KR20190052942A - 환자맞춤형 조직공학을 위한 섬유 스캐폴드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 형태의 결함에 맞게 사용할 수 있는 섬유 스캐폴드의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 스캐폴드, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 섬유 스캐폴드는 3차원 형태의 코튼형을 나타내는 것으로서 골 손실 부위에 수직적인 골 재생을 유도할 수 있고, 다양한 형태의 골 결손에 환자 맞춤형으로 주입되어 골 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

환자맞춤형 조직공학을 위한 섬유 스캐폴드의 제조방법{METHOD FOR PREPARING FIBROUS SCAFFOLDS FOR PATIENT-TUNED TISSUE ENGINEERING}

본 발명은 다양한 형태의 결함에 맞게 사용할 수 있는 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드의 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된 스캐폴드; 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 고령화 사회 현상 및 이에 따른 골질환 환자의 증가로 인하여 골 재생을 유도하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 특히 금속과 세라믹 등 비흡수성 생체재료를 사용하는 것은 이미 널리 사용되고 있으나, 이는 국소적인 골손상을 직접 대체하는 것이 어렵고 경우에 따라 회복 후 2차 수술을 통해 이를 제거해야 하는 위험성 및 불편함이 존재한다. 이에, 생체 내에서 손상이 생긴 골의 재생을 유도하고, 시간이 경과하면서 분해되어 별도의 제거술이 필요 없는 생분해성 고분자를 이용한 인공골 시술에 관한 연구가 대두되고 있다. 현재 조직공학 기술의 흐름은 생분해성 고분자를 사용하여 조직과 유사한 다공성　스캐폴드를 제조하고, 세포를　스캐폴드에 주입하여 3차원 구조의 세포/스캐폴드　복합체를 만들어 이를 체내에 이식하는 추세이다.

스캐폴드(Scaffold)는 조직구축, 세포기능 제어를 위해 인공적으로 만든 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로서, 이식거부, 세포독성, 염증반응 등을 유발하지 않도록 생체에 적합한 성질을 가져야 하고, 또한 세포 주입 및 세포 증식 유도 효율이 높은 성질이 요구된다.

특히, 환자마다 다양한 형태의 골 손실이 발생하게 되고, 치료가 요구되는 결함의 크기, 모양, 형태, 구조 등이 다양하게 나타나며, 이러한 결함의 개별적 특성을 반영하여 해당 조직의 상태에 맞게 치료할 수 있도록 탄력성 및 유연성을 갖춘 스캐폴드가 요구되어 왔다.

이에 적합한 생분해성 고분자로는, 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL) 및 이들의 공중합체 등이 있으며, 이들은 상대적으로 낮은 독성, 조절가능한 분해도(controllable degradability) 및 조직공학 스캐폴드 제작의 용이성으로 인해 널리 유용하게 사용되고 있다.

한편, 생분해성 고분자 용액에 처리하여 다공성을 갖는 전기방사(ELSP: electrospinning) 조직공학용 스캐폴드의 제조방법이 일반적으로 사용되어 왔다(Guang-Zhen Jin etc., Nanocomposite scaffolds incorporated with hydrophobically-functionalized mesoporous nanocarriers for the effective loading and longterm delivery of osteogenic drugs, RSC Adv., 2015, 5, 26832). 그러나, 전기방사에 의해 제작된 전기방사 섬유(ENs: Electrospun nanofibers)는 얇은 멤브레인 형태로 제조되어 섬유 사이의 공극 크기가 다소 작게 나타나며, 이로 인해 세포 침투에 방해가 되는 한계점이 있었다. 또한, 스캐폴드의 표면에만 세포를 시딩할 수 있어 골 결함의 크기, 모양에 따라 이용성에 한계가 나타났다. 따라서, 환자에 따라 다양한 골 손실의 형상에 맞추어 자유로운 형태로 사용할 수 있는 스캐폴드의 개발이 시급한 상황이었다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 다양한 형태의 골 결함에 맞춤형태로 사용할 수 있는 스캐폴드를 개발하기 위한 연구를 지속하였으며, 일렉트로블로잉(electroblowing) 공정을 사용하여 스캐폴드를 제조한 결과 멤브레인 형태가 아닌 3차원 구조의 코튼형(cotton-like) 스캐폴드가 제조되어 다양한 형태의 손상 부위에 맞춤형으로 사용할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 섬유 스캐폴드를 포함하는 줄기세포/스캐폴드 복합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은

a) 전압 발생기를 통해 생분해성 고분자 용액을 담지하는 실린지의 노즐과 집전 그라운드 사이에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 단계; 및

b) 팬에 의한 지속적인 공기 흐름 하에, 상기 실린지의 노즐을 통해 생분해성 고분자 용액을 방사형으로 분사하여 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드를 제조하는 단계;

를 포함하는, 섬유 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

종래 사용되는 골 재생용 스캐폴드의 경우, 얇은 멤브레인 형태로 제조되어 섬유 사이 공극이 촘촘하고, 이로 인해 세포 침투가 어려운 문제점이 있었다. 또한 스캐폴드의 표면에만 세포를 시딩할 수 있어, 다양한 형태, 특히 3차원 형상의 결함에 맞게 스캐폴드를 사용할 수 없는 한계가 있었다. 이에, 본 발명자들은 멤브레인(membrane) 형태가 아닌 코튼(cotton) 형태의 스캐폴드를 제조하여 사용시 섬유사이 공극이 커서 세포 침투가 용이함을 확인하였다. 멤브레인 형태의 스캐폴드는 거대한 손상 부위에 적용될 수 없지만, 이와 달리, 코튼형 스캐폴드는 3차원 형태로서 스캐폴드 내부에 세포를 시딩하여 3차원 결함에 주입, 골의 수직적인 증강을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

또한, 본 발명의 제조방법은 스캐폴드를 제조한 후 2차적으로 물리적인 힘을 가하여 코튼 형태를 제조하는 것이 아니라, 스캐폴드의 제조 과정 중 지속적인 공기 흐름을 가하여 섬유의 네트워크 자체가 코튼형으로 제조되도록 하는 방법으로서, 2차 공정을 가할 필요 없이 코튼형 스캐폴드를 곧바로 제조할 수 있는 경제적 장점이 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조한 스캐폴드에 세포를 시딩하고 배양하여 이식에 필요한 조직을 제조함으로써, 다양한 형태로 손상된 골을 환자 맞춤형으로 치료할 수 있다(도 1).

본 발명의 '스캐폴드'는 생체 내에서 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하며 이들의 기능을 보완 또는 대체할 수 있는 구조체를 의미하며, 구체적으로 골 조직을 재생시켜 골 손실을 치료하는 것일 수 있다. 본 발명에서는 특히 섬유 형태로 구성된　스캐폴드를 제조하여 골 재생에 사용하였다.

본 발명의 '코튼형'은 2차원 박막 형태와 대비되는 개념으로, 3차원의 부피를 가지며, 솜의 특성과 유사하게 압력을 높이거나 낮추면 다양한 형태, 크기로 유연하게 변화될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 스캐폴드는 다양한 형상의 골 결함에 맞춤형으로 주입될 수 있다.

또한, 상기 코튼형은 스캐폴드를 제조한 후 물리적인 힘을 가하여 섬유 사이의 공극을 부풀려 제조된 형태가 아니라, 공기 흐름을 가하면서 생분해성 고분자 용액을 분사함으로써 스캐폴드의 제조와 동시에 생성되는 형태이다.

따라서, 이미 제조된 스캐폴드에 2차적으로 물리적 힘을 가하여 억지로 부풀린 경우 공극 사이 크기가 불균열하게 생성되며 그 형태를 미리 예측하기 어려운 것과 달리, 본 발명의 코튼형은 지속적인 공기 흐름을 가하여 공극의 크기가 고르게 증가하고, 섬유가 균일하게 얽혀있는 네트워크를 형성한 형태이다.

상기 a) 단계의 '생분해성 고분자'는 섬유 스캐폴드의 골격을 형성하는 생체친화성 고분자 물질을 의미한다. 상기 생분해성 고분자 물질의 종류는 섬유 스캐폴드를 제조할 수 있는 한 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질일 수 있고, 구체적으로 폴리카프로락톤(PCL)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 a) 단계의 전압은 10 내지 30 kV일 수 있고, 구체적으로 15 내지 25 kV일 수 있다. 상기 전압이 10kV 미만인 경우 섬유가 충분히 제조되지 않을 수 있고, 30kV를 초과하는 경우 코튼형이 아닌 비드(bead)형태가 제조될 수 있다.

발명에 있어서, 상기 c) 단계의 공기 흐름의 속도는 0.5 내지 5m/h일 수 있고, 구체적으로 1 내지 2.5m/h일 수 있다. 상기 공기 흐름의 속도가 0.5m/h 미만인 경우 일정량의 섬유를 제조하기 위해 너무 긴 시간이 소요될 수 있고, 5m/h를 초과하는 경우 코튼형이 아닌 비드(bead) 형태가 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 폴리카프로락톤 용액을 실린지에 옮기고, 외부 팬에 의해 최대 2.5m/h 속도의 공기 연속 흐름을 가하면서 18 내지 22 kV의 전압을 가하는 방법을 통해, 섬유가 얽혀 네트워크를 형성하는 3차원 코튼형 섬유 스캐폴드를 제조하였다(실시예 1-2).

상기 생분해성 고분자 용액은 생체활성 유리 나노입자(BGn)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. '생체활성 유리(bioactive glass)'는 체내 이식 후 뼈 유사성분인 수산화아파타이트층을 표면에 생성시킴으로써 독성과 염증 및 부정적 면역반응을 동반하지 않고 체내조직과 화학적 결합이 가능한 성질 즉, 우수한　생체활성을 가지는 재료를 의미한다.

상기 생체활성 유리 나노입자의 크기는 1 내지 999nm의 평균 입경을 가질 수 있고, 구체적으로 1 내지 300nm의 평균 입경을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로 1 내지 200nm의 평균 입경을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 생체활성 유리 나노입자는 42 ± 5 nm의 입경을 갖는 것으로 확인되었다. 여기서, 평균 입경은 입도분포곡선에서 중량 백분율의 50%에 해당하는 입경을 의미한다.

상기 생체활성 유리 나노입자는 생분해성 고분자 용액 전체 중량 대비 1 내지 20 중량% 포함될 수 있고, 구체적으로 5 내지 15 중량%, 보다 구체적으로 10 중량% 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 생체활성 유리 나노입자는 코튼형 섬유 스캐폴드에 골화 특성을 부여하는 역할을 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 폴리카프로락톤(PCL) 용액, 10% BGn을 포함하는 PCL 용액을 사용하여 스캐폴드를 제조한 결과, 10% BGn을 포함하는 PCL 용액을 사용한 스캐폴드에서 세포 증식 및 골 분화 효능이 더욱 우수함을 확인하였다.

상기 생체활성 유리 나노입자는 실리카(SiO₂) 및 산화칼슘(CaO)을 60 내지 80 : 20 내지 40의 몰비로 포함할 수 있고, 구체적으로 70 내지 80 : 20 내지 30, 보다 구체적으로 75 : 25 몰비로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생체활성 유리 나노입자는,

a) 졸-겔 방법을 사용하여 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;

b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;

c) 상기 산화칼슘 템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및

d) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노입자를 제조하는 단계;

를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.

또한, 상기 b) 단계의 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate) 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 단계 c)의 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드를 제공한다. 구체적으로, 상기 섬유 스캐폴드는 손상 결함 부위 형태 맞춤형 스캐폴드일 수 있다.

본 발명의 스캐폴드는, 스캐폴드에 지속적인 공기흐름을 가하여 공극 크기를 균일하게 부풀린 것으로서, 스캐폴드의 전체 두께 및 부피가 고르게 증가한 형태이다. 또한, 공극 크기를 넓히기 위해 물리적 힘을 가한 것이 아니므로 스캐폴드의 제조과정에서 흠집이나 뒤틀림이 생기지 않으며, 섬유의 미세구조가 무너지는 문제점이 나타나지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 섬유 스캐폴드를 포함하는 줄기세포/스캐폴드 복합체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 골아세포(osteoblast) 등으로 분화하여 치주 조직의 재생에 직접적으로 관여하거나 또는 상기 치주인대 세포에서 분비/방출하는 특정 인자에 의해 간접적으로 치주 조직을 재생시킬 수 있다. 상기 줄기세포/스캐폴드 복합체는 이식시 생체 적합성을 가지며, 치주 조직 결함 모델에 이식된 경우 골 부피, 골 표면, 및 골 밀도를 증가시키는 우수한 효과가 있어 골 재생용 약학 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 치아 추출 하악골 결함이 생긴 래트 모델에 치수 줄기세포/스캐폴드 복합체를 접종한 결과, 골 부피, 골 표면 및 골 밀도가 증가하는 효과가 있고, 특히 줄기세포를 시딩한 스캐폴드 사용시 새로운 치조골 형성이 더욱 활발함을 확인하였다(실시예 4-3).

본 발명의 제조방법으로 제조된 섬유 스캐폴드는 3차원 형태의 코튼형을 나타내는 것으로서 골 손실 부위에 수직적인 골 재생을 유도할 수 있고, 다양한 형태의 골 결손에 환자 맞춤형으로 주입되어 골 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 스캐폴드 및 조직공학체를 사용하여 다양한 형태로 손상된 손상된 뼈를 환자맞춤형으로 치료하기 위한 방법으로, 세포를 스캐폴드에 시딩하고 배양하여 이식에 필요한 조직을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 PCL EBC 스캐폴드의 특성으로서, (a) 전기방사(electrospun)로 제조된 막 형태와 비교하여 쉽게 몰딩/압축이 일어나고, (b) 수성 매질을 흡수하고 모양을 유지하고, (c) EBC 스캐폴드가 신속하게 혈액을 흡수(수분 이내)함을 나타낸 것이다.
도 3은 골 재생을 목표로 10% BGn을 혼합하여 제조한 EBC 스캐폴드로서, (a) 순수 PCL 스캐폴드 및 10% BGn-PCL 스캐폴드의 SEM 이미지, (b) 85Si/15Ca 조성을 갖는 EDS 삽입된 10% BGn-PCL 스캐폴드의 TEM 이미지, (c) ICP-AES로 측정한 EBC 스캐폴드에서 최대 28일 동안 실리케이트 및 칼슘 이온의 방출을 나타낸 것이다.
도 4는 상이한 시점에서 측정한 EBC 스캐폴드 표면에 대한 세포 고정(%)에 관한 것으로서, PCL 스캐폴드보다 10%-BGn EBC 스캐폴드에서 초기 세포 고정도가 더 높음을 나타낸 것이다.
도 5는 EBC 스캐폴드에서의 세포 증식으로서, (a) CC에 세포의 공 촛점 형광 이미지 K 방법으로 분석한 9일까지 측정한 세포 생존력, (b) 각 기간의 (Phalloidin / DAPI 얼룩)를 나타낸 것이다.
도 6은 3주까지 장기간 배양된 세포의 골 형성 분화에 관한 것으로서, (a) 3주에 측정된 ALP 활성, (b) 및 (c) ARS로 염색된 광학 이미지, (d) 염색을 용리하여 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 캡을 이용하여 두개관 결함을 만든 수직 골 확대 모델을 이용하여 EBC 인공 스캐폴드 생체 내 골 형성 능력을 조사한 것으로서, (a) 수술 6주 후 H&E 염색한 조직 샘플의 저배율 및 고배율에서 조직학적 이미지; 화살표로 표시된 원래 골('OB'); 점선으로 구별된 '두개관'과 '캡'영역에서 새로 형성된 골('NB') (b) '두개관'과 '캡'영역에서의 새로운 골 영역의 정량화, (c) 새로운 골 영역에서 계산된 골 세포수(두개관+캡)를 나타낸 것이다.
도 8은 골 형성을 마이크로 CT로 분석한 것으로서, (a) 새로운 골 형성의 3D 구축 및 단면 영상(두개관:NB; 캡:*) 및 골의 품질을 나타내는 MIP 색상 맵핑 이미지 (b) μ-CT를 이용한 골 형성 지수(골 부피, 골 표면, 골 밀도) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 10% BGn/rDPSC 복합체를 이용하여 래트의 불규칙한 모양의 치조골 결함을 재생한 것으로서, (a) 수술 8주 후 H&E로 염색한 조직 샘플의 이미지; 상피(E), 혈관(V), NB와 OB의 경계(점선), 화살표(골아 세포, 골 안감 세포 및 파골 세포), 골 형성 영역(화살표), 하버스관(★) (b) 상이한 모드로 나타낸 조직 샘플의 μ-CT 이미지; 새로운 골이 강조 표시된 윗면과 측면 및 교차 단면 이미지, (c) 골 부피, 골 표면 및 골 밀도에 대한 μ-CT 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 메조다공성 생체활성 유리 나노입자 및 코튼형 (cotton-like) 섬유 스캐폴드의 제조

생체활성 유리 나노입자 및 스캐폴드를 제조하기 위한 재료로서, 테트라에틸 오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS, C₈H₂₀O₄Si, 98%), 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO₃)₂·4H₂O, 99%), 헥사데케틸트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB, C₁₉H₄₂BrN, 98%), 수산화암모늄(ammonium hydroxide, NH₄OH, 28.0% NH₃ 수용액, ≥99.99% metal basis), 무수 메탄올(methanol anhydrous, CH₃OH, 99.8%), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL, (C₆H₁₀O₂)n, M_n=80000), 및 클로로포름(CHCl₃, 99.0 %, Duksan chemicals, South Korea)은 모두 시그마-알드리치로부터 구입하였으며 어떤 추가 정제 없이 구입한 상태로 사용하였다.

1-1. 메조 다공성 생체활성 유리 나노입자의 제조

메조 다공성 생체활성 유리 나노입자는, 종래 기술된 것처럼 초음파 화학 졸-겔 방법(sonochemical sol.gel technique)을 이용하고 CTAB를 템플레이트로 하여 제조하였다.

생체활성 유리 나노입자 제조를 위해 75% SiO₂ / 25% CaO (mol%)의 구성을 이용하였으며, 그 제조방법은 다음과 같다. 먼저, CTAB 13.72mmol 및 Ca(NO₃)₂·4H₂O 1.27mmol을 120ml의 알칼리성 메탄올에 용해시키고, NH₄OH를 첨가하여 용액의 pH를 12.5로 조정하였다. 다음으로, 3.79mmol의 TEOS를 30ml의 메탄올에 희석시키고, 20분 동안 격렬하게 교반시키는 동시에 초음파 처리(ultrasonication) 하면서, pH가 조정된 용액에 적가하였다. 24시간 후, 형성된 침전물을 분리하고, 물/에탄올을 이용하여 세척한 후, 70 ℃에서 밤새 건조시켰다. 건조 분말을 공기 중 600 ℃에서 5시간 동안 가열하고, 진공 상태로 보관하였다.

1-2. 코튼형 섬유 스캐폴드의 제조

순수한 PCL 용액, 및 BGn을 10 중량% 첨가한 PCL 용액을 사용하여, 각각 코튼형 섬유 스캐폴드를 제조하였다.

구체적으로, 일렉트로블로잉 공정은 금속 프레임 플라스틱 상자(80cm x 70cm x 60cm) 내부에서 수행하였다. 순수 PCL 용액(10% w/v) 또는 10% BGn-PCL 용액이 클로로포름에 용해된 생분해성 고분자 용액을 각각 준비하고, 금속 노즐(G-23)이 부착된 플라스틱 실린지(10ml)에 옮겼다. 실린지를 실린지 펌프에 장착하고 10ml/h의 공급 속도로 조절하면서, 플라스틱 상자의 벽에 설치된 스테인리스 스틸 시트로부터 35cm의 거리를 유지하였다. 생분해성 고분자 용액은 외부 팬에 의해 가해지는 회전 공기의 연속 흐름(속도 ~2.5m/h) 하에서 18-22 kV에서 가하여 즉시 용매를 증발시키고, 얼기설기 얽힌 3D 섬유 네트워크를 형성하였다. 제조된 3D 섬유 그물은 플라스틱 막대로 수작업하여 코튼형 폼(foam)으로 수득하였다.

실험예 1: 코튼형 섬유 스캐폴드의 물리화학적 특성 분석

1-1. 코튼형 섬유 스캐폴드의 구조 관찰

상기 실시예 1에서 제조한 코튼형 섬유 스캐폴드(electroblown cotton-like foam scaffold; EBC 스캐폴드)의 형태를 고해상도 주사 전자 현미경(SEM, JEOL, Japan)에 의해 관찰하였다. SEM 관찰에 앞서, 샘플을 자동 마그네트론 스퍼터 코퍼(Cressington 108 Auto sputter coater, UK)를 사용하여 90초 동안 백금으로 코팅하였다. 에너지-분산형 X-선 분광기(EDX, Oxford Instruments, UK)가 장착된 고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM, JEM-3010, JEOL, Japan)으로 BGn의 형태, 메조 구조 및 원소 조성을 분석하였다.

실시예 1에서 제조한 EBC 스캐폴드는 스폰지 형태로서 섬유 사이의 공극이 매우 크게 나타났다. 이는 전기방사(electrospinning)를 사용하여 제조되는 멤브레인 형태의 스캐폴드가 섬유 사이의 공극이 작은 것과 대조되었다. 또한, 도 2a에 제시된 바와 같이 EBC 스캐폴드는 멤브레인 형태의 스캐폴드와 비교하여 주형의 형상과 크기에 맞게 쉽게 성형되고 압축될 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, EBS 스캐폴드는 수성 매질을 흡수하고도 형태를 유지하는 특성이 나타났다.

EBC 스캐폴드의 혈액 흡수 용량을 구연산 쥐 혈액을 이용한 혈액침지법으로 측정하였다. 상이한 시간 간격으로 혈액 침지 시험 전후 EBC 스캐폴드의 무게를 측정함으로써, 혈액이 흡수된 정도를 확인하였다.

그 결과, EBC 스캐폴드는 수 분내로 신속하게 혈액을 흡수하였고, 최대 2300%의 혈액을 흡수함을 확인하였다(도 2c).

1-2. EBC 스캐폴드 조성물 차이에 따른 구조 비교

용액 조성 변화에 따른 EBC 스캐폴드의 차이점을 비교 관찰하였다. 종래 알려진 바와 같이 BGn는 골 생체활성 및 다분화능 줄기세포의 골 형성 계통으로의 분화를 자극시키는 효능이 있기 때문에, 골 재생을 위한 생체활성 나노성분으로 BGn을 포함시킨 EBC를 함께 제조한 것이다.

도 3a에 제시된 바와 같이, PCL 용액에 10% BGn을 첨가하여 제조한 EBC 스캐폴드(10% BGn-EBC 스캐폴드)에서도, 순수한 PCL 용액을 사용하여 제조한 스캐폴드와 유사한 형태의 코튼형 섬유 폼이 생성되었다. 또한, EBC 스캐폴드 및 10% BGn-EBC 스캐폴드의 섬유 평균 크기는 각각 20.6 μm 및 22.0 μm로 관찰됨으로써, 섬유의 평균 크기 또한 비슷한 범위로 생성됨을 확인하였다.

다만, 도 3b에 제시된 바와 같이 10% BGn-EBC 스캐폴드는 EBC 스캐폴드에 비하여 다공성이 더욱 높게 나타났다.

1-3. 이온 방출

10% BGn이 함유된 EBC 스캐폴드에서 실리케이트 및 칼슘 이온의 누적 방출을 120 rpm 진동 속도, 37 ℃ 온도에서 측정하였다. 100mg의 EBC 스캐폴드를 pH가 7.4로 조정된 Tris-HCl 완충액 15ml에 담그고, 미리 정해진 시점에, 방출된 매질을 다시 회수하여 충진하였다. 회수된 매질은 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광계(ICP-AES; OPTIMA 4300 DV, Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 이온 방출을 위해 분석되었다.

ICP-AES 측정 결과, 도 3c에 제시된 바와 같이, 10% BGn-EBC 스캐폴드는 이온(실리케이트 및 칼슘)을 방출하는 것으로 나타났다. 실리케이트 이온의 방출은 7일 경과 후 포화된 것으로 나타났고, 반면 칼슘 이온은 28일까지 계속 방출되었다.

대략적으로, 7일 동안 방출된 실리케이트 이온 농도는 ~60ppm(~9ppm/일)이고, 칼슘 이온 농도는 ~110ppm(~16ppm/일)로 나타났다. 실리케이트 및 칼슘 이온이 이러한 수치범위로 방출됨을 확인함으로써, 10% BGn-EBC 스캐폴드 스캐폴드가 세포 증식, 혈관 신생, 골 형성 치료 효과 등을 발휘할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2: 세포증식 및 골 분화에서의 In-vitro 효과

2-1. 래트(rat)로부터 치수줄기세포(dental pulp stem cells) 배양

5주령의 수컷 SD-래트(Sprague-Dawley SD rat)의 앞니로부터 래트 치수줄기세포(rDPSCs)를 추출하였다. 추출한 줄기세포를 콜라게나아제 I형(Worthington Biochemical, USA) 및 디스파아제-II(neutral protease, USA)의 용액에서 37 ℃에서 2시간 동안 분해하였다. 다음으로, 수집한 줄기세포를 10% 소태아혈청(FBS, HyClone, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 α-최소 필수 배지(MEM; HyClone, GELifesciences, USA)에서, 37 ℃, 5% CO₂ 함유 습한 대기 조건으로 배양하였다. 골아세포로의 분화를 위해, 아스코르브산 50μg/mL, 덱사메타손 100nM, β-글리세로포스페이트 10mM을 함유한 골형성 배지(OM)에서 배양하였다.

2-2. EBC 스캐폴드에 세포 부착

멸균된 EBC 스캐폴드 5mg를 비-부착 24-웰 플레이트(SPL Life Sciences, Korea)의 각 웰에 넣었다. 정상 배지에서 50μl의 rDPSCs 세포(1 x 10⁵)를 각 스캐폴드에 시딩하고 37 ℃, 5% CO₂의 대기 조건 하에서 각각 다른 시간 동안 배양하였다.

먼저, 배양 시간에 따른 세포 부착을 조사하였다. 스캐폴드 모양을 보존하면서, 시딩된 세포의 일부(50μl 중 10⁵ 세포)는 신속하게 스캐폴드(5mg)를 통해 침투되었다. 도 4에 제시된 바와 같이, 세포는 10%-BGn EBC 스캐폴드에 매우 빠르게 고정되었고, 1시간 내에 약 80%의 개체군이 형성되고 24시간 이내 포화되었다. 반면, EBC 스캐폴드에서는 10%-BGn EBC 스캐폴드에 비해 세포 고정이 느리게 증가하여 3시간이 경과하였을 때 약 80%가 형성되었고, 이후 세포 포화 상태가 나타났다.

즉, 충분한 시간이 경과한 후 세포의 최종 개체군은 두 가지 스캐폴드에 대해 동등하게 나타나지만, 세포 고정 초기에는 각각 다른 결과로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해, 세포 고정은 스캐폴드의 조성물 및 배양 기간에 크게 의존함을 확인하였다.

2-3. EBC 스캐폴드에 세포 증식

세포 부착 단계 24시간 후, DPSCs/스캐폴드 구조물을 골 형성 배지에서 장기간 배양하였다. EBC 스캐폴드 내의 DPSCs의 증식을 조사하였다.

세포 생존력은 세포 카운팅 분석법 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Japan)을 사용하여 평가하였다. CCK-8 용액을 배지 (9:1 비율)에 첨가한 후 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 각 반응 매질 100 μl를 96-웰 플레이트에 옮기고, 마이크로플레이트 리더 (SpectraMax M2e, Molecular Devices, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하였고, 실험은 3회 반복 실시하였다(n = 3).

CCK 분석 결과, 두 종류의 스캐폴드 모두에서 9일이 될 때까지 시간에 따라 세포 생존능이 지속적으로 증가함을 확인하였고, 두 가지 스캐폴드에서 동등한 수준으로 나타났다(도 5a).

세포 형태를 형광 현미경으로 관찰하기 위해, 세포를 4 ℃에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 고정시키고, 0.2% Triton X-100(Sigma)으로 5분 동안 처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 (green)팔로이딘로 라벨링된 Alexa Flour 488(Life Technologies, Invitrogen)로 염색하고, 이어서 DAPI(p36935, Invitrogen)로 염색하였다. 세포 이미지는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; Zeiss LSM 700, Germany)으로 관찰하였다.

세포의 CLSM 형광 이미지를 통해, 배양기간 동안 세포가 활발하게 증식함을 확인하였다. 특히 9일째 다수의 세포가 스캐폴드 표면을 거의 전체적으로 덮었고, 섬유간 연결이 고도로 확장되어 골격을 이루는 것을 관찰하였다(도 5b). 이와 같은 결과를 통해, 두 가지 스캐폴드 모두가 우수한 세포 적합성, 및 장기간 동안 줄기세포를 채울 수 있는 능력을 가짐을 확인하였다.

2-4. ALP 및 ARS 분석법에 의한 골 형성 분화

스캐폴드에서 성장한 rDPSCs의 골 형성 분화를 확인하기 위해, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP) 활성(Colorimetric kit, Abcam, UK), 및 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S; ARS, SIGMA-ALDRICH, USA) 염색 분석을 수행하였다. 먼저, 세포를 각 스캐폴드에 1 x 10⁵로 시딩하고, 골 형성 배지에서 7일, 14일, 및 21일 동안 배양하였다.

ALP 분석을 위해, 0.25% 트립신과 ETDA(Gibco)를 사용하여 세포를 수집하였다. ALP 완충액 0.6ml를 각 시료에 첨가하고, 12000rpm으로 4-15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 수집하였다. 25-60분간 배양한 후, p-나이트로페닐 포스페이트(p-nitrophenol phosphate, 5mM, 50μl)를 사용하여 ALP 활성도를 측정하였다(n=5). 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 파장 405nm에서 판독하였고, 데이터는 표준 프로토콜에 따라 dsDNA 검출 키트(Quant-iT Picogreen, Invitrogen)로 측정된 이중가닥 DNA(dsDNA) 양으로 표준화하였다.

3주 동안 배양하면서 세포의 ALP 활성을 분석하여, EBC 스캐폴드에 대한 DPSCs의 골 형성 분화를 확인하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이, 조직 배양 플레이트에서 배양한 세포와 비교할 때, EBC 스캐폴드에서 배양된 세포들은 ALP 활성 수준이 더 높은 것으로 나타났다. 특히, 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 배양된 세포가 세포는 EBC 스캐폴드에 비하여 ALP 활성을 보다 효과적으로 자극하는 것을 확인하였다.

3주 동안의 세포 미네랄화(mineralization)를 ARS 분석에 의해 검사하였다. ARS 염색을 위해, 세포가 시딩된 스캐폴드를 부드럽게 회전시키면서 40mM ARS assay kit (pH 4.2)로 10분 동안 염색하였다. 염색 결과를 광학 현미경 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 시각화하였다. 정량화를 위해, 인산나트륨(pH 7.0, 10 mM) 중 10% 세틸피리디늄 클로라이드(CPC, Sigma)를 첨가하여 얼룩을 용리시키고, 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6b 및 6c에 제시된 바와 같이, ARS로 염색된 광학 이미지를 통해, 두 스캐폴드 모두에서 배양 시간에 따라 염색 정도가 증가함을 관찰함으로써, 세포 배양 기간동안 미네랄화가 발생함을 확인하였다. 염색 농도는 스캐폴드 전체에 걸쳐 균일하게 나타났고, 고배율로 관찰한 결과 섬유를 따라 미네랄화된 결정이 분포되어 있음을 확인하였다. 또한, EBC PCL 스캐폴드와 비교하여 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 염색이 더욱 뚜렷하게 나타났다.

10% CPC 용액으로 얼룩을 용리하여 미네랄화를 정량한 결과, 도 6d에 제시된 바와 같이 세 그룹간의 유의한 차이가 나타났다(대조군 < PCL < +10%BGn). 또한 각각 1, 2, 3주에 U, K, D 몰드에서 ARS 염색으로 만들어진 세포/스캐폴드 구조체의 광학 이미지를 통해, EBC 스캐폴드를 사용하여 다양한 형태의 결함에 맞게 조절하여 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3: 래트의 캡핑된 (capped) 두개관 결함 모델에서의 In- vivo 효능

상기 실험예 2를 통하여, 실시예 1에서 제조한 EBC 스캐폴드에 줄기세포가 채워지고, 골 형성 계통으로 분화하고, 성숙하여 미네랄화되는 우수한 스캐폴딩 조건을 제공하는 것을 확인한 후, 래트에서의 In-vivo 골 재생성을 관찰하였다.

3-1. 래트의 캡핑된 두개관 결함에 이식

12주령의 건강한 수컷(180-220g) SD-래트(Sprague-Dawley rat)를 수술에 사용하였다. 스캐폴드 이식 전, 래트를 대조군, EBC 스캐폴드, 및 10% BGn-EBC 스캐폴드 세 그룹 중 한 그룹에 무작위로 할당하였다.

래트 캡핑된 두개관 결함 모델에서 EBC 스캐폴드의 골 재생능을 조사하였다. 두개관 병변을 면도한 후, 수술 부위를 요오드와 70% 에탄올로 닦고, 선형 피부를 절개하여 두개관을 노출시켰다. 치과용 핸드피스와 5mm 직경의 LS-Reamer(Neobiotech, Seoul, South Korea)를 사용하여, 멸균 식염수로 냉각 조건에서 각 래트의 두정골(parietal bone)의 각면에 두 개의 두개관 결함(5mm 직경)을 만들었다.

케타민(80mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 혼합물을 근육 내 주사하여 전신 마취 하에서 스캐폴드 이식을 시행하였다. 3D 프린트(NP-Mendel, Opencreators, South Korea)를 통해 단단한 폴리머 캡(내경 5mm x 높이 2mm)을 주문 제작(Taulman 618 Nylon, Taulman 3D, Missouri, US)하였다. EBC 스캐폴드를 3D 프린트 폴리머 캡으로 고정시키고, 캡 및 스캐폴드는 앵커링 링을 통해 고정 나사를 사용하여 두개관 골에 보호되었다. 피하 조직과 골막을 흡수성 봉합사(4-0 Vicryl®, Ethicon, Germany)로 봉합하고, 피부를 비흡수성 봉합사 물질(4-0 Prolene, Ethicon, Germany)로 봉합하였다.

스캐폴드를 이식한 후, 감염, 염증 및 부작용의 가능한 임상 징후가 있는지 동물을 매일 모니터링 하였다. 6주 후, 동물을 CO₂ 흡입으로 안락사시키고 뚜껑을 감싸는 두개관의 조직 부분을 수확하고 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다.

3-2. 조직학적 이미지

이식 6주 후, 조직 샘플을 수확하고 H&E 염색 후에 조직학적 이미지를 광학적으로 분석하였다.

조직학적 분석을 위해, 조직 고정 후 캡을 제거하고, 고정된 조직을 RapidCal™ 용액 (BBC Chemical Co., USA)에서 3일 동안 계속하여 칼슘을 제거하였다. 그 후 조직 샘플을 에탄올의 농도를 증가시키면서 탈수시킨 다음 파라핀에 고정시켰다. 결함 부위 중심부의 5-마이크로미터 코로날 섹션을 반자동 로터리 마이크로톰 (Leica RM2245, Leica Biosystems, Germany)을 사용하여 준비한 다음 코팅된 유리 슬라이드로 옮겼다. 조직 절편을 가진 슬라이드는 크실렌 및 에탄올 시리즈 용액을 통해 탈파라핀화 및 수화되었고, 새로운 뼈 부위의 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin&eosin; H&E)으로 염색하였다. 조직학적 절편을 광학 현미경 (IX71, Olympus, Japan) 하에서 시각화하였다.

도 7a에 제시된 바와 같이, 대조군에서 두개관 영역의 새로운 골 형성은 매우 적게 나타났다. 반면, EBC 스캐폴드가 이식된 경우, 새로운 골 형성이 두개관 영역에서 관찰되었고 캡 영역은 주로 연조직으로 채워졌다. 뼈와 유사한 조직이 주로 캡 표면을 따라 관찰되었고, 이는 수직 골 형성이 결함 모서리에서 많이 발생하였음을 보여준다. 반면, 10% BGn-EBC 스캐폴드가 이식되었을 때, 두개관 영역에서 새로운 골 형성이 더욱 명확하게 나타났고, 캡 영역의 수직적인 골 형성은 모서리 뿐만 아니라 중앙 구역에서도 눈에 띄게 발생하였다.

이와 같은 결과를 통해, EBC 스캐폴드에서의 새로운 골 형성은 대부분 캡 벽 표면을 따라 나타나고, 반면 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 새로운 골의 성장은 수직적(캡을 따라서 뿐 아니라 중앙 부분을 통해)으로 균질하게 나타남을 확인하였다. 이것은 10% BGn-EBC 스캐폴드가 EBC 스캐폴드보다 수직적인 골 성장을 더욱 유도할 수 있음을 의미한다.

새로운 골 영역을 정량화한 결과, 도 7b에 제시된 바와 같이, 두 가지 스캐폴드는 두개관 영역에서 새로운 골 형성을 향상시키는데 상당히 효과적이었고, 특히 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 더 높게 나타났다. 캡 영역의 새로운 골 형성 또한 스캐폴드에 의해 유의하게 향상되었고, 특히 10% BGn-EBC 스캐폴드에 의해 더 크게 향상되었다.

새롭게 형성된 골 부위 전체(두개관+캡)에서 계산된 골 세포수는 대조군에 비하여 스캐폴드 이식 모델에서 크게 증가하였고, 특히 10%-BGn EBC 스캐폴드에서 약 2.5배 높은 것으로 확인되었다(도 7c).

3-3. 마이크로 이미지

골 형성은 micro-CT로 더 분석되었다. 65kV 및 385μA의 X선을 사용하여 각 섹션(μm) 당 279ms의 노출 시간을 갖는 마이크로-컴퓨터 단층촬영(μ-CT) 이미징을 하였다(Skyscan 1176, Skyscan, Aartselaar, Belgium). 스캔한 이미지의 재구성된 이미지를 사용하여, CTvol Skyscan 소프트웨어(버전 2.3.2.0)로 3D 이미지를 만들고 시각화하여, 관심 부위의 경조직 형성을 관찰하였다. 구체적으로, 결함 부위의 새로운 경조직 용적(%), 경막 표면(mm²) 및 경조직 면밀도(1/mm)를 분석하였다.

3D 구축 및 단면 이미지 (두개관:NB; 캡 영역:*), 및 MIP 색상 맵핑 이미지는 새로 형성된 골의 양과 품질을 나타낸다(도 8a). 이미지를 기반으로, 골 부피, 골 표면, 및 골 표면 밀도를 포함하는 골 형성 지표를 계산하였다.

도 8b에 제시된 바와 같이, 두개관 영역의 새로 형성된 골 부피, 골 표면, 및 골 표면 밀도는 순서대로 대조군 < PCL < +10% BGn로 나타났다. 캡 영역에서, 새로운 골은 스캐폴드를 이식한 그룹에서만 형성되었고, 특히 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 높게 형성되었다. 새로운 골 면적과 표면 밀도 또한 골 부피와 비슷한 경향을 보였다. 이와 같이, 마이크로 CT 결과는 조직학적 결과와 일치하는 것을 확인하였다. EBC 스캐폴드는 골 내부 성장을 위한 우수한 3D 스캐폴딩 조건을 제공하는 것으로 확인되고, 스캐폴드 내의 BGn 성분은 골의 수직적인 성장을 자극하는 것을 확인하였다.

실험예 4: 래트의 치아 추출 하악골 결함 모델에서의 In- vivo 효능

10% BGn-EBC 스캐폴드의 우수한 골 형성 능력을 바탕으로, 골 재생을 위해 세포가 시딩된 스캐폴드의 성능을 확인하였다.

4-1. 발치된 하악골 결함 모델에 이식

래트의 하악골 소켓의 각 측면에서 하악 제1대구치를 추출하였다. 치과 소켓은 냉각 조건 하에서 치과 고속 핸드 피스(Sirona, Germany)를 사용하여 멸균 식염수로, 갈라진 뼈가 제거될 때까지 둥근 모양의 치과용 바(Φ=1.6mm)를 사용하여, 치조골(alveolar bone)에 불규칙한 형태의 큰 결함을 제작하였다(도 7a). 스캐폴드는 첫번째 상악골 소켓 홀에 채워지고, 비흡수성 봉합사 물질(4-0 Prolene, Ethicon, Germany)을 사용하여 치조골에 고정되었다. DPSCs는 골 형성 배지 내 10% BGn-EBC 스캐폴드에서 7일 동안 배양되었고, 치아를 추출한 치조골 결함에 이식하는데 사용되었다.

4-2. 조직학적 이미지

H&E 염색 후 조직 샘플을 조직학적으로 검사하였다. 새로운 뼈 영역의 경계는 화살촉으로 표시하였다 (NB:새로운 골 영역; OB:오래된 골 영역).

마이크로 CT 결과를 확인한 결과, 도 9a에 제시된 바와 같이, 최소량의 골만 형성한 대조군과 비교하여, 10% BGn-EBC 스캐폴드 및 10% BGn/rDPSC EBC 스캐폴드를 처리한 그룹은 실질적으로 골 형성이 일어남을 확인하였다.

10% BGn/rDPSC 그룹을 고배율 이미지(iii)로 관찰한 결과, OB와 유사한 NB가 매우 높게 형성된 구조를 확인하였다. 많은 골 세포가 골 소강에 존재하고(화살표), 라멜라 패턴의 하버스관(★)이 발달된 것을 확인하였다.

골 형성 영역(화살표)의 정면을 나타내는 중간 부분의 확대된 이미지(ii)는 많은 골아 세포, 골 안감 세포 및 일부 파골 세포를, 결합 조직으로 채워진 윗부분(i)은 상피(E; gingival mucosa) 아래의 혈관 (V)을 나타내었다.

이와 같이, 조직학적 이미지를 통해 새로운 골 형성이 발생하는 과정을 관찰하였다. 특히, EBC 스캐폴드와 함께 도입된 rDPSC는 하악골 결함, 골 부피와 밀도를 크게 증가시키고, 새로운 혈관 형성 및 새로운 골 형성을 자극하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.

4-3. 마이크로 이미지

조직 샘플의 μ-CT 이미지는 수술 8주 후에, 측면 및 단면을 관찰하였다.

도 9b에 제시된 바와 같이, 대조군에서는 곡선이 있는 녹색 선으로 표시된 것처럼 골 높이가 내려간 것으로 보아 치아 손실로 인한 지원 부족 때문에 결함이 다소 붕괴되었고, 따라서 골 높이를 보존하기 위해 치조골 보강이 필요한 것으로 보였다. EBC 스캐폴드 또는 10% BGn/rDPSC EBC 스캐폴드를 사용했을 때, 잇몸 높이가 잘 보존되었고, 임상 응용을 위한 스캐폴드의 장점을 입증하였다.

μ-CT 이미지의 정량 분석 결과는 새로 형성된 골 부피, 골 표면 및 골 밀도를 제공하였다. 도 9c에 제시된 바와 같이, 골 부피 및 골 표면은 대조군에 비해 10% BGn-EBC 스캐폴드 및 10% BGn/rDPSC EBC 스캐폴드 이식 그룹에서 유의하게 높게 확인되었다. 이와 같은 결과를 통해, 스캐폴드에 시딩한 rDPSC 세포는 새로운 치조골 형성에 더 큰 영향을 미침을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

1. a) 전압 발생기를 통해 생분해성 고분자 용액을 담지하는 실린지의 노즐과 집전 그라운드 사이에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 단계; 및
   b) 팬에 의한 지속적인 공기 흐름 하에, 상기 실린지의 노즐을 통해 생분해성 고분자 용액을 방사형으로 분사하여 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드를 제조하는 단계;
   를 포함하는, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질인 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 전압은 10 내지 30 kV인 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 공기 흐름의 속도는 1 내지 2.5m/h인 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 생분해성 고분자 용액은 생체활성 유리 나노입자를 추가로 포함하는 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 생체활성 유리 나노입자는 생분해성 고분자 용액 전체 중량 대비 1 내지 20 중량%인 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 생체활성 유리 나노입자는 실리카(SiO₂) 및 산화칼슘(CaO)을 60 내지 80 : 20 내지 40의 몰%로 포함하는 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 생체활성 유리 나노입자는
   a) 졸-겔 방법을 사용하여 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
   b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
   c) 상기 산화칼슘 템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및
   d) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노입자를 제조하는 단계;
   를 포함하는 제조방법으로 제조된 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 b) 단계의 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate) 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 c) 단계의 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 3차원 부피를 가지는 코튼형의 섬유 스캐폴드.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 섬유 스캐폴드는 손상 결함 부위 형태 맞춤형 스캐폴드인, 섬유 스캐폴드.
    
13. 제11항의 섬유 스캐폴드를 포함하는, 줄기세포/스캐폴드 복합체.

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