KR20190060271A - 락토바실러스 퍼멘텀 kbl 375 균주 및 그 용도 - Google Patents

락토바실러스 퍼멘텀 kbl 375 균주 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간의 위장관 유래의 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주와, 상기 균주의 장 건강 개선 및 장질환의 치료 또는 예방 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 면역조절 기능이 우수하고, 장관벽 밀착연접의 강화 효과가 탁월하며, 장염에 따른 체중 감소 및 대장 길이의 감소를 억제하여 장염 치료 효과를 발휘하는바, 장 건강 기능 개선을 위한 프로바이오틱 소재로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주 및 그 용도{Lactobacillus Fermentum KBL 375 and Use Thereof}
본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 인간의 위장관 유래의 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 장 건강 개선을 위한 건강기능식품용 조성물, 및 장질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물 및 상기 미생물이 생산하는 생산물을 말한다. 아울러 프로바이오틱스는 건조세포나 발효산물 형태로 사람이나 동물에 공급되어, 장내 균총을 개선하는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 프로바이오틱스가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성, 장으로 가는 동안 살아 남아야한다. 더 나아가 전달 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지하고, 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야 하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한, 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야 한다.
이러한 프로바이오틱스로는 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성능력이 우수한 바실러스 종(Bacillus sp.), 젖산을 생성하는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp .), 가축의 분변에 남아있는 악취 유발물질(암모니아, 황화수소, 아민류 등)을 대사과정에 이용하여 악취유발을 막는 광합성 박테리아(Photosynthetic bacteria) 등을 그 예로 들 수 있다.
특히 바실러스 종과 락토바실러스 종은 다양한 항균 물질들을 생산하는 균주들이 존재하기 때문에, 매우 유용한 프로바이오틱스로 알려져 있다. 이들 유산균들은 항생제 내성 기작과 관련이 없는 항균 기작을 가지는 박테리오신(Bacteriocin)이라는 항균 펩타이드를 생산하는데, 박테리오신은 분자량, 생화학적 성질, 숙주에 대한 항균 범위나 기작이 상당히 다른 다형적 특징을 가지고 있다. Klaenhammer은 박테리오신을 생산하는 박테리아와 근접한 종들에 대한 직접적인 항균활성을 가진 단백질 또는 단백질복합체라고 정의하고 있다(Klaenhammer, TR. Biochimie 70:337-379, 1998).
한편, 과민성 대장 증후군 (IBS)은 복통 및/또는 변화된 장 거동 또는 배변 습관과 관련된 불편함을 특징으로 하는 증상으로, 이러한 증상은 구조적 또는 생화학적 이상으로는 설명되지 않는다. 긴박뇨, 복부 팽만 및 불완전한 장 운동의 느낌 역시 IBS의 일반적 증상이다. 따라서, 이 질환은 기능성 팽만감, 비심장성 흉통, 비-궤양성 소화불량 및 만성적인 변비 또는 설사 등의 질환을 포함하는 기능성 위장 장애로 분류된다 (Longstreth G. H. et al., 2006). 특히, IBS는, 관련 증상이 환자의 안녕과 정상적인 기능성 측면 모두에 작용하기 때문에, 복통 및 불편함을 넘어 이환율과 삶의 질에 막대한 영향을 미친다 (Dean B. B. et al., 2005).
IBS를 치료하기 위한 약물 개발 분야에서 막대한 연구들이 수행되고 있다. 이와 관련하여, 다양한 항우울제들이, 임상 실험에서 그 효능은 보통 수준이고 이의 임상적인 활용성은 상당한 부작용으로 인해 제한적임에도 불구하고, 대중적으로 사용되고 있다. 세로토닌성 제제들에서도 전반적인 IBS 증상들에 대한 효능이 입증되고 있다. 그러나, 최근 안전성에 대한 문제들로 인해 그 적용이 여러가지로 제약 되고 있으며, 이에 IBS에 대한 새로운 치료제를 개발하는데 관심이 크게 증폭되고 있다.
WO 96/29083와 EP 554418은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 299v(DSM 6595) 및 락토바실러스 카세이 ssp. 람노수스(Lactobacillus casei ssp . rhamnosus) 271 (DSM 6594) 등의, 장에서 집락을 이루는 2종의 락토바실러스 균주를 개시하였다. EP 415941에서는 락토바실리와 혼합하기 전에 오트밀 죽(oat gruel)을 효소로 처리하는 것을 포함하는, 영양 조성물의 제조 방법을 개시하였다. 미국 특허 7195906에서는 염증 질환, 특히 IBD 및 IBS와 같은 위장 염증 작용을 치료하기 위해, 절제하여 세정한 인간 위장관에서 분리된 비피도박테리움 균주를 개시하였다.
그러나 과민성 대장 증후군을 포함하는 장 건강 개선에 탁월한 효과를 보이는 균주는 아직 발견되지 않았고, 상기 효과를 보이는 균주를 찾기 위한 연구는 수많은 연구 기관에서 지속하고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 프로바이오틱스의 건강증진 효과는 속 (genus)과 종 (species)의 일반적 특징이라기보다는 균주 (strain) 특이적이라는 점에 착안하여 (Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London Ontario, Canada, 2002), 인간의 소화관과 질 유래의 다양한 균주를 스크리닝하여 면역 조절 효과가 탁월한 신규한 균주를 동정하였고, 상기 균주의 장 건강 개선 효과를 in vitro 및 in vivo 상에서 모두 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
1. WO 96/29083 2. EP 554418 3. EP 415941 4. US 7195906 5. KR 10-2012-7021713
1. L Laval et al. Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 and the commensal bacterium Faecalibacterium prausnitzii A2-165 exhibit similar protective effects to induced barrier hyper-permeability in mice. Gut Microbes, Vol 6, Issue 1, p.1
본 발명의 목적은 장 건강을 개선하고 장질환의 치료 또는 예방 용도로 활용할 수 있는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 장질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 면역조절 기능이 우수하고, 장관벽 밀착연접의 강화 효과가 탁월하며, 장염에 따른 체중 감소 및 대장 길이의 감소를 억제하여 장염 치료 효과를 발휘하는바, 장 건강 기능 개선을 위한 프로바이오틱 소재로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 배양 과정에서 유사 균주에 비해 생장 속도가 빨라 생산성이 탁월하여 산업화 용도로 적합한 장점을 가지고 있다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 면역 조절 기능을 THP-1 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 면역 조절 기능을 PBMC를 이용하여 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 면역 조절 기능을 다른 락토바실러스 퍼멘텀 균주인 KCTC 5467 균주와 RAW 264.7 세포주에서 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 밀착연접 강화 효과를 다른 락토바실런스 퍼멘턴 균주인 SNUV 417 균주와 Caco-2 세포주에서 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 장염이 유발된 마우스 모델에 투여하고 체중 변화 및 대장 길이 변화를 관찰한 결과이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 생장 속도를 다른 락토바실런스 퍼멘텀 균주인 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC5049 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC5467 균주와 De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 배지에서 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인간 소화관 및 질에서 유래한 총 23주의 미생물을 이용하여 면역 조절 효과를 비교하였고, 그 중에서도 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주가 면역 조절에 특히 탁월한 효과를 보이는 것을 관찰하였으며, 상기 균주의 16s rDNA를 분석한 결과, 상기 균주가 종래 공지된바 없는 신규한 균주임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주에 관한 것으로, 상기 균주는 하기 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
<서열번호 1>
Figure pat00001
본 발명에서는 또한, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주가 면역 조절 효과와 더불어 장관벽의 밀착연접 강화 효과가 있음을 확인하였고, 장염 유발 동물 모델에 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 투여한 경우 장염에 의한 체중 감소 및 대장 길이 감소가 현저히 개선되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 식품 또는 식품 첨가용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 장 건강 개선 또는 장 질환 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 기능성 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로,본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 기능성 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 장 질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 장질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 100중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1중량% 내지 99중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 10g, 바람직하게는 0.01g 내지 1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에 는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품용 조성물은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 독립적으로 또는 허용 가능한 담체에 첨가하거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 제조될 수 있다. 즉, 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품을 제조함에 있어서, 본 발명의 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이며, 특별히 제한되지 않는다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeast), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실린(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 그로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속에 속하는 세균 등이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)등을 들 수 있다. 바람직하게는, 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 면역활성 증강 및 항암작용이 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명의 식품용 조성물에 추가로 포함함으로써 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물에 사용될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375은 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 상기 균주를 함유하는 동물 사료용 첨가제 또는 이를 함유하는 동물사료의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 예컨대 단백질 분해효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주, 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 상기 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 이외에 하나 이상의 효소제제를 더 포함할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱 애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 α-1,4-글리코시드 결합(glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라제(xylase), 말토스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 동물 사료용 첨가제로 사용함에 있어서, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 가공과정은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로, 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하다. 압출성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 장질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 생균의 균체, 건조 균주의 형태, 균주의 배양물, 균주의 파쇄물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 담체 혹은 매체와 조합될 수 있는 조성물로 제공될 수 있다. 이용되는 담체 혹은 매체는 용매, 분산제, 코팅, 흡수 촉진제, 제어된 방출제(즉, 서방제), 및 1종 이상의 불활성 부형제(전분, 폴리올, 과립제, 극미세 셀룰로스(microfine cellulose), 미세결정형 셀룰로스(예컨대, 셀피어, 셀피어 비즈(Celphere beads), 희석제, 윤활제, 결착제(binder), 붕해제 등을 포함함) 등을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 개시된 조성물의 정제 제형은 표준 수성 혹은 비수성 수법에 의해 코팅될 수도 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체로서 이용하기 위한 부형제 그리고 상기 추가의 성분의 예로는, 결착제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 항미생물제 및 코팅제를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 장 질환은 복부 팽만감, 복부 불쾌감, 병원성 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 과민성 대장 증후군, 소장 미생물 과성장증 및 장 급이성 설사로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 장의 정상적인 장벽 기능 손상에 의해 야기되는 질환을 포함한다.
염증성 장 질환 (IBD)은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염을 포함하며, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 질환 군을 지칭한다. 궤양성 결장염은 단지 대장에만 영향을 미친다. 궤양성 결장염에서의 염증 및 궤양은 대장의 4개 층 중 가장 안쪽에 있는 2개의 층인 점막층 및 점막하층에 제한된다. 크론병에서 염증 및 궤양은 소장 및 대장 둘 다에서 장벽의 모든 층을 통해 확장할 수 있다.
한편, 과민성 대장 증후군은 기질적 원인이 없이 장기간 반복되는 복부팽만감 등의 복부 불편감 및 복통과 더불어 설사, 변비 등의 배변 습관의 변화를 동반하는 만성 질환이며 그 증상이 정신적인 요인이나 스트레스를 유발하는 사회 환경에 의해서 악화되기도 한다.
상기 '치료하는'이란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는' 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 장 질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 장 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 장 질환의 확산을 예방함,
(3) 장 질환을 경감시킴.
(4) 장 질환의 재발을 예방함, 및
(5) 장 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 장 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유효량(또는, 유효한 양)"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위 내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도로 적은 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 약제학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 미생물의 예정된 양을 함유한다. 성인 환자의 경구 투여용 투여 단위는 본 발명의 미생물 0.001 g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물 경구 투여량은 일회에 0.001 내지 10g, 바람직하게는 0.01 내지 5 g이다. 본 발명의 미생물의 약학적 유효량은 0.01 내지 10 g/1일이다. 그러나, 투여량은 환자의 장 질환의 심각도 및 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 횟수로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 장 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 위장 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 장 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl 용액과 같은 인공 위즙을 36℃ 내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8의 KH₂PO₄ 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.
본 발명의 장용 피복은 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우가 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365∼373; H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ∼ 742, 및 766 ∼ 778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689 ∼ 1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.
본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, 다이클로로메탄(CH2Cl2)과 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3 (코팅 재료 대 연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.
본 발명은 또 다른 관점에서 장 질환의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 상기 균주 또는 조성물의 용도 및 장 질환 치료제의 제조를 위한 상기 균주 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 용어 '예방'은 질병을 축소시키는 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)와 관련된 것이다.
본 발명에서, 용어 '치료'는 질병의 증상을 개선, 치유 또는 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키기 위해 질병에 걸린 피험자를 돌보는 것과 관련된 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 약학적 유효량의 상기 균주 또는 조성물을 장 질환의 예방 또는 치료나 장 건강의 개선이 요구되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 장질환 예방 또는 치료방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 장 질환 예방 또는 치료용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 동물일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 면역조절 기능을 갖는 프로바이오틱 균주의 스크리닝
백혈병 단핵구인 THP-1 세포주 및 말초혈액단핵구(PBMC)를 이용하여 면역조절 기능을 갖는 프로바이오틱 균주를 스크리닝하였다. 상기 2종의 세포주에 각각 인간 소화관(gut) 또는 질(vagina)에서 유래한 균주를 세포수가 1:100의 비율이 되도록 분주하고, 염증 반응의 주요 지표가 되는 사이토카인인 IL-6에 대한 염증 조절의 주요 지표가 되는 사이토카인인 IL-10의 비율(IL-10/IL-6)을 측정하였다. 스크리닝에는 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri) 2종, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) 1종, 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 5종, 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) 2종, 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) 4종, 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) 4종, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacilus plantarum) 1종, 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 2종 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 2종으로, 총 23종의 균주를 이용하였다
스크리닝 결과, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(KCTC 13381BP) 균주는 THP-1 세포주에서 IL-10/IL-6 값이 4.94, 말초혈액단핵구에서 IL-10/IL-6 값이 7.79으로 매우 높은 면역조절 효과를 나타내었다. 하기 표 1은 본 스크리닝에 사용된 프로바이오틱 23 균주 중 2종의 락토바실러스 퍼멘텀 균주 간의 IL-10/IL-6 값을 비교한 결과이다.
Cell Line 균주 IL-10/IL-6
THP-1 Lactobaciilus fermentum KBL 374 1.766582
Lactobaciilus fermentum KBL 375 4.941038
PBMC Lactobaciilus fermentum KBL 374 2.981526
Lactobaciilus fermentum KBL 375 7.7890503
표 1에서 볼 수 있듯이, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 매우 높은 IL-10/IL-6 값을 나타내어, 상기 균주는 면역 조절 기능이 매우 높은 균주일 것으로 예측하였고, 이에 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 이용하여 추가 실험을 진행하기로 하였다.
실시예 2. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 면역 조절 효과 검증( in vitro test)
상기 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주에 의한 면역조절효과의 검증을 위해, THP-1, RAW 264.7의 두 가지 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리하는 경우 면역 조절에 관여하는 사이토카인들의 생성능 및 PBMC에 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리할 경우 T 세포 분화의 마커 유전자 발현 여부 등을 확인해 보았다.
우선, THP-1 세포주를 24 웰 플레이트 (24 well plate)의 각 웰에 1×105 cell씩 분주하고 성숙한 macrophage로 분화 시킨 후, 배양액을 새로 교체하고 3시간 뒤 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 각 웰에 생균수 기준으로 1×107 cell씩 분주하였다. 대조군으로는 동일 조건에서 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주 대신 LPS를 1μg/ml의 농도로 처리하여 염증반응을 유도하였다. 24시간이 경과한 후 배양액을 모아 BD cytometric Bead Array (CBA) human inflammation kit (Cat No. 551811)을 이용하여 제조자 방식에 따라 각 사이토카인의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, THP-1 세포주에서는 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리한 군이 LPS를 처리한 군보다 염증성 사이토카인 IL-6, TNF, IL1-b 그리고 IL-8이 현저히 낮게 측정되는 양상을 나타내었다. 그러므로 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주가 THP-1 세포에서 염증성 사이토카인의 생성을 현저히 억제시키는 효능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, PBMC 세포를 24 웰 플레이트의 각 웰에 5×105 cell씩 분주한 후, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 생균수 기준으로 5×106 cell씩 되도록 첨가하였다. 대조군으로는 장 내에서 분리한 장출혈성 대장균 (Escherichia coli O157:H7 EC4115)을 생균수 기준으로 각 웰에 5×106 cell씩 넣거나 LPS를 500ng/ml의 농도가 되도록 첨가하였다. 상기 조건으로 준비된 PBMC 세포 실험군을 5일 동안 배양한 후 수득해서 세포를 모았다. 유전자 발현양을 확인하기 위해 우선 easy-spin™ (DNA free) Total RNA Extraction Kit (Intron)을 이용해 RNA를 추출한 후 High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Thermofisher)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 Rotor-Gene® Q (Qiagen) 장비를 사용, Rotor-Gene SYBR Green PCR kit (Qiagen)으로 제조자 방식에 따라 real-time PCR을 수행하여 Th1의 마커(effector cell marker) 유전자인 T-bet, Th2의 마커 유전자인 GATA3, Th17의 마커 유전자인 RORrt 그리고 Immune regulatory T 세포 (Treg 세포)의 마커 유전자인 FOXP3 mRNA발현을 측정하였다. 이때 각 실험군 간의 상대적인 유전자 발현양을 보정하기 위한 대조군 (internal control) 으로 B2M 유전자의 발현량을 측정하기 위해 (forward) 5′-CCA GCA GAG AAT GGA AAG TC-3′ (reverse) 5′-GAT GCT TCT TAC ATG TCT CG-3′ 의 서열을 가지는 프라이머 (primer) 를 이용하여 발현 정도를 측정하였다. 각 유전자 발현을 확인하기 위한 프라이머의 서열은 T-bet의 증폭을 위하여 (forward) 5′-CCC CAA GGA ATT GAC AGT TG-3′ (reverse) 5′-GGG AAA CTA AAG CTC ACA AAC-3′, GATA3의 증폭을 위하여 (forward) 5′-CTG CAA TGC CTG TGG GCT C-3′ (reverse) 5′-GAC TGC AGG GAC TCT CGC T-3′, RORrt의 증폭을 위하여 (forward) 5′-AAG ACT CAT CGC CAA AGC AT-3′ (reverse) 5′-TCC ACA TGC TGG CTA CAC A-3′, FOXP3의 증폭을 위하여 (forward) 5′-TCA AGC ACT GCC AGG CG-3′ (reverse) 5′-CAG GAG CCC TTG TCG GAT-3′을 사용하였다.
그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL375 균주는 대장균과 비교해 T 세포의 effector cell marker인 T-bet, GATA3, RORrt 유전자의 발현량을 유의하게 낮추는 반면 Treg 세포의 마커인 Foxp3 의 mRNA는 유의하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, RAW 264.7 세포주를 각각 24 웰 플레이트의 각 웰에 1×105 cell씩 분주하고, 염증 반응을 유도하기 위하여 LPS를 2ng/ml의 농도로 처리한 후 락토바실러스 퍼멘텀의 대표 아종인 KCTC 5467 혹은 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 각 웰에 생균수 기준 1×106 cell씩 추가로 분주한 후 24시간을 함께 배양하여 TNF, IL-10의 농도를 ELISA 키트(Mouse TNF ELISA Set II (Cat No. 558534, BD OptEIATM), Mouse IL-10 ELISA Set (Cat No. 555252, OptEIATM))를 사용하여 제조자 방식에 따라 측정하였다. 동일한 실험 조건에서 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 처리하지 않은 실험군을 대조군으로 사용하여 측정값을 비교하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리한 세포에서 대조군 및 비교 실험군인 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC 5467 균주에 비해 항염증성 사이토카인 IL-10 농도가 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 염증촉진성 사이토카인 TNF-α 농도와의 비율인 IL-10/TNF-α로는 면역조절 능력을 판단하였다.
그 결과, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리한 세포에서 대조군 및 비교 실험군인 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC 5467균주에 비해 유의하게 높은 IL-10/TNF-α 값을 확인하였고, 이는 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주가 기존 알려진 락토바실러스 퍼멘텀 균주에 비해 높은 면역조절능력 및 항염증 효과를 가지고 있음을 나타낸다.
실시예 3. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 장관벽 밀착연접(tight junction) 강화 효과
락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(KCTC 13381BP) 균주의 장관벽 밀착연접 강화 효과를 확인해 보고자 TEER(Transepithelial/transendothelial electrical resistance) assay를 진행하였다. 비교를 위해 인간 질에서 유래한 락토바실러스 퍼멘텀 SNUV 417 균주를 비교 실험군으로 사용하였다.
TEER assay를 위한 Caco-2(ATCC® HTB-37™) 세포주는 20% FBS, 1% non-essential amino acids solution, 1% HEPES, 1.5% sodium bicarbonate solution, 50 μg/ml gentamicin, 10 U/ml penicillin-streptomycin를 포함하는 MEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
12 웰 플레이트에 Caco-2 세포를 웰당 3×104 cell씩 분주하고 2일에 한 번씩 배지를 교체해 준 후, 6일 째 FBS와 항생제가 없는 배지로 바꾸어 밤새 배양하였다. 7일째 플레이트를 최소 20분 상온에 두어 플레이트의 온도를 상온으로 조절한 후, VOM resistance meter (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 TEER를 측정하였다(0h 기준). 이후 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주와 비교 실험군인 락토바실러스 퍼멘텀 SNUV 417 균주의 배지를 모두 PBS로 세척해주고 난 후, MEM에 풀어주었다. FACS를 이용해서 live/dead cell counting을 하여 균주를 Caco-2 세포에 생균수 기준으로 웰당 3×107 cell이 되도록 처리하였다. 균주를 처리한 후 12h, 24h에 TEER값을 측정하였다. 이 경우에도 플레이트를 최소 20분 상온에 두어 플레이트의 온도를 상온으로 조절하였다. 측정 후 TEER (Ω cm2) = (resistance (Ω) - background resistance(Ω)) × membrane area (cm2) 값으로 환산 후 아래와 같은 식을 적용하였다.
Change in TEER(%) = TEER (Ω cm2)/initial TEER (Ω.cm2) × 100
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 처리한 세포에서 대조군 및 비교 실험군인 락토바실러스 퍼멘텀 SNUV 417 균주에 비해 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주가 장관벽의 밀착연접을 강화하는 효과가 있으며, 상기 균주를 과민성 대장 증후군의 치료 용도로 활용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 장염 완화 효과 검증( in vivo test)
락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주가 in vivo 상에서도 장 기능 개선 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여, C57BL/6 마우스를 각 10마리씩의 군집으로 구분한 후, 2% DSS를 수돗물에 용해하여 식수로 9일간 음용시킴으로써 장염을 유도하였다. 이와 동시에 대조군 마우스에는 PBS를 매일 200 μl씩 경구 투여하였고, 실험군 마우스에는 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 PBS에 2x1010 CFU/ml이 되도록 희석시킨 후 매일 200μl씩 경구 투여하였다. 이후, DSS를 공급하여 장염이 유발되는 9일 동안, 대조군 및 실험군 마우스의 체중 변화를 매일 측정하였고, DSS를 공급한 후 9일째 되는 날 마우스를 부검하여 대장(colon)의 길이를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DSS를 공급하여 장염이 유발시킨 9일째 되는 날 마우스의 체중은 대조군의 경우 최초 체중의 87%까지 감소하였으나, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 경구 투여한 실험군에서는 마우스의 체중이 최초 체중의 97%로 나타나 체중 변화가 매우 미미하게 나타났다. 또한, 대장의 길이를 측정한 결과, DSS를 공급하여 장염을 유도한 마우스에서는 9일째 대장의 길이가 대조군의 80% 이하로 나타났으나, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주를 경구 투여한 실험군에서는 장의 길이가 대조군의 90%를 나타내어, 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주가 장 건강에 유익한 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주의 생산성 검증
락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(KCTC 13381BP) 균주의 생산성을 확인하기 위해 생물자원센터에 등록되어있는 락토바실러스 퍼멘텀의 두 대표 아종(L. fermentum KCTC5049, L. fermentum KCTC5467)을 비교실험군으로 비교하였다. 세 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 각각 De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 배지에서 배양하였을 때, 도 6에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 다른 두 락토바실러스 퍼멘텀에 비하여 생장속도가 빠름을 확인할 수 있었다. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL375균주의 비증식 속도(specific growth rate)는 0.756으로 다른 두 락토바실러스 퍼멘텀에 비하여 최소 1.1배에서 최대 1.3배 생장이 빠름을 확인하였다(표 2). 또한 한 개의 균체가 두배로 증식하는데 필요한 배가시간(doubling time)도 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 0.91시간인데 반하여 락토바실러스 퍼멘텀 KCC5049는 1.16시간, 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC5467 균주는 1.02시간이 필요한 것을 확인하였다(표 2). 이에 따라 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375 균주는 기존에 보고된 다른 두 락토바실러스 퍼멘텀 균주에 비하여 생산성이 10% 이상 우수한 것을 확인할 수 있었다.
Specific growth rate and doubling time of Lactobacillus fermentum KBL375, Lactobacillus fermentum KCTC5049 and Lactobacillus fermentum KCTC5467
Strains Specific growth rate (h-1) Doubling time (h) Character
L. fermentum KBL375 0.756 0.916 Isolated from feces adult
L. fermentum KCTC5049 0.677 1.163 Isolated from saliva
L. fermentum KCTC5467 0.596 1.024 Isolated from intestine
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13381BP
수탁일자 : 20171023
<110> Ko BioLabs, Inc. <120> Lactobacillus Fermentum KBL 375 and Use Thereof <130> P17-B271 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1120 <212> DNA <213> lactobacillus fermentum <400> 1 gtcctgttac ggtgctatac atgcaagtcg aacgcgttgg cctaattgat tgatggtgct 60 tgcacctgat tgattttggt cgccaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtaggtaac 120 ctgcccagaa gcgggggaca acatttggaa acagatgcta ataccgcata acaacgttgt 180 tcgcatgaac aacgcttaaa agatggcttc tcgctatcac ttctggatgg acctgcggtg 240 cattagcttg ttggtggggt aacggcctac caaggcgatg atgcatagcc gagttgagag 300 actgatcggc cacaatggga ctgagacacg gcccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacacc gcgtgagtga agaagggttt 420 cggctcgtaa agctctgttg ttaaagaaga acacgtatga gagtaactgt tcatacgttg 480 acggtattta accagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagagagtg caggcggttt tctaagtctg 600 atgtgaaagc cttcggctta accggagaag tgcatcggaa actggataac ttgagtgcag 660 aagagggtag tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720 gtggcgaagg cggctacctg gtctgcaact gacgctgaga ctcgaaagca tgggtagcga 780 acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctagtg ttggagggtt 840 tccgcccttc agtgccggag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa 900 ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960 cgaagctacg cgaagacctt accaggtctt gacatcttgc gccaacccta gagatagggc 1020 gtttccttcg ggacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtggaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgaagcgcca ccctggtact 1120

Claims (7)

  1. 락토바실러스 퍼멘텀 KBL 375(기탁번호 KCTC 13381BP) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항의 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 식품용 또는 식품 첨가용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식품은 장 건강 개선을 위한 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항의 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 장질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 장질환은 복부 팽만감, 복부 불쾌감, 병원성 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 과민성 대장 증후군, 소장 미생물 과성장증 및 장 급이성 설사로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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