KR20190065647A - 해마 추출물을 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물과 건강기능식품 조성물 - Google Patents
해마 추출물을 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물과 건강기능식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 개선 및 완화용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 해마 추출물이 혈중 요소 질소(BUN) 함량, 혈중 크레아티닌(Cr) 함량, 괴사 세뇨관 세포수를 감소시키고, 산화 스트레스를 방어함으로써 신장 기능을 증진시킴을 확인하였다. 따라서 본 발명은 신장질환의 예방 및 치료 용도를 갖는 약학 조성물 및 신장 기능을 개선시키는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 해마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
세계자연보전연맹의 적색목록(Red List) 및 멸종위기에 처한 야생동식물의 국제거래에 관한 협약(CITES)에 따라 세계적으로 보호받는 종인 해마는 실고기과에 속하는 해마속(Hippocampus)어류의 총칭이다. “Hippocampus”는 고대그리스어로 “말”을 뜻하는 “Hippo”와 “바다 괴물”을 뜻하는 “Kampos”에서 유래되었다. 일부일처 습성을 지닌 해마는 수컷이 출산하는 것으로 알려져 있으며 암컷이 수컷의 배에 있는 보육낭(brood pouch) 속에 알을 낳으면, 수컷은 수정란을 돌보고 부화시킨다. 아울러 태어난 새끼가 독립할 수 있을 때까지 자신의 보육낭에서 키워 약 0.7㎝ 정도까지 성장한 30∼70개체의 치어를 출산한다. 몸빛은 갈색이며 몸을 보호 해주는 작은 골판으로 연결된 몸의 길이는 6~10cm 정도이고 식생도 가늘고 긴 주둥이를 이용하여 작은 동물들을 빨아들여 먹는다. 해마는 오염되지 않은 아열대 바다 얕은 수심에 주로 서식하는데 우리나라 연안에서는 수온과 오염 되고 있는 연안 환경 탓에 해마를 찾기 어렵다. 그러나 최근, 제주도에서 국내 유일의 해마 대량 양식장이 조성되어 해마를 이용한 약용과 건강 보조식품 생산은 물론 중국 수출 등 양식어업인의 새로운 양식품종으로 기대를 모으고 있다. 또한, 2012년 세계에서 처음으로 발견됐던 전남 완도군 일대 ‘소안해마’는 신종 후보종으로, 인공증식으로 70%에 가까운 생존율을 보여 인공증식이 성공하였으며 2018년도에 약 천마리 이상이 생산되면 자연적응을 거쳐 소안도 거머리말 군락지내에 방사할 계획이다. 이로인해 보호종인 국내 해마 개체 수를 안정적으로 유지할 수 있을 것이다.
현재까지 가장 많이 이용되고 있는 약제로서의 해마의 효용에 대하여 문헌상에 보고된 내용을 보면 내장을 제외한 모든 부분을 약용으로 사용되고 있으며 주요성분은 arginine, aspartic acid, alanine, glycine, proline, glutamic acid 등 20가지 amino acid을 함유하고 있으며 약용가치가 높은 타우린을 비롯한 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 철, 아연, 망간, 구리, 크롬, 아연 등의 풍부한 무기원소를 함유하고 있다.
Vancomycin은 Streptomyces orientalis에서 분리된 항생물질로서, glycopeptide 항생제로 50 년 이상 동안 methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) 감염을 치료하는 데 사용되어 왔다. 살균작용은 신속하게 나타나며 세균의 내성발현은 현저하지 않다. 소화관에서 흡수되지 않기 때문에 정맥 내에 투여되며 작용의 지속은 길다. 부작용으로서는 피부발진, 발열시의 과민성반응이 있으나 주요한 것은 청신경장애와 신장장애이다. 보고된 vancomycin에 의한 신 독성의 발생률은 5-25 %이다. vancomycin에 의한 신 독성의 정확한 기전은 알려지지 않았지만, 산화 스트레스와 저산소증이 발병 기전에 관여 할 수 있다고 알려진다. 또한, vancomycin은 신장 근위 세뇨관으로 분비되며 그렇기 때문에 이를 vancomycin으로 유도된 신 독성이 일어나는 장소로 가설을 세웠다.
[선행 특허문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020120006336호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 해마 추출물의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 추출물은 알코올 추출물인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 개선 및 완화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물인 경우 통상의 방법에 따라 경구용 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 필요에 따라서 상기 조성물에 하기의 첨가제의 1종 또는 2종 이상을 첨가 배합할 수 있다. 상기 첨가제로는, 예를 들어 그레이프프루트, 사과, 오렌지, 레몬, 파인애플, 바나나, 배 등의 각종 과즙(농축 과즙, 분말 과즙 등이어도 좋다); 비타민류(팔미트산 레티놀, 리보플라빈, 피리독신,시아노코발아민 (cyanocobalamine), 아스코르빈산 나트륨, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 엽산, 비오틴, 콜레칼시페롤(cholecalciferol), 중주석산콜린, 토코페롤 또는 β-카로틴 등의 수용성 및 지용성 비타민류); 향미료(레몬플레이버, 오렌지플레이버, 딸기 플레이버, 그레이프프루트플레이버 또는 바닐라 에센스 등); 아미노산, 핵산 및 그들의 염류(글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴산 나트륨, 이노신산 등); 식물 섬유(폴리덱스트로오스,펙틴, 크산탄 고무, 글루코만난 또는 알긴산 등); 또는 미네랄류(염화나트륨, 초산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 탄산마그네슘, 염화칼슘, 인산 2칼륨, 인산 1나트륨, 글리세로인산칼슘, 구연산제1철나트륨, 구연산철암모늄, 구연산철, 황산망간, 황산구리, 요오드화나트륨, 솔빈산칼륨, 아연, 망간, 구리, 요오드 또는 코발트 등) 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구용 또는 비경구용 투여 형태로 제형화할 수 있다.
경구용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 더 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
또한 본 발명에 의한 조성물이 건강식품 조성물이 경우에는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 또는 건강 기능성 식품류 등으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴,스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1∼20 g, 바람직하게는 약 5∼12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 향미증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0∼20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 본 발명의 추출물의 투여량은 당업자의 수준 내의 범위에서 한정될 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도,발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 1 내지 5000 mg/kg, 바람직하게는 30 내지 1000 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 본 발명의 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 10∼90 중량% 범위로 함유되는 것이 바람직하다. 이는 정제 및 연질캡슐 제조시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 10∼60%, 하드캡슐의 제조 시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 10∼90%일 수 있는 점을 고려하여, 본 발명의 추출물을 10∼90%로 함유하는 건강식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 해마 추출물이 혈중 요소 질소(BUN) 함량, 혈중 크레아티닌(Cr) 함량, 괴사 세뇨관 세포수를 감소시키고, 산화 스트레스를 방어함으로써 신장 기능을 증진시킴을 확인하였다. 따라서 본 발명은 신장질환의 예방 및 치료 용도를 갖는 약학 조성물 및 신장 기능을 개선시키는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 구체적인 시료투여 조건을 나타낸 그림,
도 2는 급성 신독성 동물모델에서의 반코마이신 처리 후 신장 조직의 무게변화 측정 결과,
도 3은 급성 신부전 동물모델에서는 반코마이신 처리 후 혈중 BUN과 creatinine 측정 결과,
도 4는 해마 추출물 투여에 의한 신장조직의 형태학적 이상 소견 여부를 검증한 그림,
도 5는 신장 조직의 PAS 염색 결과,
도 6 및 7은 해마 추출물 투여에 의한 신장 조직의 염증 및 근위세뇨관의 손상 개선 검증 그림,
도 8 및 9는 해마 추출물 투여에 의한 신장 조직의 세포 사멸 개선 여부 검증 그림,및
도 10은 신장 조직을 수집해 MDA 수치를 측정해 본 결과.
도 2는 급성 신독성 동물모델에서의 반코마이신 처리 후 신장 조직의 무게변화 측정 결과,
도 3은 급성 신부전 동물모델에서는 반코마이신 처리 후 혈중 BUN과 creatinine 측정 결과,
도 4는 해마 추출물 투여에 의한 신장조직의 형태학적 이상 소견 여부를 검증한 그림,
도 5는 신장 조직의 PAS 염색 결과,
도 6 및 7은 해마 추출물 투여에 의한 신장 조직의 염증 및 근위세뇨관의 손상 개선 검증 그림,
도 8 및 9는 해마 추출물 투여에 의한 신장 조직의 세포 사멸 개선 여부 검증 그림,및
도 10은 신장 조직을 수집해 MDA 수치를 측정해 본 결과.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1:시약
및 해마 추출물의 제조
Vancomycin HCl (1g, CJ healthcare., Korea)은 멸균된 생리식염수에 녹여 400 mg/kg으로 5 ml/kg으로 복강내 주사할 양으로 만들었다. 해마 주정 추출물을 추출한 방법은 건조되어 분쇄기로 분쇄한 해마 분말 500 g에 70% 발효 에탄올을 10배수 넣고, 상온에서 24시간 침지하여 추출하였다. 추출 후에 체로 한번 거른 후, 추출물을 여과지(whatman No.1)를 이용하여 여과처리 하였다. 감압농축(ratary evaporator N-1200, Eyela, Japan)을 하여 에탄올을 제거하고 최종 부피 1L가 되도록 한 후 시료로 사용하였다. 이 때 최종 농도는 0.5 g/ml이다. TBARS assay kit(Sta-330, Cell Biolabs, Inc.), Superoxide dismutase assay kit(Item No.706002, Cayman chemical), Total Glutathione assay kit (Sta-312, Cell Biolabs, Inc.)를 사용하였다. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)을 하기위해 In situ cell death detection kit (POD, cat# 684 817 910, Roche)를 사용하였고, primary antibody로 Tumor necrosis factor alpha (TNF-α;ab66579 ,Abcam), N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGLU; ab214671, Abcam)를 사용하였고 ABC-HRP kit (peroxidase, Rabbit IgG; PK6101, Vector Laboratories)를 사용하였다.
실시예
2:실험동물
및 시료투여
26마리 male Sprague Dawley rat (5주령, 약 180-200 g)를 1주일 동안 순화한 후 랜덤으로 다음과 같이 군을 나누어 투여하였다. 정상군 (n=8); 2주일 동안 증류수를 경구투여 하고, 마지막 3일 동안 saline을 복강내 주사하였다. Vancomycin 투여군(n=9); 2주일 동안 증류수를 경구투여 하고, 마지막 3일 동안 400 mg/kg의 vancomycin을 5 ml/kg으로 하루에 한번 복강 내 주사하였다. 해마 주정추출물+vancomycin투여군 (n=9) ; 2주일 동안 해마 주정추출물을 10 ml/kg으로 경구투여하고, 마지막 3일 동안 vancomycin을 투여물질 투여 1시간 후 복강내 주사하였다. 사육환경은 12 h light/dark cycle, 22 ± 2 ℃ 온도, 50 ± 10% 습도를 유지시켰다. 모든 동물에 commercial food (Purina Inc., Gyeonggi-Do, Korea)와 물을 자유롭게 공급하였다. 모든 동물은 일주일에 두 번 체중 측정을 하였고, 마지막 투여 24시간 후 희생되었고 희생 전 12시간 동안 물을 제외하고 모든 음식을 절식하였다. 구체적인 시료투여 조건은 도 1과 같다.
실시예
3:해마
추출물 투여에 의한 신장무게의 이상 소견 여부 검증
급성 신독성 동물모델에서의 반코마이신 처리 후 신장 조직의 무게변화 측정 결과를 도 2에 나타내었다. 급성신증 대조군(반코마이신 군)의 신장무게는 1.9 g으로 정상군의 신장 무게와 비교하여 58.3%의 증가를 보였으나, 해마 추출물 군에서는 1.7 g으로 신독성 대조군의 89.5% 수준인 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4:해마
추출물에 의한 신장기능의 이상 소견 여부 검증
신장 독성을 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 해마 추출물의 반코마이신에 의한 신장독성에 대한 개선효과를 하기와 같이 혈중 BUN(Blood Urea Nitrogen)과 creatinine의 수치를 측정하여 확인하였다.
가) 실험방법
최종 희생일에 모든 실험동물을 12시간 이상 절식 후 배대동맥으로부터 혈액을 채취하며, 상온에서 1시간 정도 방치한 다음 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 이후 혈중 BUN과 creatinine 함량은 commercial kit를 이용하여 각각 측정하였다.
나) 실험결과
급성 신부전 동물모델에서는 반코마이신 처리 후 혈중 BUN과 creatinine 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 반코마이신을 투여하면 혈중 BUN 농도가 35 mg/dL로 약 2.9배 증가죄는 것을 확인하였고, 해마 추출물 투여시 BUN의 수치는 반코마이신으로 유도된 BUN의 수치와 비교하여 74.3% 정도로 유의 있게 억제됨을 확인할 수 있었다.
정상군과 비교하여 급성 신부전 대조군인 vancomycin에서의 혈중 creatinine 수치는 0.54 mg/dL로 약 2.4배의 증가가 관찰 되었으나 해마 추출물 투여군에서는 반코마이신으로 유도된 creatinine 수치와 비교하여 85% 정도로 억제됨을 확인하였다.
실시예
5:해마
추출물 투여에 의한 신장조직의 형태학적 이상 소견 여부 검증
신장조직의 형태학적 변화를 평가하기 위해, 신장조직의 Hematoxylin-Eosin (H&E) 염색과 신장 피질의 기저막을 보기 위한 Periodic acid-Schiff(PAS) 염색을 실시한 후 관찰하였다.
가) 실험방법
최종 희생일에 시험동물에서 적출한 왼쪽 신장은 10% 중성 포르말린으로 고정시켜 알코올 탈수, 자일렌, 파라핀 침투 과정을 거쳐 section하였고, 후에 Hematoxylin-Eosin (H&E) 염색을 하여 조직을 관찰 후 광학현미경으로 관찰하였다. Periodic acid-Schiff(PAS) 염색은 0.5% periodic acid로 산화시킨 후, Schiff시약으로 발색시켰고, 핵염색은 Harris hematoxylin으로 한 후 조직을 관찰 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
나) 실험결과
신장의 형태학적 변화를 평가하기 위해 수치를 표준화하여 진행하였다. 신장의 형태학적 변화 평가 항목으로는 tubular dilation, tubular cell desquamation, tubular vacuolation, interstitial inflammation, interstitial edema, cast가 있고, 이를 다음과 같이 측정하여 평균화하였다.
grade 0 : normal
grade 1 : focal, mild
grade 2 : moderate
grade 3 : severe
도 4에 나타난 바와 같이, 급성 신부전 동물모델의 신장에서는 정상군과 비교하여 반코마이신 군에서는 tubular dilation, cell desquamation, vacuolation, interstitial inflammation, interstitial edema, cast 형성을 확인하였다. 이것은 세뇨관 상피 괴사 및 탈락을 포함한 국소 변성을 특징으로 하는 전형적인 급성신부전증 경우의 소견이 인정되었다. 그러나 해마 추출물 투여군에서는 이러한 변화가 개선되는 것이 관찰되었다. 표 1은 도 4의 결과를 바탕으로 조직병리학 급성 신독성을 수치화하여 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 5의 결과는 신장 조직의 PAS 염색 결과를 나타낸 것이다. 조직학적 변화를 관찰한 결과 정상군에서는 기저막과 근위 세뇨관의 brush border에 선명하고 진한 PAS 양성 반응을 보인다. 반면 반코마이신군에서는 기저막의 PAS 양성 반응이 약해지고, 근위 세뇨관의 brush border가 소실되어 줄어든 PAS 양성 반응을 보였다. 해마 추출물을 투여한 군에서는 반코마이신 군 보다 근위 세뇨관의 brush border 소실이 덜 일어난 것으로 관찰되었다.
실시예
6:해마
추출물 투여에 의한 신장 조직의 염증 및
근위세뇨관의
손상 개선 검증
가) 실험방법
신장피질의 염증을 관찰하기 위해 Tumor necrosis factor alpha(TNF-α) 면역염색을 진행하였다. 항원성 부활을 위해 0.1 % trypsin으로 37℃, 30분 incubation하였고, 내인성 효소활성 억제를 위해 3 % H2O2 in methanol로 실온에서 30분 incubation하였고, 비특이적 반응 차단을 위해 3% bovine serum albumin in 1.5 % normal goat serum in 1x PBS(pH 7.4)로 실온에서 1시간 incubation하였고, 1차 항체로 TNF-α (1:200 in 3% bovine serum albumin in 1.5 % normal goat serum in 1x PBS(pH 7.4; ab66579, abcam)를 사용하여 4℃ overnight을 진행하였고, 2차항체는 biotinylated goat anti-rabbit IgG로 실온에서 30분 incubation하였고, 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride로 visualization하였다. 대조염색으로 Harris hematoxylin을 사용하였다.
신장의 proximal tubule의 손상을 관찰하기 위해 N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase(NAG) 면역염색을 진행하였다. 항원성 부활을 위해 microwave를 사용하여 low power에서 10분동안 1x citrate buffer(pH6.4)와 함께 boiling한 후 microwave안에서 30분 동안 cooling을 하였고, 내인성 효소 활성 억제를 위해 0.5 % H2O2 in methanol로 실온에서 30분 incubation하였고, 비특이적 반응 차단을 위해 3% bovine serum albumin in 1.5 % normal goat serum in 1x PBS(pH 7.4)로 실온에서 20분 동안incubation하였고, 1차항체로 NAGLU (1:2000 in 3% bovine serum albumin in 1.5 % normal goat serum in 1x PBS(pH 7.4); ab217671, abcam)를 사용하여 4℃, 30분동안 incubation하였으며, 2차항체는 biotinylated goat anti-rabbit IgG를 사용하여 실온에서 30분 incubation하였고, 3,3-diamino-benzidine tetrahydrochloride로 visualization하였다. 대조염색으로 Harris hematoxylin을 사용하였다.
나) 실험결과
도 6에 나타난 바와 같이, 정상군과 비교했을 때 반코마이신에 의한 급성 신부전 동물모델의 신장조직에서 TNF-α의 발현이 현저히 증가하였다. 반면에 해마 추출물 투여군에서는 TNF-α의 발현이 감소되는 것이 관찰되었다. 신장의 세뇨관에 존재하는 효수 중 하나인 NAG의 발현 여부를 확인함으로써 신장 세뇨관의 기능 손상을 확인한 실험 결과를 도 7에 나타내었다. 정상군보다 반코마이신에서 세뇨관 내 NAG의 발현이 증가된 반면에 해마 추출물 투여군에서는 NAG의 발현이 감소된 것이 관찰되었다.
실시예
7:해마
추출물 투여에 의한 신장 조직의 세포 사멸 개선 여부 검증
가) 실험방법
신장피질에 있는 근위 세뇨관 세포의 세포 사멸을 보기 위해 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL)을 진행하였다.
파라핀 섹션한 신장을 탈파라핀 과정을 거친 후, 항원성부활을 위해 0.1% trypsin in 1x PBS(pH 7.4)로 37℃, 10분 incubation하였다. 내인성효소억제를 위해 3% H2O2 in methanol로 실온에서 30분 incubation한 후 Enzyme solution과 label solution을 혼합하여 분주한 후 37℃에서 1시간 incubation하였고, convent POD를 넣고 37℃에서 30분 incubation하였다. 시각화하기 위해 기질로 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride을 사용하였고 대조염색으로 Harris hematoxylin을 사용하였다. TUNEL positive cell counting을 하여 scoring을 진행하였다. 랜덤으로 400배로 5개 시야를 관찰하여 TUNEL positive cell을 counting하여 전체 핵의 개수를 백분율하여 나타내었다.
나) 실험결과
도 8에 나타난 바와 같이, TUNEL 양성 세포는 원위세뇨관 핵에 보였고, 정상군과 비교했을 때 반코마이신 처리 군에서 TUNEL 양성 세포의 수가 증가한 것을 확인하였다. 반면에 해마 추출물 투여군에서는 TUNEL 양성 세포의 수가 감소 된 것을 관찰하였다. 도 9의 그래프는 도 8에 나타난 결과를 토대로 TUNEL 양성 세포의 수를 세어 백분율로 나타낸 것이다.
실시예
8:해마
추출물 투여에 의한 신장 조직의
Malondialdehyde
(
MDA
) 수치 변화 검증
가) 실험방법
지질 과산화 정도를 측정하기 위해 MDA kit (sta-330, Cell Biolabs,INC.)를 사용하여 진행하였다. 조직의 MDA를 측정하기 위해 100 mg/ ml in 1x PBS(pH 7.4)로 조직을 homogenization하여 4℃, 10,000 g, 5분 centrifuge하여 600 ul supernant에 6 ul 100x BHT를 첨가하였다. 추후 분석을 위해 -80℃ 보관하였다. MDA standard 와 sample에 100 ul SDS lysis solution을 첨가하였고, thoroughly mix한 후 room temperature에서 5분동안 incubation 한 후 standard와 sample에 250 ul Thiobarbituric acid(TBA) reagent를 첨가 한 후 95℃, 60분동안 air dry oven에서 incubation하였다. ice위에서 실온으로 5분간 cooling한 후 3000rpm, 15분동안 sample을 centrifuge하였다. Hemoglobin과 hemoglobin의 derivatives의 interference를 막기위해 300 ul의 상층액을 다른 Eppendorf tube에 넣고 300 ul n-buthanol을 첨가한 후 vigorously vortex를 1분 동안 한 후 10,000 g, 5분 centrifuge하였다. 96 well plate에 standard와 sample의 상층액을 200 ul씩 넣고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
나) 실험결과
MDA는 지방 과산화시에 만들어지는 대사물로 산화적 스트레스의 지표로 이용되고 있다. 신장 조직을 수집해 MDA 수치를 측정해 본 결과를 도 10에 나타내었다. 정상군과 비교해보면, MDA 수치가 반코마이신 투여 군에서 증가하였다. 해마 추출물을 투여한 군에서는 반코마이신 단독 처리 군에 비해 MDA 수치가 정상군과 동일한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
Claims (4)
- 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 해마 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 개선 및 완화용 건강기능식품 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170165024A KR20190065647A (ko) | 2017-12-04 | 2017-12-04 | 해마 추출물을 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물과 건강기능식품 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020170165024A KR20190065647A (ko) | 2017-12-04 | 2017-12-04 | 해마 추출물을 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 및 치료용 약학 조성물과 건강기능식품 조성물 |
Publications (1)
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| KR20190065647A true KR20190065647A (ko) | 2019-06-12 |
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ID=66845762
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| KR (1) | KR20190065647A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114209718A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-22 | 海南医学院 | 海马提取物的制备方法及其应用 |
| KR20220078031A (ko) * | 2020-12-03 | 2022-06-10 | 김경자 | 해마 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물 |
-
2017
- 2017-12-04 KR KR1020170165024A patent/KR20190065647A/ko active Search and Examination
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| CN114209718A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-22 | 海南医学院 | 海马提取物的制备方法及其应用 |
| CN114209718B (zh) * | 2021-12-10 | 2023-06-23 | 海南医学院 | 海马提取物的制备方法及其应用 |
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