KR20190054871A - 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법 - Google Patents

트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법 Download PDF

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Abstract

트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법에 관한 것으로, 상기 식물병 방제용 조성물은 천연물로서 인체에 무해하고 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서 식물병을 방제하는데 효과가 있어 환경친화적인 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

Description

트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법{Composition for controlling plant diseases including Trevesia palmata, fraction of thereof or a compound isolated therefrom as an active ingredient and method of controlling plant diseases using the same}
트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
작물 생산에 있어서, 식물병원균은 식물의 건전한 생육을 저해하는 유해인자의 하나로 식물병을 일으킨다. 대규모 재배 지역에 식물병이 대발생하게 되면 작물생산량의 크게 감소하여 경제적으로 큰 손실이 발생할 뿐만이 아니라, 주곡 생산에 차질이 생길 경우 식량안보 측면에서 큰 위협이 되기 때문에 심각한 사회 문제가 될 수 있다.
근현대농업에 있어서 농약사용은 식물병을 방제하는데 있어 주요 수단이 되어왔다. 그러나 다년간 대량으로 살포된 화학농약은 병원균 군집에서 약제 내성 병원균의 출현을 가속시켜 방제비용을 증가시키고 있으며, 잔류농약의 생태계 교란 및 인축독성에 대한 시민 사회 및 학계의 우려가 끊이지 않고 있다. 저항성 문제를 해결함과 동시에 합성농약의 사용을 줄이는데 있어 생물농약 사용을 골자로 하는 종합적인 병해충 방제가 합성농약에 의존적인 현행농법의 새로운 대안이 될 수 있다. 생물농약은 병해충을 방제하는데 있어 진균, 세균, 바이러스 등 살아있는 미생물을 사용하거나 식물추출물 등 생물소재에서 유래한 물질을 기반으로 개발된다. 그러므로 생물농약은 자연에서 유래한 천연물로서 자연친화적인 특징을 가지며, 합성된 화학농약과 비교하여 독성이 약하거나 무해하다는 장점을 가지고 있다.
이에, 한국을 포함한 OECD 가입국을 중심으로 합성농약 사용에 대한 정책적인 규제가 강화되고 있다. 미국화학협회의 화학정보데이터베이스(CAS)에 등록된 수백만 종의 화합물을 군집분석하면 단 몇백 종의 선도물질 군으로 분류할 수 있는데, 선도물질을 기준으로 규제가 강화되면, 향후 사용할 수 있는 합성농약의 수는 급감하게 될수 밖에 없다. 따라서 합성 농약을 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제 수단의 개발이 필요하다.
식물은 식물을 둘러싼 다양한 환경에 적응하기 위하여 알칼로이드(alkaloid), 터핀노이드(terpenoid), 플라보노이드(flavonoid), 글라이코사이드(glycoside), 퀴논(quinone), 쿠마린(coumarin), 페놀릭(phenolic), 에센셜오일(essential oil), 파이토알렉신(phytoalexin) 등 다양한 물질을 생합성할 수 있게 진화해왔으며, 식물병원균의 침입 및 해충의 섭식을 저해하는 기능을 하는 이차대사산물을 식물체내에 축적하고 있다.
생물농약으로 님(neem), 카놀라(canola), 제충국(pyrethrin), 리모넨(limonene), 티트리(tee tree), 로테논(rotenone) 유래의 식물추출물 및 에센셜오일이 사용되고 있다. 또한 만수국(Tagetes patula L.) 에센션오일은 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 및 녹색곰팡이병균(Penicillium digitatum)에 강한 항균활성을 나타냈으며, 분꽃(Mirabilis jajapa L.) 추출물은 식물병원균의 균사 신장을 저해하는 활성을 나타냈으며, 미국감나무(Diospyros virginiana L.) 추출물 유래의 화합물이 항균효과를 나타냈으며, 퀴노아(Chenopodium quinoa Willd) 유래의 사포닌 화합물이 잿빛곰팡이병균을 포함한 몇 가지 식물병원균에 항균활성을 나타낸다는 등의 식물추출물이 식물병 방제제로서 이용 가치가 높음을 뒷받침하는 다수의 연구 결과가 보고된 바 있다.
두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata Roxb. Ex Lindl)는 눈꽃을 닮은 잎 때문에 눈꽃나무(snowflake tree) 또는 눈꽃두릅이라고 부른다. 인도 원산의 상록수로 지름 15 센티미터, 높이 8 미터 이상 성장한다. 방글라데시, 콜롬비아, 인도, 라오스, 네팔, 태국, 베트남에 분포하며, 강장효과가 있어 전통음료로 음용되며, 실내 포름알데하이드 제거에 효용이 있는 관상식물로서 가치가 있다고 알려져 있다. 태국 일부지역에서는 이 식물을 산후조리용 입욕제로서 사용한다. 트레베지아 팔마타 식물의 추출물이 혈전용해 및 관절염완화에 효능을 나타낸다고 알려져 있으며, 이 식물로부터 분리한 사포닌(saponin) 화합물이 암세포 라인의 증식을 억제하는 효과를 나타낸다는 보고가 있다.
Tommasi, N. D., Autore, G., Bellino, A., Pinto, A., Pizza, C., Sorrentino, R., Venturella, P.(2000) Antiproliferative triterpenoid saponinsfrom Trevesia palmata. J. Nat. Prod. 63, 308-314. Rahman, K. H., Nandi, J. K., Sultana, S., Rahman, S., Hossan, S., Rahmatullah, M.(2014) Phytochemical screening, antihyperglycemic and analgesic activity studies with methanol extract of Trevesia palmata leaves. World J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 3, 91-101. Van Khoa, P., Van Nang, B., Hao, N. T. B.(2013) Study on gaseous formaldehyde removal capability of some native plant species in Vietnam. Pharmaceut. Res. 4, 1-7.
본 발명의 일 측면은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법이 제공된다.
나아가, 본 발명의 다른 측면에 따라, 식물병 방제에 있어서의, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물이 제공된다.
나아가, 본 발명의 다른 측면에 따라, 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법이 제공된다.
트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물, 이의 분획물 또는 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 천연물로서 인체에 무해하고 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서 식물병을 방제하는데 효과가 있어 환경친화적인 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물의 부탄올 분획물로부터 TP1 및 TP2 화합물을 분리하는 공정도이다.
도 2는 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 TP3, TP4 및 TP5 화합물을 분리하는 공정도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 벼 도열병(Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia triticina) 등의 작물생산에 있어 중요한 식물병에 대해 우수한 방제 효과를 나타내는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명자는 친환경 식물병 방제제를 개발하기 위하여 다양한 식물 추출물의 7가지 식물병에 대한 방제효과를 조사하던 중 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata Roxb. Ex Lindl)가 다양한 식물병에 방제효과가 우수하다는 것을 발견하였다.
본 명세서 중에서 “방제”라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피 뿐만 아니라 제거, 사멸을 포함하는 의미로 이용하는 것으로 한다. 하지만 식물병 방제는 예방적 처리에 의한 방제효과가 주요 방제 기작이므로 트레베지아 팔마타 추출물, 분획물, 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물의 식물병에 대한 방제효과조사는 예방적 처리로 실험하였다.
구체적으로, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤 및 아세토나이트릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 추출물의 분획물은 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드, 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 분획될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병은 알터나리아 포리(Alternaria porri; 양파 검은무늬병균), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea; 토마토 잿빛곰팡이병균), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes; 고추 탄저병균), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum; 토마토 시들음병균), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae; 벼 도열병균), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina; 밀 붉은녹병균), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani; 벼 잎집무늬마름병균), 블루메리아 그래미니스 f. sp. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei; 보리 흰가루병) 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans; 토마토 역병균)으로 이루어지는 식물병원성 곰팡이 균사로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 식물병은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae; 호접란 세균성갈색점무늬병균), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens; 과수 뿌리혹병균), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 세균성벼알마름병균), 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; 고추 궤양병균), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 세균성무름병균), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae; 키위 궤양병균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 풋마름병균) 및 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni; 복숭아 세균성구멍병균)으로 이루어지는 식물병원성 세균으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 화합물(화학식 1의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 화학식 2의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 화학식 3의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside, 화학식 4의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, 화학식 5의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid)을 하나 이상 포함할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
;
[화학식 2]
Figure pat00002
;
[화학식 3]
Figure pat00003
;
[화학식 4]
Figure pat00004
; 및
[화학식 5]
Figure pat00005
.
이때, 상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함될 수 있고, 1000 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도는 식물병이 발생된 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리할 때의 조성물에 포함된 농도를 나타내며, 상기 농도가 100 ㎍/㎖ 미만일 경우, 유효성분의 농도가 너무 낮아 식물병의 방제효과가 떨어지는 문제가 있고, 상기 농도가 3000 ㎍/㎖ 초과일 경우, 필요 이상으로 유효성분의 농도가 너무 높아 비경제적이며 환경에 대한 부정적 영향이 발생할 수 있다. 하지만, 식물병 방제용 조성물의 사용량이 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니며, 식물병원균 또는 식물병원성 세균의 종류, 발생 정도, 환경 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
상기 식물병 방제용 조성물은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물 또는 상기 추출물 또는 분획물에서 분리한 항균활성물질의 단순 혼합물일 수 있다. 대안적으로는, 식물병 방제용 조성물은 상기 추출물, 추출물의 분획물 또는 이들에서 분리한 항균활성물질과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필)및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물이 식물 병원균에 대한 방제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실험예 1 내지 3 참조), 이로부터 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 효과가 있음을 알 수 있다.
상기 트레베지아 팔마타 추출물 또는 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
1) 트레베지아 팔마타에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 트레베지아 팔마타의 추출물을 제조하는 단계; 및
4) 단계 3)의 트레베지아 팔마타 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 트레베지아 팔마타 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에서, 단계 1)의 트레베지아 팔마타는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 트레베지아 팔마타는 잎, 줄기 또는 뿌리가 모두 이용가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다..
상기 단계 1)의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤 및 아세토나이트릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올일 수 있다.
추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매를 건조된 트레베지아 팔마타 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출할 수 있고, 2 내지 3배 첨가하여 추출할 수 있다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃일 수 있고, 20℃ 내지 40℃일 수 있고, 실온일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간일 수 있고, 15 내지 30시간일 수 있고, 24시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나아가, 추출횟수는 1 내지 5회일 수 있고, 3 내지 4회 반복 추출할 수 있고, 3회일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드, 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분획물은 트레베지아 팔마타 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물로 분획하여 수득한 용매 분획물 중 어느 하나일 수 있고, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분획물은 상기 트레베지아 팔마타 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압농축할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포(액체 처리제의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하) 가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리. 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물이 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배지(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미립화하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물이 식물 병원균에 대한 방제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실험예 1 내지 3 참조), 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 측면은 식물병 방제에 있어서의, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물을 제공한다.
나아가, 본 발명의 다른 측면은 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물(화학식 1의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 화학식 2의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 화학식 3의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물일 수 있다.
또한, 상기 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물은 하기 화학식 4 및 5로 표시되는 화합물(화학식 4의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, 화학식 5의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00006
;
[화학식 2]
Figure pat00007
;
[화학식 3]
Figure pat00008
;
[화학식 4]
Figure pat00009
; 및
[화학식 5]
Figure pat00010
.
상기 헤데라게닌 사포닌 배당체 또는 아시아틱산 배당체는 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
트레베지아 팔마타 추출물로부터 용매 분획물을 제조하고, 상기 분획물을 액체크로마토그래피 기법으로 분획하여 헤데라게닌 사포닌 배당체 또는 아시아틱산 배당체를 분리할 수 있다.
상기 액체크로마토그래피 기법은 이동상이 액체인 크로마토그래피 기법을 의미하고, 고정상이 채워진 컬럼(column)이나 고정상이 부착된 평면에서 수행된다. 트레베지아 팔마타 분획물은 용매분획물이라면 제한되 않으나, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 이동상으로는 물, 헥산, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 아세톤, 클로로포름, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 등의 유기용매를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 고정상으로는 실리카겔(silica gel), Diaion HP-20, RP-18 또는 Sephadex LH-20을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 식물병은 알터나리아 포리(Alternaria porri; 양파 검은무늬병균), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea; 토마토 잿빛곰팡이병균), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes; 고추 탄저병균), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum; 토마토 시들음병균), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae; 벼 도열병균), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina; 밀 붉은녹병균), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani; 벼 잎집무늬마름병균), 블루메리아 그래미니스 f. sp. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei; 보리 흰가루병) 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans; 토마토 역병균)으로 이루어지는 식물병원성 곰팡이 균사로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 식물병은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae; 호접란 세균성갈색점무늬병균), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens; 과수 뿌리혹병균), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 세균성벼알마름병균), 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; 고추 궤양병균), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 세균성무름병균), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae; 키위 궤양병균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 풋마름병균) 및 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni; 복숭아 세균성구멍병균)으로 이루어지는 식물병원성 세균으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함될 수 있고, 1000 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도는 식물병이 발생된 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리할 때의 조성물에 포함된 농도를 나타내며, 상기 농도가 100 ㎍/㎖ 미만일 경우, 유효성분의 농도가 너무 낮아 식물병의 방제효과가 떨어지는 문제가 있고, 상기 농도가 3000 ㎍/㎖ 초과일 경우, 필요 이상으로 유효성분의 농도가 너무 높아 비경제적이며 환경에 대한 부정적 영향이 발생할 수 있다. 하지만, 식물병 방제용 조성물의 사용량이 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니며, 식물병원균 또는 식물병원성 세균의 종류, 발생 정도, 환경 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 또는 아시아틱산 배당체 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 또는 아시아틱산 배당체 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등의 형태로 사용될 수 있다.
상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 또는 아시아틱산 배당체 화합물과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필)및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 또는 아시아틱산 배당체 화합물이 식물 병원균에 대하여 방제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실험예 7-9 참조), 이로부터 상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 효과가 있음을 알 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 측면은 상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포(액체 처리제의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하) 가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리. 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물이 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배지(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미립화하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 또는 아시아틱산 배당체 화합물이 식물병에 대하여 방제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실험예 7-9 참조), 이로부터 상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 식물병 방제에 있어서의, 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 트레베지아 팔마타 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가
단계 1: 트레베지아 팔마타 추출물의 제조
트레베지아 팔마타 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제조하기 위하여 트레베지아 팔마타 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 건조한 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata)의 잎·줄기 시료를 잘게 잘라 메탄올을 가하고 상온에서 24시간 동안 추출하여 여과지로 거른 다음 여과물을 감압농축하여 50 g의 트레베지아 팔마타 메탄올 추출물을 얻었다.
단계 2: 트레베지아 팔마타 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 준비
트레베지아 팔마타 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가 실험을 위해 60 mg/ml 농도로 메탄올에 용해한 단계 1의 추출물 시료 2 ml를 증류수 38 mL로 희석하였고, 전착제 트윈 20(Tween 20)을 0.025%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여 3,000 μg/ml 농도의 트레베지아 팔마타 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 용액을 40 ml 준비했다.
단계 3: 트레베지아 팔마타 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 식물 병 방제활성 조사
단계 2에서 제조한 방제용 조성물의 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(원인균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes) 등 7가지 식물병에 대한 병 방제활성을 온실 조건에서 하기와 같이 실험하였다. 이때 대조구는 5%(v/v)의 메탄올과 0.025%(w/v)의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 실험 결과는 표 1에 나타내었다.
구체적으로, 각 식물병원균 당 3개의 포트를 이용하였다. 단계 2에서 제조한 방제용 조성물 용액을 엽면(foliage)에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물병원균을 접종하였다. 실험에 사용한 벼, 토마토, 보리, 고추 및 밀 식물은 지름 4.5 cm의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25 ± 5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다.
벼 도열병은 3~4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5 × 105 spores/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 처리한 후, 25℃, 상대습도 80%의 항온항습실에서 4일간 재배하여 발병을 유도하였다.
벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90g, 왕겨 15g 및 증류수 100㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 재배하여 발병을 유도하였다.
토마토 역병은 3~4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans, 강릉원주대학교)의 유주자낭(5 × 104 sporangia/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다.
토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5 × 105 spores/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다.
밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 트리티시나(Puccinia triticina, 한국화학연구원)의 포자를 250㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다.
보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 블루메리아 그래미니스 포메 스페살리스 홀데이(Blumeria graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다.
토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일후에 병반면적율(%)을 조사하였다.
한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 5.0㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3~4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 트레베지아 팔마타 추출물 용액을 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4 × 105 spores/㎖)을 분무 접종하였다. 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리 후에 항온항습실(25℃, 상대습도 80%)에서 1일간 재배하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다.
상기로부터 얻은 병반면적율(%)을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가(%)를 계산하였다.
[수학식 1]
Figure pat00011
시료 농도
(μg/ml)		 방제가(%)
RCB RSB TGM TLB WLR BPM PAN
트레베지아 팔마타
추출물		 3000 60 0 79 96 83 0 25
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)
표 1에 나타낸 바와 같이,
트레베지아 팔마타 잎 및 줄기에서 메탄올로 수득한 추출물을 3,000 μg/ml 농도로 처리했을 때, 벼 잎집무늬마름병, 고추 탄저병 및 보리 흰가루병을 제외한 나머지 4종의 식물병에 대한 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병에 대하여는 방제가 79% 이상의 우수한 방제효과를 나타냄을 확인하였다. 트레베지아 팔마타 추출물의 식물병 방제효과는 보고된 적이 없다.
< 실시예 2> 트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가
단계 1: 트레베지아 팔마타 추출물의 용매 분획물의 제조
트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법을 수행하여 트레베지아 팔마타 메탄올 추출물을 제조하였으며, 상기 메탄올 추출물을 사용하여 용매 분획물을 제조하였다.
구체적으로, 트레베지아 팔마타 잎·줄기 메탄올추출물 50 g을 500 ml의 증류수로 용해시킨 후 동량의 헥산으로 2회 추출하였고 헥산층과 수용액층을 얻었다. 수용액층을 다시 동량의 에틸아세테이트와 부탄올로 2회 씩 추출하였고 에틸아세테이트층, 부탄올층과 수용액층을 얻었다. 그리고 이들을 감압농축하여 건조된 헥산분획물 (1.14 g), 에틸아세테이트분획물 (5.65 g), 부탄올분획물 (16.84 g) 및 물분획물 (20.02 g)을 얻었다.
단계 2: 트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 준비
트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가 실험을 위해 40 mg/ml 농도로 메탄올에 용해한 각각의 시료 2 ml를 증류수 38 ml로 희석하였고, 전착제 트윈 20(Tween 20)을 0.025%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여 2,000 μg/ml 농도의 트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 용액을 40 ml씩 준비했다.
단계 3: 트레베지아 팔마타 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제활성 확인
단계 2에서 제조한 방제용 조성물의 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(원인균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes) 등 7가지 식물병에 대한 병 방제활성을 온실 조건에서 실시예 1의 단계 3과 동일하게 실험하였다. 이때 대조구는 5%(v/v)의 메탄올과 0.025%(w/v)의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 실험 결과는 표 2에 나타내었다.
시료 농도
(μg/ml)		 병 방제가(%)
RCB RSB TGM TLB WLR BPM PAN
헥산분획물 2000 30 0 7 7 13 0 58
에틸아세테이트분획물 2000 70 5 86 57 3 0 50
부탄올분획물 2000 30 0 75 64 53 0 8
물분획물 2000 0 0 0 0 0 0 8
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)
표 2에 나타낸 바와 같이,
에틸아세테이트분획물이 2,000 μg/ml 농도에서 벼 도열병에 대한 70%의 방제가를 나타냈고, 토마토 잿빛곰팡이병에대하여 86%, 토마토 역병에 대하여 57% 및 고추 탄저병에 대하여 50%의 우수한 방제가를 나타내는 것을 확인하였다.
동일한 농도에서 부탄올 분획물은 벼 도열병에 대한 30%의 방제가를 나타냈고, 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여 75%, 토마토 역병에 대하여 64%, 밀 붉은녹병에 대하여 53%의 방제가를 나타내는 것을 확인하였다.
헥산 분획물은 벼 도열병과 고추 탄저병에 대하여 30% 및 58%의 방제가를 나타냄을 확인하였다.
물 분획물은 방제활성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 트레베지아 팔마타 추출물의 항균활성물질은 수용성 물질이 아닌 비극성 물질임을 확인하였다.
에틸아세테이트층과 부탄올층이 몇 가지 식물병에 대해 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보인 것을 토대로 각각 별도로 방제 활성성분의 분리 및 정제에 사용하였다.
< 실시예 3> 트레베지아 팔마타 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하 는 식물병 방제용 조성물의 벼 도열병균 균사생장 억제 활성 확인
트레베지아 팔마타 추출물이 함유하는 항균활성물질의 기초적인 성질을 파악하기 위하여, 상기 실시예 2의 단계 1에서 제조한 에틸아세테이트분획물 및 부탄올 분획물의 벼 도열병균에 대한 in vitro 항균활성을 확인하였다. 실험 결과는 표 3에 나타내었다.
구체적으로, 96-well plate를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 값을 구하여 평가하였다. 벼 도열병균 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)의 균사디스크 5개를 삼각플라스크에 담긴 100 ml 감자액체배지(potato dextrose broth medium)에 접종한 후 7~10일 동안 25℃에서 150 rpm으로 진탕한 배양액을 믹서기(blade mixer)로 갈아서 제조한 균사 현탁액 2 ml을 100 ml 감자액체배지에 잘 섞어서 50 μl 씩 웰(well)에 분주하였다.
최종적으로 100 μl 웰에 트레베지아 팔마타 메탄올 추출물, 에틸아세테이트분획물 및 부탄올분획물이 각각 1, 2, 4, 8, 16, 31, 63, 125, 250, 500, 1,000 μg/ml의 농도로 포함되도록 분주하였고, 이 때 메탄올의 함량은 5%를 초과하지 않았다. 5%의 메탄올만 첨가한 것을 대조구로 사용하였으며, 25℃에서 2~3일간 배양하였다.
시료 MIC(μg/ml)
트레베지아 팔마타 메탄올 추출물 125
추출물의 에틸아세테이트 분획물 125
추출물의 부탄올 분획물 125
표 3에 나타난 바와 같이,
트레베지아 팔마타 메탄올 추출물, 상기 추출물의 에틸아세테이트분획물 및 부탄올분획물이 벼 도열병균의 균사생장을 125 μg/ml에서 완전히 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3의 결과로부터 in vitro 조건에서 트레베지아 팔마타 추출물이 함유하는 항균활성물질이 벼 도열병균 자체에 작용하여 방제 활성을 나타냄을 확인한 바, 추출물이 함유하는 항균활성물질이 벼 도열병에 방제 활성을 나타내는 유효성분임을 알 수 있다.
< 실시예 4> 항균활성물질의 분리 1
트레베지아 팔마타 추출물로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 다양한 크로마토그래피 기법을 사용하여 분리를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 단계 1에서 수득한 부탄올 분획물(16.84 g)로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 도 1에 나타난 바와 같은 공정으로 TP1과 TP2 화합물을 분리하였다. 보다 상세히 설명하면, 증류수 1 L에 현탁한 부탄올 분획물을 Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical) 컬럼(지름 6 cm × 길이 30 cm)에 흡착시킨 다음 메탄올과 증류수를 0:100, 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 및 100:0의 부피비로 혼합한 메탄올수용액으로 순차적으로 용출시키고, 아세톤으로 한번 더 용출시켜 8개 분획물로 나누었다. 분획물의 화학적 특징을 조사하기 위하여 박막크로마토그패피(thin layer chromatography; TLC) 기법을 이용하였으며, 시료를 실리카겔 고정상에 흡착시킨 후 클로로포름:메탄올:증류수(14:6:1, v/v)로 전개시킨 다음 p-아니스알데하이드시약으로 발색시켜 TLC 패턴 분석을 실시하였다. 그 중 B7(2.1 g) 분획물을 다시 실리카겔(Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 500 g; Merck)이 충진된 컬럼(지름 7 cm × 길이 15 cm)에 가한 후 클로로포름:메탄올:증류수를 7:3:0, 14:6:1 및 0:20:1의 부피비로 혼합한 용액을 순차적으로 용출시켜 9개 분획물로 나누었다. 그 중 B75(901.5 mg) 분획물을 Sephadex LH-20(Sigma-Aldrich) 컬럼(지름 3 cm × 길이 90 cm) 크로마토그래피를 실시하였다. 용출용매로는 클로로포름:메탄올(5:5, v/v)을 사용하여 2개의 분획물로 나누었다. B751(143.6 mg)은 다시 실리카겔(70-230 mesh, 150 g)이 충진된 컬럼(지름 3 cm × 길이 35 cm)에 가한 후 클로로포름:메탄올:증류수(14:6:1, v/v)로 용출하였고 5개의 분획물중 B7514 분획물에서 화합물 TP1(82.2 mg)을 순수하게 분리하였다. 또한 B752(639.7 mg)을 동일한 세파덱스 LH-20 컬럼(지름 3 cm × 길이 90 cm) 크로마토그래피를 수행하여 3개의 분획물을 얻었다. 그 중 B7522(287.0 mg)은 실리카겔(70-230 mesh, 150 g)이 충진된 컬럼(지름 3 cm × 길이 35 cm)에 가한 후 클로로포름:메탄올:증류수(14:6:1, v/v)로 용출하여 화합물 TP2(66.9 mg)와 화합물 TP1(101.7 mg)을 순수하게 분리하였다.
< 실시예 5> 항균활성물질의 분리 2
트레베지아 팔마타 추출물로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 다양한 크로마토그래피 기법을 사용하여 분리를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 단계 1에서 수득한 에틸아세테이트분획물(5.65 g)으로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 도 2에 나타난 바와 같은 공정으로 TP3, TP4 및 TP5 화합물을 분리하였다. 보다 상세히 설명하면, 클로로포름:메탄올(9:1, v/v) 용액에 녹인 에틸아세테이트분획물을 클로로포름:메탄올:증류수(9:1:0, 30:9:1, 14:6:1, 12:8:1, 0:20:1, v/v/v)를 전개용매로 하여 실리카 겔(70-230 mesh, 500 g) 컬럼(지름 7 cm × 길이 15 cm) 크로마토그래피를 실시하였다. 분취한 용출액 일부를 실리카겔 박막크로마토그래피 판에 흡착시킨 후 클로로포름:메탄올:증류수(30:9:1, v/v)로 전개시킨 다음 p-아니스알데하이드시약으로 발색시켜 나타난 TLC 패턴을 기반으로, 13개 분획물로 나누었다. 그 중 E11(263.1 mg) 분획물을 메탄올을 용출용매로 하여 Sephadex LH-20 컬럼(지름 3 cm × 길이 90 cm) 크로마토그래피를 실시하였고 6개의 분획물로 나누었다. 그 중 E115(71.8 mg)을 클로로포름:메탄올:증류수(14:6:1, v/v/v)의 조건으로 실리카겔(70-230 mesh, 40 g) 컬럼(지름 1 × 길이 25 cm) 크로마토그래피를 수행하여 8개의 분획물을 얻었고, 화합물 TP3(29.4 mg)을 순수하게 분리하였다. 또한, E10(435.1 mg) 분획물을 메탄올을 용출용매로 하여 Sephadex LH-20 컬럼(지름 3 cm × 길이 90 cm) 크로마토그래피를 실시하였고 5개의 분획으로 나누었다. 그 중 E103(223.5 mg)을 실리카겔(70-230 mesh, 40 g) 컬럼(지름 1 cm × 길이 25 cm)에 흡착시키고 클로로포름:메탄올:증류수(14:6:1, v/v/v)로 용출시켜 6개의 분획으로 나누었다. 그 중 E1032(38.4 mg) 및 E1034(76.4 mg) 분획물로부터 분취용 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 사용하여 화합물 TP4(28.5 mg) 및 TP5(26.2mg)를 분리하였다. 이 때 분취용 HPLC의 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Polaris A C18(250 mm × 21.2 mm; Agilent)을 사용하였고 농도구배 조건으로 80―100% 메탄올수용액을 분당 5 ml의 속도로 용출시켜 210 nm 파장에서 검출되는 피크를 분획하였다.
< 실시예 6> 향균활성물질의 화학구조 규명
상기 실시예 4 및 5에서 분리한 항균활성물질의 화학구조를 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 유기용매분획물에서 분리된 물질의 화학구조 규명을 위하여 핵자기공명(nuclear magnetic resonnance; NMR)과 질량분광분석(mass spectroscopy; MS)이 사용되었다. 시료를 메탄올-d4(99.5% atom%D, Cambridge Isotope Laboratory)에 녹인 후 Bruker AMX-500 장비에서 수소 및 13탄소-NMR 스펙트럼을 얻었다. 수소 NMR 스펙트럼에서 나타나는 3.31 ppm 및 탄소 NMR 스펙트럼에서 나타나는 49.0 ppm의 메탄올 용매 피크를 기준으로 화학적이동(chemical shift) 값을 δ(ppm)으로 나타내었다. 1H-1H COSY, HSQC, HMBC 및 DEPT 실험을 통해 스펙트럼에 나타난 피크의 화학적 위치를 결정하였다. MALDI-TOF-MS를 사용하여 분리한 화합물의 질량은 측정하였으며, Bruker Autoflex Speed TOF/TOF 장비를 이용하여 MS/MS 분석을 통해 분자량 기반의 화학구조적 특성을 규명하였다. 고해상도질량분석기(high-resolution mass spectroscopy; Synapt G2 HDMS Q-TOF)를 사용하여 분리된 화합물의 화학식을 완성하였다. 또한, 편광분석기(polarimeter; Auto Digital Polarieter, Rudolph Research Analytical) 및 적외선분석기(FT-IR spectroscopy; Identify IR, Smiths)로 분리된 화합물의 특징을 조사하였다.
<6-1> 화합물 TP1의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 TP1은 양이온모드의 MALDI-TOF-MS에서 m/z 1081 [M + Na]+의 양이온으로 검출되었으며, 화학식은 C53H66O21로 결정하였다. 메탄올에 녹였을 때, [α]D 21 8.26 값을 나타냈으며, IR 스펙트럼에서 하이드록시기(3378 cm-1), 카보닐기(1692 cm-1), 알켄(1636 cm-1) 및 메틸(1056 cm- 1)이 검출되었다. NMR 분석 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
하기 표 4에 나타난 바와 같이,
13탄소 NMR 스펙트럼에서 53개의 탄소 시그널이 나타났고, 이 중 30개가 트라이터핀이 구성하며, 나머지가 4개의 당을 구성한다. 수소 NMR 스펙트럼에서는 δ H 0.70, 0.81, 0.91, 0.94, 0.97, 1.18 ppm(C-24, C-25, C-26, C-27, C-29, C-30)의 6개의 메틸, δ H 5.24 ppm(t, H-12)의 산소와 결합한 메틴 및 δ H 3.58, 3.33 ppm(m, H-23)의 일차알콜 수소시그널이 나타났다. 13탄소 NMR 스펙트럼에서는 δ C 13.7, 16.4, 17.7, 26.5, 33.6, 24.0 ppm의 메틸기, δ C 123.5, 145.2 ppm의 두 개의 올레핀(olefin), δ C 82.3 ppm의 산소와 결합한메틴, δ C 64.4 ppm의 일차알콜 및 δ C 182.0 ppm의 카보닐 탄소시그널이 나타났다. 트라이터핀 구조의 HMBC 스펙트럼을 살펴보면, H-9(δ H 1.67~1.57 ppm)은 C-25(δ C 16.4 ppm) 및 C-26(δ C 17.7 ppm)과; H-11(δ H 1.93~1.85 ppm)은 C-13(δ C 145.2 ppm)과; H-18(δ H 2.85 ppm)은 C-28(δ C 182.0 ppm)과; H-24(δ H 0.70 ppm)는 C-3(δ C 82.3 ppm) 및 C-23(δ C 64.4 ppm)과; H-27(δ H 1.18 ppm)은 C-13(δ C 145.2 ppm)과; H-29(δ H 0.91 ppm)은 C-30(δ C 24.0 ppm)과; H-30(δ H 0.94 ppm)은 C-29(δ C 33.6 ppm)과 인접한다. 이러한 결과는 화합물 TP1의 트라이터핀 구조가 α-헤데라제닌(α-hederagenin)이라는 것을 나타낸다. HSQC 스펙트럼으로 당을 분석하면 δ H 5.19(d, J = 1.8 Hz), 4.85(d, J = 1.7 Hz), 4.52(d, J = 7.8 Hz), 4.47(m) ppm의 4개 아노머(anomeric) 수소가 각각 δ C 101.6, 102.8, 105.7, 105.2 ppm의 4개의 아노머 탄소와 결합한 것을 확인할 수 있다. HMBC 스펙트럼에서 나타난 δ H 4.47(α-L-Ara)과 δ C 82.3(C-3 of aglycone); δ H 101.6(α-L-Rha)과 δ C 76.7(C-2 of α-L-Ara); δ H 105.7(β-D-Glc)과 δ C 82.9(C-3 of α-L-Rha); δ H 4.85(α-D-Rha)과 δ C 70.9(C-2 of α-L-Rha)간의 상관관계 분석과 MALDI-TOF-MSMS 분석에서 나타난 m/z 935 [M + Na Rha]+, 773 [M + Na Rha Glc]+, 627 [M + Na Rha Glc Rha]+의 이온을 통해 헤데라제닌과 당, 당과 당 사이의 결합을 결정하였다. 이러한 결과를 바탕으로 화합물 TP1의 화학구조를 하기 화학식 1의 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside로 결정하였으며, 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물임을 확인하였다.
[화학식 1]
Figure pat00012
;
Position
 TP1
δ C a δ H, mult.(J)
1 39.6 1.67~1.57, m; 0.98, m
2 26.6 1.93~1.85, m; 1.81~1.68, m
3 82.3 3.63, dd(10.2, 3.6)
4 43.9
5 48.0 1.30~1.27, m
6 18.8 1.49, d(12.3); 1.44~1.32, m
7 33.8 1.67~1.57, m; 1.30~1.27, m
8 40.4
9 49.0 1.67~1.57, m
10 37.6
11 24.5 1.93~1.85, m
12 123.5 5.24, t(3.7)
13 145.2
14 42.9
15 28.8 1.81~1.68, m; 1.08, m
16 24.0 2.01, td(13.4, 3.9); 1.67~1.57, m
17 47.6
18 42.7 2.85, dd(13.9, 4.5)
19 47.2 1.81~1.68, m; 1.13, m
20 31.6
21 34.9 1.44~1.32, m; 1.22, m
22 33.3 1.67~1.57, m; 1.54, d(13.6)
23 64.4 3.58, m; 3.33, m
24 13.7 0.70, s
25 16.4 0.97, s
26 17.7 0.81, s
27 26.5 1.18, s
28 182.0
29 33.6 0.91, s
30 24.0 0.94, s
α-L-Ara
1 105.2 4.47, m
2 76.7 3.64, m
3 74.1 3.64, m
4 69.9 3.76, m
5 66.0 3.84, m; 3.52, dd(12.4, 1.9)
α-L-Rha
1 101.6 5.19, d(1.8)
2 70.9 4.25, dd(3.2, 1.8)
3 82.9 3.87, dd(9.5, 3.1)
4 72.4 3.56, m
5 70.0 3.93, dq(9.6, 6.2)
6 17.8 1.27, d(6.0)
β-D-Glc
1 105.7 4.52, d(7.8)
2 75.4 3.36, m
3 76.6 3.39, m
4 73.7 3.42, d(9.5)
5 76.3 3.48, t(9.0)
6 61.6 3.82, m; 3.67, dd(12.0, 3.7)
α-L-Rha(terminal)
1' 102.8 4.85, d(1.7)
2' 72.1 3.64, m
3' 79.0 3.59, m
4' 72.4 3.84, m
5' 70.6 3.99, dq(9.5, 6.2)
6' 18.2 1.26, d(6.0)
(a Recorded in CD3OD at 500 MHz; δ in ppm and J in Hz)
<6-2> 화합물 TP2의 화학구조 규명
분리된 화합물 TP2의 MALDI-TOF-MS에서 m/z 935 [M + Na]+의 양이온이 검출되었고, 화학식은 C47H76O17로 결정하였다. MALDI-TOF-MSMS 분석에서 773 [M + Na Rha Glc]+, 627 [M + Na Rha Glc Rha]+의 이온이 검출되었다. NMR 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
하기 표 5에 나타난 바와 같이 13탄소 NMR 스펙트럼에서 47개의 탄소 시그널이 나타났고, 이 중 30개가 트라이터핀이 구성하며, 나머지가 3개의 당을 구성한다. 화합물 TP2의 수소 및 13탄소 NMR 스펙트럼은 문헌(Tommasi et al., 2000)에 나타난 데이터와 일치하였기 때문에, 화합물 TP2를 하기 화학식 2의 화합물로 동정하였으며, 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물임을 확인하였다.
[화학식 2]
Figure pat00013
Position
 TP2
δ C a δ H, mult.(J)
1 39.7 1.70~1.58, m; 0.98, m
2 26.6 1.95~1.85, m; 1.80~1.71, m
3 82.4 3.69, dd(11.8, 5.0)
4 44.0
5 48.1 1.30~1.27, m
6 18.8 1.50, d(13.2); 1.42~1.33, m
7 33.8 1.70~1.58, m; 1.30~1.27, m
8 40.5
9 49.9 1.70~1.58, m
10 37.6
11 24.5 1.92~1.85, m
12 123.6 5.24, t(3.8)
13 145.3
14 43.0
15 28.9 1.80~1.71, m; 1.08, dt(13.6, 3.5)
16 24.0 2.00, td(13.6, 4.1); 1.70~1.58, m
17 47.7
18 42.8 2.85, dd(13.8, 4.5)
19 47.3 1.80~1.71, m; 1.13 ddd(13.7, 4.7, 2.3)
20 31.6
21 34.9 1.42~1.33, m; 1.20, m
22 33.4 1.70~1.58, m; 1.54, dt(13.7, 3.6)
23 64.5 3.62, dd(12.0, 4.6), 3.33 d(8.2)
24 13.7 0.70, s
25 16.4 0.97, s
26 17.8 0.82, s
27 26.5 1.18, s
28 182.0
29 33.6 0.91, s
30 24.1 0.94, s
α-L-Ara
1 105.0 4.49, dd(5.0, 1.5)
2 76.9 3.65, m
3 74.0 3.65, m
4 69.8 3.76, m
5 65.7 3.84, dd(12.3, 3.9); 3.51, dd(12.3, 2.2)
α-L-Rha
1 101.7 5.17, d(1.9)
2 71.1 4.24, dd(3.2, 1.9)
3 82.8 3.88, dd(9.5, 3.0)
4 72.3 3.56, t(9.5)
5 70.1 3.92, dq(9.7, 6.2)
6 18.1 1.26, d(6.2)
β-D-Glc
1 105.8 4.51, d(7.8)
2 75.3 3.31, dd(7.9, 1.32)
3 77.8 3.38, t(8.9)
4 71.3 3.33, d(11.2)
5 77.8 3.57, d(11.3)
6 62.4 3.87, dd(11.9, 2.4); 3.86, dd(12.3, 3.9)
(a Recorded in CD3OD at 500 MHz; δ in ppm and J in Hz)
<6-3> 화합물 TP3의 화학구조 규명
화합물 TP3의 MALDI-TOF-MS에서 검출되는 양이온은 m/z 773 [M + Na]+으로 화학식 C41H66O12로 결정하였다. NMR 분석 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
하기 표 6에 나타난 바와 같이 13탄소 NMR 스펙트럼에서 41개의 탄소 시그널이 나타났고, 이 중 30개가 트라이터핀이 구성하며, 나머지가 2개의 당을 구성한다. 화합물 TP3의 수소 및 13탄소 NMR 데이터를 문헌(Aliev and Movsumov, 1976)과 비교하여 분리된 화합물 TP3를 하기 화학식 3의 화합물은 hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside으로 동정하였으며, 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물임을 확인하였다.
[화학식 3]
Figure pat00014
Position
 TP3
δ C a δ H, mult.(J)
1 39.7 1.70~1.58, m; 0.98, m
2 26.5 1.95~1.85, m; 1.80~1.71, m
3 82.3 3.62, dd(11.8, 4.7)
4 43.9
5 48.1 1.30~1.27, m
6 18.8 1.50, d(12.3); 1.42~1.33, m
7 33.9 1.70~1.58, m; 1.30~1.27, m
8 40.5
9 49.5 1.70~1.58, m
10 37.6
11 24.5 1.92~1.85, m
12 123.6 5.24, t(3.7)
13 145.5
14 43.0
15 28.9 1.80~1.71, m; 1.08, dt(13.6, 3.5)
16 24.1 1.99, td(13.6, 3.9); 1.70~1.58, m
17 47.8
18 43.9 2.86, dd(13.9, 4.5)
19 47.4 1.80~1.71, m; 1.13 ddd(13.7, 4.7, 2.3)
20 31.6
21 35.0 1.42~1.33, m; 1.20, m
22 33.4 1.70~1.58, m; 1.53, dt(14.5, 3.7)
23 64.6 3.62, m; 3.33, m
24 13.7 0.70, s
25 16.4 0.98, s
26 17.9 0.83, s
27 26.5 1.18, s
28 182.6
29 33.6 0.90, s
30 24.0 0.94, s
α-L-Ara
1 104.4 4.56, dd(5.0, 1.5)
2 76.9 3.71, m
3 74.0 3.71, m
4 69.8 3.77, m
5 65.7 3.84, dd(12.0, 5.0); 3.50, dd(11.6, 2.2)
α-L-Rha
1 101.9 5.16, d(1.7)
2 71.1 3.91, dd(3.5, 1.7)
3 82.8 3.48, d(11.2)
4 72.3 3.37, q(9.5)
5 70.1 3.85, q(6.2)
6 18.1 1.24, d(6.3)
(a Recorded in CD3OD at 500 MHz; δ in ppm and J in Hz)
<6-4> 화합물 TP4의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 TP4는 양이온모드의 MALDI-TOF-MS에서 m/z 805 [M + Na]+의 양이온으로 검출되었으며, 화학식은 C41H66O14로 결정하였다. NMR 분석 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
하기 표 7에 나타난 바와 같이,
13탄소 NMR 스펙트럼에서 41개의 탄소 시그널이 나타났고, 이 중 30개가 트라이터핀이 구성하며, 나머지가 2개의 당을 구성한다. 수소 NMR 스펙트럼에서는 δ H 0.77, 0.86, 0.92, 0.99, 1.08, 1.15 ppm(C-24, C-25, C-26, C-27, C-29, C-30)의 6개의 메틸, δ H 5.28 ppm(t, H-12)의 산소와 결합한 메틴 및 δ H 3.60, 3.54 ppm(m, H-23)의 일차알콜 수소시그널이 나타났다. 13탄소 NMR 스펙트럼에서는 δ C 14.4, 17.6, 17.9, 18.0, 21.6, 24.1 ppm의 메틸기, δ C 127.0, 139.3 ppm의 두 개의 올레핀(olefin), δ C 88.3 ppm의 산소와 결합한메틴, δ C 64.4 ppm의 일차알콜 및 δ C 177.9 ppm의 카보닐 탄소시그널이 나타났다. 트라이터핀 구조의 HMBC 스펙트럼을 살펴보면, H-9(δ H 1.65 ppm)은 C-10(δ C 38.5 ppm) 및 C-25(δ C 17.9 ppm)과; H-11(δ H 2.00 ppm)은 C-13(δ C 139.3 ppm)과; H-18(δ H 2.26 ppm)은 C-28(δ C 177.9 ppm), C-29(δ C 17.6 ppm), C-22(δ C 25.2 ppm) C-14(δ C 43.4 ppm) 및 C-12(δ C 127.0 ppm)과; H-24(δ H 0.77 ppm)는 C-3(δ C 88.3 ppm) 및 C-23(δ C 64.4 ppm)과; H-27(δ H 1.15 ppm)은 C-15(δ C 29.2 ppm) 및 C-13(δ C 139.3 ppm)과; H-29(δ H 0.92 ppm)는 C-19(δ C 40.4 ppm) 및 C-18(δ C 54.2 ppm)과; H-30(δ H 0.99 ppm)은 C-21(δ C 31.7 ppm) 및 C-19(δ C 40.4 ppm)과 인접한다. 이러한 결과는 화합물 TP4의 트라이터핀 구조가 우르세인(ursane)화합물인 아시아틱산(asiatic acid)라는 것을 나타낸다. HSQC 스펙트럼으로 당을 분석하면 δ H 5.37(d, J = 8.1 Hz), 4.56(d, J = 4.4 Hz) ppm의 2개 아노머(anomeric) 수소가 각각 δ C 95.7, 106.3 ppm의 2개의 아노머 탄소와 결합한 것을 확인할 수 있다. HMBC 스펙트럼에서 나타난 δ H 4.56(α-L-Ara)과 δ C 88.3(C-3); δ H 5.37(β-D-Glc)과 δ C 177.9(C-28) 간의 상관관계 분석을 통해 아시아틱산과 당사이의 결합을 결정하였다. 이러한 결과를 바탕으로 분리한 화합물 TP4의 화학구조를 하기 화학식 4의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester로 결정하였으며, 아시아틱산 배당체 화합물임을 확인하였다.
[화학식 4]
Figure pat00015
Position
 TP4
δ C a δ H, mult.(J)
1 47.4 2.05, dd(12.6, 4.6); 0.88, m
2 68.0 3.82, dd(12.0, 2.0)
3 88.3 3.48, d(9.5)
4 45.2
5 47.7 1.33, m
6 18.8 1.52, m; 1.40, m
7 33.6 1.68, m; 1.33, m
8 41.0
9 48.9 1.65, m
10 38.5
11 24.5 2.0, m; 0.98, m
12 127.0 5.28, t(3.8)
13 139.3
14 43.4
15 29.2 1.96, m; 1.12, m
16 25.2 2.10, m; 1.78, m
17 49.4
18 54.2 2.26, d(11.3)
19 40.4 1.40, m
20 40.2
21 31.7 1.52, m; 1.33, m
22 37.5 1.78, m; 1.65, m
23 64.0 3.71, m; 3.29, d(11.4)
24 14.4 0.77, s
25 17.9 1.08, s
26 18.0 0.86, s
27 24.1 1.15, s
28 177.9
29 17.6 0.92, d(6.4)
30 21.6 0.99, s
α-L-Ara
1 106.3 4.31, d(7.6)
2 72.9 3.71, m
3 74.6 3.54, m
4 70.1 3.85, dt(3.5, 1.6)
5 67.8 3.93, dd(12.7, 2.1); 3.65, dd(12.8, 1.3)
β-D-Glc
1 95.7 5.37, d(8.1)
2 73.9 3.33, m
3 78.2 3.42, m
4 71.1 3.39, m
5 78.5 3.35, d(8.5)
6 62.5 3.80, m; 3.71, m
(a Recorded in CD3OD at 500 MHz; δ in ppm and J in Hz)
<6-5> 화합물 TP5의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 TP5는 양이온모드의 MALDI-TOF-MS에서 m/z 643 [M + Na]+의 양이온으로 검출되었으며, 화학식은 C35H56O9로 결정하였다. NMR 분석 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
하기 표 8에 나타난 바와 같이,
13탄소 NMR 스펙트럼에서 35개의 탄소 시그널이 나타났고, 이 중 30개가 트라이터핀이 구성하며, 나머지가 1개의 당을 구성한다. 화합물 TP5의 NMR 스펙트럼에서 상기 화합물 TP4의 NMR 스펙트럼에서 나타난 28번 카보닐에 연결된 β-D-글루코스의 아노머 수소 δ H 5.37(d, J = 8.1 Hz) 및 탄소 δ C 106.3가 사라진 것을 확인할 수 있었다, HMBC 스펙트럼 분석을 통해 δ H 4.56(α-L-Ara)과 δ C 88.3(C-3)간의 상관관계를 확인하였고, 분리된 화합물 TP5의 화학구조를 하기 화학식 5의 3-O-α-L-arabinopyranosyl asiatic acid로 결정하였으며, 아시아틱산 배당체 화합물임을 확인하였다.
[화학식 5]
Figure pat00016
Position
 TP5
δ C a δ H, mult.(J)
1 47.4 2.04, m; 0.88, m
2 68.0 3.82, dd(6.6, 4.7)
3 88.3 3.48, dd(9.5, 2.4)
4 45.2
5 47.8 1.33, m
6 18.8 1.52, m; 1.40, m
7 33.7 1.68, m; 1.33, m
8 40.8
9 48.9 1.65, m
10 38.6
11 24.5 2.01, m; 0.98, m
12 126.4 5.26, t(3.6)
13 140.1
14 43.0
15 29.3 1.96, m; 1.12, m
16 25.4 2.10, m; 1.78, m
17 49.9
18 54.5 2.25, d(11.5)
19 40.5 1.40, m
20 40.4
21 31.7 1.52, m; 1.33, m
22 37.6 1.78, m; 1.65, m
23 64.0 3.71, m; 3.29, d(11.4)
24 14.4 0.77, s
25 17.9 1.08, s
26 18.0 0.86, s
27 24.1 1.16, s
28 182.8
29 17.6 0.91, d(6.3)
30 21.7 0.99, s
α-L-Ara
1 105.0 4.31, d(7.6)
2 72.9 3.72, d(11.5)
3 74.0 3.53, dd(9.6, 3.4)
4 69.8 3.84, dt(3.3, 1.5)
5 65.7 3.93, dd(12.7, 2.1); 3.65, d(12.4)
(a Recorded in CD3OD at 500 MHz; δ in ppm and J in Hz)
< 실시예 7> 헤데라게닌 사포닌 배당체 또는 아시아틱산 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병원균에 대한 항균활성 평가
상기 실시예 4 및 5에서 분리한 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 TP1, TP2, 및 TP3, 아시아틱산 배당체 화합물 TP4 및 TP5의 식물병원균에 대한 항균활성 스펙트럼을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며 그 결과를 표 9에 나타내었다.
구체적으로, 분리한 화합물의 5종의 식물병원균 알터나리아 포리(Alternaria porri), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae) 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대한 항균활성을 96-well plate를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도인 MIC(minimum inhibitory concentration) 값을 구하여 평가하였다. 알터나리아 포리(Alternaria porri)는 V8 한천배지에 접종하여 25℃에서 7일간 배양한 뒤 균사를 제거하였다. 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)는 감자한천배지에 접종하여 5일간 20℃에서 배양하였으며, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)와 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)는 오트밀(oatmeal) 한천배지에 접종하여 7일간 25℃에서 배양한 다음 균사를 제거하였다. 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)은 감자 한천배지에 접종하여 7일간 25℃에서 배양한 다음 균사를 제거하였다. 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)는 오트밀 한천배지에 접종한 다음 20℃에서 10일간 배양하였다. 모든 균주는 상대습도 80%의 항온항습실에서 2일간 광처리 하여 포자형성을 유도하였다. 감자 액체배지를 이용하여 수확한 포자는 4겹 거즈(gauze)로 걸러서 포자현탁액을 제조하였다.
최종적으로 100 μl 웰에 식물병원균의 포자가 1 × 104 spores/ml의 농도로 포함하도록 하였고, 화합물 TP1, TP2, TP3, TP4 및 TP5이 각각 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 μg/ml의 농도로 포함되도록 분주하였고, 이 때 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 1%의 메탄올만 첨가한 것을 대조구로 사용하였으며, 농도별로 3회 반복하여 실험하였다. 72시간 배양한 후 UV/Vis 분광분석기로 OD600 값을 측정하였고, 곰팡이의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도로 결정하였다. 또한 대조구의 OD600 값과 비교하여 곰팡이의 생장이 50% 억제되는 농도를 EC50으로 결정하였다.
MIC(㎍/ml) EC50(㎍/ml)
식물병원균 TP1 TP2 TP3 TP4 TP5 TP1 TP2 TP3 TP4 TP5
Alternaria porri ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256
Botrytis cinerea ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 127 24 44 >256 35
Colletotrichum coccodes ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 >256 >256 ＞256 ＞256 256
Fusariumoxysporum ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256
Magnaporthe oryzae 8 8 4 ＞256 32 5 4 2 >256 5
Phytophthora infestans ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 ＞256 136 205 36 218 128
표 9에 나타난 바와 같이,
TP4를 제외한 나머지 화합물은 4-32 μg/ml 농도에서 벼 도열병의 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)의 균사생장을 완전히 억제하는 활성을 나타냈고, 24-127 μg/ml 농도에서 토마토 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 균사생장을 50% 억제하는 항균활성을 나타냈다.
분리한 모든 화합물은 36-218 μg/ml의 농도에서 토마토 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 균사생장을 50% 억제하는 항균활성을 나타냈다. 또한, TP5 화합물은 256 μg/ml의 농도에서 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)의 균사생장을 50% 억제하는 효과를 나타냈다. 분리한 화합물의 알터나리아 포리(Alternaria porri) 및 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 대한 명확한 항균활성은 시험한 농도범위에서 확인되지 않았다.
<실시예 8> 헤데라게닌 사포닌 배당체 또는 아시아틱산 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병원성 세균에 대한 항세균활성 평가
상기 실시예 4 및 5에서 분리한 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물 TP1, TP2, 및 TP3, 아시아틱산 배당체 화합물 TP4 및 TP5의 식물병원성 세균에 대한 항세균활성 스펙트럼을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며 그 결과를 표 9에 나타내었다.
구체적으로, 상기 실시예 4와 5에서 트레베지아 팔마타 추출물로부터 분리된 5가지 화합물 TP1, TP2, TP3, TP4 및 TP5을 사용하여 식물 세균병원성 세균의 생장을 억제하는 활성을 평가하였다. 분리된 5개의 화합물을 각각 100 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해시킨 다음 두 배 희석법으로 메탄올에 희석하여 농도별 스탁(stock) 용액을 준비하였다. 96-웰 플레이트를 사용하여, 웰 당 100 ml의 콩(tryptic soy broth; TSB) 배지에 각각의 분리된 화합물이 최종적으로 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 μg/ml의 농도가 되도록 농도별 스탁 용액을 분주하였고, 이 때 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 8가지 식물 세균병원성 세균 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae; 호접란 세균성갈색점무늬병균), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens; 과수 뿌리혹병균), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 세균성벼알마름병균), 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; 고추 궤양병균), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 세균성무름병균), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae; 키위 궤양병균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 풋마름병균), 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni; 복숭아 세균성구멍병균)에 대한 항세균활성을 96-웰 플레이트(96-well plate)를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도인 MIC(minimum inhibitory concentration) 값을 구하여 평가하였다. TSB 배지에 접종 후, 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에와 잔토모나스 아르보르콜라 pv. 프루니는 25℃에서 나머지 세균은 30℃에서 2일 150rpm으로 진탕배양한 후 TSB 배지로 희석하여 세균농도가 약 1 × 107 CFU/ml되도록 하였다. 희석한 세균배양액을 접종하여, 최종적으로 약 1 × 105 CFU/ml가 되도록 하였다. 항생제 스트렙토마이신(streptomycin sulfate; Sigma-Aldrich)을 대조구로 사용하였고, 1%의 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였으며, 72시간 배양한 후 UV/Vis 분광분석기로 OD600 값을 측정하였다. 대조구의 OD600 값과 비교하여 세균의 생장이 50% 억제되는 농도를 EC50으로 결정하으며, 농도별로 3회 반복하여 실험하였다.
EC50(㎍/ml)
식물병원성 세균 SSa TP1 TP2 TP3 TP4 TP5
Acidovorax avenae subsp.cattleyae 6 >256 >256 182 >256 >256
Agrobacterium tumefaciens 53 >256 >256 >256 >256 >256
Burkholderiaglumae 7 >256 >256 >256 >256 213
Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis 10 184 218 210 >256 212
Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum 6 >256 >256 >256 >256 >256
Pseudomonas syringae pv. actinidiae 20 >256 >256 >256 >256 >256
Xantomonas arboricola pv. pruni 4 >256 >256 >256 234 >256
Ralstonia solanacearum 3 192 199 >256 204 >256
a스트렙토마이신
표 10에 나타난 바와 같이,
분리한 화합물은 182 μg/ml 이상의 농도에서 식물병원성 세균의 생장을 저해하는 활성을 나타냈으나, 그러나 양의 대조구로 사용한 스트렙토마이신에 비해 항세균활성의 수준은 낮았다. TP4를 제외한 나머지 분리한 화합물은 184-218 μg/ml 농도에서 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스의 세균생장을 50% 억제하는 활성을 나타냈고, TP3 및 TP5를 제외한 나머지 분리한 화합물은 192-204 μg/ml 농도에서 랄스토니아 솔라나세아룸의 세균생장을 50% 억제하는 활성을 나타냈다. 분리한 화합물 TP3, TP4 및 TP5는 182-234 μg/ml 농도에서 각각 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니, 버크홀데리아 글루메, 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이의 세균생장을 50% 억제하는 활성을 나타냈다. 아그로박테리움 튜메파시엔스, 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸, 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에에 대한 항세균활성은 시험한 농도범위에서는 확인되지 않았다.
< 실시예 9> 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가
상기 실시예 4에서 얻은 트레베지아 팔마타 추출물로부터 분리된 헤데라게닌 사포닌 배당체 화합물의 in vivo 식물병 방제활성을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 그 결과는 표 11에 나타내었다.
구체적으로, 트레베지아 팔마타 추출물로부터 가장 많이 분리된 화합물 TP1의 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병에 대한 방제활성을 온실조건에서 평가하였다. 상기 활성성분을 메탄올에 용해시킨 후 250 μg/ml의 트윈 20 용액을 가하여 최종농도를 125 μg/ml, 250 μg/ml과 500 μg/ml로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%로 맞추었다. 이 때, 대조군으로는 5% 메탄올과 250 μg/ml의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 이들 7가지 식물병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였다.
방제가(%)
시료 농도(㎍/ml) RCB RSB TGM TLB WLR BPM PAN
TP1 500 84 10 82 88 70 4 8
TP1 250 69 0 77 50 73 0 8
TP1 125 0 0 39 36 33 0 0
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)
표 11에 나타난 바와 같이, 화합물 TP1이 500 μg/ml의 농도로 처리되었을 때 벼 도열병과 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병에 대해 80% 이상의 방제가가 나타났으며 밀 붉은 녹병에 대해 70%의 방제가가 나타났다. 250 μg/ml 농도로 처리했을 때에는 벼 도열병에 대해 69%, 토마토 잿빛곰팡이병에 대해 77%, 토마토 역병애 대해 50%, 밀 붉은녹병에 대해 73% 방제가를 나타냈다. 전반적으로 벼 도열병과 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병에 대해 우수한 방제활성을 나타냈으며, 트레베지아 팔마타 추출물을 처리하였을 때 나타나는 방제스펙트럼과 유사했으며, 더 높은 수준의 방제활성을 보였다.

Claims (17)

  1. 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
  2. 제1항에 잇어서,
    상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤 및 아세토나이트릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드, 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 분획된 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 식물병은 알터나리아 포리(Alternaria porri; 양파 검은무늬병균), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea; 토마토 잿빛곰팡이병균), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes; 고추 탄저병균), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum; 토마토 시들음병균), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae; 벼 도열병균), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina; 밀 붉은녹병균), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani; 벼 잎집무늬마름병균), 블루메리아 그래미니스 f. sp. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei; 보리 흰가루병) 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans; 토마토 역병균)으로 이루어지는 식물병원성 곰팡이 균사로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식물병은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae; 호접란 세균성갈색점무늬병균), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens; 과수 뿌리혹병균), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 세균성벼알마름병균), 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; 고추 궤양병균), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 세균성무름병균), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae; 키위 궤양병균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 풋마름병균) 및 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni; 복숭아 세균성구멍병균)으로 이루어지는 식물병원성 세균으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00017
    ;

    [화학식 2]
    Figure pat00018
    ;

    [화학식 3]
    Figure pat00019
    ;

    [화학식 4]
    Figure pat00020
    ; 및

    [화학식 5]
    Figure pat00021
    .
  7. 제1항에 있어서,
    상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  8. 제1항의 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
  9. 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물이고, 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물은 하기 화학식 4 및 5로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00022
    ;

    [화학식 2]
    Figure pat00023
    ;

    [화학식 3]
    Figure pat00024
    ;

    [화학식 4]
    Figure pat00025
    ; 및

    [화학식 5]
    Figure pat00026
    .
  11. 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물이고, 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물은 하기 화학식 4 및 5로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00027
    ;

    [화학식 2]
    Figure pat00028
    ;

    [화학식 3]
    Figure pat00029
    ;

    [화학식 4]
    Figure pat00030
    ; 및

    [화학식 5]
    Figure pat00031
    .
  13. 제11항에 있어서,
    상기 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물은 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata) 추출물 및 이의 분획물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 식물병은 알터나리아 포리(Alternaria porri; 양파 검은무늬병균), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea; 토마토 잿빛곰팡이병균), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes; 고추 탄저병균), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum; 토마토 시들음병균), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae; 벼 도열병균), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina; 밀 붉은녹병균), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani; 벼 잎집무늬마름병균), 블루메리아 그래미니스 f. sp. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei; 보리 흰가루병) 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans; 토마토 역병균)으로 이루어지는 식물병원성 곰팡이 균사로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 식물병은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae; 호접란 세균성갈색점무늬병균), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens; 과수 뿌리혹병균), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 세균성벼알마름병균), 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; 고추 궤양병균), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 세균성무름병균), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae; 키위 궤양병균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 풋마름병균) 및 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni; 복숭아 세균성구멍병균)으로 이루어지는 식물병원성 세균으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 유발된 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 μg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  17. 제11항의 헤데라게닌 사포닌 배당체(hederagenin saponin glycoside) 화합물 및 아시아틱산 배당체(asiatic acid glycoside) 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
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