 믹서로 분쇄한 다음, 18% 에탄올 76 mL을 폴리에틸렌(polyethylene) 팩에 넣고 밀봉한 후 초고압 추출장치(Frescal MFP-7000; Mitsubishi Heavy Industries, Tokyo, Japan)를 이용하여 추출하였다. 초고압 추출 조건은 추출압력이 320 MPa, 추출시간을 5 분으로 설정하였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 팥 초고압 추출물을 수득하였다.
<1-7> 초임계 추출물
건조된 팥을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 팥 시료 1 g을 시료 카트리지에 충전하고 초임계 장치(SFX 3560, Isco Inc., Lincoln, NE, USA)를 이용하여 추출하였다. 초임계 유체 추출 조건은 추출 압력이 40 MPa, 추출 온도는 50℃, 초임계 이산화탄소의 유속은 60 mL/분, 추출 시간은 60 분으로 설정하고 추출을 진행하였다. 초임계 추출이 완료되면, 추출 장치의 압력을 낮춰 초임계 유체 상태를 해제하여 팥 초임계 추출물을 수득하였다.
<1-8> 아임계 추출물
분쇄한 팥 50 g을 1 L 물과 함께 아임계 추출장치(Biovan, Gyeonggi, Korea)의 아임계수 반응기에 넣고 밀폐하였다. 밀폐 후, 반응기의 온도를 200℃로 압력은 20 MPa로 상승시켰으며, 반응기의 온도가 200℃에 도달하면 상기 온도를 20분간 유지하여 추출하였다. 20분 후 추출물의 냉각수가 공급되는 저장탱크로 이송하여 30℃까지 급속 냉각시킨 후, 부유 잔사를 분리하기 위해 3,600 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액만 취하였다. 동결건조기(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 물을 전부 제거함으로써 팥 아임계 추출물을 제조하였다.
<1-9> 단백질 가수분해 효소가 처리된 추출물
건조된 팥을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 팥 100 g을 1 L 물에 넣고 80℃에서 4시간 추출하였다. 여과하기 전, 0.1% 알카라아제(Alcalase), 0.1% 플라보르자임(Flavourzyme), 0.1% 뉴트라아제(Neutrase), 0.1% 프로타멕스(Protamex; Novozymes, Bagsvaerd, Denmark) 및 0.1% 단백질 가수분해효소-NP (Protease-NP; Bioland, Asan, Korea) 각각을 pH 6.5, 40℃의 조건하에 팥 열수 추출물과 6시간 반응시켰다. 6시간 후, 90℃에서 15분간 효소를 비활성화시켰으며, 여과 후 회전 농축기(CEP-20S; Okawara Co., Tokyo, Japan)로 농축하였다. 그런 후 70% 에탄올을 넣고 45℃에서 12시간 추출하였다. 추출한 후, 여과하여 회전 농축기(CEP-20S; Okawara Co.)로 농축하였으며, 단백질 가수분해 효소가 처리된 열수 추출물과 혼합하였다. 혼합물을 분무 건조기(MSD-60-N; Niro Korea, Chungcheongnam-do, Korea)로 완전히 용매를 제거하여, 단백질 가수분해 효소가 처리된 팥 추출물을 제작하였다.
실시예 2 : 팥 유래 단백질 및 펩타이드의 분리
<2-1> 팥 유래 단백질의 분리
건조된 팥을 분쇄한 다음, 분쇄한 팥 시료 1 kg을 1 L 헥산에 넣고 상온에서 4시간 교반하면서 추출하였다. 헥산 추출물을 제거한 뒤, 남은 박에 물을 넣고 pH 9, 25℃에서 30분간 방치하였다. 6,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 상등액 취하고, 상등액을 pH 4.5, 25℃의 조건에서 30 분간 다시 방치하였다. 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전된 단백질을 수득하였으며, 침전된 단백질을 물에 녹이고 중성화과정을 거쳐 동결건조기(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 물을 전부 제거함으로써 분리한 팥 단백질을 수득하였다.
<2-2> 알카라아제(Alcalase) 처리에 따른 팥 펩타이드 제조
실시예 <2-1>에서 수득한 팥 단백질에 단백질 분해효소인 1% 알카라아제(Novozymes)를 가하고 50℃에서 6시간 동안 효소반응을 시켰다. 6 시간 후에, 90℃에서 20 분간 효소를 불활성화시키고 와트만 2번 여과지로 여과하여 침전물을 제거하였다. 여과된 액체를 동결건조기(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 물을 전부 제거함으로써 알카라아제 처리에 의한 팥 펩타이드를 수득하였다.
<2-3> 플라보르자임(Flavourzyme) 처리에 따른 팥 펩타이드 제조
상기 실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 알카라아제 대신 플라보르자임 (Novozymes)을 처리하여 플라보르지임 처리에 의한 팥 펩타이드를 수득하였다.
<2-4> 뉴트라제(Neutrase) 처리에 따른 팥 펩타이드 제조
상기 실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 알카라아제 대신 뉴트라제 (Novozymes)을 처리하여 뉴트라제 처리에 의한 팥 펩타이드를 수득하였다.
<2-5> 프로타멕스(Protamex) 처리에 따른 팥 펩타이드 제조
상기 실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 알카라아제 대신 프로타멕스 (Novozymes)를 처리하여 프로타멕스 처리에 의한 팥 펩타이드를 수득하였다.
<2-6> 프로테아제-NP(Protease-NP) 처리에 따른 팥 펩타이드 제조
상기 실시예 <2-2>에서와 동일한 방법으로 알카라아제 대신 프로테아제-NP (Bioland, Asan, Korea)를 처리하여 프로테아제-NP 처리에 의한 팥 펩타이드를 수득하였다.
실시예 3 : 팥 펩타이드의 근육 위성세포 Pax7의 활성 평가
생후 7주령의 수컷쥐(C57BL/6N; Daehan Biolink, Chungcheongbukdo, Korea)를 사용하여 뒷다리로부터 근육 위성세포를 분리하였다. 실험동물을 325 mg/kg tribromoethanol (Sigma-aldrich, St Louis, MO, USA)을 복강 주사하여 마취 후 심채혈을 통해 희생을 하였다. 뒷다리에서 근육 조직을 적출한 뒤, 면도칼과 해부 가위를 이용하여 잘게 잘랐으며, 2.5 U/mL dispase II (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 2.5 U/mL collagenase B (Roche Diagnostics), 2.5 U/mL collagenase A (Roche Diagnostics) 효소를 조직에 넣고, 37℃ 조건에서 1시간 동안 작동시켜 근육 위성세포가 근육 조직에서 분리되게 하였다. 1시간 뒤, 현탁액을 70 μm cell strainer (Falcon, Corning, NY, USA)와 40 μm cell strainer (Falcon)을 이용하여 필터하였다. 모인 필터액을 33 g 조건에서 5분간 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하였다. 세포를 20% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Waltham, MA, USA), 2.5 ng/mL fibro growth factor (FGF; R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로 이루어진 Ham’F-10 배지(Gibco)로 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 뒤, 배양액을 회수하여 collagen (Corning, Corning, NY, USA)이 코팅된 culture dish에서 다시 24시간 배양하였다.
뒷다리에서 분리한 근육 위성세포를 6 well plate에 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2조건에서 배지로 24시간 배양하였다. 실시예 2-5)에서 제조한 팥 펩타이드가 50 ug/mL 또는 100 ug/mL이 함유되어 있는 5% horse serum (HS; Gibco)로 이루어진 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco)배지로 교체하였다. 3일 뒤, TRIzol시약(Takara Bio. Inc., Otsu, Japan)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA는 나노드랍(NanoDrop 1000; Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)을 이용하여 정량하였다. 정량된 16 μL의 RNA를 Reverse Transcriptase Premix (ELPIS-Biotech, Daejeon, Korea)와 PCR 기계(Gene Amp PCR System 2700; Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 42℃ 55분, 70℃ 15분의 조건에서 cDNA로 합성하였다. 16 μL의 생성된 cDNA 중 4 μL의 cDNA, 하기의 특정 프라이머(Bioneer, Daejeon, Korea) 그리고 PCR premix (ELPIS-Biotech)로 95℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분을 30번 반복하여 PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타냈다.
| 유전자 | 서열번호 | 염기서열 | |
| Pax7 | 1 | Forward primer | 5'-ACTAGAATGGCTTGTATCTGTGGTT-3' |
| 2 | Reverse primer | 5'-TTGAAGTTCCTGCTCCTAAAGTGTA-3' | |
| β-Actin | 3 | Forward primer | 5'-ACTGTTACTGAGCTGCGTTTTACAC-3' |
| 4 | Reverse primer | 5'-GAGGGACTTCCTGTAACCACTTATT-3' |
PCR 결과 증폭된 cDNA를 1.5% agarose gel로 전기영동하여 분리하였으며, G;BOX EF imaging system (Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 cDNA band를 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 팥 펩타이드를 처리함에 따라 근육 위성세포에서 Pax7의 mRNA 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 팥 펩타이드가 손상된 근육세포 내에서 근육전구세포 마커인 Pax7 mRNA 발현 증가를 통해 근육 위성세포의 활성을 촉진하는 능력이 우수하다는 것을 의미한다.
실시예 4 : 팥 에탄올 추출물의 손상된 근육 재생 활성 평가
실험동물로 생후 7주된 수컷쥐(C57BL/6N; Young Bio, Chungcheongbuk-do, Korea)를 구입하여 실험을 진행하였다. 모든 동물의 사육은 연세실험동물연구센터(Yonsei Laboratory Animal Reaserch Center; YLARC, Seoul, Korea)에서 진행되었으며, 사육실 환경은 온도 23 ±2℃, 상대습도 55 ±10%로 유지시켰다. 실험 시작 전, 총 20마리의 쥐를 무작위로 1군당 5마리가 되도록 정상군, 근육 손상군, 팥 50% 에탄올 추출물 300 mg/kg 농도 투여군, 팥 50% 에탄올 추출물 600 mg/kg 농도 투여군으로 나누었다. 1 주일간 적응시킨 후, 325 mg/kg tribromoethanol (Sigma-aldrich)을 복강 주사하여 마취를 유도하였다. 마취 후, 근육 손상군과 팥 50% 에탄올 추출물 투여군에 속한 쥐의 오른쪽 뒷다리(hindlimb) 장딴지근육(gastrocnemius muscle)과 오른쪽 발바닥을 스킨 스테플러(skin stapler; Unidus, Chungcheongbuk-do, Korea)를 사용하여 스테이플러 심으로 근육을 손상시키고 오른쪽 뒷다리를 고정시켜 이 상태를 일주일 간 유지시켰다. 일주일 후, 장딴지근과 발바닥에 고정되어 있던 스테이플러 심을 제거하고 다시 일주일간 실시예 1-2)에서 제조한 팥 50% 에탄올 추출물을 300 mg/kg 또는 600 mg/kg의 농도로 매일 경구투여하여 근육 재생을 유도하였다. 이 때, 정상군과 근육 손상군은 팥 추출물 대신에 식염수를 경구투여하였다. 경구투여 기간이 끝난 후, 실험동물에 325 mg/kg tribromoethanol (Sigma-aldrich)을 복강 주사하여 마취 후 심채혈을 통해 안락사하였다. 심장이 멈춘 것을 확인한 후, 오른쪽 장딴지근육의 조직을 적출하였다. 적출한 오른쪽 장딴지근육의 조직 일부를 떼어 10% 포르말린(formalin)으로 고정시켜 파라핀 블록을 만들었다. 고정시킨 후, 조직학적인 측면에서 근육의 회복을 측정하기 위해 헤마톡실린&에오신(hematoxylin & eosin) 염색을 실시하였으며, 염색된 조직은 eXcope T500 카메라(DIXI Science, Daejeon, Korea)가 장착된 광화학현미경(CK40; Olymupus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정상군과 비교하여 근육 손상군에서 위성세포의 핵이 근섬유의 가장자리가 아닌 근섬유의 가운데에 위치함을 확인하였다. 반대로, 팥 추출물을 투여했을 때 핵이 근섬유의 가장자리에 위치하고 있었다. 이는 본 발명의 팥 50% 에탄올 추출물이 근육을 빠르게 재생시키는 효과가 있음을 의미한다.
실시예 5 : 단백질 분해효소가 처리된 팥 추출물의 손상된 근육 재생 활성 평가
상기 실시예 1-9)에서 제조한 프로타멕스가 처리된 팥 추출물을 300 mg/kg과 600 mg/kg 경구투여 하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 근육 재생 활성을 평가하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 정상군과 비교하여 근육 손상군에서 위성세포의 핵이 근섬유의 가장자리가 아닌 근섬유의 가운데에 위치함을 확인하였다. 반면에 단백질 분해 효소가 처리된 팥 추출물을 투여했을 때 핵이 근섬유의 가장자리에 위치하고 있었다. 이는 본 발명의 단백질 분해 효소가 처리된 팥 추출물이 근육을 빠르게 회복시키는 효과가 있음을 의미한다.
하기에 본 발명의 실시예 1에서 제조한 팥 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
팥 추출물 20 ㎎
유당수화물 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
팥 추출물 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당수화물 100 ㎎
스테아르산마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
팥 추출물 10 ㎎
미결정셀룰로오스 3 ㎎
유당수화물 14.8 ㎎
스테아르산마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 다라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
팥 추출물 10 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
인산일수소나트퓸 26 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
팥 추출물 10 ㎎
이성화당 10 ㎎
만니톨 5 ㎎
정제수 적량
레몬향 적량
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
팥 추출물 10 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이드 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13㎎
비타민 B2 0.15㎎
비타민 B6 0.5㎎
비타민 B12 0.2㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 30 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강음료의 제조
팥 추출물 10 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25g
비타민 B2 0.3g
정제수 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
하기에 본 발명의 팥 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제조예 1: 영양화장수(밀크로션)
본 발명의 팥 추출물 2.0 중량%
스쿠알란 5.0 중량%
밀납 4.0 중량%
폴리솔베이트60 1.5 중량%
솔비탄세스퀴올레이트 1.5 중량%
유동파라핀 0.5 중량%
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 중량%
글리세린 3.0 중량%
부틸렌글리콜 3.0 중량%
프로필렌글리콜 3.0 중량%
카르복시비닐폴리머 0.1 중량%
트리에탄올아민 0.2 중량%
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100 중량%
상기의 배합비는 비교적 영양화장수에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
제조예 2: 유연화장수(스킨로션)
발명의 팥 추출물 2.0 중량 %
글리세린 3.0 중량 %
부틸렌글리콜 2.0 중량 %
프로필렌글리콜 2.0 중량 %
카르복시비닐폴리머 0.1 중량 %
PEG 12 노닐페닐에테르 0.2 중량 %
폴리솔베이트80 0.4 중량 %
에탄올 10.0 중량 %
트리에탄올아민 0.1 중량 %
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100 중량 %
상기의 배합비는 비교적 유연화장수에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
제조예 3: 영양크림
본 발명의 팥 추출물 2.0 중량 %
폴리솔베이트60 1.5 중량 %
솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량 %
PEG60 경화피마자유 2.0 중량 %
유동파라핀 10 중량 %
스쿠알란 5.0 중량 %
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 중량 %
글리세린 5.0 중량 %
부틸렌글리콜 3.0 중량 %
프로필렌글리콜 3.0 중량 %
트리에탄올아민 0.2 중량 %
방부제 적량
색소 적량
향료 적량
정제수 to 100 중량 %
상기의 배합비는 비교적 영양크림에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
제조예 4: 마사지크림
본 발명의 팥 추출물 1.0 중량 %
밀납 10.0 중량 %
폴리솔베이트60 1.5 중량 %
PEG 60 경화피마자유 2.0 중량 %
솔비탄세스퀴올레이트 0.8 중량 %
유동파라핀 40.0 중량 %
스쿠알란 5.0 중량 %
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량 %
글리세린 5.0 중량 %
부틸렌글리콜 3.0 중량 %
프로필렌글리콜 3.0 중량 %
트리에탄올아민 0.2 중량 %
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100 중량 %
상기의 배합비는 비교적 마사지크림에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
제조예 5: 팩
발명의 팥 추출물 1.0 중량 %
폴리비닐알콜 13.0 중량 %
소듐카르복시메틸셀룰로오스 0.2 중량 %
글리세린 5.0 중량 %
알란토인 0.1 중량 %
에탄올 6.0 중량 %
PEG 12 노닐페닐에테르 0.3 중량 %
폴리솔베이트60 0.3 중량 %
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100 중량 %
상기의 배합비는 비교적 팩에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
제조예 6: 젤
본 발명의 팥 추출물 0.5 중량 %
에틸렌디아민초산나트륨 0.05 중량 %
글리세린 5.0 중량 %
카르복시비닐폴리머 0.3 중량 %
에탄올 5.0 중량 %
PEG 60 경화피마자유 0.5 중량 %
트리에탄올아민 0.3 중량 %
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100 중량 %
상기의 배합비는 비교적 젤에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
상기 배합비는 비교적 화장료 조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그외의 색채 화장품을 포함하는 다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있으며 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
이상 살펴본 바와 같이, 팥에서 분리한 펩타이드가 Pax7의 mRNA를 증가시켰을 뿐만 아니라, 팥 추출물이 근육을 빠르게 회복시켰기 때문에 정상처럼 근육 위성세포의 핵이 근섬유의 가장자리에 위치하게 되었다. 따라서, 본 발명의 팥 추출물은 위성세포를 활성화시켜, 근육 손상으로 인한 근육 기능 감소를 완화시킬 수 있으며, 근육 손상으로부터 회복을 촉진시킬 수 있는 바, 근육 손상 예방 또는 개선, 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> NewTree Co., Ltd.
Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> Composition for preventing, improving or treating muscular damage
comprising Vigna angularis extract
<130> NP17-0119P
<150> 10-2017-0168646
<151> 2017-12-08
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pax7 primer forward
<400> 1
actagaatgg cttgtatctg tggtt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pax7 primer reverse
<400> 2
ttgaagttcc tgctcctaaa gtgta 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-Actin primer forward
<400> 3
actgttactg agctgcgttt tacac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-Actin primer reverse
<400> 4
gagggacttc ctgtaaccac ttatt 25
Claims (11)
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 팥 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매, 아임계 유체, 초임계 유체 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 팥 추출물은 팥을 100 내지 1000 MPa의 압력에서 40 내지 90 ℃의 온도로 1 내지 24 시간 동안 초고압 처리 및 추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 팥 추출물은 알카라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex) 및 단백질 가수분해효소-NP(Protease-NP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소에 의해 단백질이 가수분해되어 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 근육 손상은 운동-유발성 근육 손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 근육 손상은 근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion), 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 및 근육염(myositis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 약학적 조성물.
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 식품 조성물.
- 팥 추출물 또는 팥 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상 근육의 재생 촉진용 화장료 조성물.
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| KR20020044535A (ko) * | 2000-12-05 | 2002-06-15 | 가부시끼가이샤 엔도세이안 | 팥을 원료로 하는 건강 음료 및 그의 제조 방법 |
| KR20170124473A (ko) * | 2016-05-02 | 2017-11-10 | 연세대학교 산학협력단 | 팥을 포함하는 근 기능 개선 또는 운동수행능력 향상용 조성물 |
-
2018
- 2018-10-15 KR KR1020180122603A patent/KR102070854B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR102070854B1 (ko) | 2020-01-29 |
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