KR20190058372A - 신이 추출물을 포함하는 알레르기 비염 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효율적으로 알레르기 비염 예방 및 치료에 사용될 수 있는 신이 추출물 함유 흡입용 에어로졸 제제를 제공하는 것으로, 본 발명은 알레르기 비염 예방 및 치료에 유용한 것으로 알려져 있는 신이 추출물을 특정 농도로 함유되는 비경구 투여방법인 흡입용 에어로졸 제제를 제공함으로써, 알레르기성 비염 질환의 예방 및 치료용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신이 추출물을 포함하는 알레르기 비염 예방 및 치료용 조성물{Composition for Prevention and Treatment of Allergic Rhinitis including Magnoliae Flos Extract}

본 발명은 효율적으로 알레르기 비염 예방 및 치료에 사용될 수 있는 신이 추출물 함유 흡입용 에어로졸 제제에 관한 것이다.

알레르기 비염이란 코 점막이 특정 물질(알레르겐)에 대하여 과민반응을 나타내는 것으로 연속적인 재채기 발작, 계속 흘러내리는 맑은 콧물, 그리고 코막힘이 특징적인 만성 염증성 질환이다. 꽃가루, 집먼지 진드기와 같은 알레르겐이 호흡을 통해 비강 점막에 노출되면, 이를 염증세포가 인식하여 Th2 T 세포, 비만세포(mast cell) 등을 활성화 시키게 된다. 이 중 Th2 T 세포의 경우 IL-4, IL-13과 같은 사이토카인을 분비하여 B 세포가 IgE를 분비하는 세포로 되는 종류 변환(class switching)을 일으키며 이는 비만 세포의 Fc 수용체에 결합하여 IgE 매개 알레르기 반응을 개시한다. 특정 알레르겐에 특이적인 IgE가 결합되어 있는 비만 세포는 알레르겐에 의해 활성화 되어 저장하고 있는 히스타민 등의 물질을 분비하는 탈과립 현상이 일어난다. 이러한 히스타민의 분비는 코 점막 상피세포 및 혈관에 발현하고 있는 히스타민 수용체와 결합하여 점액의 과분비, 코막힘등을 일으키게 된다.

이러한 기전을 바탕으로 알레르기 비염을 포함한 염증성 질환의 치료는 일차적으로 알레르기를 일으킬 수 있는 Th2 T 세포 및 비만세포의 활성을 억제하기 위한 면역 억제제 및 항히스타민제의 사용이 일반화되어 있다.

현존하는 가장 강력한 면역억제제인 리무스 계열의 약물(tacrolimus, sirolimus 등)들은 면역 세포 내 NFAT(Nuclear factor of activated T-Cells)라고 하는 전사조절 인자의 활성을 저해하여 결과적으로 친염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것으로 알려져 있으며, NFAT의 경우 칼시뉴린(calcineurin)이라는 단백질 포스파타아제(protein phosphatase)에 의해 활성화가 된다.

항히스타민제의 경우 비만세포에 발현하고 있는 히스타민 수용체에 특이적으로 결합하여, 알레르겐 노출시에도 비만세포가 활성화하여 히스타민을 분비하지 못하도록 탈과립 현상을 억제한다. 하지만, 이러한 효과들은 항염증제 및 항히스타민제 등 2가지 약재를 한꺼번에 복용을 해야할 뿐만아니라, 암발생 위험 증가(염증억제제) 및 진정작용(항히스타민제)으로 인한 졸음 무기력, 학습능력 저하가 일어날 수 있어 환자들에게 정신적, 육체적 불편함을 줄 수 있다.

최근 연구에 따르면, 면역세포와 비만세포의 활성화를 위해서는 세포 내 칼슘 신호 생성이 중요한데, 이러한 세포 내 칼슘 증가를 일으키는 통로를 서로 공유하는 것으로 알려져 있다.

T 세포 수용체를 통한 자극 혹은 FC 수용체를 통한 자극의 경우 Gq단백질 연결 수용체를 활성화하여 PLC(phospholipase C)를 활성화시키는데, 이러한 PLC의 활성은 IP₃(inositol-3-phosphate) 및 DAG(diacylglycerol) 를 생성하게 된다.

이들은 궁극적으로 ER 칼슘 저장고를 고갈시켜 이들 세포에서 공통적으로 세포 밖 칼슘 유입 통로인 SOCE(Store Operated Calcium Entry)를 활성화 시키게 된다. 또한, 다른 최신 지견에 따르면 통증을 일으키는 신경세포(DRG neuron)에만 발현이 국한되어 있다고 생각되던 TRPV1 이온통로가 Th2 면역세포에도 존재하며, SOCE와 함께 면역세포를 활성화 시키는데 중추적인 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다.

한편, 이러한 세포 내 칼슘 농도 증가는 알레르겐 노출 시 콧물 생성에 중요한 코 상피세포에서도 일어나는데, 세포 내 칼슘 농도가 증가하면 증가된 세포 내 칼슘 이온에 반응하여 ANO1이라는 칼슘의존성 염소이온통로를 활성화하게 된다. ANO1 활성화는 콧물 생성을 가속화하여 알레르기 비염의 특징적인 증상인 계속해서 흘러내리는 맑은 콧물의 분비를 일으키게 된다.

이에 본 발명자는 알레르기 비염 예방 및 치료에 유용한 것으로 알려져 있는 신이 추출물이 SOCE, TRPV1 및 ANO1을 동시에 억제하며, 부작용이 없으면서도 면역억제제 및 항히스타민제의 복용을 대체할 수 있는 효과적인 알레르기 비염 치료를 위한 흡입용 에어로졸 제제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 효율적으로 알레르기 비염 예방 및 치료에 사용될 수 있는 신이 추출물 함유 흡입용 에어로졸 제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신이 추출물을 0.001~0.08 중량% 함유하는 알레르기 비염 예방 및 치료를 위한 흡입용 에어로졸 제제를 제공한다.

본 발명자들은 알레르기 비염 예방 및 치료에 유용한 것으로 알려져 있는 신이 추출물의 약리기전을 연구한 끝에, ORAI1을 통한 칼슘이온 전류(I_SOCE)의 저해 작용, 비 선택적 양이온 통로인 TRPV1 전류의 저해작용 및 칼슘 의존성 염화물 이온통로인 ANO1 전류의 저해작용에 의해 신이 추출물이 알레르기 비염 예방 및 치료에 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명에 의한 신이 추출물이 ORAI1을 통한 칼슘이온 전류(I_SOCE)의 저해 작용, 비 선택적 양이온 통로인 TRPV1 전류의 저해작용 및 칼슘 의존성 염화물 이온통로인 ANO1 전류의 저해작용에 의해 알레르기 비염 예방 및 치료에 효과를 나타낸다는 것을 도 1 내지 도 11, 실시예 2 내지 실시예 6에 나타내었다.

본 발명은 신이 추출물의 알레르기 비염 예방 및 치료를 위한 여러 약리기전을 연구한 끝에 신이 추출물이 0.001 중량%(0.01 mg/ml) 내지 0.08 중량%(0.8 mg/ml) 함유된 농도에서 가장 효과가 우수하였음을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 사용되는 흡입용 에어로졸 제제는 신이 추출물을 0.001 ~ 0.08 중량% 포함하며, 바람직하게는 0.01 ~ 0.8 중량% 포함한다. 신이 추출물이 0.001 중량% 미만 농도로 투여되는 경우에는 알레르기 비염에 대한 예방 및 치료 효과를 기대하기 어렵고, 놀랍게도 신이 추출물이 0.08 중량%(0.8 mg/ml) 이상 농도로 투여되는 경우에도 알레르기 비염에 대한 예방 및 치료 효과를 나타내지 않는다.

본 발명은 흡입용 에어로졸 제제에 포함되는 신이 추출물을 1일 1회 내지 수회 흡입하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 신이 추출물은 하기 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 신이를 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하고 분쇄한다. 신이는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 분쇄된 신이의 분말에 적당한 양의 용매를 첨가하여 완전히 침지되도록 한다. 신이의 혼합 분말은 통상의 추출 용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, (i) 부틸아세테이트 또는 (j) 물을 이용하여 추출할 수 있으며, 용매로 사용되는 에탄올 용액은 에탄올 30: 증류수 70으로 추출하는 것이 추출 수율 면에서 가장 바람직하다. 에탄올로 상기 약재를 추출하는 경우 3시간 동안 중탕으로 가열하여 추출하는 것이 바람직하며, 에탄올은 신이 1 중량부 당 5 내지 20 중량부로 첨가될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 신이 분말을 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 신이 분말을 에탄올 및 물의 중량비가 3 : 10 내지 6 : 10 인 혼합 용매로 추출한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 신이 추출물을 함유하는 흡입용 에어로졸 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 흡입용 에어로졸 제제에 포함되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 흡입용 에어로졸 제제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 흡입용 에어로졸 제제는 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명은 알레르기 비염 예방 및 치료에 유용한 것으로 알려져 있는 신이 추출물을 특정 농도로 함유되는 비경구 투여방법인 흡입용 에어로졸 제제를 제공함으로써, 알레르기성 비염 질환의 예방 및 치료용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 한약제 30% 에탄올 추출물의 ORAI1을 통한 칼슘이온 전류(I_SOCE)의 저해 효과를 나타낸 그래프로써, ORAI1 이온통로가 과발현된 HEK293-T 세포에서 측정한 ORAI1 이온통로의 전류(검은색 화살표)와 이의 억제효과를 나타내는 신이 30% 에탄올 추출물 1 mg/ml(빨강색 화살표) 및 ORAI1 저해제 BTP2(파란색 화살표) 의 패치 클램프 차트 기록을 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에서 표시된 해당 화살표의 전류-전압(I-V) 관계 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 기록된 I_SOCE 전류의 120 mV 전압에서 측정된 전류의 저해 정도를 요약한 그래프이다.
도 4는 신이 30% 에탄올 추출물의 비 선택적 양이온 통로인 TRPV1 전류의 저해효과를 나타낸 그래프로써, TRPV1 이온통로가 과발현된 HEK293-T 세포에서 측정한 TRPV1 이온통로의 전류(검은색 화살표)와 이의 억제효과를 나타내는 30% 에탄올 추출물 10μg/ml(빨간색 화살표), 30 μg/ml(파란색화살표), 100 μg/ml(청녹색 화살표) 및 TRPV1의 저해제 BCTC(회색 화살표)의 패치 클램프 차트 기록을 나타낸 것이다.
도 5는 도 4에서 표시된 해당 화살표의 전류-전압(I-V) 관계 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6은 사람 혈액에서 채취한 PBMC에서 면역세포인 T 세포를 분리하고, 이를 CD3와 CD28로 자극한 T 세포 증식의 억제를 나타낸 것으로써, ORAI1 이온 전류의 억제 효과를 보인 신이 30% 에탄올 추출물 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 1 mg/ml의 T 세포 증식 억제 및 세포 증식의 비율의 %를 나타낸 것이다. Negative는 자극을 주지 않은 T 세포, Positive는 CD3, CD28로 T 세포를 자극하여 증식을 유도한 세포를 의미한다.
도 7은 신이 30% 에탄올 추출물의 칼슘 의존성 염화물 이온통로인 ANO1 전류의 저해효과를 나타낸 그래프로써, ANO1 이온통로가 과발현된 HEK293-T 세포에서 측정된 ANO1 이온통로의 전류와 신이 30% 에탄올 추출물 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 1 mg/ml 및 ANO1 저해제인 A0-1의 패치 클램프 차트 기록을 나타낸 것이다.
도 8은 도 7의 전류 전압(I-V) 관계 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 9는 기록된 ANO1 전류의 +100 mV 전압에서 측정된 전류의 저해 정도를 요약한 그래프이다.
도 10은 인간 기도 상피 세포주인 Calu-3에서 측정된 칼슘 의존성 염화물 이온통로(I_CaCC)의 전류 저해 효과를 나타낸 그래프로써, 기도 상피세포인 Calu-3와 Th2 T 세포가 분비하는 알레르기 유도 사이토카인 IL-4 100 ng/ml을 24시간 동안 처리한 Calu-3에서 증가한 칼슘 의존성 염화물 이온통로 전류를 측정하여 비교한 것 및 기록된 칼슘 의존성 염화물 이온통로 전류의 +100 mV 전압에서 측정된 전류 및 ANO1 이온통로 억제제인 Ani9의 전류 억제를 나타낸 것이다.
도 11은 인간 기도 상피 세포주인 Calu-3에서 측정된 칼슘 의존성 염화물 이온통로(I_CaCC)의 전류 저해 효과를 나타낸 그래프로써, 사이토카인 IL-4를 처리한 Calu-3 세포에서 신이 30% 에탄올 추출물 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 1 mg/ml 의 칼슘 의존성 염화물 이온통로 전류의 억제 및 ANO1 이온통로 제해제인 Ani9의 전류 억제 및 기록된 칼슘 의존성 염화물 이온통로 전류의 + 100 mV 전압에서 측정된 전류의 저해 정도를 요약한 것을 나타낸 것이다.
도 12는 생쥐의 알레르기 비염 유도 질환 동물모델에서의 신이 30% 에탄올 추출물의 치료 효과를 나타낸 그래프로써, 유도된 알레르기 비염 질환 동물모델의 7일간 추출물의 농도별로 치료를 진행한 생쥐와 대조군 생쥐에서 10분간 관찰한 재채기와 코를 문지르는 횟수를 종합한 임상증상의 점수의 평균을 나타낸 것이다.
도 13은 생쥐의 알레르기 비염 유도 질환 동물모델에서의 신이 30% 에탄올 추출물의 치료 효과를 나타낸 그래프로써, 신이 30% 에탄올 추출물의 농도별 치료를 진행한 질환 동물모델에서 채취한 비장세포에서 분비한 사이토카인 IL-4을 나타낸 것이다.
도 14는 생쥐의 알레르기 비염 유도 질환 동물모델에서의 신이 30% 에탄올 추출물의 치료 효과를 나타낸 그래프로써, 신이 30% 에탄올 추출물의 농도별 치료를 진행한 질환 동물모델에서 채취한 비장세포에서 분비한 사이토카인 IL-13을 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로도 구체화 될 수 있다. 여기서 소개되는 실시예는 소개하는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1> 신이 추출물의 제조

건조된 신이를 구입하여 분쇄기를 이용하여 분말을 제조하였다. 신이 분말 200g을 2kg의 30% 에탄올에 넣고, 3시간 동안 중탕으로 가열하여 교반한 뒤, Whatman No. 1 여과지를 이용하여 추출 용액을 여과시켰다. 이후, 원심분리기를 사용하여 상층액을 취하고, 남은 잔사는 동일한 방법으로 2회 반복하여 추출하였다. 여과된 추출 용액은 동결 건조하여 신이 에탄올 추출물 건조 분말을 회수하였다.

<실시예 2> 전세포 패치 클램프를 통한 신이 추출물의 SOCE 억제 확인

실시예 1에서 제조한 신이 추출물의 SOCE(Store Operated Calcium Entry) 억제 여부를 확인하기 위하여, SOCE의 구성 요소인 ORAI1 및 STIM1 단백질이 과발현된 HEK293T 세포주를 이용하여 전세포 패치클램프(whole cell patch clamp)를 수행하였다.

세포 내 IP₃에 의해 ER 내부의 칼슘 저장고의 고갈이 일어나는 데 이때, ER calcium sensor인 STIM1이라는 단백이 활성화되고 ER의 칼슘 분비가 일어나게 되면 그에 따라서 ORAI1과 STIM1의 복합체가 형성되며 Orai-1 채널의 활성이 생겨 SOCE를 통한 세포 내 칼슘 유입이 일어나게 된다. 이러한 기전에 의해 생성되는 I_SOCE가 평형상태로 유지되었을 때 추출물을 처리하여 I_SOCE의 전류가 억제되는지 확인하였으며, 또한, ORAI1 저해제인 BTP2 10 uM 를 처리하여 각 한약재 추출물에 의한 I_SOCE의 상대적인 활성 저해 정도를 비교분석하였다.

구체적으로, HEK293T 세포(catalog no. CRL-3216)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(american type culture collection; ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. Axopatch 200B(Molecular Device) 증폭기를 사용하여 측정되는 전류를 증폭시켰고, Digidata 1440A(Molecular Device)를 통해 디지털화시켜, pClamp 10.4(Molecular Device)로 기록하였다. SOCE를 통한 전류를 측정하기 위해 피펫 용액으로 135 mM CsOH, 125 mM Glutamic acid, 20 mM HEPES, 20 mM BAPTA, 3 mM MgATP, 1 mM MgCl2, 0.002mM Na-pyruvate(pH7.2 CsOH)를 사용하였고, 세포 밖 용액으로 135 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose(pH 7.4 NaOH)용액을 사용하였다. 또한, 각 전류를 기록하기 위해 -100 mV로 전압을 고정 시켜주고, -130 mV부터 -70 mV까지 경사 전압을 100 ms 동안 20 초 간격으로 변화시켰으며, SOCE를 활성화시키기 위해 세포 내 용액에는 Inositole-3-phosphate(IP₃)를 넣어주었다.

그 결과 도 1 내지 도 3에서 보이는 바와 같이 신이 추출물 1 mg/ml 이 I_SOCE의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 전세포 패치 클램프를 통한 신이 추출물의 TRPV1 활성 억제 확인

실시예 1에서 제조한 신이 추출물이 칼슘통로 중 하나인 TRPV1을 억제 시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 인간 TRPV1 단백이 과발현된 HEK293T 세포주를 이용하여 전세포 패치클램프(whole cell patch clamp)를 수행하였다.

구체적으로, TRPV1을 활성화 시킬 수 있는 캡사이신 1 uM을 처리하여 TRPV1을 통한 이온전류(I_TRPV1)가 커지는 것을 확인한 뒤, 신이 추출물을 10, 30, 100 ug/ml을 순차적으로 처리하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 추출물이 I_TRPV1의 활성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. 즉, 상기 결과를 통하여, 신이 추출물이 칼슘의 세포 내 유입과 관련된 I_TRPV1의 내향 전류를 보다 민감하게 억제할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 인간 T 세포 증식 억제효과 확인

상기 실시예 2 및 3에서 확인한 바와 같이, 세포 내 칼슘 유입을 억제 시킬 수 있는 신이 추출물이 실질적으로 인간 T 세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인하였다.

구체적으로, 15ml의 Ficoll(GE Healthcare)이 담긴 50ml 튜브에 혈액과 인산완충용액(PBS)를 1:1로 혼합한 혈액을 Ficoll과 섞이지 않도록 천천히 넣어주고 300xg에서 20분간 원심분리를 한 뒤 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell) 층을 조심히 채취한 뒤 혈소판 제거를 위해 200xg, 10분간 한 번 더 원심분리 하였다. 상층액의 혈소판은 제거하고 모인 세포 덩어리를 PBS에 재현탁시킨 후, 분리된 PBMC에서 Pan T cell isolation Kit(Milteny biotech)을 사용하여 T 세포를 분리하였다. 분리과정은 제조사에서 제공한 방법에 따라 진행하였다.

분리된 T 세포의 증식을 확인하기 위하여 형광을 나타내는 물질인 carboxy- fluorescein succinimidyl ester(CFSE) 2 μM을 T 세포에 넣고 실온에서 10분간 배양하였다. 표지된 T 세포를 2×10⁵ cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하였고, 분주된 세포에 5 μg/ml Anti-Human CD3와 2 μg/ml의 Anti-Human CD28이 첨가된 RPMI 1640으로 3일간 배양하였다. 3일 후 Anti-Human CD4-APC(BD Pharmingen)를 사용하여 CD4⁺ T 세포만을 염색한 뒤 FACS를 사용하여 세포의 증식을 분석하였다.

신이 추출물(MD)을 0.1, 0.3, 1 mg/ml을 넣고 실험한 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 추출물이 인간 T 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다.

<실시예 5> 전세포 패치 클램프를 통한 신이 추출물의 ANO1 활성 억제 확인

칼슘의존성 염소이온통로인 ANO1 이온통로는 코 상피세포에서 점액 및 전해질의 분비 즉 콧물 형성에 매우 중요한 이온통로이므로, 신이추출물이 인간 ANO1 이온통로에 대해 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 인간 ANO1 단백이 과발현된 HEK293T 세포주를 이용하여 전 세포 패치클램프(whole cell patch clamp)를 수행하였다.

그 결과, 도 7 내지 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 추출물 0.1, 0.3, 1 mg/ml를 처리하면 농도 의존적으로 ANO1을 통한 이온 전류가 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 1mg/ml에서는 ANO1을 87% 이상 억제함을 확인하였다.

<실시예 6> 인간 기도상피세포에서 신이 추출물의 칼슘의존성 염소이온통로 활성 억제 확인

인간 기도상피세포에는 ANO1이온통로를 포함한 다양한 염소이온 통로가 있으므로, 인간 기도상피세포주인 Calu-3(ATCC)를 이용하여 Th2 T 세포에서 분비하는 사이토카인인 IL-4가 콧물 생성에 관련이 있는 염소이온통로의 발현을 증가시키는지 및 신이 추출물이 이를 효과적으로 억제할 수 있는지를 확인하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, Calu-3에 IL-4를 처리하고 24시간 후에 칼슘의존성 염소이온통로를 통한 염소이온전류의 크기를 측정하면 전류의 크기가 2배 이상 증가한 것을 확인하였다.

한편, ANO1 이온통로의 선택적 저해제인 ANI-9을 처리하였을 때 전류가 완전히 억제되었으며, 이를 통하여, IL-4가 ANO1의 발현을 선택적으로 증가시킨다는 것을 확인하였다.

또한, 신이 추출물 0.1, 0.3 그리고 1mg/ml을 처리하였을 때 IL-4로 인해 발현이 증가된 칼슘의존성 염소이온통로를 통한 이온전류(I_CaCC)를 억제할 수 있는지 확인한 결과, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 추출물 처리로 인해 I_CaCC가 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.

< 실시예 7> 신이 추출물의 알레르기 비염 억제 효과 확인

1. 동물모델 및 시약 준비

7주령의 Balb/c 암컷마우스를 구입(오리엔트바이오, 경기도, 대한민국)하여 자유급식 조건에서 사육하고, 사육실에서 1주일 동안 안정화시킨 후 실험에 이용하였다. 알레르기 비염 억제 효과를 확인하기 위하여 오브알부민(Ovalbumin; OVA,sigma A5503), Inject Alum(Alum, Thermo scientific Prod#77161), 신이 추출물 및 히드로코르티손(Hydrocortisone, sigma H0888)을 대상 물질로 사용하였으며, 그룹당 6마리의 마우스를 사용하였다.

2. 동물모델의 알레르기 비염 유발

Day 0, Day 7, Day 14에 주 1회, 3주 동안 항원 0.2 ml를 마우스에 복강 주사하였다. 정상 대조군(Normal control; NL)은 Alum 2mg을 포함한 DPBS 200 ul를, 양성 대조군(Positive control; PC) 및 실험군은 OVA 25 ug과 Alum 2 mg을 포함한 DPBS 200 ul를 주입하였다.

Day 21부터 1일 1회 8일 동안 비강에 점적하였다. 정상 대조군은 DPBS 30 ul를, 양성 대조군 및 실험군은 OVA 100 ug을 포함한 DPBS 30 ul를 비강에 점적하였다.

3. 동물모델의 치료물질 투여

Day 24부터 OVA challenge 6시간 전에 비강에 점적하였다. DPBS에 30% 에탄올 신이 추출물이 각각 0.001 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1 mg/ml, 3 mg/ml 및 10 mg/ml 포함된 용액 20 ul를 비강에 1회 점적하였으며, Hydrocortisone은 1 mg/ml가 DPBS 20 ul에 포함되도록 하여 비강에 점적하였다.

4. 동물모델의 알레르기 비염 평가 방법

Day 28(OVA challenge 8일)에 30% 에탄올 추출물 또는 Hydrocortisone 처리 없이 Intranasal OVAchallenge 후 투명 아크릴 상자(15 cm x 20 cm x 15 cm)에 1마리씩 넣어 10분 동안 재채기와 코를 긁는 횟수를 관찰하였으며, 각각의 횟수를 합산하여 결과를 나타내었다.

5. 동물모델의 사이토카인 측정 방법

상기 마우스의 비장세포를 단일 세포로 분리하여 적혈구를 용혈 시킨 후, 비장세포 5 x 10⁶ cell/ml에 OVA 1 mg/ml을 첨가하고, 37.5℃, 72시간 배양한 다음, 배양액의 상층액을 수집하여 제조사의 프로토콜에 따라 Magnetic Luminex Assay(R&D Systems　, Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 IL-4와 의 농도를 측정하였다(Cytokine measurements).

6. 동물모델에서 신이 추출물의 알레르기 비염 억제 효과 확인

상기 4.의 방법으로 동물모델에서 알레르기 비염을 평가한 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 30% 에탄올 추출물이 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.8 mg/ml이 포함된 군을 점적한 마우스에서 재채기와 코를 긁는 횟수가 50% 정도 감소한 것을 확인하였다.

한편, 상기 5.의 방법으로 동물모델에서 사이토카인인 IL-4 및 IL-13을 측정한 결과, 도 13 및 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신이 추출물이 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.8 mg/ml이 포함된 군을 점적한 마우스의 IL-4 농도가 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, IL-13에서도 0.01 mg/ml 내지 0.8 mg/ml에서 양성 대조군 대비 현저한 수준으로 신이 추출물이 생성을 감소시키는 것을 확인하였다.

Claims (2)

1. 신이 추출물을 0.001 중량% 내지 0.08 중량% 함유함을 특징으로 하는 알레르기 비염 예방 및 치료를 위한 흡입용 에어로졸 제제.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 신이 추출물을 0.01 중량% 내지 0.08 중량% 함유함을 특징으로 하는 흡입용 에어로졸 제제.
   

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